專利名稱：：α-ENaC表達(dá)的RNAi抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及ENaC介導(dǎo)的氣道離子轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域，涉及用于調(diào)節(jié)a-EnaC表達(dá)的組合物和方法，更具體地涉及利用寡核苷酸通過RNA干擾下調(diào)a-EnaC，所述寡核苷酸通過吸入/鼻內(nèi)施用被局部施用至肺和鼻道，或例如通過靜脈內(nèi)注射進(jìn)行全身性施用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾或"RNAi"是最初由Fire及其同事創(chuàng)造的術(shù)語，用于描述當(dāng)將雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入蠕蟲時(shí)其可阻斷基因表達(dá)的觀察現(xiàn)象(Fire等，Nature391:806-811，1998)。短dsRNA在許多生物(包括脊椎動(dòng)物)中指導(dǎo)基因特異性轉(zhuǎn)錄后沉默，并且為研究基因功能提供了新工具。該技術(shù)近來已被多次綜述，參見，例如Novina，C.D:，和Sharp,P.，Nature2004,430:161，和Sandy，P.，等，Biotechniques2005,39:215，通過引用合并入本文。位于環(huán)境和身體之間的界面上的粘膜表面已進(jìn)化出許多保護(hù)機(jī)制。此先天防御的一個(gè)主要形式是用液體清潔這些表面。通常，粘膜表面上的液體層的量反映了上皮液體分泌(通常反映與水(和陽離子抗衡離子)偶聯(lián)的陰離子(Cl—和/或HC03—)的分泌)與上皮液體吸收(通常反映與水和抗衡陰離子(CI—和/或HC03-)偶聯(lián)的Na+吸收)之間的平衡。粘膜表面的許多疾病由因分泌(太少)與吸收(相對(duì)太多)間失衡導(dǎo)致的粘膜表面太少保護(hù)液引起。表征這些粘膜機(jī)能障礙的缺陷型鹽轉(zhuǎn)運(yùn)過程存在于粘膜表面的上皮層中。補(bǔ)充粘膜表面上的保護(hù)性液體層的一個(gè)方法是通過阻斷Na+通道介導(dǎo)的液體吸收來"重平衡"該系統(tǒng)。介導(dǎo)Na+和液體吸收的限速步驟的上皮蛋白質(zhì)是上皮Na+通道(ENaC)，a-EnaC位于上皮細(xì)胞的頂面，即粘膜表面-環(huán)境界面。對(duì)a-EnaC介導(dǎo)的Na+介導(dǎo)的液體吸收的抑制可達(dá)到治療功效。因此，需要開發(fā)用于治療和預(yù)防人和動(dòng)物中牽涉a-EnaC的疾病或障礙，例如囊性纖維化的有效療法，特別是高效療法。高效的一個(gè)前提是活性成分在生理環(huán)境中不被太快降解。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特定的組合物和方法，所述組合物和方法可以例如通過吸入、鼻內(nèi)或氣管內(nèi)施用試劑來用于降低受試者例如哺乳動(dòng)物，例如人中的a-EnaC水平。本發(fā)明特別地提供了由a-EnaC的至少15個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成的或基本上由其組成的或包含其的iRNA試劑，更特別地提供了包含來自表1A-1D中所示序列之一的15個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的試劑。該iRNA試劑優(yōu)選包含每鏈少于30個(gè)核苷酸，例如21至23個(gè)核苷酸，例如表1A-1D中提供的那些。該雙鏈iRNA試劑可具有平端，或更優(yōu)選地在該試劑的一個(gè)或兩個(gè)3'末端具有1至4個(gè)核苷酸的突出端(overhang)。此外，iRNA試劑可以只包含天然的核糖核苷酸亞單位，或其可以被合成以包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)該試劑中包括的一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸亞單位的糖、磷酸或堿基的修飾。iRNA試劑還可被修飾，以與選擇用于改善該試劑的穩(wěn)定性、分布或細(xì)胞攝取的配體，例如膽固醇連接。此外，iRNA試劑可以以分離的形式存在，或可以是用于本文所述方法的藥物組合物4(特別是配制用于遞送至肺或鼻道或配制用于胃腸外施用的藥物組合物)的部分。藥物組合物可包含一種或多種iRNA試劑，在一些實(shí)施方案中，可包含兩種或更多種iRNA試劑，其中每一種分別指向a-EnaC基因的不同區(qū)段。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含至少1個(gè)非天然核堿基的雙鏈寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，非天然核堿基是二氟甲苯基(difluorotolyl)、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，非天然核堿基是二氟甲苯基。在某些實(shí)施方案中，在包含雙鏈寡核苷酸的兩條寡核苷酸鏈中只有一條包含非天然核堿基。在某些實(shí)施方案中，包含雙鏈寡核苷酸的兩條寡核苷酸鏈都獨(dú)立地包含非天然核堿基。本發(fā)明還提供了用于降低細(xì)胞中a-ENaCmRNA的水平的方法。此類方法包括對(duì)受試者施用本發(fā)明的一種iRNA試劑的步驟，見下面進(jìn)一步的描述。本方法利用涉及RNA干擾的細(xì)胞機(jī)制，選擇性地降解細(xì)胞中的靶RNA，所述方法由將細(xì)胞與本發(fā)明的一種iRNA試劑接觸的步驟組成。此類方法可直接在細(xì)胞上進(jìn)行，或可通過對(duì)受試者施用本發(fā)明的一種iRNA試劑/藥物組合物而在哺乳動(dòng)物受試者上進(jìn)行。細(xì)胞中耙RNA的減少導(dǎo)致產(chǎn)生的編碼蛋白質(zhì)的量的減少，以及在生物體中，導(dǎo)致上皮電位差的降低、減少的液體吸收和增加的粘液纖毛清除率。本發(fā)明的方法和組合物，例如本發(fā)明的方法和iRNA試劑組合物，可以以本文所述的任何劑量和/或制劑以及以本文所述的任何施用途徑使用。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容示于附圖和下面的說明。根據(jù)該說明、附圖、以及根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征、目的和有利方面將變得顯而易見。本申請(qǐng)為了所有目的并入所有引用的參考文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)的全文作為參考。附圖簡述在圖中圖1:用于克隆的食蟹猴a-EnaC的pXoon構(gòu)建體的限制性消化圖譜。圖2:食蟹猴a-EnaC的蛋白質(zhì)和DNA序列。圖3:預(yù)測(cè)的脫靶(off-target)和標(biāo)靶(on-target)識(shí)別位點(diǎn)在AY535007二元螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體中的克隆。片段由19nt的預(yù)測(cè)的靶位點(diǎn)和位于5'和3'末端的10nt側(cè)翼序列組成。本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述為了便于說明，術(shù)語"核苷酸"或"核糖核苷酸"在本文中有時(shí)用于指RNA試劑的一個(gè)或多個(gè)單體亞單位。將理解，本文中術(shù)語"核糖核苷酸"或"核苷酸"的使用，在修飾的RNA或核苷酸替代物(surrogate)的情況下，還可指如下面進(jìn)一步描述的、在一個(gè)或多個(gè)位置上的修飾的核苷酸或替代物置換部分(surrogater印lacementmoiety)。"RNA試劑"，如本文所使用的，是未修飾的RNA、修飾的RNA或核苷替代物，其每一個(gè)都在本文中進(jìn)行了描述或是RNA合成領(lǐng)域中眾所周知的。雖然描述了許多修飾的RNA和核苷替代物，但優(yōu)選實(shí)例包括比未修飾的RNA具有更大的抗核酸酶降解抗性的那些。優(yōu)選實(shí)例包括具有2'糖修飾、單鏈突出端(優(yōu)選3'單鏈突出端)修飾，或特別地如果是單鏈，包含1個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)類似物的5'-修飾的那些。"iRNA試劑"("干擾RNA試劑"的縮寫)，如本文所使用的，是可下調(diào)耙基因例如EnaC基因SCNN1A的表達(dá)的RNA試劑。然而不希望受理論束縛，iRNA試劑可通過眾多機(jī)制中的一個(gè)或多個(gè)機(jī)制起作用，包括靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后切割(有時(shí)在本領(lǐng)域內(nèi)稱為RNAi)或轉(zhuǎn)錄前或翻譯前機(jī)制。"dsiRNA試劑"("雙鏈iRNA試劑"的縮寫)，如本文所使用的，是包含一條以上，優(yōu)選兩條鏈的iRNA試劑，其中鏈間雜交可形成雙鏈體結(jié)構(gòu)區(qū)域。"鏈"在本文中是指核苷酸(包括非天然的或修飾的核苷酸)的連續(xù)序列。該兩條或更多條鏈可以是分開的分子或各自形成分開的分子的一部分，或它們可共價(jià)互連，例如通過連接體例如聚乙二醇連接體共價(jià)互連，從而形成一個(gè)分子。至少一條鏈可包含與靶RNA充分互補(bǔ)的區(qū)域。這樣的鏈稱為"反義鏈"。包含與反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域的dsRNA試劑的第二鏈稱為"有義鏈"。然而，dsiRNA試劑還可由至少部分地自身互補(bǔ)從而形成例如發(fā)夾或鍋柄樣結(jié)構(gòu)(包含雙鏈體區(qū)域)的單個(gè)RNA分子形成。后者在本文中稱為短發(fā)夾RNA或shRNA。在該情況下，術(shù)語"鏈"是指RNA分子中與該相同RNA分子的另一區(qū)域互補(bǔ)的一個(gè)區(qū)域。盡管在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，長dsiRNA試劑可誘導(dǎo)通常是有害的干擾素應(yīng)答，但短dsiRNA試劑不觸發(fā)干擾素應(yīng)答，至少未達(dá)到對(duì)細(xì)胞和/或宿主有害的程度(Manche等，Mol.Cell.Biol.12:5238，1992;Lee等，Virology199:491，1994;Castelli等，J.Exp.Med.186:967，1997;Zheng等，RNA10:1934,2004;Heidel等，NatureBiotechnol.221579)。本發(fā)明的iRNA試劑包括足夠短以致于不能在正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觸發(fā)有害的非特異性干擾素應(yīng)答的分子。因此，給受試者施用包含iRNA試劑的組合物(例如，如本文所述配制的)，可用于降低受試者中a-EnaC的表達(dá)，同時(shí)規(guī)避干擾素應(yīng)答。足夠短以致于不能觸發(fā)有害干擾素應(yīng)答的分子在本文中稱為siRNA試劑或siRNA。"siRNA試劑"或"siRNA"，如本文所使用的，是指足夠短以致于不能在哺乳動(dòng)物，特別是人細(xì)胞中誘導(dǎo)有害的干擾素應(yīng)答的iRNA試劑，例如dsiRNA試劑，例如，其具有少于60個(gè)，但優(yōu)選少于50、40或30個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈區(qū)域。本文所述的分離的iRNA試齊U，包括dsiRNA試劑和siRNA試劑，可以例如通過降解RNA，介導(dǎo)a-EnaC的表達(dá)降低。為方便起見，這樣的RNA在本文中也稱為待沉默的RNA。這樣的核酸也稱為"靶RNA"，有時(shí)稱為"靶RNA分子"或有時(shí)稱為"靶基因"。如本文所使用的，短語"介導(dǎo)RNAi"是指試劑以序列特異性的方式沉默靶基因的能力。"沉默耙基因"意指這樣的過程，通過該過程，在未與所述試劑接觸時(shí)包含和/或表達(dá)耙基因的一定產(chǎn)物的細(xì)胞，在與所述試劑接觸后，相比于未接觸過所述試劑的相似細(xì)胞，將包含和/或表達(dá)少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的該基因產(chǎn)物。靶基因的此產(chǎn)物可以例如是信使RNA(mRNA)、蛋白質(zhì)或調(diào)控元件。如本文所使用的，術(shù)語"互補(bǔ)"旨在用于表示足以使本發(fā)明化合物與靶RNA分子，例如a-ENaCmRNA之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結(jié)合的互補(bǔ)程度。特異結(jié)合需要足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在期望發(fā)生特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測(cè)定或治療性醫(yī)治的情況下，在生理?xiàng)l件下，或在體外測(cè)定的情況下，在實(shí)施該測(cè)定的條件下)寡聚化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合。非靶序列通常與靶序列相異至少2、3或4個(gè)核苷酸。如本文所使用的，如果iRNA試劑減少細(xì)胞中靶RNA編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的話，則所述iRNA試劑與靶RNA，例如靶mRNA(例如，a-ENaCmRNA)"充分互補(bǔ)"。iRNA試劑還可以與靶RNA"精確互補(bǔ)"，例如，耙RNA與iRNA試劑退火，優(yōu)選地在精確互補(bǔ)的區(qū)域中形成專門由Watson-Crick堿基對(duì)產(chǎn)生的雜交體(hybrid)。"充分互補(bǔ)的"iRNA試劑可包括與靶a-EnaCRNA精確互補(bǔ)的內(nèi)部區(qū)域(例如，至少10個(gè)核苷酸)。此外，在一些實(shí)施方案中，iRNA試劑可特異地區(qū)分單核苷酸差異。在該情況下，只有在單核苷酸差異區(qū)域(例如，7個(gè)核苷酸內(nèi))中存在精確互補(bǔ)時(shí)，iRNA試劑才介導(dǎo)RNAi。優(yōu)選的iRNA試劑將基于表1A-1D中提供的有義和反義序列，或由其組成，或包含其。如本文所使用的，"基本上同一(相同)"，當(dāng)用于指與第二核苷酸序列相比較的第一核苷酸序列時(shí)，意指所述第一核苷酸序列除了不超過1、2或3個(gè)的核苷酸置換(例如，用尿嘧啶替代腺苷)外與第二核苷酸序列相同。"基本上保留抑制a-EnaC在培養(yǎng)的人細(xì)胞中表達(dá)的能力"，在本文中用于與表1A-1D的iRNA試劑之一不同但通過核苷酸的缺失、添加或置換從其衍生的iRNA試劑時(shí)，意指所述衍生的iRNA試劑的抑制活性不低于其所源自的表1A-1D的iRNA試劑的抑制活性的20%。例如，對(duì)于可以使培養(yǎng)的人細(xì)胞中的a-ENaCmRNA的量降低70%的表1A-1D的iRNA試劑，當(dāng)衍生自其的iRNA試劑本身可以使存在于培養(yǎng)的人細(xì)胞中的mRNA的量降低至少50%時(shí)，則可以被認(rèn)為基本上保留了抑制a-EnaC在培養(yǎng)的人細(xì)胞中復(fù)制的能力。任選地，本發(fā)明的iRNA試劑可以使存在于培養(yǎng)的人細(xì)胞中的a-ENaCmRNA的量降低至少50%。如本文所使用的，"受試者"是指正在接受對(duì)a-EnaC介導(dǎo)的病癥的治療的哺乳動(dòng)物生物體。受試者可以是任何哺乳動(dòng)物，例如牛、馬、小鼠、大鼠、狗、豬、山羊或靈長類動(dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。iRNA試劑的設(shè)計(jì)和詵擇如本文中所使用的，"與a-EnaC表達(dá)相關(guān)的病癥"是指(1)至少部分地由a-EnaC的存在來介導(dǎo)的和(2)可通過降低a-EnaC的存在水平來影響其結(jié)果的任何生物學(xué)或病理學(xué)狀態(tài)。下面給出與a-EnaC表達(dá)相關(guān)的特定病癥。本發(fā)明所基于的是靶向a-EnaC的iRNA試劑的設(shè)計(jì)、合成和產(chǎn)生，和在培養(yǎng)的細(xì)胞中在與iRNA試劑一起溫育后體外沉默a-EnaC基因的證明，以及所得到的針對(duì)a-EnaC介導(dǎo)的病癥的保護(hù)作用?？苫谛蛄行畔⒑推谕奶卣鱽砗侠碓O(shè)計(jì)iRNA試齊U。例如，可根據(jù)候選雙鏈體的相對(duì)解鏈溫度設(shè)計(jì)iRNA試劑。通常，雙鏈體應(yīng)當(dāng)在反義鏈的5'末端比在反義鏈的3'末端具有低的解鏈溫度。本發(fā)明提供了包含耙向一個(gè)或多個(gè)a-ENaC轉(zhuǎn)錄物的(一個(gè)或多個(gè))siRNA和/或shRNA的組合物。對(duì)于選定的任何特定基因靶，根據(jù)本發(fā)明所使用的siRNA或shRNA的設(shè)計(jì)將優(yōu)選遵循一定的指導(dǎo)方針。此外，在許多情況下，根據(jù)本發(fā)明遞送至細(xì)胞的試劑在成為活性抑制劑之前可經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)加工步驟(關(guān)于進(jìn)一步論述，參見下面)；在該情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，相關(guān)試劑優(yōu)選經(jīng)設(shè)計(jì)以包含對(duì)于其加工可能是必需的序列。由上皮鈉通道的機(jī)能障礙介導(dǎo)的疾病，包括與跨上皮膜的液體體積的調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病。例如，氣道表面液體體積是粘液纖毛清除和維持肺健康的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。上皮鈉通道的阻斷將促使液體在氣道上皮的粘膜側(cè)積聚，從而促進(jìn)粘液清除和預(yù)防粘液和痰在呼吸組織(包括肺氣道)的積累。此類疾病包括呼吸系統(tǒng)疾病，例如囊性纖維化、原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾患(C0PD)、哮喘、呼吸道感染(急性和慢性的；病毒性和細(xì)菌性的)和肺癌。由上皮鈉通道的阻斷介導(dǎo)的疾病還包括除了呼吸系統(tǒng)疾病以外的與7跨上皮的異常液體調(diào)節(jié)(可能牽涉上皮表面上的保護(hù)性表面液體的異常生理學(xué))相關(guān)的疾病，例如，口干燥癥(口腔干燥)或干燥性角膜炎(keratoconjunctivitissire)(干眼)。此外，腎臟中，上皮鈉通道的阻斷可用于促進(jìn)利尿，從而誘導(dǎo)降血壓作用。根據(jù)本發(fā)明的治療可以是對(duì)癥的或預(yù)防性的。哮喘包括內(nèi)因性(非變應(yīng)性)哮喘和外因性(變應(yīng)性)哮喘、輕度哮喘、中度哮喘、重度哮喘、支氣管炎性氣喘、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)哮喘、職業(yè)性哮喘和細(xì)菌感染后誘導(dǎo)的哮喘。哮喘的治療也應(yīng)理解為包括治療例如4或5歲以下、呈現(xiàn)喘鳴癥狀、被診斷為或可被診斷為"喘鳴嬰兒"的受試者(已建立的主要醫(yī)學(xué)關(guān)注的患者類別，現(xiàn)常鑒定為初期氣喘或早期氣喘)。(為方便起見，該特殊的哮喘狀況稱為"喘鳴_嬰兒綜合征")在哮喘治療中，預(yù)防性功效可以由(例如急性哮喘的)癥狀性發(fā)作或支氣管收縮(bronchoconstrictor)發(fā)作的頻率或嚴(yán)重度的降低、肺功能的改善、或氣道高反應(yīng)性的改善來證明。其還可由對(duì)其他對(duì)癥治療的需要減少來證明，所謂其它對(duì)癥治療即在癥狀性發(fā)作時(shí)用于或旨在限制或中斷該癥狀性發(fā)作的治療，例如消炎藥(例如，皮質(zhì)類固醇)或支氣管擴(kuò)張劑(bronchodilatory)。哮喘的預(yù)防性益處特別在傾向于"晨降"(morningdipping)的受試者中可以是明顯的。"晨降"是公認(rèn)的哮喘綜合征，對(duì)于大多數(shù)哮喘病患者來說是很普遍的，其特征在于例如大約凌晨4至6點(diǎn)的數(shù)小時(shí)之間，即在通常實(shí)質(zhì)性遠(yuǎn)離任何之前施用的對(duì)癥哮喘治療的時(shí)間，的哮喘發(fā)作。慢性阻塞性肺疾患包括慢性支氣管炎或與其相伴的呼吸困難、肺氣腫、以及由其他藥物治療，特別是其他吸入性藥物治療繼發(fā)的氣道高反應(yīng)性的加重。本發(fā)明還可用于治療任何類型或成因的支氣管炎，包括例如急性、花生仁吸入性、卡他性、格魯布性、慢性或結(jié)核性支氣管炎?；诒疚乃@示的結(jié)果，本發(fā)明提供了在培養(yǎng)細(xì)胞中和在受試者中例如哺乳動(dòng)物，例如人中減少a-EnaC表達(dá)的iRNA試劑。表1A-1D提供了靶向a-ENaC的示例性iRNA試劑(基于表A中所示標(biāo)準(zhǔn)名稱縮寫)。表lA，SeqIdNo.305-608，表IB和表1D，SeqIdNo.1519-1644列出了除了位于3'-末端與倒數(shù)第二的胸苷之間的一個(gè)硫代磷酸酯連接以外不包含核苷酸修飾的siRNA。表1A-1D中的其余SeqId列出了這樣的siRNA，其中在有義鏈中所有包含嘧啶堿基的核苷酸都是2'_0-甲基-修飾的核苷酸，且在反義鏈中5'-ua-3'序列背景中的所有尿苷和5'-ca-3'序列背景中的所有胞苷都是2'-O-甲基-修飾的核苷酸?；谶@些結(jié)果，本發(fā)明特別地提供了iRNA試劑，所述iRNA試劑包括具有表IA-ID中提供的試劑的有義鏈序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的有義鏈、和具有表1A-1D中提供的試劑的反義鏈序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的反義鏈。表1A-1D中顯示的iRNA試劑由與靶序列互補(bǔ)或同一的長度為19個(gè)核苷酸的兩條鏈，加上3'-U突出端，組成。本發(fā)明提供了包含來自這些序列的至少15個(gè)或至少16、17或18或19個(gè)連續(xù)核苷酸的試劑。然而，雖然這些長度可能是最佳的，但本發(fā)明的iRNA試劑并不意味著局限于這些長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地認(rèn)識(shí)到，更短或更長的iRNA試劑可具有相似的功效，因?yàn)?，在一定的長度范圍內(nèi)，功效是核苷酸序列而不是鏈長度的函數(shù)。例如，Yang，等，PNAS99:9942-9947(2002)，i正明長度在21至30個(gè)堿基對(duì)之間的iRNA試劑具有相似的功效。其他人已經(jīng)證明長度減少至大約15個(gè)堿基對(duì)的iRNA試劑可以有效沉默基因(Byrom，等，"IndueingRNAiwithsiRNACocktailsGeneratedbyRNaseIII，，TechNotes10(1)，Ambion，Inc.，Austin,TX)。因此，本發(fā)明可以并且本發(fā)明考慮從表1A-1D提供的序列中選擇15至19個(gè)核苷酸的部分序列來產(chǎn)生源自表1A-1D提供的序列之一的iRNA試劑。備選地，可以向表1A-1D提供的序列之一或包含來自這些試劑之一的15個(gè)連續(xù)核苷酸的試劑添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，添加方式優(yōu)選地但非必需地為使加入的核苷酸與靶基因例如a-EnaC的相應(yīng)序列互補(bǔ)的方式。例如，可將來自這些試劑之一的前15個(gè)核苷酸與在a-ENaCmRNA中出現(xiàn)在這些序列的5'的8個(gè)核苷酸組合，以獲得在有義鏈和反義鏈中具有23個(gè)核苷酸的試劑。所有這樣衍生的iRNA試劑包括在本發(fā)明的iRNA試劑中，只要它們基本上保持抑制a-ENaC在培養(yǎng)的人細(xì)胞中復(fù)制的能力即可。iRNA試劑的反義鏈在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛑辽贋?4，15，16，17，18，19，25，29，40或50個(gè)核苷酸。其在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛏儆?0，50，40，或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選長度范圍是15至30，17至25，19至23和19至21個(gè)核苷酸。iRNA試劑的有義鏈在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛑辽贋?4，15，1617，18，19，25，29，40或50個(gè)核苷酸。其在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛏儆?0，50，40，或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選長度范圍是15至30，17至25，19至23，和19至21個(gè)核苷酸。iRNA試劑的雙鏈部分在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛑辽贋?5，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，29，40或50個(gè)核苷酸對(duì)。其在長度上應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蛏儆?0，50，40或30個(gè)核苷酸對(duì)。優(yōu)選長度范圍是15至30，17至25，19至23，和19至21個(gè)核苷酸對(duì)。通常，本發(fā)明的iRNA試劑包括與a-ENaCmRNA充分互補(bǔ)的區(qū)域，并且就核苷酸而言長度足夠長，以便所述iRNA試劑或其片段可介導(dǎo)a-ENaC基因的下調(diào)。在iRNA試劑和靶基因之間不必完全互補(bǔ)，但相應(yīng)性必須足以使iRNA試劑或其斷裂產(chǎn)物能夠例如通過RNAi切割a-ENaCmRNA而指導(dǎo)序列特異性沉默。因此，本發(fā)明的iRNA試劑包括包含各含有至少16、17或18個(gè)核苷酸的序列的有義鏈和反義鏈的試劑，其中所述序列與表1A-1D的序列之一相比，除了每鏈各有不超過1、2或3個(gè)核苷酸已經(jīng)被其它核苷酸替代(例如，用尿嘧啶替代腺苷)之外，基本上相同(如下面所定義的)，其中所述試劑基本上保留抑制a-ENaC在培養(yǎng)的人細(xì)胞中表達(dá)的能力。因此此類試劑具有與表1A-1D的序列之一相同的至少15個(gè)核苷酸，但相對(duì)于靶a-ENaC序列或在有義鏈與反義鏈之間導(dǎo)入了1、2或3個(gè)堿基錯(cuò)配。與靶a-ENaCRNA序列的錯(cuò)配，特別是在反義鏈中的錯(cuò)配，在末端區(qū)域是最耐受的，并且如果存在，優(yōu)選在末端區(qū)域(一個(gè)或多個(gè))中，例如5'和/或3'末端的6、5、4或3個(gè)核苷酸之內(nèi)，最優(yōu)選在有義鏈的5'-末端或反義鏈的3'_末端的6、5、4或3個(gè)核苷酸之內(nèi)。有義鏈只需要與反義鏈充分互補(bǔ)以維持分子的總體雙鏈特征即可。優(yōu)選，選擇有義鏈和反義鏈以使iRNA試劑在分子的一個(gè)或兩個(gè)末端上包含單鏈或未配對(duì)區(qū)域。這樣，iRNA試劑包含有義和反義鏈，兩鏈優(yōu)選在配對(duì)后包含突出端，例如，一個(gè)或兩個(gè)5或3'突出端，但優(yōu)選2至3個(gè)核苷酸的3'突出端。大多數(shù)實(shí)施方案將具有3'突出端。優(yōu)選的siRNA試劑將具有單鏈突出端，優(yōu)選3'突出端，優(yōu)選長1至4個(gè)或優(yōu)選2或3個(gè)核苷酸，于該iRNA試劑的一個(gè)或兩個(gè)末端上。突出端可以是一條鏈比另一條鏈長的結(jié)果，或可以是相同長度的兩條鏈交錯(cuò)的結(jié)果。形成突出端的未配對(duì)的核苷酸可以是核糖核苷酸，或它們可以是脫氧核糖核苷酸，優(yōu)選胸苷。5'-末端優(yōu)選被磷酸化，或它們可以是非磷酸化的。雙鏈區(qū)域的優(yōu)選長度，例如在上面所討論的siRNA試劑范圍中，為15至30個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為18，19，20，21，22和23個(gè)核苷酸。siRNA試劑可在長度和結(jié)構(gòu)上與來自長dsRNA的天然Dicer加工產(chǎn)物相似。本發(fā)明還包括其中siRNA試劑的兩條鏈連接，例如共價(jià)連接在一起的實(shí)施方案。發(fā)夾結(jié)構(gòu)、或提供需要的雙鏈區(qū)域和優(yōu)選地3'突出端的其他單鏈結(jié)構(gòu)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。候詵iRNA試劑的評(píng)估如上面所指出的，本發(fā)明提供了鑒定可以用作a-ENaC的抑制劑的siRNA的系統(tǒng)。因?yàn)?，如上面所指出的，shRNA經(jīng)細(xì)胞內(nèi)加工可以產(chǎn)生具有雙鏈部分(序列與shRNA的莖結(jié)構(gòu)相同)的siRNA，因此該系統(tǒng)同樣地適用于鑒定可用作a-ENaC的抑制劑的shRNA。為了描述目的，該部分將涉及siRNA，但該系統(tǒng)也包括相應(yīng)的shRNA。特別地，本發(fā)明顯示了靶向抑制a-ENaC活性的siRNA的成功制備。如本文所述的，在此描述的技術(shù)和試劑可容易地應(yīng)用于設(shè)計(jì)靶向其他基因或基因區(qū)域的潛在新型siRNA，并且檢測(cè)它們?cè)谝种芶-ENaC上的活性。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，可通過將候選siRNA(—或多種)導(dǎo)入細(xì)胞(例如，通過外源施用、或通過將能夠指導(dǎo)siRNA內(nèi)源合成的載體或構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞)、或通過肺或鼻施用，導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，就對(duì)內(nèi)源a-ENaC表達(dá)的抑制，檢測(cè)潛在的a-ENaC抑制劑。備選地，可通過將候選siRNA(—或多種)與a-ENaC表達(dá)質(zhì)粒一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，在體外檢測(cè)潛在的a-ENaC抑制劑。然后評(píng)估候選siRNA降低耙轉(zhuǎn)錄物水平和/或抑制或阻抑a-ENaC活性的一個(gè)或多個(gè)方面或特征(例如上皮電位差或氣道表面液體吸收)的能力?？蓪⒁堰f送了本發(fā)明的siRNA組合物的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)室動(dòng)物(受試細(xì)胞/動(dòng)物)，與未接受本發(fā)明組合物的相似的或可比較的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)室動(dòng)物(對(duì)照細(xì)胞/動(dòng)物，例如，沒有接受siRNA或接受了對(duì)照siRNA例如耙向非內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物例如綠色熒光蛋白(GFP)的siRNA的細(xì)胞/動(dòng)物)相比較。可將受試細(xì)胞/動(dòng)物的離子轉(zhuǎn)運(yùn)表型與對(duì)照細(xì)胞/動(dòng)物的該表型相比較，條件是本發(fā)明的siRNA與受試細(xì)胞類型/物種具有序列交叉反應(yīng)性?？稍谑茉嚰?xì)胞/動(dòng)物中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞/動(dòng)物比較a-ENaC蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和短路電流(體外或離體)。相似地可比較a-ENaC活性的其他指標(biāo)，包括離體上皮電位差或體內(nèi)粘液纖毛清除率或全身磁共振成像(MRI)。一般地，受試細(xì)胞/動(dòng)物和對(duì)照細(xì)胞/動(dòng)物將來自相同物種，且對(duì)于細(xì)胞，具有相似或相同的細(xì)胞類型。例如，可比較來自相同細(xì)胞系的細(xì)胞。當(dāng)受試細(xì)胞是原代細(xì)胞時(shí)，通常對(duì)照細(xì)胞也將是原代細(xì)胞。例如，候選siRNA抑制a-ENaC活性的能力可方便地通過如下方式確定(i)將候選siRNA遞送至細(xì)胞，(ii)估量相對(duì)于內(nèi)源表達(dá)的對(duì)照基因，a-ENaCmRNA的表達(dá)水平，(iii)將體外細(xì)胞模型中在siRNA存在的情況下產(chǎn)生的氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感性電流與在該siRNA不存在的情況下產(chǎn)生的量比較。此后一種測(cè)定法可用于檢測(cè)靶向可間接地影響a-ENaC活性的任何耙轉(zhuǎn)錄物的siRNA，而不限于耙向編碼ENaC通道亞基的轉(zhuǎn)錄物的siRNA。候選siRNA降低靶轉(zhuǎn)錄物水平的能力可通過使用例如Northern印跡法、核酸酶保護(hù)試驗(yàn)、探針雜交、逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR、微陣列分析等測(cè)量靶轉(zhuǎn)錄物的量來進(jìn)行10評(píng)估。候選siRNA抑制靶轉(zhuǎn)錄物編碼的多肽產(chǎn)生(在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上)的能力可使用多種基于抗體的方法來測(cè)量，包括但不限于Western印跡法、免疫測(cè)定法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)微陣列等。一般地，可使用測(cè)量靶轉(zhuǎn)錄物或靶轉(zhuǎn)錄物編碼的多肽的量的任何方法?！愕?，某些優(yōu)選的a-ENaCiRNA抑制劑使靶轉(zhuǎn)錄物水平，相對(duì)于在該抑制劑不存在時(shí)(例如，在缺乏抑制劑的可比較的對(duì)照細(xì)胞中)的水平，降低至少大約2倍，優(yōu)選至少大約4倍，更優(yōu)選至少大約8倍，至少大約16倍，至少大約64倍或甚至更大的程度。一般地，某些優(yōu)選a-ENaCiRNA抑制劑抑制ENaC通道活性，從而在包含抑制劑的細(xì)胞中所述活性比在不包含抑制劑的對(duì)照細(xì)胞中的低至少大約2倍，優(yōu)選至少大約4倍，更優(yōu)選至少大約8倍，至少大約16倍，至少大約64倍，至少大約100倍，至少大約200倍或達(dá)到甚至更大的程度。某些優(yōu)選a-ENaCiRNA抑制劑在siRNA施用和細(xì)胞感染后抑制ENaC通道活性至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少36小時(shí)、至少48小時(shí)、至少60小時(shí)、至少72小時(shí)、至少96小時(shí)、至少120小時(shí)、至少144小時(shí)或至少168小時(shí)。某些優(yōu)選a-ENaC抑制劑在施用siRNA后阻止(即，減少至不可檢測(cè)的水平)或顯著降低a-ENaC的活性至少24小時(shí)、至少36小時(shí)、至少48小時(shí)或至少60小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，a-ENaC活性的顯著降低是指降低至低于在siRNA不存在的情況下的水平的大約90%，降低至低于在siRNA不存在的情況下的水平的大約75%，降低至低于在siRNA不存在的情況下的水平的大約50%，降低至低于在siRNA不存在的情況下的水平的大約25%，或降低至低于在siRNA不存在的情況下的水平的大約10%?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量a-ENaC活性的減少，包括但不限于，體外氨氯吡嗪脒敏感性的短路電流測(cè)量、離體上皮電位差或體內(nèi)粘液纖毛清除或全身/肺MRI。iRNA試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)、修飾和再檢測(cè)可就穩(wěn)定性，例如對(duì)核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶切割的易感性，評(píng)估候選iRNA試劑，例如在將iRNA試劑導(dǎo)入受試者的身體中后?？捎梅椒ㄨb定對(duì)修飾，特別是切割，例如由受試者體內(nèi)存在的組分引起的切割，易感的位點(diǎn)。此類方法可包括在候選iRNA試劑與分離的生物介質(zhì)例如血清、血漿、痰、腦脊液或細(xì)胞或組織勻漿物在體外溫育后，或在使受試者與候選iRNA試劑體內(nèi)接觸后，分離和鑒定通過候選iRNA試劑的降解而形成的最豐富的片段，從而鑒定易于切割的位點(diǎn)。此類方法見于，例如，但不限于2005年5月27日提交的國際專利申請(qǐng)公開號(hào)W02005115481中。當(dāng)鑒定到對(duì)切割易感的位點(diǎn)時(shí)，可設(shè)計(jì)和/或合成另外的iRNA試齊U，其中例如通過在切割位點(diǎn)上導(dǎo)入2'_修飾例如2'-O-甲基，使該潛在的切割位點(diǎn)抗切割。可就穩(wěn)定性再檢測(cè)該另外的iRNA試劑，并且可以重復(fù)該過程直至發(fā)現(xiàn)展示期望穩(wěn)定性的iRNA試劑。體內(nèi)檢測(cè)可在動(dòng)物模型中(例如，在哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、豚鼠或靈長類動(dòng)物中)就體內(nèi)功能性檢測(cè)被鑒定為能夠抑制a-ENaC基因表達(dá)的iRNA試劑。例如，可對(duì)動(dòng)物施用iRNA試齊U，就其生物分布、穩(wěn)定性和其抑制a-ENaC表達(dá)或調(diào)節(jié)至少部分由a-ENaC介導(dǎo)的生物學(xué)或病理學(xué)過程的能力，評(píng)估iRNA試劑?？梢岳缤ㄟ^注射，將iRNA試劑直接施用至耙組織，或可將iRNA試劑以與其施用給人時(shí)的方式相同的方式對(duì)動(dòng)物施用。優(yōu)選，通過例如鼻內(nèi)、吸入或氣管內(nèi)施用，將iRNA試劑遞送至受試者的氣道。還可就iRNA試劑的細(xì)胞內(nèi)分布來對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估可包括確定iRNA試劑是否被攝入細(xì)胞。評(píng)估還可包括測(cè)定iRNA試劑的穩(wěn)定性(例如，半衰期)。可通過使用綴合至示蹤標(biāo)記物(例如，熒光標(biāo)記，例如熒光素；放射性標(biāo)記物，例如^S,P,P或^;金顆粒；或用于免疫組織化學(xué)的抗原顆粒)的iRNA試劑，促進(jìn)對(duì)iRNA試劑的體內(nèi)評(píng)估?？删蚷RNA試劑下調(diào)a-ENaC表達(dá)的能力，對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。可以例如通過在暴露于iRNA試劑之前和之后從組織分離RNA，或通過原位雜交，測(cè)量體內(nèi)a-ENaC基因表達(dá)的水平。在需要處死動(dòng)物以收獲組織的情況下，未處理的對(duì)照動(dòng)物將用于比較。a-ENaCRNA可通過任何期望的方法來檢測(cè)，包括但不限于RT-PCR、northern印跡法、分支-DNA測(cè)定法(branched-DNAassay)或RNA酶保護(hù)試驗(yàn)。備選地或另外地，a-ENaC基因表達(dá)可通過對(duì)用iRNA試劑處理過的組織提取物進(jìn)行western印跡分析或免疫染色來監(jiān)測(cè)?？墒褂萌魏晤愋偷囊验_發(fā)的動(dòng)物模型來檢測(cè)潛在的a-ENaC抑制劑。可對(duì)動(dòng)物施用包含候選siRNA、能夠指導(dǎo)此類siRNA在宿主細(xì)胞中合成的構(gòu)建體或載體、或經(jīng)工程改造或經(jīng)操作而含有候選siRNA的細(xì)胞的組合物。評(píng)估組合物抑制a-ENaC表達(dá)和/或改變ENaC-依賴性表型和/或相對(duì)于未接受該潛在a-ENaC抑制劑的動(dòng)物減輕它們的嚴(yán)重度的能力。此類模型包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、綿羊和非人靈長類動(dòng)物的ENaC-依賴性表型模型，所述全部模型在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且被用于檢測(cè)潛在的a-ENaC治療劑的功效。通過利用本發(fā)明用于鑒定候選治療性siRNA試劑的系統(tǒng)，合適的治療劑選自Duplex標(biāo)識(shí)符ND-8302,ND-8332,ND-8348,ND-8356,ND-8357,ND-8373,ND-8381,ND-8396,ND-8450和ND-8453,更合適地選自ND-8356,ND-8357和ND_8396。iRNA化學(xué)在此描述介導(dǎo)RNAi以抑制a-ENaC基因表達(dá)的分離的iRNA試劑，例如dsRNA試劑。本文所述的RNA試劑包括未修飾的RNA以及已被修飾例如以提高功效的RNA，和核苷替代物的聚合物。未修飾的RNA是指分子中核酸的組分，即糖、堿基和磷酸部分，與天然存在的，優(yōu)選在人體中天然存在的相同或基本上相同。本領(lǐng)域一直將稀有或罕見但天然存在的RNA稱為修飾的RNA，參見，例如Limbach等NucleicAcidsRes.22:2183-2196,1994。此類通常稱為修飾的RNA(明顯原因是它們通常是轉(zhuǎn)錄后修飾的結(jié)果)的稀有或罕見RNA，在本文所使用的術(shù)語未修飾的RNA的范圍內(nèi)。本文中，修飾的RNA是指分子中核酸的一個(gè)或多個(gè)組分，即糖、堿基和磷酸部分，與天然存在的不同，優(yōu)選與在人體中天然存在的不同。雖然它們被稱為修飾的"RNA"，但它們當(dāng)然，由于修飾的原因，將包括非RNA的分子。核苷替代物是其中核糖磷酸(ribophosphate)主鏈被非核糖磷酸構(gòu)建物替代的分子，其中所述非核糖磷酸構(gòu)建物允許堿基呈現(xiàn)正確的空間關(guān)系，以致于與利用核糖磷酸主鏈時(shí)觀察到的雜交具有基本相似的雜交，例如，核糖磷酸主鏈的不帶電荷的模擬物。上述實(shí)例在本文中進(jìn)行了論述。可將本文所述的修飾摻入本文所述的任何雙鏈RNA和RNA樣分子，例如iRNA試劑?？赡芷谕揎梚RNA試劑的反義和有義鏈中的一條或兩條鏈。因?yàn)楹怂崾莵唵挝换騿误w的聚合物，下面描述的許多修飾發(fā)生在核酸中重復(fù)的位置上，例如對(duì)堿基或磷酸部分或磷酸部分的非連接氧的修飾。在一些情況下，修飾將在核酸的所有主題位置上發(fā)生，但在許多，事實(shí)上大多數(shù)情況下，情況不是這樣的。例如，修飾可能只發(fā)生在3'或5'末端位置，可能只發(fā)生在末端區(qū)域，例如末端核苷酸的位置上，或鏈的最后2、3、4、5或10個(gè)核苷酸中。修飾可發(fā)生在雙鏈區(qū)域，單鏈區(qū)域或兩者中。例如，非連接O位置上的硫代磷酸酯修飾可只發(fā)生在一個(gè)或兩個(gè)末端，可只發(fā)生在末端區(qū)域，例如末端核苷酸的位置上、或鏈的最后2、3、4、5或10個(gè)核苷酸中，或可發(fā)生在雙鏈和單鏈區(qū)域中，特別地在末端上。類似地，修飾可在有義鏈、反義鏈或兩者上發(fā)生。在一些情況下，有義鏈和反義鏈具有相同的修飾或相同類型的修飾，但在其他情況下有義鏈和反義鏈將具有不同的修飾，例如在一些情況下，可能期望只修飾一條鏈，例如有義鏈。將修飾導(dǎo)入iRNA試劑的兩個(gè)主要目的是它們對(duì)抗生物環(huán)境中降解的穩(wěn)定化作用和對(duì)藥理性質(zhì)例如藥效學(xué)性質(zhì)的改善，這在下面進(jìn)一步論述。對(duì)iRNA試劑的糖、堿基或主鏈的其他適宜修飾描述于2004年1月16日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/01193中。iRNA試劑可包含非天然堿基，例如2004年4月16日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/011822中描述的堿基。iRNA試劑可包含非天然糖，例如非糖環(huán)狀載體分子。用于iRNA試劑的非天然糖的示例性特征描述于2003年4月16日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/11829中。iRNA試劑可包含用于增加核酸酶抗性的核苷酸間鍵(例如，手性硫代磷酸酯鍵)。此外，或備選地，iRNA試劑可包含核糖模擬物以增加核酸酶抗性。用于增加核酸酶抗性的示例性核苷酸間鍵和核糖模擬物描述于2004年3月8日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/07070中。iRNA試劑可包含用于寡核苷酸合成的綴合配體的單體亞單位和單體。示例性單體描述于2004年8月10日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?0/916，185。iRNA試劑可具有ZXY結(jié)構(gòu)，例如2004年3月8日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/07070中描述的該結(jié)構(gòu)?？蓪RNA試劑與兩親性部分復(fù)合。與iRNA試劑一起使用的示例性兩親性部分描述于2004年3月8日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/07070中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使iRNA試劑與遞送試劑復(fù)合(以模塊復(fù)合物(modularcomplex)為特征)。所述復(fù)合物可包括與一種或多種(優(yōu)選兩種或更多中，更優(yōu)選所有三種)下列試劑連接的載體試劑(carrieragent):(a)縮合劑(condensingagent)(例如能夠通過離子或靜電相互作用吸引，例如結(jié)合核酸的試劑)；(b)融合劑(例如，能夠與細(xì)胞膜融合和/或能夠跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑)；和(c)靶向性基團(tuán)，細(xì)胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)，例如結(jié)合特定細(xì)胞類型的抗體。與遞送劑復(fù)合的iRNA試劑描述于2004年3月8日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/07070中。iRNA試劑可具有非規(guī)范配對(duì)，例如在iRNA雙鏈體的有義和反義序列之間。非規(guī)范iRNA試劑的示例性特征描述于2004年3月8日提交的PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2004/07070中。增強(qiáng)的核酸酶抗件iRNA試劑，例如耙向a-ENaC的iRNA試劑，可具有增強(qiáng)的對(duì)核酸酶的抗性。增加抗性的一個(gè)方法是鑒定切割位點(diǎn)，然后修飾此類位點(diǎn)以抑制切割，如2004年5月4日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?0/559，917中所述的。例如，二核苷酸5'-ua-3'、5'-ca-3'、5'-ug-3'、5'-皿-3'或5'-cc-3'可用作切割位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，iRNA試劑的有義鏈、反義鏈或兩條鏈中所有嘧啶都具有2'-修飾，由此該iRNA試劑具有增強(qiáng)的對(duì)核酸內(nèi)切酶的抗性。增強(qiáng)的核酸酶抗性還可通過修飾5'核苷酸，導(dǎo)致例如至少一個(gè)尿苷是2'-修飾核苷酸的5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸、至少一個(gè)5'-胞苷是2'-修飾核苷酸的5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸、至少一個(gè)5'-尿苷是2'-修飾核苷酸的5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸、至少一個(gè)5'-尿苷是2'-修飾核苷酸的5'-尿苷-尿苷-3'(5'-皿-3')二核苷酸、或至少一個(gè)5'-胞苷是2'-修飾核苷酸的5'-胞苷-胞苷-3'(5'-cc-3')二核苷酸來實(shí)現(xiàn)，如2005年5月27日提交的國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2005/018931中所描述的。iRNA試劑可包含至少2個(gè)，至少3個(gè)，至少4個(gè)或至少5個(gè)這樣的二核苷酸。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，有義鏈、反義鏈或兩條鏈中所有出現(xiàn)的序列基序5'-ua-3'和5'-ca-3'中的5'核苷酸都是修飾的核苷酸。優(yōu)選有義鏈、反義鏈或兩條鏈中所有出現(xiàn)的序列基序5'-ua-3'、5'-ca-3'和5'_ug-3'中的5'核苷酸都是修飾的核苷酸。更優(yōu)選，有義鏈中所有嘧啶核苷酸都是修飾的核苷酸，而反義鏈中所有出現(xiàn)的序列基序5'-ua-3'和5'-ca-3'中的5'核苷酸都是修飾的核苷酸，或在反義鏈不包含5'-ua-3'和5'-ca-3'基序的情況下，所有出現(xiàn)的基序5'-ug-3'中的5'核苷酸都是修飾的核苷酸。優(yōu)選，2'_修飾的核苷酸包括例如2'-修飾的核糖單位，例如可用許多不同的"氧基"或"脫氧基"取代基替代或修飾2'-羥基(OH)。"氧基"-2'羥基基團(tuán)修飾的實(shí)例包括烷氧基或芳氧基(0R，例如，R=H，烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)凍乙二醇(PEG)，0(CH2CH沖nCH^H20R;其中2'羥基例如通過亞甲基橋連接至相同核糖的4'碳的"鎖"核酸(LNA);0-AMINE和氨基烷氧基，0(CH2)。AMINE(例如，AMINE=NH2;烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基或二雜芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。值得注意的是，只包含甲氧基乙基(M0E)，(0CH2CH20CH3，PEG衍生物)，的寡核苷酸可以展示與具有強(qiáng)力硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸相當(dāng)?shù)暮怂崦阜€(wěn)定性。"脫氧基"修飾包括氫(即，脫氧核糖，其對(duì)部分dsRNA的突出端部分尤其合適)；鹵素(例如，氟)；氨基(例如朋2;烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基、芳基氨基，二芳基氨基，雜芳基氨基，二雜芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE=NH2;烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基或二雜芳基氨基)；-NHC(0)R(R二烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；和烷基，環(huán)烷基，芳基，鏈烯基和炔基，其可任選地被例如氨基官能團(tuán)取代。優(yōu)選取代基是2'-甲氧基乙基、2'_0CH3、'-O-烯丙基、'-C-烯丙基和2'_氟。寡核苷酸主鏈中包含呋喃糖也可減少內(nèi)切核酸降解切割。還可以通過包含3'陽離子基團(tuán)，或通過以3'-3'連接倒置3'-末端核苷酸，修飾iRNA試劑。在另一個(gè)備選方案中，可用氨基烷基封閉3'末端，例如3'C5-氨基烷基dT。其他3'綴合物可抑制3'-5'外切核酸降解切割。然而不受理論束縛，3'綴合物，例如萘普生(naproxen)或布洛芬(ibuprofen)，可通過空間阻斷核酸外切酶與寡核苷酸的3'-末端結(jié)合來抑制外切核酸降解切割。甚至小烷基鏈、芳基或雜環(huán)綴合物或修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)14也可阻斷3'-5'_核酸外切酶。還可通過導(dǎo)入磷酸酯連接體修飾，例如硫代磷酸酯鍵，抑制核酸降解切割。因此，優(yōu)選的iRNA試劑包含這樣的核苷酸二聚體，該二聚體富含或純粹僅具有特定手性形式的修飾磷酸基團(tuán)，其中所述修飾的磷酸基團(tuán)在通常由氧占據(jù)的非橋接位置上包含雜原子。雜原子可以是S，Se，Ni^或Biv當(dāng)雜原子是S時(shí)，富Sp連接或手性純Sp連接是優(yōu)選的。"富"意指至少70，80，90，95或99%的該優(yōu)選形式。當(dāng)在iRNA試劑的5'-或3'-末端位置，優(yōu)選5'-末端位置，附近導(dǎo)入時(shí)，修飾的磷酸酯連接在抑制外切核酸降解切割方面特別有效。5'綴合物也可抑制5'-3'外切核酸降解切割。盡管不受任何理論束縛，5'綴合物，例如萘普生或布洛芬，可通過空間阻斷核酸外切酶與寡核苷酸的5'-末端結(jié)合來抑制外切核酸降解切割。甚至小烷基鏈、芳基或雜環(huán)綴合物或經(jīng)修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)也可阻斷3'-5'-核酸外切酶。當(dāng)雙鏈的iRNA試劑在至少一個(gè)末端上包含單鏈核苷酸突出端時(shí)，iRNA試劑可具有增強(qiáng)的對(duì)核酸酶的抗性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸突出端包含1至4個(gè)，優(yōu)選2至3個(gè)未配對(duì)的核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與末端核苷酸對(duì)直接鄰接的單鏈突出端的未配對(duì)核苷酸含有嘌呤堿基，而該末端核苷酸對(duì)是G-C對(duì)，或者最后四個(gè)互補(bǔ)核苷酸對(duì)中的至少兩個(gè)是G-C對(duì)。在其它實(shí)施方案中，核苷酸突變端可以具有1個(gè)或2個(gè)未配體的核苷酸，在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，核苷酸突變端是5'_gc-3'。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸突出端在反義鏈的3'端。在一個(gè)實(shí)施方案中，iRNA試劑在反義鏈的3'端包括基序5'-cgc-3'，由此形成2-nt的突出端5'_gc-3'。因此，iRNA試劑可以包括修飾以抑制降解，例如由受試者體內(nèi)的核酸酶，例如內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶，引起的降解。這些單體在本文中稱作NRM或核酸酶抵抗促進(jìn)單體，相應(yīng)的修飾稱作NRM修飾。在許多情況下，這些修飾還調(diào)節(jié)iRNA試劑的其它性質(zhì)，例如，與蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如血清白蛋白，或RISC成員相互作用的能力，或者第一和第二序列相互形成雙鏈體的能力、或與其它序列，例如靶分子形成雙鏈體的能力?？梢詫⒁环N或多種不同的NRM修飾引入iRNA試劑中或引入iRNA試劑的序列中。一種NRM修飾可以在序列中或在iRNA試劑中使用一次以上。NRM修飾包括僅可以放置在末端的一些修飾和可以置于任何位置的其它修飾。一些NRM修飾可以抑制雜交，因此，優(yōu)選僅將其用在末端區(qū)域中，并且優(yōu)選不將其用于耙向主題序列或基因的序列的切割位點(diǎn)或切割區(qū)域中，尤其是在反義鏈上。只要可以維持dsiRNA試劑兩鏈之間的充分雜交，它們可以用在有義鏈的任何地方。在一些實(shí)施方案中，期望將NRM置于有義鏈的切割位點(diǎn)處或切割區(qū)域中，因?yàn)檫@可以最小化脫耙沉默。在許多情況下，NRM修飾根據(jù)其是包含在有義鏈上還是包含在反義鏈上而有不同的分布。如果在反義鏈上，干擾或抑制內(nèi)切核酸酶切割的修飾不應(yīng)插入接受RISC介導(dǎo)的切割的區(qū)域，例如切割位點(diǎn)或切割區(qū)域(參見Elbashir等，2001，GenesandDev.15:188，特此并入作為參考)。靶的切割發(fā)生在20或21nt反義鏈的大約中部，或者與反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA的第一個(gè)核苷酸上游大約10或11個(gè)核苷酸處。在本文中，切割位點(diǎn)指在靶上或在與靶雜交的iRNA試劑鏈上位于切割位點(diǎn)兩側(cè)的核苷酸。切割區(qū)域指位于切割位點(diǎn)在每一方向上的1、2或3個(gè)核苷酸內(nèi)的核苷酸。此類修飾可以引入有義鏈或反義鏈的末端區(qū)域，例如，末端位置或者末端2、3、4或5個(gè)位置內(nèi)。栓系配體(tetheredligand)可以例如通過導(dǎo)入配體，例如栓系配體，影響和剪裁iRNA試劑的性質(zhì)，包括其藥理學(xué)性質(zhì)。此外，當(dāng)iRNA試劑可以具有或確實(shí)具有栓系配體時(shí)，可通過將配體摻入iRNA試劑的制劑中，改良iRNA試劑的藥理學(xué)性質(zhì)?？蓪⒍喾N多樣的實(shí)體例如配體栓系到iRNA試劑上，或用作制劑綴合物或添加物，例如到配體綴合的單體亞單位的載體上。在下面就綴合配體的單體亞單位描述實(shí)例，但這只是優(yōu)選的，還可將實(shí)體在其他點(diǎn)上偶聯(lián)至iRNA試劑。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)部分(moiety)是通過居間系鏈(interveningtether)直接或間接地偶聯(lián)，優(yōu)選共價(jià)地偶聯(lián)，至載體的配體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過居間系鏈將配體連接至載體。當(dāng)將配體綴合的單體摻入到正在生長的鏈中時(shí)，配體或栓系配體可存在于配體綴合的單體上。在一些實(shí)施方案中，可以在將"前體"配體綴合單體亞單位摻入到正在生長的鏈中之后，再將配體摻入"前體"配體綴合單體亞單位中。例如，可將具有例如以氨基結(jié)尾的系鏈，例如TAP-(CH》nNH2，的單體摻入正在生長的有義或反義鏈。在隨后的操作中，S卩，在將該前體單體亞單位摻入鏈中后，可以隨后將具有親電子基團(tuán)，例如，五氟苯基酯或醛基團(tuán)，的配體，通過該配體的此親電子基團(tuán)與前體配體綴合單體亞單位系鏈的末端親核基團(tuán)偶聯(lián)，而結(jié)合到前體配體綴合單體上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，配體改變摻入了其的iRNA試劑的分布、耙向性或壽命。在優(yōu)選實(shí)施方案中，配體提供了，當(dāng)例如與不存在這樣的配體的物類相比時(shí)，增強(qiáng)的對(duì)于選擇的耙，例如分子、細(xì)胞或細(xì)胞類型、區(qū)室例如細(xì)胞或器官區(qū)室、組織、器官或身體區(qū)域的親和力。優(yōu)選的配體可提高轉(zhuǎn)運(yùn)、雜交和特異性性質(zhì)，并且還可提高所得的天然的或修飾的寡核糖核苷酸、或包含本文所述單體和/或天然的或修飾的核糖核苷酸的任何組合的聚合分子的核酸酶抗性。配體通常可包括治療性調(diào)節(jié)物(modifier)，例如，以增強(qiáng)攝??；診斷性化合物或報(bào)告基團(tuán)，例如以監(jiān)測(cè)分布；交聯(lián)劑；賦予核酸酶抗性的部分；和天然的或罕見的核酸堿基(皿cleobases)。一般實(shí)例包括親脂分子、脂質(zhì)、凝集素、類固醇(例如烏蘇醇、核柯配基(hecigenin)、薯蕷皂苷配基)、萜類(例如，三萜類，例如，薩灑皂苷配基、無羈萜、表無羈萜醇衍生的石膽酸)，維生素、碳水化合物(例如，葡聚糖、普魯蘭多糖、殼多糖、殼聚糖、合成(例如寡聚乳酸15-聚體)和天然(例如低和中分子量)聚合物、菊淀粉、環(huán)糊精或透明質(zhì)酸)、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合齊U、整聯(lián)蛋白靶向性分子、聚陽離子、肽、多胺和肽模擬物。其他實(shí)例包括葉酸或上皮細(xì)胞受體的配體例如轉(zhuǎn)鐵蛋白。配體可以是天然發(fā)生的或重組的或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的實(shí)例包括多聚賴氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯_馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯_共_乙交酯)共聚物、二乙烯醚_馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯酰胺聚合物、或聚磷嗪。多胺的實(shí)例包括聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸(PLL)、精胺、亞精胺、多胺、假肽_多胺、肽模擬物多胺、樹狀聚體多胺、精氨酸、脒、魚精蛋白、陽離子結(jié)構(gòu)部分，例如陽離子脂質(zhì)、陰離子卟啉、多胺的季鹽或a螺旋肽。配體還可包括靶向性基團(tuán)，例如細(xì)胞或組織靶向劑，例如，促甲狀腺激素、促黑激素、表面活性蛋白A、粘蛋白糖、糖基化的聚氨基酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、或Arg-Gly-Asp(RGD)肽或RGD肽模擬物。配體可以是蛋白質(zhì)，例如糖蛋白，脂蛋白，例如低密度脂蛋白(LDL)，或白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，或肽，例如對(duì)共配體具有特定親和力的分子，或抗體，例如結(jié)合特定細(xì)胞類型例如癌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或骨細(xì)胞的抗體。配體還可包括激素和激素受體。它們還可包括非肽物質(zhì)(non-p印tidic)，例如輔因子、多價(jià)乳糖、多價(jià)半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多價(jià)甘露糖、或多價(jià)巖藻糖。配體可以是能夠例如通過破壞細(xì)胞的細(xì)胞骨架，例如通過破壞細(xì)胞的微管、微絲和/或中間纖維來增加細(xì)胞對(duì)iRNA試劑的攝取的物質(zhì)，例如藥物。藥物可以是例如taxon，長春花新堿、長春花堿、松胞菌素、諾可唑、j即lakinolide、紅海海綿素A、鬼筆環(huán)肽、swinholideA、indanocine、myoservin、四環(huán)素。在一個(gè)方面，配體是脂質(zhì)或基于脂質(zhì)的分子。這樣的脂質(zhì)或基于脂質(zhì)的分子優(yōu)選結(jié)合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA結(jié)合性配體允許綴合物分布至靶組織例如肝組織(包括肝的實(shí)質(zhì)細(xì)胞)。可結(jié)合HSA的其他分子也可用作配體。例如，可使用n印roxin或阿斯匹林。脂質(zhì)或基于脂質(zhì)的配體能夠(a)增加抵抗綴合物降解的抗性，(b)增加至靶細(xì)胞或細(xì)胞膜的耙向或轉(zhuǎn)運(yùn)，和/或(c)可用于調(diào)節(jié)對(duì)血清蛋白例如HSA的結(jié)合。基于脂質(zhì)的配體可用于調(diào)節(jié)例如控制綴合物與靶組織的結(jié)合。例如，更強(qiáng)地結(jié)合HSA的脂質(zhì)或基于脂質(zhì)的配體靶向腎的可能性更低，從而從身體清除的可能性更低。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基于脂質(zhì)的配體結(jié)合HSA。優(yōu)選，其以足夠的親和力結(jié)合HSA，這樣綴合物優(yōu)選地將被分配至非腎組織。然而，優(yōu)選親和力不要太強(qiáng)以至HSA-配體結(jié)合不能被逆轉(zhuǎn)。在另一個(gè)方面，配體是被靶細(xì)胞例如增殖細(xì)胞攝取的部分，例如維生素或營養(yǎng)物。這些配體尤其可以用于治療以不期望的細(xì)胞增殖，例如惡性或非惡性類型的，例如癌細(xì)胞，為特征的病癥。示例性維生素包括維生素A、E和K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被癌細(xì)胞攝取的維生素或營養(yǎng)物。在另一方面，配體是細(xì)胞滲透劑，優(yōu)選螺旋細(xì)胞滲透劑(helicalcell-permeationagent)。優(yōu)選，該細(xì)胞滲透試劑是兩親性的。示例性試劑是肽，例如tat或antenn即edia。如果試劑是肽，則其可被修飾，包括肽模擬物、invertomer、非肽或假肽連接，以及使用D-氨基酸。螺旋劑優(yōu)選是a-螺旋劑，其優(yōu)選具有親脂和疏脂相。細(xì)胞滲透劑可與iRNA試劑共價(jià)連接，或其是iRNA-肽復(fù)合物的一部分。5'-磷酸修飾在優(yōu)選實(shí)施方案中，iRNA試劑為5'磷酸化的或在5'引物末端包含磷酰基類似物。反義鏈的5'-磷酸修飾包括與RISC-介導(dǎo)的基因沉默相容的修飾。適宜的修飾包括5'-—磷酸酯((H0)2(0)P-0-5');5'-二磷酸酯((H0)2(0)P-0-P(H0)(0)-0-5');5'_三磷酸酯((H0)2(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5');5'_鳥苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-0-5'-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5');5'-腺苷帽(A卯p)，和任何修飾的或未修飾的核苷酸帽結(jié)構(gòu)(N-0-5'—(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5');5'-硫代一磷酸酯(硫代磷酸酯；(H0)2(S)P-0-5');5'-二硫代一磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-0-5')，5'-磷酸硫酯((HO)2(0)P_S_5');氧/硫代的一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其它組合(例如5'-a-硫代三磷酸酯、5'-Y-硫代三磷酸酯等)、5'-磷酰胺((HO)2(0)P-NH-5'、(HO)(NH2)(0)P-0-5')、5'-烷基膦酸酯(R二烷基二甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(0H)(0)-0-5'-、(0H)2(0)P-5'-CH2-)、5'_烷基醚膦酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(0)-0-5'-)?？尚揎椨辛x鏈以使有義鏈?zhǔn)Щ畈⑶易柚够钚訰ISC的形成，從而潛在地減少脫靶效應(yīng)。這可通過防止有義鏈的5'_磷酸化的修飾，例如通過利用5'-O-甲基核糖核苷酸的修飾，以實(shí)現(xiàn)(參見Nykanen等，(2001)ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferenc印athway.Cell107，309-321.)。還可使用防止磷酸化的其他修飾，例如，用H而非0-Me簡單地替代5'0H。備選，將大體積基團(tuán)加至5'-磷酸，以將其轉(zhuǎn)變成磷酸二酯鍵。非天然核酸堿某(皿cleobase)硝基吡咯基和硝基吲哚基是非天然核酸堿基，是稱為通用堿基的一類化合物的成員。通用堿基是可替代四種天然堿基之任何一種而不實(shí)質(zhì)性影響寡核苷酸雙鏈體的解鏈行為或活性的化合物。與和天然核酸堿基相關(guān)的起穩(wěn)定作用的氫鍵相互作用不同，據(jù)推測(cè)包含3-硝基吡咯基核酸堿基的寡核苷酸雙鏈體只依靠堆積相互作用來穩(wěn)定。與硝基吡咯基核酸堿基的顯著氫鍵相互作用的缺乏，消除了對(duì)于特定互補(bǔ)堿基的特異性。此外，不同的報(bào)導(dǎo)證實(shí)4-，5-和6-硝基吲哚基展示對(duì)4種天然堿基非常小的特異性。有趣的是，包含5-硝基吲哚基的寡核苷酸雙鏈體比包含4-硝基吲哚基和6-硝基吲哚基的相應(yīng)寡核苷酸更穩(wěn)定。用于制備l-(2'-0-甲基-P-D-呋喃核糖基)-5-硝基吲哚的方法描述于Gaubert，G;Wengel，J.TetrahedronLetters2004，45，5629.中。其他適用于本發(fā)明的通用堿基包括次黃嘌呤基、異肌苷基、2-氮雜-肌苷基、7-脫氮雜-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、和其結(jié)構(gòu)衍生物。關(guān)于更詳細(xì)的論述，包括硝基吡咯基，硝基噴哚基和其他上面提及的通用堿基的合成方法，參見Vallone等，NucleicAcidsResearch,27(17):3589-3596(1999);Loakes等，J.Mol.Bio.，270:426-436(1997);Loakes等，NucleicAcidsResearch,22(20):4039-4043(1994);Oliver等，OrganicLetters,Vol.3(13):1977-1980(2001);Amosova等，NucleicAcidsResearch,25(10):1930-1934(1997);Loakes等，NucleicAcidsResearch,29(12):2437-2447(2001);Bergstrom等，J.Am.Chem.Soc.，117:1201-1209(1995);Franchetti等，Biorg.Med.Chem.Lett.11:67-69(2001);和Nair等，Nucelosides，Nucleotides&NucleicAcids，20(4-7):735-738(2001)。二氟代甲苯基是可以充當(dāng)通用堿基的非天然核酸堿基。二氟代甲苯基是天然核酸堿基胸腺嘧啶的等構(gòu)物。但與胸腺嘧啶不同，二氟代甲苯基沒有顯示對(duì)于任何天然堿基的可感知的選擇性?？梢猿洚?dāng)通用堿基和適用于本發(fā)明的其他芳香族化合物是4-氟_6-甲基苯并咪唑和4-甲基苯并咪唑。此外，相對(duì)疏水的異喹諾酮基衍生物3-甲基異喹諾酮基、5_甲基異喹諾酮基、和3-甲基-7-炔丙基異喹諾酮基是與只包含天然堿基的寡核苷酸序列相比僅引起輕微的寡核苷酸雙鏈體失穩(wěn)定的通用堿基。本發(fā)明考慮的18其他非天然核酸堿基包括7-氮雜吲哚基、6_甲基_7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基_咪唑并吡啶基、。71^01叩71^^町1、異喹諾酮基、7-炔丙基異喹諾酮基、炔丙基-7-氮雜吲哚基、2，4，5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4，6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基(phenanthracenyl)、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、和其結(jié)構(gòu)衍生物。關(guān)于更詳細(xì)的論述，包括二氟代甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑和上面提及的其他非天然堿基的合成方法，參見Schweitzer等，J.Org.Chem.，59:7238-7242(1994);Berger等，NucleicAcidsResearch,28(15):2911-2914(2000);Moran等，J.Am.Chem.Soc.，119:2056-2057(1997);Morales等，J.Am.Chem.Soc.，121:2323-2324(1999);Guckian等，J.Am.Chem.Soc.，118:8182-8183(1996);Morales等，J.Am.Chem.Soc.，122(6):1001-1007(2000);McMinn等，J.Am.Chem.Soc.，121:11585-11586(1999);Guckian等，J.Org.Chem.，63:9652-9656(1998);Moran等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94:10506-10511(1997);Das等，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.，1:197-206(2002);Shibata等，J.Chem.Soc.，PerkinTrans.，1:1605-1611(2001);Wu等，J.Am.Chem.Soc.，122(32):7621-7632(2000);0，Neill等，J.Org.Chem.，67:5869-5875(2002);Chaudhuri等，J.Am.Chem.Soc.，117:10434-10442(1995);和美國專利6，218，108。iRNA試劑至細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)不希望受任何理論束縛，綴合有膽固醇的iRNA試劑與某些脂蛋白的組分(例如膽固醇、膽固醇酯、磷脂)之間的化學(xué)相似性，可導(dǎo)致iRNA試劑在血液中與脂蛋白(例如LDL、HDL)結(jié)合、和/或?qū)е耰RNA試劑與具有膽固醇親和力的細(xì)胞組分(例如膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的組分)的相互作用。脂蛋白及其組分通過各種主動(dòng)和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被細(xì)胞攝取和加工，所述轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是例如但不限于與LDL-受體結(jié)合的LDL的內(nèi)吞、氧化的或其它方式修飾的LDL通過與清道夫受體A相互作用而發(fā)生的內(nèi)吞、肝中清道夫受體Bl介導(dǎo)的HDL膽固醇攝取、胞飲、或通過ABC(ATP-結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如ABC-A1、ABC-G1或ABC-G4進(jìn)行的膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，對(duì)于具有此類轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞，綴合有膽固醇的iRNA試劑可具有被促進(jìn)的細(xì)胞攝取。這樣，本發(fā)明提供了將iRNA試劑靶向表達(dá)某些細(xì)胞表面組分(例如受體)的細(xì)胞的證據(jù)和一般方法，即通過將這樣的組分的天然配體(例如膽固醇)綴合至iRNA試劑，或通過將與所述組分的天然配體(例如LDL、HDL)締合或結(jié)合的化學(xué)部分(例如膽固醇)綴合至iRNA試劑上，實(shí)現(xiàn)靶向。其他實(shí)施方案可在體內(nèi)在細(xì)胞中，例如從遞送入細(xì)胞的外源DNA模板，產(chǎn)生iRNA試劑。例如，可將DNA模板插入載體并且用作基因治療載體?？赏ㄟ^例如靜脈內(nèi)注射、局部施用(美國專利5，328，470)，或通過立體定位注射(參見，例如，ChEN等Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057，1994)，將基因治療載體遞送給受試者。基因治療載體的藥物制劑可在可接受的稀釋劑中包含基因治療載體，或可包含其中包埋了基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。DNA模板例如可包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，一個(gè)產(chǎn)生包含iRNA試劑的上鏈(topstrand)的轉(zhuǎn)錄物，一個(gè)產(chǎn)生包含iRNA試劑的下鏈(bottomstrand)的轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)模板被轉(zhuǎn)錄時(shí)，iRNA試劑產(chǎn)生并且被加工成可以介導(dǎo)基因沉默的siRNA試劑片段。細(xì)本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的dsRNA化合物的藥物組合物和制劑。取決于期望局部19治療還是全身性治療以及待治療的區(qū)域，可以以許多方式施用本發(fā)明的藥物組合物。施用可以是局部、經(jīng)肺，例如，通過粉劑或氣霧劑的吸入或吹入(包括利用霧化器)；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮、口服或胃腸外施用。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如，鞘內(nèi)(intrathecal)或腦室內(nèi)施用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑，霜?jiǎng)?，凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥物載體(水性的、粉末的或油基的)、增稠劑等可以是必需的或期望的。具包衣的避孕套、手套等也可以是有用的。優(yōu)選的局部制劑包括其中本發(fā)明的dsRNA與局部遞送劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑相混合的制劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油酰磷脂酰乙醇胺=D0PE、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿=DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰離子的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油二DMPG)和陽離子的(例如二油酰四甲基氨基丙基二DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺二DOTMA)，例如溴化(+/-)-^(3-氨基丙基)-&N-二甲基-2，3-雙(十二烷基氧)-l-丙銨=GAP-DLRIE)。本發(fā)明的dsRNA可被包封在脂質(zhì)體中或可與其，特別是與陽離子脂質(zhì)體，形成復(fù)合物。備選地，可將dsRNA復(fù)合至脂質(zhì)，特別地陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯類包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十碳烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、二月桂精、甘油l-單癸酸酯、l-十二烷基氮雜環(huán)庚烷_2-酮、酰基肉毒堿、?；憠A或(V1Q烷基酯(例如異丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受鹽。局部制劑詳細(xì)地描述于1999年5月20日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)09/315，298中，其以其全文通過引用合并入本文。用于口服施用的組合物和制劑包括粉劑或顆粒劑、微粒劑、納米顆粒、懸浮劑、或水或非水介質(zhì)中的溶液、膠囊劑、凝膠膠囊劑、囊劑、片劑或小片。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化齊U、分散助劑或粘合劑可能是期望的。優(yōu)選口服制劑是其中將本發(fā)明的dsRNA與一種或多種穿透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑結(jié)合施用的制劑。優(yōu)選表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯類或其鹽、膽汁酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽汁酸/鹽包括鵝去氧膽酸(CDCA)和熊去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、甘膽酸(glucholicacid)、甘氨膽酸(glycholicacid)、甘氨脫氧膽酸、?；悄懰帷⑴；侨パ跄懰?、牛磺-24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉和甘氨二氫梭鏈孢酸鈉。優(yōu)選的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸，亞油酸，亞麻酸，二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、二月桂精、甘油1-單癸酸酯，1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、?；憠A或甘油一酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受鹽(例如鈉鹽)。還優(yōu)選的是穿透促進(jìn)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。特別優(yōu)選的組合是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。另外的穿透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明的DsRNA可以以顆粒形式，包括噴霧干燥的微粒，口服遞送，或可以復(fù)合以形成微粒或納米顆粒。DsRNA復(fù)合劑(complexingagent)包括聚氨基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、polyoxethane、聚烷基氰丙烯酸酯；陽離子化明膠、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亞胺、普魯蘭多糖、纖維素和淀粉。特別優(yōu)選的復(fù)合劑包括殼聚糖、N-三甲基殼聚糖、多聚_卜賴氨酸、多組氨酸、多鳥氨酸、多精胺、魚精蛋白、聚乙烯吡啶、多硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如對(duì)-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯JEAE-己基丙烯酸酯JEAE-丙烯酰胺JEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制劑和它們的制備詳細(xì)地描述于美國申請(qǐng)系列號(hào)08/886，829(1997年7月1日提交)、系列號(hào)09/108，673(1998年7月1日提交)、系列號(hào)09/256，515(1999年2月23日提交)、系列號(hào)09/082，624(1998年5月21日提交)和系列號(hào)09/315，298(1999年5月20日提交)，其各自以其全文通過引用合并入本文。用于胃腸外、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用的組合物可包括無菌水溶液，該無菌水溶液還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他適當(dāng)?shù)奶砑觿├绲幌抻诖┩复龠M(jìn)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和包含脂質(zhì)體的制劑。此類組合物可從多種組分，包括但不限于預(yù)制的液體、自乳化的固體和自乳化的半固體，產(chǎn)生?？砂凑罩扑幑I(yè)中公知的常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明的藥物制劑，其可方便地以單位劑型提供。此類技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑結(jié)合的步驟。一般地，通過使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻且緊密地結(jié)合，然后，如果必要的話，使產(chǎn)品成形，以制備制劑。本發(fā)明的組合物可配制成多種可能劑型中的任一種，例如但不限于，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟膠囊、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可配制為在水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可進(jìn)一步包含增加懸浮液的粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液還可包含穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以以泡沫的形式配制和使用藥物組合物。藥物泡沫包括諸如但不限于乳劑、微乳劑、霜?jiǎng)?、凍膠劑(jellies)和脂質(zhì)體等制劑。雖然性質(zhì)上基本相似，但這些制劑在終產(chǎn)物的組分和粘稠度上是不同的。此類組合物和制劑的制備對(duì)于藥學(xué)和藥劑學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是公知的并且可用于配制本發(fā)明的組合物。翻可將本發(fā)明的組合物制備和配制為乳劑。乳劑通常是一種液體分散在另一種液體中形成直徑通常大于O.liim的小滴的非均質(zhì)系統(tǒng)(Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.199;Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.245;BlockinPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第2巻，p.335;Higuchi等，inRemington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1985，p.301)。乳劑通常是兩相系統(tǒng)，包含緊密混合的并且彼此分散的兩種不相混溶的液相。一般，乳劑可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)型。當(dāng)水相被細(xì)分成微滴并且以微滴的形式分散入大體積的油相中時(shí)，所得的乳劑稱為油包水(w/o)乳劑。備選地，當(dāng)油相被細(xì)分成微滴并且以微滴形式分散入大體積水相中時(shí)，所得的組合物稱為水包油(o/w)乳劑。乳劑可包含除了分散相以外的額外組分和活性藥物，所述活性藥物可以在水相、油相中或本身作為一個(gè)單獨(dú)的相以溶液形式存在。如果需要，乳劑中還可存在藥物賦形劑例如乳化劑、穩(wěn)劑。藥物乳劑還可以是多相乳劑，由兩個(gè)以上的相組成，例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況下。這樣的復(fù)合制劑通常提供了簡單的二元乳劑所沒有的某些優(yōu)勢(shì)。在o/w乳劑的單個(gè)油小滴中包封小水滴的多相乳劑構(gòu)成了w/o/w乳劑。同樣，在穩(wěn)定于連續(xù)油相中的小水球中包封油小滴的系統(tǒng)提供了o/V/o乳劑。乳劑以極小的熱力學(xué)穩(wěn)定性或無熱力學(xué)穩(wěn)定性為特征。通常，通過乳化劑的作用或制劑的粘度，乳劑的分散相或不連續(xù)相可以充分地分散至外部相或連續(xù)相中，并且維持該形式。乳劑的任一相都可以是半固體或固體，乳劑類型的軟膏基質(zhì)和霜的情況也是這樣。穩(wěn)定乳劑的其他方法需要使用可被摻入乳劑的任一相的乳化劑。乳化劑寬范地分類為4類合成的表面活性劑、天然乳化劑、吸收基質(zhì)和精細(xì)分散的固體(Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.199)。合成表面活性劑，也稱為表面活化劑，已廣泛用于乳劑配制并且已綜述于文獻(xiàn)中(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.285;Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾卩Banker(Eds.)，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，1988，第l巻，p.199)。表面活性劑通常是兩親性的并且包含親水和疏水部分。表面活性劑的親水性對(duì)疏水性的比值被稱為親水/親油平衡值(HLB)并且是制劑的制備中分類和選擇表面活性劑的有價(jià)值的工具。表面活性劑可基于親水基的性質(zhì)分為不同類型非離子型、陰離子型、陽離子型禾口兩性型(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.285)。用于乳劑制劑的天然乳化劑包括羊毛脂，蜂蠟，磷脂類，卵磷脂和阿拉伯膠。吸收基質(zhì)具有親水性質(zhì)，這樣它們可吸收水以形成w/Q乳液，但仍然保留它們的半固體稠度，例如無水羊毛脂和親水凡士林。細(xì)碎的固體也一直被用作良好的乳化劑(尤其是與表面活性劑組合的形式)和用在粘稠制劑中。此類固體包括極性無機(jī)固體，例如重金屬氫氧化物、非膨脹粘土例如膨潤土、硅鎂土、水輝石，高嶺土，蒙脫石、膠態(tài)硅酸鋁和膠態(tài)硅酸鎂鋁、色素，和非極性固體例如碳或三硬脂酸甘油酯。多種多樣的非乳化材料也可以包含于乳劑制劑中并且為乳劑的性質(zhì)作出貢獻(xiàn)。此類材料包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、濕潤劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.335;Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第l巻，p.199)。親水膠體或水膠體包括天然樹膠(gum)和合成聚合物，例如多糖(例如，阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、角叉菜膠、瓜爾豆膠、剌梧桐樹膠和黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)和合成的聚合物(例如，卡波姆，纖維素醚和羧基乙烯基聚合物)。這些在水中分散或膨脹，從而形成膠體溶液，該膠體溶液可以通過在分散相小滴周圍形成強(qiáng)界面膜和通過增加外相的粘度來穩(wěn)定乳劑。因?yàn)槿閯┩ǔ０S多可容易地支持微生物生長的成分，例如碳水化合物、蛋白質(zhì)、固醇和磷脂，因此這些制劑通常包含防腐劑。乳劑制劑中包含的常用防腐劑包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，季銨鹽，苯扎氯銨，對(duì)羥基苯甲酸的酯類和硼酸?？寡趸瘎┮餐ǔ＜尤肴閯┲苿┮苑乐怪苿┳冑|(zhì)。所使用的抗氧化劑可以是自由基清除劑例如生育酚，烷基沒食子酸酯，丁化羥基茴香醚，丁化羥基甲苯、或還原劑例如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉，和抗氧化劑協(xié)同劑例如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂。通過皮膚學(xué)的、口服的和胃腸外的途徑施用乳劑制劑和它們的制造方法已綜述于文獻(xiàn)中(Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第l巻，p.199)。用于口服遞送的乳劑制劑由于容易配制以及從吸收和生物利用度的角度來看非常有效而已得到廣泛使用(Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第l巻，p.245;Idson，inPharmaceuticalDosageForms，Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.199)。礦物油基輕瀉藥、油溶性維生素和高脂肪營養(yǎng)制劑在常作為o/w乳劑口服施用的材料之列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將dsRNA和核酸的組合物配制為微乳劑。微乳劑可定義為水、油和兩親化合物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)是單一光學(xué)各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定液體溶液(Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.245)。典型地，微乳劑是通過如下方式制備的系統(tǒng)首先將油分散在水性表面活性劑溶液中，然后加入充足量的第四組分，通常為中等鏈長度的醇，以形成透明系統(tǒng)。因此，微乳劑已被描述為不相混溶的兩種液體的熱力學(xué)穩(wěn)定的、各向同性的清澈分散體，其通過表面活性分子的界面膜來穩(wěn)定(Le皿g和Shah，in-ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems,Rosoff，M.，Ed.，1989，VCHPublishers,NewYork,pages185-215)。微乳劑通常通過3至5種組分(包括油、水、表面活性劑、共表面活性劑和電解質(zhì))的組合來制備。微乳劑是油包水(w/o)還是水包油(o/V)類型取決于所用的油和表面活性劑的性質(zhì)以及取決于表面活性劑分子的極性頭禾口:S尾的結(jié)構(gòu)禾口幾亍可包裝(Schott，inRemington'sPharmaceuticalSciENces，MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1985，p.271)。利用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法已得到了深入研究并且已為本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生了關(guān)于微乳劑配制的全面知識(shí)(Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms，Lieberman，Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.245;Block，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，RiegerandBanker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第l巻，p.335)。與常規(guī)乳劑相比較，微乳劑提供了在自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定小滴制劑中溶解水不溶性藥物的優(yōu)勢(shì)。用于制備微乳劑的表面活性劑包括但不限于，離子型表面活性劑、非離子型表面活性、Brij96，聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(M0310)、六甘油單油酸酯(P0310)、六甘油五油酸酯(P0500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(M0750)、十甘油sequioleate(S0750)、十甘油十油酸酯(DA0750)，單獨(dú)地或與共表面活性劑組合。共表面活性劑，通常為短鏈醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，可以通過穿透入表面活性劑膜并由此導(dǎo)致無序膜(因在表面活性劑分子之間產(chǎn)生的空隙空間)而用于增加界面流動(dòng)性。然而，可在不使用共表面活性劑的情況下制備微乳劑，不含醇的自乳化微乳劑系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。水相通?？梢允堑幌抻冢?、藥物、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇衍生物的水溶液。油相可包括但不限于材料例如Captex300、C即tex355、C即mulMCM、脂肪酸酯、中等鏈長(C8_C12)甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯、聚氧乙基化的脂肪酸甘油酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、飽和的聚乙二醇化的C8-C1Q甘油酯、植物油和硅油。從藥物溶解和增強(qiáng)藥物吸收的角度來看，微乳劑是特別有意義的。已經(jīng)提出基于脂質(zhì)的微乳(0/V和w/q)可以增強(qiáng)藥物(包括肽)的口服生物利用度(Constantinides等，PharmaceuticalResearch,1994，11，1385-1390;Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993,13,205)。微乳劑提供了如下優(yōu)勢(shì)提高藥物溶解、防止藥物被酶促水解、由于表面活性劑誘導(dǎo)的膜流動(dòng)性和通透性的改變而導(dǎo)致的藥物吸收的可能增強(qiáng)、易于制備、比固體劑型易于口服施用、提高的臨床潛力和減少的毒性(Constantinides等，PharmaceuticalResearch,1994，11，1385;Ho等，J.Pharm.Sci.，1996,85，138-143)。當(dāng)在環(huán)境溫度將微乳劑的組分聚在一起時(shí)，微乳劑通?？勺园l(fā)形成。在配制不耐熱的藥物、肽和dsRNA時(shí)，這可能是特別有利的。微乳劑在化妝品和藥物應(yīng)用中在活性組分的透皮遞送方面也一直是有效的。預(yù)期本發(fā)明的微乳劑組合物和制劑將有助于增加dsRNA和核酸從胃腸道的全身性吸收以及促進(jìn)dsRNA和核酸在胃腸道、陰道、口腔和其他施用區(qū)域內(nèi)的局部細(xì)胞攝取。本發(fā)明的微乳劑還可包含額外的組分和添加劑，例如脫水山梨醇單硬脂酸酯(Grill3)、Labraso1和穿透促進(jìn)劑，以改善制劑的性質(zhì)和增強(qiáng)本發(fā)明的dsRNA和核酸的吸收。用于本發(fā)明微乳劑的穿透促進(jìn)劑可分類為屬于以下5大類之一表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑(Lee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，p.92)。這些類型的每一種都已在上面進(jìn)行了論述。脂質(zhì)體除了微乳劑外，還存在許多有序表面活性劑結(jié)構(gòu)已被研究并且被用于藥物配制。這些結(jié)構(gòu)包括單層、微膠束、雙層和小泡(vesicle)。小泡例如脂質(zhì)體從藥物遞送的觀點(diǎn)來看由于它們的特異性和它們所賦予的作用持續(xù)時(shí)間而引起了人們的極大觀注。如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語"脂質(zhì)體"意指由以球形雙層或雙層排列的兩親性脂質(zhì)組成的小泡。脂質(zhì)體是具有從親脂性材料形成的膜和水性內(nèi)部的單層或多層小泡。水性部分包含待遞送的組合物。陽離子型脂質(zhì)體具有能夠與細(xì)胞壁融合的優(yōu)勢(shì)。非陽離子型脂質(zhì)體，雖然不能夠同樣有效地與細(xì)胞膜融合，但可以在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞攝取。為了跨過完整的哺乳動(dòng)物皮膚，脂質(zhì)小泡必須在適宜的透皮遞度的影響下穿過一系列細(xì)微小孔，每個(gè)小孔具有50nm以下的直徑。因此，可能期望使用高度可變形的并且能夠通過此類細(xì)孔的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的另外優(yōu)勢(shì)包括從天然磷脂獲得的脂質(zhì)體是生物相容性的和生物可降解的；脂質(zhì)體可摻入多種多樣的水溶性和脂溶性藥物；脂質(zhì)體可以保護(hù)封裝在它們內(nèi)部區(qū)室中的藥物免遭代話個(gè)禾口降角牟(Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，RiegerandBanker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，第1巻，p.245)。月旨質(zhì)體制劑的制備中，重要的考慮問題是脂質(zhì)的表面電荷、小泡的大小和脂質(zhì)體的水性體積。脂質(zhì)體可以用于將活性成分轉(zhuǎn)移和遞送至作用部位。因?yàn)橹|(zhì)體膜在結(jié)構(gòu)上與生物膜相似，因此當(dāng)將脂質(zhì)體用于組織時(shí)，脂質(zhì)體開始與細(xì)胞膜發(fā)生融合，并且隨著脂質(zhì)體和細(xì)胞融合的進(jìn)展，脂質(zhì)體內(nèi)容物將被排空到細(xì)胞內(nèi)，在此處活性劑可以發(fā)揮作用。脂質(zhì)體制劑作為許多藥物的遞送模式一直是廣泛研究的焦點(diǎn)。有越來越多的證據(jù)表明對(duì)于局部施用，脂質(zhì)體提供了數(shù)種優(yōu)于其他制劑的優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)包括減少與施用藥物的高全身性吸收相關(guān)的副作用、增加施用藥物在期望的靶位置的累積、以及能夠?qū)⒍喾N多樣的藥物(親水性和疏水性的)施用至皮膚內(nèi)。幾篇報(bào)導(dǎo)已詳述了脂質(zhì)體遞送藥劑，包括高分子量DNA，進(jìn)入皮膚的能力。已將包括鎮(zhèn)痛藥、抗體、激素和高分子量DNA在內(nèi)的化合物施用至皮膚。大部分應(yīng)用導(dǎo)致了對(duì)上表皮的靶向。脂質(zhì)體落在兩個(gè)大類中。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物。帶正電荷的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物可以結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面并且被內(nèi)化入內(nèi)體(endosome)。由于內(nèi)體的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，將它們的內(nèi)容物釋放入細(xì)胞質(zhì)(Wang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147,980-985)。pH-敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體將截留DNA而非與其復(fù)合。因?yàn)镈NA和脂質(zhì)體兩者具有相似的電荷，因而相互排斥而非形成復(fù)合物。然而，一些DNA可以被截留在這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部。pH-敏感性脂質(zhì)體已用于向培養(yǎng)的細(xì)胞單層遞送編碼胸苷激酶基因的DNA。在耙細(xì)胞中檢測(cè)到了該外源基因的表達(dá)(Zhou等，JournalofControlledRelease,1992，19,269-274)。脂質(zhì)體組合物的一個(gè)主要類型包括磷脂而非天然來源的磷脂酰膽堿。中性脂質(zhì)體組合物例如可從二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)形成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常從二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而陰離子促融脂質(zhì)體主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一類型的脂質(zhì)體組合物由磷脂酰膽堿(PC)，例如大豆PC和蛋PC形成。另一種類型由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇形成。幾個(gè)研究已評(píng)估了脂質(zhì)體藥物制劑向皮膚的局部遞送。將包含干擾素的脂質(zhì)體應(yīng)用到豚鼠皮膚導(dǎo)致了皮膚皰疹疼痛的減少，而通過其他方式(例如以溶液或以乳劑的方式)進(jìn)行的干擾素遞送是無效的(Weiner等，JournalofDrugTargeting,1992，2，405-410)。此外，另外的研究檢測(cè)了作為脂質(zhì)體制劑的一部分施用的干擾素相對(duì)于使用水性系統(tǒng)的干擾素施用的功效，得出結(jié)論——脂質(zhì)體制劑優(yōu)于水性施用(duPlessis等，AntiviralResearch，1992，18，259-265)。也已對(duì)非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)，特別是包含非離子型表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)，進(jìn)行了調(diào)查，以測(cè)定它們?cè)谒幬锏钠つw遞送中的效用。包含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和包含Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非離子型脂質(zhì)體制劑已經(jīng)用于遞送環(huán)孢菌素-A入小鼠皮膚的真皮。結(jié)果顯示此類非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)有效地促進(jìn)環(huán)孢菌素-A在皮膚的不同層中沉積(Hu等S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。脂質(zhì)體還包括"立體穩(wěn)定"脂質(zhì)體，該術(shù)語在本文中是指包含一種或多種專門的脂質(zhì)的脂質(zhì)體，該專門的脂質(zhì)當(dāng)摻入脂質(zhì)體時(shí)導(dǎo)致相對(duì)于缺乏此專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體增加的循環(huán)壽命。立體穩(wěn)定脂質(zhì)體的實(shí)例是這樣的脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體的形成小泡的脂質(zhì)部分中有一部分(A)包含一種或多種糖脂例如單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂Gml，或(B)用一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)部分，衍生化。然而不希望受任何理論束縛，在本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)25為，至少對(duì)于包含神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂質(zhì)的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體來說，立體穩(wěn)定脂質(zhì)體的增加的循環(huán)半衰期來源于減少的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞攝取(A11EN等，F(xiàn)EBSLetters,1987，223，42;Wu等，CancerResearch,1993，53，3765)。包含一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。P即ahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64)報(bào)導(dǎo)了單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯Gml、硫酸半乳糖腦苷脂和磷脂酰肌醇提高脂質(zhì)體的血液半衰期的能力。Gabizon等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988,85,6949)對(duì)這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了詳細(xì)說明。美國專利4，837，028和WO88/04924，兩者都屬于A11EN等，公開了包含(1)鞘磷脂和(2)神經(jīng)節(jié)苷脂Gml或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質(zhì)體。美國專利5，543，152(Webb等)公開了包含鞘磷脂的脂質(zhì)體。在WO97/13499(Lim等)中公開了包含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體。包含用一種或多種親水聚合物衍生的脂質(zhì)的脂質(zhì)體和制備其的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2778)描述了包含非離子型去垢劑2Q皿(其包含PEG部分)的脂質(zhì)體。Illum等(FEBSLett.，1984，167，79)注意到，用聚合甘醇親水包被聚苯乙烯顆粒導(dǎo)致顯著增加的血液半衰期。Sears(美國專利4，426，330和4，534，899)描述了通過連接聚亞烷基二醇(例如，PEG)的羧基而修飾的合成磷脂。Klibanov等(FEBSLett.，1990，268，235)描述的實(shí)驗(yàn)證明包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體具有顯著增加的血液循環(huán)半衰期。Blume等(BiochimicaetBiophysicaActa,1990，1029，91)將此觀察擴(kuò)展至其他PEG衍生的磷脂，例如，DSPE-PEG(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的組合形成)。在外表面上具有共價(jià)鍵合的PEG部分的脂質(zhì)體描述在Fisher的歐洲專利EP0445131Bl和WO90/04384中。包含l-20摩爾百分比的PEG衍生的PE的脂質(zhì)體組合物和其使用方法描述于Woodle等(美國專利5，013，556和5，356，633)以及Martin等(美國專利5，213，804和歐洲專利EP0496813Bl)中。包含許多其他脂質(zhì)-聚合物綴合物的脂質(zhì)體公開于WO91/05545和美國專利5，225，212(兩者都屬于Martin等)中和W094/20073(Zalipsky等)中。包含PEG-修飾的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)的脂質(zhì)體描述于W096/10391(Choi等)中。美國專利5，540，935(Miyazaki等)和美國專利5，556，948(Tagawa等)描述了可進(jìn)一步用官能性部分在其表面上進(jìn)行衍生的包含PEG的脂質(zhì)體。有限數(shù)目的包含核酸的脂質(zhì)體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。Thierry等的W096/40062公開了用于將高分子量核酸封裝在脂質(zhì)體中的方法。Tagawa等的美國專利5，264，221公開了蛋白質(zhì)_鍵合的脂質(zhì)體并且聲稱此類脂質(zhì)體的內(nèi)含物可包含dsRNA。Rahman等的美國專利5，665，710描述了將寡聚脫氧核苷酸封裝入脂質(zhì)體的某些方法。Love等的WO97/04787公開了包含靶向raf基因的dsRNA的脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)運(yùn)體(transfersome)是另一類脂質(zhì)體，是高度可變形的脂質(zhì)聚集體，是極吸引人的藥物遞送運(yùn)載工具候選物。轉(zhuǎn)運(yùn)體可描述為小液滴，其高度可變形以致于能夠容易地穿過比小滴更小的小孔。轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠適應(yīng)于使用它們的環(huán)境，例如它們可以自優(yōu)化(適應(yīng)于皮膚中的孔的形狀)、自修復(fù)，通常到達(dá)它們的靶點(diǎn)而無片段化，并且通?？梢宰匝b截。為了制備轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以向標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)體組合物中加入表面邊緣激活劑(edge-activator)，通常為表面活性劑。轉(zhuǎn)運(yùn)體已被用于血清白蛋白的皮膚遞送。血清白蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的遞送已經(jīng)被證實(shí)與皮下注射包含血清白蛋白的溶液一樣有效。表面活性劑廣泛用于制劑例如乳劑(包括微乳劑)和脂質(zhì)體。最常用的對(duì)許多不同類型的表面活性劑(天然的和合成的)的性質(zhì)進(jìn)行分類和評(píng)級(jí)的方法是使用親水/親油平衡值(HLB)。親水基團(tuán)(也稱為"頭部")的性質(zhì)提供了最有用的對(duì)用于制劑的不同表面活性劑分類的方法(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms，MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，1988，p.285)。如果表面活性劑分子未離子化，則其可被分類為非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑廣泛用于藥物和化妝品，并且可在寬廣的PH值范圍內(nèi)使用。通常，取決于它們的結(jié)構(gòu)，它們的HLB值范圍在2至大約18之間。非離子型表面活性劑包括非離子酯類，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化的酯。非離子型鏈烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物，也包括在該分類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子型表面活性劑類的最普及成員。當(dāng)表面活性劑分子溶解或分散在水中時(shí)，如果其帶有負(fù)電荷，那么該表面活性劑被分類為陰離子型。陰離子型表面活性劑包括羧酸鹽類，例如皂、酰基乳酸鹽、氨基酸的酰基酰胺類、硫酸的酯例如烷基硫酸鹽和乙氧基化烷基硫酸鹽，磺酸鹽例如烷基苯磺酸鹽、酰基羥乙基磺酸鹽、酰基?；撬猁}和磺基琥珀酸鹽、及磷酸鹽。陰離子表面活性劑類的最重要成員是烷基硫酸鹽和皂。當(dāng)表面活性劑分子溶解或分散在水中時(shí)，如果其攜帶正電荷，則該表面活性劑被分類為陽離子型。陽離子型表面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽是該類的最常用成員。如果表面活性劑分子具有攜帶正電荷或負(fù)電荷的能力，則該表面活性劑被分類為兩性型。兩性型表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、^烷基甜菜堿和磷脂類。已對(duì)表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑中以及在乳劑中的用途進(jìn)行了綜述(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker，Inc.，NewYork,N.Y.，1988，p.285)。穿透促進(jìn)劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用各種穿透促進(jìn)劑來實(shí)現(xiàn)核酸，特別是dsRNA，至動(dòng)物皮膚的有效遞送。大多數(shù)藥物以離子化和非離子化兩種形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或親脂性藥物能容易地穿過細(xì)胞膜。已發(fā)現(xiàn)，如果用穿透促進(jìn)劑處理待跨越的細(xì)胞膜，則甚至是非親脂藥物也可穿過膜。除了幫助非親脂藥物擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜外，穿透促進(jìn)劑還增強(qiáng)親脂藥物的滲透性。穿透促進(jìn)劑可分類為屬于5個(gè)大類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑禾口非整合非_表面活性劑(Lee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，p.92)。下面將更詳細(xì)地描述上面提及的每一類穿透促進(jìn)劑。表面活性劑在本發(fā)明中，表面活性劑(或"surface-activeagents")是當(dāng)溶解在水溶液中時(shí)可以減少溶液的表面張力或水溶液與另一種液體之間的界面張力，從而增強(qiáng)dsRNA通過粘膜的吸收的化學(xué)實(shí)體。除了膽汁鹽和脂肪酸外，此類穿透促進(jìn)劑包括例如月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚)(Lee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，p.92);禾口全氣化合物乳劑，例如FC-43(TakaHSAhi等，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252).。脂肪酸用作穿透促進(jìn)劑的各種脂肪酸和它們的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、癸酸(正_十碳烷酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油酰基-rac-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷_2-酮、?；舛緣A、?；憠A、其Q-Q。烷基醚(例如，甲基、異丙基和叔_丁基)，以及其甘油一酯和二酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等)(Lee等，CriticalReviewsinTher即euticDrugCarryierSystems,1991，p.92;Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990，7，1-33;ElHariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654).膽汁鹽膽汁的生理作用包括促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapter38in:Goodman&Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，Hardman等Eds.，McGraw-Hill,NewYork,1996，pp.934-935)。各種天然的膽汁鹽和它們的合成衍生物可以用作穿透促進(jìn)劑。因此術(shù)語"膽汁鹽"包括任何天然膽汁組分以及任何其合成衍生物。本發(fā)明的膽汁鹽包括，例如，膽酸(或其藥學(xué)上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸納)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、甘氨膽酸(甘氨膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、甘氨脫氧膽酸(甘氨脫氧膽酸鈉)、?；悄懰??；悄懰徕c)、?；敲撗跄懰??；敲撗跄懰徕c)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-梭鏈孢酸鈉(STDHF)、甘氨二氫梭鏈孢酸鈉和聚氧乙烯_9_月桂基醚(P0E)(Xee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，92頁；Swinyard，Chapter39In:Remington'sPharmaceuticalSciences,第18片反，Ge皿aro，ed.，MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1990，782-783頁；Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990，7，1_33;Yam咖oto等，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25;Yamashita等，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583).螯合劑螯合劑，在本發(fā)明中，可定義為通過與金屬離子形成絡(luò)合物而從溶液中除去金屬離子的化合物，結(jié)果增強(qiáng)了dsRNA通過粘膜的吸收。在本發(fā)明中作為穿透促進(jìn)劑應(yīng)用時(shí)，螯合劑還具有額外的優(yōu)勢(shì)還可以充當(dāng)DNA酶抑制劑，因?yàn)榇蠖鄶?shù)已經(jīng)表征的DNA核酸酶需要二價(jià)金屬離子用于催化并因此可以被螯合劑抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993,618,315-339).本發(fā)明的螯合劑包括但不限于，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉，5_甲氧基水楊酸鹽和高香蘭酸鹽(homovanilate))、膠原蛋白的N-?；苌铩3-二酮(烯胺)類的月桂基醚-9(laureth-9)和N-氨基?；苌?Xee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，page92;Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990，7，1_33;B皿r等，J.ControlRel.，1990，14,43-51)。非螯合非表面活性劑如本文所使用的，非螯合非表面活性劑穿透促進(jìn)化合物可定義為沒有顯示顯著的作為螯合劑或作為表面活性劑的活性，但卻增強(qiáng)dsRNA通過消化道粘膜的吸收的化合物(Muranishi，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990，7，1_33)。該類型的穿透促進(jìn)劑包括例如，不飽和環(huán)脲類，1_烷基_和1_鏈烯基氮雜環(huán)-烷酮衍生物(Lee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，page92);和非類固醇抗炎劑例如雙氯酚酸鈉，噴哚美辛和二苯丁唑酮(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。還可將增強(qiáng)dsRNA在細(xì)胞水平上的吸收的試劑加入本發(fā)明的藥物和其他組合物。例如，也已知陽離子脂質(zhì)，例如lipofectin(J皿ichi等，美國專利5，705，188)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子例如多聚賴氨酸(Lollo等，PCT申請(qǐng)WO97/30731)和其他肽可以增強(qiáng)dsRNA的細(xì)胞攝取?？墒褂闷渌噭┰鰪?qiáng)施用的核酸的穿透，包括甘醇類，例如乙二醇和丙二醇，吡咯類例如2-吡咯、氮卓酮類、和萜類例如苧烯和薄荷酮。載體(carrier)本發(fā)明的某些組合物還將載體化合物摻入在制劑中。如本文所使用的，〃載體化合物〃或〃載體〃可以指如下核酸或其類似物，所述核酸或類似物是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但可以被如下體內(nèi)過程識(shí)別為核酸，所述體內(nèi)過程通過例如降解生物活性核酸或促進(jìn)其從循環(huán)中清除，而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物(通常后者過量)的共施用可導(dǎo)致肝、腎或其他循環(huán)外貯庫中回收的核酸的量顯著減少，推測(cè)原因是載體化合物與核酸之間對(duì)共同受體的競(jìng)爭(zhēng)。例如，當(dāng)與聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4'異硫氰基-二苯乙烯-2，2'-二磺酸共施用時(shí)，可降低肝組織中部分硫代磷酸酯的dsRNA的回收(Miyao等，AntisENseRes.Dev.，1995，5，115-121;Takakura等，AntisENse&Nucl.AcidDrugDev.，1996，6，177-183。賦形劑與載體化合物相反，"藥物載體"或"賦形劑"是藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或任何其他藥理學(xué)上惰性的媒介物，其用于將一種或多種核酸遞送至動(dòng)物。賦形劑可以是液體或固體，并且可按照想要的計(jì)劃施用方式進(jìn)行選擇，以在與核酸和給定的藥物組合物的其他成分組合時(shí)，提供期望的體積、稠度等。典型的藥物載體包括但不限于，粘合劑(例如，預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石粉、硅藻土、二氧化硅膠體、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如，淀粉、淀粉羥乙酸鈉等)；和濕潤劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。還可將適于非胃腸外施用的、不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)賦形劑用于配制本發(fā)明的組合物。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體包括但不限于，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟油、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。用于核酸的局部施用的制劑可包括在常用溶劑例如醇中的無菌和非無菌水溶液、非水性溶液，或在液態(tài)或固態(tài)油基質(zhì)中的核酸溶液。溶液還可包含緩沖劑、稀釋劑和其他適當(dāng)?shù)奶砑觿??？墒褂眠m于非胃腸外施用的、不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)賦形劑。適宜的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟油、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。用于呼吸道遞送的藥物組合物本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了iRNA試劑至呼吸道(特別地以治療囊性纖維化)的遞送。呼吸道包括上氣道(包括口咽和喉)，然后是下氣道(其包括氣管，接著是進(jìn)入支氣管和細(xì)支氣管的分叉)。上氣道和下氣道稱為傳導(dǎo)性氣道。終末細(xì)支氣管之后分成呼吸性細(xì)支氣管，其然后通向最終的呼吸區(qū)、肺泡或深肺部。傳導(dǎo)性氣道的上皮是吸入的用于遞送iRNA試劑例如a-ENaCiRNA試劑的治療性氣霧劑的主要耙。肺遞送組合物可通過患者吸入分散體來遞送，這樣分散體中的組合物，優(yōu)選iRNA試劑，可到達(dá)肺，在肺中其可以例如通過肺泡區(qū)域而被容易地直接吸收進(jìn)血液循環(huán)。肺遞送對(duì)于治療肺部疾病的全身性遞送和局部遞送都是有效的。肺遞送可通過下列不同方法來實(shí)現(xiàn)，包括使用霧化的、氣霧化的、膠束的和基于干粉的制劑；通過吸入的施用可以是口服和/或經(jīng)鼻施用?？衫靡后w霧化器、基于氣霧劑的吸入器和干粉分散裝置來實(shí)現(xiàn)遞送。計(jì)量給藥裝置是優(yōu)選的。使用噴霧器或吸入器的益處之一是污染的可能性減少至最低限度，因?yàn)檠b置是自含式的。干粉分散裝置可以例如遞送可容易地配制為干粉的藥物。iRNA組合物可以自身以凍干的或噴霧干燥的粉末形式穩(wěn)定貯存，或與適當(dāng)?shù)姆勰┹d體組合而穩(wěn)定貯存。用于吸入的組合物的遞送可由給藥定時(shí)元件來介導(dǎo)，該給藥定時(shí)元件可包括定時(shí)器、劑量計(jì)數(shù)器、時(shí)間測(cè)量裝置或時(shí)間指示器，當(dāng)整合在裝置中時(shí)其使得能夠在氣霧劑藥物的施用過程中進(jìn)行劑量跟蹤、順應(yīng)性監(jiān)控和/或?qū)颊哌M(jìn)行給藥觸發(fā)。用于氣霧劑遞送的藥用裝置的實(shí)例包括計(jì)量給藥吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和空氣噴射霧化器?？扇菀椎卣{(diào)整以適應(yīng)于主題iRNA試劑的遞送的示例性吸入遞送系統(tǒng)描述于，例如，美國專利5，756，353;5,858，784;和PCT申請(qǐng)W098/31346;W098/10796;WOOO/27359;W001/54664;W002/060412。可用于遞送iRNA試劑的其他氣霧劑制劑描述于美國專利6，294，153;6，344，194;6，071，497，和PCT申請(qǐng)W002/066078;W002/053190;W001/60420;W000/66206中。此外，用于遞送iRNA試劑的方法可從用于通過吸入遞送其他寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸)的方法，例如Templin等，AntisENseNucleicAcidDrugDev，2000，10:359_68;Sandr雄gra等，ExpertOpinBiolTher，2001，1:979_83;Sandrasagra等，AntisENseNucleicAcidDrugDev，2002，12:177-81中描述的方法改造而來。本發(fā)明試劑的遞送還可包括施用所謂的"前體藥物"，即治療性物質(zhì)的制劑或化學(xué)修飾——其需要受試生物體天生的系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行一些形式的加工或轉(zhuǎn)運(yùn)，以釋放，優(yōu)選地在期望起作用的部位，釋放治療性物質(zhì)；此后一種實(shí)施方案可以與呼吸道遞送結(jié)合使用，而且也可與本發(fā)明的其他實(shí)施方案一起使用。例如，人肺可在從數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)清除或快速降解可水解斷裂的沉積氣霧劑。在上氣道中，纖毛上皮貢獻(xiàn)了"粘液纖毛自動(dòng)扶梯(mucociliaryexcalator)"，通過該粘液纖毛自動(dòng)扶梯可將顆粒從氣道清掃向口部。Pavia，D.，〃UmgMucociliaryClearance,〃inAerosolsandtheUmg:ClinicalandExperimENtalAspects,Clarke,S.W.禾口Pavia，D.，Eds.，Butterworths，London,1984。在深肺中，肺泡巨噬細(xì)胞能夠在顆粒沉積后不久將其吞噬。Warheit等MicroscopyRes.Tech.，26:412-422(1993);禾口Brain，J.D.，〃PhysiologyandPathophysiologyofPulmonaryMacrophages，〃inTheReticuloENdothelialSystem,S.M.Reichard禾口J.Filkins，Eds.，PlENum，New.York.，pp.315—327，1985。在優(yōu)選實(shí)施方案中，特別是在期望全身性給藥iRNA試劑的情況下，可以將氣霧化的iRNA試劑配制為微粒。具有0.5至10微米直徑的微?？赏高^肺，通過大多數(shù)天然屏障。30少于10微米的直徑是繞開咽喉所必需的；0.5微米或更大的直徑是避免被呼出所必需的。其他成分本發(fā)明的組合物可另外地以相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)建立的使用水平包含常規(guī)見于藥物組合物中的其他輔助組分。因此，例如，組合物可包含另外的相容性藥學(xué)活性物質(zhì)，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉藥或抗炎劑，或可包含另外的可以用于物理上配制各種劑型的本發(fā)明組合物的物質(zhì)，例如著色齊U、調(diào)味齊U、防腐齊U、抗氧化齊iJ、遮光齊iJ、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，此類物質(zhì)，當(dāng)加入時(shí)，不應(yīng)當(dāng)過度干擾本發(fā)明組合物的成分的生物活性。可對(duì)制劑進(jìn)行滅菌，必要時(shí)，可將其與不和制劑中的核酸發(fā)生有害相互作用的助劑，例如，潤滑劑，防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、香料和/或芳香物質(zhì)等，混合。水性懸浮液可包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液還可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了包含(a)—種或多種dsRNA試劑和(b)—種或多種其他通過非RNA干擾機(jī)制起作用的治療劑的藥物聯(lián)合和組合物。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的iRNA與抗炎劑、支氣管擴(kuò)張劑，抗組胺劑、鎮(zhèn)咳藥、抗生素或DNA酶藥物物質(zhì)的聯(lián)合，所述上皮鈉通道阻斷劑和所述藥物物質(zhì)存在于相同的或不同的藥物組合物中。適當(dāng)?shù)目股匕ù蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素，例如，妥布拉霉素(T0BI)。適當(dāng)?shù)腄NA酶藥物物質(zhì)包括a鏈道酶(Pulmozyme)，一種高度純化的重組人脫氧核糖核酸酶I(rhDNA酶)溶液，其選擇性切割DNA。a鏈道酶用于治療囊性纖維化。上皮鈉通道阻斷劑與抗炎藥的其他有用組合是與趨化因子受體的拮抗劑的組合，所述趨化因子受體的拮抗劑是例如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9和CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、特別地CCR-5的拮抗劑，例如Schering-Plough拮抗劑SC-351125,SCH-55700和SCH-D;Takeda拮抗劑，例如氯化N-[[4-[[[6，7-二氫-2-(4-甲基-苯基)-5H-苯并-環(huán)庚烯-8-基]羰基]氨基]苯基]_甲基]四氫-N，N-二甲基-2H-吡喃-4-銨(TAK-770);和USP6，166，037(特別地權(quán)利要求18和19)、W000/66558(特別地權(quán)利要求8)、W000/66559(特別地權(quán)利要求9)、W004/018425和W004/026873中描述的CCR-5拮抗劑。適當(dāng)?shù)目寡姿幇惞檀?，特別地糖皮質(zhì)類固醇，例如布地萘德、倍氯美松雙丙酸酯、丙酸氟地松、環(huán)索奈德或糠酸莫米他松、或W002/88167、W002/12266、W002/100879、W002/00679(特別地實(shí)施例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99和101中的類固醇)，W003/35668、W003/48181、W003/62259、W003/64445、W003/72592、W004/39827和W004/66920中所述的類固醇；非類固醇糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑，例如DE10261874、WO00/00531、WO02/10143、WO03/82280、WO03/82787、WO03/86294、WO03/104195、W003/101932、WO04/05229、WO04/18429、WO04/19935和WO04/26248中所述的那些；LTD4拮抗劑，例如孟魯司特(montelukast)和扎魯司特(zafirlukast);PDE4抑制劑，例如西洛司特(cilomilast，ArifloGlaxoSmithKline)、羅氟司特(roflumilast，BykGuldEN)，V_l1294A(Napp)、BAY19-8004(Bayer)、SCH-351591(Schering-Plough)、阿羅茶堿(arofylline，AlmirallProdesfarma)、PD189659/PD168787(Parke-Davis)、AWD-12-281(AstaMcdica)、CDC—801(CelgENe)、SelCID(TM)CC-10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe)、KW-4490(KyowaHakkoKogyo)、和WO92/19594、WO93/19749、WO93/19750、WO93/19751、WO98/18796、WO99/16766、WO01/13953、WO03/104204、W003/104205、WO03/39544、WO04/000814、WO04/000839、WO04/005258、WO04/018450、WO04/018451、WO04/018457、WO04/018465、W004/018431、WO04/018449、WO04/018450、WO04/018451、WO04/018457、WO04/018465、WO04/019944、WO04/019945、WO04/045607和W004/037805中公開的那些；腺苷A2B受體拮抗劑，例如WO02/4229中描述的；和P-2腎上腺素受體激動(dòng)，例如沙丁胺醇(柳丁氨醇(salbutamol))、異丙喘寧、叔丁喘寧、沙美特羅、非諾特羅、異丙喹喘寧，特別地、福莫特羅、卡莫特羅和其藥學(xué)上可接受的鹽，和WO0075114(該資料通過引用合并入本文)的式(I)化合物(游離或鹽或溶劑化物形式)，優(yōu)選其實(shí)施例的化合物，特別地indacaterol和其藥學(xué)上可接受的鹽，以及WO04/16601的式(I)化合物(游離或鹽或溶劑化物形式)，還有EP1440966，JP05025045、WO93/18007、WO99/64035、USP2002/0055651、WO01/42193、WO01/83462、WO02/66422、WO02/70490、WO02/76933、WO03/24439、WO03/42160、WO03/42164、WO03/72539、WO03/91204、WO03/99764、WO04/16578、WO04/22547、WO04/32921、WO04/33412、WO04/37768、WO04/37773、WO04/37807、WO04/39762、WO04/39766、WO04/45618、WO04/46083、WO04/80964、WO04/108765和WO04/108676的化合物。適當(dāng)?shù)闹夤軘U(kuò)張藥物包括抗膽堿能或抗毒蕈堿藥物，特別地異丙托溴銨、氧托溴銨、噻托銨(tiotropi咖)鹽和CHF4226(Chiesi)以及甘羅溴銨，以及EP424021、USP3，714，357、USP5，171，744、WO01/04118、W002/00652、WO02/51841、WO02/53564、WO03/00840、WO03/33495、WO03/53966、WO03/87094、WO04/018422和WO04/05285中描述的藥物。適當(dāng)?shù)碾p重抗炎和支氣管擴(kuò)張藥物包括雙重13-2腎上腺素受體激動(dòng)劑/毒蕈堿拮抗劑，例如USP2004/0167167、WO04/74246和WO04/74812中描述的。適當(dāng)?shù)目菇M胺藥包括鹽酸西替立嗪(cetirizinehydrochloride)、對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)、富馬酸氯苯節(jié)咯(clemastinefumarate)、普魯本近(promethazine)、氯雷他定(loratidine)、脫羧氯雷他定(desloratidine)、苯海拉明(diphenhydramine)和鹽酸非索那定(fexofenadinehydrochloride)、阿伐斯丁(activastine)、阿司咪唑(astemizole)、氮卓其jf汀(zaelastine)、依巴其jf汀(ebastine)、依匹那丁(印inastine)、咪唑斯汀(mizolastine)和特非那丁(tefenadine)，以及JP2004107299、WO03/099807和WO04/026841中公開的那些。本發(fā)明的試劑與抗炎藥物的其他有用組合是與趨化因子受體的拮抗劑的組合，所述趨化因子的拮抗劑是例如CCR-l、CCR-2、CCR-3、CCR_4、CCR_5、CCR_6、CCR_7、CCR-8、CCR-9和CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、特別地CCR-5的拮抗劑、例如Schering-Plough拮抗劑SC-351125,SCH-55700和SCH-D;Takeda拮抗劑，例如氯化N-[[4-[[[6，7-二氫-2-(4-甲基-苯基)-5H-苯并-環(huán)庚烯-8-基]羰基]氨基]苯基]_甲基]四氫-N，N-二甲基-2H-卩比喃-4-銨(TAK-770);禾口USP6，166，037(特別地權(quán)利要求18和19)、W000/66558(特別地權(quán)利要求8)、W000/66559(特別地權(quán)利要求9)、W004/018425和W004/026873中描述的CCR-5拮抗劑。其他有用的額外治療劑還可選自細(xì)胞因子結(jié)合分子，特別地其他細(xì)胞因子的抗體，特別地組合抗-IL4抗體(例如如PCT/EP2005/00836中所描述的)、抗-IgE抗體例如Xolair、抗_IL31抗體、抗-IL31R抗體、抗-TSLP抗體、抗-TSLP受體抗體、抗-endoglin抗體、抗-ILlb抗體或抗-IL13抗體，如W005/00769中所描述的。組合的兩種或更多種化合物可以于單個(gè)制劑中一起使用，分開使用，相伴使用或相繼使用。可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測(cè)量此類化合物的毒性和治療功效，例如以測(cè)定LD50(使50%的群體致死的劑量)和ED50(在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，其可表示為LD50/ED50比。展示高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的?？梢允褂脧募?xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)，配制一系列劑量用于人。本發(fā)明組合物的劑量通常在一個(gè)具有極小毒性或無毒性的包括ED50在內(nèi)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于所用劑型和所用的施用途徑，劑量可在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何化合物，均可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)初步估計(jì)治療有效劑量。可在動(dòng)物模型中配制劑量以實(shí)現(xiàn)化合物或適當(dāng)時(shí)，耙序列的多肽產(chǎn)物(例如，獲得降低的多肽濃度)的如下循環(huán)血漿濃度范圍，該濃度范圍包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的IC50(即，獲得癥狀的半最大抑制的受試化合物濃度)。該信息可用于更精確地確定在人中有用的劑量。可以例如利用高效液相色譜測(cè)量血漿中的水平。除了如上所述將本發(fā)明的dsRNA單個(gè)地或多重地施用以外，還可將本發(fā)明的dsRNA與在ENaC相關(guān)病癥的治療中有效的其他已知活性劑組合施用。無論如何，施藥醫(yī)生可基于使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)功效測(cè)量法所觀察到的結(jié)果，調(diào)整dsRNA施用的量和時(shí)間。辦射細(xì)涕送條可以通過多種途徑，將包含iRNA試劑，例如耙向a-ENaC的iRNA試劑，的組合物遞送給受試者，以實(shí)現(xiàn)向作用部位的局部遞送或?qū)崿F(xiàn)向受試者的全身遞送。示例性途徑包括對(duì)治療部位，例如肺、鼻道的直接局部施用、以及靜脈內(nèi)、鼻、口和眼遞送。施用本發(fā)明的iRNA試劑的優(yōu)選方法是以液體、氣霧劑或霧化溶液的形式對(duì)肺和鼻道直接施用。用于吸入或胃腸性外施用的制劑在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。這樣的制劑可包括無菌水溶液，所述無菌水溶液還可包含緩沖劑、稀釋劑和其他適當(dāng)?shù)奶砑觿?。為了靜脈內(nèi)使用，應(yīng)當(dāng)控制溶質(zhì)的總濃度以使制劑等滲。優(yōu)選通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)受試者的肺或鼻道施用本文所公開的活性化合物。可通過施用能被受試者吸入的包含活性化合物(一種或多種)的可吸入顆粒的混懸型氣霧劑來施用活性化合物?？梢砸远喾N形式霧化活性化合物，例如但不限于干粉吸入劑、計(jì)量吸入劑或液體/液體懸浮劑?？晌腩w?？梢允且后w或固體。顆粒可任選地包含其他治療成分，例如氨氯吡嗪脒(amiloride)、benzamil或phenamil，其中以有效地抑制從氣道粘液分泌物重吸收水的量包含該選擇的化合物，如美國專利4，501，729中所描述的。可任選地將顆粒藥物組合物與載體組合以幫助分散或轉(zhuǎn)運(yùn)?？梢砸匀魏芜m當(dāng)?shù)谋壤?例如，按重量計(jì)算l:1)將適當(dāng)?shù)妮d體例如糖(即，乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇)與活性化合物混合。由用于實(shí)施本發(fā)明的活性化合物組成的顆粒應(yīng)當(dāng)包括可吸入大小的顆粒，S卩，顆粒大小足夠小以致于可以在吸入時(shí)通過口或鼻和喉并且進(jìn)入支氣管和肺泡。一般地，范圍在大約1至10微米大小(更特別地，小于大約5微米的尺寸)的顆粒是可吸入的。包含在氣霧劑中的具有不可吸入性大小的顆粒傾向于沉積在咽喉并被吞咽，優(yōu)選使氣霧劑中的不可吸入性顆粒的量減少至最少。為了經(jīng)鼻施用，優(yōu)選使用范圍在10-500um內(nèi)的顆粒大小以確保停留在鼻腔中。用于產(chǎn)生氣霧劑的活性化合物的脂質(zhì)藥物組合物可通過將活性化合物與適當(dāng)?shù)拿浇槲锢鐭o菌無熱源水組合來制備。用于本發(fā)明的高滲鹽水溶液優(yōu)選是無菌無熱原溶液，包含1至15%(按重量計(jì)算)的生理可接受鹽，更優(yōu)選按重量計(jì)算3至7%的生理可接受鹽。包含活性化合物的液態(tài)顆粒的氣霧劑可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉懋a(chǎn)生，例如使用壓力驅(qū)動(dòng)的噴射霧化器或超聲霧化器。參見，例如，美國專利4，501，729。霧化器是可商購獲得的裝置，其通過使壓縮氣體(通常是空氣或氧氣)加速通過狹窄的文丘里管或通過超聲攪拌，將活性成分的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)化成治療性氣霧。在霧化器中使用的適宜制劑可以由在液體載體中的活性成分組成，活性成分可以占制劑的高達(dá)40^w/w，但優(yōu)選低于20^w/w。載體通常是水(最優(yōu)選無菌無熱原水)或稀釋的水性醇溶液，優(yōu)選使其與體液等滲，但可通過加入例如氯化鈉使其對(duì)體液是高滲的。任選的添加劑包括防腐劑例如羥苯甲酸甲酯(如果制劑未經(jīng)滅菌的話)、抗氧化劑、調(diào)味劑、揮發(fā)油、緩沖劑和表面活性劑。包含活性化合物的固體顆粒的氣霧劑同樣可用任何固體顆粒治療性氣霧發(fā)生器來產(chǎn)生。用于將固體顆粒治療劑施用給受試者的氣霧發(fā)生器產(chǎn)生可吸入的顆粒，并以適于人施用的速率產(chǎn)生包含預(yù)定計(jì)量的治療劑的一定體積氣霧。固體顆粒氣霧發(fā)生器的一個(gè)示例性類型是吹入器。通過吸入法施用的適宜制劑包含細(xì)碎的粉末，該粉末可利用吹入器遞送或以鼻吸的方式吸入鼻腔。在吹入器中，粉末(例如，有效實(shí)施本文所述治療的其計(jì)量劑量)被裝在通常由明膠或塑料制造的膠囊或藥筒中，所述膠囊或藥筒可在原位被剌穿或打開，粉末通過在吸入時(shí)或利用手動(dòng)泵抽過裝置的空氣來遞送。用于吹入器的粉末可以只由活性成分組成或由包含活性成分、適當(dāng)?shù)姆勰┫♂寗├缛樘恰⒑腿芜x的表面活性劑的粉末混合物組成。活性成分通常占制劑的0.1至100w/w。第二類型的示例性氣霧發(fā)生器包括計(jì)量給藥吸入器。計(jì)量給藥吸入器是加壓的氣霧分配器，通常在液化的拋射劑中包含活性成分的懸浮液或溶液制劑。在使用過程中，此類裝置將制劑射過經(jīng)改造適合遞送計(jì)量體積(通常10至200ul)的閥門，從而產(chǎn)生包含活性成分的細(xì)顆粒噴霧。適當(dāng)?shù)膾伾鋭┌承┞确蓟衔锢?，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和其混合物。制劑可額外地包含一種或多種共溶劑，例如乙醇、表面活性劑例如油酸或脫水山梨糖醇三油酸酯、抗氧化劑和適當(dāng)?shù)恼{(diào)味劑。可將iRNA試劑摻入適于施用的藥物組合物中。例如，組合物可包含一種或多種iRNA試劑和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意在包括可與藥物施用相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。此類用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。除非與活性化合物不相容，否則任何常規(guī)介質(zhì)或試劑均可以考慮用于本發(fā)明組合物中。也可將增補(bǔ)性活性化合物摻入組合物。34可由受試者或由另一個(gè)人例如看護(hù)者提供施用?？醋o(hù)者可以是參與照料該人的任何實(shí)體例如醫(yī)院、收容所、醫(yī)生辦公室、門診部；健康護(hù)理工作者，例如醫(yī)生、護(hù)士或其他執(zhí)業(yè)者；或配偶或監(jiān)護(hù)人例如父母。可以以測(cè)量好的劑量提供藥物，或在遞送計(jì)量劑量的分配器中提供藥物。術(shù)語"治療有效量"是指存在于組合物中的、為在待治療的受試者中提供期望的藥物水平以產(chǎn)生預(yù)期的生理反應(yīng)所需的量。術(shù)語"生理有效劑量"是指遞送給受試者以產(chǎn)生期望的緩解性或治愈性效果的量。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意指載體可被吸入肺而對(duì)肺無顯著有害的毒理作用。術(shù)語"共施用"是指對(duì)受試者施用兩種或更多種活性劑，特別地兩種或更多種iRNA試劑。這些活性劑可包含在單個(gè)藥物組合物中并且同時(shí)施用，或可包含在分開的制劑中，并且相繼對(duì)受試者施用。只要兩種活性劑可同時(shí)在受試者中被檢測(cè)到，那么就說這兩種活性劑是共施用的。用作載體的藥物賦形劑的類型包括穩(wěn)定劑例如人血清白蛋白(HSA)、填充劑例如碳水化合物、氨基酸和多肽；PH調(diào)節(jié)劑或緩沖劑；鹽例如氯化鈉；等。這些載體可以以晶體或無定形的形式存在或可以是兩者的混合物。特別有價(jià)值的填充劑包括相容的碳水化合物、多肽、氨基酸或其組合。適宜的碳水化合物包括單糖例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；環(huán)糊精，例如2-羥丙基-P-環(huán)糊精；和多糖，例如棉子糖、麥芽糖糊精、葡聚糖等；糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇等。優(yōu)選類型的碳水化合物包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麥芽糖糊精和甘露糖醇。適當(dāng)?shù)亩嚯陌ò⑺拱吞?。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，甘氨酸是?yōu)選的。適宜的pH調(diào)節(jié)劑或緩沖劑包括從有機(jī)酸和堿制備的有機(jī)鹽，例如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等；檸檬酸鈉是優(yōu)選的。齊隨可以以低于大約75mg/kg體重，或低于大約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg體重，以及低于200翻1的iRNA試劑(例如，大約4.4x1016拷貝)/kg體重，或低于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015翻1的iRNA試劑/kg體重的單位劑量，施用iRNA試劑。例如，可通過注射(例如，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)、鞘內(nèi)或直接至器官內(nèi))、吸入給藥或局部應(yīng)用來施用單位劑量。劑量可以是有效地治療或預(yù)防疾病或病癥的量。其可以預(yù)防性提供或作為治療方案的主體或一部分提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，單位劑量施用頻率低于一天一次，例如，低于每2、4、8或30天一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不按頻率(例如，不定期)施用單位劑量。例如，單位劑量可以一次施用。因?yàn)閕RNA試劑介導(dǎo)的沉默可在施用iRNA試劑組合物后持續(xù)數(shù)天，因此在許多情況下，可以以低于每天一次的頻率施用組合物，或者對(duì)于一些情況，對(duì)于整個(gè)治療方案，只施用一次。在一個(gè)實(shí)施方案中，給受試者施用iRNA試劑，例如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑(例如，前體，例如可被加工成siRNA試劑的更大iRNA試齊U，或編碼iRNA試齊U，例如雙鏈iRNA試劑或siRNA試劑或其前體的DNA)的起始劑量，和一個(gè)或多個(gè)維持劑量。維持劑量(一個(gè)或多個(gè))通常低于起始劑量，例如比起始劑量少一半。維持方案可包括用范圍在0.01至75mg/kg體重/天，例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg體重/天的劑量(一個(gè)或多個(gè))治療受試者。優(yōu)選維持劑量的施用不超過每5天、10天或30天一次。此外，治療方案可持續(xù)一段時(shí)間，該時(shí)間將視具體疾病的性質(zhì)、其嚴(yán)重度和患者的總體狀況而變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量的遞送可以不超過每天1次，例如不超過每24、36、48或更多小時(shí)1次，例如不超過每5天或8天1次。在治療后，可就患者的狀況的變化和就疾病狀態(tài)的癥狀的緩和來監(jiān)控患者?？梢栽诨颊邔?duì)當(dāng)前劑量水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著反應(yīng)的情況下，增加化合物的劑量，或者在觀察到疾病狀態(tài)的癥狀緩和時(shí)，在疾病狀態(tài)已消除時(shí)、或在觀察到不期望的副作用時(shí)，減少劑量。有效劑量可以，按需或在特定情況下認(rèn)為適當(dāng)時(shí)，以單劑量或以兩個(gè)或更多個(gè)劑量施用。如果期望有利于重復(fù)的或頻繁的輸注，植入遞送裝置例如泵、半永久性支架(stent)(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、池內(nèi)或囊內(nèi))可能是值得推薦的。在成功地治療后，可能期望使患者經(jīng)歷維持療法以防止疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中本發(fā)明的化合物以范圍在0.OOlg至100g/kg體重的維持劑量施用(參見US6，107，094)。iRNA試劑組合物的濃度是足以在人中有效地治療或預(yù)防病癥或調(diào)節(jié)生理狀況的量。施用的iRNA試劑的濃度或量將取決于針對(duì)該試劑和施用方法(例如鼻、口腔或肺施用)所確定的參數(shù)。例如，鼻制劑傾向于需要濃度低得多的一些成分以避免剌激或灼燒鼻道。有時(shí)期望稀釋口服制劑多達(dá)10至100倍以提供適當(dāng)?shù)谋侵苿Ｄ承┮蛩乜捎绊懹行е委熓茉囌咚璧膭┝?，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重度、之前的治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡和存在的其他疾病。也將認(rèn)識(shí)到，用于治療的iRNA試劑例如siRNA的有效劑量可在特定的治療過程中增加或減少。劑量的變化可由診斷試驗(yàn)的結(jié)果導(dǎo)致并變得顯而易見。例如，可在施用iRNA試劑組合物后監(jiān)控受試者?；趤碜员O(jiān)控的信息，可施用額外量的iRNA試劑組合物。劑量取決待治療的疾病狀況的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，或直至治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀況的減輕。最佳給藥方案可根據(jù)藥物在患者體內(nèi)的積累的測(cè)量結(jié)果來計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量、劑量給藥方法和重復(fù)速率。最佳劑量可視各單個(gè)化合物的相對(duì)效力而變化，并且通?？苫谠隗w外和體內(nèi)動(dòng)物模型(如上所述的)中發(fā)現(xiàn)有效的EC50來估計(jì)。如本文所述的本發(fā)明iRNA試劑可用于治療和預(yù)防(在適宜的情況下)任一下列疾病/病癥囊性纖維化、利德爾綜合征、腎機(jī)能不全、高血壓、電解質(zhì)失衡。特別地在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的iRNA試劑可用于治療和/或預(yù)防這些疾病/病癥的不良臨床表現(xiàn)。通過下列不應(yīng)當(dāng)解釋為限制性的實(shí)施例，進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例試劑來源在本文未明確給出試劑來源的情況下，此類試劑可根據(jù)分子生物學(xué)中應(yīng)用的質(zhì)量/純度標(biāo)準(zhǔn)從任何分子生物學(xué)試劑提供商處獲得。實(shí)施例1:序列的選擇為了鑒定下調(diào)上皮鈉通道ENaC的a亞基(a-ENaC)表達(dá)的治療性siRNA，基于生物信息學(xué)分析確定篩選組。設(shè)計(jì)該篩選組的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素是預(yù)測(cè)的siRNA針對(duì)相關(guān)物種的轉(zhuǎn)錄組的特異性。為了鑒定a-ENaCsiRNA和有效的遞送系統(tǒng)，使用了一個(gè)三管齊下的方法選擇大鼠作為受試物種以著眼于在氣管內(nèi)遞送后體內(nèi)的沉默功效，而選擇豚鼠作為疾病模型生物以證明a-ENaCmRNA的降低導(dǎo)致可測(cè)量的功能效應(yīng)。治療性siRNA分子必須耙向人a-ENaC以及至少一種毒理學(xué)相關(guān)物種(在本案中為恒河猴)的a-ENaC序列。相關(guān)a-ENaCmRNA序列的初步分析揭示，幾乎不能鑒定到既滿足特異性的需要同時(shí)又在所有相關(guān)物種中耙向a-ENaCmRNA的序列。因此，決定針對(duì)治療性siRNA和針對(duì)替代物分子設(shè)計(jì)獨(dú)立的篩選組以在相關(guān)疾病模型中接受檢測(cè)(表1A，1B，1C和ID)。由于人細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(H441，參見下面)被選擇用于測(cè)定體外活性，故所有siRNA均識(shí)別人a-ENaC序列。因此所有siRNA均可在治療背景中用于靶向人a-ENaCmRNA。治療性篩選組經(jīng)設(shè)計(jì)只包含與人和恒河猴a-ENaC序列完全互補(bǔ)的siRNA序列。靶向a-ENaC的siRNA(SCNN1A)的設(shè)計(jì)和insilico詵擇進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)以鑒定用于4個(gè)之前確定的組的siRNA(參見上面)a)"起始篩選組"b)"擴(kuò)展篩選組"c)"用于大鼠的體內(nèi)替代物組"d)"用于豚鼠的體內(nèi)替代物組"。起始篩詵組起始篩選組的insilico選擇目標(biāo)是鑒定特異地耙向人a-ENaC以及其恒河猴直系同源物的siRNA。在整個(gè)siRNA選擇過程中，從NCBI來源(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi7CMD=search&DB=nucleotide)下載人革巴mRNA(NM_001038.4)。為了鑒定該a-EnaC的恒河猴(Macacamulatta)直系同源物，使用該人序歹ll在Baylor醫(yī)藥大學(xué)(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/organism=Mmulatta)針對(duì)截止到2004年10月01日的恒河猴重疊群(Mmulattacontig)進(jìn)行Blastn搜索。提取所有命中區(qū)域，然后利用CAP組裝工具進(jìn)行組裝，從而產(chǎn)生第一裝配序列。此外，使用該人序歹ll在UCSC(htt。//genome,ucsc.edu/cgi_bin/hgBlat7command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356)針對(duì)2005年3月12日RhesusFreeze進(jìn)行BLAST搜索。下載scaffoldhit84554，通過CAP用于與第一裝配序列一起產(chǎn)生最終的恒河猴a-ENaC共有序列。在從人mRNA中提取出所有重疊的19mer序列后，鑒定在裝配的恒河猴共有序列中具有相同序列的保守19mer。這些19mer序列被定義為人_恒河猴交叉反應(yīng)性siRNA(有義)序列庫，其由1185個(gè)19mer代表。產(chǎn)生相應(yīng)的反義序列并就在人中對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè)。為此，將預(yù)測(cè)的它們與不相關(guān)靶mRNA相互作用的潛能(脫靶潛能)取作參數(shù)。具有低脫靶潛能的序列被確定為優(yōu)選的并預(yù)測(cè)具有更高特異性。為了進(jìn)一步選擇，根據(jù)預(yù)測(cè)的候選siRNA與其他宿主序列(在此為，但不限于，人)相互作用的潛能，對(duì)候選siRNA評(píng)級(jí)。具有低脫靶潛能的siRNA被假定為在體內(nèi)更具特異性。為了預(yù)測(cè)siRNA-特異的脫靶潛能，進(jìn)行了下列假設(shè)371)鏈的脫靶潛能可根據(jù)針對(duì)脫靶的錯(cuò)配的數(shù)目和分布來推導(dǎo)2)最相關(guān)的脫靶，即由于對(duì)錯(cuò)配的耐受性而被預(yù)測(cè)具有最高的被沉默的概率的基因，決定鏈的脫靶潛能3)鏈的位置2至9(按5'至3'計(jì)數(shù))(種子區(qū)域)可比序列的其余部分(S卩，非種子和切割位點(diǎn)區(qū)域)對(duì)脫靶潛能有更大的貢獻(xiàn)(Haley，B.，和Zamore，P.D.，NatStructMolBiol.2004，11:599)。4)鏈的位置10和11(按5'至3'計(jì)數(shù))(切割位點(diǎn)區(qū)域)可比非種子區(qū)域(即位置12至18，按5'至3'計(jì)數(shù))對(duì)脫靶潛能有更大的貢獻(xiàn)5)各鏈的位置1和19與脫靶相互作用不相關(guān)6)脫靶潛能可用最相關(guān)脫靶的脫靶分?jǐn)?shù)來表示，脫靶分?jǐn)?shù)在考慮假設(shè)3-5的情況下，基于鏈與脫耙基因中最高同源區(qū)域的錯(cuò)配數(shù)目和位點(diǎn)來計(jì)算。7)假定導(dǎo)入的內(nèi)部修飾對(duì)有義鏈活性的潛在消除，則只有反義鏈的脫靶潛能是相關(guān)的。為了鑒定潛在的脫靶基因，將19mer反義序列針對(duì)可公共獲得的人mRNA序列(假定代表人全部轉(zhuǎn)錄組)進(jìn)行同源性搜索。為了實(shí)現(xiàn)該目的，使用所有19mer序列針對(duì)人RefSeq數(shù)據(jù)庫(2005年11月18日從ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/refseq/可獲得的版本)進(jìn)行fastA(版本3.4)搜索。使用參數(shù)——值-對(duì)——f30-g30進(jìn)行FastA搜索，以考慮在無任何空位的情況下的19mer全長上的同源性。此外，為了確保所有相關(guān)脫靶命中事件都列于fastA輸出文件中，使用了參數(shù)E15000。針對(duì)每個(gè)輸出序列，搜索產(chǎn)生了一列潛在的脫靶，按照下降的與全長19mer的序列同源性列出。為了按照假定3至5對(duì)所有潛在的脫靶進(jìn)行評(píng)級(jí)，以及據(jù)此鑒定最相關(guān)的脫靶基因和其脫耙分?jǐn)?shù)，利用perlscript對(duì)fastA輸出文件進(jìn)行分析。Script針對(duì)每一個(gè)19mer輸出序列以及每一個(gè)脫靶基因提取出下列脫靶性質(zhì)，以計(jì)算脫靶分?jǐn)?shù)參非種子區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù)目參種子區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù)目參切割位點(diǎn)區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù)目通過考慮假定3至5分，如下計(jì)算了脫靶分?jǐn)?shù)脫靶分?jǐn)?shù)=種子錯(cuò)配的數(shù)目*10+切割位點(diǎn)錯(cuò)配的數(shù)目*1.2+非種子錯(cuò)配的數(shù)目*1每個(gè)19mer序列的最相關(guān)脫靶基因被定義為具有最低脫靶分?jǐn)?shù)的基因。因此，最低脫靶分?jǐn)?shù)被定義為代表每個(gè)siRNA(由分析的19mer反義序列代表)的脫靶潛能。計(jì)算的脫靶潛能被用作分選參數(shù)(按脫靶分?jǐn)?shù)遞減)，以對(duì)所有人-恒河猴交叉反應(yīng)性siRNA序列產(chǎn)生評(píng)級(jí)。3或更高的脫靶分?jǐn)?shù)被確定為siRNA選擇的前提條件，然而連續(xù)包含4或更多個(gè)G(poly-G序列)的所有序列被排除，這導(dǎo)致總共152個(gè)耙向人和恒河猴ENaCa的siRNA的選擇(參見表la)。擴(kuò)展篩詵組擴(kuò)展篩選組的insilico選擇的目標(biāo)是鑒定具有足夠特異性的靶向人a-ENaC的所有其他siRNA，這些siRNA由于缺少與恒河猴的交叉反應(yīng)性而被排除在起始組外。采用源于人a-ENaC的19mer庫中之前還未進(jìn)行過分析的其余序列，產(chǎn)生相應(yīng)的反義序列。如"起始篩選組"部分中所述，計(jì)算最相關(guān)的脫靶基因和其相應(yīng)脫靶分?jǐn)?shù)。為了測(cè)定與小鼠和豚鼠(荷蘭豬(Caviaporcellus)/天竺鼠(cobya))的交叉反應(yīng)性，從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫工下載了這些物種的a-ENaC序列(分別地，登錄號(hào)NM—011324.1和AF071230(全長)/DQ109811(部分cds))。兩個(gè)豚鼠序列用于產(chǎn)生豚鼠a-ENaC共有序列。檢測(cè)每一個(gè)人19mer序列在小鼠和豚鼠序列中的存在。陽性序列被分配至人_小鼠交叉反應(yīng)性siRNA(有義)序列庫，或人-豚鼠交叉反應(yīng)性siRNA(有義)序列庫。在排除所有poly-G序列后，選擇具有3或更高的脫靶分?jǐn)?shù)的序列，以及具有2.2或2.4的脫靶分?jǐn)?shù)并且與小鼠、恒河猴或豚鼠具有交叉反應(yīng)性的序列。擴(kuò)展篩選庫中siRNA的總數(shù)是344(參見表lb)。觸t匪備目體內(nèi)大鼠替代物組的insilico選擇的目標(biāo)是鑒定在大鼠中具有足夠特異性的靶向人和大鼠a-ENaC的所有siRNA。為了鑒定人_大鼠交叉反應(yīng)性siRNA，從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)，NMJ)31548.2)下載大鼠a-ENaCmRNA序列，然后從人19mer庫中檢測(cè)出存在于大鼠序列中的所有序列，代表人-大鼠交叉反應(yīng)性siRNA(有義)序列庫。產(chǎn)生相應(yīng)的反義序列并在大鼠中對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè)。為此，使用大鼠mRNA組(RefSeq數(shù)據(jù)庫)而非人轉(zhuǎn)錄物，如"起始篩選組"部分中所述，計(jì)算了大鼠中的最相關(guān)脫靶基因和其相應(yīng)的脫靶分?jǐn)?shù)。在排除所有poly-G序列后，通過第一優(yōu)先考慮大鼠脫靶分?jǐn)?shù)以及第二優(yōu)先考慮人脫靶分?jǐn)?shù)，產(chǎn)生了評(píng)級(jí)。最終選擇了該列表的最前部的48個(gè)序列，代表體內(nèi)大鼠替代物組(參見表lc)。體內(nèi)豚鼠替代物組體內(nèi)豚鼠替代物組的insilico選擇的目標(biāo)是鑒定未在前述組中被選擇的、耙向人和豚鼠a-ENaC的所有siRNA。按照人脫靶分?jǐn)?shù)，對(duì)之前確定的人_豚鼠交叉反應(yīng)性siRNA(有義)序列組中的剩余siRNA進(jìn)行評(píng)級(jí)。選擇最靠前的63個(gè)序列(排除poly-G序列)，代表體內(nèi)豚鼠替代物組(參見表Id)。實(shí)施例2:siRNA合成包含天然堿某的核苷酸的合成由于來自篩選組的siRNA都潛在地旨在用于體內(nèi)施用，因此利用保護(hù)siRNA免受生物環(huán)境中的核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶降解的改良策略，合成了siRNA。在該策略中，利用3'-末端最后兩個(gè)核酸堿基之間的硫代磷酸酯連接來保護(hù)兩條鏈的3'-末端免受3'->5'-外切核酸活性。為了抑制siRNA的內(nèi)切核酸降解，將siRNA的有義鏈中的所有嘧啶用相應(yīng)的2'-0-甲基-修飾的核糖核苷酸替代。為了減少反義鏈(其是更具活性的鏈，從而對(duì)修飾更敏感)中修飾的數(shù)目，我們利用2'-0-甲基只對(duì)之前鑒定的主要核酸酶切割位點(diǎn)中的嘧啶進(jìn)行了修飾。主要的切割位點(diǎn)是下列兩個(gè)序列基序5'-UA-3'和5'-CA-3'。39由于還考慮到在潛在地保護(hù)RNA免受肺中核酸水解生物環(huán)境影響的制劑中使用siRNA，因此也合成了無任何內(nèi)切核酸降解保護(hù)的相同siRNA組。在試劑的來源未在本文中明確給出的情況下，這樣的試劑可以根據(jù)用于分子生物學(xué)的質(zhì)量/純度標(biāo)準(zhǔn)從任何分子生物學(xué)試劑提供商獲得。使用Expedite8909合成儀(AppliedBiosystems，AppleraDeutschlandGmbH，Darmstadt,Germany),以可控多孔玻璃(CPG，500A，ProligoBiochemicGmbH，Hamburg,Germany)作為固相支持物，以1Pmole級(jí)固相合成產(chǎn)生單鏈RNA。分別利用相應(yīng)的亞磷酰胺和2'-0-甲基亞磷酰胺(ProligoBiochemieGmbH，Hamburg,Germany)通過固相合成產(chǎn)生RNA和包含2'-0-甲基核苷酸的RNA。使用標(biāo)準(zhǔn)核苷亞磷酰胺化學(xué)(例如Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage，S丄等(Edrs.)，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork,NY，USA中描述的)，將這些構(gòu)件摻入寡核糖核苷酸鏈序列中的選定位點(diǎn)。通過用Beaucage試劑(ChruachemLtd,Glasgow,UK)在乙腈(1%)中的溶液替代碘氧化劑溶液，導(dǎo)入硫代磷酸酯連接。可從MallinckrodtBaker(Griesheim，Germany)獲得其他輔助試劑。按照已建立的方法對(duì)粗制寡核糖核苷酸進(jìn)行去保護(hù)和利用陰離子交換HPLC進(jìn)行純化。使用分光光度計(jì)(DU640B，BeckmanCoulterGmbH，UnterschleiPheim，Germany)測(cè)量各RNA溶液在260nm波長處的UV吸收，由此確定產(chǎn)率和濃度。通過在退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8;100mM氯化鈉)中混合等摩爾的互補(bǔ)鏈溶液，在85-9(TC水浴中加熱3分鐘，然后經(jīng)3至4小時(shí)冷卻至室溫，產(chǎn)生雙鏈RNA。將退火的RNA溶液稀釋至50ymole雙鏈RNA/L的濃度，然后在使用前在-2(rC貯存。實(shí)施例3:siRNA的體外檢測(cè)在人細(xì)胞系中體外檢測(cè)或在大鼠中體內(nèi)檢測(cè)iRNA試劑抑制a-ENaC表達(dá)的能力。通過例如轉(zhuǎn)染將iRNA試劑轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，允許其作用于細(xì)胞一定時(shí)間，例如，24小時(shí)，然后通過分支-DNA分析來測(cè)定a-ENaCmRNA的水平。備選地，通過氣管內(nèi)途徑體內(nèi)施用iRNA試劑，然后通過對(duì)靶器官進(jìn)行分支-DNA分析來測(cè)定a-ENaCmRNA表達(dá)的抑制。作為這些直接測(cè)定法的補(bǔ)充，我們針對(duì)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的a-ENaCmRNA，檢測(cè)了RNAi試劑對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。細(xì)胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC-號(hào)HTB-174，LCGPromochemGmbH，Wesel，Germany)獲得H441細(xì)胞，將其在37。C于5%0)2/95%空氣下培養(yǎng)于RPMI1640，10%胎牛血清，lOOu青霉素/100iig/mL鏈霉素，2mML_谷氨酰胺，10nMH印es和ImM丙酮酸鈉(全部來自BiochromAG，Berlin,Germany)中。從Cambrex(CatftCC-2540)獲得原代人支氣管上皮細(xì)胞，將其常規(guī)培養(yǎng)在具有singlequots(CambrexCat#CC_3170減去三碘蘇氨酸)的BEGM培養(yǎng)基中。為了在氣液界面極化和生長，將細(xì)胞培養(yǎng)在BEGM:DMEM的1:1混合物中，所述混合物補(bǔ)充有4.5g/LD-葡萄糖(GibcoBRLCat#41965-039)和補(bǔ)充有singlequot(CambrexCat#CC_4175)，如上但除去了三碘蘇氨酸和GA1000等分試樣并且存在50iig/mL慶大霉素(GibcoBrlCat#10131-015)。由于細(xì)胞維持在無血清培養(yǎng)基中，因此在傳代步驟中使用胰蛋白酶中和溶液(CambrexCat#CC-5002)。為了在氣_液界面極化和培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)在半透性(0.4微米)聚碳酸酯支持物(CorningCostarCat#3407#3460)上，并且始終在37°C、5%。02/95%空氣下培養(yǎng)。將Cos-l非洲綠猴腎細(xì)胞(ATCC#CRL-1650)培養(yǎng)在Dulbecco'sMEM，4.5g/L葡萄糖，10%胎牛血清，2慮L-谷氨酰胺，l.5g/L碳酸氫鈉(GibcoBRL)，100u青霉素/100iig/mL鏈霉素中。實(shí)施例3.1:在H441中體外篩詵活件a-ENaCsiRNA和測(cè)定IC50在轉(zhuǎn)染前1天，通過加入lOOnM地塞米松在H441細(xì)胞(ATCC-號(hào)HTB_174，LCGPromochemGmbH，Wesel，Germany)中誘導(dǎo)ENaC-a表達(dá)。即將轉(zhuǎn)染前，在96孔板(GreinerBio-OneGmbH，F(xiàn)rickenhausen，Germany)上，將細(xì)胞以1.5x104個(gè)細(xì)胞/孔接種在75iiL生長培養(yǎng)基(RPMI1640，10X胎牛血清，100u青霉素/lOOiig/ml鏈霉素，2mML-谷氨酰胺，10nMH印es禾口lmM丙酮酸鈉，全部來自BiochromAG，Berlin,Germany)中。以一式四份重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)于每一個(gè)孔，將0.5iiLLipofectamine2000(InvitrogenGmbH，Karlsruhe,Germany)與12yLOpti-MEM(Invitrogen)混合并且在室溫溫育15分鐘。對(duì)于在100iiL轉(zhuǎn)染體積中50nM的siRNA濃度，每孔將1yL的5yMsiRNA與11.5iiLOpti-MEM混合，與Lipofectamine2000-0pti-MEM混合物組合，然后再于室溫溫育15分鐘。將siRNA-Lipofectamine2000-復(fù)合物完全(每孔各25yL)用于細(xì)胞，將細(xì)胞在37。C和5%C02下于潮濕的培養(yǎng)箱(HeraeusGmbH，Hanau)中溫育24小時(shí)。通過對(duì)每一個(gè)包含100iiL生長培養(yǎng)基的孔使用50iiL裂解混合物(來自Genospectra，F(xiàn)remont,USA的QuantiGenebDNA-試劑盒的內(nèi)含物)，收獲細(xì)胞，并53°C裂解30分鐘。之后，將50iiL裂解物與特異于人ENaC-a和人GAPDH的探針組(探針組的序列參見下面)一起溫育，并且按照QuantiGene的廠商說明書進(jìn)行反應(yīng)。最后，在Victor2-Light(PerkinElmer，Wiesbaden,Germany)中以RLU(相對(duì)光單位)測(cè)量化學(xué)發(fā)光，將使用hENaC探針組獲得的值相對(duì)于各孔的相應(yīng)GAPDH值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將利用抗ENaC-a的siRNA獲得的值與利用非特異性siRNA(抗HCV)獲得的值(被設(shè)定為100%)關(guān)聯(lián)起來。siRNA實(shí)例的a-ENaC殘留表達(dá)百分比示于表1A_1D。通過劑量響應(yīng)曲線進(jìn)一步表征來自該篩選的有效siRNA。按照上述方案以下列濃度進(jìn)行劑量響應(yīng)曲線的轉(zhuǎn)染lOOnM，16.7nM，2.8nM，0.46nM，77picoM，12.8picoM，2.lpicoM，O.35picoM，59.5預(yù)，9.9fM和模擬品(無siRNA)，用Opti-MEM稀釋至12.5ii1的終濃度。使用MicrosoftExceladd-in軟件XL-fit4.2(IDBS，Guildford,Surrey,UK)和應(yīng)用S型曲線模型Number606進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。探針組人a-ENaC:FPL名稱成員功能序列SEQ.I.D.NO:hENACOOl.235.255.CECEgtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaElgt1645hENAC002.274.293.CECE3ctgccattcttggtgc3gtTTTTTctcttgg皿3g3皿gt1646hENAC003.344.367.CECEctctcctgg^gc3ggagtg^teTTTTTctcttgg3皿gaaagt1647hENAC004．391．4l1．CECEgCCgCggatagaagatgtaggTTTTTCtCttggaaagaaagt1648hENAC005．501．521．CECEgCaCttggtgaaaCagCCCagTTTTTCtCttggaaagaaagt1649hENAC006．539．560．CECEagCagagagCtggtagCtggtCTTTTTCtCttggaaagaaagt1650hENAC007．256．273．LELECgCCataatCgCCCCCaaTTTTTaggCataggaCCCgtgtCt165lhENAC008．368．390．LELECaCagCCaCaCtCCttgatCatgTTTTTaggCataggaCccgtgtct1652hENAC009．412．431．LELEaCagtaCtCCaCgttCtgggTTTTTaggCataggaCCCgtgtct1653hENAC010．455．477．LELEggagCttatagtagCagtaCCCCTTTTTaggCataggaCCCgtgtCt1654hENACOl1．522．538．LELEaCgCtgCatggCttCCgTTTTTaggCataggaCCCgtgtCt1655hENAC012．561．580．LELEgagggCCatCgtgagtaaCCTTTTTaggCataggaCCCgtgtct1656hENAC0l3．2l4．234．BLBLTCatgCtgatggaggtCtCCa1657hENACO14．294．318．BLBLGgtaaaggttCtCaaCaggaaCatC1658hENACO15．319．343．BLBLCaCaCCtgCtgtgtgtaCtttgaag1659hENAC0l6．432．454．BLBLCaggaaCtgtgCtttCtgtagtC1660hENAC0l7．478．500．BLBLGtggtCtgaggagaagtCaaCCt166lhENAC0l8．581．599．BLBLCCattCCtgggatgtCaCC1662人GAI~DHFPL名稱成員功能序列SEQ．工．D．NOhGAP00lAF261085．252．271．CECEgaatttgCCatgggtggaatTTTTTCtCttggaaagaaagt1663hGAP002AF261085．333．352．CECEggagggatCtCgCtCCtggaTTTTTCtCttggaaagaaagt1664hGAP003AF261085．413．431．CECECCCCagCCttCtCCatggtTTTTTCtCttgga朋g朋3gt1665hGAP004AF261085.432.450.CECEgctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttgga朋g朋3gt1666hGAP005AF261085.272.289.LELEagccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct1667hGAP006AF261085.290.310.LELEgatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct1668hGAP007AF261085.311.332.LELEagatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct1669hGAP008AF261085.353.372.LELEgcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct1670hGAP009AF261085.373.391.LELEcacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct1671hGAP010AF261085.451.472.LELEggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct1672hGAPOllAF261085.392.412.BLGgtgaagacgccagtggactc1673個(gè)細(xì)胞siRNA實(shí)例的IC50示于表2A和2B。實(shí)施例3.2:原代人支氣管上皮模型中瞬時(shí)a-EnaC降低在轉(zhuǎn)染前1天，在24孔板中將人支氣管上皮細(xì)胞(供體參考號(hào)4F1499)以lx105孔接種在0.5mL生長培養(yǎng)基中。在siRNA轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到70%的匯合。將各siRNA以100nM重懸浮于lmLOptimemI(Invitrogen)中，并在分開的管中，將Lipofectamine2000(Invitrogen)于Optimem中稀釋至6iiL/mL，從而產(chǎn)生足以在24孔板中用于一式四份重復(fù)轉(zhuǎn)染的量。在室溫下5分鐘后，組合混合物以產(chǎn)生期望的終濃度，50nMsiRNA和3iiL/mLLipofectamine2000。在室溫再溫育轉(zhuǎn)染混合物20分鐘，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的規(guī)定向每孔中加入420L該siRNA/試劑復(fù)合物。輕輕搖動(dòng)板以確保完全混合，然后在371:于培養(yǎng)箱中在5%C02/95X空氣下溫育4小時(shí)。隨后，吸出轉(zhuǎn)染混合物，使細(xì)胞返回正常培養(yǎng)條件再20小時(shí)。制備用于分支-DNA分析的細(xì)胞裂解物。制備2:l培養(yǎng)基裂解緩沖液(Panomics)混合物，將細(xì)胞在200yL中于53"C裂解30分鐘。在目測(cè)完全裂解后，將細(xì)胞裂解物于-8(TC貯存以待以后分析。如上所述進(jìn)行分支-DNA分析，針對(duì)GAPDH對(duì)a-ENaC表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所使用的分支DNA分析方案與上述方案的不同僅在于在本情況下每孔應(yīng)用20iiL樣品。表2C顯示針對(duì)siRNA實(shí)例在原代HBEC中的a-ENaC表達(dá)。實(shí)施例3.3:Cos-l細(xì)胞中選擇的RNAi試劑對(duì)外源表達(dá)的克隆食蟹猴a-ENaC基因表汰的體外抑制食蟹猴a-ENaC序列的克隆用于擴(kuò)增5'-UTR和CDS的引物序列(括號(hào)內(nèi)顯示的核苷酸相應(yīng)于Macacamulatta(恒河猴)的a-ENaCcDNA序列)P745:5'-CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3'(nt1427)(SEQ.I.D.NO:1674)P733:5'-CCGGCCGGCGGGCGGGCT—3'(nt1)(SEQ.I.D.NO:1675)P734:5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3'(ntl7)(SEQ.I.D.NO:1676)P735:5'-GGCCGCTGCACCTGTAGGG—3'(nt28)(SEQ.I.D.NO:1677)用于擴(kuò)增CDS和3'-UTR的弓|物序列P737:5'-ATGGAGTACTGTGACTACAGG—3'(ntl422)(SEQ.I.D.NO:1678)P740:5'-TTGAGCATCTGCCTACTTG—3'(nt3113)(SEQ.I.D.NO:1679)用于擴(kuò)增CDS的內(nèi)部部分的引物序列P713:5'-5，-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3'(nt1182)(SEQ.I.D.NO:1709)P715:5'-5，-TCAGGGCCCCCCCAGAGG—3'(nt2108)(SEQ.I.D.NO:1680)食蟹猴(Macacafascicularis)的肺總RNA(#R1534152_Cy-BC)購自BioCat(Germany)。使用SuperscriptIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行cDNA的合成。使用隨機(jī)六聚物或寡dT引物進(jìn)行cDNA的合成。此外，食蟹猴肺第一鏈cDNA也購自BioCat/#C1534160-Cy-BC)。為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Advantage2PCR試劑盒(#K1910_1，Clontech)。使用P745和等摩爾的P733、P734和P735的混合物進(jìn)行5'-UTR和CDS的部分的擴(kuò)增。為了PCR擴(kuò)增CDS和3'-UTR，使用引物P737和P740。引物P713和P715用于擴(kuò)增CDS的部分。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所有PCR產(chǎn)物，然后使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆在pCR2.1載體中于T0P10細(xì)菌中。然后挑取克隆，使用QiagenMinipr印試劑盒分離DNA。在用EcoRI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶降解后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將來自正確克隆的DNA測(cè)序。然后將序列與恒河猴的a-ENaCcDNA序列比對(duì)，將各單個(gè)克隆的序列相互比對(duì)。然后如下克隆全長食蟹猴a-ENaCcDNA:用EcoRI和NotI消化5'-部分(5'-UTR和CDS,克隆55)，利用NotI和BstEII消化CDS的中間部分(克隆15)，以及用BstEII和EcoRV消化3'-部分(CDS和3'-UTR)(克隆80)。然后將消化的DNA片段亞克隆入用EcoRI和EcoRV消化的pcDNA3.1。然后將pcDNA3.1中的全長食蟹猴a-ENaCcDNA進(jìn)行全長測(cè)序(Ingenetix，Vienna，Austria)。食蟹猴a-ENaCcDNA序列相應(yīng)于恒河猴a-ENaCcDNA序列的nt28-3113。最后通過用BamHI和EcoRV消化，從pcDNA3.l-食蟹猴a-ENaC切取食蟹猴a-ENaCcDNA，然后亞克隆入載體pX00N。圖l中給出了質(zhì)粒圖譜。圖2描述了食蟹猴a-ENaC的蛋白質(zhì)(SEQ.I.D.NO:1681)和DNA(SEQ.I.D.NO:1682)序列。轉(zhuǎn)染:在24孔板上，將C0S-l細(xì)胞以6xl(^個(gè)細(xì)胞/孔接種在0.5mL生長培養(yǎng)基中。在接種后1天，用PX00N食蟹猴a-ENaC表達(dá)質(zhì)粒和所示的siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)孔，4nga-ENaC表達(dá)質(zhì)粒和600ng載體質(zhì)粒(pNFAT-luc)與相關(guān)siRNA(終濃度45nM)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，其中在720iiL總體積/孔Opti-MEM(Invitrogen)中以3.75iiL/孔使用X-treme基因轉(zhuǎn)染試劑(Roche)。對(duì)于各樣品以一式三份重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如下制備質(zhì)粒/siRNA母混合液(mastermix)(每一個(gè)用于3.5個(gè)孔)在總體積210iiL(Opti-MEM)中14nga-ENaC表達(dá)質(zhì)粒，2.lyg載體質(zhì)粒和112pmole相關(guān)siRNA。制備用于整個(gè)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)母混合液(mastermix)(105ill脂質(zhì)+1575ill0pti-MEM用于8個(gè)一式三份重復(fù)轉(zhuǎn)染樣品)。將質(zhì)粒/siRNA和脂質(zhì)以等體積混合以產(chǎn)生總體積420iU的轉(zhuǎn)染混合物/一式三份重復(fù)樣品(3.5x)。在室溫溫育20分鐘后，向每一個(gè)孔的細(xì)胞加入120i！L的相關(guān)轉(zhuǎn)染混合物，終轉(zhuǎn)染體積720iil(Opti-MEM)。將細(xì)胞在潮濕的培養(yǎng)箱(HeraeusGmbH，Hanau，Germany)中于37t:和5%C02下轉(zhuǎn)染24小時(shí)，然后收獲以進(jìn)行分支-DNA分析。制備用于分支DNA分析的細(xì)胞裂解物。制備2:l的培養(yǎng)基裂解緩沖液(Panomics)混合物，將細(xì)胞在200yL中于53"C裂解30分鐘。在目測(cè)完全裂解后，將細(xì)胞裂解于-S(TC貯存以待以后分析。如上所述進(jìn)行分支-DNA分析，并針對(duì)來自表達(dá)質(zhì)粒的eGFP，對(duì)食蟹猴a-ENaC表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所用的分支-DNA分析方案與上述方案的不同只在于在本情況下對(duì)每一個(gè)孔應(yīng)用20iiL的樣品。探針組食蟹猴a--ENaC:FPL名稱功能序列SEQ.I.D.NO:cyENa001CEcgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt1683cyENa002CEggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt1684cyENa003CEc3g朋g朋ctcg33g3gctctcTTTTTctcttgg333g333gt1685cyENa004CEcccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt1686cyENa005LEggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt1687cyENa006LEgtgccgcaggttctgggTTTTTaggcateggacccgtgtct1688cyENa007LEgatcagggcctcctcctcTTTTTaggcateggacccgtgtct1689cyENa008LEccgtggatggtggtettgttgTTTTTaggcateggacccgtgtct1690cyENa009LEgcggttgtgctgggagcTTTTTaggcateggacccgtgtct1691cyENa0010LEttgccagtecatcatgccaaaTTTTTaggcateggacccgtgtct1692cyENa0011BLacaccaggcggatggcg1693eGFP:FPL名稱功能.序列SEQ.LD.NO:EGFP001CEggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt1694EGFP002CEggtegcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt1695EGFP003CEcctggacgtegccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt1696EGFP004CEccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaagt1697EGFP005LEcgaacttcacctcggcgcTTTTTctcttggaaagaaagt1698EGFP006LEccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt1699EGFP007LEgtcacgagggtgggccagTTTTTaggcateggacccgtgtct1700EGFP008LEcacgccgteggtcagggtgTTTTTaggcateggacccgtgtct1701EGFP009LEgtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcateggacccgtgtct1702EGFP0010LEtcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcateggacccgtgtct1703EGFP0011BLcggtggtgcagatgaacttca1704EGFP0012BLcatggcggacttgaagaagtc1705EGFP0013BLcgtcctccttgaagtcgatgc1706表2C顯示針對(duì)siRNA實(shí)例的a-ENaC在食蟹猴物種中的表達(dá)。實(shí)施例3.4篩詵干擾素_a的誘導(dǎo)為了評(píng)估siRNA剌激干擾素-a(IFN-A)釋放的能力，將siRNA與新鮮純化的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)體外溫育24小時(shí)。將siRNA直接加入PBMC，或首先將其與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑(GenePorter2或Lipofectamine2000或D0TAP轉(zhuǎn)染劑)復(fù)合，然后再與PBMC—起溫育。包括未修飾的對(duì)照序列DI_A_2216和DI—A—5167，作為IFN-a誘導(dǎo)的陽性對(duì)照。DI_A_2216:是單鏈反義DNA分子5，-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3，(SEQ.I.D.NO:1707)DI_A_5167是綴合有膽固醇的siRNA5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol-3'3'-CsAs￡AGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5'(SEQ.I.D.NO:1708)在24小時(shí)后，通過ELISA測(cè)量IFN-a。針對(duì)未處理的細(xì)胞測(cè)定基線IFN-a水平，其總是非常接近只有水的對(duì)照。單獨(dú)的轉(zhuǎn)染劑的加入不產(chǎn)生或幾乎不產(chǎn)生IFN-a水平的增加。直接或在轉(zhuǎn)染子存在的情況下向細(xì)胞中加入已知的剌激性寡核苷酸，觀察到預(yù)期的IFN-a增加。該設(shè)置使得能夠測(cè)定siRNA(或其他寡核苷酸)對(duì)人PBMC中IFN-a的剌激。人PBMC的分離白細(xì)胞的濃縮的級(jí)分(血沉棕黃層)獲自theBloodBankSuhl，InstituteforTransfusionMedicine,Germany。這些細(xì)胞對(duì)于多種病原體，包括HIV、HCV等是陰性的。用PBS以1:l稀釋血沉棕黃層，加入至裝有Ficoll的試管，然后以2200rpm離心20分鐘進(jìn)行分級(jí)分離。之后取出渾濁的白細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至裝有新鮮PBS和Ficoll的試管中，以2200rpm離心15分鐘。再次取出渾濁的白細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至RPMI1640培養(yǎng)基中，以1，200rpm離心5分鐘以沉淀白細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮于RPMI中，如上進(jìn)行沉淀，重懸浮于具有10%FCS的培養(yǎng)基中至lx106/mL。干擾素-a的測(cè)量在37。C將培養(yǎng)的細(xì)胞與500nM(或1iiM)在Optimem中的寡核苷酸或133nM在GP2或Lipofectamine2000或DOTAP轉(zhuǎn)染劑中的寡核苷酸混合24小時(shí)。按照廠商說明書使用BenderMedSystems(Vienna,Austria)instantELISA試劑盒測(cè)量干擾素-a?；诘陀陉栃詫?duì)照的15%的IFN-a誘導(dǎo)水平，選擇了前驅(qū)治療性序列。實(shí)施例3.5在CF患者的痰中測(cè)定siRNA的穩(wěn)定性痰樣品由Dr.AhmetUluer，Children'sHospitalBoston收集。收集后，用抗生素處理痰樣品，然后進(jìn)行UV-照射以減少細(xì)菌含量。為測(cè)定痰樣品中siRNA的穩(wěn)定性，將siRNA以5iiM的濃度在37t:于30iiL痰中溫育指定的時(shí)間。通過加入蛋白酶K終止反應(yīng)，將樣品在42t:再溫育另外20分鐘。加入由L-核苷酸("Spiegelmer")制造的抗核酸酶降解的40-merRNA分子，其用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。將樣品過濾通過0.2ym濾膜以除去剩余的碎片。在DNAPacPA200柱(Dionex)，pH11.0上通過變性離子交換HPLC分析樣品，其中高氯酸鈉梯度用于洗脫。通過針對(duì)每一個(gè)樣品測(cè)定峰下面積，定量siRNA和降解產(chǎn)物。將濃度相對(duì)于在未溫育樣品中的濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；谟^察到的在CF痰中具有長于60分鐘的半衰期的體外穩(wěn)定性，選擇了前驅(qū)治療性序列(ND8356、ND8357和ND8396)。實(shí)施例3.6針對(duì)R知的人SCNN1A某閔中的多杰件對(duì)前驅(qū)治療件序列講行奪叉檢査為了從前驅(qū)候選物的耙位點(diǎn)中排除已知的多態(tài)性，針對(duì)NCBI單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=snp)檢查前驅(qū)siRNA序列。在人SCNN1A基因的10個(gè)已知外顯子多態(tài)性中，沒有1個(gè)顯示存在于10個(gè)最有效的前驅(qū)治療性候選物之任一個(gè)的靶位點(diǎn)中。實(shí)施例3.7:最靠前的5個(gè)預(yù)測(cè)l的脫,靶序列的體外特ffi根據(jù)19-mer區(qū)域上的同源性分選各序列的比對(duì)列。按照實(shí)施例1中描述的標(biāo)準(zhǔn)，基于錯(cuò)配的數(shù)目和位置，對(duì)脫靶進(jìn)行評(píng)分。對(duì)于各前驅(qū)治療性序列(ND8356，ND8357和ND8396)鑒定了最靠前的5個(gè)脫靶序列。將標(biāo)靶和脫靶序列單個(gè)地克隆入雙重螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)。每一個(gè)克隆的片段除了10個(gè)核苷酸側(cè)翼區(qū)(靶序列的5'和3')以外還包含19個(gè)核苷酸的靶。將片段克隆入位于海腎螢光素酶序列3'的多克隆位點(diǎn)，于SV40啟動(dòng)子控制之下。通過海腎螢光素酶靶相對(duì)于螢火蟲螢光素酶的相對(duì)熒光，確定每個(gè)siRNA針對(duì)標(biāo)靶和脫靶序列的活性，其中螢火蟲螢光素酶獨(dú)立地受HSV-TK啟動(dòng)子控制。最初，以50nM的siRNA濃度在C0S-7細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)采集螢光素酶的讀出值。在該高siRNA濃度，對(duì)于3個(gè)前驅(qū)siRNA中的任一個(gè)，沒有觀察到針對(duì)任何脫耙序列的大于30%的下調(diào)。大約80%的海腎螢光素酶活性的相對(duì)降低證明了針對(duì)標(biāo)靶序列的活性。還產(chǎn)生各siRNA相對(duì)于標(biāo)耙序列的IC50曲線，并以上面鑒定的脫耙序列來檢驗(yàn)(control)。對(duì)于每個(gè)前驅(qū)siRNA，在該報(bào)告試驗(yàn)中標(biāo)耙的IC50與在H441中針對(duì)內(nèi)源耙獲得的IC50(實(shí)施例3.3)具有相似的數(shù)量級(jí)(10-50pM)，這表明對(duì)于ND8356、ND8357和ND8396，在標(biāo)靶序列上的效力比在任何預(yù)測(cè)的脫靶序列上高至少1000-5000倍。實(shí)施例3.8:基因毒性譜細(xì)胞毒性測(cè)定通過使用細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目來測(cè)定細(xì)胞毒性。眾所周知，在體外檢測(cè)細(xì)胞毒性濃度可誘導(dǎo)基因毒性效應(yīng)，例如微核形成。因此，如果在顯示至多中等毒性的濃度下未能觀察到劑量依賴性的微核化細(xì)胞的增加，則我們認(rèn)為在大約50%或更少細(xì)胞計(jì)數(shù)(與并行的陰性對(duì)照相比較)出現(xiàn)的包含微核的細(xì)胞的數(shù)目增加是與細(xì)胞毒性相關(guān)的。管理體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)的指南(用于執(zhí)行染色體畸變?cè)囼?yàn)的0ECD和ICH指南)要求分析顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)至少50%降低的濃度。此外，0ECD方案要求檢測(cè)無毒化合物以包括至少一個(gè)陡降濃度(precipitatingconcentration)(只要該濃度不超過10mM或5mg/ml，無論哪一個(gè)更低)。因?yàn)轶w外微核試驗(yàn)旨在預(yù)測(cè)該規(guī)制試驗(yàn)，即體外染色體畸變?cè)囼?yàn)，的結(jié)果，因此該體外微核試驗(yàn)的方案經(jīng)設(shè)計(jì)以滿足這些試驗(yàn)的要求。試驗(yàn)系統(tǒng)TK6細(xì)胞是EB病毒(Ebstein-Barr-Virus)轉(zhuǎn)染的和永生化的細(xì)胞(來源于脾臟的人類淋巴母細(xì)胞來源)。在使用/不使用來自雄性大鼠(Aroclor1254-預(yù)處理的)的S9-肝勻漿物(2%)的情況下，使用TK6細(xì)胞在體外微核試驗(yàn)中測(cè)定誘裂潛力和/或致非整倍性潛力。處理時(shí)間20小時(shí)(-S9)，3小時(shí)(+S9)。取樣時(shí)間在3小時(shí)的處理開始后24小時(shí)，在20小時(shí)的處理開始后48小時(shí)。對(duì)于每一種物質(zhì)，分析至少3個(gè)濃度(每濃度2個(gè)培養(yǎng)物)和每濃度2000個(gè)細(xì)胞。如果微核化細(xì)胞的頻率參>=2%并且顯示是并行溶劑對(duì)照值的至少加倍，或參<2%并且顯示超過并行溶劑對(duì)照值至少3倍的增加，則受試濃度的微核誘導(dǎo)效應(yīng)被認(rèn)為是陽性的。為得出一個(gè)實(shí)驗(yàn)為陽性的結(jié)論，必須考慮劑量-效應(yīng)關(guān)系和細(xì)胞毒性?？偨Y(jié)前驅(qū)治療性序列ND8396、ND8356、ND8357既不在無代謝活化的20小時(shí)處理后誘導(dǎo)包含微核的細(xì)胞的數(shù)目增加，也不在使用或不使用S9的3小時(shí)處理后誘導(dǎo)包含微核的細(xì)胞的數(shù)目增加。直至達(dá)到5mg/ml的檢測(cè)限，未能分析到細(xì)胞毒性濃度。實(shí)施例3.9H441中的體外功效ND8396為了證明前驅(qū)siRNA抗a-ENaC的體外功效，用siRNA轉(zhuǎn)染H441細(xì)胞，并預(yù)備該細(xì)胞用于離子轉(zhuǎn)運(yùn)的Ussingschamber分析。為了轉(zhuǎn)染，將H441細(xì)胞在補(bǔ)充有200nM地塞米松的培養(yǎng)基中以2x1(f個(gè)細(xì)胞/瓶接種T25培養(yǎng)瓶。每瓶用ND8396或非靶向性對(duì)照siRNA(以30nMsiRNA)和4mL/mLLipofectamine2000在5mL(無血清培養(yǎng)基)總體積中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后l天，將細(xì)胞在匯合下種在lcm2Sn即well插片(insert)上(2xl(f個(gè)細(xì)胞/插片)，以使分化和形成緊密連接所需的時(shí)間減少至最少，在頂和底外側(cè)小室中提供培養(yǎng)基，在又培養(yǎng)一天后，移去頂培養(yǎng)基，更換底外側(cè)的培養(yǎng)基，由此將細(xì)胞置于氣_液界面(ALI)培養(yǎng)。在進(jìn)行離子轉(zhuǎn)運(yùn)分析前將細(xì)胞在ALI再維持6天。為了在Ussingschamber中進(jìn)行功會(huì)g分析，將S卿well插片置于VerticalDiffusionChambers(Costar)中，用維持在37°C的持續(xù)通氣的林格液(5%C02于02中；pH7.4)浸浴，該林格液包含120mMNaCl，25mMNaHC03，3.3mMKH2P04，0.8mMK2HP04，1.2mMCaC12，1.2mMMgC12和10mM葡萄糖。溶液的滲透摩爾濃度經(jīng)測(cè)定在280至300mosmol/kgH20的范圍內(nèi)。對(duì)細(xì)胞實(shí)施電壓鉗至0mV(EVC4000型；WPI)。通過以30秒間隔施用1或2-mV的脈沖，或使用跨細(xì)胞的初始電位差以及測(cè)量的初始電流，然后利用歐姆定律計(jì)算RT，測(cè)量了跨上皮電阻(RT)。使用PowerLab工作站(ADInstr咖ents)記錄數(shù)據(jù)。在siRNA處理后，記錄細(xì)胞的基礎(chǔ)特征和氨氯吡嗪脒敏感性的短路電流(在應(yīng)用10yM氨氯吡嗪脒后的Isc;僅頂側(cè))。在每一種情況下，通過氨氯吡嗪脒敏感性Ise，確定了各培養(yǎng)物的ENaC通道活性。在試驗(yàn)后，將各插片上的細(xì)胞分別裂解用于RNA分析。測(cè)定時(shí)RNA水平的75X降低(ND8396相比于非靶向性對(duì)照)與大約30%的氨氯吡嗪脒敏感性電流的功能性降低(ND8396相比于非耙向性對(duì)照)相關(guān)。下面使用標(biāo)準(zhǔn)命名法，特別地表A中的縮寫來表示核酸序列。表A:用于核酸序列表示的核苷酸單體的縮寫。要理解，這些單體，當(dāng)存在于寡核苷酸中時(shí)，相互之間通過'_3'-磷酸二酯鍵連接。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表1A:起始篩選組中的選擇的siRNA(人-恒河猴a-ENaC交叉反應(yīng)性siRNA)?？偣?52個(gè)iRNA序列被鑒定為起始篩選組，具有(序列鏈1-304)和不具有(序列鏈305-608)主鏈修飾。按照實(shí)施例部分描述的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，iRNA序列經(jīng)設(shè)計(jì)與人和恒河猴a-ENaC序列兩者完全互補(bǔ)。顯示了兩個(gè)獨(dú)立單劑量轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的a-ENaC殘留表達(dá)百分?jǐn)?shù)(關(guān)于使用的方法參看實(shí)施例部分)。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>[O449]表IB:擴(kuò)展篩選組中的選擇的siRNA("僅人"siRNA)。鑒定了另外344個(gè)iRNA序列，按照實(shí)施例部分描述的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，其經(jīng)設(shè)計(jì)與人a-ENaC序列完全互補(bǔ)。該篩選組中所61<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>isJif>fJvrsnv.fr33v.33f>:3;D一。6SiJisJ;SSUD§.n:Dr50nvovnu;Djsssjc;守9rolcs一列的所有siRNA只具顯示了在單劑量轉(zhuǎn)染<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>有在每鏈的核苷酸20和21之間的3'-末端硫代磷酸酯連接修飾。試驗(yàn)中a-ENaC的殘留表達(dá)百分比(關(guān)于所用方法參看實(shí)施例部分)。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表1D:體內(nèi)豚鼠替代物組中的選擇的siRNA(人-豚鼠交叉反應(yīng)siRNA)。鑒定和合成了具有63個(gè)人和豚鼠交叉反應(yīng)性a-ENaCiRNA序列的篩選組，具有(序列鏈1393-1518)和不具有(序列鏈1519-1644)主鏈修飾。顯示了兩個(gè)獨(dú)立的單劑量轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中a-ENaC的殘留表達(dá)百分比(關(guān)于所用方法參看實(shí)施例部分)。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表2A:表1A的示例性iRNA試劑的50%抑制濃度(IC50)<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>Duplex標(biāo)識(shí)符%原代HBEC中食蟹猴a-ENaC表達(dá)(對(duì)a-ENaC表達(dá)(對(duì)照照的％)45nMsiRNA的％)50nMsiRNA未轉(zhuǎn)染的77.2n/a非靶向性對(duì)照10093.3陰性對(duì)照(非食蟹猴n/a100a-ENaC)ND8449ND-830230.257ND-833224.754.3ND-834840.156.2ND-835636.655.8ND-835729.650.4ND-837330.453.8ND-838132.540.4ND-839634.146.3ND-845045.978.9ND-845330.155.權(quán)利要求包含有義鏈和反義鏈的iRNA試劑，其中有義鏈包含與表1A-1D中提供的編號(hào)為ND8285-ND10788的試劑之任一的有義鏈序列相異不超過1、2或3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其中反義鏈包含與表1A-1D中提供的編號(hào)為ND8285-ND10788的試劑之任一的反義序列相異不超過1、2或3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。2.包含有義鏈和反義鏈的iRNA試劑，其中有義鏈包含與表1A-1D中提供的編號(hào)為ND8285-ND10788的試劑之任一的有義鏈序列相異不超過1、2或3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，其中反義鏈包含表1A-1D中提供的編號(hào)為ND8285-ND10788的試劑之任一的反義序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，并且其中該iRNA試劑，與未與該iRNA試劑一起溫育的細(xì)胞相比，使a-ENaC的表達(dá)減少20%，30%，40%，50%，60%，70%或80%以上。3.包含有義鏈和反義鏈的iRNA試劑，所述有義鏈和反義鏈各自包含至少16、17或18個(gè)核苷酸的序列，所述核苷酸序列，除了每鏈不超過1、2或3個(gè)核苷酸分別被其他核苷酸置換外，與表1A-1D中提供的編號(hào)為ND8285-ND10788的試劑之任一的序列之一基本相同，同時(shí)基本上保留在細(xì)胞中減少a-ENaC表達(dá)的量的能力。4.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其中所述試劑選自ND-8302,ND-8332,ND-8348,ND-8356,ND-8357,ND-8373,ND-8381,ND-8396,ND-8450和ND_8453。5.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其中所述試劑選自ND-8356,ND-8357和ND-8396。6.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其中反義RNA鏈在長度上是30個(gè)或更少的核苷酸，并且所述iRNA試劑的雙鏈體區(qū)域在長度上是15-30個(gè)核苷酸對(duì)。7.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其包含引起所述iRNA試劑在生物樣品中具有增加的穩(wěn)定性的修飾。8.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其包含硫代磷酸酯或2'-修飾的核苷酸。9.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其包含至少一個(gè)其中尿苷是2'-修飾的核苷酸的5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-im-3')二核苷酸；至少一個(gè)其中5'-尿苷是2'-修飾的核苷酸的5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸；至少一個(gè)其中5'-胞苷是2'-修飾的核苷酸的5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸；或至少一個(gè)其中5'-尿苷是2'_修飾的核苷酸的5'-尿苷-尿苷_3'(5'-uu-3')二核苷酸。10.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其中2'-修飾選自2'-脫氧、2'-脫氧-2'-氟、2'-0-甲基、2'_0-甲氧基乙基(2'-0-M0E)、2'_0-氨基丙基(2'-0-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-0-DMA0E)、2'_0_二甲基氨基丙基(2'-0-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-0-DMAE0E)和2'-0-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)。11.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其包含具有1至4個(gè)未配對(duì)的核苷酸的核苷酸突出端。12.權(quán)利要求ll的iRNA試劑，其中核苷酸突出端具有2或3個(gè)未配對(duì)的核苷酸。13.權(quán)利要求11的iRNA試劑，其中核苷酸突出端在所述iRNA試劑的反義鏈的3'末丄山順。14.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其包含上皮受體配體。15.權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑，其中iRNA試劑被靶向以被肺細(xì)胞攝取。16.治療具有至少部分由a-ENaC表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的人受試者的方法，其中iRNA試劑包含有義鏈，其中有義鏈包含與權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)中提供的任一試劑的有義鏈序列相異不超過1、2或3個(gè)核苷酸的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。17.權(quán)利要求16的方法，其中以充分地降低a-ENaC在受試者的細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平的量施用iRNA試劑。18.—種藥物組合物，其包含a.)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑；禾口b.)藥學(xué)上可接受的載體。19.治療患有囊性纖維化的人受試者的方法，該方法包括對(duì)所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑。20.治療患有利德爾綜合征的人受試者的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑。21.治療和/或預(yù)防人受試者中高血壓和/或腎機(jī)能不全的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑。22.治療和/或預(yù)防人受試者中電解質(zhì)失衡的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的iRNA試劑。全文摘要本發(fā)明涉及通過化學(xué)修飾的寡核苷酸調(diào)節(jié)α-ENaC的表達(dá)，更具體地下調(diào)α-ENaC的表達(dá)的組合物和方法。文檔編號(hào)A61K31/713GK101778941SQ200880103262公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者A·蓋克,E·?？寺?G·范黑克,H·L·達(dá)納哈伊,H-P·沃恩洛赫爾,P·丹申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司