專利名稱：用于調節(jié)巨噬細胞抑制因子(mic-1)活性的藥劑和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于調節(jié)對象的食欲和/或體重的方法和新型藥劑。此外，本發(fā)明還 涉及篩選與巨噬細胞抑制因子-l(MIC-l)受體復合物相互作用并調節(jié)其活性的藥劑的方法。通過引用而并入本專利申請要求2007年8月16日提交的名稱為“Agents andmethods for modulating macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1) activity"^AU2007904412 ^^ 先權，該申請的全部內容在此通過引用并入本文中。此外，在下面的說明書中參考下述專利說明書-國際專利申請No. PCT/AU2005/000525(W0 2005/099746)；以及-美國專利5,225,539。這兩篇專利說明書每一篇的全部內容均在此通過引用并入本文中。
背景技術：
體重和食欲控制是復雜的、未完全表征的過程。其失調可導致肥胖，肥胖是一個重 要的世界性公共健康問題。在另一個極端，食欲減退/惡病質最常見是由于晚期癌癥而引 起的，在晚期癌癥中，認為腫瘤或基質細胞衍生分子(stromal cell derived molecule)干 擾了對食欲和體重的嚴格控制，導致消瘦、衰弱，并常常導致死亡h。已經表明幾種細胞因 子與食欲減退/惡病質的發(fā)病機理相關，但是認為白細胞介素_6 (IL-6)是最可能的發(fā)病原 因。然而，迄今為止還沒有抗IL-6單克隆抗體的人臨床試驗表現(xiàn)出在治療癌癥食欲減退/ 惡病質中的效力。MIC-1 (又稱為ffl)F-15、PLAB、PDF和NAG-1)是TGF- ^超家族的分支成員，其在基 礎條件下不表達，但是可被炎癥、損傷或惡性腫瘤形成所誘導7_13。MIC-1在許多癌癥(包括 前列腺癌、結腸癌、胰腺癌和乳癌)中過表達14。在晚期癌癥患者中，這導致血清MIC-1水 平顯著升高，可升高10-100倍，從平均450pg/ml升高到5-50ng/ml的水平或更高。由于表 達水平的個體差異和通過前轉化酶(pro-convertase)加工成熟MIC-1的不同，單個腫瘤分 泌的MIC-1的量可不盡相同”。MIC-1前肽強有力地結合細胞外基質(ECM)，導致MIC-1的 ECM儲備形成，這可在體外和體內證實。僅加工后形式的MIC-1 (缺少結合前肽的基質)擴 散到循環(huán)中。因此，所述前肽調節(jié)體內ECM儲備和循環(huán)血中MIC-1水平之間的平衡”。本發(fā)明人之前在國際專利申請No. PCT/AU2005/000525 (W02005/099746)中描述 了調節(jié)對象中食欲和/或體重的方法和藥劑，所述方法和藥劑涉及MIC-1活性的調節(jié)。其 中所述的具體藥劑類型是抗MIC-1抗體，其抑制MIC-1活性并且能增加對象的食欲和/或 體重。下文提供了過表達MIC-1的腫瘤誘導食欲減退/惡病質的進一步證據(jù)，所述食欲減 退/惡病質可通過施用抗MIC-1抗體來逆轉，并且可通過注射重組MIC-1來誘導。此外，還 研究了 MIC-1的作用機制，導致了 MIC-1受體復合物以及影響食欲和能量動態(tài)平衡調節(jié)的 潛在中樞調節(jié)劑的表征。
因此，本發(fā)明人鑒定了用于調節(jié)食欲和/或體重的方法和新型藥劑等。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及用于調節(jié)巨噬細胞抑制因子-l(MIC-l)活性的新型藥劑的鑒定，其中 所述藥劑調節(jié)包含轉化生長因子(TGF-0)RII受體之MIC-1受體復合物的活性。通過 調節(jié)MIC-1的活性，所述藥劑能夠調節(jié)對象的食欲和/或體重。因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供了調節(jié)對象中巨噬細胞抑制因子-l(MIC-l) 活性的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的調節(jié)包含轉化生長因子(TGF-3) RII受體之MIC-1受體復合物的活性的藥劑，其任選地與藥理學上可接受的載體和/或賦形 劑相混合。本發(fā)明還提供了篩選調節(jié)MIC-1活性之藥劑的候選藥劑或藥劑庫的方法。因此，在第二個方面中，本發(fā)明提供了篩選能夠調節(jié)巨噬細胞抑制因子-l(MIC-l) 活性之藥劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉化生長因子(TGF-0)RII受體的MIC-1受體復合物或 其單體接觸，以及(ii)檢測所述MIC-1受體復合物或其單體的任何活性變化。在第三個方面中，本發(fā)明提供了通過所述第二個方面的篩選方法鑒定的新藥劑。


圖1顯示a.對肋腹皮下注射DU145人前列腺癌細胞系的45只裸小鼠的體重和 腫瘤大小的影響，所述DU145人前列腺癌細胞系已經用表達hMIC-1的質粒構建體或空質粒 載體進行了永久轉染。監(jiān)測所述小鼠的體重和腫瘤大小6周。處死時，通過ELISA測定血 清hMIC-1水平，以體重減輕程度的平均值和標準差對血清hMIC-1水平范圍作圖；b.單次 劑量MIC-1-MAb對裸鼠平均體重變化的影響，所述裸鼠利用導致高血清MIC-1水平的構建 體永久轉染的DU145細胞進行了異種移植。11天后，當帶有表達MIC-1之腫瘤的小鼠的體 重顯著降低時，給小鼠腹膜內注射單次劑量的MIC-1-Mab，每個劑量注射3只小鼠，給5只 小鼠注射對照緩沖液(載體)或不作處理。每日監(jiān)測其體重，監(jiān)測20天。繪圖顯示所述 小鼠的峰值體重增加相比于對照小鼠在此相同時間段內平均體重變化的平均值和標準差； c.顯示根據(jù)“l(fā)b”的小鼠的反應持續(xù)時間(定義為其體重恢復至注射抗體當天的體重的時 間)的平均值和標準差對所施用的MIC-1-Mab的劑量作圖；d.顯示利用導致高血清MIC-1 水平的構建體永久轉染的DU145細胞進行異種移植的20只裸鼠和利用對照空載體轉染的 DU145細胞進行異種移植的20只裸鼠的體重變化。注射后第8天，當MIC-1小鼠的平均體 重減輕為7%時，監(jiān)測3個連續(xù)的24小時時間段的攝食量。將食物置于料斗內并在0時間 點稱重。24小時后，從置入所述料斗中的食物中減去未進食和溢失的食物來測定所消耗的 食物。結果以每天每克小鼠體重所消耗的食物重量(克)的平均值和標準差來表示。* = p < 0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001 ;e.給20只裸鼠植入利用導致高MIC-1水平 的構建體永久轉染的DU145細胞，給20只小鼠植入對照空載體構建體。當帶有MIC-1腫瘤 的小鼠體重減輕約18%時，處死小鼠。剝離肩胛骨間棕色脂肪組織、腹股溝、附睪和腹膜后 白色脂肪組織以及脛骨肌和腓腸肌，取出并稱重。總白色脂肪代表腹股溝、附睪和腹膜后脂肪貯庫的總重量。結果以樣本重量的平均值和標準差表示，所述樣品重量表示為注射腫瘤 當天的小鼠體重的比例。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，= p < 0. 001 ；f.剝離之前， 對“l(fā).e”中的小鼠進行DXA掃描以測定總的瘦肉質量和脂肪質量。所示結果表示為總重 量(以克計)的平均值和標準差。*** = p < 0. 001 ；g.皮下注射10 y g高度純化的重組 hMIC-1來處理12只BALB/c小鼠，每日兩次。在實驗開始時，給一半小鼠腹膜內單次注射 10mg MIC-1-PAb或對照-PAb。每日監(jiān)測小鼠體重，以其初始體重的百分數(shù)表示，將結果繪 制為平均值和標準差；以及h.顯示監(jiān)測“ lg”中所述hMIC-1處理的小鼠的3個連續(xù)24小 時時間段的每日攝食量。將食物置于料斗中并在0時間點稱重。24小時后，從置入所述料 斗中的食物中減去未進食和溢失的食物來測定所消耗的食物。結果表示為每天每克小鼠體 重所消耗的食物重量(克)的平均值和標準差。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖2顯示a. (A)用空載體轉染的DU145細胞進行異種移植的裸鼠、⑶用過表達 MIC-1的DU145細胞進行異種移植后第14天的裸鼠以及(C)按照“B”處理但是預先腹膜 內注射lmg MIC-1-Mab 9天的小鼠的代表性照片。箭頭表示腫瘤生長部位；b.利用表達 hMIC-1的質粒構建體或含有MIC-1的空質粒載體轉染的DU145細胞和對照腫瘤進行異種移 植的40只裸鼠的體重的平均值和標準差。圖3提供了得自利用導致高血清MIC-1水平的構建體永久轉染的DU145細胞進行 異種移植的裸鼠的數(shù)據(jù)。11天后，當帶有表達MIC-1的腫瘤的小鼠體重顯著減輕時，給小鼠 腹膜內注射3種不同劑量的MIC-1-Mab或對照緩沖液(PBS)，每個劑量注射3只小鼠。每日 監(jiān)測其體重，監(jiān)測20天。就每組而言，以其相對體重變化的平均值和標準差對隨實驗進程 的時間作圖。用箭頭標出注射MIC-1-Mab的時間。圖4顯示MIC-1劑量對體重減輕的影響。給18只9周齡的BALB/c小鼠皮下注射 載體對照或指定量的重組MIC-1，每日兩次。每日監(jiān)測其體重，監(jiān)測3天，計算此期間的體重 變化。將結果歸一化為載體對照注射第一天的體重并以平均值和標準差對結果繪圖。圖5顯示a.MIC-l或載體(對照)處理的自由進食的小鼠以及載體處理的配對進 食的動物的體重變化(每組6只)。給小鼠皮下注射10 u gMIC-1 (或載體)，每日兩次，注 射10天。將結果歸一化為MIC-1注射第一天的體重并以平均值和標準差對結果繪圖。與載 體處理的對照小鼠相比，MIC-1處理的小鼠(p < 0. 05)以及配對進食的小鼠(p < 0. 001) 的體重顯著降低。MIC-1處理的小鼠與配對進食的小鼠之間的差異不顯著(兩因素重復測 量的方差分析AN0VA)。b. 10天后，對5a中的小鼠進行DXA掃描以測定全身脂肪質量和兩 只后腿的瘦肉質量。結果表示為平均值(克)和標準差。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，
氺氺氺=p < 0. 001。圖6顯示MIC-1對小鼠能量消耗的影響。將15只BALB/c小鼠單獨飼養(yǎng)在開放回 路量熱儀(open circuit calorimeter)中并使其在籠中適應24小時。在開始夜晚循環(huán) 時，給8只小鼠皮下注射(箭頭UOygMIC-l，給7只小鼠皮下注射對照緩沖液。在下一個 循環(huán)初期給予第二次注射(箭頭)，其后立即撤除食物以監(jiān)測禁食狀態(tài)下MIC-1誘導的代 謝變化。測量每個27分鐘周期的能耗(熱量)、呼吸交換率(RER)、耗氧量以及運動(x和 y總計數(shù))。以橫條標出12小時的黑暗和光照循環(huán)。數(shù)據(jù)是2個循環(huán)的平均值，并以平均 值和平均值的標準誤對所述數(shù)據(jù)繪圖。通過兩因素重復測量的方差分析AN0VA來比較所述數(shù)據(jù)。* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖7顯示MIC-1對ob/ob小鼠體重變化和攝食量的影響。給瘦素缺陷ob/ob小 鼠皮下注射載體對照(5只小鼠)或10i!g/20g體重的重組MIC-1(5只小鼠)，每日兩次。
a.每日測量體重，將結果歸一化為MIC-1注射第一天的體重并以平均值和標準差對結果繪 圖。b.測量最后一天的攝食量并歸一化為實驗開始時的初始體重。利用雙尾t檢驗分析所 述結果。* = p < 0. 05。圖8提供了(a)對照腫瘤小鼠以及(b)MIC-l腫瘤小鼠的下丘腦弓狀核中GHRH mRNA表達的原位雜交的乳液自顯影圖片。Arc:下丘腦弓狀核；3V:第三腦室。比例尺= 40 y m。圖9顯示晚期前列腺癌患者中MIC-1 (a)或IL_6 (b)的血清水平與體重變化之間 的關系。圖10顯示a 檢測出生后(0-48小時，N = 76)、3周齡(N = 36)以及8-9周齡(N =40)的fmsMIC-1轉基因小鼠以及其WT同窩小鼠的體重。針對每個時間點和性別將體重 歸一化。結果以平均值和標準差表示。* = p < 0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001。
b.監(jiān)測8周齡的fmsMIC-1和WT同系對照小鼠的3個連續(xù)24小時時間段內的每天攝食 量，如圖4a所示。結果以平均值和標準差表示。* = p<0. 05，# = p < 0. 01，= p < 0. 001。c.在第52-54天齡處死5只雄性和5只雌性fmsMIC-1轉基因小鼠以及4只雄 性和5只雌性同系對照小鼠。按照圖le剝離脂肪貯積和脛骨肌以及腓腸肌，取出并稱重。 以樣本體重的平均值和標準差分開表示雄性和雌性小鼠的結果，所述樣品體重以小鼠體重 的比例表示，* = p < 0. 05，** = p < 0. 01，*** = p < 0. 001。圖11提供直接AAV介導的下丘腦中MIC-1過表達所引起的體重減輕的結果。給 小鼠單側下丘腦內注射表達MIC-1的AAV或對照AAV。監(jiān)測12只小鼠的體重，其中一半小 鼠單側下丘腦內注射過表達MIC-1的AAV，另一半小鼠單側下丘腦內注射對照AAV載體。每 日給小鼠稱重，以平均值和所述平均值的標準誤對結果繪圖。發(fā)明詳述之前已經發(fā)現(xiàn)許多癌癥(尤其是上皮細胞來源的癌癥)過表達MIC-1，導致循環(huán) 中MIC-1水平(即血清水平)升高。還發(fā)現(xiàn)這些水平與癌癥疾病的時期和程度成比例，在 晚期癌癥的情形下，這些水平尤其與顯著的體重減輕相關。相似地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)患有慢性腎衰 竭(通常伴隨體重減輕和食欲減退/惡病質的病癥)的患者的血清MIC-1水平顯著升高， 這與體重指數(shù)(BMI)降低有關。通過降低MIC-1水平或MIC-1活性，預計與癌癥、慢性腎衰 竭或其它由血清MIC-1水平升高介導的病因相關的體重減輕可被逆轉或減輕。實際上，在 上述國際專利申請No PCT/AU2005/000525 (W0 2005/099746)中，本申請人證明了抗MIC-1 抗體(抑制MIC-1活性)實際上能引起過表達MIC-1的腫瘤小鼠的體重增加。實現(xiàn)體重減 輕的逆轉或減輕是一個重要的臨床結果，因為預計這導致提高患者健康程度，因此認為能 成功治療患者的癌癥、慢性腎衰竭或其它病因的疾病或病癥，根據(jù)具體情況而定?，F(xiàn)在，本發(fā)明人研究了 MIC-1作用機制，這導致更深入了解通過MIC-1調節(jié)食 欲的途徑和潛在的中樞調節(jié)劑。更具體而言，現(xiàn)在將所述MIC-1受體復合物表征為含有 TGF-0RII受體。因此，本發(fā)明鑒定了用于調節(jié)食欲和/或體重的新型藥劑，其中所述藥劑 通過調節(jié)MIC-1受體復合物的MIC-1受體活性起作用。此外，本發(fā)明人鑒定了篩選與MIC-1受體復合物相互作用并且調節(jié)MIC-1受體復合物活性的新型藥劑的方法。因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供調節(jié)對象中巨噬細胞抑制因子-1 (MIC-1)活 性的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的調節(jié)MIC-1受體復合物活性的藥劑，其 任選地與藥理學上可接受的載體和/或賦形劑相混合，所述MIC-1受體復合物含有轉化生 長因子-3(TGF-3)的RII受體。優(yōu)選地，所述藥劑與MIC-1受體復合物相互作用并調節(jié)MIC-1受體復合物的活性， 然而，所述藥劑還可通過調節(jié)MIC-1受體復合物的量來起作用。通過調節(jié)MIC-1活性，所述藥劑能調節(jié)對象的食欲和/或體重。更具體而言，通過抑制(即拮抗)MIC_1活性(例如通過結合和阻斷所述MIC-1受 體復合物)，所述藥劑能增加對象的食欲和/或體重。在此情形下，所述方法適用于治療與 由于癌癥、慢性腎衰竭或其它病因疾病、病癥或治療引起的MIC-1過表達相關的食欲減退/ 惡病質。另一方面，通過提高(即激動)MIC_1活性(例如通過結合和刺激MIC-1受體復合 物活性而模擬MIC-1活性)，所述藥劑能降低對象的食欲和/或體重。在此情形下，所述方 法可適用于治療例如肥胖。TGF-0超家族蛋白(包括MIC-1)受體超家族的受體是四聚體復合物，其含有兩個 RI受體單體和兩個RII受體單體。所述MIC-1受體是四聚體復合物，其含有兩個RI受體單體和兩個TGF-0RII受 體。存在TGF-0 RII受體的許多剪接變體和其它變體(參見例如Konrad，L等38所述的變 體)，因此，應當理解的是本文所用的術語“TGF- 0 RII受體”包括這些變體。用在所述第一個方面的方法中的藥劑可與一個或兩個所述TGF-0RII受體單體 和/或一個或兩個RI受體單體相互作用。然而，優(yōu)選地，所述藥劑與一個或兩個TGF- 0 RII 受體單體相互作用。優(yōu)選地，所述TGF- 0 II受體單體單體是下丘腦TGF- 0 RII受體單體。優(yōu)選地，所述方法包括抑制MIC-1活性并且是為了增加對象的食欲和/或體重而 進行的，所述對象可能患有與以下原因引起的MIC-1過表達相關的食欲減退/惡病質癌癥 (尤其是上皮細胞癌癥，例如前列腺癌、結腸癌、胰腺癌和乳癌)、慢性腎衰竭或其它病因疾 病(例如炎性疾病，比如類風濕性關節(jié)炎)、病癥(例如損傷、炎癥或應激)或治療(例如放 療或化療)。為了抑制MIC-1活性，所述藥劑優(yōu)選選自結合和阻斷TGF-0RII受體(優(yōu)選下 丘腦TGF-0 RII受體)的藥劑，但是預計結合和阻斷RI受體或其它方式抑制四聚體MIC-1 受體復合物的單體之間相互作用的藥劑也是合適的。結合和阻斷TGF-0 RII受體的合適的藥劑的實例包括MIC-1的抑制性肽片段和模 擬物。然而，優(yōu)選地，這樣的藥劑選自抗TGF-0RII抗體(例如抗TGF-0RII抗體AF532， 可得自R&D Systems, Inc.，Minneapolis, MI，美國)和抗體片段(例如Fab片段和重組 scFV片段)。更優(yōu)選地，所述藥劑是人源化抗TGF-0 RII單克隆抗體?？筛鶕?jù)美國專利No 5，225，539(在此通過引用以整體并入本文)中所述的方法制備人源化抗TGF-0 RII單克隆 抗體。結合和阻斷RI受體的合適的藥劑的實例包括熟知的抑制劑，例如ALK5抑制劑，包 括SB-431542(4-(5-苯并(1,3) 二噁唑-5-基-4-吡啶-2基-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺) (Sigma Aldrich, St Louis，M0，美國)、SB-505124 (2-(5-苯并[1，3] 二噁唑 _5_ 基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽)35、SD-20836 (Scios, Inc.，F(xiàn)reemont，CA，美國) 以及GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)37以及MIC-1的抑制性 肽片段和模擬物。然而，優(yōu)選地，這樣的藥劑選自抗RI抗體和抗體片段(例如抗ALK5細胞 外結構域的hAP-0016抗體，可得自Angio-Proteomie，Boston, MA，美國)。更優(yōu)選地，所述 藥劑是人源化抗RI單克隆抗體。當為了抑制MIC-1活性而進行時，適用于利用所述第一個方面的方法治療的對象 可限于表現(xiàn)出MIC-1過表達或至少血清MIC-1水平一直處在200-1200pg/ml的正常人血 清水平的高端的那些對象?？衫冕槍IC-1的分析(例如MIC-1ELISA33)來測定高血清 MIC-1水平(例如來自全血或血清樣品)來選擇這樣的對象?！案摺毖錗IC-1水平包括> 850pg/ml，更優(yōu)選> 1000pg/ml，最優(yōu)選> 1200pg/ml?；蛘?，所述方法包括提高MIC-1活性，并且是為了降低對象的食欲和/或體重而進 行的，所述對象可能患有肥胖或還可能出于健康或虛榮心原因而期望體重減輕。為了提高 MIC-1活性，所述藥劑優(yōu)選選自通過結合TGF-0 RII受體和刺激TGF-0 RII受體活性來模 擬MIC-1活性的藥劑，但是預計結合RI受體和刺激RI受體活性的藥劑也是合適的。結合 和刺激TGF-0RII受體的合適的藥劑的實例包括MIC-1的刺激性肽片段和模擬物。結合和 刺激RI受體的合適的實例包括MIC-1的刺激性肽片段和模擬物。此外，所述第一個方面的方法可包括通過調節(jié)MIC-1受體復合物的量(即對象中 內源性MIC-1受體復合物的量)來調節(jié)MIC-1活性。就調節(jié)MIC-1受體復合物的量而言， 所述藥劑優(yōu)選選自降低對象中MIC-1受體復合物的量的藥劑，并且可選自靶向抗編碼所述 MIC-1受體復合物之基因的催化性和抑制性寡核苷酸分子(例如核酶、脫氧核糖核酸酶、反 義RNA和小抑制性RNA (siRNA))以及MIC-1受體復合物轉錄或翻譯的抑制劑。優(yōu)選地，這 樣的藥劑降低內源性TGF-0 RII受體(優(yōu)選內源性下丘腦TGF-0 RII受體)的量，但是降 低內源性RI受體的量的藥劑也是合適的。預計這樣的藥劑適于治療與由癌癥、慢性腎衰竭 或其它病因疾病、病癥或治療引起的MIC-1過表達相關的食欲減退/惡病質。用在所述第一個方面的方法中的藥劑可以被配制成任意合適的藥物/獸用組合 物或劑型(例如用于口服、口含、鼻內、肌肉內和靜脈內施用的組合物)。通常，這樣的組合 物是以有效調節(jié)食欲和/或體重的量施用給所述對象的，因此其可提供約0.01-約100 i! g/ kg體重/天的藥劑，更優(yōu)選提供0. 05-25 u g/kg體重/天的藥劑。合適的組合物可旨在用 于每日施用一次、每日施用多次或控制釋放或緩慢釋放，根據(jù)達到的最大有效作用而定。此外，本發(fā)明還提供篩選用于調節(jié)MIC-1活性的候選藥劑或藥劑庫的方法。因此，在第二個方面中，本發(fā)明提供用于篩選能調節(jié)巨噬細胞抑制因子(MIC-1) 活性的藥劑的方法，所述方法包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉化生長因子(TGF-0 )之RII受體的MIC-1受體復合 物或其單體接觸，以及(ii)檢測所述MIC-1受體復合物或其單體的任何活性改變。優(yōu)選地，所述方法是利用例如表達MIC-1受體復合物或其單體的培養(yǎng)細胞(例如 CH0細胞)在體外進行。MIC-1受體復合物或其單體活性的改變可通過檢測一種或多種信號 傳導分子例如erk l/2、P-stat3以及smad信號傳導途徑的活化與否來檢測?；蛘?，MIC-1 受體復合物或其單體的活性改變可通過檢測akt信號傳導途徑的一種或多種信號傳導分子的活化與否來檢測，之前的報道表明所述akt信號傳導途徑與MIC-1活性有關34。其中所述方法的步驟(i)是利用所述MIC-1受體復合物的單體進行的，優(yōu)選地，所 述單體是TGF- 0 RII受體，更優(yōu)選地，所述單體是下丘腦TGF- ^ RII受體。所檢測的MIC-1受體復合物或其單體活性的降低可表明所述藥劑可能增加對象 的食欲和/或體重。另一方面，所檢測的MIC-1受體復合物或其單體活性的增加可表明所 述藥劑可能降低對象的食欲和/或體重。在第三個方面中，本發(fā)明提供通過所述第二個方面的方法鑒定的新藥劑。在下文中，通過參考下述非限定性實施例和附圖進一步描述本發(fā)明。
實施例實施例1材料和方法腫瘤異種移棺樽型在8周齡BALB/c裸鼠的右肋腹皮下注射在200mi PBS中的5_7X 106個經轉染的 DU145細胞。所述DU145細胞已經用含有成熟MIC-1 (MIC-1)、全長MIC-1、MIC-1前轉化酶 位點缺失突變體或空載體的PIRES2-EGFP質粒(Clontech，Mountain View，CA，美國)進行 了轉染11。一旦腫瘤可見，就測量腫瘤大小，并每1-3天給小鼠稱重，稱重6周。通過以下測定瘦肉和脂肪質量使用雙能X射線吸收儀(DXA) (Lunar Piximus II，GE Medical Systems, Madison, WI，美國)并剝離白色和棕色脂肪組織貯積(adipose d印ot)、脛骨肌以及腓腸肌，然后將其重量表示為占注射腫瘤當天小鼠體重的比例。過表達MIC-1的轉基因小鼠的產生通過傳統(tǒng)方法構建轉基因小鼠。簡而言之，將含有以巨噬細胞特異性方式驅動嚙 齒動物MIC-1全長編碼序列表達的經修飾c-fms啟動子序列的質粒構建體線性化并注射到 C57BL6卵母細胞中。然后使所得轉基因小鼠與WT C57BL6小鼠交配，基于通過實時RT-PCR 評價脾臟(富含巨噬細胞的組織)中MIC-1表達的增加來選擇所得的轉基因小鼠系(稱為 fmsMIC-1)。MIC-1被強烈表達至在小鼠血清中可容易檢測到的程度。MIC-1 試劑如之前所述制備和純化所有MIC-1抗體和重組蛋白"’15’16。在巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)的條件化培養(yǎng)基中表達重組MIC_1并利用疏水性相互作用色譜、離子 交換色譜的組合從中純化，然后利用反相HPLC純化。分別通過用重組MIC-1免疫或未免疫 的綿羊的血清進行蛋白G親和色譜來制備MIC-lPAb或對照IgG。對于一些實驗而言，通過 在偶聯(lián)純化重組MIC-1的瓊脂糖柱上純化MIC-lPAb來制備親和力純化的抗MIC-1抗體?？?MIC-1單克隆抗體來源于雜交瘤并通過蛋白G親和色譜純化。經改造以表達MIC-1的AAV載體的制備將人MIC-1的cDNA亞克隆到受控于CBA(雞肌動蛋白)啟動子并含有WPRE (土 撥鼠肝炎病毒轉錄后調節(jié)元件)的AAV表達質粒中，并具有側翼為AAV2反向末端重復序列 (ITR)的牛生長激素聚腺苷酸化信號。將不含轉基因插入片段的AAV表達質粒裝配到AAV 中并用作對照載體。然后基本上如所述制備感染性AAV顆粒32。簡而言之，通過標準磷酸鈣 轉染法利用AAV和輔助質粒共轉染HEK293細胞。轉染后60小時收獲細胞，通過碘克沙醇密度梯度超離心從細胞裂解液中純化AAV載體，然后濃縮并用PBS透析。利用實時PCR(ABI Prism7700)滴定載體，將所有載體儲備液稀釋為1 X 1013個基因組/ml。代謝諫率、呼吸變換率和物理活動的測定利用八室開放回路量熱儀(Oxymax Series, Columbus Instruments, Columbus, 0H，美國)通過間接量熱法測量了 8-10周齡雄性BALB/c、fmsMIC-1或C57B16小鼠的代謝 速率。將小鼠單獨飼養(yǎng)在特制的樹脂玻璃(Plexiglass)籠(20. lcmXIO. lcmX12. 7cm) 中。溫度維持在22°C，空氣流量為0.6升/分鐘。隨意進食和飲水，或者在一些實驗中，注 射MIC-1后將小鼠禁食12小時。在開始記錄之前使小鼠在籠中適應24小時。然后給小鼠 皮下注射lOyg MIC-1或對照緩沖液，然后監(jiān)測12小時。每27分鐘測量耗氧量(V02)，呼 吸交換率計算為VC02/V02(RER)。能量消耗(所產生的千卡熱量)計算為熱值(CV)XV02， 其中CV是3. 815+1. 232XRER。通過兩因素重復測量的AN0VA分析對產熱數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學 分析。配對飼養(yǎng)實騎利用3組8周齡雌性BALB/c小鼠進行實驗。在實驗開始前將小鼠單個飼養(yǎng)1周。 一組小鼠皮下注射10 u g MIC-1，每日兩次，并隨意進食。第二組對照小鼠僅注射載體，也是 隨意進食。第三組配對飼養(yǎng)組僅注射載體并且與注射MIC-1的小鼠配對飼養(yǎng)。通過測量MIC-1處理組每24小時所消耗的食物來進行配對飼養(yǎng)。第二天，給予所 述配對飼養(yǎng)小鼠的食物量與MIC-1處理的小鼠在前一天所消耗的食物量相同。為了測量攝 食量，將顆粒狀食物稱重并置于食物料斗中，再次稱量24小時后剩余的食物，經溢出和糞 便校正后的差異代表每日攝食量。癌癥惡病質患者群組用于評價MIC-1水平的血清樣品得自之前所公開的癌癥惡病質研究23中所招募 的患者。簡而言之，對照組為10名未患有前列腺疾病的患者，一組為19名最近診斷患有器 官局限性前列腺癌(CaP)的患者，另一組為38名患有晚期CaP的患者。就進一步的分析 而言，此組被分為兩個亞組未患有惡病質和患有惡病質的晚期前列腺癌。晚期前列腺癌 患者是根據(jù)參加本研究之前由腫瘤科醫(yī)生確定的臨床狀態(tài)來分類的。當患者體重減輕3-6 個月并且失去食欲(食欲減退)時其被確定為惡病質。如果兩種癥狀均不存在，則患者被 認為非惡病質。如果存在一個癥狀，那么僅當存在低能量水平、疲勞或低運動耐受性癥狀 中之一時才診斷為惡病質。未患有惡病質的晚期PCa亞組由14名患者組成。在3/14的 患者中發(fā)現(xiàn)了體重減輕，其中體重減輕的平均值士SEM為0. 87士0. 51kg(中值0kg ；范圍 0-6. 2kg)。盡管一些患者的體重減輕，但是根據(jù)腫瘤科主治醫(yī)生所確定的其臨床狀態(tài)，他們 不被認為是惡病質。中值年齡是72. 5歲。患有惡病質的亞組由24名患者組成。僅一名患 者根據(jù)第二標準被置于惡病質組中。此組中所有患者體重均減輕，體重減輕的平均值士 SEM 為 6. 89士 1. 00kg(中值4. 7kg ；范圍1. 5-21. 9kg)。中值年齡是 68. 5 歲。小鼠下丘腦內注射利用下述步驟進行所有實驗。將小鼠用100mg/kg氯胺酮和20mg/kg賽拉嗪(Parke Davis-Pfizer, Sydney, Australia and Bayer AG, Leverkusen,德國)麻酉卒并置于 Kopf■立 體定位儀(stereotaxic frame) (David Kopf, CA，美國)上，其中頭部處于平坦頭骨位置。 利用10 u 1漢密爾頓氏注射器以0. 1 yl/分鐘的速度向小鼠下丘腦內單側注射相關物質，所述注射器與 Micro4 微量注射泵控制器(World Precisionlnstruments Inc.，Sarasota, FL，美國)相連。就細胞因子的直接注射而言，通過相對于前囟后部2. 3mm、外側士0.3mm、腹部 5. 6mm的坐標(其對應于ARC28)給成年WT小鼠注射lyl MIC-1、1 yl瘦蛋白或1 yl對 照溶液。注射開始后30分鐘，處死小鼠。通過灌注固定腦，如下文所述通過免疫組化鑒定 P-stat3神經元?？筎GF-B警體抗體的施用就涉及注射抗TGF-3受體抗體的實驗而言，以0. 1 ill/分鐘的速度將1.5 ill 抗體(0. lmg/ml)單側注射到3只成年小鼠的下丘腦后區(qū)域中。所注射的抗體是針對 TGF-^RII(R&D Systems, Inc. ) ■ BMP RII(GeneTex, Inc. , San Antonio, TX, United States of America)或瘦蛋白受體(Upstate Biotech.，Lake Placid, NY，美國)的抑制 性山羊抗體。在此情形下，注射后使針頭在原位置放置10分鐘以允許擴散。注射坐標為 (從前因開始)前后-2. 3mm;中外側-0.5mm;背腹-4. 5mm，對應于下丘腦后區(qū)域29。注射 TGF-^RII抗體后24小時，在上午10點至下午12點間給動物腹膜內注射100 u g hMIC_l。 在注射后恰好30分鐘處死小鼠，收集腦，用于檢測下丘腦后區(qū)域中c-fos和TGF-0RII免 疫反應性神經元，如下文所述。在一個替代性實驗中，將6只成齡雄性小鼠分成3個組將1. 5iU抗TGF-3 RII 抗體(0. lmg/ml) (R&D Systems, Inc.)、1. 5 ii 1 抗BMP RII 抗體(0. lmg/ml) (GeneTex Inc., San Antonio, TX，美國)或 1. 抗瘦素抗體(0. lmg/ml) (Upstate Biotech.)單側注射 到所述ARC中。在此情形下，注射后使針頭在原位置放置10分鐘以允許擴散。所述注射坐 標定位(從前囟開始)前后-1. 94mm沖外側-0. 4mm ；背腹_5. 5mm,即對應于下丘腦弓狀核 29o注射后24小時，在上午10點至下午12點之間給動物腹膜內注射100 iig hMIC-1。注 射后30分鐘，處死小鼠，收集腦，用于檢測下丘腦弓狀核區(qū)中c-fos免疫反應性，如下文所 述。小鼠腦的免疫組化和免疫熒光在當天的固定時間(上午10點至下午12點)給BALB/c小鼠腹膜內注射lOyg或 100 ug hMIC-1或對照緩沖液。為確保c-fos免疫反應性可能的最小變化，在腹膜內注射 10 u g hMIC-1后恰好60 士 1分鐘時處死所有小鼠。就P-stat3而言，用5mg/kg (約100 u g) 瘦蛋白、100 y g hMIC-1或對照緩沖液處理小鼠，并在腹膜內注射后恰好30分鐘時處死小 鼠。將小鼠深度麻醉，通過用在磷酸鹽緩沖液中的25ml 0.9%鹽水、以及隨后在0. 1M磷酸 鹽緩沖液(PH7. 4)中的冷的4%多聚甲醛灌注來固定腦。立即取出腦并置于4%多聚甲醛中 30分鐘，然后置于在磷酸鹽緩沖液中的30%蔗糖溶液中過夜。將腦切成30 ym冠狀切片，并 用在50%乙醇中的1%H202中清洗20分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性。按1 5000將 第一抗體艮口兔抗小鼠 c-Fos (sc-52 ；Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA,美 國)稀釋在含有0. 曲拉通X-100的PBS中，然后孵育過夜。除分別按1 500、1 2000 和 1 2000 稀釋外，類似地處理兔抗小鼠 Phospho-Stat3(Cell Signaling Technology Inc.，Danvers，MA，美國)、兔抗 phosphoERK 1/2 抗體(Cell Signaling)以及山羊抗小鼠 TGF- 3 RII (R&D Systems, Inc.)。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分鐘)后，將切 片與在PBS中以1 250稀釋的生物素化抗兔第二抗體(Sigma Aldrich)或生物素化抗山羊第二抗體(ChemiC0n，TemeCula，CA，美國)孵育2小時。在PBS中清洗切片30分鐘，然后 在室溫下與親和素_生物素_過氧化物酶(Vectastain，Burlingame，CA，美國)孵育30分 鐘。就一些實驗而言，在使用鎳增強染色來區(qū)分一個切片上兩種抗體的反應性的情況下，在 PBS中清洗切片，然后在0. 04%硫酸鎳胺存在下用0. 05%二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(Sigma) 和0. 007%過氧化氫處理。然后在PBS中清洗切片并用來自DAKO(Carpinteria，CA，美國) 的二氨基聯(lián)苯胺處理5分鐘。在水中清洗載玻片，在封片之前通過二甲苯脫水。通過Zeiss Axioplan光學顯微鏡的格柵刻線和10X物鏡對核Fos陽性神經元進行計數(shù)。對所述區(qū) 域(包括其中差異明顯的區(qū)域)中的c-fos陽性核進行計數(shù)。就每個目的腦核而言，根據(jù) Franklin和Paxinos所述的立體定位坐標中的小鼠腦圖譜對每隔兩個切片進行計數(shù)以定 量c-fos陽性神經元29。比較同時染色的兩組(每組5只小鼠)，測定左側和右側的每個核 中計數(shù)的平均神經元數(shù)。合并所有組用于最后的分析，通過AN0VA，然后通過Fisher' s事 后檢驗來評價組與組之間的差異。就免疫熒光而言，將所述第一抗體即兔抗小鼠P_Stat3 (細胞信號傳導)和山羊抗 小鼠 a -MSH(AB5087 ；Chemicon)按 1 5000 和 1 4000 在含有 0. 曲拉通 X-100 的磷 酸鹽緩沖鹽(PBS)中稀釋，然后孵育過夜。在PBS-曲拉通中清洗3次(每次清洗10分鐘) 后，將切片在山羊抗兔和驢抗綿羊第二抗體中孵育3小時，所述第二抗體與Alexa熒光團 (AlexaFluor 594 和 Alexa Fluor 488 ；Molecular Probes,Eugene, 0R，美國)綴合，按 1 250在PBS中稀釋。在PBS中清洗切片3次(每次清洗10分鐘)后，在Zeiss Axioplan 光學顯微鏡(Oberkochen，德國)下觀察熒光團信號(c-Fos神經元為紅色，a-MSH神經元 為綠色)。原位雜交在所述天的固定時間(上午10點至下午12點)，給小鼠腹膜內注射10 y g hMIC-1或對照緩沖液。在腹膜內注射后恰好60分鐘時處死所有小鼠，立即取出腦并冷 凍在干冰上。在低溫恒溫器上切冠狀切片(20i!m)并解凍固定在Superfrost 切片 (Menzel-Glaser，Braunschweig，德國)上。利用與小鼠 NPY(5，_GAGGGTCAGTCCACACAGCCCC ATTCGCTTGTTACCTAGCAT-3，)(SEQ ID NO :1)、小鼠P0MC(5，_TGGCTGCTCTCCAGGCACCAGCTCCAC ACATCTATGGAGG-3，)(SEQ ID NO :2)、小鼠GHRH(5，_GCTTGTCCTCTGTCCACATGCTGTCTTCCTGGCG GCTGAGCCTGG-3，) (SEQ ID NO 3)互補的放射性標記的DNA寡核苷酸一起分析來自同一冠 狀腦水平的MIC-1注射和PBS注射小鼠(n = 5只小鼠/組)的匹配切片，如之前所述28。為評價分散的神經元中的mRNA水平，利用固定在Zeiss Axiophot顯微鏡上的 ProgRes 3008相機(Zeiss，Jena，德國)對浸漬切片進行數(shù)字化處理。利用NIH-Image 1. 61 軟件(由Wayne Rasband編寫，可以從zippy, nimh. nih. gov的匿名FTP上獲得)評價單一 神經元上的銀顆粒密度。背景標記相同并且不超過特定信號的5%。組合免疫組化(原位雜交)如上所述利用重組hMIC-1處理C57B6小鼠，并且進行相同處理用于P_stat3免疫 組化。如上所述加以微小改變來進行P-stat3的免疫組化標記。在含有0. 3%曲拉通X-100、 0. BSA和5mg/ml肝素的PBS中按1 2000稀釋抗P_stat3抗體。在4°C下孵育切片 48小時，利用如上所述的相同步驟檢測特異性抗體標記。固定切片并如上所述進行NPY原 位雜交。
統(tǒng)計學分析除線性回歸、單變量logistic回歸以及多變量logistic回歸外，還利用 Mann-ffhi tney-U檢驗分析了前列腺癌患者的數(shù)據(jù)。利用McNemar檢驗(GraphPad，San Diego，CA，美國)比較了血清MIC-1和IL-6，作為用于預測癌癥相關體重減輕的獨立檢驗。 利用PRISM 4通過兩因素重復測量的AN0VA比較了代謝數(shù)據(jù)。除非另外指明，否則利用未 配對的雙側T檢驗進行差異的所有其它統(tǒng)計學評價。除非另外指明，圖表上的所有誤差線 均表示標準差。除非另外指明，利用 STATVIEWVERSION 4. 5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA，美國)進行所有分析。結果MIC-1誘導可通過抗MIC-1抗體逆轉的快諫體重減輕為了了解MIC-1的局部和全身過表達的作用，利用表達人MIC_l(h MIC-1)的質粒 構建體永久轉染了不組成性產生MIC-1的人前列腺癌細胞系DU145。這些構建體保留了或 缺少介導MIC-1基質結合的前肽結構域“。將轉染的DU145細胞系皮下注射到裸小鼠的肋腹 內以建立異種移植腫瘤“。監(jiān)測所述小鼠6周，其后利用高度特異性ELISA測定血清hMIC-1 水平"’15’16。具有升高的腫瘤來源hMIC-1的小鼠體重進行性減輕，與終點血清MIC-1濃度 成比例(圖la、2a和2b)。具有低血清水平腫瘤來源hMIC_l (0_1500pg/ml，與正常人中所 觀察到的水平相似)的小鼠的體重增加了約19%，與這些小鼠中的幼齡小鼠一致(圖la)。 具有中度升高的MIC-1水平(1501-8500pg/ml)的小鼠在實驗過程中體重減輕約3%，具有 顯著升高的MIC-1水平(> 8500pg/ml)的小鼠在實驗過程中體重減輕約28% (圖la)。由 于具有對照腫瘤的小鼠在實驗過程中持續(xù)增加體重，所以就對照組而言，MIC-1的凈作用是 使具有中度和高度血清hMIC-1水平的小鼠的體重分別減輕了 22%和47%。為直接證明MIC-1對體重減輕的作用的特異性，通過給荷瘤小鼠注射多克隆綿羊 抗MIC-lIgG(MIC-l-PAb)來逆轉其作用。當利用對照IgG(CON-IgG)時未觀察到這種對 MIC-1的體重減輕作用的逆轉(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，單次注射hMIC-1特異性單克隆抗體 (MIC-1-MAb)而不注射載體對照可快速逆轉此MIC-1相關的體重減輕(圖lb、lc、2a和3) 和對腫瘤大小的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。MIC-1誘導的體重減輕的逆轉幅度和持續(xù)時間與所 施用MIC-1-MAb的量成比例。注射lmgMIC-1-MAb導致14%的峰值體重增加，這導致完全逆 轉腫瘤誘導的體重減輕。將這與施用載體對照的帶有MIC-1腫瘤小鼠顯著的持續(xù)體重減輕 相比較(圖3)。此MIC-1-MAb的作用持續(xù)時間是17天(圖lc)。此外，抗體處理對腫瘤大 小無影響(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，表達MIC-1的腫瘤所誘導的體重減輕是由MIC-1 特異性介導的。為進一步證明是MIC-1引起此作用，給正常BALB/c小鼠皮下施用劑量遞增的純化 重組hMIC-1，每日兩次，施用3天，并測量此期間小鼠的體重變化。這證明MIC-1以劑量依 賴性方式誘導體重減輕(圖4)，其中10 y g劑量的純化重組hMIC-1導致顯著而立即的體重 減輕，所述體重減輕可被MIC-1-PAb完全逆轉，但不能被CON-PAb完全逆轉(圖lg)。MIC-1誘導的小鼠體重減輕的表征為更具體地表征表達MIC-1的腫瘤所誘導的體重減輕的性質，通過以下測定了多 個區(qū)域中脂肪和瘦肉組織質量的變化剝離白色和棕色脂肪組織貯積、脛骨肌和腓腸肌，然 后將其重量表示為占注射腫瘤當天小鼠體重的比例(圖le)。具有過表達MIC-1之腫瘤的小鼠沒有剩余的腹膜后脂肪，腹股溝脂肪貯積和附睪脂肪貯積分別減少了 54%和89%。與 具有對照腫瘤的小鼠相比，具有MIC-1腫瘤的小鼠的肩胛間棕色脂肪組織貯積(40%)以及 脛骨肌和腓腸肌(分別25%和29%)的重量有較小但顯著的減少。雙能X射線吸收(DXA) 掃描數(shù)據(jù)證明，與對照相比，具有MIC-1腫瘤的小鼠平均減少5. 3g瘦肉質量和1. lg脂肪質 量(圖If)。為確定具有過表達MIC-1之腫瘤的小鼠的體重減輕是否是由于進食減少而引起 的，測量了連續(xù)3日的攝食量。將具有與高血清MIC-1水平相關的DU145細胞腫瘤的小鼠 與具有利用空載體轉染的DU145細胞腫瘤的小鼠進行了比較。具有過表達MIC-1之腫瘤的 小鼠比具有對照腫瘤的小鼠的每日平均攝食量減少了 32% (圖Id)。還測量了注射重組 MIC-1的BALB/c小鼠的食物消耗量，所述BALB/c小鼠被施用MIC_l_PAb或CON-PAb。與所 述荷瘤小鼠的數(shù)據(jù)相似，施用重組MIC-1引起攝食量顯著降低(圖lh)。重要的是，此食欲 低下(hypophagia)被導致體重增加的MIC-1-Pab處理所逆轉(圖lh)，確定了攝食量降低 是MIC-1介導的體重減輕的主要原因。為查明MIC-1誘導的脂肪質量、瘦肉質量以及體重的降低是完全是由于食欲低下 引起，還是代謝性因素也起作用，以接受每日兩次注射MIC-1的小鼠所消耗的食物量配對 飼養(yǎng)注射載體的小鼠。配對飼養(yǎng)的注射載體的小鼠減輕的體重至少與注射MIC-1的動物一 樣多，表明注射MIC-1的小鼠在瘦肉或脂肪質量損失方面與注射MIC-1的小鼠沒有顯著性 差異(圖5a和5b)。在配對飼養(yǎng)的動物中所觀察到的稍微大些的體重減輕很有可能是由于 所誘導的應激反應和由食物限制引起的物理活動(例如覓食行為)的增加而造成的17，而 注射MIC-1后未出現(xiàn)這樣的物理活動增加?？傊?，這些數(shù)據(jù)確定了食欲低下是MIC-1減輕 體重和相關的脂肪和瘦肉質量降低的方法。為完全排除增加的代謝速率是MIC-1處理小鼠中體重減輕以及機體組成改變的 貢獻，在以單次注射對照緩沖液或重組MIC-1處理的正常小鼠中通過間接量熱研究了能量 消耗。與對照相比，注射10 y g MIC-1的小鼠表現(xiàn)出小但顯著的能量消耗降低(圖6)。當 注射MIC-1后將小鼠禁食12小時以上時，這種小的相對能量消耗降低消失(圖6)。因此， 能量消耗增加不能解釋MIC-1處理小鼠中的體重減輕和機體組成的改變，這進一步作為單 獨原因支持了降低的能量攝取。為檢測MIC-1是否還對肥胖動物起作用，給遺傳性肥胖的瘦蛋白缺陷型ob/ob小 鼠每20g體重注射lOiig MIC-1，每日兩次，注射3天。與瘦小鼠中MIC-1的作用相似，ob/ ob動物顯示出體重顯著減輕(圖7a)。與注射對照的小鼠相比，注射MIC-1的ob/ob小鼠 中的此體重減輕是攝食量顯著降低的結果(圖7b)。這些數(shù)據(jù)表明，MIC-1強有力地誘導食 欲低下和體重減輕，即使在非常肥胖的動物模型中也是如此。對激素和代謝物的血清水平的評價表明，具有MIC-1腫瘤的小鼠的游離脂肪酸、 甘油三酯、葡萄糖、胰高血糖素、瘦蛋白和IGF-1的血清水平顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)，這與 其瘦肉和脂肪質量的減輕是一致的。具有MIC-1腫瘤的小鼠還顯示出血清皮質酮水平升高 的趨勢。循環(huán)IGF-1水平的變化提示對下丘腦_垂體_生長激素軸的抑制，并因此檢測了 下丘腦中生長激素釋放激素(GHRH)的mRNA表達。如圖8所示，具有MIC-1腫瘤的小鼠的 腦中GHRH表達水平顯著降低，這證實了這些動物中生長激素軸的中樞性介導的下調。雖然 降低的血清IGF-1水平可引起MIC-1的一些作用，特別是瘦肉組織減少18，但是此神經內分泌的變化并不能解釋MIC-1處理動物中的脂肪減少。實際上，具有低血清IGF-1水平的同 系類小鼠顯示出顯著增加的身體脂肪19。對生長激素軸的抑制可能是對MIC-1引起的食欲減退和體重減輕的保護性適應。 與此相一致，受限的能量攝取抑制嚙齒動物和人的下丘腦_垂體_生長激素軸和/或降低 血清IGF-1水平2°’21’22。因此，MIC-1處理對生長激素軸的作用可能是MIC-1主要作用(食 欲減退和體重減輕)的繼發(fā)后果，而不是MIC-1作用的主要調節(jié)者。具有MIC-1腫瘤的小鼠還表現(xiàn)出血清瘦蛋白水平的顯著降低，盡管伴有食欲低 下。這提示MIC-1掩蓋了血清瘦蛋白水平降低引起的食欲促進作用，這與瘦蛋白缺陷型ob/ ob小鼠(例如瘦動物)還表現(xiàn)出響應于MIC-1的食欲低下和體重減輕這一觀察結果相一 致。血清MIC-1水平與晩i期前歹II腺癌患者的彳本重減輕首梓相關為確定MIC-1與人食欲減退/惡病質的相關性，檢測了被招募到良好表征的晚 期前列腺癌(PCa)患者群組中的患者的血清MIC-1水平，其中血清IL-6水平與惡病質相 關23。與未患有惡病質的晚期癌癥患者相比，患有惡病質的晚期癌癥患者中血清MIC-1 水平顯著升高(12416 士 10235pg/ml 與 3265 士 6370pg/ml (平均值 士 SD) ；p < 0. 0001 ； Mann-ffhitney-U檢驗)。類似地，惡病質患者中血清IL-6水平升高(33. 8士64. 2pg/ml與 7. 8 士 3. 4pg/ml, p < 0. 002 ；Mann-ffhitney-U 檢驗)。血清 MIC-1 與血清 IL-6 水平弱但顯 著地正相關(r = 0. 2949，p < 0. 04 ；線性回歸)。此外，在單變量logistic回歸和多變量 logistic回歸中，血清MIC-1和IL-6水平均為癌癥惡病質存在的獨立預測因子(分別為 p = 0. 0002，p < 0. 0001 ；單變量 logistic 回歸；分別為 p = 0. 0017，p < 0. 0005 ；多變量 logistic回歸)。然而，食欲減退/惡病質最客觀的可定量衡量標準是體重減輕。血清MIC-1 水平與和前列腺癌相關的體重減輕程度顯著相關(圖4a ;p = 0. 0002,r = 0. 4899 ；線性回 歸)，而血清IL-6與和前列腺癌相關的體重減輕程度則沒有這樣的相關性(p = 0. 6303 ；線 性回歸)(圖％)。這些結果還提供了以下可能性血清MIC-1評價可用作預測前列腺癌相關性惡病 質的檢驗。為評價此可能性，通過接受器工作曲線(R0C)分析比較了癌癥診斷時存在的目 前最佳的血清標記物(IL-6)和血清MIC-1水平。作為癌癥相關性體重減輕的預測因子，血 清MIC-1水平顯著優(yōu)于IL-6 (曲線下面積(AUC)為0. 6829和0. 3505 ；p = 0. 0046)?？紤] 到血清MIC-1水平對癌癥惡病質的診斷能力，用于診斷前列腺癌的最廣泛應用的血清標志 物PSA的R0C的AUC為0. 678 (95%置信區(qū)間，0. 666-0. 689)24，幾乎等同于MIC-1的特征。 因此，血清MIC-1測量應證明可用于預測與前列腺癌相關的癌癥惡病質，并且還鑒定可能 受益于被設計成降低血清MIC-1水平的任何未來療法的患者。血清MIC-1水平與慢性腎衰竭患者中BMI相關如晚期癌癥一樣，慢性腎衰竭也可能與體重減輕和惡病質相關。此過程的標志例 如食欲減退、體重減輕和BMI是晚期腎衰竭死亡的強預測因子3°。因為BMI是死亡的強預 測因子，并且血清MIC-1水平升高與動物中相似變化相關聯(lián)，所以研究了晚期腎衰竭中血 清MIC-1水平與BMI之間的相關性。為此，檢驗了來自381名晚期腎衰竭患者群組的血清 樣品，所述樣品沒有被集合以研究惡病質或其它代謝過程31。在研究期間(多達3年)死亡的患者具有顯著較低的BMI(26. 17 士 5.63 ;266(平均值士 SD ；n)，23. 15 士 4. 92 ； 104 :p < 0. 0001 ；非配對t檢驗)。在研究開始時獲得透析前 血清樣品，并測定血清MIC-1水平。血清MIC-1水平與BMI相關，從而血清MIC-1水平升高 與BMI降低相關(p = 0. 0003 ；r = 0. 189 ；線性回歸)。i寸表議MIC-1的轉某因小鼠￥痺小并曰底得￥4、為確定長期施用MIC-1可能出現(xiàn)的作用，研究了過表達受控于CSF-1啟動子的 MIC-1的C57BL6轉基因小鼠(fmsMIC-1小鼠)。當在出生后最初48小時內測量時，這些小 鼠與其WT對照具有相似的體重(圖10a)。然而，到21天齡時，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠 的體重均比其性別匹配的WT同窩小鼠輕18% (圖10a)，此差異持續(xù)到成年期。從絕對值 上講，fmsMIC-1小鼠吃得比對照小鼠少(圖10b)，但在依據(jù)小鼠體重校正攝食量時此差異 消失。可能出生后攝食量的降低可導致小鼠發(fā)育比同類系同窩小鼠瘦小，并因此吃得相應 更少。與用MIC-1短期處理的小鼠相似，雄性和雌性fmsMIC-1小鼠的所有測量貯庫中的脂 肪均減少(圖10c)?？偟恼f來，過表達MIC-1的轉基因小鼠的數(shù)據(jù)與利用此細胞因子短期 處理的小鼠的數(shù)據(jù)大體一致。全身件施用MIC-1活化下丘腦神經元食欲和體重控制的主要調節(jié)中樞位于下丘腦中，尤其是弓狀核區(qū)域(ARC)中，其 被認為具有半通透性的血腦屏障，可能允許血液運載的調節(jié)劑與腦的此區(qū)域直接相互作用 25o為確定MIC-1是否直接對腦發(fā)揮其作用，給小鼠腹膜內注射重組hMIC-1，然后1小時后 將其處死以檢查即早期基因c-fos的腦表達模式。此轉錄因子由多種刺激快速誘導，是廣 泛使用的、可靠的神經元活化指示劑26。注射MIC-1后，下丘腦ARC和室旁核(PVN)中c-fos 免疫反應活性顯著增加，表明這些核中的神經元是MIC-1作用的下游調節(jié)劑。有趣的是，腦 干最后區(qū)(AP)也顯示出c-fos陽性神經元數(shù)目的顯著增加(表1)，提示此核對MIC-1作用 做出響應的潛在作用。孤束核(NTS)或下丘腦或腦干的任意其它區(qū)域中c-fos陽性神經元 數(shù)目無變化(數(shù)據(jù)未顯示)。表1 對腦的多個區(qū)域包括ARC、PVN、AP和NTS中c-fos核染色進行定量并以平均值和 標準偏差表示這些發(fā)現(xiàn)提示，MIC-1的核心作用在于ARC，其為食欲控制的主要中心。來自ARC 的映射到達其它下丘腦核(例如PVN)，在那里與腦干區(qū)域(包括所述AP)形成連接，通過 所述連接，它們特異性地調節(jié)迷走交感神經系統(tǒng)活性27。然而，不能排除的MIC-1直接活化 AP。NTS中c-fos活化不改變，這表明通過迷走神經由外周傳入的信號不參與介導MIC-1作用。T Ff.M MIC-1特異丨牛i寸表汰i秀導彳本重減輕為進一步證實MIC-1誘導的體重減輕是通過下丘腦介導的作用而進行的，將腺相 關病毒(AAV)直接單側注射到下丘腦弓狀核內來誘導MIC-1表達。其被改造成表達受控于 神經元特異性烯醇酶啟動子的全長人MIC-1。使用人MIC-1特異性抗體的免疫組化證明了 此蛋白質由細胞在ARC中的表達(圖11)。以此方式注射表達MIC-1的AAV的小鼠快速減 輕體重，但是注射空對照載體的小鼠以正常方式增加體重。這為MIC-1直接作用于下丘腦 細胞提供了進一步有力的證據(jù)。全身件施用的MIC-1通過TGF- P RII警體作用于ARCTGF-0超家族蛋白(例如MIC-1)結合高度保守的受體超家族并通過其起作用，所 述受體超家族由4種不同的II型(RII)受體和7種I型受體(RI)組成，其各自含有絲氨 酸/蘇氨酸激酶結構域。結合配體時，兩個RII和兩個RI受體組裝成四聚體，其中RII使 位于細胞質RI結構域中的絲氨酸殘基磷酸化。這開始了信號傳導級聯(lián)，其常涉及保守smad 家族的轉錄因子。許多其它信號傳導分子也被活化，包括erk 1/2，其之前與MIC-1激發(fā)的 受體活化相關聯(lián)14’32。為確定MIC-1優(yōu)選的RII受體，利用多種抗不同RII受體的抗體進行了免疫組化。 這表明，僅TGF-0 RII與c-fos共同定位于處死前30分鐘注射MIC-1的小鼠的下丘腦中 (數(shù)據(jù)未顯示)。為確定TGF-0 RII受體是否形成所述MIC-1結合受體復合物的一部分，將 此受體的封閉抗體單側注射到下丘腦中。24小時后，給這些小鼠腹膜內注射lOy gMIC-1。 30分鐘后處死小鼠，檢測下丘腦c-fos表達。在注射TGF-0 RII抗體的一側將免疫組化核c-fos表達封閉，但是不封閉對側的 C-fos表達。重要的是，針對密切相關的骨形成蛋白(BMP)的RII或瘦蛋白受體注射封閉抗 體并不導致抑制MIC-1誘導的c-fos表達(數(shù)據(jù)未顯示)。這清楚地表明，TGF-0RII受體 必須形成復合物的一部分，MIC-1通過所述復合物在下丘腦中發(fā)揮其作用。為探究MIC-1誘導下丘腦中下游作用的機制，對處死前15分鐘至60分鐘之間腹 膜內注射lOOiig MIC-1的小鼠的下丘腦進行進一步的免疫組化。使用對smad信號傳導途 徑成員的磷酸化形式具有特異性的抗體smad 2,smad 3和smad 1、5、8。在每種情形下，未 處理小鼠的ARC還表明用所有抗體染色的核的存在，提示下丘腦中這些途徑的組成性活化 (數(shù)據(jù)未顯示)。可檢測到MIC-1處理小鼠中smad染色無顯著性增加，表明這些途徑未被 利用或者可能這些途徑的組成性活化掩蓋了 smad磷酸化的任何顯著增加。然而，已經有幾 個小組報道了 MIC-1直接誘導erk 1/2的磷酸化32。因此，檢測了處死前10分鐘至60分鐘 之間注射100 y g MIC-1的小鼠下丘腦中此分子的活化。腹膜內注射MIC-1后，檢測了 ARC 中P-erk 1/2染色，最大值出現(xiàn)在注射MIC-1后20分鐘。在注射對照緩沖液的小鼠中不存 在此途徑的活化?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，MIC-1通過erk 1/2途徑的活化來介導作用。全身性施用的MIC-1調節(jié)ARC的NPY和P0MC表達并活化轉錄因子stat3為確定全身性注射MIC-1是否活化已知與食欲調節(jié)相關的ARC神經元途徑，研究 了兩種主要的食欲調節(jié)劑NPY和P0MC的表達。利用原位雜交，觀察到注射MIC-1使ARC中 NPY mRNA表達水平降低34%，使P0MC mRNA水平增加47%，這與減少進食動力相一致(表 2)。
表2 對ARC中的表達細胞進行了定量，結果表示為平均值和標準差。這種主要P0MC食欲減退途徑的上調和NPY促進食欲途徑的下調在方式上與在瘦 蛋白處理小鼠中所觀察到的相似(數(shù)據(jù)未顯示)。由于此相似性，還用抗磷酸化Stat3(P-Stat3)抗體探測了 MIC-1處理小鼠的下丘 腦，所述磷酸化stat3是瘦蛋白受體信號傳導途徑的重要分子(數(shù)據(jù)未顯示)。這清楚地表 明，MIC-1處理小鼠的外側ARC和腹側正中下丘腦中P-stat3染色神經元顯著上調。有趣 的是，MIC-1處理小鼠中P_stat3的染色方式與注射瘦蛋白所誘導的不同，與注射瘦蛋白時 為背部ARC相比，注射MIC-1的小鼠中大多數(shù)P_stat3陽性神經元存在于外側ARC中。因 此，MIC-1和瘦蛋白雖然均活化ARC中的stat3信號傳導途徑，但卻誘導不同的ARC神經元 子集上的P_stat3。這些發(fā)現(xiàn)提示，MIC-1和瘦蛋白通過不同的途徑誘導其作用。與此一 致，將MIC-1注射到瘦蛋白受體缺陷型db/db小鼠中，在ARC中產生的P-stat3染色與在注 射MIC-1的WT小鼠中所觀察的相當，結論表明MIC-1不通過瘦蛋白受體起作用。為進一步鑒定MIC-1誘導的P_stat3陽性神經元，進行了 NPY的原位雜交以及 a -黑色素細胞刺激素(a -MSH，P0MC的生物活性加工產物)的免疫組化以及P_stat3的 免疫組化/免疫熒光(數(shù)據(jù)未顯示)。這證明了 a-MSH和NPY神經元為主要的MIC-1靶 標種類，并且表明導致此模型體重減輕的攝食量降低是由于NPY和a -MSH產生改變而引起 的。此外，與c-fos活化的結果一致，大部分這些P_stat3/NPY和P_stat3/ a -MSH陽性神 經元代表不同的被瘦蛋白活化的神經元子集，從而代表了 MIC-1調節(jié)食欲的新途徑。將MIC-1肓接注射到ARC內也活化stat3為提供MIC-1直接作用于ARC的進一步證據(jù)，研究了將MIC-1、瘦蛋白或對照緩沖 液直接單側注射到所述ARC內。完成注射后20分鐘，處死小鼠，對腦切片染色用于P_stat3。 雖然對照注射沒有作用，但是瘦蛋白和MIC-1均明顯誘導所述ARC中P-stat3的活化(數(shù) 據(jù)未顯示)。染色模式與全身性施用調節(jié)劑所觀察到的相似，其中注射MIC-1誘導ARC外 側部和下丘腦腹側正中核(VMHDM)背部中神經元中stat3的磷酸化。與之相反，瘦蛋白注 射活化ARC背部、VMHDM背部以及下丘腦外側區(qū)(LHA)的神經元中Stat3途徑(數(shù)據(jù)未顯 示)。這進一步表明這兩種調節(jié)劑作用于下丘腦中不同的神經元子集。討論動物模型和前列腺癌患者中腫瘤過表達MIC-1以及血清MIC-1水平與體重減輕的 強相關表明，MIC-1參與癌癥食欲減退/惡病質以及可能的其它惡病質病癥(例如與心臟衰 竭和腎臟衰竭相關的那些病癥)的發(fā)病機制。雖然許多研究描述了患有癌癥食欲減退/惡 病質的人與不具有此并發(fā)癥的相比細胞因子水平升高，但是還沒有任何人證實細胞因子水平與對于MIC-1而言明顯的體重減輕程度之間的直接相關性。此相關性以及本文所提供的 機制性部分的數(shù)據(jù)表明，MIC-1作用于下丘腦神經元中的TGF-0 RII受體來降低食欲，確定 了 MIC-1是癌癥相關的食欲減退和體重減輕的重要原因。此外，通過抗MIC-1抗體對食欲 減退/惡病質的逆轉作用表明了利用治療性抗體(和其它MIC-1拮抗劑)治療此嚴重疾病 的潛力。最后，本文所示結果表明，MIC-1引起食欲低下并且能直接影響攝食量和能量動態(tài) 平衡、NPY和P0MC源a-MSH的主要下丘腦調節(jié)劑。此外，雖然MIC-1誘導食欲減退、體重減 輕的瘦蛋白樣作用并且減少下丘腦NPY表達以及增加P0MC表達，但是由MIC-1活化的NPY 和P0MC神經元的子集與由瘦蛋白活化的不同。這表明，神經元的更多種功能性網絡調節(jié)能 量動態(tài)平衡的不同方面，并且合起來證實MIC-1是食欲和體重的核心調節(jié)劑并且與其受體 復合物一起提供了作為用于治療癌癥食欲減退/惡病質和肥胖之靶標的相當大的潛力。在整個說明書中，詞語“包含”或者變化形式例如“包括”或“含有”應當理解為意 味著涵蓋所述元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組，但是不排除任意其它元素、整 體或步驟，或者元素、整體或步驟的組。本說明書中所述的所有出版物在此通過引用并入本文。包含在本說明書中的對文 獻、法案、材料、設備、文章等的任意描述僅用于提供本發(fā)明情形的目的。不應當認為，由于 任意或所有這些材料在本申請每個權利要求的優(yōu)先權日前存在于澳大利亞或其它地方而 就承認其構成現(xiàn)有技術基礎的一部分或是與本發(fā)明相關的領域中的一般常識。本領域技術人員應當理解，可在不背離廣泛描述的本發(fā)明精神或范圍的情形下， 如具體實施方案所述對本發(fā)明進行多種改動和/或修改。因此，本發(fā)明的實施方案應當在 所有方面被認為是示例性的而不是限制性的。參考文獻1. Tisdale, MJ. Cachexia in cancer patients. Nat Rev Cancer, 2: 862-871(2002).2. Huhmann, MB. Cunningham, RS. Importance of nutritional screening in treatment of cancer-relatedweight loss. Lancet Oncol, 6 :334_343(2005) 3. Marks, DL. Ling, N. Cone, RD. Role of the central melanocortin system in cachexia. Cancer Res,61 :1432—1438(2001).4. Rubin, H. Cancer cachexia :its correlations and causes. Proc Natl Acad Sci,100 5384-5389(2003).5. Rail, LC. Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia :metabolic abnormalities, mechanisms andinterventions. Rheumatology 43 1219-1223 (2004).6. Anker, SD. Sharma, R. The syndrome of cardiac cachexia. Int J Cardiol 85: 51-66(2002).7. Bootcov, MR.et al. MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of theTGF—旦 superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci 94: 11514-11519(1997).8. Welsh, JB. et al. Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in CancerTissue and Serum. Proc Natl Acad Sci 100 3410-3415(2003).
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權利要求
一種調節(jié)對象中巨噬細胞抑制因子-1(MIC-1)之活性的方法，包括向所述對象施用有效量的與包含轉化生長因子-β(TGF-β)RII受體的MIC-1受體復合物相互作用并調節(jié)其活性的藥劑，其任選地與藥理學上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
2.權利要求1的方法，其中所述藥劑與MIC-I受體復合物相互作用并調節(jié)其活性。
3.權利要求2的方法，其中所述藥劑抑制MIC-I的活性以增加對象的食欲和/或體重。
4.權利要求3的方法，其用于治療與MIC-I過表達相關的食欲減退/惡病質。1
5.權利要求2-4中任一項的方法，其中所述藥劑與所述TGF-βRII受體相互作用。
6.權利要求5的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
7.權利要求2-4中任一項的方法，其中所述藥劑選自ALK5抑制劑、MIC-I的抑制性肽 片段和模擬物、抗TGF-β RII抗體及其片段、抗RI抗體及其片段。
8.權利要求2的方法，其中所述藥劑提高MIC-I的活性以降低對象的食欲和/或體重。
9.權利要求8的方法，其用于治療肥胖。
10.權利要求8或9的方法，其中所述藥劑與所述TGF-βRII受體相互作用。
11.權利要求10的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其中所述藥劑選自MIC-I的刺激性肽片段和模擬物。
13.權利要求1的方法，其中所述藥劑調節(jié)所述對象中MIC-I受體復合物的量。
14.權利要求13的方法，其中所述藥劑降低所述對象中MIC-I受體復合物的量。
15.權利要求14的方法，其中所述藥劑選自靶向編碼所述MIC-I受體復合物之基因的 催化性和抑制性寡核苷酸分子以及MIC-I受體復合物轉錄或翻譯的抑制劑。
16.權利要求14或15的方法，其中所述藥劑通過降低內源性TGF-βRII受體的量來降 低MIC-I受體復合物的量。
17.權利要求16的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
18.權利要求13-17中任一項的方法，其用于治療與MIC-I過表達相關的食欲減退/惡 病質。
19.權利要求4或18的方法，其中所述MIC-I過表達是由癌癥引起的。
20.權利要求4或18的方法，其中所述MIC-I過表達是由慢性腎衰竭引起的。
21.一種用于篩選能夠調節(jié)巨噬細胞抑制因子(MIC-I)活性的藥劑的方法，所述方法 包括以下步驟(i)使所述藥劑與包含轉化生長因子(TGF-β) RII受體的MIC-I受體復合物或其單 體接觸，以及( )檢測所述MIC-I受體復合物或其單體的任何活性變化。
22.權利要求21的方法，其中所述MIC-I受體復合物或其單體在培養(yǎng)細胞的表面上提{共。
23.權利要求21或22的方法，其中所述MIC-I受體復合物或其單體活性的變化可通過 檢測erk l/2,P-stat3信號傳導分子或smad和/或akt信號傳導途徑的活化與否來檢測。
24.權利要求21-23中任一項的方法，其中所述TGF-βRII受體是下丘腦TGF-β RII受體。
25.通過權利要求21-24中任一項的方法鑒定的新藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調節(jié)對象的食欲和/或體重的方法和新型藥劑。此外，本發(fā)明還涉及篩選與巨噬細胞抑制因子-1(MIC-1)受體復合物相互作用并調節(jié)其活性的藥劑的方法。
文檔編號A61P3/04GK101854947SQ200880103168
公開日2010年10月6日 申請日期2008年8月18日 優(yōu)先權日2007年8月16日
發(fā)明者塞繆爾·諾貝特·布賴特, 大衛(wèi)·亞歷山大·布朗, 林舒, 赫貝特·赫爾佐克 申請人:圣文森特醫(yī)院悉尼有限公司;加文醫(yī)學研究所