專利名稱：B7-dc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的組合物和方法，特別地,本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)T
細(xì)胞活化的組合物和方法。 政府支持 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院資助號ROl CA85721的政府支持下完成的。美國 政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞的抗原特異性活化和增殖受到來自共刺激分子的正信號和負(fù)信號的調(diào) 節(jié)。表征的最詳盡的T細(xì)胞共剌激通路是B7-CD28，其中B7-1(CD8())和B7-2 (CD86)可以分 別結(jié)合刺激性CD28受體和抑制性CTLA-4(CD152)受體。在通過T細(xì)胞受體而進(jìn)行信號傳 導(dǎo)時，B7-1與CD28的接合能增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，剌激 T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、和促進(jìn)T細(xì)胞的存活(Lenshow, et al. ， Annu. Rev. Immunol, 14:233-258(1996) ;Chambers and Allison, Curr. ()pin. Immunol ， 9 :396-404 (1 997);和 Rathmell and Thompson, Annu. Rev. Immunol, 17 :78 1-828(1999))。相反，據(jù)認(rèn)為通過 CTLA-4的信號傳遞的卻是能抑制T細(xì)胞的增殖、抑制IL-2的產(chǎn)生和抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的 負(fù)信號(Kru咖el and Allison, J. Exp. Med. ,183 :2533-2540(1996);和Walunas，et al. ,J E鄧.Med，183 :2541-2550 (1996)) 。B7族的其他成員包括B7-HI (Dong, et a:l.. ,Nature Med.， 5 :1365-1369(1999);禾P Freeman， et al. ， J E.xp. Med. ，192 :1—9(2000))、 B7—DC (Tseng, et. al. ， J. Exp. Med. ，193 :839-846(2001);禾卩Latchman， et al. ， Nature Immunol. ，2 : 26卜268(2001)) 、 B7-H2(Wang, et al. ， Blood,96 :2808-2813(2000) ;Swallow, et al.， I:匪nity,ll :423-432(1999); 和Yoshinaga， et a:l.. ， Nature, 402 :827-832(1999))、 B7-H3(Chapoval， et al. ， Nature Immunol. ,2 :269-274(2001))和B7-H4(Choi， et. al.， J. I咖翻l. ，171 :4650_4654(2003) ;Sica， et al. ， Immunity, 18 :849_861 (2003) ;Pr雄d， et al. , Immunity, 18 :863—873(2003);禾口Zang，et al. ，Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. ， 100 : 10388-10392(2003)) 。 B7-HI和B7-DC是PD-1的配體，B7-:H2是[COS的配體，目前:B7-H3 仍為孤兒配體(Dong, et al. ， Immunol. Res. ，28 :39-48 (2003))。 B7族分子在細(xì)胞表面表達(dá)為同型二聚體的形式，并且具有近膜恒定IgC結(jié)構(gòu)域和 遠(yuǎn)膜IgV結(jié)構(gòu)域。這些配體的受體具有共同的胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域。受體-配體對的相互作用 主要通過配體和受體的IgV結(jié)構(gòu)域中的殘基來介導(dǎo)(Schwartz, et a， Nature Iiranuno:[.， 3:427-434(2002))。通常，IgV結(jié)構(gòu)域被描述為雙折疊層結(jié)構(gòu)，每層均含有|3鏈折疊層 (Williams and Barclay, Annu. Rev. Immunol. ，6 :381-405 (1998)) 。CTLA-4的前折疊層和后 折疊層分別包含A，GFC，C鏈和ABEDC"鏈(Ostrov，et al. , Science, 290 :816-819 (2000))，而B7IgV結(jié)構(gòu)域的前折疊層和后折疊層分別由AGFCC， C"鏈和BED鏈構(gòu)成(Schwartz, et. al. ， Nature,410 :604-608(2001) ;St卿er， et al. ， Nature,410 :608-611(2001);以及 Ikemizu, et al. , Immunity, 12 :51-60 (2000))。晶體學(xué)分析表明CTLA-4/B7的結(jié)合界面由 CTLA-4上的CDR3類似環(huán)(其由MYP:PPY基序構(gòu)成)禾B :B7上的主要由G、F、C、C'和C"鏈形 成的表面之間的相互作用來主導(dǎo)(Schwartz, et. al. , (2001)，見上文；和Stamper, et al.， (2001)，見....匕文)。氨基酸同源性、突變和計算機(jī)模擬方面的數(shù)據(jù)提供了對于下列概念的支 持所述基序也是CD28與B7的主結(jié)合位點(Bajorath, et al. , J. Mol. Graph. Model. , 15 : 135-139 (1997))。盡管MYP:PPY基序未存在于]:C()S中，但是研究已表明具有序列FDP:PPF并 且位于類似位點的類似基序是ICOS與B7-H2結(jié)合的主要決定因素(Wand， et al. ， J. E鄧. Med. ，195 :1033-1041(2002))。 B7-DC (也稱為PD-L2)是B7族的較新成員，其具有與B7-HI (也稱為PD-LI)的同 一性約為34%的氨基酸序列。人和鼠B7-DC同源物具有約70X的氨基酸同一性。雖然在 各種組織中發(fā)現(xiàn)了 B7-H1和B7-DC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Dong，et al. (1999)，見上文；Latchman，et al. (2001)，見上文；和Tamura， Blood, 97 :1809-1816 (2001))，但是這些蛋白的表達(dá)譜卻十 分不同。盡管在除了巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞之外的正常組織中基本上沒有發(fā)現(xiàn)B7-HI蛋白的表 達(dá)，但是B7-HI蛋白的表達(dá)能在多種組織和細(xì)胞類型中被誘導(dǎo)(Dong, et al. (1999)，見上 文；Tamura，et al. (2001)，見上文；和Isbida,et al. 'Immunol Lett. ，84 :57-62(2000))。 相反，B7-DC只在樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)(Tseng, et.al. (2001)，見上文；和Ishida， et al. (2000)，見上文)。 現(xiàn)已證明B7-HI和B7-DC均與PD-1 (程序化細(xì)胞死亡-1)結(jié)合(Freeman, et al.， J. E-xp.Med. ，192 :1027-1034(2000) ;Tseng(2001)，見上文；Latchman(2001)，見上文)，所 述PD-1為CD28族的遠(yuǎn)緣成員，并且在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有免疫受體酪氨酸基抑制性基 序(IT頂)(Ishida， et al. ， EMBO J. ,11 :3887-3895 (1992)) 。 PD-1在胸腺細(xì)胞亞群上表 達(dá)，并且在活化后對T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞進(jìn)行上調(diào)(Agata， et al. ， Int. Immunol. ，8 : 765-772 (1996))。對PD-1+小鼠的表型分析提供了 PD_1在體內(nèi)是免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)物 的直接證據(jù)。在缺乏PD-1時，具有C57BL/6背景的小鼠慢慢患上狼瘡樣腎小球性腎炎和 進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(Nishimura， et al. ， Immunity, 11 :14H51 (1999))。具有BALB/c背景的 PD-1+小鼠迅速患上致命的自體免疫性擴(kuò)張性心肌病(Nishinmra， et al. ， Science. 291 : 319-322(2001))。然而，大量證據(jù)表明B7-DC可以具有共刺激T細(xì)胞應(yīng)答的功能。在次優(yōu) TCR信號的存在下，B7-DC在體外刺激T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生(Tseng, et. al. ， J E鄰.Med. 193 :839-846 (2001))。另一方面，體外研究表明B7-DC在T細(xì)胞應(yīng)答中具有負(fù)調(diào) 節(jié)作用(Latchraan (2001)，見上文)。對這些看起來矛盾的數(shù)據(jù)的最好解釋是在T細(xì)胞上除 了 PD-1以外還表達(dá)有B7-DC的另外的受體的表達(dá)。 有利的是提供一種組合物，所述組合物能增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖，增強(qiáng)T細(xì) 胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，刺激分化和效應(yīng)子功能,和促進(jìn)T細(xì)胞的存活。還有利的是提供B7-DC變 體多肽，與野生型B7-DC相比，所述B7-DC變體多肽對于PI) 1的親和結(jié)合性降低，并且仍保 留共刺激T細(xì)胞的能力(即增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、剌激 T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、或促進(jìn)T細(xì)胞的存活)。 因此，本發(fā)明的目的是提供B7-DC變體多肽，與野生型B7-DC相比,所述B7-DC變
5體多肽對于PD-1的親和結(jié)合性降低，并且仍保留共剌激T細(xì)胞的能力。 本發(fā)明的另一個目的是提供編碼B7-DC變體多肽的分離的核酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供包含載體的細(xì)胞,所述載體表達(dá)編碼B7-DC變體多肽
的核酸分子。本發(fā)明的又一個目的是提供通過使T細(xì)胞與B7-DC變體多肽接觸來共刺激T細(xì)胞 的方法。 本發(fā)明的又一個目的是提供向需要的哺乳動物施用B7-DC變體多肽、施用編碼 B7-DC變體多肽的核酸、或施用由編碼B7-DC變體多肽的核酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供通過將B7-DC變體多肽與抗原或疫苗聯(lián)合施用，來加 強(qiáng)對該抗原或疫苗的免疫應(yīng)答的方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于共剌激T細(xì)胞(即增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn) 生細(xì)胞因子、剌激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、和/或促進(jìn)T細(xì)胞的存活)的組合物和方 法。合適的組合物包括B7-DC變體多肽。B7-DC變體多肽對于抑制性PD-I配體的親和結(jié)合 性降低，但基本上保留了共刺激T細(xì)胞的能力。在某些實施方案中,B7-DC變體多肽可包含 (但不限于)在鼠或人B7-DC的A' e鏈的33位、BP-鏈的39或41位、CP-鏈的56或 58位、C' 0 _鏈的65或67位、C" P -鏈的71或72位、D P -鏈的84位、E P -鏈的88位、 FP-鏈的101、103或105位、或者GI3-鏈的Hl、113或116位的置換、缺失或插入。 [,] 本發(fā)明還提供B7-DC變體多肽的片段和包含B7-DC變體多肽的融合蛋白。在一 些實施方案中，B7-DC變體多肽的片段包括可溶性片段，所述可溶性片段包括胞外域或其片 段。其他合適的B7-DC變體多肽的片段包括含有IgV和IgC結(jié)構(gòu)域的片段或僅含有IgV結(jié) 構(gòu)域的片段。B7-DC變體多肽及其片段可以與其他多肽連接以形成融合蛋白。本發(fā)明提供 B7-DC變體融合多肽,其具有包含B7-DC變體多肽的全部或一部分的第一融合伴侶，所述第 一融合伴侶(i)與第二多肽直接融合，或者(ii)可任選地，與和第二多肽融合的接頭肽序 列融合。融合伴侶的存在能夠改變B7-DC變體多肽的溶解性、親和性和/或效價。在某些 實施方案中，B7-DC變體多肽與Ig重鏈恒定區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域融合，所述恒定區(qū)優(yōu)選 具有對應(yīng)于人免疫球蛋白Cy 1鏈的鉸鏈區(qū)、&2區(qū)和CH3區(qū)的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供編碼B7-DC變體多肽和:B7-DC變體融合蛋白的核酸以及包含存在于 載體中的這種核酸的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明還提供包含B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白的免疫原性組合物。免 疫原性組合物包含抗原、B7-DC變體多肽源以及可任選的助劑和靶分子。合適的抗原包括 病毒、細(xì)菌、寄生蟲、環(huán)境抗原和腫瘤抗原。 本發(fā)明還提供使用B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白以共剌激T細(xì)胞的方 法。可以在體外、離體或體內(nèi)用B7-DC變體組合物來共剌激T細(xì)胞。使用B7-DC變體組合 物共刺激T細(xì)胞可以在T細(xì)胞的抗原特異性活化之前、之中、或之后進(jìn)行。
本發(fā)明提供B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、和編碼它們的核酸的治療用 途。B7-DC變體組合物可用于刺激針對癌癥和傳染病(包括病毒感染)的免疫應(yīng)答。B7-DC 變體組合物還可用于刺激針對免疫受抑制的受試者的免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，B7-DC 變體組合物與疫苗聯(lián)合施用。
下面結(jié)合附圖和下文的內(nèi)容將詳細(xì)闡述本發(fā)明的--個或多個實施方案。從該說明
書、附圖以及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將顯而易見的。 附圖簡要說明

圖1示出人B7-DC(hB7-DC)的全長未成熟的氨基酸序列(SEQ]:D NO :1)。人B7-DC 的信號序列包含該全長未成熟的氨基酸序列的最初19個氨基酸。 圖2示出小鼠B7-DC(mB7-DC)的全長未成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。小鼠 B7-DC的信號序列包含該全長未成熟的氨基酸序列的最初19個氨基酸。
圖3示出編碼全長未成熟的人B7-DC多肽(SEQ ID NO :1)的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)，其中所述人B7-DC多肽具有圖l所示的氨基酸序列。人B7-DC的信號序列由該全長 未成熟的核酸序列的最初57個核苷酸編碼。 圖4示出編碼全長未成熟的小鼠B7-DC多肽(SEQ ID NO :2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :4)，其中所述小鼠B7-DC多肽具有圖2所示的氨基酸序列。小鼠B7-DC的信號序列 由該全長未成熟的核酸序列的最初57個核苷酸編碼。 圖5示出小鼠和人B7分子的結(jié)構(gòu)取向的序列比對。比對序列包括下列蛋白序列 人CD86(hCD86)(SEQ ID NO :5)、人CD80(hCD80)(SEQ ID NO :6)、人B7-HI(hB7-HI)(SEQ ID NO :7)、小鼠:B7-HI (ra B7-HI) (SEQ ID NO :8)、人B7-:H2 (h B7-:H2) (SEQ ID N():9)、人 B7-H3 (hB7-H3) (SEQ ID NO : 10)、人B7-DC(hPD_L2) (SEQ ID NO :11)、小鼠B7-DC(mPD-L2) (SEQ ID NO :12)的N-末端IgV結(jié)構(gòu)域。在CDSO和CD86的X射線結(jié)構(gòu)中觀測到的P鏈被 做標(biāo)記(A' -G) ,B7族內(nèi)最保守的殘基位置(例如,較大的疏水性、帶電的/極性、或半胱氨 酸殘基)以陰影標(biāo)示。用方框框出潛在的N-連結(jié)的糖基化位點。CD86中斜體所示的殘基 在CD80中保守參與結(jié)晶性同型二聚體界面的形成，粗斜體所示的殘基在與CTLA-4形成的 復(fù)合體結(jié)構(gòu)中參與和CTLA-4的結(jié)合?；谕蛔冄芯?，用下劃線和粗體標(biāo)出了對于PD-1結(jié) 合最為重要的mB7-Hl和mB7-DC中的殘基位置。圓圈示出了當(dāng)突變時顯示出對于PD-1而 言增強(qiáng)的親和力的raB7-Hl中的殘基。數(shù)字表示了 raB7-Hl (上排數(shù)字)和mB7-DC(下排數(shù) 字)內(nèi)殘基的位置。 圖6示出與PD-1結(jié)合的B7-DC的表面等離子共振分析結(jié)果的曲線圖。該圖示出 野生型B7-DCIg和K113S B7-DCIg變體與固定化的PD-llg結(jié)合的結(jié)果。數(shù)據(jù)以應(yīng)答單位 (RU)作為以秒為單位的時間的函數(shù)的形式記錄。 圖7是示出野生型和變體型B7-DCIg融合蛋白與表達(dá)PD_1的CHO細(xì)胞結(jié)合情況 的一系列圖。B7-DCIg融合蛋白與所示野生型或變體型B7-DC融合蛋白一起溫育，然后與 FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG溫育并經(jīng)FACS分析。培養(yǎng)基本身和人IgG被用作陰性對照，抗人 P:[)-l抗體被用作陽性對照。所示曲線標(biāo)示細(xì)胞數(shù)作為發(fā)射的熒光水平的函數(shù)。曲線右側(cè)和 左側(cè)的數(shù)字表示分別被認(rèn)為與所示組合物的結(jié)合是陽性結(jié)果和陰性結(jié)果的細(xì)胞的百分率。
圖8A和8B是示出野生型和變體型B7-DC分子對T細(xì)胞共刺激的效果的圖。圖 8A中數(shù)據(jù)表示在所示濃度下的包覆到96孔板的孔底上的抗CD3mAb存在下，用所示野生型 (- -)或變體型(-■ -[)111 x-K113)B7-DC :l:g融合蛋白刺激后T細(xì)胞的增殖情況。以 力-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) (X103cpm)的摻入量作為抗CD3mAb濃度(yg/ml)的函數(shù)來測 量T細(xì)胞增殖。人lg(hlg) (-o-)和PBS(-A-)本身被用作共剌激分子的陰性對照。該數(shù) 據(jù)來自三個實驗中的有代表性的一個。圖8B中數(shù)據(jù)表示在所示Ig融合蛋白(國野生型；□ Dill ; □ K113)和抗-CD3存在下培養(yǎng)48或72小時，T細(xì)胞的IFN- y分泌情況(ng/ml)。 人Ig( □)和PBS(口)被用作陰性對照。該數(shù)據(jù)來自三個實驗中的有代表性的一個。
圖9示出在抗CD3mAb存在下與所示野生型(-鑤-)或變體型 (-△-Dill x-K113)B7-DC ]:g融合蛋白溫育后，PD-1+T細(xì)胞增殖的曲線圖。以3:H-胸腺 嘧啶核苷fH-TdR) (X103cpm)的摻入量作為抗CD3mAb濃度(y g/ml)的函數(shù)來測量T細(xì)胞 增殖。人Ig(圜)和PBS(-o-)被用作陰性對照。該數(shù)據(jù)來自三個實驗中的有代表性的一 個。 圖10示出EG7小鼠腫瘤細(xì)胞在具有免疫活性的純系小鼠(C57BL/6)中的生長(腫 瘤平均直徑(毫米))與時間(天)的函數(shù)的線性圖，所述腫瘤細(xì)胞或者是用空載體轉(zhuǎn)染的 (-□ _)、或者是用野生型B7-DC轉(zhuǎn)染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(- -)轉(zhuǎn)染的。
圖11示出EG7小鼠腫瘤細(xì)胞在免疫缺陷型裸鼠(nu/nu)中的生長(腫瘤平均直 徑(毫米))與時間(天)的函數(shù)的線性圖，所述腫瘤細(xì)胞或者是用空載體轉(zhuǎn)染的(-口-)、 或者是用野生型B7-DC轉(zhuǎn)染的(-■ _)、或者是用K113S B7-DC(-攀-)轉(zhuǎn)染的。
圖12示出小鼠P815巨大細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞在具有免疫活性的純系小鼠(DBA/2)中 的生長(腫瘤平均直徑(毫米))與時間(天)的函數(shù)的線性圖，所述腫瘤細(xì)胞或者是用空 載體轉(zhuǎn)染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC轉(zhuǎn)染的(-■-)、或者是用K113S B7-:[)C(-鑤-) 轉(zhuǎn)染的。 圖13示出小鼠P815巨大細(xì)胞瘤腫瘤腫瘤細(xì)胞在免疫缺陷型裸鼠(皿/nu)中的生 長(腫瘤平均直徑(毫米))與時間(天)的函數(shù)的線性圖，所述腫瘤細(xì)胞或者是用空載體 轉(zhuǎn)染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC轉(zhuǎn)染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(-鑤-)轉(zhuǎn) 染的。 圖14示出小鼠P815巨大細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞在具有免疫活性的純系小鼠(DBA/2)中 的生長(腫瘤平均直徑(毫米))與時間(天)的函數(shù)的線性圖，該圖顯示了腹腔內(nèi)注射野 生型B7-DC]:g的效果。在第3天和第8天給小鼠腹腔內(nèi)注射0. lrag的對照]:g(- □-)或野 生型B7-DC Ig(- ■-)。
發(fā)明詳述
I.定義 本文中使用的術(shù)語"分離的"用來描述將目標(biāo)化合物(例如，多核苷酸或多肽)從 其天然環(huán)境中分離，使得所述目標(biāo)化合物處于不同于化合物天然所存在的環(huán)境中，例如，將 肽濃縮至天然未發(fā)現(xiàn)的濃度，而將其從天然環(huán)境中分離出來。"分離的"是指包含這樣的化 合物,其是樣品中的目標(biāo)化合物被基本上富集得到,和./或目標(biāo)化合物被部分地或基本上 純化而得到。 本文中使用的術(shù)語"多肽"指任何長度的氨基酸鏈，不管該氨基酸鏈?zhǔn)欠癖恍揎?(例如，磷酸化修飾或糖基化修飾)。 本文中使用的"共刺激性多肽"是指這樣的多肽，其在與T細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子 相互作用時，與不和共刺激性多肽接觸的T細(xì)胞相比,該多肽增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答、增強(qiáng)T細(xì)胞 的增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生和/或分泌細(xì)胞因子、剌激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、或促進(jìn)T 細(xì)胞的存活。 與對應(yīng)的野生型多肽的氨基酸序列相比，本文中使用的"變體"多肽包含至少一個氨基酸序列改變。 本文中使用的"氨基酸序列改變"可以是(例如) 一個或多個氨基酸置換、缺失或 插入。 本文中使用的"表達(dá)載體"是指包含一個或多個表達(dá)控制序列的載體。 本文中使用的"表達(dá)控制序列"是指控制和調(diào)節(jié)另外的DM序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻
譯的DM序列。 本文中使用的"可操作地連接"是指引入到基因構(gòu)建體中，使得表達(dá)控制序列有效 地控制目標(biāo)編碼序列的表達(dá)。 本文中使用的多肽"片段"是指多肽的任何亞型，該片段是全長蛋白中較短的多 肽。通常，片段具有五個或更多個氨基酸的長度。 本文中使用的"效價"是指每個分子中可用的結(jié)合位點的數(shù)量。 本文中使用的"保守"氨基酸置換是指具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性能的氨基酸的置換。 本文中使用的"非保守"氨基酸置換是指那些被置換的氨基酸的電荷、疏水性或體 積顯著地改變的置換。 本文中使用的"分離的核酸"是指與哺乳動物基因組中存在(包括在哺乳動物基 因組中通常位于該核酸的一側(cè)或兩側(cè))的其他核酸分子(例如編碼非B7-DC蛋白的核酸) 分離開而得到的核酸。 本文中術(shù)語"分離的"在針對核酸使用時，包括任何非天然存在的核酸序列，因為 所述非天然存在的核酸序列在天然中找不到并且不具有天然存在的基因組中的直接鄰接 序列。 本文中使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指可以向其中引入重組表達(dá)載體的原核和真核 細(xì)胞。 本文中使用的"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"包括通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)將核酸(例如， 載體)引入細(xì)胞。 本文中使用的術(shù)語"抗體"是指包括含有抗原結(jié)合位點的完整分子及其片段。所 述抗體包括Fab和F(ab' ) 2片段，它們沒有完整抗體中的Fc片段。 本文中使用的術(shù)語"個體"、"宿主""受試者"和"患者"可以相互替換，其是指哺乳 動物，包括(但不限于)鼠類、猿猴類、人、哺乳類家畜、哺乳類運(yùn)動性動物(sport animal) 和哺乳類寵物。 本文中使用的術(shù)語"有效量"或"治療有效量"是指足以治療、抑制或減輕一種或
多種待治療的炎癥反應(yīng)或自身性免疫疾病狀態(tài)的癥狀的劑量，或者足以提供所需的藥理和
/或生理的效果的劑量。精確的劑量隨各種因素,例如受試者依賴性變量(例如年齡、免疫
系統(tǒng)健康狀況等)、疾病和所實施的治療而變化。 II.組合物 A.分離的B7-DC多肽 1.B7-DC變體多肽
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本文中公開了分離的B7-DC多肽。B7-DC多肽可以來源自任何物種。在 一個實施 方案中，B7-DC多肽源自哺乳動物種。在優(yōu)選的實施方案種，B7-DC多肽源自小鼠或人。圖 2示出小鼠B7-DC的全長未成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。小鼠B7-DC的信號序列包 含全長未成熟的氨基酸序列的最初19個氨基酸。圖1示出人B7-DC的全長未成熟的氨基 酸序列(SEQ ID N0:1)。人B7-DC的信號序列包含全長未成熟的氨基酸序列的最初19個氨 基酸。本文中使用的術(shù)語"多肽"是指不管是否被修飾(例如，磷酸化修飾或糖基化修飾) 的任何長度的氨基酸鏈。 在一個實施方案中，:B7-DC變體多肽的生物活性和野生型:B7-DC的活性相同、基本 上相同或者不同?；钚曰旧舷嗤侵钙浔Ａ袅斯藏菁細(xì)胞的能力。
本文中公開的多肽包括B7-DC變體多肽。與相應(yīng)的野生型多肽的氨基酸序列相 比，本文中使用的"變體"多肽包含至少一個氨基酸序列改變。氨基酸序列改變可以是(例 如) 一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入。 B7-DC變體多肽可以具有氨基酸的置換、缺失或插入的任意組合。在--個實施方 案中，分離的B7-DC變體多肽具有整數(shù)個氨基酸改變，使得其氨基酸序列與野生型B7-DC 多肽的氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99. 5%或 1()0%的一致性。在優(yōu)選的實施方案中，B7-I)C變體多肽與野生型小鼠或野生型人B7-DC多 肽的氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99. 5%或 100%的一致性。 序列 一 致性百分比可以使用計算機(jī)程序或者直接序列比較來計算。確定兩 個序列的一致性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括(但不限于)GCG程序包法、FASTA法、 BLASTP法禾卩TBLASTN法(參見，例如，D. W. Mount, 2001， B ioinformat.ics :Sequence and GenomeAnalysis， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)。 BLASTP和TBLASTN程序可以從NCBI和其他來源公開地獲得。熟知的Smith Waterman算法 也可以用于確定一致性。 氨基酸序列比較的示例性參數(shù)包括1) Needleman和Wunsch算法(J. Mol Biol.， 48 :443-453(1970)) ;2) Hent.ikoff和Hentikoff的比較矩陣BL0SSUM62 (Proc. Natl Acad Sci U. S. A. ，89 :10915-10919(1992)) ;3)空位罰分=12 ;4)空位長度罰分=4。具有上述 參數(shù)的可用程序以"空位"程序的形式可公開地獲得(Genetics Compute Group, Madison, Wis.)。上述參數(shù)是用于多肽比較的默認(rèn)參數(shù)(對末端空位無罰分)。 或者，多肽序列一致性可以用下面等式計算一致性％=(—致殘基數(shù))/(氨基酸 殘基比對長度)X 100。對于該計算，比對長度包括內(nèi)部空位但不包括末端空位。
B7-DC多肽在的氨基酸置換可能是"保守的"或"非保守的"。 本文中使用的"保守的"氨基酸置換是指具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性能的氨基酸的 置換，"非保守的氨基酸置換是指那些被置換的氨基酸的電荷、疏水性或體積顯著地改變的 置換。非保守置換在下列方面的效果上具有明顯的差別保持(a)置換區(qū)域中的肽鏈的結(jié) 構(gòu),例如折疊或螺旋構(gòu)型，保持(b)目標(biāo)位點的分子的電荷或者疏水性，或保持(c)側(cè)鏈的 體積。 保守氨基酸置換的例子包括在下面五組中的一組內(nèi)的置換1)小分子脂肪族、非 極性或弱極性殘基(丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；2)極性、帶負(fù)電殘基和其酰胺(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺)；極性、帶正電殘基(組氨酸、精氨酸、賴氨酸)； 大分子脂肪族、非極性殘基(蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸)；以及大分子芳 族殘基(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。非保守氨基酸殘基置換的例子包括1)親水性殘基 (例如，絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基)置換(或被置換為)疏水性殘基(例如，亮氨酸殘基、 異亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、纈氨酸殘基或丙氨酸殘基)；2)半胱氨酸或脯氨酸置換(或 被置換為)任何其他殘基；3)具有正電荷的側(cè)鏈殘基(例如，賴氨酸殘基、精氨酸殘基或組 氨酸殘基置換(或被置換為)帶負(fù)電荷的側(cè)鏈殘基(例如,谷氨酸殘基或天冬酰胺殘基)； 或4)具有大分子側(cè)鏈殘基(例如，苯丙氨酸)置換(或被置換為)無側(cè)鏈殘基(例如，甘 氨酸)。 B7族分子(包括B7-DC)在細(xì)胞表面表達(dá)為同型二聚體的形式，并且具有近膜恒定 IgC結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜IgV結(jié)構(gòu)域。這些配體的受體具有共同的胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域。受體-配
體對的相互作用主要通過配體和受體的i:gv結(jié)構(gòu)域中的殘基來介導(dǎo)。通常，[gv結(jié)構(gòu)域被
描述為雙折疊層結(jié)構(gòu)，每層均含有e鏈折疊層。該！3-鏈被稱為A'、B、C、C'、C"、D、E、F 和G。在一個實施方案中，B7-DC變體多肽在上述13 -鏈的一個或多個中包含任何可能組合 的氨基酸改變(即，置換、缺失或插入)。在另一個實施方案中，B7-DC變體在A' 、 B、 C、 C'、 C"、D、E、F或GI5-鏈中包含一個或多個氨基酸改變(即，置換、缺失或插入)。在優(yōu)選的實 施方案中，B7-DC變體在GI3 _鏈中包含一個或多個氨基酸改變。 對于小鼠B7-DC或人B7-DC， B7-DC變體多肽可包括(但不限于)在A' P -鏈的 33位、B |3 -鏈39或41位、C P -鏈的56或58位、C' |3 -鏈的65或67位、C" P -鏈的71 或72位、D P -鏈的84位、E e -鏈的88位、F P -鏈的101 、 103或105位、G P -鏈的111 、 113或116位的置換、缺失或插入。 在一個實施方案中，B7-DC變體多肽包含在33位的置換(例如，絲氨酸置換33位 的天冬氨酸)、在39位的置換(例如，酪氨酸置換39位的絲氨酸)、在41位的置換(例如， 絲氨酸置換41位的谷氨酸)、在56位的置換(例如，絲氨酸置換56位的精氨酸)、在58位 的置換(例如，酪氨酸置換58位的絲氨酸)、在65位的置換(例如，絲氨酸置換65位的天 冬氨酸)、在67位的置換(例如，酪氨酸置換67位的絲氨酸)、在71位的置換(例如，絲氨 酸置換71位的谷氨酸)、在72位的置換(例如，絲氨酸置換72位的精氨酸)、在84位的 置換(例如，絲氨酸置換84位的賴氨酸)、在88位的置換(例如，丙氨酸置換88位的組氨 酸)、在101位的置換(例如，絲氨酸置換101位的精氨酸)、在103位的置換(例如，丙氨 酸置換103位的亮氨酸)、在105位的置換(例如，丙氨酸置換105位的異亮氨酸)、在111 位的置換(例如，絲氨酸置換111位的天冬氨酸)、在113位的置換(例如，絲氨酸置換113 位的賴氨酸)、或在116位的置換(例如，酪氨酸置換116位的蘇氨酸)。
然而，可以理解，所述氨基酸位置上的置換可以使用任何氨基酸或氨基酸類似物。 例如，在所述位置....匕的置換可以使用任何天然存在的氨基酸(例如，丙氨酸、天冬氨酸、天 冬酰胺、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴 氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)。
雖然這里所述的置換是針對小鼠和人B7-DC而言的，但是請注意本領(lǐng)域技術(shù)人員 能夠容易地對其他物種(例如，大鼠、倉鼠、豚鼠、沙鼠、野兔、狗、貓、馬、豬、羊、?；蚍侨遂` 長類)的相應(yīng)的多肽進(jìn)行等同的改變。
2. B7-DC變體多肽的性能 本發(fā)明公開的分離的B7-DC多肽具有共刺激T細(xì)胞的能力。"共刺激性多肽"是指 這樣的多肽，其在與T細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子相互作用時,與不和共刺激性多肽接觸的T細(xì) 胞相比，該多肽增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答、增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生和/或分泌細(xì)胞因子、 刺激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、或促進(jìn)T細(xì)胞的存活。源自該相互作用的T細(xì)胞應(yīng)答-一 般要比不存在共刺激性多肽時的應(yīng)答更強(qiáng)。不存在共刺激性多肽時的T細(xì)胞應(yīng)答可能是沒 有應(yīng)答或者可能是應(yīng)答比存在共刺激性多肽下的應(yīng)答顯著地降低。T細(xì)胞的應(yīng)答可能是效 應(yīng)子(例如，CTL或產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞)應(yīng)答、或者是為一個或多個效應(yīng)子(例如，CTL或產(chǎn) 生抗體的B細(xì)胞)應(yīng)答提供幫助的輔助T細(xì)胞應(yīng)答、或者是抑制性應(yīng)答。
與相應(yīng)的野生型B7-DC多肽的親和結(jié)合性相比，本文中公開的B7-DC變體多肽對 于PD-1的親和結(jié)合性降低。與相應(yīng)的野生型b7-DC多肽的親和結(jié)合性相比，變體的親和結(jié) 合性通常降低至少50 % 、 55 % 、 60 % 、 70 % 、 75 % 、 80 % 、90 % 、95 % 、99 % 、或多于99 % 。
測量兩個分子間的親和結(jié)合性的方法是本領(lǐng)域熟知的。測量B7-DC變體多肽對 PD-1的親和結(jié)合性的方法包括(但不限于)熒光活化細(xì)胞分揀法(FACS)、表面等離子體共 振法、熒光各向異性法、親和層析法和親和選擇性質(zhì)譜法。 此夕卜，公開的B7-DC變體多肽對PD-1的親和結(jié)合性降低，但基本上保留了共刺激 活性。例如，B7-DC變體多肽可以具有相應(yīng)的野生型B7-DC多肽所表現(xiàn)出的至少20 % 、25 % 、 30 % 、40 % 、 50 % 、60 % 、 75 % 、90 % 、 100 % 、或大于100 %的共剌激活性水平。
測量T細(xì)胞共刺激的方法是本領(lǐng)域熟知的，其包括測量T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子 的分泌，所述細(xì)胞因子包括(但不限于)I]:-2、 IL-4、 IL-5、]丄-6、 IL-10、 IL-13和IFN-y 。 T細(xì)胞的增殖可以通過許多方法測量,包括(但不限于)細(xì)胞計數(shù)法、通過攝取標(biāo)記的核苷 酸(例如卩H]TdR和BrdU)測量DNA合成的方法、以及使用四唑錄鹽測量代謝活性的方法。 測量細(xì)胞因子分泌的方法包括(但不限于)ELISA法。
3. B7-DC變體多肽的片段 本文公開的B7-DC多肽可以是全長多肽，也可以是全長B7-DC多肽的片段。本文
中使用的B7-DC片段是指多肽的任何亞群，所述亞群是比全長蛋白短的多肽。 在一個實施方案中，B7-DC變體多肽片段是那些保留了共刺激T細(xì)胞的能力的片
段。作為全長B7-DC的片段的:B7-DC變體多肽通常具有全長B7-DC變體多肽的至少20% 、
30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90% 、95% 、98% 、99% 、 100% 、或甚至大于100%的共刺
激活性。 人和鼠B7-DC蛋白包含較短的細(xì)胞質(zhì)間結(jié)構(gòu)域、單一一個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外域。 胞外域包含兩個:[g結(jié)構(gòu)域近膜]:gC結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜IgV結(jié)構(gòu)域。B7-DC變體多肽的有用片 段包括可溶性片段?？扇苄訠7-DC片段是可從生產(chǎn)細(xì)胞流出、分泌或提取出的B7-DC片段。 在一個實施方案中，B7-DC變體多肽片段包括B7-DC的整個胞外域。B7-DC胞外域包括來 自小鼠或人B7-DC或它們的共刺激性片段的約26位氨基酸至約226位氨基酸。在另一個 實施方案中，:B7-DC變體多肽片段包含B7-DC的I:gC和IgV結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中， B7-DC變體多肽片段包含B7-DC的IgV結(jié)構(gòu)域。 在一個實施方案中，B7-DC變體多肽片段可包含對PD-1親和結(jié)合性而言重要的多 肽區(qū)域。這些多肽片段可用于與PD-1競爭結(jié)合并防止天然B7-DC與PD-l結(jié)合。通過與PD-l競爭結(jié)合，這些片段可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，因為由于可防止B7-H1和B7-DC與PD-l的 抑制性相互作用而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答抑制。可與PD-l競爭結(jié)合的小鼠或人B7-DC的多肽片 段可以包含(例如)67-71、10卜105或1U-113位的氨基酸。與在不存在所述片段的情況 下:B7-DC與:PD-1的結(jié)合水平相比，所述:B7-DC與:PD-1的結(jié)合通常被抑制至少5()%、6()%、 70% 、75% 、80% 、90% 、95% 、或大于95%。
4.修飾的B7-DC變體多肽 B7-DC變體多肽可通過在正常細(xì)胞環(huán)境的多肽中存在的化學(xué)基團(tuán)所修飾，例 如磷酸化、甲基化、酰胺化、硫酸化、?；?、糖基化、S[M()化(sumoylation)和泛素化 (ubiquitylation) 。 B7_DC變體多肽還可由能夠提供可檢測的信號的標(biāo)記物直接地或間接 地修飾，所述標(biāo)記包括(但不限于)放射性同位素和熒光化合物。 B7-DC變體多肽還可由通常不在細(xì)胞環(huán)境中添加到多肽中的化學(xué)基團(tuán)所修飾。所 述修飾可通過使多肽的目標(biāo)氨基酸殘基和能夠與所選側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生試 劑反應(yīng)來引入分子中。另一種修飾是蛋白的環(huán)化。 多肽的化學(xué)衍生物的例子包括賴氨酰殘基和氨基末端殘基與由琥珀酸或其他羧 酸酸酐反應(yīng)衍生的物質(zhì)。與環(huán)狀羧酸酸酐反應(yīng)的衍生物具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的作 用。其他合適的用于衍生含氨基的殘基的試劑包括亞氨酸酯(例如甲基吡啶亞氨酸甲酯 (Methylpicolinimidate))、磷酸妣卩多醛、妣卩多醛、氯氫硼化物(chloroborohydride)、三硝 基苯磺酸、0-甲基異脲、2，4-戊二酮、以及與乙醛酸的轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)。羧基側(cè)基(例如天 冬氨酰基或谷氨?；?可通過與碳二亞胺(R-N = C = N-R')反應(yīng)來進(jìn)行選擇性修飾，所述 碳二亞胺例如為1-環(huán)己基-3- (2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3- (4-氮鎗-4， 4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬氨酰殘基或谷氨酰殘基可通過與氨反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為天 冬氨酰胺殘基和谷氨酰胺殘基。多肽還可包括置換了一個或多個L氨基酸的一個或多個D 氨基酸。 5. B7-DC變體融合多肽 本文公開的B7-DC變體多肽可與其他多肽結(jié)合以形成融合蛋白。本發(fā)明提供 B7-DC變體融合多肽，其具有包含B7-DC變體多肽的全部或一部分的第一融合伴侶，所述第 一融合伴侶(i)與第二多肽直接融合,或者(ii)可任選地,與和第二多肽融合的接頭肽序 列融合。融合伴侶的存在能夠改變B7-DC變體多肽的溶解性、親和性和/或效價。本文中 使用的"效價"是指每個分子中可用的結(jié)合位點的數(shù)量。本文公開的B7-DC變體融合蛋白 包括氨基酸改變(即，置換、缺失或插入)、B7-DC的片段和/或上述修飾的任意組合。在一 個實施方案中，B7-DC變體融合蛋白包含B7-DC蛋白或其共刺激性片段的胞外域作為第一 結(jié)合伴侶。在另一個實施方案中，B7-DC變體融合蛋白包含:B7-DC蛋白的IgV和]:gC結(jié)構(gòu)域 作為第一結(jié)合伴侶。在另--個實施方案中，B7-DC變體融合蛋白包含B7-DC蛋白的IgV結(jié) 構(gòu)域作為第一結(jié)合伴侶。 第二結(jié)合伴侶多肽可以是相對于B7-DC變體多肽的N-末端或C-末端。在優(yōu)選的 實施方案中，該第二多肽是B7-DC變體多肽的C-末端。 大量常規(guī)用作融合蛋白結(jié)合伴侶的多肽序列是本領(lǐng)域熟知的。有用的結(jié)合伴侶多 肽的例子包括(但不限于)綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、聚組氨酸、myc、 血球凝集素、FlagTM標(biāo)簽(Kodak, New Haven， CT)、麥芽糖E結(jié)合蛋白以及蛋白A。在一個實施方案中，B7-DC變體融合蛋白與Ig重鏈恒定區(qū)的--個或多個結(jié)構(gòu)域融合，所述結(jié)構(gòu)域優(yōu) 選具有對應(yīng)于人免疫球蛋白C Y 1鏈的鉸鏈區(qū)、區(qū)和CH3區(qū)的氨基酸序列。
B.分離的核酸分子本文公開了編碼B7-DC變體多肽的分離的核酸序列。本文中使用的"分離的核酸" 是指與哺乳動物基因組中存在(包括在哺乳動物基因組中通常位于該核酸的一側(cè)或兩側(cè)) 的其他核酸分子(例如編碼非B7-DC蛋白的核酸)分離開而得到的核酸。本文中在針對核 酸使用的術(shù)語"分離的",還包括任何非天然存在的核酸序列，因為所述非天然存在的核酸 序列在天然中找不到并且不具有天然存在的基因組中的直接鄰接序列。
分離的核酸可以是(例如)DNA分子，只要在天然存在的基因組中直接位于該DNA 分子兩翼的核酸序列中的一個被移除或不存在即可。因此，分離的核酸包括(但不限于)作 為獨立于其他序列(例如,化學(xué)合成的核酸、或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶處理而制備的 d)NA片段或者基因組I)NA片段)而單獨存在的DNA分子、以及被引入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、 病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、慢病毒、腺病毒或皰疹病毒)、或被引入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的 基因組DNA中的重組DNA。此外，分離的核酸可包括人造核酸，例如作為雜交或融合核酸的 一部分的重組DNA分子。與在(例如)cDNA文庫或基因組文庫、或在凝膠切片中包含的基 因組:[)NA限制性消化片段中存在的幾百到幾百萬的其他核酸一起存在的核酸不認(rèn)為是分 離的核酸。 核酸可以是正義方向或是反義方向，也可以是與編碼B7-DC多肽的參比序列互補(bǔ) 的。參比序列包括(例如)圖3中給出的人B7-DC的核苷酸序列(SEQ ID NO :3)和圖4中 給出的小鼠:B7-DC的核苷酸序列(SEQ ID NO :4),所述人B7-DC的核苷酸序列編碼具有圖 l給出的氨基酸序列(SEQ ID N0:1)的全長未成熟的B7-DC，所述小鼠B7-DC的核苷酸序列 編碼具有圖2給出的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)的全長未成熟的B7_DC。
核酸可以是DNA、 RNA或核酸類似物。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分或磷 酸酯骨架處被修飾。所述修飾能夠提高(例如)核酸的穩(wěn)定性、雜交性或溶解性。在堿基 處修飾可包括將脫氧胸腺嘧啶核苷修飾為脫氧尿苷以及將脫氧胞嘧啶核苷修飾為5-甲 基-2' _脫氧胞嘧啶核苷或5-溴-2'-脫氧胞嘧啶核苷。糖部分的修飾可包括將核糖的 2'羥基進(jìn)行修飾以形成2' -0-甲基糖或2' -0-烯丙基糖。脫氧核糖磷酸酯骨架能夠 被修飾以產(chǎn)生嗎啉核酸(其中各堿基部分與六元嗎啉環(huán)連接)或肽核酸(其中脫氧磷酸 酯骨架被假肽骨架替代，但四種堿基仍被保留)。例如參見Summerton and Weller(1997) Antisense NucleicAcid Drug Dev. 7 :187-195、禾口 Hyrup et. al. (1996) Bioorgan. Med. Chem.4:5-23。此外，脫氧磷酸酯骨架能夠被(例如)硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亞 磷酰胺(phosphoroaniidite)、或烷基磷酸三酯骨架所替代。
C.載體和宿主細(xì)胞 核酸(例如....匕面所述核酸)能夠被插入到用于在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體里。本文 中使用的"載體"是指復(fù)制子(例如,質(zhì)粒、噬菌體或粘粒)，可將另外的DM片段插入該載 體中以使該插入片段得以復(fù)制。此處所述的載體可以是表達(dá)載體。"表達(dá)載體"是指包含一 個或多個表達(dá)控制序列的載體。"表達(dá)控制序列"是指控制和調(diào)節(jié)另外的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和 /或翻譯的DNA序列。 可將載體中的核酸與一個或多個表達(dá)控制序列可操縱地連接。本文中使用的"可
14操作地連接"是指引入到基因構(gòu)建體中，使得表達(dá)控制序列有效地控制目標(biāo)編碼序列的表 達(dá)。表達(dá)控制序列的例子包括啟動子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。啟動子是一種表達(dá)控制序列， 由DM分子的、通常是轉(zhuǎn)錄起始位點( 一般接近于RNA聚合酶II起始位點)上游100個核 苷酸以內(nèi)的區(qū)域構(gòu)成。為了將編碼序列置于啟動子的控制下,必需將多肽的翻譯讀碼框的 翻譯起始位點置于啟動子下游1到約50個核苷酸之內(nèi)。增強(qiáng)子提供表達(dá)時間、位點和水平 方面的特異性。與啟動子不同，增強(qiáng)子當(dāng)其位于離轉(zhuǎn)錄位點不同的距離處時都能夠發(fā)揮功 能。增強(qiáng)子還能夠位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游。當(dāng)RNA聚合酶能夠?qū)⒕幋a序列轉(zhuǎn)錄成mRNA， 然后再被翻譯為由編碼序列編碼的蛋白的情況下，該編碼序列被認(rèn)為在細(xì)胞中是"可操作 地連接的"并且是"在表達(dá)控制序列的控制下"的。 合適的表達(dá)載體包括(但不限于)質(zhì)粒和病毒載體，這些質(zhì)粒和病毒載體源于 (例如)噬菌體、棒狀病毒、煙草花葉病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、牛痘 病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。許多病毒和表達(dá)系統(tǒng)是可以自公司商購的，如Novagen公 司(Madison， WI) 、 Clontech公司(Palo Alt.o， CA) 、 Strat.agene公司(La Jolla， CA)和 Invitrogen Life Technologies公司(Carlsbad, CA)。 表達(dá)載體可以包括標(biāo)簽序列。 一般,標(biāo)簽序列以具有被編碼的多肽的融合體形式 而得以表達(dá)。上述標(biāo)簽可以插入多肽中的任何地方，包括羧基或氨基末端。有用的標(biāo)簽的 例子包括(不限于)綠色熒光蛋白(GFP)，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、聚組氨酸、c-myc、血球 凝集素、FlagTM標(biāo)記(Kodak, New Haven, CT)、麥芽糖E結(jié)合蛋白以及蛋白A。在一個實施方 案中，B7-DC變體融合蛋白存在于包含編碼Ig重鏈恒定區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域的核酸的載 體中，所述結(jié)構(gòu)域優(yōu)選具有對應(yīng)于人免疫球蛋白C y 1鏈的鉸鏈區(qū)、&2區(qū)和CH3區(qū)的氨基酸 序列。 含有待表達(dá)的核酸的載體可以被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指其中可 以引入重組表達(dá)載體的原核和真核細(xì)胞。本文中使用的"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"包括通過各種技 術(shù)將核酸分子(例如,載體)引入細(xì)胞。盡管不限于特定的技術(shù)，但是許多這樣的技術(shù)是本 領(lǐng)域已經(jīng)建立的。原核細(xì)胞可以用核酸并通過(例如)電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn) 化?？梢酝ㄟ^包括(例如)磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿 孔法或顯微注射的技術(shù)將核酸轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中。宿主細(xì)胞(例如，原核細(xì)胞或真核 細(xì)胞(如CH()細(xì)胞))可被用于制備本文所述的B7-DC變體多肽。在一些實施方案中，宿主 細(xì)胞(例如抗原呈遞細(xì)胞)可用于表達(dá)本文公開的B7-DC變體多肽以將其呈遞至T細(xì)胞。
D.抗體 在Kohler and Milstein, Nature 256 :495-497 (1975)、美國專利No. 4， 376， 110、 Hartlow, E. et al. ， Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ， (1988) 、 Monoclonal Abt.ibodies and Hybridomas :A New Dimension inBiological Analyses, Plenum Press, New York, N. Y. (1980) .、 H. Zola， etal. ， in Monoclonal Hybridoma Antibodies -Techniques and Applications, CRC Press, (1982)中描述了單克隆抗體(mAb)及其制備方法和用途。 在Coligan， J. E. et al. ， eds， Current Protocols in Immunology,
Wiley-Interscience， New York 1991 (或現(xiàn)在的版本)、Butt.， W. R. (eds)Practical Immunoassay :The State of the Art, Dekker， N. Y. ，1984、 Bizollon, Ch. A. , eds，Monoclonal Antibodies and New Trends inlmmunoassays, Elsevier, N. Y. ，1984、 Butler， J. E. ， ELISA(29章)，In :van 0ss， C. J. et al. ， (eds) ， IMMUNOCHEMISTRY, Marcel Dekker， Inc. ， New York, 1994， pp. 759-803、 Butler, J. E. (eds) ， Immunochemistry of Solid—Phase Immunoassay, C:RC Press, Boca :Raton， 1991 、 Weintraub， B. ， Principles of Radioimmunoassays, Sevent.hTraining Course on Radioligand Assay Techniques, The EndocrineSociety， March,1986、 Work, T.S.et al. ， Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY， (1978) (Chapter by Chard, T.， "An Introduction to Radioi細(xì)uneAssay and Related Techniques")中描述了免疫測定方法。 例如，在Idiot.ypy in Biology and Medicine, Academic Press, NewYork， 1984 ; Immunological Reviews Volume 79，1984、I咖unologicalReviews Volume 90，1986、Curr. Top. Microbiol. ， Immunol. Volurael 19， 1985 ;Bona， C. et al. , CRC Grit. Rev. Immunol.， pp. 33-81 (1981) 、 Jerme， N K， Ann. Immunol. 125C :373-389 (1974) 、 Je潔，N K， In : Idiotypes—Antigens on the Inside, West.en_Schnurr， L， ed. ， EditionesRoche， Basel, 1982， Urbain, J. et al. , Ann. Immunol. 133D :179-(1982) 、 Rajewsky, K. et al. , Ann. Rev. I鵬uno:l.. 1 :569-607(1983)中描述了抗獨特型抗體。 本文中公開了與B7-DC的新型抗原表位反應(yīng)的單克隆和多克隆抗體，所述抗原表 位是在已知的B7族蛋白中不存在的?？贵w可能是異種基因型的、同種異型的、同型的、或 它們的修飾的形式,如人源化抗體或嵌合抗體。本發(fā)明還包括抗獨特型抗體,其對于獨特 型抗B7-DC抗體而言是特異性的。術(shù)語"抗體"是指包括含有抗原結(jié)合位點、并且能夠和 B7-DC抗原表位結(jié)合的完整分子及其片段。所述抗體包括Fab和F(ab')2片段，所述Fab和 F (ab') 2片段不包含完整抗體中的Fc片段，可更快地從體循環(huán)中清除，并可具有比完整抗體 更低的非特異性組織結(jié)合性(Wahl et al. ， J. Nuc. Med. 24 :316-325 (1983))。本發(fā)明還包括 Fv片段(Hochman, J. et a:l.. (1973) Biochemistry12 :1130-1135 ;Sharon， J. et al. (1976) Biochemistry 15 :159卜1594)。上述各種片段是用常規(guī)技術(shù)制備的，例如蛋白酶裂解法或 化學(xué)裂解法(參見，如Rousseaux et al. ， Meth. Enzymol. ， 121 :663-69 (1986))。
多克隆抗體從免疫的動物(如兔、山羊、嚙齒動物等)的血清中獲取，其可不經(jīng)過 進(jìn)一步處理而直接使用，或者可進(jìn)行常規(guī)的富集或純化方法，例如硫酸銨沉淀法、離子交換 層析法和親和層析法。 免疫原可包括完整B7-DC蛋白或其片段或其衍生物。優(yōu)選的免疫原包括人B7-DC 的胞外域(ECD)的全部或部分，其中所述這些殘基包含在天然B7-DC中發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾， 例如糖基化。含有胞外域的免疫原通過本領(lǐng)域已知的許多方法來制備，例如利用傳統(tǒng)的重 組方法表達(dá)克隆基因、從原始細(xì)胞分離、采用表達(dá)高水平B7-DC的細(xì)胞群獲得等。
單克隆抗體可使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)來制備，例如Kohler和Milst.ein提出的方 法(Nature, 256 :495-97(1975))和該技術(shù)的改進(jìn)方法(見上面的參考文獻(xiàn))。通過上述免 疫原免疫使動物(優(yōu)選小鼠)接觸抗原，從而在已接觸抗原的動物中產(chǎn)生所需的抗體應(yīng)答。 通常在促融劑(如聚乙二醇(PEG))的存在下，來自已接觸抗原的動物的淋巴結(jié)、脾或外周 血液中的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。F列多種小鼠骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種可用于 所述用途P3-NSl/卜Ag4-1、P3-x63-kOAg8. 653、Sp2/0-Agl4或HL1-653骨髓瘤細(xì)胞系(可得自ATCC， Rockville， Md.)。接下來的步驟包括在選擇性培養(yǎng)基中生長，使得未融合的親 本骨髓瘤細(xì)胞和供體淋巴球細(xì)胞最終死亡，而只有雜交瘤細(xì)胞存活。使它們克隆和生長，并 例如通過使用B7-DC融合蛋白的免疫分析技術(shù)來篩選它們的上清以確定所述特異性的抗 體的存在。陽性克隆通過(例如)有限稀釋法而亞克隆，并且將單克隆抗體分離出來。
可以運(yùn)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(通常參見Fink， et. al. ， Prog. Clin. Pathol. ，9 : 121-22(1954))在體外或在體內(nèi)(在腹腔積液中)來繁殖根據(jù)所述方法制備的雜交瘤。通 常，在培養(yǎng)基中繁殖單獨細(xì)胞系,可以通過傾析、過濾或離心來收獲含有高濃度的單一一種 單克隆抗體的培養(yǎng)液。 所述抗體可制備為單鏈抗體或scFv而不是通常的多聚體結(jié)構(gòu)。單鏈抗體是完整 Ig的尺寸的一部分，該單鏈抗體包括目標(biāo)Ig的高變區(qū)并且再造了天然Ig的抗原結(jié)合位點 (Skerra, A et al. (1988)Science,240 :1038-1041 ;Pluckthun， A et al. (1989)Methods Enzymol 178:497-515; ;Winter， G. et al. (1991) Nature, 349 :293-299)。在優(yōu)選的實施 方案中，通過使用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)來制備抗體。
E免疫原性組合物 疫苗需要強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答以消滅癌細(xì)胞和受感染的細(xì)胞。本文所述的B7-DC變體 可以作為疫苗的組分來施用，從而對T細(xì)胞提供共剌激信號。本文中公開的疫苗包含抗原、 B7-DC變體多肽源以及可任選的助劑和靶分子。B7-DC變體多肽源包括任何B7-DC變體多 肽、B7-DC變體融合蛋白、編碼B7-DC變體多肽或B7-DC變體融合蛋白的核酸、或者含有能 表達(dá)B7-DC多肽或B7-DC變體融合蛋白的載體的宿主細(xì)胞。
1.抗原 抗原可以是肽、蛋白、多糖、糖、脂類、核酸或其組合。所述抗原可以源自病毒、細(xì) 菌、寄生蟲、植物、原生動物、真菌、組織或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(如癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞)，并且可以 是完整細(xì)胞或其免疫原性成分,例如其細(xì)胞壁成分或分子成分。 合適的抗原是本領(lǐng)域已知的，其可得自經(jīng)營性的政府和科研機(jī)構(gòu)。在一個實施方 案中，抗原是完全滅活或減毒的生物體。這些生物體可以是傳染性生物體，例如病毒、寄生 蟲和細(xì)菌。這些生物體還可以是腫瘤細(xì)胞?？乖梢允茄苌阅[瘤、或病毒、或細(xì)菌的純化 或部分純化的多肽?？乖梢允峭ㄟ^在異源表達(dá)體系中表達(dá)編碼多肽抗原的DNA而制備的 重組多肽?？乖梢允蔷幋a全部或部分抗原蛋白的DNA。所述DNA可以是載體DM的形式， 如質(zhì)粒DNA。 抗原可以以單一一種抗原的形式來提供，也可以以組合形式提供。抗原還可以以
多肽或核酸的復(fù)合混合物的形式來提供。 I.病毒抗原 病毒抗原可以從任何病毒中分離，所述病毒包括(但不限于)來自下列病毒 科的任何病毒沙粒病毒科、動脈炎病毒科、星狀病毒科、桿狀病毒科、桿狀DNA病毒 (badnavirus)科、桿菌狀核糖核酸病毒科(barnaviridae)、雙RNA病毒科、雀麥鑲嵌病毒 科、布尼亞病毒科、杯狀病毒科、毛狀病毒、香石竹潛病毒、花椰菜花葉病毒、圓環(huán)病毒科、線 形病毒、豇豆花葉病毒科、冠狀病毒科(例如冠狀病毒，如嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)病 毒)、覆蓋噬菌體科、囊狀噬菌體科、S病毒、石竹屬病毒、耳突花葉病毒、絲狀病毒科(例 如，馬爾堡病毒和埃博拉病毒(例如扎伊爾株、萊斯頓株、象牙海岸株、或蘇丹株))、黃病毒科(例如丙型肝炎病毒、登革熱病毒1型、登革熱病毒2、登革病毒3和登革病毒4)、肝病毒 科、皰疹病毒科(如人皰疹病毒1、3、4、5和6、以及巨細(xì)胞病毒)、低毒性病毒科、虹彩病毒 科、光滑病毒科、脂毛噬菌體科、微小噬菌體科、正粘液病毒科(如流感病毒A、和B、和C)、 乳多空病毒科、副粘病毒科(如麻疹、腮腺炎、和人呼吸道合胞病毒)、細(xì)小病毒科、正鏈:RM 病毒科(如脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、嗜肝病毒和口蹄疫病毒)、痘病毒科(如牛痘和天花病 毒)、呼腸孤病毒科(如輪狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如慢病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV) 1 和HIV 2)、炮彈病毒科(例如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、披膜病毒科(例 如風(fēng)疹病毒、登革熱病毒等)和全病毒科。合適的病毒抗原還包括登革熱(Dengue)蛋白M、 登革熱蛋白E、登革熱D1NS1、登革熱D1NS2以及登革熱D1NS3中的全部或一部分。
病毒抗原可衍生自特定病毒株，如乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒(即單純皰疹1和2)、 肝炎病毒(例如，甲肝病毒(MV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV) 、 S 丁肝病毒(HDV)、 戊肝病毒(HEV)、和己肝病毒(HGV))、森林腦炎病毒、副流感病毒、帶狀皰疹、巨細(xì)胞病毒、 Epstein-Barr病毒、輪狀病毒、鼻病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、黃 熱病病毒、裂谷熱病毒和淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒。
ii.細(xì)菌抗原 細(xì)菌抗原可源自任何細(xì)菌，所述細(xì)菌包括(但不限于)放線菌、項圈藻、芽孢桿 菌、類桿菌、蛭弧菌、博德特氏菌屬、包柔氏螺旋體菌、彎曲菌、柄桿菌、衣原體、綠菌屬、著色 菌、梭狀芽胞桿菌、棒狀桿菌、嗜纖維菌、異常球菌屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、鹽桿菌 屬、螺旋桿菌屬、嗜血桿菌、B型嗜血流感桿菌(HIB)、生絲微菌屬、軍團(tuán)菌、鉤端螺旋體病細(xì) 菌、李斯特菌、A、 B和C型腦膜炎雙球菌、產(chǎn)甲垸菌(Melhanobacteri，)、小球菌、分枝桿菌 屬(Myobact.erium)、支原體、粘細(xì)菌、奈瑟菌、硝化桿菌、顫藍(lán)細(xì)菌、原綠藻(Prochloron)、 變形桿菌、綠膿桿菌、紅螺菌屬(Phodospirillum)菌、立克次體、沙門氏菌、志賀氏菌、螺旋 菌、螺旋體、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、鏈霉菌、硫化葉菌、嗜熱枝原體、硫桿菌、和密螺旋體、 霍亂弧菌、和耶爾森氏菌。
iii.寄生蟲抗原 寄生蟲抗原可得自寄生蟲，例如(但不限于)衍生自F列寄生蟲的抗原新型隱 球菌、組織胞漿菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、星狀諾卡氏菌、立氏立克次體(rickettsia rickettsii)、傷寒立氏立克次體、肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、惡性瘧原蟲、布 氏錐蟲、阿米巴、弓形蟲、陰道毛滴蟲和曼氏血吸蟲。這些抗原包括孢子蟲抗原、瘧原蟲抗原 (如環(huán)子孢子蛋白的部分或全部)、孢子蟲表面蛋白、肝期抗原、頂端膜相關(guān)蛋白、或裂殖子 表面蛋白。 iv.過敏原和環(huán)境抗原 抗原可以是過敏原或環(huán)境抗原，例如(但不限于)源自天然存在的過敏原的抗 原，例如花粉過敏原(樹、藥草、種子和禾本科草的花粉過敏原)、昆蟲過敏原(吸入性、 唾液和毒液過敏原)、動物毛發(fā)和皮屑過敏原和食物過敏原。來自樹、禾本科草、和藥草的 重要的花粉過敏原源自分類學(xué)中的殼斗目、洋橄欖目、松杉目和懸鈴木科，包括(但不限 于)樺木(白樺)、榿木(赤楊)、榛子(榛)、鵝耳櫪(鵝耳櫪屬)和橄欖(油橄欖)、雪松 (Cryptomeriaand刺柏)、法國梧桐(懸鈴木屬)；禾本目，包括(例如)稻禾科植物黑麥草、 梯牧草、早熟未、狗牙根、廳草屬、裸麥和高梁；菊目和蕁麻目，包括(但不限于)豚草屬藥草、艾屬藥草、和墻草屬藥草。其他可使用的過敏原抗原包括來自下列的過敏原中塵螨屬和歐塵螨屬塵螨、倉儲螨(例如L印idoglyphys、 Glycyphagus和Tyrophagus屬倉儲螨)、來自蟑螂、蛟和跳蚤(如小蠊屬、大蠊屬、黃色羽搖蛟和Ctenoc印phalides)的過敏原、來自哺乳動物(如貓、狗、馬、鳥)的過敏原、毒液過敏原(包括源于刺或叮咬昆蟲的那些，例如分類學(xué)的膜翅目的那些,包括蜜蜂(總科，蜜蜂科)、黃蜂(總科，胡蜂科)和螞蟻(總科，蟻總科))。其他可用的過敏原抗原包括來自真菌(例如鏈格孢菌菌屬和枝孢霉菌屬)的吸入型過敏原。 V.腫瘤抗原 抗原可以是腫瘤抗原，包括腫瘤相關(guān)或腫瘤特異性抗原,例如(但不限于)a _輔肌動蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、 P -連環(huán)素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-l、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶AS融合蛋白、IILA-A2、HLA-Al 1 、hsp70-2、 KIAA()2()5、 Mart2、 Mura-1 、2和3、 neo-PAP、 I類阻凝蛋白、OS-9、 pni:l -MR a融合蛋白、PTPRK、 K-ras、 N-ras、磷酸甘油醛異構(gòu)酶、Bage-l、 Gage 3、4、5、6、7、 GnTV、 Herv-K-mel、Lage-l、 Mage-A1、2、3、4、6、10、12、 Mage-C2、 NA_88、 NY_Eso_l/Lage_2、 SP17、 SSX_2、TRP2-Int2、 MelanA(MART-1) 、 gplOO(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、 TRP-2、 MAGE-1、 MAGE-3、BAGE、 GAGE-1、 GAGE-2、 pi5 (58) 、 CEA、 MGE、 NY-ESO(LAGE) SCP-1 、 Hora/Mel-40、 PRAME、 p53、H-Ras、HER-2,Zneu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、 IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、 TSP_180、脆GE-4、 MAGE-5、 MAGE-6、 pl85erbB2、pl80erbB-3、 c-met、 nm-23H1、 PSA、 TAG-72-4、 CA 19-9、 CA 72-4、 CAM 17. 1、 NuMa、 K-ras、0 -聯(lián)蛋白、CDK4 、 Mum-1 、 p 16 、 TAGE 、 PSMA 、 :PSCA 、 CT7 、端粒酶、43-9F、 5T4、 791 Tgp72 、 a -甲胎蛋白、13HCG、 BCA225、 BTAA、 CA 125、 CA 15-3 (CA27. 29\BCAA) 、 CA 195、 CA 242、 CA_50、CAM43、 CD68\KP 1、 C0_029、 FGF-5、 G250、 Ga733 (EpCAM) 、 HTgp-175、 M344、 MA_50、 MG7-Ag、M0V18、 NB\70K、 NY-CO-1、 RCAS1、 SDCCAG16、 TA-90 (Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C-相關(guān)蛋白)、TAAL6、 TAG72、 TL:P和TPS。
2.耙分子 在抗原呈遞細(xì)胞(B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC))的主要類型中，DC是最有效的，并且負(fù)責(zé)引起所有的抗原特異性免疫應(yīng)答。因此，靶向DC提供了增強(qiáng)抗原和抗原應(yīng)答的遞送的機(jī)會。 樹突狀細(xì)胞表達(dá)許多細(xì)胞表面受體,這些受體可以介導(dǎo)結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)吞作用。將異源抗原靶向在全身分布的抗原呈遞細(xì)胞--匕的表面分子能促進(jìn)抗原的攝入，因而克服了免疫和疫苗接種中的主要限速步驟。 靶向樹突狀細(xì)胞的分子包括對樹突狀細(xì)胞表面上顯示的抗原表位進(jìn)行識別和結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或它們的片段。靶向樹突狀細(xì)胞的分子還包括與樹突狀細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體。 一個這樣的受體是凝集素DEC-205，它已被在體外和在小鼠中使用，以將體液(基于抗體的)和細(xì)胞(CD8T細(xì)胞)的應(yīng)答加強(qiáng)2-4個數(shù)量級(I--Iawiger,et al. ， J. Exp. Med. ， 194(6) :769-79(2001) ;:Bonifaz， et a:l..,丄Exp. Med, 196 (12):1627-38(2002) ;Bonifaz， et al. ， J. Exp. Med， 199 (6) :815-24(2004))。在這些實驗中，抗原與抗DEC205重鏈融合，重組抗體分子被用于免疫。 許多其他的細(xì)胞內(nèi)吞受體(包括甘露糖特異性凝集素(甘露糖受體)和IgG Fc受體也以這種方式靶向，并且類似地增強(qiáng)抗原呈遞效率。能夠被靶向的其他合適的受體包 括(但不限于)DC-SIGN、33D1、 SIGLEC-H、 DCIR、 CDllc、熱激蛋白受體和清道夫受體。
其他能夠被靶向的受體包括Toll樣受體(TLR) 。 TLR對病原體相關(guān)的分子模式 (PAMP)進(jìn)行識別并結(jié)合。PAM:P靶向樹突狀細(xì)胞表面上的TL:R，繼而向內(nèi)部傳遞信號，從而有 力地提高DC抗原攝入、T細(xì)胞的成熟和T細(xì)胞剌激能力。與微粒表面連接或共包囊的PAMP 包括未甲基化CpG DNA(細(xì)菌)、雙鏈RNA(病毒)、脂多糖(細(xì)菌)、肽聚糖(細(xì)菌)、人脂阿 拉伯甘露聚糖(細(xì)菌)、酵母聚糖(酵母菌)、支原體脂蛋白(如區(qū)LP-2(細(xì)菌))、鞭毛蛋 白(細(xì)菌)、聚(肌酐胞苷)酸(細(xì)菌)、脂磷壁酸質(zhì)(細(xì)菌)、或咪唑并喹啉類物質(zhì)(合成 的)。 3.佐劑 可任選地,本文公開的疫苗可包含佐劑。佐劑可以是(但不限于)下面物質(zhì)中的 一種或多種油乳(例如弗氏佐劑)、皂苷制劑、病毒顆粒和病毒樣顆粒、細(xì)菌和微生物衍生 物、免疫剌激性寡核苷酸、ADP-核糖基毒素和解毒派生物、鋁佐劑、BCG、含礦物質(zhì)的組合物 (例如無機(jī)鹽，如鋁鹽和鈣鹽、氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等)、生物粘著劑和/或粘膜粘著 劑、微粒、脂質(zhì)體、聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑、聚磷腈、胞壁酰肽(murarnyl p印tide)、 咪唑并喹諾酮(iraidazoquino:[one)化合物、和表面活性物質(zhì)(例如，溶血卵磷脂、聚醚多元 醇、聚陰離子、多肽、油乳、鑰孔血藍(lán)蛋白、和二硝基酚)。 佐劑還可包括免疫調(diào)節(jié)物，例如細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素(例如IL-I、 IL-2、 IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如Y -干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞 死因子。除了 B7-DC變體多肽以外，還可施用其他的共剌激性分子，包括:B7族的其他多肽。 這樣的蛋白類佐劑可以以全長多肽或其活性片段、或者DNA的形式(如質(zhì)粒DNA)的方式來 提供。F.藥物組合物 本發(fā)明提供了包含B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、編碼B7-DC變體多肽和 融合蛋白的核酸、含有這些核酸的載體的藥物組合物。藥物組合物可通過口服、腸胃外(肌 肉、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)(IV)或皮下注射)、透皮(被動、或使用電離子透入療法或電穿孔法)、 透粘膜(鼻粘膜、陰道粘膜、直腸粘膜或舌下粘膜)的途徑施用，或者使用生物侵蝕性嵌入 物來施用，其可以被配制成適于各種施用途徑的劑型。在優(yōu)選的實施方案中，多肽以水溶 液的形式、特別是腸胃外注射的形式施用。通常，提供的藥物組合物包含有效量的B7-DC 變體多肽、融合蛋白、編碼它們的核酸、或其衍生物；以及可藥用的稀釋齊U、防腐齊U、增溶齊IJ、 乳化劑、佐劑和/或載體。所述組合物包含各種緩沖成分(例如，Tris-HC1、醋酸鹽、磷酸 鹽)的稀釋劑、pH:和離子強(qiáng)度的稀釋劑、添加劑(例如去垢劑和增溶劑(例如，吐溫2()、吐 溫80、聚山梨醇酯80))、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(硫柳汞、苯甲 醇)和填充劑(例如乳糖、甘露醇)，將這些材料摻入聚合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)的 微粒制劑或脂質(zhì)體中。還可使用透明質(zhì)酸。這樣的組合物可影響本發(fā)明蛋白和衍生物的物 理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除率。例如參見，Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990， MackPublishing Co. ， Easton， Pa. 18042)第1435-1712頁。i亥
組合物可制成液體形式或千粉(如凍千)形式。
1. 口服遞送
可配制B7-DC變體多肽、融合蛋白和編碼它們的核酸以用于口服遞送?？诜?體劑型在Remington ' s Pharmaceutical Sciences,18thEd. 1990(Mack Publishing Co.Easton Pa. 18042)第89章有一般性描述。固體劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、糖錠或 錠劑、扁囊劑、小丸劑、粉劑或顆粒劑。此外,脂質(zhì)體或類蛋白包囊可用于配制本發(fā)明組合 物(例如美國專利No.4，925，673中記載的類蛋白微球)?？墒褂弥|(zhì)體包囊，并且該脂 質(zhì)體可用各種聚合物衍生化(例如，美國專利No. 5， 013， 556)。可用于治療的固體劑型在 Marshall，K. In :ModernPharmaceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes第10章, 1979.中有所描述。通常，制劑包含A:BC運(yùn)輸配體(或其化學(xué)修飾的形式)、和惰性成分(其 為生物活性物質(zhì)提供抵抗胃部環(huán)境的保護(hù)、以及使之在腸道內(nèi)釋放)。 另一個實施方案提供口服施用的液體劑型，包括可藥用的乳劑、溶液、懸浮劑和糖 漿劑,所述液體劑型可包含其他成分，包括惰性稀釋劑；助劑,如潤濕齊U、乳化劑和懸浮齊U、 以及甜味劑、調(diào)味劑和香味劑)。 可對多肽拮抗劑進(jìn)行化學(xué)修飾以使該衍生物的口服遞送更加高效。通常，所考慮 的化學(xué)修飾是將成分分子本身與至少一個部分連接，其中所述部分允許(a)抑制蛋白水 解；和(b)從胃部和腸道吸收到血流。此外,合意的是,使一種或多種成分在體內(nèi)的總穩(wěn)定 性增加和循環(huán)時間延長。聚乙二醇化對于藥用而言是優(yōu)選的化學(xué)修飾。其他的可使用的 部分包括丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡 咯烷酮、聚脯氨酸、聚-l，3-二氧戊環(huán)和聚-l，3，6-三氧戊環(huán)(例如參見，Abuchowski and Davis (1981)〃 Soluble Polymer-Enzyme Adducts,〃 in Enzymes as Drugs. Hocenbergand Roberts, eds. (Wiley-]:nterscience :New York, N. Y.) 第367-383頁；禾口 Newraark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4 :185-189)。 對于口服制劑，釋放部位可以是胃部、小腸(十二指腸、空腸或回腸)、或大腸。本 領(lǐng)域技術(shù)人員己經(jīng)制得了這樣一種制劑，該制劑不在胃中溶解,但在腸道的十二指腸或其 他部位釋放藥物。優(yōu)選地，通過對肽(或衍生物)進(jìn)行修飾或在胃部環(huán)境外(如在腸道中) 來釋放肽(或衍生物)，從而避免胃部環(huán)境對藥物的破壞作用。 為了確保完全的胃部耐受性，在至少pH 5.0情況下不滲透的包衣是必要的。用作 腸溶包衣的更普通的惰性成分的例子有醋酸纖維素苯三酸酯(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰 苯二甲酸酯(HPMC:P)、 H:PMCP 50、 H:PMCP 55、聚醋酸乙烯酯鄰苯二甲酸酯(PVAP)、 Eudragit L30D、Aquateric、纖維素醋酸酯鄰苯二甲酸酯(CAP) 、Eudragit L、Eudragit S和蟲膠。這 些包衣可作為混合膜使用。 還可在那些沒有就抵抗胃部作用而進(jìn)行保護(hù)的片劑上使用包衣或包衣混合物。這 可包括糖包衣或者使藥片更易吞咽的包衣。膠囊由用于遞送干燥治療劑(例如粉末)的硬 殼(例如明膠)、或由可用于遞送液體形式治療劑的軟的明膠殼構(gòu)成。扁囊劑的殼材料可以
是粗淀粉或其他可食用紙。對于丸齊U、錠齊iJ、模制片或研制片劑而言，可以使用濕法成團(tuán)技術(shù)。 B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們(或衍生物)的核酸可以以作 為微細(xì)多顆粒的粒徑為約lmm的顆?；蛐⊥璧男问桨谥苿┲?。用于以膠囊劑施用的材 料的制劑也可以是粉末、輕微壓成的塞子、或甚至為片劑。這些治療劑可通過壓制來制備。
還可包含著色劑和/或矯味劑。例如，可(例如通過脂質(zhì)體或微球體包囊)配制sH4拮抗劑(或衍生物)，然后進(jìn)一步將之包含在可食用產(chǎn)品(例如含有著色劑和矯味劑的 冷凍飲料)中。 人們可以使用惰性材料稀釋B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們 (或衍生物)的核酸或增大它們的體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，特別是甘露醇、 a-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、經(jīng)修飾的葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可作為填料，包括 三磷酸f丐、碳酸鎂和氯化鈉。 一些市售稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress 禾卩Avicell。 在治療制劑中，固體劑型中可包含崩解劑。用作崩解劑的材料包括(但不限于)淀 粉，包括基于淀粉的市售崩解劑E鄧lotab。羥基乙酸淀粉鈉、安伯來特(Amberlit.e)、羧甲 基纖維素鈉、ultramylopectin、海藻酸鈉、明膠、橘皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤 土都可使用。崩解劑還可以是不溶性陽離子交換樹脂。粉末狀樹膠可用作崩解劑和粘結(jié)劑， 可包含的粉末狀樹膠例如為瓊脂、次梧桐膠或黃芪膠。褐藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。
粘結(jié)劑可用于將B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們(或衍生物) 的核酸粘連到一起以形成硬的片劑，所述粘結(jié)劑包括來自天然產(chǎn)品的材料，如阿拉伯樹膠、 黃芪膠、淀粉和明膠。其他的粘結(jié)劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)、以及羧甲基纖 維素(CMC)。聚乙烯吡咯垸酮(PV:P)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均可用在醇溶液中以使肽 (或衍生物)成粒狀。 sH4拮抗劑(或衍生物)的制劑中可包含減摩劑以避免在配制過程中的粘連。潤滑 劑可用作肽(或衍生物)與模具壁之間的夾層,這些潤滑劑可包括(但不限于)硬脂酸(包 括其鎂鹽和鈣鹽)、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可使用可溶性潤滑劑，例 如十二烷基硫酸鈉、十二垸基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇、Carb固x 4000和6000。
可以加入助流劑以改善在配制過程中藥物的流動性能和在壓制過程中幫助重新 排列。助流劑可包括淀粉、滑石、煅制二氧化硅、以及水合硅鋁酸鹽。 為了幫助肽(或衍生物)溶解到水性環(huán)境中，可加入表面活性劑作為潤濕劑。表面 活性劑可包括陰離子去垢劑，例如十二垸基硫酸鈉、丁二酸二辛基磺酸鈉和二辛基磺酸鈉。 可使用陽離子去垢劑，其包括苯扎氯銨或芐索氯銨。可含在制劑中作為表面活性劑的潛在 的非離子去垢劑有下列物質(zhì)聚桂醇400、聚氧基40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50 和60、甘油單硬脂酸酯、聚山梨酯2()、40、6()、65和8()、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基 纖維素。這些表面活性劑可單獨或作為混合物(不同配比的)存在于蛋白或衍生物制劑中。
能有力增強(qiáng)B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們(或衍生物)的核 酸的攝入的添加劑(例如)為脂肪酸，有油酸、亞油酸和亞麻酸。 控釋口服制劑是合乎人們需要的?？蓪7-:[)C變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或 編碼它們(或衍生物)的核酸摻入惰性基質(zhì)(例如樹膠)中，所述基質(zhì)允許通過(例如) 擴(kuò)散或浸出機(jī)理來進(jìn)行釋放。也可將緩慢降解的基質(zhì)加入制劑中。 一些腸溶包衣也具有延 遲釋放的作用?？蒯尩牧硪环N形式是通過基于Oros治療系統(tǒng)(Alza公司)的方法，即藥物 被封裝入半透膜中，由于滲透作用，所述半透膜允許水進(jìn)入而將藥物從單一的小孔擠出。
其他包衣也可用于制備制劑。這些包衣包括可在包衣鍋中應(yīng)用的各種糖類。B7-DC 變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們(或衍生物)的核酸也可以被制成薄膜包衣的 片劑的形式,在這種情形下使用的材料分為兩組。第一組是非腸溶材料,包括甲基纖維素、
22乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥甲
基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組為腸溶材料，其通常為鄰苯二甲酸酯。 材料的混合物可用于提供最佳薄膜包衣。薄膜包衣可在包衣鍋、或流化床、或通過
壓制包衣的方法來進(jìn)行。 2.腸胃外遞送 腸胃外施用的本發(fā)明的制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液或乳液。非水溶 劑或載體的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油和玉米油)、明膠和可注射的有 機(jī)酯(例如油酸乙酯)。這種劑型還可包含助劑,例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。它 們可(例如)通過下列方式來滅菌通過細(xì)菌截留性過濾器過濾、在組合物中加入滅菌劑、 對組合物進(jìn)行輻照、或加熱組合物。還可在使用前用無菌水、或一些其他的無菌注射用介質(zhì) 來即刻制備它們。
3.粘膜遞送 在直腸或陰道中施用的組合物優(yōu)選為栓劑，除了有效成分外,其可包含(例如)可 可油或栓劑蠟之類的賦形劑。在鼻腔或舌F施用的組合物也可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)賦形 劑來制備(見下文)。
適于(噴射或超聲)霧化器的制劑通常包含溶于水的肽(或衍生物)，其濃度為 約0. 1到25mg的生物活性蛋白/毫升溶液。該制劑還可包含緩沖劑和單糖(例如用于蛋 白的穩(wěn)定和滲透壓的調(diào)節(jié))。霧化配方還可包含表面活性劑以減少或防止在形成氣溶膠時 由于溶液的霧化而引起的表面誘導(dǎo)性肽(或衍生物)聚集。 用于計量吸入裝置的制劑通常包含微細(xì)粉末，其含有在表面活性劑幫助下懸浮在 噴射劑中的肽(或衍生物)。噴射劑可以是任何為此目的使用的傳統(tǒng)材料，例如氟氯化碳、 氯氟烴、氫氟烴、或烴(包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、1,1,1,2-四氟乙烷 或其組合)。合適的表面活性劑包括失水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表 面活性劑。 用于從粉末吸入裝置分配的制劑包括含有肽(或衍生物)的微細(xì)千粉，并且還包 含疏松劑(例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露糖)，其量足以促使粉末從裝置中分散，例如為制 劑的50重量％至90重量％。最有利的是，應(yīng)將B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、或 編碼它們(或衍生物)的核酸制成將它們最有效遞送至肺末梢的微粒形式，其平均粒徑為 小于10mm(或微米)，最優(yōu)選為0. 5mm至5mm。 [ons]5.聚合物基質(zhì) 盡管非生物降解性和生物降解性基質(zhì)都可用于B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合 蛋白、或編碼它們(或其衍生物)的核酸的遞送，但是生物降解性基質(zhì)是優(yōu)選的。該基質(zhì)可 以是天然或合成聚合物，但是由于合成聚合物具有更好的降解性和釋放性，因此其是優(yōu)選 的?；谒Ｍ尼尫艜r間來選擇聚合物。盡管在其他情況下脈沖式釋放或"大量釋放" 可提供更多的有效的結(jié)果，但是在一些情況下，線性釋放可能是最有用的。聚合物可以是水 凝膠的形式(通常最多吸收約90重量％的水)，而且可以可任選地用多價離子或聚合物交 聯(lián)。 可用于遞送的典型的合成聚合物包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚亞烷基二醇、 聚亞烷基氧化物、聚亞垸基對苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、 聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、和它們的共聚物,垸基纖維素、羥基烷基纖 維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯聚合物、甲基纖維素、乙基 纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、醋酸纖維素、丙酸纖維素、 纖維素醋酸酯丁酸酯、纖維素醋酸酯鄰苯二甲酸酯、羧乙基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素 硫酸鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基 丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸基酯)、聚(甲基丙烯酸十二 烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁 酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚(對苯二甲酸乙 二醇酯)、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。
非生物降解性聚合物的例子包括乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚(甲基)丙烯酸、聚酰 胺、其共聚物以及混合物。生物降解性聚合物的例子包括合成聚合物，如乳酸和乙醇酸的 聚合物、聚酸酐、聚(鄰)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-C『己內(nèi)酯)； 和天然聚合物，例如海藻酸和其他多糖，包括葡聚糖和纖維素、膠原蛋白、及其化學(xué)衍生物 (化學(xué)基團(tuán)(例如烷基、亞烷基)的取代、引入、羥基化、氧化和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使 用的修飾)、白蛋白和其他親水性蛋白、玉米醇溶蛋白和其他醇溶谷蛋白和疏水性水蛋白、以及其共聚物和混合物。通常，這些材料通過酶水解作用或在體內(nèi)通過與水接觸而引起的 表面或主體消融而降解。 特別令人感興趣的生物粘附性聚合物包括生物侵蝕性水凝膠(由H. S. Sawhney，
C. P. Pathak and J. A. Hubel 1 in Macromo:l.ecu:l.es， 1993， 26， 581-587所述)、聚透明質(zhì)酸、
酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸、殼聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲
基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、
聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯 酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)和聚(丙烯酸--卜八垸基酯)。 所述基質(zhì)可以是微粒的形式(例如微球或微囊的形式)，在所述微粒中肽分散于 固體聚合物基質(zhì)中，在所述微囊中核芯與聚合物殼的材料不同，肽分散或懸浮于核芯中，所 述核芯本質(zhì)上可以為液體或固體。本文中除非另有明確說明，否則微粒、微球和微囊可替換 地使用?；蛘?，可將聚合物澆鑄為薄的片或膜(納米至千厘米)，該聚合物也可以是通過研 磨或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的粉末，或者甚至可以是凝膠，如水凝膠。 可通過溶劑蒸發(fā)、噴霧千燥、溶劑萃取和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來形成 基質(zhì)。 生物侵蝕性微球可使用這樣的方法來制備，該方法為用于制備藥物遞送用微球 而開發(fā)的方法中的任意一種，例如由Mathiowit.z andLanger， J. Controlled Release 5, 13-22(1987)、Mathiowitz，et al. ，Reactive Polymers 6，275-283 (1987)、和Mathiowitz， et al. ， J. Appl. Polymer Sci. 35， 155-11A(198S)所述的方法。方法的選擇取決于聚合物的 選擇、尺寸、外部形態(tài)和所需的結(jié)晶性，例如由Mathiowitz， et al. , Scanning Microscopy 4,329-340(1990) 、 Mat.hiowitz， et al. J. Appl. Polymer Sci 45,125-134(1992)、以及 Benita，et al. ， J. Pharm. Sci. 73， 1721-1724 (1984)所述。在(例如)Mat.hiowitz， et al.， (1990) ， Benita和美國專利No. 4, 272, 398 (Jaffe)所述的溶劑蒸發(fā)方法中，將聚合物溶解 到揮發(fā)性有機(jī)溶劑中。向聚合物溶液中加入拮抗劑，所述拮抗劑為可溶性形式或分散為微 粒的形式,然后所得該混合物在含有表面活性劑(如聚乙烯醇)的水相中懸浮。攪拌所得 乳液，直到大多數(shù)有機(jī)溶劑蒸發(fā)并留下固體微球為止。通常，聚合物可溶于二氯甲烷。通過 此方法(其用于相對穩(wěn)定的聚合物,如聚酯和聚苯乙烯)，可獲得不同尺寸(1-1000微米) 和形態(tài)的微球。然而，不穩(wěn)定聚合物(如聚酸酐)由于暴露于水而可能降解，對于這些聚合 物，熱熔包囊法和溶劑去除法可能是優(yōu)選的。 在熱熔包囊法中，將聚合物首先熔融，然后再和B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合 蛋白、或編碼它們(或衍生物)的核酸的固體微?；旌?。將所得混合物混懸在不混溶的溶 劑(如硅油)中，在不斷攪拌下加熱至比所述聚合物的熔點高5"C的溫度。在乳液穩(wěn)定后， 將之冷卻直到聚合物微粒固化為止。將微球用石油醚通過傾析來洗滌，從而得到自由流動 的粉末。使用該方法可以獲得直徑在1至1000微米的微球。用此技術(shù)制備的球體的外表
面通常是光滑的和致密的。該方法可用于對水不穩(wěn)定的聚合物,但限于使用分子量在iooo
和50000之間的聚合物。溶劑去除法主要被設(shè)計用于聚酸酐。在該方法中，將B7-DC變體 多肽、B7-DC變體融合蛋白、或編碼它們的核酸分散或溶解在所選聚合物溶于揮發(fā)性有機(jī)溶 劑(如二氯甲烷)而得的溶液中。然后將該混合物懸浮在油(如硅油)中，通過攪拌以形 成乳液。在24小時內(nèi)所述溶劑擴(kuò)散到油相中，并且乳液滴硬化成固體聚合物微球。不同于
25溶劑揮發(fā)法，這種方法可用于用具有高熔點和寬范圍分子量的聚合物來制備微球。使用該 方法可以獲得直徑為卜300微米的微球。該球體的外部形態(tài)高度依賴于所使用的聚合物類 型。在噴霧干燥時,將聚合物溶解在二氯甲烷(0.04克/毫升)中。把已知量的活性藥物 懸浮(如果不溶)或共溶(如果可溶)在聚合物溶液中。然后將溶液或分散液進(jìn)行噴霧干 燥。根據(jù)美國專利No. 4， 861， 627 (Mathiowitz)可制備雙層微球。 通過下列方式，可由凝膠型聚合物(例如海藻酸鹽、或聚磷嗪、或其他二羧基聚 合物)制備水凝膠微球?qū)⒕酆衔锶芙庠谒芤褐?，然后將待摻入的材料混懸在混合?中，通過裝有氮氣噴嘴的微滴形成設(shè)備來將聚合物混合物擠出。將所得微球置于緩慢攪拌 的離子型淬火浴中，例如按照由Salib, et. al. ， Pharmazeut.ische Industrie 40-11 A， 1230 (1978)所述方式。殼聚糖微球可通過將聚合物溶解在酸性溶液中并與三聚磷酸鹽交聯(lián) 來制備。例如,羧甲基纖維素(CMC)微球通過將聚合物溶解在酸性溶液中并用鉛離子來沉 淀微球而制備?？芍苽浜Ｔ逅猁}/聚乙烯酰亞胺(PEI:)以減少海藻酸鹽微囊上的羧基量。
可使用溶劑或熔體澆鑄法、擠出法、以及制備復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備包括薄膜、 包衣、小丸、薄片和裝置在內(nèi)的其他遞送系統(tǒng)。如梭尼等描述，可通過將單體和肽首先混合、 然后使用紫外光使單體聚合來制備聚合物。聚合可在體外和體內(nèi)進(jìn)行。
II.制備方法
A. B7-DC變體多肽的制備方法 分離的B7-DC變體多肽可通過(例如)化學(xué)合成或在宿主細(xì)胞內(nèi)的重組生產(chǎn)來獲 得。為了重組生產(chǎn)共刺激性多肽，可用含有編碼多肽的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或轉(zhuǎn) 染細(xì)菌或真核宿主細(xì)胞(如昆蟲、酵母菌或哺乳動物細(xì)胞)。 一般來說,核酸構(gòu)建體包含調(diào) 控序列，該調(diào)控序列與編碼共剌激性多肽的核苷酸序列可操縱地連接。調(diào)控序列(本文中 也稱為表達(dá)控制序列)通常不編碼基因產(chǎn)物，而是影響與它們可操作地連接的核酸序列的 表達(dá)。 用于表達(dá)和生產(chǎn)多肽的有用的原核和真核系統(tǒng)是在本領(lǐng)域熟知的，例如包括大腸 桿菌菌株(如BL-21)和培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)。 在真核宿主細(xì)胞中，許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)B7-DC變體多肽?；?病毒的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的,其包括(但不限于)桿狀病毒、SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或者基 于水痘病毒的病毒載體。 利用具有合適的調(diào)控元件和選擇性標(biāo)志物的表達(dá)載體，可以制備對共剌激性變體 多肽進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞系。例如，真核細(xì)胞表達(dá)載體pCR3. l(Invitrogen Life Technologies)和p91023(B)(參見Wong，et al. (1985) Science 228 :810-815)適于在(例 如)中華鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、人類胚胎腎293細(xì)胞、NI:H3T3細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、 MDCK細(xì)胞、和人類血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中表達(dá)共剌激性變體多肽。在通過電穿孔法、脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、或者其他合適的轉(zhuǎn)染法來引入表達(dá) 載體后，可選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系(例如通過對G418、卡那霉素或潮霉素的抗生素耐受性來選 擇)?？蓪D(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使得目標(biāo)多肽被表達(dá)，并且所述多肽可從(例如)細(xì)胞培 養(yǎng)上清或裂解細(xì)胞中回收。或者，B7-DC變體多肽可通過下列方式制備(a)將擴(kuò)增序列連 結(jié)到哺乳動物表達(dá)載體，如pcDNA3(Invitrogen Life Technologies)中，和(b)在體外用 小麥胚芽提取物或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。
例如，使用層析法(如DEAE離子交換法、凝膠過濾法和羥基磷灰石層析法)，可以對共刺激性變體多肽進(jìn)行分離。例如，細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞質(zhì)提取物中的共刺激性多肽可以用蛋白G柱分離。在一些實施方案中，共刺激性變體多肽可以是"工程化的"以使其包含允許該多肽被親和基質(zhì)捕捉的氨基酸序列。例如，可以使用標(biāo)簽(如ciyc、紅血球凝聚素、聚組氨酸或Flag (Kodak))來幫助多肽的純化。這些標(biāo)簽可被插入多肽中的任何地方,包括羧基或者氨基末端。其他可用的融合體包括幫助檢測多肽的酶，如堿性磷酸酶。免疫親和層析法也可用于純化共刺激性多肽。
B.分離的核酸分子的制備方法 分離的核酸分子可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備，所述技術(shù)包括(但不限于)普通的分子克隆和核酸化學(xué)合成技術(shù)。例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可用于獲得對共刺激性變體多肽進(jìn)行編碼的分離的核酸。PCR是酶法擴(kuò)增目標(biāo)核酸的技術(shù)。通常，目標(biāo)區(qū)域末端或之外的序列信息可用于設(shè)計寡核苷酸引物，所述引物與待擴(kuò)增的模板互補(bǔ)鏈的序列是一致的。PCR可用于擴(kuò)增DNA和RNA中的特定序列，包括全部基因組DNA或全部細(xì)胞RNA中的序列。通常，引物長度為14個到40個核苷酸，但其長度可以是IO個到幾百個核苷酸。通用的PCR技術(shù)在(例如)PCR Primer :A Laboratory Manual, ed. byDieffenbach and Dveksler，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995中有所描述。當(dāng)使用:RM作為模板來源時，反轉(zhuǎn)錄酶可用于合成互補(bǔ)DNA(cDNA)鏈。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增法、自我維持序列復(fù)制法、或基于核酸序列的擴(kuò)增法也可用于獲得分離的核酸。例如參見Lewis (1992)Genetic Engineering News 12:1 ;Guatelli et al. (1990)Proc. Natl Acad. Scl USA 87:1874-1878和Weiss(1991)Science254 :1292-1293。 分離的核酸可以是化學(xué)合成的單種核酸分子或者 -系列寡核苷酸(例如使用亞磷酰胺法沿3'到5'方向自動合成DNA)。例如，可合成一對或多對包含所需序列的長鏈寡核苷酸(例如，> 100核苷酸)，其中每對包含互補(bǔ)性的短片段(例如約15個核苷酸)，使得在寡核苷酸對退火時形成雙鏈?？捎肈M聚合酶來延伸寡核苷酸，從而每個寡核苷酸對產(chǎn)生單鏈、雙鏈核酸分子，然后可將其連接到載體上。分離的核酸還可通過誘變獲得?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)使編碼B7-DC的核酸突變，所述技術(shù)包括通過PCR的寡核苷酸定向誘變禾口 /或定點誘變。參見Short Protocols in Molecular Biology. Chapter 8, GreenPublishing'Associates and John Wiley & Sons, Au sub el et al. 1992。可被修飾的氨基酸位置的例子包括本文中所描述的那些。
III.使用方法
A. T細(xì)胞的共刺激 B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白、編碼B7-DC變體多肽或B7-DC變體融合蛋白的核酸、或表達(dá)B7-DC變體多肽的細(xì)胞可用于T細(xì)胞的共剌激(即增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、刺激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、和/或促進(jìn)T細(xì)胞的存活)。 B7-:[)C可與:PD-1 (程序化細(xì)胞死亡-1)結(jié)合，所述PD-1為CD28同系物，其具有免疫受體酪氨酸基抑制性模體(motifinits)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Ishida et al. (1992)EMBO J. 11 :3887-3895) 。 PD-1在胸腺細(xì)胞亞群上表達(dá)，并且對T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞在其活化后具有上調(diào)作用(Agata,et al. ， Int. Immunol. ,8 :765-772 (1996)) 。 PD-1在體內(nèi)表現(xiàn)為免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)物。例如，具有C57BL/6背景的PD-1+小鼠慢慢患上狼瘡樣腎小球性腎炎和進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(Nishimura，et al. ， Immunity, 11 :141-151 (1999))。另外，具有BALB/c背景的PD-1+小鼠迅速患上致命的自體免疫性擴(kuò)張性心肌病(Nishimura， et al. ， Science. 291 :
319-322 (2001))。然而，證據(jù)還表明B7-DC可以具有共剌激T細(xì)胞應(yīng)答的功能。在次優(yōu)TCR信號的存在下，B7-DC可以在體外剌激T細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，看來B7-DC還與除了 PD-1之外的其他T細(xì)胞受體結(jié)合。下面實施例中描述的實驗說明了 B7-DC和本文中所述的B7-DC變體的共刺激活性不受PD-1受體的介導(dǎo)。 與野生型B7-DC相比，本文所述B7-DC變體對于PD-1的親和結(jié)合性降低，但仍保留共剌激T細(xì)胞的能力。因此，本文所述B7-DC變體保留了它們共剌激T細(xì)胞的能力，并具有降低的通過與PD-1結(jié)合來抑制T細(xì)胞活化的能力。因此就共刺激T細(xì)胞而言，這些B7-DC變體優(yōu)于野生型B7-DC。本文公開了使用對PD-1的親和性降低的B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白來刺激T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括使分離的共刺激性變體多肽與T細(xì)胞接觸。該接觸可以在體外、離體或體內(nèi)(例如，在哺乳動物中，如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬、非人靈長類、或人)接觸。 接觸可以在T細(xì)胞活化之前、之中、或之后進(jìn)行。通常，共刺激性變體多肽與T細(xì)胞接觸可以基本與活化同時進(jìn)行?；罨梢允?例如)使T細(xì)胞暴露于與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的抗體，或暴露于與TCR物理相關(guān)的CD3復(fù)合物多肽中的一個?？蓪細(xì)胞暴露于(例如)APC[例如，交錯樹突狀細(xì)胞(本文中稱為樹突狀細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞或B細(xì)胞]上的同種異體抗原(如MHC同種抗原)，或者暴露于抗原性肽,所述抗原性肽通過上述APC中的任意一種加工蛋白抗原，并且通過APC表面上的MH:C分子呈遞至T細(xì)胞而獲得。T細(xì)胞可以是CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。 在一些實施方案中，分離的共剌激性變體多肽可直接施用于T細(xì)胞。或者，可用包含編碼共刺激性變體多肽的核苷酸序列的核酸所轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染APC(例如，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、交錯樹突狀細(xì)胞(本文中稱為樹突狀細(xì)胞)或B細(xì)胞)。被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以是這樣--種細(xì)胞或該細(xì)胞的后代，其中該細(xì)胞是在被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染之前從受試者(將被施用該被轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)或其他的受試者(例如，同種的其他的受試者)中獲得的。 B7-I)C變體多肽可以是本文所述的那些中的任意一者,包括所公開的氨基酸改變、多肽片段、融合蛋白及其組合中的任意一者。 如果在體外活化，B7-DC變體分子可結(jié)合到相關(guān)培養(yǎng)皿底部，例如塑料微量滴定板的孔底。 體外應(yīng)用分離的共剌激性變體多肽(例如)在下列方面可以是有用的免疫機(jī)理的基礎(chǔ)科學(xué)研究，或者用于在T細(xì)胞功能的研究中使用的活化的T細(xì)胞的制備，或者(例如)被動免疫治療。另外，可將B7-DC變體多肽添加到體外分析(例如T細(xì)胞增殖分析)中，其中所述分析被設(shè)計用來測試目標(biāo)抗原在受試者(從其中獲得T細(xì)胞)中的免疫性的。向這樣的分析中加入共刺激性變體多肽期望產(chǎn)生更強(qiáng)、因此更易檢測的體外應(yīng)答。此外，B7-DC變體多肽或用編碼該多肽的核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的APC可以(a)在分析中用作陽性對照以測試其他分子的共刺激活性；或者(b)用于對能抑制T細(xì)胞共刺激性的化合物(例如,具有治療自體免疫性疾病或器官移植排斥的潛在用途的化合物)的篩選分析。
B. B7-DC變體的治療用途
1.待治療的病癥 本文提供的B7-DC變體多肽通?？稍隗w外和離體用作刺激免疫應(yīng)答的治療藥物。通常,本文所述的組合物用于治療這樣的受試者,所述受試者具有或傾向于具有使受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何疾病或病癥。B7-DC變體多肽共刺激T細(xì)胞的能力使得所公開的組合物可用于刺激或增強(qiáng)T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答。因此，在優(yōu)選的實施方案中，待治療或預(yù)防的疾病類型是惡性腫瘤或由侵入細(xì)胞內(nèi)并受到(例如)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞攻擊的細(xì)菌、病毒、原生動物、蠕蟲、或其他微生物病原體引起的慢性傳染病。使用本文所述的B7-DC變體組合物進(jìn)行T細(xì)胞的共刺激對于治療或預(yù)防以免疫抑制為特性的病癥也是有利的。 i.病毒感染 因為病毒感染主要由T細(xì)胞清除,所以T細(xì)胞活性增強(qiáng)可用于治療這樣的情形，其中更快速或徹底地清除感染性病毒劑對于動物或人受試者而言是有益的。因此,可給受試者施用B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白以治療局部或全身性病毒感染，包括(但不限于)免疫缺陷性病毒(如HIV)、乳頭瘤病毒(如HPV)、皰疹病毒(如HSV)、腦炎病毒、流感病毒(如人流感病毒A)和普通感冒病毒(如人鼻病毒)感染。例如，可局部施用由B7-DC組合物要素制成的藥劑以治療病毒性皮膚病，例如皰疹病變、或帶狀皰疹、或生殖器疣。還可施用由B7-DC變體組合物制成的藥劑以治療全身性病毒疾病，包括(但不限于)AIDS、流感、普通感冒或腦炎。
ii.癌癥 B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白和編碼它們的核酸可用于誘導(dǎo)對腫瘤的免疫。例如，可將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行工程改造以使其攜帶編碼本文所述的B7-DC變體多肽或B7-DC變體融合蛋白的核酸、然后將該腫瘤細(xì)胞施用給受試者以規(guī)避(traverse)受試者中的腫瘤特異性耐受，其中所述腫瘤細(xì)胞包括(但不限于)肉瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、或癌細(xì)胞。特別地，B7-1在B7陰性小鼠腫瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)，已顯示出可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異免疫性，并且顯示出在小鼠中伴隨有對腫瘤排斥和對抵抗腫瘤攻擊的保護(hù)延長(L. Chen et al.，見上文；S. Townsend etal.,見上文；S. Baskar et al.，見上文)。利用B7相關(guān)因子的腫瘤或癌細(xì)胞基因療法的治療方案，可在動物試驗中進(jìn)行模擬(參見K. Dunussi-Joannopoulos et al. (1997) J. Pediat.r. Hematol.Oncol. 19 :356-340 ;K. Hiroishi et. al. (1999)Gene Ther. 6 :19884994 ;B. K. Martin etal. (1999) J. Immunol. 162 :6663-6670 ;M. Kuiper et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 465 :381-390)，或在人I期臨床試驗中進(jìn)行模擬(H. L. Kaufman et al. (2000) Hum. GeneTher. 11 :1065-1082)，其中該I期臨床試驗利用B7-1或B7-2進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移治療。應(yīng)理解這些方法可適用于各種腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。另外，通過施用直接刺激免疫細(xì)胞的B7-DC變體多肽或B7-DC變體融合蛋白，可完成腫瘤免疫。 可被治療的惡性腫瘤在本文中根據(jù)組織(腫瘤衍生自該組織)的胚胎來源來進(jìn)行分類。癌是源自內(nèi)胚層或外胚層組織(例如皮膚或內(nèi)部器官和腺體的上皮層)的腫瘤。不經(jīng)常發(fā)生的肉瘤源于中胚層結(jié)締組織，例如骨骼、脂肪和軟骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血細(xì)胞的惡性腫瘤。白血病以單細(xì)胞形式增殖，而淋巴瘤趨向于以腫瘤團(tuán)塊形式生長。惡性腫瘤可在機(jī)體的很多器官或組織中出現(xiàn)并發(fā)展為癌癥。 可用本發(fā)明所提供的組合物和方法治療的癌癥類型包括(但不限于)下面的癌 膀胱癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、食道癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前 列腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌等。本發(fā)明組合物的施用不限于對已生成的腫瘤或感染性疾 病的治療，其還可用于預(yù)防或降低個體形成這類病癥的風(fēng)險，即用于預(yù)防用途。預(yù)防性免 疫接種的可能候選人群包括高?；及﹤€體，即有某種類型癌癥歷史的個人或有家族史的個 人。 iii.免疫抑制病癥 B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白可用于治療以免疫抑制為特征的疾病病
癥，包括(但不限于)AIDS或AIDS相關(guān)綜合癥、其他病毒或環(huán)境誘導(dǎo)的病癥、和某些先天性
免疫缺陷。B7-DC變體多肽和B7-DC變體融合蛋白還可用于提高由于使用免疫抑制性藥物
(例如某些化療劑)的放射療法而削弱的免疫功能，因此當(dāng)與所述藥物或放射療法結(jié)合使
用時是特別有用的。 2. B7-DC變體在疫苗中的用途 B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白和/或編碼它們的核酸可單獨被施用，或與 其他合適的治療手段聯(lián)合施用。在一個實施方案中，B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白 和/或編碼它們的核酸可與疫苗組合物聯(lián)合施用或作為疫苗組合物的成分來施用。合適的 疫苗組合物成分在下文描述。本文所述的B7-DC變體組合物可在疫苗施用前、同時、或之后 施用。在一個實施方案中，B7-DC變體組合物在施用疫苗的同時施用。
本文所述的B7-DC變體組合物可與預(yù)防性疫苗聯(lián)合施用，其使受試者在隨后暴露 于傳染性物體時被賦予耐受性，或者與治療性疫苗聯(lián)合施用，其可用于引發(fā)或增強(qiáng)受試者 對于預(yù)先存在的抗原(例如癌癥受試者中的腫瘤抗原或感染病毒的受試者中的病毒抗原) 的免疫應(yīng)答。 預(yù)防性、治療性或去敏性免疫應(yīng)答的所需結(jié)果可根據(jù)疾病的不同、根據(jù)本領(lǐng)域熟 知的原則而改變。例如，針對傳染性物體的免疫應(yīng)答可完全地預(yù)防傳染性物體形成集落和 復(fù)制、趨向"無菌免疫"和沒有任何疾病癥狀。然而，如果抗傳染性物體的疫苗減少了癥狀 的數(shù)量、減輕癥狀的嚴(yán)重性或縮短了癥狀的持續(xù)時間；或者如果減少了具有癥狀的人群中 的個體數(shù)量；或者減緩傳染性物體的傳播,那么其可被認(rèn)為是有效的。類似地,針對癌癥、過 敏原或傳染性物體的免疫應(yīng)答可以是完全使疾病得以治療，或者是減輕了癥狀，或者是使 疾病在整個治療千預(yù)中的一個方面得以治療或減輕。例如，為了有效地治療，針對癌癥的免 疫應(yīng)答的刺激可與外科手術(shù)、化療、放療、激素和其他免疫手段結(jié)合。
C. B7-DC變體多肽的施用方法 在體內(nèi)實施的一些方法中，將治療有效量的B7-DC變體多肽或B7-DC變體融合蛋 白本身施用于受試者。典型地，可將多肽懸浮于可藥用的載體中。可藥用的載體是生物相容 性載體(例如，生理鹽水)，其適于施用給人。治療有效量是能夠在治療的動物中產(chǎn)生所需 醫(yī)學(xué)效果(即增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答)的共刺激性變體多肽的量。B7-DC變體多肽和B7-I)C變體 融合蛋白可口服、或靜脈滴注、或者皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、 胃腸道內(nèi)、氣管內(nèi)、或肺內(nèi)施用?？蓪⒐藏菁ば宰凅w多肽直接遞送至合適的淋巴組織(例如 脾臟、淋巴結(jié)、或粘膜相關(guān)的淋巴組織)。
D.核酸和細(xì)胞的施用方法 可將編碼B7-DC變體多肽或融合蛋白的核酸施用于需要的受試者。核酸遞送包 括將"外源"核酸引入到細(xì)胞、并使之最終進(jìn)入活的動物中。幾種通用的基因治療的策略已 有深入的研究和綜述(Yang, N-S. , Crit. Rev. Biotechnol. 12 :335-356(1992) ;Anderson， W.F. ，Science 256:808-813(1992) ;Miller， A. S. , Nature 357:455-460(1992) ;Crystal， R. G. ， Amer. J. Med. 92(s卿l 6A) :44S—52S (1992) ;Zwiebel， J. A. et al. ， Ann. N. Y. Acad. Sci. 618 :394-404(1991) ;McLachlin, J. R. etal. , Prog. Nuc. Acid Res. Molec. Biol. 38 : 91-135(1990) ;Kohn, D. B. etal. , Cancer Invest. 7 :179-192(1989)。 —種途徑包括將核酸轉(zhuǎn)移到被培養(yǎng)的原代細(xì)胞中、接下來將離體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者 全身性地自體移植到宿主中或自體移植到宿主的特定器官或組織中。在一個實施方案中， 將包含編碼B7-DC變體多肽的核酸的載體轉(zhuǎn)染到待施用給需要的受試者的細(xì)胞中。在優(yōu)選 的實施方案中，含有所述載體(其含有編碼B7-DC變體多肽的核酸)的細(xì)胞是抗體呈遞細(xì) 胞。 離體法可包括(例如)下列步驟從受試者中收集細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、用表達(dá)載體轉(zhuǎn) 導(dǎo)它們、并將細(xì)胞保持在適于本文提供的共刺激性變體多肽表達(dá)的條件下。這些方法在分 子生物學(xué)領(lǐng)域中是已知的。轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟可通過用于離體基因治療的任何的標(biāo)準(zhǔn)方式來完成， 包括(例如)磷酸鈣法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、病毒感染法、和基因槍轉(zhuǎn)移法。此外，也 可以使用脂質(zhì)體或聚合物微粒。然后可選擇已成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，例如以用于編碼序列或耐 藥基因的表達(dá)。接著，可對所述細(xì)胞進(jìn)行滅活照射(如果需要)并注射或移植入受試者中。
在一些離體方法中，外周血單核細(xì)胞(P:BMC)可從患者或合適的供體中提取，并離 體暴露于活化刺激物(見前)和共剌激性變體多肽(無論是可溶性形式還是依照標(biāo)準(zhǔn)法附 著在市售承載體....匕)。接著，可將該包含PBMC的高度活化的T細(xì)胞引入同一或不同的患者 中。 一個可選擇的離體策略可包括用編碼B7-DC變體多肽的核酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得自受 試者的細(xì)胞。然后，將被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞輸回到受試者中。雖然所述細(xì)胞通常是造血細(xì) 胞(例如，骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞)，但它們還可以是很多類 型細(xì)胞中任意一種，包括(但不限于)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或肌 肉細(xì)胞,其中它們起到B7-DC變體多肽源的作用，只要它們在受試者中存活即可。造血細(xì) 胞(包括上述的APC)的使用可以是特別有用的，因為相比于其他細(xì)胞，通常認(rèn)為這些細(xì)胞 與淋巴組織(例如淋巴結(jié)或脾臟)是同源的，因此B7-DC變體多肽可在其發(fā)揮作用(即增 強(qiáng)免疫應(yīng)答)的位點處以較高濃度產(chǎn)生。此外，如果使用APC,則表達(dá)外源共刺激性變體分 子的APC可與將同種抗原或抗原性肽呈遞給相關(guān)T細(xì)胞的APC是相同的。B7-DC變體可由 APC分泌或者在其表面上表達(dá)。 可通過在體內(nèi)將功能活性DNA直接轉(zhuǎn)移到哺乳動物體組織或器官中來完成核酸 治療。例如，可將編碼B7-DC變體多肽的核酸直接施用于淋巴組織?；蛘撸墒褂昧馨徒M織 特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(T啦(例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞特異性T啦來完 成對淋巴組織特異性的靶向。淋巴組織特異性TRE包括(例如)本領(lǐng)域熟知的那些(例如 參見Thompson et al. (1992)Mol Cell. Bio112 :1043-1053 ; ;Todd et al. (1993) J. Exp. Med 177 :1663—1674 ;和Penixet al. (1993)J Exp. Med. 178 :1483-1496)。
DNA轉(zhuǎn)移可使用下面描述的各種方法來完成?？赏ㄟ^使用可選擇的標(biāo)志物(例如，G418抗性標(biāo)志物)在體外測試這些系統(tǒng)是否進(jìn)行成功表達(dá)，以選擇出表達(dá)DNA的轉(zhuǎn)染的克隆，接著以合適的免疫分析法使用產(chǎn)物的抗體來檢測B7-H4表達(dá)產(chǎn)物的存在(在可誘導(dǎo)系統(tǒng)的情況下在用誘導(dǎo)劑處理之后進(jìn)行)。通過使用已知的方法將質(zhì)粒DNA線性化和使用高分子量哺乳動物DNA作為"載體"進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,可以提高工序的效率，包括DNA攝入、質(zhì)粒整合和整合質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 本領(lǐng)域報道的成功"基因轉(zhuǎn)移"的例子包括(a)將質(zhì)粒DNA直接注射到小鼠肌肉組織中，這導(dǎo)致標(biāo)志物基因無限期表達(dá)(Wolff, J.A. et al. ， Science 247 :1465(1990);Acsadi，G. et al. ， The NewBiologist 3 :71 (1991)) ; (b)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對于血管組織的體內(nèi)和原位感染是有效的；(c)將逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑通過門靜脈注射和直接注射到肝臟，從而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和在體內(nèi)表達(dá)(Horzaglou， M. et al. , J. Biol. Chem. 265 :17285(1990);Koleko， M. et al. ， Human GeneTherapy 2 :27(1991) ;Ferry， N. et al. , Proc. Natl. Acad.Sci.USA88 :8387(1991)) ; (d)將重組腺病毒通過氣管內(nèi)灌注而注入到肺組織中，這對外源基因在肺呼吸....匕皮細(xì)胞中的體內(nèi)轉(zhuǎn)移和延長表達(dá)是有效的(Rosenfeld， M. A. et al.，Science 252 :431(1991) ; (e)單純皰疹病毒載體在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到腦組織(Ahmad， F. etat, eds， Miami Short:R印orts—Advances in Gene Technology :The Molecular BiologyofHuman Genetic Disease, Vol 1，Boerringer Manneheim Biochemicals，USA，1991)。
人逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)療法利用了復(fù)制缺陷型雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(Temin， H. M.，Human Gene Therapy 1:111(1990) ;Temin et al.,美國專禾lj No. 4， 980， 289 ;Temin etal.，美國專利No. 4， 650， 764 ;Temin etal.，美國專利No. 5， 124,263 ;Wills，J. W.美國專利No. 5， 175， 099 ;Miller， A. D.,美國專利No. 4， 861， 719)。所述載體已被用于將功能性DNA引入人細(xì)胞或組織中，例如，將腺苷脫氨酶基因引入淋巴細(xì)胞中，將NPT-II和腫瘤壞死因子基因引入腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中。逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移一般需要進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的靶向細(xì)胞能增殖(Miller, I). G. et al. ,MoL Cell. Biol 10:4239(1990))。通過某些優(yōu)選的靶向細(xì)胞(其中待引入本發(fā)明的DNA分子)、即主動生長的腫瘤細(xì)胞來滿足該條件。通過使用各種方法中任意一種進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)染對囊腫性纖維化的基因治療在美國專利No. 5， 240， 846 (Collins et al.)中有所描述。 可用包裝細(xì)胞系將編碼B7-I)C變體多肽或融合蛋白的核酸分子包裝到逆轉(zhuǎn)錄病
毒載體中，所述包裝細(xì)胞系產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，這在本領(lǐng)域是熟知的(例如參見Cone， R. D. et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6349-6353 (1984) ;Mann， R. F. et al.，Cell 33:153-159 (1983) ;Miller, A. D. et al. , Molec. Cell. Biol. 5 :43H37 (1985),Sorge， J. ， et al. ， Molec. Cell. Biol. 4 :1730—1737(1984) ;H:ock， :R. A. et al. ， Nature32():257(1986) ;Miller，A. D. et. at，Molec. Cell. Biol. 6 :2895-2902 (1986))。對于基因轉(zhuǎn)移而言高效和安全的新型包裝細(xì)胞系也已有描述(Bank et al.，美國專利No. 5， 278， 056)。
該方法可以以位點特異性方式將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送至所選擇的組織或器官。因此，例如，可以使用導(dǎo)管遞送系統(tǒng)(Nabel， EG et a:l.. ， Science 244:1342(1989))。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或脂質(zhì)體載體的這類方法特別適用于將待表達(dá)的核酸遞送至血管壁，或腫瘤的血液循環(huán)中。 還可使用其他的病毒載體,包括用于神經(jīng)細(xì)胞特異性遞送和持久性遞送的重組腺病毒(Horowitz, M. S. ， In :Virology， Fields, BN etal. ， eds， Raven Press, New York,1990， p. 1679 ;Berk證，K丄，Biotechniques 6 :616919(1988) ， Str雄s， S. E. ， In :TheAdenoviruses, Ginsberg, HS， ed. , Plenum Press, New York, 1984， chapter 11)、單純皰疹
病毒(h:sv)。腺病毒載體在人基因治療中的優(yōu)勢包括以下事實重組是罕見的，沒有人惡
性腫瘤已知是與該病毒有關(guān)的，腺病毒基因組是雙鏈DNA，其可被操作以容納大小最多為7. 5kb的外源基因，并且活腺病毒是安全的人疫苗生物體。腺相關(guān)病毒也可用于人的治療(Samulski， R. J. et al. ， EMBO J. 10 :3941 (1991))。 其他可表達(dá)本文所公開的DM分子并且可在本發(fā)明的治療方案、特別是人中使用的載體是呈現(xiàn)非復(fù)制性的牛痘病毒(美國專利No. 5， 225， 336、5， 204， 243、5， 155， 020、4， 769， 330 ;Sutt.er， G et. al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 :10847-10851 ;Fuerst.，T.R.et al. , Proc. NatlAcad. Sci USA (1989) 86 :2549-2553 ;Falk證F. G. et al.;Nucl. AcidsRes (1987) 15 :7192 ;Chakrabarti， S et at, Molec. Cel丄Biol. (1985)5 :3403-3409)。包含異源DNA的重組牛痘病毒和其他病毒以及它們在免疫和DNA治療中的用途在下列文獻(xiàn)中有所綜述Moss， B. ， Curr. Opin. Genet. Dev. (1993)3 :86-90 ;Moss，B.Biotechnology(1992) 20 :345-362 ;Moss， B. ， Curr Top Microbiol Immunol(1992) 158 :25-38 ;Moss, B. ， Science(1991) 252 :1662-1667 ;Piccini， A et al. ， Adv.VirusRes.(1988) 34 :43-64 ;Moss， B. et al. ， Gene Amplif Anal (1983) 3 :20卜213。
除了裸露的DNA或RNA或病毒載體，還可以使用工程改造的細(xì)菌作為載體。有大量菌株，包括沙門氏菌、BCG和單核增生李斯特氏菌(LM) (Hoiseth&Stocker， Nature291,238—239(1981) ;Poirier， TP et al. J. Exp. Med. 168，25—32(1988) ;(Sadoff， J. C， etal. ， Science240，336-338 (1988) ;Stover， C. K. ， et al. ， Nature 351，456-460 (1991);Aldovini， A. et al. ， Nature 351,479-482(1991) ;Schafer， R. ， et al. ， J. Immunol. 149，53-59(1992) ;Iko謹(jǐn)idis， G. et al. ，J. Exp. Med. 180， 2209-2218 (1994))。這些生物體表現(xiàn)
出作為疫苗載體的兩個有前途的特性(l)腸道感染途徑提供了疫苗口服遞送的可能性；(2)對單核細(xì)胞Z巨噬細(xì)胞感染，從而將抗原靶向?qū)ｉT的APC。 除了體內(nèi)的由病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，本領(lǐng)域熟知的物理方法也可用于DNA直接轉(zhuǎn)移，包括質(zhì)粒DNA的施用(Wolff et al. ， 1990,見上文)和微粒轟擊介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Yang,N. —S. , et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :9568(1990) ;Williaras， R. S. et al. ， Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:2726(1991) ;Zelenin， A. V. et. al. ， FEBS Lett. 280 :94 (1991);Zelenin，A.v. et al. ， FEBS Lett. 244 :65 (1989) ; Johnston, S.A.et al. ， In Vitro Cell.Dev. Biol. 27 :11(1991))。此外，熟知的是在體外將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的電穿孔法可用于將DNA分子轉(zhuǎn)移到體內(nèi)組織中(Titoniirov, A. V. et al. ， Biochii Biophys. Acta 1088 :131((1991))。 對"載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移"已有描述(Wu， C. H. et. al. ， J. Biol. Chem. 264 :16985(1989) ;Wu，G.Y.et al. ， J. Biol. Chem. 263 :14621 (1988) ;Soriano, P. et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA 80 :7128(1983) ;Wang, C-Y. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7851(1982) ;Wilson， J.M. et. al. ， J. Biol. Chem. 267 :963 (1992))。優(yōu)選的載體為耙向脂質(zhì)體(Nicolau， C. et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :1068(1983) ;Sorianoet al.，見上文)，如免疫脂質(zhì)體,其可以使酰化的單克隆抗體整合到脂質(zhì)雙層中(Wang et al.,見上文)?？墒褂镁坳栯x子，例如唾液酸糖蛋白/聚賴氨酸(Wu et. al. ,1989，見上文)，其中偶聯(lián)物包含能識別靶向組織的分子(例如，肝脫唾液酸血清類粘蛋白)和用于與待轉(zhuǎn)染的DNA結(jié)合的DM結(jié)合性化合物。聚賴氨酸是DM結(jié)合性分子的例子，其與DM連接但并不損傷它。然后該偶聯(lián)物與質(zhì)粒DM絡(luò)合。 用于轉(zhuǎn)染或顯微注射的質(zhì)粒DNA可使用本領(lǐng)域熟知的方法(例如使用Quiagen方法(Quiagen))來制備，然后用已知的方法純化DNA，如本文例舉的方法。
E.劑量 對于:B7-DC變體多肽、B7-DC變體融合蛋白以及編碼B7-DC多肽和B7-DC變體融合蛋白的核酸，隨著進(jìn)一步研究的進(jìn)行,將獲得關(guān)于在各種患者中治療各種病癥的合適劑量水平的信息，而且考慮到接受治療者的治療內(nèi)容、年齡和總體健康情況，普通技術(shù)人員能夠確定合適的劑量。選擇的劑量取決于所需的治療效果、給藥途徑和所需治療的持續(xù)時間。通常，每天以0. 001至10毫克/公斤體重的劑量水平給藥于哺乳動物。通常，靜脈注射或
輸液的劑量可以較低。實施例 通過參照下列非限制性實施例，可進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實施例1B7-DC的分子模型和三維序列分析
材料和方法 基于人CD80和CD86的X射線坐標(biāo)，通過同源(或相當(dāng)?shù)?模型產(chǎn)生人B7-HI (hB7-HI)、小鼠B7-HI (niB7-HI)、人B7-DC(h:B7-DC)和小鼠B7-DC(m:B7-DC)的]:g V型結(jié)構(gòu)域的分子模型，這可在CD80ZCTLA-4和CD86/CTLA-4的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中見到。首先，將CD80和CD86的V-結(jié)構(gòu)域最優(yōu)地疊加，并基于該疊加對B7族成員序列進(jìn)行比對。用MOE(Molecular Operating Environment, ChemicalComputing Group, Montreal, Quebec,Canada)的序列-結(jié)構(gòu)比對功能完成該疊加和最初的比對。然后進(jìn)行手動調(diào)整比對以相互符合Ig共有序列位置，并在靶序列上畫出其他的保守疏水性殘基，以在X射線結(jié)構(gòu)中確定核心位置。因此，在比對序列中的相應(yīng)的殘基被預(yù)測具有大致等同的空間位置。如果一致性較低，如本發(fā)明的這種情況,與僅考慮序列一致性的比對校準(zhǔn)相比，將這種結(jié)構(gòu)信息納入考慮范疇通常是更加可靠的比對標(biāo)準(zhǔn)。在比對的區(qū)域中，相對于兩個結(jié)構(gòu)模板CD80和CD86，被比較的B7序列僅有約16%的平均--致性。圖5示出了結(jié)構(gòu)取向的比對的最終版本，其提供了建模的基礎(chǔ)。在比對后，四個模型的核心區(qū)域用來自所述結(jié)構(gòu)模板的MOE自動組裝，環(huán)區(qū)域中的插入和缺失通過應(yīng)用鏈段匹配程序來建模(Levitt, J Mol Biol. ，226 :507-533(1992) ;Fechteler， et al. ， J. Mol. Biol. ，253 :114-131 (1995))。使用在高分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的優(yōu)選的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體構(gòu)象來完成側(cè)鏈的置換(Ponder and Richards,J. Mol Biol，193 :775-791 (1987) ;Berman，et al. ，Nucl. Acids Res. ，28 :235-242 (2000))。在每一種情況下,產(chǎn)生二十個中間體模型，計算平均坐標(biāo),所得結(jié)構(gòu)是在使用蛋白力場的情況下能量最小化的(Engh and Huber， Ada Cryst. ， A47 :392-400 (1991))，直到各模型的分子內(nèi)接觸和立體化學(xué)是合理的為止。用Insight.II(Accelrys， San Diego， California)進(jìn)行模型的圖形化分析，包括溶劑可及表面的計算(Connolly, J Appl Cryst， 16 :548-558(1983))和殘基作圖研究。
34
結(jié)果 CD 80和CD 86的V_區(qū)域僅具有有限的序列同一性(約20% )，但通過獨立晶體學(xué)研究揭示出它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似。在CD80/CD86中見到的許多核或Ig超家族共有序列殘基位置，在其他:B7族成員(包括:B7-H1和B7-DC)中也還是保守的或保守置換的(圖5)。 構(gòu)建小鼠和人的B7-H1和B7-DC分子的分子模型。這些模型揭示了在V-區(qū)域中，與整個B7族的平均同一性相比，B7-HI和B7-DC具有的同一性高約34% 。因為B7-III和B7-DC均與PD-1結(jié)合，所以殘基保守性對于形成受體結(jié)合性結(jié)構(gòu)可能是有顯著意義的。因此，該模型被用于對暴露于蛋白表面上的保守殘基的推定分布進(jìn)行比較。對這些分子模型的并排比較揭示了 B7-H1和B7-DC的BED面....匕的表面殘基具有明顯的保守性，人蛋白比小鼠蛋白更保守。相反，反面的A' GFCC ' C〃面沒有顯示出顯著的殘基保守性。所述結(jié)果是有些出乎意料的，因為CD80和CD86相應(yīng)的A' GFCC' C 〃面均包含CD28/CTLA-4結(jié)合位點。 實施例2受體結(jié)合位點的誘變分析
方法和材料
小鼠和細(xì)胞系 雌性C57BL/6 (B6)小鼠，購自國立癌癥研究所(Frederick, MD) 。 PD-1缺失(PD-1+)型小鼠通過前人所述方法產(chǎn)生(Nishimura， et al. Int. Immunol， 10 :1563-1572(1998))。分泌融合蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞克隆在添加有1%透析胎牛血清(FBS ;:HyClone， Logan, UT)的CHO-SF II:培養(yǎng)基(Invitrogen LifeTechnologies)中培養(yǎng)。淋巴細(xì)胞和COS細(xì)胞在添加有10% FBS、25mM HEPES、2mML-谷氨酰胺、lffll丙酮酸鈉、1 % MEM非必需氨基酸、100U/mL青霉素G和100 u g/ml硫酸鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM ;Invitrogen Life Technologies)中生長。
定點誘變 通過使用B7-DC Ig cDNA作為模板、利用兩步PCR技術(shù)來構(gòu)建B7-DC Ig的所有變體。合成了交叉重疊的寡核苷酸引物以編碼所需的突變，設(shè)計了兩側(cè)的5'和3'引物用于分別容納EcoRI和Bgl II限制位點。起初使用相應(yīng)的交叉重疊引物和側(cè)翼引物來擴(kuò)增cDNA的合適區(qū)域。使用5'和3'側(cè)翼引物,將具有交叉重疊的序列的片段融接在一起，并進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用EcoR I和Bgl II消化并連接到經(jīng)EcoRI/Bgl II消化的pHIg載體中。為了驗證是否引入了所需突變，使用了 ABI Prism 310基因分析儀對每個變體進(jìn)行測序。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，收獲無血清上清,并將其用于體外結(jié)合分析，或者在蛋白G柱上分離以用于B:[Acore分析和功能性分析。
Ig融合蛋白 用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞來制備含有小鼠PD-1的胞外域的融合蛋白，所述胞外域與小鼠IgG2a(PD-llg)的Fc部分連接，該融合蛋白通過上述蛋白G親和柱層析分離(Wand,et a:l..見上文)?？?RM分離自小鼠脾臟細(xì)胞，B7-DC d)NA通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得。通過用包含嵌合cDNA的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞來制備小鼠B7-DC Ig，其中所述嵌合cDNA包含在讀碼框中連接到人IgGl的CH2-CH3部分的小鼠B7-DC的胞外域。通過包含嵌合cDNA的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞來制備人B7-DC Ig,所述嵌合cDNA包含在讀碼框中連接到人IgGl的CH2-CH3部分的人B7-DC的胞外域。將轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞在無血清的DMEM中培養(yǎng)，濃縮的上清被用作進(jìn)行初始結(jié)合分析的Ig融合蛋白源。該Ig蛋白被進(jìn)一歩在蛋白G柱....匕分離以用于前人所述的BIAcore分析和功能性分析(Wand, et al.見上文)。
EL1SA : 建立了對B7-DCIg特異性夾心型EL1SA。將微量滴定板用2f ig/ml的羊抗人IgG(Sigma， St.. Louis, M0)進(jìn)行包覆并在4tT下過夜。將孔用封閉液(含10% FBS的PBS)封閉1小時，然后用含有0. 05%的吐溫20的PBS(PBS-Tween)洗滌。加入COS細(xì)胞培養(yǎng)物上清，并在室溫下溫育2小時。還向各個板的單獨孔中加入已知濃度的分離的B7-DCIg以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在充分洗滌后，添加l : 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)-結(jié)合的羊抗人IgG(TAGO， Inc. ， Burlingame， CA)，隨后用TMB底物顯色，然后添加0. 5M H2S04用于終止反應(yīng)。用微量滴定板閱讀器測量405mm處的吸光度。通過與B7-DC Ig標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)的部分進(jìn)行比較，確定變體融合蛋白的濃度。收集了三重微孔的數(shù)據(jù)，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。實驗重復(fù)至少三次。 使用捕獲ELISA分析法來測定突變型和野生型B7-DCIg融合多肽結(jié)合PD_1的能力。用5ii g/ml的重組型PD-1 Ig融合蛋白包覆微量滴定板，并在4。C下過夜。將板封閉和洗滌，添加COS細(xì)胞培養(yǎng)基，并在室溫下溫育2小時。在充分洗滌后，添加HRP-結(jié)合的羊抗人IgG，接著用TMB底物顯色并測量405mm處的吸光度。
流式細(xì)胞術(shù): 將人胚胎腎293細(xì)胞用PD4GFP載體轉(zhuǎn)染，所述載體是通過在讀碼框中將GFP(綠色熒光蛋白d)NA)融合到全長小鼠PD-ld麓的C末端來構(gòu)建的。在轉(zhuǎn)染24小時后收獲細(xì)胞，將其在FACS(熒光活化細(xì)胞分選)緩沖液(PBS、3%FBS、0.02%NaN3)中與等量融合蛋白在冰上溫育45分鐘，所述融合蛋白已用野生型B7-DC I g在COS細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行了滴定。包含人Ig的無關(guān)的融合蛋白被用作陰性對照。洗滌細(xì)胞，進(jìn)一步與熒光素異硫氰酸(PE)-結(jié)合的羊抗人IgG(BioSource， Camari:l.lo， CA)溫育，并用FACScaliber(BectonDickinson， Mountain View, CA)的Cell Quest.軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。GFP-陽性細(xì)胞被FL1屏蔽(gate)。
表面等離子體共振分析 分離的野生型:B7-DC多肽和B7-DC變體多肽的親和性用BIAcore 3000設(shè)備(Biacore AB,Uppsala, Sweden)分析。除融合蛋白外所有的試劑均購于BIAcore并預(yù)先過濾和脫氣。所有的實驗在25tT下使用0. 1M HEPES、0. 15M NaCl (pH 7. 4)作為運(yùn)行緩沖液來進(jìn)行。簡要地說，首先將PD-llg依照BIAcore手冊通過胺偶聯(lián)而固定到CM5傳感器芯片(BIAcore)上。CM5芯片的流動池通過向其中注入1 : 1EDC : N:HS[N-乙基-N'' -(二乙基氨基丙基)碳化二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺]混合物7分鐘、接著以10u 1/min注入用10mM乙酸鈉(pH4. 5)稀釋的20ug/ml PD-lIg來衍生化。PD-lIg在2000RU被固定。接著用1M氨基乙醇(pH 8.5)來封閉殘留的活化羧基。用與上述類似的方法制備對照流動池,只是用運(yùn)行緩沖液替換PD-l:l:g。融合蛋白用運(yùn)行緩沖液稀釋為一系列的濃度3. 75、7. S、15、3()和60 u g/ml。在20 1/min的流速下注入蛋白3分鐘，并為分離數(shù)據(jù)的目的，允許緩沖液溢出表面5分鐘。用lOmM NaOH的單——次30秒的脈沖來使流動池再生。使用BIAevaluat.ion軟件包3. 1 (BIAcore)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果分析 在分子模型的幫助下，逐一研究B7-DC的V結(jié)構(gòu)域的重要殘基。為了定點突變，在 BED和A' GFCC' C"面上均選出保守和非保守殘基。使小鼠分子中的殘基突變以能夠接下 來對所選的突變蛋白進(jìn)行功能性研究。對于與P[)4的結(jié)合，所得變體蛋白的結(jié)合特性通過 特異性ELISA和FACS分析法來分析。準(zhǔn)備和測試了 17個mB7_DC變體。表1中概括了測 試結(jié)果。如果mB7-DC內(nèi)的特定殘基的突變以FACS測量產(chǎn)生至少50%結(jié)合損失或以ELISA 測量產(chǎn)生至少一個數(shù)量級的結(jié)合損失,那么其才將被認(rèn)為對配體-受體交互作用而言是重 要的。 約--半的這些殘基的突變顯著地破壞了與mPD-1的結(jié)合。特別是，mB7-DC的殘基
E71、 1105、 Dill和K113被確定為對于與mPDl結(jié)合而言是重要的。通過ELISA測定發(fā)現(xiàn)，
mB7-DC中的S58殘基突變使之與mPD-1的結(jié)合增強(qiáng)。因此，此殘基必須至少與受體-配體
界面靠近，并且不僅對置換有耐受性，而且是結(jié)合性相互作用的潛在的最優(yōu)配置。還使用ELISA和FACS測試了人B7-DC變體與PD-1的結(jié)合。hB7_DC殘基K114和
Dill的突變被確定為對于與mPDl的結(jié)合而言是重要的。FACS分析結(jié)果在圖7中示出。表1小鼠B7-DC變體的氨基酸置換和結(jié)合特性的概述
置換b 結(jié)合 突f 位置 核酸 氨基酸 E JkC^ 《夠d PD-l結(jié)合位點被作圖定位于反面A' GFCC' C〃面上的等同區(qū)域。結(jié)合位點區(qū)域
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37的作圖揭示了，其突變對PD-1結(jié)合帶來負(fù)(正)影響的那些殘基，可以在兩個配體中形成 粘合表面。重要殘基和對結(jié)合而言并不重要的某些殘基之間接近，再次說明所觀察到的作 用是特殊的，而且不是全部結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。對重要殘基位點的比較證實了在mB7-DC中的 推定結(jié)合位點的位置與CD86和CD80中的CD28/CTLA-4結(jié)合位點密切對應(yīng)。
野生型和突變型蛋白與PD-1結(jié)合的表面等離子體共振分析結(jié)果與FACS和ELISA 分析結(jié)果非常相符。野生型B7-DC蛋白的RMX為227RU，而B7-DC變體Kl 13根本沒有與PD-1 結(jié)合(圖6)。這些數(shù)據(jù)說明了野生型B7-DC比變體K113對PD-1具有更穩(wěn)定狀態(tài)的親和 性。與野生型:B7-DC相比，B7-DC Kl 13變體顯示了更慢的結(jié)合率和解離率,或者沒有結(jié)合 率和解離率。 實施例3B7-DC變體的共刺激功能 材料和方法 T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分析 如前人所述(Wang， et al.見上文)，使用尼龍羊毛柱(RobbinsScientif ic Co， Sunnyvale, CA)來分離野生型B6小鼠或PD-l—'—小鼠中的T細(xì)胞。將富集的T細(xì)胞在5 u g/ ml融合多肽或?qū)φ斩嚯拇嬖谙乱悦靠?X 105個細(xì)胞在96孔的平底微孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，所 述微孔板已用抗CD3mAb (clone 145-2C11 ， Pharmingen, San Diego， CA)預(yù)包覆。T細(xì)胞的 增殖由在3日培養(yǎng)的最后12小時中的1 u Ci/孔3H-TdR的摻入量來確定。使用MicroBeta Trilux液體閃爍計數(shù)器(Wallac， Finland)來計數(shù)3H_TdR的摻入量。為了檢測細(xì)胞因子， 在各個時間點收集培養(yǎng)基上清，按照廠商的指導(dǎo)手冊(Pharmingen)通過夾心型ELISA法測 定IFN-y的濃度。
結(jié)果分析 還測定了選定的變體的共刺激能力。B7-DC變體K113和D111被選擇用于分析。 在FACS和ELISA分析中K113和Dill都具有與PD-1最小的結(jié)合性(表1)。如圖8A和8B 所示的，與野生型B7-DC相比，所述變體還能夠共刺激T細(xì)胞增殖和I:FNi產(chǎn)生。
盡管B7-DC可能通過未知的受體來共刺激T細(xì)胞的生長，但是這些發(fā)現(xiàn)可被解釋 為未被識別的共刺激性受體和PD-1的整合刺激作用。因此，在PD-1缺乏型T細(xì)胞中測定 了 B7-DC變體的共刺激作用。野生型和變體型B7-DC多肽都共刺激PD-1——7———T細(xì)胞的增殖， 所述增殖相當(dāng)于或優(yōu)于PD-細(xì)胞的增殖(圖8A與圖9相比)。因此，這些觀察結(jié)果明顯 表明，B7-DC通過非PD-1受體共剌激T細(xì)胞的生長。 實施例4.野生型和變體型B7-DC在具有免疫活性的純系小鼠和免疫缺陷型純系 小鼠中對于腫瘤細(xì)胞生長的作用 上述實施例表明與抑制性受體程序化死亡因子 1 (PD-1)沒有結(jié)合性的B7-DC變 體保留了對T細(xì)胞的共刺激功能。這些結(jié)果表明B7-DC突變體可用于增強(qiáng)抗腫瘤的免疫 應(yīng)答。因此，檢驗了 B7-DC和B7-DC變體在整個動物中刺激抗腫瘤免疫性的能力。將包含 編碼點突變的cDNA的質(zhì)粒K113S B7-DC通過電穿孔法轉(zhuǎn)染到小鼠腫瘤細(xì)胞系EG7中。建 立了穩(wěn)定表達(dá)K113S B7-DC的EG7細(xì)胞系。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，使用對B7-DC特異性的 單克隆抗體，來證實B7-DC在EG7轉(zhuǎn)染子的亞系EG7ZK113S的細(xì)胞表面上的表達(dá)。還用親 本質(zhì)粒(空載體)轉(zhuǎn)染EG7細(xì)胞作為陰性對照，或者用包含野生型B7-DC的質(zhì)粒(EG7/Wt. B7-DC)轉(zhuǎn)染EG7細(xì)胞作為附加對照?？蛰d體EG7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不表達(dá)可檢測的B7—DC，而野生型B7-DC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子表達(dá)B7-DC的水平與用K113S B7-DC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞水平相當(dāng)。
將EG7/K113S細(xì)胞皮下接種到10只具有免疫活性的C57BL/6純系小鼠中，誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞暫時生長成小瘤。然而，這些腫瘤迅速地消退。20天后，所有的腫瘤全部消失。相 反，接種空載體EG7細(xì)胞系則誘導(dǎo)腫瘤日益生長，并最終在30-40天時導(dǎo)致小鼠死亡。接種 野生型B7-DC細(xì)胞系的小鼠也誘導(dǎo)腫瘤日益生長。然而，它們的生長比接種空載體EG7細(xì) 胞系的要慢許多(圖10) 雖然這些結(jié)果說明K113S B7-DC在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)在具有免疫活性的小鼠中 誘導(dǎo)腫瘤消退，但是還不清楚這些作用是否受到免疫系統(tǒng)介導(dǎo)。為了確認(rèn)這一點，將K113S B7-DC細(xì)胞皮下接種到免疫缺陷型裸鼠中。結(jié)果表明EG7/K113S細(xì)胞的生長率與空載體細(xì) 胞系和野生型B7-DC細(xì)胞系的生長率類似，而且腫瘤沒有消退(圖ll)。因此所述結(jié)果證明 腫瘤消退是受免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的并且K113S B7-DC的表達(dá)刺激了強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。
為了證明Kl 13S B7-DC剌激抗腫瘤免疫性并不限于EG7腫瘤細(xì)胞，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 的小鼠P815肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行類似的實驗。K113S B7-DC、親本質(zhì)粒和含野生型B7-DC 的質(zhì)粒也被轉(zhuǎn)染以建立對照細(xì)胞系。在使用上述特異性抗體的流式細(xì)胞術(shù)分析后，挑選表 達(dá)相當(dāng)水平的B7-DC的腫瘤細(xì)胞亞系。與EG7/K11S腫瘤細(xì)胞系類似，將P815/K113S細(xì)胞 皮下接種到l()只具有免疫活性的DBA/2純系小鼠中，誘導(dǎo)腫瘤暫時生長，而且所有腫瘤迅 速地消退。接種空載體轉(zhuǎn)染的P815細(xì)胞則誘導(dǎo)腫瘤日益生長,而注射P815/野生型B7-DC 細(xì)胞也誘導(dǎo)腫瘤日益生長。然而，它們的生長比接種空載體P815細(xì)胞系的要慢很多(圖 12)。將這些腫瘤細(xì)胞系接種到免疫缺失型rm/nu小鼠中，則誘導(dǎo)腫瘤以類似的速率生長 (圖13)，這些結(jié)果支持免疫系統(tǒng)在:B7-DC轉(zhuǎn)染子的抗腫瘤生長方面發(fā)揮作用。
實施例5. B7-DCIg在小鼠中對于腫瘤生長的治療作用 為了測定B7-DC蛋白對于腫瘤生長的治療作用，對長有在免疫活性小鼠中建立的 P815腫瘤的小鼠，用B7-DCIg融合蛋白進(jìn)行治療。將野生型P815細(xì)胞接種到小鼠中，誘導(dǎo) 腫瘤日益生長。在第3天和第8天給小鼠腹腔內(nèi)注射().lmg B7-DC:l:g，抑制腫瘤生長(圖 14)。 除非另有規(guī)定，否則本文中使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員通常所理解的意義相同。 本領(lǐng)域技術(shù)人員僅通過常規(guī)實驗就會認(rèn)識到或能夠確定本文所述的本發(fā)明具體 實施方案的許多等同方式。這些等同方式也被認(rèn)為包括在所附權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
一種分離的B7-DC變體多肽或其共刺激性片段，其中所述B7-DC變體多肽是野生型B7-DC多肽的變體，其中與野生型B7-DC多肽相比，所述B7-DC變體多肽對于PD-1的親和結(jié)合性降低，并且其中所述B7-DC變體多肽保留了下列能力增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖的能力、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力、刺激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能的能力、或促進(jìn)T細(xì)胞存活的能力。
2. 權(quán)利要求1所述的分離的B7-DC變體多肽,其中該多肽包含一個或多個氨基酸的置 換、缺失或插入。
3. 權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中所述B7-DC多肽為人B7-DC。
4. 權(quán)利要求3所述的分離的B7-DC變體多肽，其中所述一個或多個氨基酸的置換、缺失 或插入存在于A' 、 B、 C、 C' 、 C"、 D、 E、 F或G鏈中、或存在于它們的任何組合中。
5. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用絲氨酸殘基替換野生型鼠 B7-DC或人B7-DC的111位的氨基酸。
6. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用絲氨酸殘基替換野生型人 B7-DC的113位的氨基酸。
7. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用絲氨酸殘基替換野生型人 B7-DC的56位的氨基酸。
8. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用酪氨酸殘基替換野生型人 B7-DC的67位的氨基酸。
9. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用絲氨酸殘基替換野生型人 B7-DC的71位的氨基酸。
10. 權(quán)利要求4所述的分離的多肽，其中所述置換包括用絲氨酸殘基替換野生型人 B7-DC的101位的氨基酸。
11.權(quán)利要求4所述的分離的多肽,其中所述置換包括用丙氨酸殘基替換野生型鼠 B7-DC或人B7-DC的105位的氨基酸。
12. —種分離的融合多肽，包含a) 作為第一融合伴侶的權(quán)利要求1所述的多肽；禾口b) 作為第二融合伴侶的第二多肽，其中所述第一融合伴侶與所述第二融合伴侶直接融合；或者可任選地，所述第-一融合 伴侶與和所述第二融合伴侶融合的接頭序列融合。
13. 權(quán)利要求12所述的融合多肽，其中所述第二多肽包含I:g重鏈恒定區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域。
14. 權(quán)利要求13所述的融合多肽，其中所述第二多肽包含對應(yīng)于人免疫球蛋白C y 1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的氨基 酸序列。
15. 權(quán)利要求14所述的融合多肽，其中所述第--多肽包含B7-DC或其共剌激性片段的胞外域，以及其中所述第二多肽包含對應(yīng)于人免疫球蛋白C y 1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的氨基酸序列。
16. —種增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、刺激T細(xì)胞的分化 和效應(yīng)子功能、或促進(jìn)T細(xì)胞存活的方法，其中該方法包括使T細(xì)胞與分離的融合多肽接觸，所述分離的融合多肽包含a) 作為第一融合伴侶的分離的B7-DC變體多肽或其共刺激性片段， 其中所述B7-DC變體多肽是野生型B7-DC多肽的變體，其中與野生型B7-DC多肽相比，所述B7-DC變體多肽對于PD-1的親和結(jié)合性降低，并且其中所述B7-DC變體多肽保留了下列能力增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖的能力、增強(qiáng) T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力、刺激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能的能力、或促進(jìn)T細(xì)胞存活的 能力;和b) 作為第二融合伴侶的第二多肽，其中所述第一融合伴侶與所述第二融合伴侶直接融合；或者可任選地，所述第一融合 伴侶與和所述第二融合伴侶融合的接頭序列融合。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第二多肽包含]:g重鏈恒定區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第二多肽包含對應(yīng)于人免疫球蛋白C y 1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的氨基 酸序列。
19. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一多肽包含B7-DC或其共刺激性片段的胞外域，以及其中所述第二多肽包含對應(yīng)于人免疫球蛋白C y 1鏈的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的氨基 酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于共刺激T細(xì)胞(即增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原特異性增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、刺激T細(xì)胞的分化和效應(yīng)子功能、和/或促進(jìn)T細(xì)胞的存活)的組合物和方法。合適的組合物包含B7-DC多肽、其片段和融合蛋白。B7-DC變體多肽對于抑制性PD-I配體的親和結(jié)合性降低，但基本上保留了共刺激T細(xì)胞的能力。本發(fā)明提供在需要刺激免疫應(yīng)答的受試者中使用B7-DC變體多肽以刺激其免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號A61P37/04GK101784564SQ200880024511
公開日2010年7月21日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者陳列平 申請人:約翰霍普金斯大學(xué)