專利名稱：磷鉑及其在治療順鉑和卡鉑耐藥性癌中的用途的制作方法
磷鉑及其在治療順鉑和卡鉑耐藥性癌中的用途相關申請的交叉引用本申請根據35U. S. C.第119(e)款要求2007年8月6日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?0/954，126以及2007年9月20日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/973，926的優(yōu)先權 權益，這兩個美國臨時專利申請均以其全部內容通過弓I用并入本文。
背景技術：
由于順二氨合二氯鉬(II)(順鉬)用于治療卵巢癌、睪丸癌、頭頸癌及其他形式癌的極大成功，鉬二胺絡合物是本領域中熟知的。此外，順鉬與其他治療方案包括放射治療聯(lián) 合應用。這種鉬化療藥在細胞循環(huán)G2期介導凋亡，主要通過轉錄抑制和通過復制抑制進 程，尤其在大劑量時。以鏈內和鏈間兩種模式通過鳥嘌呤和腺嘌呤堿基N7位點共價結合至 DNA，通常被認為在轉導大量的導致凋亡的細胞響應中的關鍵分子事件。盡管順鉬非常有效，但是它表現(xiàn)出腎臟的、與腎有關的和神經的毒性。而且，許多 患者隨著時間對順鉬治療產生耐藥性，因而不能通過順鉬治療來治愈。FDA批準的兩種其他 鉬藥物，卡鉬(二氨合-1，1-環(huán)丁燒二羧酸-鉬(II) (diammine-1,1-dicarcarboxylatocy clobutane-platinum(II))和奧沙利鉬(二氨合-草酸鉬(II))，也被認為是以與順鉬類似 的方式起作用?？ㄣf對順鉬耐藥的腫瘤細胞特別有效，但是為了有效地治療對順鉬耐藥的 患者，需要相對大的劑量。這種大劑量同樣具有相關的毒性。已合成了許多新的鉬胺絡合物，并測試了它們的抗癌活性。然而，這些絡合物中只 有幾個(其中一些列于

圖14中)表現(xiàn)出有前景的結果。這些新絡合物包含了各種可替換 的非胺配體，以及被認為對DNA結合和細胞攝取重要的非可替換的胺配體。通常，本領域 中已知的這些及其他相關的鉬氨合絡合物是通過制備順鉬的方法來合成的，即四氯鉬酸鹽 (PtCl42O接受胺配體而變成PtCl2(胺/ 二胺)。以該四氯絡合物起始，通常提供其他的產 品，因此為了確保順式異構體的高收率和純度，同樣可以使用Ptl42_，隨后將Ptl42_轉化為 PtI2 (胺/ 二胺)，且然后轉化成PtCl2 (胺/ 二胺)。在將PtI2 (胺/ 二胺)轉化為PtCl2 (胺 / 二胺)時，通過用二當量的硝酸銀或其他可溶性銀鹽在低PH下處理該二碘絡合物來將該 二碘絡合物轉化為二水合絡合物(diaqua complex)。得到的二水合絡合物易于與氯化鉀 或鹽酸反應而生成目標的該二氯絡合物。通常，目標鉬絡合物是從相應的二水合絡合物在 低PH下引入可取代配體而合成的，因為在較高PH下很快地發(fā)生該二水合絡合物的二聚或 多聚，產生不期望的產物。在本領域中，鉬胺絡合物還用氮、硫、羧酸鹽和磷酸鹽作為可替換配體來代替可替 換的氯配體。然而，那些顯示最有前途治療癌的絡合物的一個特點是被配位至鉬(一種軟 酸)的可替換的硬堿配體。這種已顯示優(yōu)異抗癌性質的硬-軟結合的例子是羧酸鉬絡合物、 碳酸鉬絡合物、膦酸鉬絡合物。盡管付出了巨大的努力想用更有效的化療藥代替順鉬，但是帶有磷酸鹽作為可替 換配體的鉬(II)和鉬(IV)絡合物仍大量未開發(fā)。這主要歸因于早期的關于鉬(II)磷酸 絡合物的工作通常產生磷酸橋接的雙核絡合物。盡管已報道了某些雙核磷酸鉬(II)絡合 物的優(yōu)異抗癌性質，但是對它們的應用的進一步開發(fā)由于這些絡合物在水溶液中溶解性較差而受限。盡管某些單體焦磷酸絡合物和三磷酸絡合物是本領域中已知的，但是這種絡合 物不適用于藥物組合物，因為它們在中等酸性溶液中進行磷酸鹽水解，產生不溶性雙核產 物(參見Odani等的US7, 342. 122，描述了在本文中和在Bose等Inorg. Chem. 1985,24, 3989-3996中所描述的單體絡合物am_2的二聚體；還可參見Odani等的W02005/000858，將 單體的am-2描述為一種潛在的抗癌藥物)。因此，本領域仍然存在這樣的需要用于治療癌的、穩(wěn)定且有效的順鉬及卡鉬替代 物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了磷鉬(phosphaplatins)，穩(wěn)定的、單體的鉬(II)和(IV)磷酸絡合物 (phosphato complexes)，其具有圖1中所示的通式，其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代 的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，而且其中當R1和R2中的一個為NH3時，R1和R2中的另 一個不是NH3 ；而且其中S不存在或者獨立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。本發(fā) 明還提供了制備和分離磷鉬的方法。本發(fā)明還提供了治療癌的方法，通過對需要這種治療的患者，單獨地或者聯(lián)合地， 與藥學上可接受的載體一起施用有效量的磷鉬，所述癌包括對順鉬和/或卡鉬耐藥的癌。附圖簡述圖1顯示本發(fā)明的鉬(II)和鉬(IV)絡合物的結構。Rl、R2和R3各自獨立地選 自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，其中當Rl和R2中的一個為ΝΗ3時，則Rl和R2 中的另一個不是ΝΗ3。在某些實施方案中，Rl和R2選自胺、甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁胺、 環(huán)己胺、苯胺、吡啶和取代的吡啶。在某些實施方案中，R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。S獨立 地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。在某些實施方案中，本發(fā)明要求了這些化合物 的藥學上可接受的鹽。圖2顯示一些分離的本發(fā)明絡合物的結構，S卩(A) 二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II)， 也稱作am-2 ；⑶順式-二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)，也稱作am-4 ； (C)l，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II)，也稱作en-2; (D)I，2-乙二胺-反式-二羥配位基 (二氫焦磷酸)鉬(1力，也稱作611-4;伍)(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)， 也稱作dach-2 ；和(F)(反式-1，2-環(huán)己二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)， 也稱作dach-4。圖3顯示帶有鈉反離子的am-4的X-射線晶體結構。圖4顯示從焦磷酸一側所看到的、處于不同構象的en-4的X-射線晶體結構。圖5顯示圖2所示絡合物的質子化程度，通過31P化學位移作為PH函數(shù)進行測定。 估算的酸度常數(shù)列于表1。這些數(shù)據提供了對于這些絡合物在酸性溶液與中性溶液之間溶 解性差異的了解。在所公開的PH值低于2的條件下，這些絡合物被完全質子化，于是預期表現(xiàn)出降低的溶解性。圖6表現(xiàn)出dach-2在(A) pH 4. 2和(B)pH 8時差異的穩(wěn)定性。在pH 8時，通過 已配位焦磷酸根離子至鉬(II)長達六天的保持所證明的，沒有dach-2分解被觀察到。相 反地，在pH 4. 2時，因游離焦磷酸鹽信號的出現(xiàn)，顯著分解是明顯的。在每個圖板的底部圖 譜起，以24小時的時間間隔來記錄圖譜。圖7是在順鉬和卡鉬耐藥性人卵巢細胞系(A2780/C30)中作為微摩爾濃度函數(shù)的dach-2、順鉬和卡鉬細胞毒性作用的對照圖。該細胞系對30微摩爾順鉬和100微摩爾卡鉬是耐藥的。圖8是dach-2與FDA已批準的順鉬和卡鉬抗癌藥對人卵巢細胞系(A2780)的細 胞毒性作用的對比圖。圖9表示dach-2對(A)順鉬敏感性和(B)順鉬耐藥性的頭頸癌細胞系的細胞毒 性。dach-2用于順鉬敏感性細胞的IC50值低于1微摩爾，而用于順鉬耐藥性細胞的IC50 值，低于5微摩爾。圖10顯示在一定濃度下，相比于順鉬，dach-2被細胞所攝取的量(用原子吸收光 譜法檢測)減少。例如，在10 μ M濃度下，順鉬在A2780細胞中的積聚為3. Ong Pt/ΙΟ6細 胞，而dach-2顯示為1. Ong Pt/ΙΟ6細胞。對于其他濃度，鉬積聚保持相似的趨勢。圖11顯示作為人卵巢細胞系(A2780)中濃度的函數(shù)的順鉬結合DNA的程度，在培 育順鉬持續(xù)2小時后用原子吸收光譜法檢測。當用高達50微摩爾濃度的dach-2處理A2780 細胞時，甚至當處理細胞持續(xù)24小時后，通過相同的技術，沒有結合DNA的鉬被檢測到。圖12是通過質子NMR光譜法在順鉬(底部)、am-2 (中部)和dach-2 (上部)中 鳥嘌呤堿基結合(順鉬主要的DNA結合位點)的比較。上部的圖譜顯示了游離的鳥嘌呤堿 基的一個信號，即在8. 05ppm處的嘌呤環(huán)的H8氫，底部圖譜顯示了由于鳥嘌呤通過該嘌呤 環(huán)的N7位點結合至順鉬而導致的在8. 43ppm處的H8質子的另一個信號，而中部圖譜僅顯 示未結合的鳥嘌呤H8信號而非鉬結合的信號。在48小時后記錄底部圖譜。在96和106小 時后分別記錄中部和上部的圖譜。本發(fā)明絡合物未共價地結合鳥嘌呤堿基(順鉬、卡鉬和 奧沙利鉬的DNA結合位點)，這表明了不同于針對順鉬所提出的那些凋亡機理的凋亡機理。圖13顯示1H NMR光譜數(shù)據，證實在經dach-2處理的人卵巢細胞中缺乏DNA結 合。在相關的實驗中，以比細胞劑量高250倍的濃度，dach-2與雙鏈的小牛胸腺DNA、合成 的寡核苷酸(5’ -ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT-3’)、二核苷酸(dGpG)以及單磷酸核苷酸 (5' -dGMP和5' -dAMP)反應。以1H NMR光譜法監(jiān)測DNA結合的程度。在平行實驗中， 在同樣條件下進行與順鉬相似的反應。圖中顯示了使用25-mer寡核苷酸的典型NMR實驗 結果，其表明了 dach-2未表現(xiàn)出任何可檢測到的DNA結合，而順鉬易于與DNA形成共價加 合物，誠如在8. 4至8. 95ppm區(qū)域內新信號形成所證明的。然而，順鉬易于與上述所有的核 苷酸都形成加合物，而甚至7天之后也沒有dach-2結合至核苷酸的可檢測NMR信號被觀察 到。圖14顯示一些本領域中已知的、有活性的鉬絡合物的結構，它們在被用作藥物、 作為潛在藥物正被評價或者在進行臨床試驗。圖15顯示用于形成圖1磷鉬絡合物的結構；X是鹵素，R1、R2和R3各自獨立地選 自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺。詳述本文提供了用于癌治療的、穩(wěn)定的、單體的鉬(II)和(IV)焦磷酸鹽絡合物(命名 為磷鉬)，所述癌治療包括順鉬和/或卡鉬耐藥性癌的治療。通常，磷鉬不易進行水解，可溶 在中性PH的水溶液中，而且在中性pH水溶液中是穩(wěn)定的。而且，磷鉬顯示在癌細胞系中普 遍的細胞毒性，并且在對順鉬和卡鉬中一種或兩種均耐藥的細胞系中有效。因此，與已知的 鉬抗癌藥相比，磷鉬在誘導癌細胞死亡方面是有效的，而且在有些情況下更有效，并且在適于患者用藥的溶液中表現(xiàn)出期望的穩(wěn)定性和溶解性。如本文提及本發(fā)明磷鉬所使用的，穩(wěn) 定的是指當被維持在PH范圍為6-8的水溶液中持續(xù)2天至六天之間的時間段時該絡合物 的抗水解性。認為與順鉬、卡鉬以及相關的基于鉬的抗癌劑不同，磷鉬非共價鍵地結合DNA。由 于順鉬耐藥性被認為是源自包括核切除修復酶的各種酶對DNA損傷的有效修復，而且由于 磷鉬非共價地結合DNA，所以因DNA修復機理導致磷鉬耐藥性是不可能的。數(shù)據表明，磷鉬 引發(fā)fas及fas相關轉錄因子和某些促凋亡基因如Bak和Bax的過度表達。此外，磷鉬的 細胞結合遠小于順鉬，另外磷鉬表現(xiàn)出極大的細胞毒性。因此，本發(fā)明提供了具有不同于本 領域那些分子靶的、有效的鉬抗癌劑。在一些實施方案中，該絡合物具有圖1所示的通式，其中Rl、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，其中當Rl和R2中的一個為NH3時，則Rl和 R2中的另一個不是NH3。在某些實施方案中，Rl和R2選自胺、甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁 胺、環(huán)己胺、苯胺、吡啶以及取代的吡啶。在某些實施方案中，R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。S 獨立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸。在某些實施方案中，本發(fā)明要求了這些化 合物的藥學上可接受的鹽。因此，本發(fā)明的抗癌劑包括，在某些實施方案中，圖2中的絡合 物。本文還提供了合成與分離穩(wěn)定的單體鉬(II)和(IV)焦磷酸鹽絡合物的方法。在 一種實例中，該方法包括將含過量磷酸鹽與圖15所示的式的鉬絡合物的含水反應混合物 維持在溫度為約30至約60攝氏度下持續(xù)約12至約18小時的時間段、ρΗ為約7至約9，來 形成具有圖1式(I)和(III)的絡合物，其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代 的脂肪族胺或者芳香族胺，而且其中當R1和R2中的一個為NH3時，則R1和R2中的另一個不 是NH3 ；而且其中X獨立地選自鹵素。圖15中所示的絡合物可用任何適宜的方式制備。在一些如本領域通常所描述的 實例中，可通過加入碘化鉀而將K2PtCl4轉化成K2PtI4來制備順式-(胺/二胺)二氯鉬(II) 絡合物。然后它與期望的胺配體反應。然后通過加入二當量的硝酸銀，將得到的順式-(胺 /二胺)二碘鉬(II)絡合物原位轉變?yōu)橄鄳捻樖?(胺/二胺)二水合鉬(II)絡合物。 通過加入氯化鉀，將該順式-二水合物[Pt(胺/二胺)2(H2O)22+]轉化為順式-二氯絡合物。應當理解是，也可采用其他適宜的反應條件。例如，在一些實施方案中，溫度可以 是從約35至約45°C。因此，反應溫度可以是從約30-31、31-32、32-33、33-34、34-35、35-36、 36-37,37-38,38-39,39-40,40-41,41-42,42-43,43-44,44-45,45-46,46-47,47-48, 48-49、49-50、50-51、51-52、52-53、53-54、54-55、55-56、56-57、57-58、58-59、59-60 "C,以 及它們之間的增量。在40°C已獲得了優(yōu)良的結果。在一些實例中，使反應進行約13至約16 小時。因此，反應時間可以是從約12-13、13-14、14-15、15-16、16-17和17-18小時，以及它 們之間的增量。在反應15個小時已獲得優(yōu)良的結果。在一些實例中，ρΗ可以是從約6-7、 7-8和8-9，以及它們之間的增量。在ρΗ約為8，已獲得了優(yōu)良的結果。所述方法還包括隨后濃縮含水反應混合物使得不形成焦磷酸鹽沉淀。應當理解 為，可用任何適宜的方式濃縮含水反應混合物。例如，可用旋轉蒸發(fā)濃縮含水反應混合物。所述方法還包括通過加入一種適宜的酸來將反應混合物的ρΗ迅速降至ρΗ小于約 2。在一些實例中，可用硝酸來降低ρΗ。在一些實施方案中，ρΗ是在約1與約2之間的范圍。在pH 1時已獲得了優(yōu)良的結果。在一些實例中，所述方法也包括在濃縮反應混合物后使反應混合物到5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。在另外的實例中，所述方法也包括在降低反應混合物PH之后將反應 混合物冷卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了形成根據圖I(II)和(IV)絡合物的方法。該 方法如上所述，但還包括在維持反應混合物在約30至約60攝氏度的溫度下持續(xù)約12至約 18小時的時間段、pH為約7至約9之后，向反應混合物加入過氧化氫，以及選自乙酸鹽、丁 酸鹽和α-羥基酸的鹽的任選試劑。在一些實例中，在濃縮反應混合物前與過氧化氫一起加入的任選試劑選自乙酸 鈉、丁酸鈉以及α-羥基丁酸鈉鹽。在另外的實例中，在濃縮反應混合物前與過氧化氫一起 加入的任選試劑選自乙酸鉀、丁酸鉀以及α-羥基丁酸鉀鹽。本文所述的單體絡合物的合成和分離方法可以有別于現(xiàn)有技術，因為新方法不產 生二聚或寡聚的磷酸鹽化合物。例如，Bose等在Inorg. Chem. 1985，24，3989-3996 (〃 Bose 1985")中所報道的方法，它包括通過在中性pH下將陰離子焦磷酸絡合物吸附在陰離子交 換樹脂上并且用較低pH洗脫液對其洗脫來從反應混合物中分離Pt (NH3) 2 (H2P2O7) (am-2)， 該方法對于am-4、en-2、en-4、dach-2以及dach-4的合成和分離是無用的。當使用Bose 1985方法時，在嘗試用較低pH電解液洗脫而進行分離時這些絡合物在離子交換床上分解。 最初，絡合物變成棕黑色，隨后在離子交換樹脂內形成不溶性黑色沉淀物。只有對Bose 1985方法進行如本文所述的改進，才可能從其各自反應混合物中分離am-4、en-2、en-4、 dach-2以及dach-4。用真空蒸發(fā)將每個反應混合物濃縮至當在下列步驟中降低pH(焦磷 酸鹽配體的溶解性隨著PH而變化很大)時未反應的焦磷酸不會沉淀出的程度。為了引起 選擇性沉淀，最終的濃度為0. 05M與0. 08M之間，因為體積的進一步減少導致了反應過程中 必須過量存在的未反應焦磷酸鹽的共沉淀。濃縮后，將反應混合物冷卻，并將PH迅速調低 至1. 0，以便利用絡合物的質子化與去質子化形式之間的溶解度差異來誘導沉淀。在中性pH時，本發(fā)明的分離的單體Pt (II)和Pt (IV)絡合物是穩(wěn)定的。如31PNMR 譜所示，在PH 6-8的范圍內，該絡合物沒有經受因為在中性pH水溶液中經六天的時間間隔 后胺或焦磷酸鹽配體喪失而導致的任何解絡合物形成作用(deligation)。但是，在相同的 時間間隔、PH 4. 2，通過在-10. 3ppm處游離焦磷酸鹽信號的出現(xiàn)，因焦磷酸鹽配體釋放導 致的緩慢的解絡合物形成作用是明顯的。同時，形成不溶性焦磷酸橋接的雙核鉬(II)產 物。數(shù)據也表明酸分解大大地取決于酸度_酸度越高，分解越快(參見圖5，表1和表2)。表1.去質子化的鉬(II)和鉬(IV)焦磷酸絡合物的化學位移(d，ppm)以及Pt-P偶合常數(shù)δ -31P δ -195Pt絡合物ppmppmJP-Pt,Hzam-22. 12-1503 23. 44dach-21. 78-172925. 03en-21. 93N/A29. 73am-42. 32173315. 38dach-42. 41161325. 91
en-42. 35158225. 91表2.從磷-31化學位移確定的Pt (II)-和Pt (IV)-焦磷酸絡合物的計算的 PKa (酸度常數(shù)的log)值絡合物PKa1pKa2am-22. 9 士 0.3 4. 7 士 0. 2(3. 8 士 0.1)en-22. 2 士 0. 1 4. 4 士 0. 1dach-22. 6 士 0.2 4. 4 士 0. 2(3. 3 士 0.1)am-42.0 士 0.1 4. 7 士 0. 1en-4<24. 3 士 0. 1本發(fā)明的絡合物用于治療各種癌是有用的。人卵巢細胞系(A2780)和中國卵巢細 胞(CHO)的細胞毒性試驗證明，這些絡合物作為第一輪治療是有效的，而且對于順鉬和卡 鉬均耐藥的卵巢細胞(C30)的試驗(參見表3)表明，這些絡合物適合于耐藥性癌的第二輪 治療。本發(fā)明絡合物是特別期望的，因為它們可減少體內毒性。相比于順鉬，這些絡合物 以減少的量被細胞所攝取，表明與順鉬及其他鉬抗癌治療藥的劑量相比可能需要較低的劑 量。例如，在10 μ M濃度，在A2780細胞中順鉬積聚為3. Ong Pt/ΙΟ6細胞，而dach_2顯示 為l.Ong Pt/ΙΟ6細胞，而且在耐藥性細胞系中dach-2顯示為在其IC50值處1. 4ngPt/106 細胞，而順鉬顯示為> 5ng Pt/106細胞，然而前者絡合物的IC5tl值小于后者絡合物的一半 (參見圖10和表4)。表3.磷鉬、順鉬和卡鉬在A270和A2780/C30、CH0細胞系中的按μ M濃度的IC50
值絡合物Α780A2780/C30 CHO順鉬7. 5 士 1.5 110 士 11. 29 29 士 3卡鉬90 士 13 > 200>200dach-220 士 448 士 535 士 5dach-4 180士15 155士17116士17am-2100士 11 > 200120 士 30am-4175 士 22 > 200>200en-4170 士 33 > 200>200表4.順鉬和焦dach-2 (pyrodach-2)在A2780與A2780/C30細胞系中對比的鉬細胞積聚(ng/ΙΟ6細胞)A2780A2780/C30濃度(μΜ) 順鉬dach-2順鉬dach-2103.00 士 0· 05 1.00 士 0.20 1.00 士 0.10 1.00 士 0.08205. 00 士 0.06 1. 50 士 0. 30 2. 00 士 0.40 1.00 士 0.02306. 00 士 0.10 3. 00 士 1.00 2. 00 士 0.50 1.00 士 0.025020. 00 士 1.00 5. 00 士 0.30 5. 00 士 1.00 2. 00 士 0.10數(shù)據表明，本發(fā)明的絡合物可通過與順鉬和其他鉬藥物不同的分子機理與細胞機理來誘導凋亡。首先，不存在共價鍵合(參見圖12和實施例13)表明了本發(fā)明絡合物不是通過DNA結合途徑發(fā)揮作用的。本領域的技術人員通常認為，獲得性順鉬耐藥性是由于核 苷酸切除修復過程將鉬從DNA有效地去除。因為明顯不存在DNA結合，所以在本發(fā)明的絡 合物上不可能進行DNA修復機理，對該絡合物的細胞耐藥性可被消除。此結論在細胞毒性 數(shù)據中獲得支持，該數(shù)據表明dach-2在對順鉬和卡鉬均耐藥的細胞系中是有活性的(參見 表3)。第二，本發(fā)明的絡合物是通過與順鉬及其他鉬藥物不同的分子機理和細胞機理 來誘導凋亡的證據，來自于使dach-2與半胱氨酸和谷胱甘肽反應的實驗(數(shù)據未標出)。 dach-2的焦磷酸鹽配體容易被通過巰基的伴發(fā)的絡合物形成作用而替換，表明通過半胱氨 酸或甲硫氨酸殘基的細胞表面蛋白的可能的蛋白質錨定位點。第三，本發(fā)明的絡合物是通過與順鉬及其他鉬藥物不同的分子機理和細胞機理來 誘導凋亡的證據，也來自于關于fas及其相關成員的過度表達的實驗(參見實施例11)。對 本發(fā)明絡合物反應的這種過度表達，說明了在表現(xiàn)本發(fā)明絡合物的細胞毒性活性方面極可 能涉及信號轉導途徑，而非DNA損傷途徑。當用本發(fā)明絡合物處理細胞時，平均地，fas被 過度表達六倍，而在用順鉬處理的細胞中沒有顯著的過度表達被觀察到。如本文所述的，本發(fā)明絡合物與經常使用的順鉬和卡鉬相比一樣有效或者更有 效，因此為早期缺乏有效的順鉬和卡鉬治療的替代選擇的患者提供了一種癌治療方法。但 是，患者不必為了用本文所述的絡合物以及方法治療而先用順鉬或卡鉬治療，這種治療的 用藥可由醫(yī)療人員在醫(yī)院或其他醫(yī)療設施里實施。本發(fā)明絡合物的用藥和劑量是根據良好醫(yī)學執(zhí)業(yè)規(guī)范，考慮到個體患者臨床病 況，用藥的部位和方法，用藥方案，患者的年齡、性別、體重以及醫(yī)療從業(yè)者已知的其他因 素。因此，本文所用的藥學上“有效量”是由本領域已知的這類考慮而決定的。該量必須是 有效的以實現(xiàn)改善，所述改善包括但不限于改善存活率或更快的康復，或者改善或消除癥 狀以及被本領域技術人員選為合適措施的其他指標?？蓪⒈景l(fā)明絡合物向動物包括哺乳動 物用藥。在本發(fā)明的治療方法中，可以各種方式施用本發(fā)明絡合物。應當注意的是，它們可 作為絡合物而被施用，而且可利用這些絡合物優(yōu)異溶解性而單獨地以水溶液施用，或者作 為活性成分與藥學上可接受載體、稀釋劑、佐劑和媒介物組合。該絡合物可口服地，皮下地 或非胃腸地包括靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內、扁桃體內和鼻內用藥，以及鞘內和輸注技術 而給藥。絡合物植入體也是有用的。治療的患者是溫血動物，以及特別是包括人的哺乳動 物。所述藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和媒介物以及植入物載體通常是指與本發(fā)明活 性成分不反應的、惰性的、無毒的固態(tài)或液態(tài)填充物、稀釋劑或包封材料。所述劑量可以是單次劑量或超過數(shù)天時間的多次劑量。治療的時間通常與病程的 時間和藥物的有效性以及治療患者的種類成比例。當非胃腸施用本發(fā)明絡合物時，通常將它們配制成單位劑量可注射形式(溶液、 混懸劑、乳劑)。適于注射的藥用制劑包括無菌水溶液或分散液以及重組為無菌可注射溶液 或分散液用的無菌粉。所述載體可以是溶劑或分散媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(例 如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇及類似物)、它們適宜的混合物以及植物油?？杀３诌m當?shù)牧鲃有?，例如通過使用如卵磷脂的包衣，通過在分散液情形下維持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑。非水性媒介物如棉籽油、芝麻油、橄欖油、豆油、 玉米油、向日葵油、或花生油及酯諸如肉豆蔻異丙酯，也可用作組合物的溶劑體系。另外，可 以加入各種提高組合物穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧化劑、螯 合劑和緩沖劑?？赏ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及類似 物，來確保防止微生物的作用。在許多情況下，比較理想的是包含等滲劑，例如糖、氯化鈉及 類似物?？赏ㄟ^使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來產生可注射藥用形式的延長 的吸收。然而，根據本發(fā)明，所使用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑都得是與本發(fā)明絡合物 相容的。將實施本發(fā)明所用的絡合物與各種所需的其他成分一起加入所需量的合適溶劑中，可制備無菌的可注射溶液。可以用可注射制劑對患者施用本發(fā)明的藥理學制劑，該制劑包括任何相容性載體，諸如各種媒介物、佐劑、添加劑和稀釋劑；或者本發(fā)明中所用的絡合物可以對患者非胃 腸用藥，以緩釋皮下植入體或靶向傳輸系統(tǒng)如單克隆抗體、定向傳輸、離子導入、聚合物基 質、脂質體以及微球的形式。對于本領域的技術人員而言，許多其他這類植入體、傳輸系統(tǒng) 和模式都是熟知的。參照下面的實驗性實例來進一步詳述本發(fā)明。提供這些實例只是為了舉例說明， 而不意欲是限制性的。因此，應當將本發(fā)明解釋為包含了由于本文所提供的教導而將會變 得明顯的任何及全部的變化。以上描述及隨后的實例說明了以與之前所披露的合成方法不同的方式合成焦磷 酸鉬絡合物。已顯示這些絡合物具有抗癌活性，包括在順鉬和卡鉬耐藥性癌中。令人預料 不到地，所顯示的抗癌活性是與一些當前施用的鉬絡合物相當?shù)?，并且在相對較低劑量下 是比一些當前施用的鉬絡合物有活性的。同樣令人預料不到地，數(shù)據表明了本發(fā)明絡合物 具有與當前施用的鉬絡合物不同的作用機理，即它們在治療過程中不結合DNA。因此，本發(fā) 明絡合物代表了用于治療癌有用的新類別的鉬治療藥，所述癌包括之前難于實現(xiàn)有效治療 的順鉬和卡鉬耐藥性癌。本發(fā)明是以示例性方式進行描述，并且應當理解為，所使用的術語意欲是具有詞 語描述性質，而非限制性的。顯然，根據本文教導，本發(fā)明的許多改進和變化是可能的。因 此，應當理解為，在所附的權利要求的范圍內，本發(fā)明可以如具體描述不同的其它方式實 施。實施例1 二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II) (am-2)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig順鉬溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培 育15小時。培育期后，用旋轉蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過濾以除掉任何未反應的起始 材料。通過加入IN HNO3來迅速將pH降至約1.0，沉淀出淡黃色粉末的產物。在冰上冷卻 來完成沉淀，并且通過真空過濾來分離產物，并用冷水和丙酮洗滌。得到Pt (NH3)2 (H2P2O7) 0. 04g(30% )0 31P NMR譜圖顯示了在2. 12ppm處單峰，pH 7. 99，參照85%磷酸的外標。 在-1503ppm處檢測到195Pt NMR共振。實施例2 順式-二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (am-4)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig順鉬溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培 育15小時。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應混合物，并使反應再進行3小時。然后用旋轉蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，過濾以除掉任何未反應的起始材料。通過加入IN HNO3來迅速 將PH降至約1. 0，沉淀出淡黃色的粉末的產物。在冰上冷卻來完成沉淀，并且通過真空過濾 來分離產物，并用冷水和丙酮洗滌。得到順式，反式-Pt (NH3)2 (OH)2 (H2P2O7) 0. 05g(34%)o 31P NMR譜圖顯示了在2.32ppm處單峰，pH 8. 11，以及195Pt-31P耦合常數(shù)為15. 4Hz。195Pt NMR譜圖顯示了在1733ppm處五重峰，以及195Pt-14N耦合常數(shù)為232Hz。實施例3 :1，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II) (en-2)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig 二氯(乙二胺)鉬(II)溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時。培育期后，用旋轉蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過濾以除 掉任何未反應的起始材料。通過加入IN HNO3來迅速將pH降至約1.0，未沉淀出產物。用 31P NMR來原位表征產物。在31P NMR譜圖中觀察到1.93ppm處單峰，以及195Pt-31P常數(shù)為 29.73Hz。實施例4 1，2-乙二胺-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (en-4)將焦磷酸鈉十水合物(0. 4g)和0. Ig 二氯(乙二胺)鉬(II)溶于250mL蒸餾水 中，PH 8，并于40°C培育15小時。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應混合物，并使反應 再進行3小時。然后用旋轉蒸發(fā)濃縮該溶液至5-10mL，并過濾以除掉任何未反應的起始材 料。通過加入IN HNO3來迅速將pH降至約1. 0，沉淀出淡黃色粉末的產物。在冰上冷卻來完 成沉淀，并且通過真空過濾來分離產物，并用冷水和丙酮洗滌。得到反式-Pt(OH)2(C2H8N2) (H2P2O7) 0. 07g(49% )。31P NMR 譜圖顯示了在 2. 30ppm 處單峰，pH 8. 13，以及 195Pt-31P 耦 合常數(shù)為25. 9Hz。195Pt NMR譜圖顯示在1582ppm處寬峰。實施例5 :(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II) (dach-2)將焦磷酸鈉十水合物(0.4g)和0. Ig 二氯(反式-1，2-二氨基環(huán)己基)鉬(II) 溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時。培育期后，用旋轉蒸發(fā)濃縮該溶液至 5-10mL,并過濾以除掉任何未反應的起始材料。通過加入IN HNO3來迅速將pH降至約1. 0， 沉淀出淡黃色粉末的產物。在冰上冷卻來完成沉淀，并且通過真空過濾來分離產物，并用冷 水和丙酮洗滌。得到反式-Pt (C6H14N2) (H2P2O7) 0. 05g(38%)o31P NMR譜圖顯示了在 1. 78ppm 處單峰，pH 7. 93，以及195Pt-31P常數(shù)為25. 03Hz。在-1729ppm處記錄到195Pt NMR信號。實施例6:(反式-1，2-環(huán)己二胺)_反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV) (dach-4)將焦磷酸鈉十水合物(0.4g)和0. Ig 二氯(反式-1，2-二氨基環(huán)己基)鉬(II) 溶于250mL蒸餾水中，pH 8，并于40°C培育15小時。培育期后，將ImL 30% H2O2加至反應 混合物，并使反應再進行3小時。然后用旋轉蒸發(fā)來濃縮該溶液至5-10mL，并過濾以除掉 任何未反應的起始材料。通過加入INHNO3來迅速將pH降至約1.0，沉淀出淡黃色粉末的 產物。在冰上冷卻來完成沉淀，并且通過真空過濾來分離產物，并用冷水和丙酮洗滌。得到 反式-Pt(OH)2(C6H14N2) (H2P2O7) 0. 07g(52% )。31P NMR 譜圖顯示了在 2. 41ppm 處單峰，pH 7. 95，以及195Pt-31P耦合常數(shù)為25. 9Hz。195Pt NMR譜圖顯示了在1613ppm處寬峰。實施例7可使用31P NMR光譜法以證實圖2中所示的以及實施例1_6中所述的各自的二胺 (焦磷酸)鉬(II)和二胺(二羥配位基)(焦磷酸)鉬(IV)絡合物是用本文所述的新方法 合成和分離的。
這些絡合物中的每個顯示了在化學位移1. 78-2. 12ppm范圍中單一31PNMR共振。這些化學位移相比于游離焦磷酸鹽配體是在9-llppm的低場，與本領域所報道的磷酸鹽螯合 物的已觀測到配位化學位移相一致。如不存在預期的兩組二重峰所揭示的，在最終產品中 未檢測到單齒的焦磷酸絡合物。31PNMR數(shù)據也顯示了用H2O2將Pt (II)絡合物氧化為Pt (IV) 絡合物是選擇性的，如在每種情況中單一焦磷酸鉬(IV)絡合物的形成所證明的。實施例8人卵巢癌細胞,A2780，獲得自 Thomas Hamilton 博士(Fox Chase CancerCenter, 費城，賓夕法尼亞州)。使用補充了 10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.25單位/mL胰島素以 及青霉素/鏈霉素的RPMI 1640，在連續(xù)充氣5% CO2的371培養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)細胞。為了 維持細胞指數(shù)生長，使用在HBSS中0. 0625%的胰蛋白酶將細胞傳代培養(yǎng)。使用集落形成(clonogenic)試驗來測定IC50值。簡要地說，在藥物處理前24小 時，將來自單個細胞懸浮液的500個A2780細胞平鋪在60mm Peri培養(yǎng)皿上，以使細胞貼壁。 在藥物處理當天，將培養(yǎng)基傾析，并用藥物替換，而且將這些已處理的細胞放回37°C培養(yǎng)箱 中，持續(xù)1小時。對于每個藥物濃度建立一式三份的培養(yǎng)皿。在藥物處理1小時后，傾析含 藥物的培養(yǎng)基并用新培養(yǎng)基替換。將這些培養(yǎng)皿放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)集落形成1星期。 固定集落，并且用在純甲醇中2%結晶紫染色。對含50個細胞以上的集落計數(shù)。將來自一 式三份培養(yǎng)皿的計數(shù)的集落數(shù)目進行平均，將這個數(shù)目除以所平鋪的細胞數(shù)目，以獲得集 落形成細胞的分數(shù)值。然后，針對培養(yǎng)皿效率校正這些集落形成細胞的分數(shù)值，通過將其除 以在藥物未處理培養(yǎng)皿中集落形成細胞的數(shù)目。表3顯示了本文所述絡合物的抗癌活性，以IC50值表示，對比順鉬和卡鉬。如從 這些數(shù)據可看到的，在耐藥性細胞系中dach-2表現(xiàn)出比順鉬和卡鉬兩者均更佳的性質。而 且，dach-4顯示了比卡鉬高得多的活性。數(shù)據也表明，對于順鉬/卡鉬耐藥性癌細胞和順 鉬敏感性細胞，dach-4 一樣有效或更有效，這進一步表明磷鉬不可能發(fā)展耐藥性。不同于順鉬和卡鉬，預計本發(fā)明的磷酸絡合物由于磷酸配體的存在而表現(xiàn)出較低 的毒性，其可能有助于有效地將這些絡合物運輸至細胞。而且，與順鉬不同，這些磷酸絡合 物在72小時內未顯示出任何可檢測到的對DNA的結合，如圖12所示。順鉬被認為是通過 結合基因組DNA而發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的磷酸絡合物具有不同的細胞靶。實施例9順鉬耐藥性卵巢細胞系(C30) (Hamaguchi等，1993)，獲得自ThomasHamilton博 士(Fox Chase Cancer Center，費城，賓夕法尼亞州)，用本發(fā)明的單體鉬絡合物(圖2所 示)進行處理。該細胞系也是卡鉬交叉耐藥性的。使用補充了 10%胎牛血清、2mM谷氨酰 胺、0. 25單位/mL胰島素以及青霉素/鏈霉素的RPMI 1640，在連續(xù)充氣5% CO2的37°C培 養(yǎng)箱中單層培養(yǎng)細胞。為了維持細胞指數(shù)生長，使用在HBSS中0.025%的胰蛋白酶將細胞 傳代培養(yǎng)。使用集落形成試驗來測定IC50值。簡要地說，在藥物處理前24小時，將來自單個 細胞懸浮液的500個C30細胞平鋪在60mm Petri培養(yǎng)皿上，以使細胞貼壁。在藥物處理當 天，將培養(yǎng)基傾析，并用藥物替換，而且將這些已處理的細胞放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)1小 時。對于每個藥物濃度建立一式三份的培養(yǎng)皿。在藥物處理1小時后，傾析含藥物的培養(yǎng) 基并用新培養(yǎng)基替換。將這些培養(yǎng)皿放回37°C培養(yǎng)箱中，持續(xù)集落形成1星期。固定集落，并且用在純甲醇中2%結晶紫染色。對含50個細胞以上的集落計數(shù)。將來自一式三份培養(yǎng)皿計數(shù)的集落數(shù)目進行平均，將這個數(shù)目除以所平鋪的細胞數(shù)目，以獲得集落形成細胞的 分數(shù)值。然后，針對培養(yǎng)皿效率校正這些集落形成細胞的分數(shù)值，通過將其除以在藥物未處 理培養(yǎng)皿中集落形成細胞的數(shù)目。實施例10源自人頭頸鱗狀細胞癌的UMSCClOb (順鉬敏感性)和UMSCC10b/15s(順鉬耐藥 性)細胞系，是獲得自加州大學(圣迭戈)的Stephen B. Howell博士的細胞系。在含有 10%胎牛血清、100單位/ml青霉素和100μ g/ml鏈霉素的1640RPMI中培養(yǎng)細胞。將細胞接種至24孔板，每孔板中大約20，000個細胞/500 μ 1培養(yǎng)基。將細胞曝露于dach-2，可變 的濃度范圍是1. 12 μ M至最大72 μ Μ。制備dach-2絡合物的貯存液，并且添加這些溶液的 等份小樣以制備那些有效的濃度。然后，使細胞生長72小時。在本研究中使用了十二種不 同的濃度。每個濃度具有一個對照，總計12個對照。可估計UMSCClOb (順鉬敏感性)的IC50低于1.0 μ M。相比之下，在同樣的細 胞系中順鉬的 IC50 值為17μΜ(參見 Zheng 等，Clinical Cancer Research, 1997,3, 1157-1165)。測得UMSCC10b/15s (順鉬耐藥性)的IC50為5 μ Μ。圖9顯示了順鉬敏感性 細胞系和順鉬耐藥性細胞系的細胞存活曲線。實施例11使用包含84個基因的細胞凋亡陣列、實時PCR進行涉及本發(fā)明絡合物(數(shù)據未標 示)相比于順鉬的初步基因表達實驗，包括了 BCL2超家族，促細胞凋亡及抗細胞凋亡兩種， 半胱氨酸蛋白酶，BIR-家族，TNF受體激活劑因子，Ρ53及其同源物、以及fas相關成員。對 兩組基因表達的密切觀察清楚地表明了在表達模式上的一些不同。例如，fas及fas超家 族基因成員在dach-2處理的細胞中過度表達，而順鉬在這些基因的表達中引起微小變化。 具體地說，fas相比于對照被過度表達6倍，而TNFRS基因諸如TNFRSF-10B比對照被過度 表達2-3倍。這些后者的受體因子屬于fas超家族。有趣的是，觀察到dach-2使促細胞凋 亡的BCL2成員諸如BAKl和BAX被過度表達約2_3倍，而順鉬在它們的表達中沒有顯著的 變化。實施例12鉬的細胞積聚和DNA結合的鉬的估算由通過使用水中的順鉬或焦dach-2所建立的校正曲線，來在石墨爐原子吸收光 譜儀(Perkin Elmer AA-600)上定量地估算鉬含量。將細胞(5X106)接種在T75cm2燒瓶 中。24小時后，然后用不同濃度(0yM、10yM、20yM、30yMfP50yM)的順鉬和焦dach-2 處理這些細胞。用鉬絡合物曝露1小時后，除去含藥物的培養(yǎng)基，并用冰冷的磷酸鹽緩沖的 鹽水(PBS)沖洗細胞。然后，將細胞胰蛋白酶化并離心成球團。根據McGahan的方法，在分 析前將細胞球團在濃HNO3和H2O2中浸漬。表4所報告的數(shù)據收集自三個獨立實驗，每個實 驗進行兩次。關于順鉬積聚，數(shù)據獲得自給定濃度的單一樣品三次操作。關于DNA-Pt的檢測，將1.0X IO7細胞接種在T75cm2燒瓶中。24小時后，加入不 同濃度0 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ M禾口 50 μ M的鉬絡合物。用鉬絡合物處理細胞，持續(xù)24小 時。處理后，除去培養(yǎng)基，而且用冰冷的PBS沖洗。將細胞胰蛋白酶化并離心成球團。使 用Wizard SV DNA純化試劑盒(Promega)來提取DNA。使用NanoDrop UV-Vis儀器來從 260nm處的吸收定量地估算DNA。
實施例13 匪R檢測鉬-DNA結合在Bruker 500MHz NMR儀器上99% (原子)D2O中以水抑制脈沖序列進行質子NMR光譜法實驗。樣品含有順鉬(2. OmM)或焦dach-2 (2. OmM)和核苷酸(5’ -dGMP，5，-dAMP， dGpG (5. OmM))，以及單鏈和雙鏈的DNA (小牛胸腺，5. OmM)，用磷酸鹽和碳酸鹽緩沖液 (10-20mM)保持pH 7.0。在相同的條件下，也進行順鉬(0. 25mM)和焦dach-2 (0. 25mM)與 合成的 25-mer :5，-ATGATTTAGGTGACACTATAGCAGT-3，(0. 25mM)反應。反應進行長達 7 天， 并且以固定時間間隔記錄了 1H和31P NMR譜圖。通常，檢測中使用5μ s脈沖寬度以及1.0s 重復延時。一般選擇掃描寬度10，OOOHz和32K數(shù)據點來收集自由感應衰減。對于所應用 的傅里葉變換，線增寬因子為1Hz?；瘜W位移參照H-O-D峰，位于4. 67ppm。
權利要求
一種用于治療癌的組合物，其包括一種或更多種如圖1所給出的式I、II、III和IV的分離的單體鉑絡合物其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺或芳香族胺，而且其中當R1和R2中的一個為NH3時，R1和R2中的另一個不是NH3；而且其中S獨立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸；或者其藥學上可接受的鹽。
2.如權利要求1所述的組合物，其中R1和R2各自獨立地選自氨合物、甲胺、乙胺、丙胺、 異丙胺、丁胺、環(huán)己胺、苯胺、吡啶和取代的吡啶。
3.如權利要求1所述的組合物，其中R3選自乙二胺和環(huán)己二胺。
4.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物是1，2_乙二胺(二氫焦 磷酸)鉬(II)。
5.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物是(反式-1，2-環(huán)己二 胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)。
6.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物是順式_二氨合_反 式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
7.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物是1，2_乙二胺-反 式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
8.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物是反式-1，2-環(huán)己二 胺)_反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
9.一種用于治療癌的組合物，其包含一種或更多種選自以下的分離的單體鉬絡合物(i)順式_二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；(ii)l，2-乙二胺(二氫焦磷酸)鉬(II)；(iii)l，2-乙二胺-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；(iv)(反式-1，2-環(huán)己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)；(ν)反式-1，2-環(huán)己二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)；和 (vi)其藥學上可接受的鹽。
10.如權利要求9所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物在PH約6至約8之間 的水溶液中是穩(wěn)定的。
11.如權利要求9所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物不結合DNA。
12.如權利要求11所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物引發(fā)fas以及fas相 關轉錄因子的過度表達。
13.如權利要求11所述的組合物，其中所述分離的單體鉬絡合物引發(fā)促細胞凋亡基因 的過度表達。
14.如權利要求13所述的組合物，其中所述促細胞凋亡基因是Bak和Bax。
15.一種制備分離的單體鉬(II)絡合物的方法，所述方法包括(i)將含過量焦磷酸鹽與如圖15所給出的式V和式VI鉬絡合物的含水反應混合物 其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺，而且 其中X獨立地選自鹵素；維持在約30至約60攝氏度的溫度，持續(xù)約12至約18小時的時間，pH為約7至約9 ；( )隨后濃縮所述含水反應混合物，以使不形成焦磷酸鹽沉淀；(iii)通過加入酸來將反應混合物的PH迅速降至pH小于2 ；其中，所述分離的單體鉬絡合物具有如圖1所給出的式I或III其中R\R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺；而且其中所述分離的單體鉬絡合物在PH約6至約9之間的水溶液中是穩(wěn)定的。
16.如權利要求15所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡合物是(反式-1，2-環(huán) 己二胺)(二氫焦磷酸)鉬(II)。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述溫度是40攝氏度，且反應時間是15小時，并 且PH是在7與8之間。
18.如權利要求15所述的方法，其還包括在濃縮反應混合物之后將反應混合物冷卻至 5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
19.如權利要求15所述的方法，其還包括在降低反應混合物的pH之后將反應混合物冷 卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
20.一種制備分離的單體鉬(IV)絡合物的方法，所述方法包括(i)將含過量焦磷酸鹽與如圖15所給出的式V和式VI鉬絡合物的含水反應混合物 其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺，而且 其中X獨立地選自鹵素；維持在約30至約60攝氏度的溫度，持續(xù)約12至約18小時，pH為約7至約9 ； ( )向反應混合物加入過氧化氫，以及選自由乙酸鹽、丁酸鹽和α-羥基酸的鹽及其 組合所組成的組的任選試劑；(iii)隨后濃縮含水反應混合物，以使不形成焦磷酸鹽沉淀；(iv)通過加入硝酸來將反應混合物的pH迅速降至pH小于2； 其中，所述分離的單體鉬絡合物具有如圖1所給出的式II或IV ；其中R1、R2和R3各自獨立地選自取代的或未取代的脂肪族胺和芳香族胺；其中S獨立地選自氫氧化物、乙酸、丁酸和α-羥基酸；而且其中所述分離的單體鉬絡合物在PH約6與約9之間的水溶液中是穩(wěn)定的。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述溫度是40攝氏度，且反應時間是15小時，而 且pH在7與8之間。
22.如權利要求20所述的方法，其還包括在濃縮反應混合物之后將反應混合物冷卻至 5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
23.如權利要求20所述的方法，其還包括在降低反應混合物的pH之后將反應混合物冷 卻至5攝氏度與環(huán)境溫度之間的溫度。
24.如權利要求20所述的方法，其中在濃縮反應混合物前與過氧化氫一起加入的任選 試劑選自乙酸鈉、丁酸鈉和α-羥基酸鈉鹽。
25.如權利要求20所述的方法，其中在濃縮反應混合物前與過氧化氫一起加入的任選 試劑選自乙酸鉀、丁酸鉀和α-羥基酸鉀鹽。
26.如權利要求20所述的方法，其中過氧化氫的初始體積比濃度為30%。
27.如權利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡合物是順式_二氨合-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
28.如權利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡合物是1，2-乙二胺-反 式_ 二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
29.如權利要求20所述的方法，其中所制備的分離的單體鉬絡合物是反式-1，2-環(huán)己 二胺)-反式-二羥配位基(二氫焦磷酸)鉬(IV)。
30.一種治療癌的方法，所述方法包括施用治療上有效量的至少一種選自權利要求1 所述絡合物的分離的單體鉬絡合物，以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或媒 介物。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述癌選自卵巢癌、睪丸癌、小細胞肺癌和頭頸癌。
32.—種治療對選自順鉬、卡鉬和奧沙利鉬的一種或更多種抗癌劑耐藥的癌的方法，所 述方法包括施用治療上有效量的至少一種選自二氨合(二氫焦磷酸)鉬(II)和權利要求 1所述絡合物的分離的單體鉬絡合物，以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或 媒介物。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述癌選自卵巢癌、睪丸癌、小細胞肺癌和頭頸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了磷鉑，穩(wěn)定的、分離的單體鉑(II)和(IV)的磷酸絡合物，以及其用于治療癌的方法，所述癌包括對順鉑和卡鉑耐藥性癌。與順鉑不同，這些絡合物不易進行水解并且頗溶于和穩(wěn)定于水溶液中。而且，與順鉑、卡鉑以及基于鉑的相關抗癌劑不同，這些絡合物不結合DNA。確切地，數(shù)據表明磷鉑引發(fā)fas及fas相關轉錄因子以及某些促細胞凋亡基因如Bak和Bax的過度表達。不過，這些絡合物表現(xiàn)出對癌細胞極大的細胞毒性。因此，本發(fā)明提供了具有與本領域那些不同分子靶的新的鉑抗癌劑。
文檔編號A61K33/24GK101801369SQ200880101577
公開日2010年8月11日 申請日期2008年8月6日 優(yōu)先權日2007年8月6日
發(fā)明者拉廷德拉·N·博斯 申請人:俄亥俄大學