專利名稱：：GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽類似物的可商購(gòu)制劑，所述的胰高血糖素樣肽類似物與免疫球蛋白的Fc部分融合。該制劑可以用于治療糖尿病和肥胖癥以及多種其它病癥或障礙。
背景技術(shù)：
：胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和衍生物有希望在臨床試驗(yàn)中用于治療2型糖尿病。GLP-1誘導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，例如剌激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃運(yùn)動(dòng)或腸運(yùn)動(dòng)，并且誘導(dǎo)重量減輕。GLP-1的顯著特征是其剌激胰島素分泌而不伴有低血糖相關(guān)危險(xiǎn)的能力，所述低血糖相關(guān)危險(xiǎn)見于應(yīng)用胰島素治療或通過增加胰島素表達(dá)起作用的某些類型的口服治療時(shí)。GLP-1(1-37)活性很低，并且GLP-1(7-37)0H和GLP-1(7-36)NH2這兩種天然存在的截短的肽在體內(nèi)被迅速清除，并且具有極短的體內(nèi)半壽期這一事實(shí)限制了涉及GLP-1肽的治療的有效性。已知內(nèi)源性產(chǎn)生的二肽基肽酶IV(DPP-IV)通過除去N端組氨酸和丙氨酸殘基而使循環(huán)GLP-1肽失活，并且這是體內(nèi)短半壽期的主要原因。已經(jīng)采取多種途徑以在保持生物學(xué)活性的同時(shí)延長(zhǎng)GLP-1肽的清除半壽期或降低該肽從機(jī)體的清除。一條途徑涉及將GLP-1肽與免疫球蛋白Fc部分融合。免疫球蛋白典型地具有長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)半壽期。例如，IgG分子在人體內(nèi)具有至多23天的半壽期。免疫球蛋白Fc部分是這種體內(nèi)穩(wěn)定性的部分原因。在保留GLP-1分子生物學(xué)活性的同時(shí)，GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)具有由免疫球蛋白Fc部分提供的穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。盡管此途徑對(duì)于GLP-1療法(參見WO02/46227)是可行的，但是對(duì)多種融合蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)期反復(fù)施用時(shí)的抗原性存在普遍的顧慮。對(duì)于GLP-l-Fc融合體療法，這尤其是一個(gè)顧慮，因?yàn)樘悄虿』颊咭坏┙?jīng)診斷患有該疾病，就必須一生接受治療。此外，如果Fc部分保留不需要的效應(yīng)子功能，F(xiàn)c融合蛋白質(zhì)療法可能是一個(gè)顧慮。該方法是PCT/US04/15595(W02005/000892)的焦點(diǎn)，其中通過鑒定特別GLP+Fc融合蛋白質(zhì)克服了與施用GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)相關(guān)的關(guān)于潛在免疫原性和效應(yīng)子活性的問題，所述特別GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)反復(fù)和長(zhǎng)期施用后，誘導(dǎo)免疫響應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)降低并且不再具有效應(yīng)子功能。對(duì)于在細(xì)菌細(xì)胞中合成產(chǎn)生或重組產(chǎn)生具有這種性質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，在技術(shù)上過于龐大和復(fù)雜。這些融合蛋白質(zhì)典型地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、例如CH0、293或NS0中產(chǎn)生。觀察到在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)比在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的非融合蛋白質(zhì)更易于被內(nèi)源蛋白酶降解以及化學(xué)改變。該問題試圖在PCT/US2005/045376(W02006/068910)中克服，其中發(fā)現(xiàn)了包含GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)，緩沖在約pH6至約pH8.5之間的制劑提供了增加的化學(xué)穩(wěn)定性。另外，當(dāng)在檢查中存在由宿主細(xì)胞蛋白酶引起的不穩(wěn)定性時(shí)，如果其在物理上不穩(wěn)定，該制劑可能不適合。本發(fā)明人還觀察到另外一個(gè)問題是溶液制劑在長(zhǎng)期貯存后形成可溶聚集物和不可溶顆粒。該問題試圖通過賦形劑的特別組合和GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的特別濃度來克服。發(fā)明概述為了克服GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的溶液制劑在長(zhǎng)期貯存后形成可溶聚集物和不可溶顆粒的問題，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了物理和化學(xué)上穩(wěn)定的溶液制劑，該溶液制劑包含約0.5至約10mg/mLGLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)、5至20mM檸檬酸鹽緩沖液、0.Ol至O.05%(w/v)聚山梨酯-80和4.0至5.3%(w/v)甘露醇，并且pH為6_7。該制劑意外地并且相當(dāng)大地提供了在長(zhǎng)期貯存后形成較少的可溶聚集物和不可溶顆粒。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該溶液制劑經(jīng)長(zhǎng)期貯存后在注射器中比在小瓶中更穩(wěn)定。本發(fā)明還包括治療患有糖尿病和肥胖癥以及多種其它病癥或障礙的患者的方法，該方法包括施用GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)制劑。發(fā)明詳述本發(fā)明的GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)包含GLP-1化合物，其在C_端通過肽連接體與免疫球蛋白的Fc部分的類似物的N-端融合。融合蛋白質(zhì)在生物學(xué)上用作單體或者用作同型二聚體并且比天然GLP-1具有增加的半壽期。優(yōu)選的GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)包含(SEQIDN0:1)中給出的氨基酸序列。更優(yōu)選的GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)基本由(SEQIDNO:1)中給出的氨基酸序列組成。最優(yōu)選的GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)由(SEQIDNO:1)中給出的氨基酸序列組成。His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys55-Pro-Pro-Cys58-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys_Pro_Lys_Asp_Thr_Leu_Met_Ile_Ser_Arg_Thr_Pro_Glu_Val_Thr_Cys90_Val_Val_Val_Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val_His_Asn_Ala_Lys_Thr_Lys_Pro_Arg_Glu_Glu_Gln_Phe_Asn_Ser_Thr_Tyr_Arg_Val_Val_Ser_Val_Leu_Thr_Val_Leu_His_Gln_Asp_Trp_Leu_Asn_Gly_Lys_Glu_Tyr_Lys_Cys150_Lys一Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln_Pro_Arg_Glu_Pro_Gln_Val_Tyr_Thr_Leu_Pro_Pro_Ser_Gln_Glu_Glu_Met_Thr_Lys_Asn_Gln_Val_Ser_Leu_Thr_Cys196_Leu_Val_Lys_Gly_Phe_Tyr_Pro_Ser_Asp_Ile_Ala_Val_Glu_Trp_Glu_Ser_Asn_Gly_Gln_Pro_Glu_Asn_Asn_Tyr_Lys_Thr_Thr_Pro_Pro_Val_Leu_Asp_Ser_Asp_Gly_Ser_Phe_Phe_Leu_Tyr_Ser_Arg_Leu_Thr_Val_Asp_Lys_Ser_Arg_Trp_Gln_Glu_Gly_Asn_Val_Phe_Ser_Cys254_Ser_Val_Met_His_Glu_Ala_Leu_His_Asn_His_Tyr_Thr—Gin—Lys—Ser—Leu—Ser—Leu—Ser—Leu—Gly(SEQIDNO:1)二硫鍵可以存在于鏈內(nèi)(在A鏈或B鏈上)和/或鏈間(在A鏈和B鏈之間)。鏈內(nèi)二硫鍵的實(shí)例是Cys90A-Cysl50A、Cysl96A-Cys254A、Cys90B-Cysl50B、Cysl96B-Cys254B。鏈間二硫鍵的實(shí)例是Cys55A-Cys55B、Cys58A-Cys58B。生物學(xué)活性指的是融合蛋白質(zhì)在體內(nèi)與GLP-1受體結(jié)合和活化GLP-1受體并且引發(fā)響應(yīng)的能力。響應(yīng)包括但不限于分泌胰島素、抑制胰高血糖素、抑制食欲、減輕重量、誘導(dǎo)飽腹感、抑制凋亡、誘導(dǎo)胰P細(xì)胞增殖以及分化胰P細(xì)胞。GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)制劑包含約0.25至約10mg/mLGLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選融合蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)范圍為約0.5至10、0.5至5、0.5至2.5、0.5至2、0.5至1.67、0.5至1.5、0.5至1.25、0.5至1、0.5至0.9、0.5至0.8、0.5至0.75、0.6至2、0.7至2、0.8至2、0.9至2、0.5至3、0.6至3、0.7至3、0.8至3、0.9至3、0.5至4、0.6至4、0.7至4、0.8至4、0.9至4、1至2、1.1至2、1.2至2、1.3至2、1.4至2、1.5至2、1.6至2、0.7至1.67、0.9至1.1、1至4、1.0至4.0、0.5至5、0.25至7、0.25至5、0.25至4、0.25至3、0.25至2、0.25至1.5、0.25至1、0.25至0.5。優(yōu)選GLP+Fc融合蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)為約0.25、約0.42、約0.5、約0.6、約0.67、約0.7、約0.75、約0.8、約0.83、約0.9、約1、約1.1、約1.2、約1.25、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.67、約1.7、約1.8、約1.9、約2、約2.5、約3、約3.33、約4、約5、約6.67或約10。GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)制劑的緩沖范圍為約5至20mM檸檬酸鹽。優(yōu)選檸檬酸鹽濃度(mM)范圍為約5至15、5至12.5、5至10、7.5至20、7.5至15、7.5至12.5、7.5至10、8至20、8至15、8至12.5、8至11、8至10、9至20、9至15、9至12.5、10至20、10至17.5、10至15、10至12.5、6至14、7至13、8至12、9至11、12至20、14至20、16至20和18至20。特別優(yōu)選的檸檬酸鹽的濃度范圍為約9至約11和約8至約12mM。特別優(yōu)選的檸檬酸鹽的濃度為約10或約10.0。pH調(diào)節(jié)的范圍為約6至7以提供可接受的穩(wěn)定性，以保持GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的溶解度和促胰島素活性并且是非腸道施用可以接受的。可以通過加入酸、例如HC1，或加入堿例如NaOH將pH調(diào)節(jié)至預(yù)期的pH或者可以加入檸檬酸鹽緩沖液和檸檬酸的組合以獲得預(yù)期的緩沖濃度和預(yù)期的pH。優(yōu)選pH值的范圍為約6.3至6.7、6.25至6.75、6.2至6.8、6.15至6.85、6.1至6.9。優(yōu)選pH值為約6.5。GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)制劑進(jìn)一步包含甘露醇作為等張劑。甘露醇的濃度范圍為4.0至5.3%(w/v)。單位"(w/v)"指的是組分的質(zhì)量/最終制劑的體積。因此，甘露醇濃度為4.6%(w/v)的制劑中每mL制劑具有46mg甘露醇，或者以另一種方式表達(dá)，其具有4.6克甘露醇溶于總體積為100mL的制劑中。優(yōu)選的甘露醇濃度(％(w/v))范圍為約4.0至約4.1、約4.1至約4.2、約4.2至約4.3、約4.3至約4.4、約4.4至約4.5、約4.5至約4.6、約4.6至約4.7、約4.55至約4.75、約4.5至約4.8、約4.4至約4.9、約4.3至約5.0、約4.2至約5.1、約4.1至約5.2、約4.7至約4.8、約4.8至約4.9、約4.9至約5.0、約5.0至約5.1、約5.1至約5.2、約5.2至約5.3。優(yōu)選的甘露醇濃度(％(w/v))為約4.3、約4.5、約4.55、約4.6、約4.65、約4.64、約4.7、約4.75、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2或約5.3。GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)制劑進(jìn)一步包含聚山梨酯-80作為增溶劑和/或穩(wěn)定劑。聚山梨酯-80的濃度范圍為約0.Ol至O.05%(w/v)(或者以術(shù)語(yǔ)mg/mL表示，約0.l至O.5mg/mL)。聚山梨酯-80的該濃度是與GLP-Fc融合蛋白質(zhì)和甘露醇組合確定的，以使可溶聚集物和不可溶顆粒的形成最小化。聚山梨酯-80優(yōu)選的濃度(％(w/v))范圍為約0.01至0.04、0.01至0.03、0.015至0.025。聚山梨酯_80優(yōu)選的濃度范圍為約0.018至約0.022%(w/v)。聚山梨酯-80另一個(gè)優(yōu)選的濃度范圍為約O.015至約0.025%(w/v)。聚山梨酯-80特別優(yōu)選的濃度為約0.02%(w/v)。特別優(yōu)選的制劑包含具有SEQIDN0:1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白質(zhì)、濃度范圍為約O.25至約10mg/mL，擰檬酸鹽緩沖液、濃度為約lOmM，聚山梨酯-80、濃度為約0.02%(w/v)，山梨醇、濃度為約4.6X(w/v)，并且pH為約6.5。另一個(gè)特別優(yōu)選的制劑包含具有SEQIDN0:1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白質(zhì)、濃度范圍為約0.25至約5mg/mL，檸檬酸鹽緩沖液、濃度為約10mM，聚山梨酯-80、濃度為約0.02X(w/v)，山梨醇、濃度為約4.6%(w/v)，并且pH為約6.5。另一個(gè)特別的制劑包含具有SEQIDN0:1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白質(zhì)、濃度范圍為約0.25至約10mg/mL，檸檬酸鹽緩沖液、濃度范圍為約5至約20mM，聚山梨酯-80、濃度為約0.02%(w/v)，山梨醇、濃度范圍為約4.5至約4.8%(w/v)，并且pH范圍為約6.3至約6.7。另一個(gè)特別的制劑包含具有SEQIDNO:1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白質(zhì)、濃度范圍為約0.25至約5mg/mL，檸檬酸鹽緩沖液、濃度范圍為約5至約20mM，聚山梨酯-80、濃度為約0.02%(w/v)，山梨醇、濃度范圍為約4.5至約4.8%(w/v)，并且pH范圍為約6.3至約6.7。制劑的施用可以通過普通技術(shù)人員已知的任何有效途徑。外周非腸道施用是其中一種方法。非腸道施用在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中通常被理解為通過滅菌注射器或某些其它機(jī)械設(shè)備例如輸注泵將劑型注射至體內(nèi)。外周非腸道途徑可以包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)途徑施用。皮下施用是優(yōu)選的途徑。本發(fā)明制劑可以用于治療患有非胰島素依賴性糖尿病或者處于發(fā)展成非胰島素依賴性糖尿病危險(xiǎn)中的個(gè)體、胰島素依賴性糖尿病或肥胖癥的個(gè)體。在上下文描述的制劑中GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的有效量是當(dāng)施用于需要GLP-1受體剌激的個(gè)體時(shí)引起預(yù)期的治療和/或預(yù)防效果而不引起不希望的副作用的量。優(yōu)選融合蛋白質(zhì)每?jī)芍苁┯靡淮位蛘呙恐苁┯靡淮?。取決于待治療的疾病，其可能需要更頻繁施用融合蛋白質(zhì)，例如每周施用二至三次。本發(fā)明將通過參考以下實(shí)施例以非限制性實(shí)施例的方式進(jìn)行描述。實(shí)施例體外GLP-1受體活化分析應(yīng)用CRE-熒光素酶系統(tǒng)將穩(wěn)定表達(dá)人類GLP-1受體的HEK-293細(xì)胞以30，000個(gè)細(xì)胞/孔/80iiL低血清的DMEMF12培養(yǎng)基接種于96孔板中。接種后一天，將溶于0.5%BSA的試驗(yàn)蛋白質(zhì)的20iiL等分試樣與細(xì)胞混合并且培養(yǎng)5小時(shí)。對(duì)于每種試驗(yàn)蛋白質(zhì)，通常以5X濃度制備含有3pM至3nM的12個(gè)稀釋物后加入細(xì)胞，從而產(chǎn)生劑量響應(yīng)曲線，從中確定EC5。值。培養(yǎng)后，將100iiL熒光素酶試劑直接加入至各板，并且輕輕混合2分鐘。將板置入Tri-lux發(fā)光計(jì)中并且計(jì)算熒光素酶表達(dá)引起的光輸出。GLP-Fc融合體制劑分析試驗(yàn)GLP-Fc融合體制劑的穩(wěn)定性是應(yīng)用以下方法評(píng)價(jià)的紫外_可見光譜(UV)、反相(RP)色譜、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜，具有RP色譜的限制消化，在550nm處吸收，動(dòng)態(tài)光散射，instron，HIAC和差示掃描量熱法(microDSC)。反相(RP)色譜用于監(jiān)控片段形式的GLP-Fc的形成、Fc區(qū)域的氧化以及相應(yīng)的完整主峰損失。尺寸排阻(SE)HPLC用于監(jiān)控聚合物(可溶聚集物)的形成和相應(yīng)的單體損失。陰離子交換(AEX)HPLC用于監(jiān)控電荷不均勻性，特別是酸性變體(AV)的形成，所述的酸性變體通常相應(yīng)于脫酰胺作用，以及相應(yīng)的主峰損失。限制消化用于監(jiān)控對(duì)GLP-Fc分子的肽(GLP-1)部分具有特異性的降解產(chǎn)物，例如HI(在SEQIDNO:1的1位的His)和/或G2(在SEQIDNO:1的2位的Gly)的N-端剪除、在F22(在SEQIDNO:1的22位的Phe)和/或W25(在SEQIDNO:1的25位的Trp)處的蛋白酶修剪、在N-端的丙酮酸化、在W25(在SEQIDNO:1的25位的Trp)處的氧化以及在S46(在SEQIDNO:1的46位的Ser)處的磷酸化。在550nm處的吸收監(jiān)控由于不可溶顆粒的形成引起的溶液濁度。動(dòng)態(tài)光散射用于測(cè)量大的可溶聚集物。Instron用于測(cè)量過濾阻力，其是半定量方法，最初發(fā)展用于測(cè)量胰高血糖素溶液中凝膠樣結(jié)構(gòu)的形成。該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于評(píng)價(jià)GLP-1肽溶液的物理不穩(wěn)定性。由于GLP-Fc融合體是GLP-1類似物與IgG4Fc鏈的組合，試驗(yàn)過濾阻力可以給物理不穩(wěn)定性的性質(zhì)提供進(jìn)一步的參考。進(jìn)行該試驗(yàn)以測(cè)量將溶液通過具有0.2iim孔徑的13mm直徑的PVDF膜過濾器推入注射器的反壓。如果沒有阻力或聚集，壓力反饋圖就沒有斜度。歷經(jīng)一段時(shí)間斜度增加表明聚集作用和/或凝膠作用的增加。為了將運(yùn)行比較簡(jiǎn)單化，僅記錄最大阻力值。HIAC是廣泛用于非腸道制劑的光阻礙技術(shù)，其用于監(jiān)控不可溶顆粒物質(zhì)的形成。差示掃描量熱法用于監(jiān)控解折疊特征，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)開始進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化時(shí)，其通過熱轉(zhuǎn)化溫度表明。根據(jù)下表制備GLP-Fc融合體制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>GLP-Fc融合體制劑是通過0.22iim聚偏1，1_二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾的。將溶液在5、15、25、37和45t:下貯存在5mL玻璃小瓶中直至分析或至多20周。pH對(duì)GLP-Fc穩(wěn)定性的作用下表顯示在37t:下修剪形式的GLP-Fc融合蛋白質(zhì)的形成速率常數(shù)，其是通過RP色譜確定的。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>37°CTGLP-Fc融合蛋白質(zhì)的酸性變體的酸性的。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>下表顯示在37t:下貯存20周后GLP-Fc融合蛋白質(zhì)的可溶聚集物(聚合物％)的形成，其是通過SEHPLC確定的。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>下表顯示在37t:下N-端修剪(desH1/H1G2)的速率常數(shù)，其是通過限制消化確定的。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>溶解度和粘度下表顯示pH對(duì)GLP-Fc融合體制劑的溶解度和粘度的作用。首先在適合的緩沖液中制備溶液，調(diào)節(jié)pH，然后通過應(yīng)用Centricon濃縮機(jī)將溶液離心濃縮。通過視覺檢查溶液達(dá)到溶液的溶解限的征象。通過UV吸收確定濃度。以Poise(P)測(cè)定粘度，其中1P=lgcm—、—、2(TC的水的粘度為約0.01gcm18-、其與l厘泊(cP)相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>溶液制劑穩(wěn)定性比較進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE)研究以解釋關(guān)鍵制劑參數(shù)和分子的化學(xué)/物理穩(wěn)定性性質(zhì)之間的關(guān)系?；跀?shù)據(jù)，開發(fā)了定量模型以(i)定義在化學(xué)和物理穩(wěn)定性方面的最佳靶制劑；(ii)探尋制劑設(shè)計(jì)空間以定義具有可接受表現(xiàn)的產(chǎn)物的參數(shù)范圍以及(iii)實(shí)現(xiàn)在研究中探尋的設(shè)計(jì)空間內(nèi)的制劑表現(xiàn)的足夠穩(wěn)定性。在DoE研究中試驗(yàn)的所有制劑在下表中概述。制備多種制劑并且通過0.22iim聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾。將制劑在5、25和4(TC下貯存在3mL玻璃小瓶中直至分析或至多3個(gè)月。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>制劑的穩(wěn)定性通過監(jiān)控主峰的降低％來評(píng)價(jià)，其是通過反相(RP)色譜測(cè)定的。所有制劑的速率常數(shù)如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>有兩種類型的修剪形式可以通過RP色譜監(jiān)控。第一種是通過殘留蛋白酶在GLP區(qū)域的F22和/或W25處的修剪形式。第二種類型是通過化學(xué)機(jī)制在連接區(qū)域的修剪。所有制劑的速率常數(shù)如下表所示，其是通過RP色譜確定的。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如下表所示'<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>l體的形成是通過尺寸排阻HPLC監(jiān)控的。在4(TC下單《<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>通過在GLP區(qū)域的限制消化的N-端修剪是通過限制消化分析確定的。DesHI,H1G2的速率常數(shù)如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通過在400RPM下進(jìn)行軌道振蕩24小時(shí)的攪拌后可溶聚集物的形成是通過SEHPLC監(jiān)控的。單體％結(jié)果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>對(duì)于攪拌穩(wěn)定性，主要關(guān)注的是不可溶顆粒物質(zhì)的形成，其可以通過HIAC測(cè)量監(jiān)控。通過在400RPM下進(jìn)行軌道振蕩24小時(shí)的攪拌后的HIAC結(jié)果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在注射器和小瓶中的NaCl與甘露醇制劑的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以上兩種制劑在5t:下的穩(wěn)定性比較，比較甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶貯存。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>ND=未測(cè)定以上兩種制劑在25t:下的穩(wěn)定性比較，比較甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶貯存。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>ND=未測(cè)定以上兩種制劑在4(TC下的穩(wěn)定性比較，比較甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶貯存。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>ND=未測(cè)定甘露醇濃度確定獲得GLP-Fc融合蛋白質(zhì)溶液制劑的靶張力為290毫重量克分子滲透濃度/Kg所需的甘露醇濃度是通過滴定試驗(yàn)確定的。下表概述了產(chǎn)生的重量克分子滲透濃度，其是甘露醇濃度的函數(shù)?；谥亓靠朔肿訚B透濃度結(jié)果與甘露醇濃度的線性回歸分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)P值<0.Ol，確定甘露醇濃度為46.4mg/mL或4.64%。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求穩(wěn)定的溶液制劑，該制劑包含治療有效量的在檸檬酸鹽緩沖液中的GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)，所述的檸檬酸鹽緩沖液含有范圍為約0.01％至0.05％(w/v)的聚山梨酯-80、范圍為約4.3至5.0％(w/v)的甘露醇，并且其中溶液的pH范圍為約pH6至7。2.權(quán)利要求l的穩(wěn)定的溶液制劑，其中治療有效量的GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的范圍為約0.25至約10mg/mL。3.權(quán)利要求2的穩(wěn)定的溶液制劑，其中治療有效量的GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)的范圍為約0.25至約5mg/mL。4.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中檸檬酸鹽緩沖液的濃度范圍為約5至20mM。5.權(quán)利要求4的穩(wěn)定的溶液制劑，其中檸檬酸鹽緩沖液的濃度為約10mM。6.權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中聚山梨酯-80的濃度為約0.02%(w/v)。7.權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中甘露醇的濃度范圍為約4.5至4.8%(w/v)。8.權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中甘露醇的濃度為約4.6%(w/v)。9.權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列是通過SEQIDN0:1給出的。10.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的濃度范圍為約0.25至5mg/mL，擰檬酸鹽的濃度為約lOmM，聚山梨酯-80的濃度為約0.02%(w/v)，甘露醇的濃度為約4.6X(w/v)并且pH范圍為約6.3至6.7。11.權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中GLP-l-Fc融合蛋白質(zhì)的濃度為約lmg/mL。12.權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中pH為約6.5。13.權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)的穩(wěn)定的溶液制劑，其中制劑貯存在滅菌注射器中。全文摘要本發(fā)明提供了穩(wěn)定的溶液制劑，其包含治療有效量的GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)，其在含有聚山梨酯-80和甘露醇的檸檬酸鹽緩沖液中的pH約為6.5。該制劑用于治療糖尿病和肥胖癥以及多種其它病癥或障礙。文檔編號(hào)A61K38/26GK101730523SQ200880023539公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者K·額申請(qǐng)人:伊萊利利公司