專利名稱：：G-csf綴合物的液體制劑的制作方法G-CSF綴合物的液體制劑本發(fā)明涉及一種包含與聚合物綴合的粒細(xì)胞集落刺激因子多肽的液體藥物組合物，組合物的PH值在4.5至5.5的范圍內(nèi)。該組合物還包含表面活性劑，以及任選地包含一種或多種其他可藥用的輔料。此外，本發(fā)明組合物不含作為緩沖劑的酒石酸或其鹽、和琥珀酸及其鹽，并且不含作為穩(wěn)定劑的氨基酸。該組合物具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且特別用于預(yù)防和治療認(rèn)為使用粒細(xì)胞集落刺激因子制劑治療有用的疾病和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，刺激造血前體細(xì)胞的增殖和分化，以及嗜中性粒細(xì)胞的活化。G-CSF能夠在體內(nèi)或體外支持嗜中性粒細(xì)胞的增殖。來自日本和美國的小組于1986年克隆了人形式的G-CSF(見如Nagata等人，Nature319415-418，1986)。這種天然人類糖蛋白以兩種形式存在，一種具有174個(gè)氨基酸，另一種具有177個(gè)氨基酸。豐度更高和活性更高的174個(gè)氨基酸形式已用于通過重組DNA技術(shù)開發(fā)藥物產(chǎn)品。重組G-CSF已在基因工程大腸桿菌(Escherichiacoli)中大量生產(chǎn)，并已成功地用于臨床應(yīng)用，以治療由于化學(xué)療法導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少的癌癥患者。大腸桿菌生產(chǎn)的G-CSF是一種在其N端包含額外甲硫氨酸的175個(gè)氨基酸的多肽鏈。該蛋白質(zhì)通過在E.coli中表達(dá)G-CSF基因，并純化蛋白質(zhì)產(chǎn)品至同質(zhì)性來生產(chǎn)。該蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)，具有5個(gè)半胱氨酸殘基，其中有4個(gè)形成二硫鍵。游離的半胱氨酸殘基通常與在溶液中存儲(chǔ)時(shí)形成更高分子量的聚集物有關(guān)。蛋白質(zhì)聚集物也可通過蛋白質(zhì)氧化形式形成，其中蛋白質(zhì)氧化形式通過蛋白質(zhì)一級(jí)序列內(nèi)部甲硫氨酸殘基的氧化產(chǎn)生。在四個(gè)甲硫氨酸殘基中，一個(gè)位于N端，另外三個(gè)在序列內(nèi)部。包含122位氧化態(tài)甲硫氨酸的蛋白質(zhì)氧化形式，能夠通過常規(guī)反相HPLC分離程序從包含127位或138位氧化態(tài)甲硫氨酸的形式以及天然蛋白質(zhì)中分離出來(用由175個(gè)氨基酸組成的甲硫氨酰-G-CSF計(jì)算位置)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中合成的重組人G-CSF稱為非格司亭(國際非專有名稱，INN)。非格司亭的結(jié)構(gòu)與天然糖蛋白略有不同。重組人G-CSF的另一種形式稱為來格司亭(INN)，是在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中合成的。非格司亭和來格司亭在歐洲市場的商品名分另|J為Neupogen禾口Granocyt。然而，市售重組人G-CSF形式具有短期藥理學(xué)作用，必須在白細(xì)胞減少狀態(tài)期間多于每天一次地經(jīng)常施用。具有更長循環(huán)半衰期的分子可減少減輕白細(xì)胞減少和預(yù)防后續(xù)感染必要的給藥次數(shù)。目前可用的重組人G-CSF產(chǎn)品的另一問題是劑量依賴性骨痛的發(fā)生。由于骨痛作為重組人G-CSF治療的明顯副作用為病人所體驗(yàn)，因此希望提供一種不引起骨痛的重組人G-CSF產(chǎn)品，或借助于本身不具這種作用的產(chǎn)品，或借助于在不引起骨痛或至少減少骨痛的足夠小的劑量下有效的產(chǎn)品。因此，明顯存在對(duì)改進(jìn)型重組G-CSF分子的需要，以及對(duì)包含G-CSF分子的穩(wěn)定的隨時(shí)可用藥物制劑的需要。已報(bào)道了人G-CSF的蛋白質(zhì)工程變體，例如G-CSF變體在W001/87925，EPO456200A,US6，166，183，US6，004，548，US5,580，755，US5，582，823，US5，675，941，US5，416，195，US5,399，345，WO2005/055946和WO2006/074467中有描述。還報(bào)道了與天然多肽相比引入了至少一條附加糖鏈的人G-CSF和其他多肽的修飾(美國5，218，092)。此外，已報(bào)道和研究了天然人G-CSF的聚合物修飾，包括連接聚乙二醇(PEG)基團(tuán)(美國專利號(hào)5，824，778、美國5，824，784、WO96/11953、WO95/21629和W094/20069)。在改進(jìn)糖蛋白藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的嘗試中，將合成聚合物連接至肽主鏈為本領(lǐng)域公知。PEG是已結(jié)合至肽的示例性聚合物。已表明用PEG衍生肽治療劑可降低肽的免疫原性。例如，美國專利號(hào)4，179，337公開了非免疫原性多肽，如偶聯(lián)至PEG或聚丙二醇(PPG)的酶和肽類激素。除降低免疫原性外，由于所述多肽的PEG綴合物尺寸增加，還延長了循環(huán)清除時(shí)間。在改進(jìn)糖蛋白藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的嘗試中，將合成聚合物連接至肽主鏈為本領(lǐng)域公知。聚乙二醇(PEG)是已結(jié)合至肽的示例性聚合物。已表明用PEG衍生肽治療劑可降低肽的免疫原性。例如，美國專利號(hào)4，179，337公開了非免疫原性多肽，如偶聯(lián)至聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的酶和肽類激素。除降低免疫原性外，由于所述多肽的PEG綴合物尺寸增加，還延長了循環(huán)清除時(shí)間。培非司亭(INN)是重組甲硫氨?；薌-CSF(非格司亭)和單個(gè)20kDa單甲氧基-PEG-分子的共價(jià)綴合物。單甲氧基-PEG-分子與非格司亭N端甲硫氨?；矁r(jià)結(jié)合。培非司亭在歐洲市場的商品名為Neulasta。將PEG及其衍生物連接至肽的主要方式是通過肽氨基酸殘基的非特異性結(jié)合(見如美國專利號(hào)4，088，538、美國專利號(hào)4，496，689、美國專利號(hào)4，414，147、美國專利號(hào)4，055，635和WO87/00056)。將PEG連接至肽的另一方式是通過糖肽上糖基殘基的非特異性氧化(見如WO94/05332)。在這些非特異性方法中，聚乙二醇以隨機(jī)、非特異的方式加至肽主鏈的反應(yīng)性殘基。PEG分子的隨機(jī)加入具有其缺點(diǎn)，包括終產(chǎn)物缺乏同質(zhì)性和降低肽生物活性或酶活性的可能性。因此，在近幾年的努力中，已開發(fā)更多將合成聚合物或其他標(biāo)記物連接至肽的位點(diǎn)特異的方法，并且已發(fā)現(xiàn)可通過酶的作用在體外生產(chǎn)特異性綴合的同質(zhì)肽類治療劑。這些基于酶的綴合具有區(qū)域選擇性和立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)。用于綴合肽合成的兩類主要的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶(如唾液酸轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)和糖苷酶。這些酶可用于糖的特異性連接，隨后可對(duì)糖進(jìn)行修飾，使其包含治療部分。備選地，可用糖基轉(zhuǎn)移酶和經(jīng)修飾的糖苷酶直接將經(jīng)修飾的糖轉(zhuǎn)移至肽主鏈(見如美國專利6，399，336及美國專利申請(qǐng)公開US2003/0040037、US2004/0132640、US2004/0137557、US2004/0126838和US2004/0142856)。還已知將化學(xué)和酶合成元件相結(jié)合的方法(見如US2004/137557)。將多肽樣G-CSF綴合至聚合物部分如PEG的各種方法是公知的并且被廣泛地描述在現(xiàn)有技術(shù)中。糖聚乙二醇化G-CSF的制備描述在例如WO2005/055946中。另一個(gè)專利申請(qǐng)WO2006/074467是針對(duì)G-CSF和PEG部分之間綴合物的制備的。在這個(gè)方法中，綴合物通過完整的糖基連接基團(tuán)連接，嵌入并共價(jià)連接在G-CSF多肽和修飾基團(tuán)之間。通過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，綴合物可從糖基化的和非糖基化的G-CSF多肽形成。糖基轉(zhuǎn)移酶將修飾的糖部分連接到多肽的氨基酸或糖殘基其中之一上。WO2005/055946和WO2006/074467所公開的內(nèi)容在本
發(fā)明內(nèi)容中做明確參考。除了PEG，也有其他聚合物被描述用于帶有G-CSF和其他治療性蛋白質(zhì)的綴合物。其中，WO02/09766公開了通過生物學(xué)活性蛋白質(zhì)和生物相容性聚合物衍生物綴合產(chǎn)生的生物相容性蛋白質(zhì)-聚合物化合物。使用的生物相容性聚合物為高反應(yīng)活性分支聚合物，并由此產(chǎn)生在聚合物衍生物和蛋白質(zhì)之間包含長連接物的綴合物。根據(jù)WO02/09766，生物相容性聚合物的例子為PEG、PPG、聚氧乙烯(POE)、聚亞丙基二醇、聚乳酸及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物、聚氨基酸、聚氨酯、聚磷腈、聚(L-賴氨酸)、聚環(huán)氧烷(PAO)，水溶性聚合物例如多糖、葡聚糖，以及非免疫原性聚合物例如聚乙烯醇和聚丙烯酰胺。WO94/01483公開了生物學(xué)惰性聚合物或聚合物衍生物和藥學(xué)純的合成親水性聚合物通過特殊類型化學(xué)鍵的共價(jià)結(jié)合形成的生物相容性聚合物綴合物。作為自然存在的聚合物及其衍生物，多糖例如透明質(zhì)酸，蛋白聚糖例如硫酸軟骨素A、B和C，甲殼質(zhì)，肝素，硫酸肝素，葡聚糖例如環(huán)糊精、羥乙基纖維素、纖維素醚和淀粉，脂質(zhì)例如甘油三酯和磷脂都已被公開。WO96/11953描述了N-端化學(xué)修飾蛋白質(zhì)化合物及其生產(chǎn)方法。具體的說，所述G-CSF組合物由偶聯(lián)水溶性聚合物至G-CSF的N端產(chǎn)生。列舉在WO96/11953中的水溶性聚合物的例子為乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、多聚氨基酸(既可以是均聚物也可以是無規(guī)共聚物)、聚(η-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、PPG均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、或聚氧乙烯多元醇。WO97/30148描述了減少變應(yīng)原性的多肽綴合物，其包含具有兩個(gè)或多個(gè)偶聯(lián)于其上的多肽分子的聚合物載體分子。這些綴合物通過活化聚合物載體分子，使兩個(gè)或多個(gè)多肽分子與活化聚合物載體分子反應(yīng)，并阻斷綴合物上殘留的活化基團(tuán)來制備。WO97/30148列舉了多種聚合物載體分子，包括自然的或合成的均聚物例如多元醇、多胺、多羧酸，以及包含至少兩個(gè)不同附著基團(tuán)的雜聚物。所給的例子包含星型PEG、分支PEG、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚-D，L-氨基酸。WO97/30148的綴合物還包括那些含有葡聚糖，例如羧甲基葡聚糖，纖維素例如羥乙基纖維素或羥丙基纖維素，殼聚糖水解物，淀粉例如羥乙基淀粉或羥丙基淀粉，糖原，瓊脂糖，瓜爾膠，菊糖，支鏈淀粉，黃原膠，角叉膠，果膠，海藻酸等的綴合物。WO03/074087涉及將蛋白質(zhì)偶聯(lián)至淀粉衍生的變性多糖的方法。蛋白質(zhì)和多糖、羥烷基淀粉之間的結(jié)合反應(yīng)，為一種在末端醛基、或由所述羥基烷基淀粉分子終端醛基的化學(xué)修飾所產(chǎn)生的功能基團(tuán)，與蛋白質(zhì)功能基團(tuán)之間所形成的的共價(jià)連接。作為蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)，氨基、硫代基和羧基都已被公開。WO2005/014050描述了羥烷基淀粉(HAS)和G-CSF蛋白的綴合物的制備，其中聚合物或其衍生物的至少一個(gè)功能基團(tuán)與蛋白質(zhì)的至少一個(gè)功能基團(tuán)反應(yīng)，從而形成共價(jià)連接。其他涉及多肽的羥烷基淀粉化，優(yōu)選羥乙基淀粉化的現(xiàn)有技術(shù)文件為WO2005/014655,W02005/092390,WO2007/031266,WO2005/092928和WO2005/092391。雖然通過聚合物部分修飾治療性多肽例如G-CSF以延長其清除時(shí)間和降低免疫原性的若干方法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述，為這樣的聚合物-G-CSF綴合物研發(fā)有利制劑的工作似乎還鮮有所成。上述Neulasta產(chǎn)品為用于皮下注射的液體組合物。該制劑包括培非司亭、乙酸鈉、山梨糖醇、聚山梨酸酯20和注射用水，并有4.0的pH值(見http://WWW.neulasta.com和ROTELISTE2007)。NeulaSta禾口NeilpOgen產(chǎn)品都通過Amgen進(jìn)入市場，其溶液的緩沖劑、賦形劑和PH值幾乎是相同的Neupogen包含非格司亭(而不是培非司亭)、乙酸鈉、山梨糖醇、聚山梨酸酯20和注射用水，也具有4.0的pH值(見httD://V驟.neupogen.com禾口ROTELISTE2007)。本發(fā)明是針對(duì)包含聚合物-G-CSF綴合物的液體藥物組合物，其中，專門開發(fā)該組合物以考慮到聚合物-G-CSF綴合物的特點(diǎn)。雖然現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道了幾種關(guān)于包含非綴合G-CSF的制劑的方法，但是很少有已知的關(guān)于聚合物-G-CSF綴合物的有用的制劑。雖然一些為了非綴合G-CSF開發(fā)的藥物組合物出現(xiàn)在專利文獻(xiàn)中，以這樣的方式，其包含將非綴合G-CSF取代為PEG-G-CSF綴合物的制劑，很顯然該組合物是只為非綴合G-CSF定制或測(cè)試的。例如，WO2005/042024描述了包含G-CSF的穩(wěn)定的藥物組合物，其中組合物具有高于4.0的pH值，并且還包含一種酸，但是沒有表面活性劑。盡管描述于WO2005/042024的藥物組合物顯然是為非綴合G-CSF開發(fā)的，在其說明書中也提到了其也包含用PEG或其相似物化學(xué)修飾過的G-CSF，表現(xiàn)出同樣的或改進(jìn)的生物學(xué)活性。另一個(gè)例子是WO2005/039620，其也是針對(duì)穩(wěn)定的水性的包含G-CSF的組合物。該組合物包含作為緩沖劑的琥珀酸或酒石酸或其鹽，并且具有優(yōu)選范圍在4.0和5.8的pH值。根據(jù)說明書，G-CSF蛋白質(zhì)也可以經(jīng)合成修飾，例如，通過酶促糖基化或化學(xué)聚乙二醇化。EP1260230A1公開了包含色氨酸作為穩(wěn)定劑的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑。蛋白質(zhì)列表包括G-CSF，以及用PEG或其相似物化學(xué)修飾的G-CSF。所述G-CSF制劑優(yōu)選具有5_7的PH值，更優(yōu)選為6.0-6.7。另一個(gè)例子是EP1336410A1，其描述了包含生理活性蛋白質(zhì)作為活性成分，以及至少一種糖作為安撫劑的可注射的藥物制劑，并且具有6.5-7.4的pH值。同樣是在這種情況下，其提及到了包含用PEG或其相似物化學(xué)修飾的G-CSF。EP1329224A1描述了一種G-CSF溶液制劑，其包含至少一種作為穩(wěn)定劑的氨基酸或其鹽，優(yōu)選甲硫氨酸。G-CSF溶液制劑優(yōu)選具有5-7的pH值，更優(yōu)選為5.5-6.8。同樣，用PEG或其相似物化學(xué)修飾的G-CSF也包括在內(nèi)。但是，在現(xiàn)有技術(shù)中公開的制劑沒有一個(gè)是特定的聚合物-G-CSF-綴合物制劑。相反，在專利文獻(xiàn)中描述的溶液僅僅是為了非綴合G-CSF開發(fā)和測(cè)試的。本發(fā)明的基本問題是提供聚合物-G-CSF-綴合物組合物，其適合這種綴合物，并且在高溫下穩(wěn)定，即，高于通常在2至8°C之間的冰箱溫度。此外，發(fā)明的目標(biāo)是提供一種藥物組合物，其在制備的任何階段不需要重構(gòu)，并在對(duì)患者給藥時(shí)引起盡可能小的刺激。根據(jù)本發(fā)明，這些問題通過提供包含聚合物-G-CSF綴合物的水性藥物組合物解決，該組合物具有4.5至5.5范圍內(nèi)的pH值。根據(jù)本發(fā)明的水溶液制劑包含表面活性劑和任選的一種或多種其他的可藥用的賦形劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物沒有作為穩(wěn)定劑的氨基酸或其衍生物或其鹽，沒有作為緩沖劑的酒石酸或其鹽、和琥珀酸或其鹽。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，在具有4.5至5.5范圍內(nèi)，優(yōu)選5.0的pH值的組合物中配制聚合物-G-CSF綴合物，能防止綴合鍵的酸水解。這個(gè)pH范圍改進(jìn)了溶液在溫度高于冰箱溫度(2-8°C)，特別是在室溫(即低于25°C)，甚至在較高溫度(例如40°C)時(shí)的穩(wěn)定性。這意味著該組合物能夠不經(jīng)冷卻地儲(chǔ)存很長一段時(shí)間，而活性沒有明顯損失，且沒有明顯的降解。此外，不論儲(chǔ)存穩(wěn)定性，根據(jù)本發(fā)明的組合物與pH為4.0的可比較組合物相比是有利的，因?yàn)樵趯?duì)患者給藥時(shí)，組合物中更少的酸性能引起更少的刺激。除非另有指明，以下定義是用以說明和定義用于本發(fā)明描述的不同術(shù)語的意思和范圍。術(shù)語“聚合物-G-CSF綴合物，，指G-CSF多肽和聚合物之間的綴合物，其中綴合物通過聚合物功能基團(tuán)和多肽功能基團(tuán)之間的共價(jià)連接形成。該綴合物可以包含一個(gè)或多個(gè)聚合物部分。術(shù)語〃G-CSF"(或G-CSF多肽或G-CSF蛋白質(zhì)或G-CSF肽)指具有自然存在的人G-CSF的體內(nèi)生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即能刺激造血祖細(xì)胞分化和增殖的蛋白質(zhì)。根據(jù)描述-f'Stute,N.^Α"Pharmacokineticsofsubcutaneousrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorinchildren，，(1992)Blood79(11)，第2849-2854頁的分析方法，該G-CSF能夠被準(zhǔn)確的鑒定為G-CSF。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，G-CSF具有根據(jù)下列SEQIDNO:1或SEQIDNO2的氨基酸序列，其中SEQIDN0:1描述了在大腸桿菌中生產(chǎn)的人甲硫氨酰-G-CSF的野生型氨基酸序列，SEQIDNO:2描述了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的人-G-CSF的氨基酸序列。SEQIDNO:1為175個(gè)氨基酸的變體，其中第一個(gè)氨基酸為甲硫氨酸，并且在Thr134位為蘇氨酸。SEQIDNO:2為174個(gè)氨基酸的變體，其與175個(gè)氨基酸的變體具有同樣的序列，除了沒有為首的甲硫氨酸，因此該序列從T開始，并且其133位為蘇氨酸殘基。SEQIDNO1MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(175個(gè)氨基酸)SEQIDNO2TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(174個(gè)氨基酸)熟練技術(shù)人員將很容易領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明并不局限于描述于此的序列，并且還包括G-CSF變體。這種變體是本領(lǐng)域所熟知的。它們可以包含在上述氨基酸序列中缺失、替換或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而保持自然存在的G-CSF的生物學(xué)活性。作為例子，但絕不意味著限制本發(fā)明，G-CSF變體在WO01/87925，EP0456200A,US6，166，183，US6,004，548，US5,580,755,US5,582,823,US5,675,941,US5,416,195,US5,399,345,WO2005/055946和WO2006/074467中有描述。G-CSF多肽可以是糖基化或未糖基化的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該G-CSF多肽為在大腸桿菌中生產(chǎn)的重組人G-CSF，即具有描述于上述SEQIDNO1或其變體的氨基酸序列。聚合物可為能夠共價(jià)結(jié)合G-CSF多肽、并且當(dāng)共價(jià)結(jié)合G-CSF多肽時(shí)產(chǎn)生有治療作用聚合物-G-CSF綴合物的任何聚合物。若干適合的聚合物已經(jīng)在前面的導(dǎo)言部分提及過，這些包括聚(烷基二醇類)例如PEG和PPG，羥烷基淀粉類例如羥乙基淀粉(HES)，以及在TO02/09766,WO96/11953和WO97/30148中有關(guān)連接聚合物多肽綴合物的聚合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物為PEG。在下列關(guān)于綴合物使用的所有mg/ml濃度規(guī)格只與G-CSF部分相關(guān)。依定義PEG部分不考慮在質(zhì)量濃度中。雖然非格司亭具有大約18_19kD的分子量，由于單甲氧基-PEG部分，聚乙二醇非格司亭的分子量要大很多，具有大約39kD的分子量。本發(fā)明的聚合物-G-CSF綴合物可以具有20至60kD范圍內(nèi)的分子量，優(yōu)選35至45kD范圍內(nèi)?，F(xiàn)有技術(shù)中已公開有合適的PEG，例如在WO2005/055946,W02006/074467和WO01/87329中。PEG部分可以是線性的或分支的，并且具有5至40kD的大小。優(yōu)選的，PEG部分具有15至25kD的分子量，更優(yōu)選大約20kD。生產(chǎn)聚合物-G-CSF綴合物的方法也已經(jīng)描述于現(xiàn)有技術(shù)中。上述與在多肽和聚合物部分之間制備綴合物有關(guān)的文件也包含于此作為參考。在本發(fā)明中有用的其他聚合物-G-CSF綴合物詳細(xì)描述于W096/11953，EP822199A，W001/51510,WO2006/0128460,EP921131A和EP744409中。這些文件所描述的公開內(nèi)容，即綴合物和生產(chǎn)它們的方法，一并明確參考。熟練技術(shù)人員將很容易領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明并不局限于其中的聚合物例如PEG或HES直接連接到蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的綴合物，而且還包括其中的聚合物部分和G-CSF多肽通過連接物相互連接的綴合物。例如，介于多肽和PEG部分之間的糖基連接基團(tuán)就是本發(fā)明綴合物中有用的連接物。WO2006/074467描述了這種聚合物-G-CSF綴合物，其G-CSF多肽和聚合物部分通過糖基連接物或非糖基連接物(例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基)連接。WO2006/074467的公開內(nèi)容在此明確包含作為參考。術(shù)語“PEG-G-CSF"(聚乙二醇化-G-CSF)指如下述與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇部分共價(jià)連接的G-CSF蛋白質(zhì)。PEG基團(tuán)和G-CSF蛋白質(zhì)既可以相互直接連接，也可以通過連接物，例如糖基連接物連接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物-G-CSF肽綴合物根據(jù)描述于WO2006/074467的方法制備。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物-G-CSF肽是具有糖基連接基團(tuán)的PEG-G-CSF綴合物，其中糖基連接基團(tuán)介于PEG修飾部分和G-CSF多肽之間。這樣的綴合物被稱為“糖聚乙二醇化(glycopeglyated)"G-CSF0在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明〃糖聚乙二醇化〃的G-CSF分子通過酶介導(dǎo)在糖基化或非糖基化G-CSF肽和可酶促轉(zhuǎn)移的糖基部分之間形成綴合物，可酶促轉(zhuǎn)移的糖基部分結(jié)構(gòu)中包括聚乙二醇部分。PEG部分直接連接至糖基部分(即通過兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)形成的單個(gè)基團(tuán))，或通過連接物部分，例如取代或未取代的烷基、取代或未取代雜烷基等連接。糖基連接基團(tuán)可為具有PEG的衍生的唾液酸部分。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖基連接物通過0-糖基化與G-CSF蛋白質(zhì)結(jié)合，優(yōu)選通過G-CSF蛋白質(zhì)蘇氨酸殘基的0-糖基化。糖基連接物優(yōu)選包含單糖、雙糖或寡糖，更優(yōu)選糖基連接物包含唾液酸和N-乙酰半乳糖胺。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物-G-CSF肽綴合物包含以下部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R1為包含直鏈或分支的聚乙二醇?xì)埢牟糠?；并且L為連接物，其選自鍵、取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基的成員；并且其中肽是以糖殘基糖基化的，并且該部分與糖殘基共價(jià)結(jié)合。糖殘基優(yōu)選N-乙酰半乳糖胺。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，G-CSF肽在蘇氨酸殘基處糖基化，優(yōu)選在134位的蘇氨酸殘基處(以甲硫氨酰-G-CSF計(jì)算，即具有N端甲硫氨酸，總計(jì)175個(gè)氨基酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為直鏈聚乙二醇?xì)埢?，并且L為雜烷基。上述G-CSF肽綴合物可以根據(jù)這樣的方法制備，包括(a)將底物G-CSF肽與具有下式的PEG-唾液酸的供體、和具有將PEG-唾液酸部分從供體轉(zhuǎn)移至底物G-CSF肽糖殘基上的能力的酶相接觸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R1和L如上定義。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶為唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如描述于WO2005/055946的ST6GalNAcI。上述G-CSF肽綴合物可以根據(jù)這樣的方法制備，包括(a)將非糖基化的底物G-CSF肽與糖基供體、和具有將糖基部分從供體轉(zhuǎn)移至底物G-CSF肽上的能力的酶相接觸，(b)將糖基化的G-CSF肽與具有下式的PEG-唾液酸的供體、和具有將PEG-唾液酸部分從供體轉(zhuǎn)移至底物G-CSF肽的糖殘基上的能力的酶相接觸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中隊(duì)和！^如上定義，(a)和(b)為相繼或同時(shí)的反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖基供體為UDP-N-乙酰半乳糖胺。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，(a)中的酶為N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶，(b)中的酶為唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如(a)中為GalNAcT2、(b)中為ST6GalNAcI。G-CSF可通過化學(xué)合成程序生產(chǎn)，或可為任何人或其他哺乳動(dòng)物來源并可通過從自然存在的來源例如人胎盤、人血或人尿中純化獲得。此外，許多上皮癌、急性髓樣細(xì)胞白血病細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞系有能力表達(dá)這個(gè)因子。優(yōu)選地，G-CSF為重組生產(chǎn)。這包括通過基因組或cDNA克隆或DNA合成獲得的外源DNA序列的原核或真核宿主表達(dá)。適合的原核宿主包括各種細(xì)菌，例如優(yōu)選的宿主大腸桿菌。適合的真核宿主包括酵母例如釀酒酵母(S.cerevisiae)，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和猴子細(xì)胞。蛋白質(zhì)例如G-CSF的重組生產(chǎn)在本領(lǐng)域是眾所周知的。通常來說，這包括用適當(dāng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，和將蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中純化。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)見例如Souza，L.M.等人，1986，Recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactor:effectsonnormalandleukemicmyeloidcells,Science(1986)23261-65；Nagata,S.等人，1986,MolecularcloningandexpressionofcDNAforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor,Nature(1986)319415-418；Komatsu,Y.等人，1987，Cloningofgranulocytecolony-stimulatingfactorcDNAfromhumanmacrophagesanditsexpressioninEscherichiacoli,Jpn.J.CancerRes.(1987)78:1179-1181。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，G-CSF具有人成熟G-CSF的氨基酸序列(見例如Nagata,S.等人(1986)，見上)，并且可以在其氨基端還包含甲硫氨酸，而產(chǎn)生175個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(見上面SEQIDNO:1)。此外，G-CSF可以包含絲氨酸或蘇氨酸殘基，而不是甲硫氨酸。該蛋白質(zhì)然后根據(jù)傳統(tǒng)下游加工程序純化。適合的G-CSF純化方法描述于現(xiàn)有技術(shù)中，例如在wo87/01132，epo719860a，ep1458757a，ep1527188a,w003/051922，WO01/04154和WO2006/097944中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物-G-CSF肽綴合物按在此提供的實(shí)施例1所描述的制備。這種綴合物特征在于G-CSF多肽和PEG部分通過N-乙酰半乳糖胺基(GalNAc)基團(tuán)和唾液酸(SA)基團(tuán)連接。該綴合物具有如下G-CSF-GalNAc-SA-PEG的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R1和L如上定義，并且AA為G-CSF的氨基酸殘基。在示例性實(shí)施方案中，Rl為通過唾液酸基團(tuán)和GalNAc基團(tuán)連接至的G-CSF多肽上的線性PEG部分，如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中L如上定義，并且AA為G-CSF的氨基酸殘基；并且f為選自1至2500的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，聚合物G-CSF綴合物具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中AA為G-CSF的蘇氨酸133(如N端有甲硫氨酸則為蘇氨酸134)；f為選自1至2500的整數(shù)。本發(fā)明的藥物制劑是液體組合物，例如水溶液。為了注射目的，優(yōu)選使用純凈水為溶劑。但是其他適合的且傳統(tǒng)的用于藥物制劑的溶劑也可使用。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物為等滲溶液。此外，本發(fā)明液體溶液制劑的制備在任何階段都不需要重構(gòu)。該溶液為隨時(shí)可用的制劑。本發(fā)明藥物組合物具有范圍在4.5至5.5之間的pH值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該P(yáng)H值在4.7至5.3之間，更優(yōu)選在4.8至5.2之間，最優(yōu)選在4.9至5.1之間。如果需要調(diào)整以達(dá)到預(yù)期的pH值范圍，pH值可通過適合的溶液進(jìn)行調(diào)整；如果指示PH值減小則用酸溶液，如果指示pH值增加則用堿溶液。適合的酸溶液為例如鹽酸、磷酸、檸檬酸、磷酸氫鈉或磷酸氫鉀。適合的堿溶液為例如堿和堿土的氫氧化物、碳酸堿、乙酸堿、檸檬酸堿和磷酸氫二堿，例如氫氧化鈉、乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀、或氨。優(yōu)選的，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值。因此，本發(fā)明的制劑中可能包含鈉離子。存在的鈉的濃度一般小于lOmmol/1，通常是小于6mmol/l。本發(fā)明藥物制劑包含一種或多種表面活性劑。典型的表面活性劑的例子包括非離子表面活性劑，例如，失水山梨醇脂肪酸酯如失水山梨醇單辛酸酯、失水山梨醇單月桂酸酯、失水山梨醇單棕櫚酸，甘油脂肪酸酯如單辛酸甘油酯，單肉蔻酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯，聚甘油脂肪酸酯如單硬脂酸十甘油酯、雙硬脂酸十甘油酯、單亞油酸十甘油酯，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯例如聚氧乙烯單硬脂酸甘油酯，聚乙二醇脂肪酸酯例如聚乙二醇雙硬脂酸酯，聚氧乙烯烷基醚例如月桂醇聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚例如聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚，聚氧乙烯烷基苯基醚例如聚氧乙烯壬基苯基醚，聚氧乙烯硬化蓖麻油例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)，聚氧乙烯蜂蠟衍生物例如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟，聚氧乙烯羊毛脂衍生物例如聚氧乙烯羊毛脂，聚氧乙烯脂肪酰胺例如HLB值為6至18的聚氧乙烯硬脂酸酰胺；陰離子表面活性劑，例如，具有C10-18烷基的烷基硫酸鹽如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉，具有2-4的平均EO摩爾數(shù)和C10-18烷基的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽如聚氧乙烯十二烷基硫酸鈉，具有C10-18烷基的烷基磺基琥珀酸酯鹽如月桂基磺基琥珀酸鈉，以及天然表面活性劑，例如，卵磷脂、甘油磷脂，鞘磷脂例如神經(jīng)鞘磷脂，蔗糖的C12-18脂肪酸酯。這些表面活性劑中的一個(gè)或多個(gè)可組合加入到本發(fā)明制劑中。優(yōu)選的表面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯，更優(yōu)選為聚山梨酸酯20，21，40，60，65，80，81，85，最優(yōu)選為聚山梨酸酯20和80?；谌芤褐苿┑目傮w積，制劑中去污劑的濃度通常在0.0005%(w/v)至0.05%(w/v)的范圍內(nèi)，優(yōu)選從0.001%(w/v)至0.01%(w/v)，更優(yōu)選從0.002%(w/v)至0.006%(w/v)，最優(yōu)選從0.003%(m/v)至0.004%(w/v)。本發(fā)明制劑中一般含有濃度為0.003%(w/v)、0·0033%(w/v)或0·004%(w/v)的表面活性劑聚山梨酸酯20或80。優(yōu)選聚山梨酸酯20。根據(jù)本發(fā)明的制劑包含生理學(xué)可接受的緩沖劑。適合的緩沖劑為溶液制劑領(lǐng)域所知，例如，磷酸緩沖液(優(yōu)選磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉系統(tǒng))、檸檬酸緩沖液、乳酸緩沖液、乙酸緩沖液、碳酸緩沖液、BisTris、MES、以及甘氨酸-鹽酸。優(yōu)選使用乙酸緩沖液，即酸性酸或其鹽，例如堿或銨鹽。緩沖劑一般以1至lOOmmol/1的濃度存在于制劑中，優(yōu)選2至50mmol/l，更優(yōu)選5至20mmol/l。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖劑以lOmmol/1的濃度存在，最優(yōu)選為乙酸以10mmol/l的濃度存在。緩沖劑例如乙酸的濃度以這種方式選擇要提供穩(wěn)定PH值的租用以及足夠的緩沖能力。但是，同時(shí)離子濃度以及由此而致的溶液導(dǎo)電性保持盡可能低，以避免聚集體形成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，最終溶液制劑的導(dǎo)電性小于1.OmS/cm，優(yōu)選小于0.SmS/cm,更優(yōu)選小于0.5mS/cm。此外，優(yōu)選制劑中沒有酒石酸和琥珀酸及其鹽。還優(yōu)選溶液中沒有HEPES，TES和三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)。還優(yōu)選本發(fā)明制劑沒有硫酸離子。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑中無防腐劑，其中防腐劑是指傳統(tǒng)上被用作防腐劑以增加存儲(chǔ)穩(wěn)定性并且在標(biāo)準(zhǔn)濃度時(shí)具有殺菌效果的物質(zhì)。特別的，制劑中不含有如氯乙烷、苯甲醇、對(duì)氯間甲酚、焦碳酸二烷基酯和苯扎氯銨的防腐劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制劑還包含多元醇，優(yōu)選糖醇，最優(yōu)選甘露醇或山梨糖醇，作為滲漲度調(diào)節(jié)劑。山梨糖醇為特別優(yōu)選的。基于溶液的總體積，糖例如山梨糖醇或甘露醇的數(shù)量一般達(dá)10.0%(w/v)0優(yōu)選的濃度達(dá)8.0%(w/v)，更優(yōu)選的濃度達(dá)6.0%(w/ν)，最優(yōu)選的濃度達(dá)5.0%(w/v)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，山梨糖醇存在的量為5.0%(w/v)0此外，優(yōu)選本發(fā)明溶液制劑不包含選自氨基酸及其衍生物和鹽的穩(wěn)定劑，聚合物穩(wěn)定劑以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。包含聚合物-G-CSF綴合物的本發(fā)明制劑一般通過腸胃外途徑給藥，例如注射(皮下、靜脈或肌內(nèi)注射)或經(jīng)皮、黏膜、鼻腔或肺給藥，但是也可以口服給藥。聚合物-G-CSF綴合物在制劑中一般以1.O至30.Omg/ml的濃度存在，優(yōu)選5.O至20.Omg/ml，更優(yōu)選8.O至12.Omg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物-G-CSF綴合物為以10.Omg/ml數(shù)量存在的PEG-SA-GalNAc-G-CSF。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑中包含作為活性成分的聚合物-G-CSF綴合物、表面活性齊、緩沖劑、滲漲度調(diào)節(jié)劑、鈉離子和水，并且沒有其他組分。最優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的水性制劑包含糖聚乙二醇化G-CSF作為活性成分、聚山梨酸酯20或80作為表面活性劑、山梨糖醇和/或甘露醇作為滲漲度調(diào)節(jié)劑、乙酸作為緩沖劑、和鈉，并且沒有其他賦形劑。本發(fā)明另一方面，將如上所述本發(fā)明水性制劑稀釋以獲得合適兒科使用的水性稀釋制劑。用于兒童治療的適當(dāng)?shù)南♂屚ㄟ^稀釋本發(fā)明上述溶液12至18獲得。本發(fā)明還涉及到藥物容器，其中包含本發(fā)明水性制劑或通過稀釋獲得的稀釋溶液。適合的藥物容器可從現(xiàn)有技術(shù)中獲知。該容器可以，例如，為注射器、小瓶、輸液瓶、安瓿或卡普耳(carpoule)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)容器為注射器時(shí)，該注射器配備有針頭保護(hù)系統(tǒng)。在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的這種針頭保護(hù)系統(tǒng)有助于減少受傷的風(fēng)險(xiǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該容器為注射筆(injectionpen)內(nèi)的卡普耳(carpoule)。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明水性制劑的方法，其中聚合物-G-CSF綴合物作為活性成分，配制在PH值為4.5至5.5范圍內(nèi)、并且包含表面活性劑和其他藥物賦形劑的水性制劑中。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及本發(fā)明水性制劑在治療或預(yù)防中性白細(xì)胞減少癥中的用途。此外，本發(fā)明水性制劑能有利的用于治療或預(yù)防神經(jīng)性疾病或用于骨髓移植方面。一般來說，本發(fā)明藥物溶劑對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員是有用的。本發(fā)明藥物液體制劑被發(fā)現(xiàn)顯示出非常好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語“儲(chǔ)存穩(wěn)定”的意思理解為，制劑在25°C儲(chǔ)存三個(gè)月以后，活性聚合物-G-CSF綴合物的含量仍總計(jì)為原始濃度的80%或更多。優(yōu)選的，在25°C儲(chǔ)存三個(gè)月以后，G-CSF活性的剩余量仍總計(jì)為原始活性的至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%。聚合物-G-CSF綴合物的活性能通過用于G-CSF的現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)活性測(cè)試方法石角定。見例如DraftMonographie,"FiIgrastimConcentratedSolution”，PharmEur.Vol.19，No.1,2007年1月，或Stute，N.等人，“Pharmacokineticsofsubcutaneousrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorinchildren1〃,(1992),Blood，79(11)，第2849-2854頁。G-CSF活性的體外測(cè)量描述于例如Shirafuji，N.等人，1989，“Anewbioassayforhumangranulocytecolony-stimulatingfactor(hG-CSF)usingmurinemyeloblastsNFS—60cellsastargetsandestimationofitslevelsinserafromnormalhealthypersonsandpatientswithinfectiousandhematologicaldisorders，，，Exp.Hematol.(1989)17,116-119中。G-CSF活性的體內(nèi)測(cè)量見例如Tanaka，H.等人，1991，Pharmacokineticsofrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorconjugatedtopolyethyleneglycolinrats，CancerResearch,CancerResearch(1991)51,3710-3714中。描述用于測(cè)量G-CSF活性的實(shí)驗(yàn)的其他出版物為US6，555，660、Nohynek,G.J.等人，1997，Comparisonofthepotencyofglycosylatedandnonglycosylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorsinneutropenicandnon-neutropenicCDrats,CancerChemother.Pharmacol.(1997)39,259-266。根據(jù)本發(fā)明制劑中使用的聚合物-G-CSF綴合物的純度應(yīng)該至少為95%，優(yōu)選為至少97%，更優(yōu)選為至少99%，最優(yōu)選為大于99%。純度可以通過HPLC分析的方法確定。用于進(jìn)行這樣的分析的適合的材料和方案能通過商業(yè)來源例如Vydac或T0S0HBioscience(http//www,tosohbiosep.de)獲得。用于配制根據(jù)本發(fā)明溶液的組分能夠從傳統(tǒng)來源，例如從如Sigma或Merck公司獲得。本發(fā)明制劑的生產(chǎn)可根據(jù)傳統(tǒng)方法執(zhí)行。制劑的組分能溶解在水性緩沖劑中?？蛇x地，綴合物也能作為純化過程的結(jié)果已經(jīng)處于水性緩沖劑中獲得。最后，成品液體制劑填充到適合的藥物容器中，儲(chǔ)存直至給藥。以下實(shí)施例用來說明本發(fā)明，但不限制其范圍。實(shí)施例實(shí)施例1.G-CSF-GalNAc-SA-PEG的制備以下實(shí)施例說明G-CSF-GalNAc-SA-PEG的制備方法為(a)兩個(gè)連續(xù)步驟的方法，其中每一個(gè)中間產(chǎn)物在下一步使用前被純化，以及(b)使用同時(shí)加入酶的一步法。a.兩步法使用GalNAc-T2從G-CSF和UDP-GalNAc制備G-CSF-GalNAc(pH6.2)。在3.2mL緩沖劑包裝中的G-CSF(960μg)通過使用UF過濾器(MWC05K)超濾進(jìn)行濃縮，然后使用ImL的25mMMES緩沖液(pH6.2,0.005%NaN3)進(jìn)行重構(gòu)。然后加入U(xiǎn)DP-GalNAc(6mg,9.24mM)、GalNAc_T2(40μL,0.04U)禾口IOOmMMnCl2(40μL,4mM)，將所得溶液在室溫下孵育。24小時(shí)以后，MALDI表明反應(yīng)完成。反應(yīng)混合物直接使用SEC(Superdex75和Superdex200)和PBS(磷酸鹽緩沖液，pH4.9和0.005%Tween80)組成的洗脫緩沖液進(jìn)行HPLC純化。收集的G-CSF-GalNAc峰用Centricon5KDaMWCO過濾器濃縮至150μL，并且使用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH4.9和0.005%Tween80)將體積調(diào)整至1ml。最終的蛋白質(zhì)濃度為lmg/mL(A28Q)，產(chǎn)量100%。樣品在4°C保存。使用純化的G-CSF-GalNAc，CMP-SA-PEG(20KDa)和小鼠ST6GalNAc_TI(pH6.2)制備G-CSF-GalNAc-SA-PEG。包含Img蛋白質(zhì)的G-CSF-GalNAc溶液用緩沖劑交換成25mMMES緩沖劑(pH6.2，0.005%NaN3)，并加入CMP-SA-PEG(20KDa)(5mg,0.25μmol)。溶解后，加入MnCl2(100μL,IOOmM溶液)和ST6GalNAc-I(100μL，小鼠酶)，并將反應(yīng)混合物在32°C緩慢搖動(dòng)三天。將反應(yīng)混合物通過超濾法(MWCO5K)濃縮，并用25mMNaOAc(pH4.9)緩沖劑交換一次，然后濃縮至ImL總體積。然后用SP-S印harose(A:25mMNa0Ac+0.005%tween-80pH4.5；B:25mMNa0Ac+0.005%Tween-80pH4.5+2MNaCl)純化，保留時(shí)間13-18分鐘，以及用SEC(Superdex75；PBS-pH7.2,0.005%Tween80)，保留時(shí)間8.6分鐘(Superdex75，流速lml/min)將產(chǎn)品純化。收集所需組分，濃縮至0.5mL并在4°C保存。b.一步法使用小鼠ST6GalNAc_I(pH6.0)的一鍋法G-CSF(960μg蛋白質(zhì)溶解在3.2mL產(chǎn)品制劑緩沖劑中)用超濾法(MWCO5K)濃縮至0.5ml，并使用25mMMES緩沖劑(pH6.0,0.005%NaN3)重構(gòu)至總體積約ImL或蛋白質(zhì)濃度為lmg/mL。然后加入U(xiǎn)DP-GalNAc(6mg，9.21μmol)、GalNAc_T2(80μL，80mU)、CMP-SA-PEG(20KDa)(6mg，0，3μmol)、小鼠酶ST6GalNAc_I(120μL)和IOOmMMnCl2(50μL)。溶液在32°C搖動(dòng)48小時(shí)，并使用標(biāo)準(zhǔn)色譜條件在SP-S印harose上純化。獲得總共0.5mg蛋白質(zhì)(A28tl)或約50%總收率。產(chǎn)品結(jié)構(gòu)通過經(jīng)MALDI和SDS-PAGE兩者的分析確定。使用雞ST6GalNAc_I(pH6.0)的一鍋法14.4mgG-CSF濃縮至3mL終體積，用25mMMES緩沖劑(pH6.0,0.05%NaN3,0.004%Tween80)進(jìn)行緩沖劑交換，將體積調(diào)整至13mL。然后加入U(xiǎn)DP-GalNAc(90mg，150μmole)、GalNAc_T2(0.59U)、CMP-SA-PEG_20KDa(90mg)、雞ST6GalNAc_I(0.44U)禾口IOOmMMnCl2(600μL)。所得混合物室溫放置60小時(shí)。然后用UF(MWCO5K)將反應(yīng)混合物濃縮，并離心。殘?jiān)?約2mL)溶解在25mMNaOAc緩沖劑(pH4.5)中并再次濃縮至5mL終體積。該樣品使用SP-S印harose純化大約10-23分鐘、SEC(Superdex75，17min，流速0.5ml/min)和額外的SEC(Superdex200，23min，流速0.5ml/min)純化至產(chǎn)生3.6mg(25%總收率)G-CSF-GalNAc-SA-PEG-20KDa(A28tl和BCA方法)。實(shí)施例2.液體聚合物-G-CSF綴合物(PEG-SA-GalNAc-G-CSF)制劑包含糖聚乙二醇化G-CSF(綴合物的結(jié)構(gòu)為=PEG-SA-GalNAc-G-CSF)的液體制劑通過配制以下組分于水性乙酸緩沖液中制備。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>組合物的ρΗ值通過加入NaOH調(diào)整。所有成分的質(zhì)量符合歐洲藥典(Ph.Eur.)。此外，還制備ρΗ4.5或ρΗ5.5，以及分別成比例的減少或增加鈉的同樣的組合物。還制備具有ρΗ4.ο的對(duì)比制劑(如Neulasta制劑)。實(shí)施例3.本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性測(cè)試ρΗ4.5，5.0和5.5的組合物分裝為500μ1/瓶，并在2_8°C和25°C下保存。在1，2，3，4.5，6，8，12和15個(gè)月后，將樣品按下表給定的測(cè)試參數(shù)測(cè)試。具有pH5.0的組合物的預(yù)期規(guī)格如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在T=0，1個(gè)月，2個(gè)月，3個(gè)月，4.5個(gè)月，6個(gè)月，8個(gè)月，12個(gè)月和15個(gè)月時(shí)測(cè)試的所有樣品都符合預(yù)期規(guī)格。這個(gè)對(duì)所有測(cè)試的包含糖聚乙二醇化G-CSF，并且pH值為4.5、5.0或5.5的組合物均如此。本發(fā)明組合物與兩個(gè)對(duì)比制劑進(jìn)行比較Neulasta(pH4.ο)和ΡΗ4.ο的糖聚乙二醇化G-CSF(PEG-SA-GalNAc-G-CSF)組合物。結(jié)果顯示，與包含糖聚乙二醇化G-CSF且PH值為4.O的對(duì)比溶液相比，具有更高pH值4.5，5.O和5.5的該制劑顯示出更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。所收集的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，更高的PH值能防止糖PEG鍵的酸水解。此外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明制劑的穩(wěn)定性與作為Neulasta所公知的PEG-G-CSF綴合物的穩(wěn)定性相當(dāng)。權(quán)利要求包含聚合物-G-CSF綴合物的水性制劑，其中該制劑具有范圍在4.5至5.5之間的pH值，并且還包含表面活性劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水性制劑，其中該聚合物為聚亞烷基二醇。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水性制劑，其中該聚合物和G-CSF通過糖基連接物連接。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水性制劑，其中該糖基連接是通過O-糖基化。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的水性制劑，其中該O-糖基化是在G-CSF蛋白質(zhì)的蘇氨酸殘基上。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水性制劑，其中該蘇氨酸殘基是基于甲硫氨酰-G-CSF蛋白質(zhì)氨基酸序列的Thr134，或基于自然存在的人G-CSF氨基酸序列的Thr133。7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的水性制劑，其中該糖基連接物包含單糖、雙糖或寡糖。8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的水性制劑，其中該糖基連接物包含唾液酸和N-乙酰半乳糖胺。9.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該表面活性劑以0.0001%(w/v)-0.05%(w/v)的濃度存在。10.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該表面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的水性制劑，其中該聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯為聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。12.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該pH值在4.7至5.3的范圍內(nèi)。13.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該pH值在4.9至5.1的范圍內(nèi)。14.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，還包含生理學(xué)可接受的緩沖劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的水性制劑，其中該緩沖劑包含乙酸或其鹽。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的水性制劑，其中該緩沖劑以2-50mmol/l的濃度存在。17.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，還包含選自山梨糖醇和甘露醇的滲漲度調(diào)節(jié)劑。18.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該滲漲度調(diào)節(jié)劑以1-10%的濃度存在。19.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該制劑不含有選自氨基酸、聚合物穩(wěn)定劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的穩(wěn)定劑。20.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該制劑不含有防腐劑。21.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該制劑不含有硫酸離子。22.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該pH值使用NaOH調(diào)節(jié)。23.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該制劑包含鈉離子。24.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該制劑包含聚合物-G-CSF綴合物作為活性成分、聚山梨酸酯20或80作為表面活性劑、山梨糖醇和/或甘露醇作為滲漲度調(diào)節(jié)劑、乙酸作為緩沖劑、和鈉，并且沒有其他賦形劑。25.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該聚合物-G-CSF綴合物以l-20mg/ml的濃度存在。26.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑，其中該聚合物-G-CSF綴合物以8-12mg/ml的濃度存在。27.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑衍生的水性稀釋制劑，其中根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑以12至18稀釋。28.包含根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的水性制劑的藥物容器。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物容器，其中該容器為注射器、小瓶、輸液瓶、安瓿或卡普耳。30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的藥物容器，其中該容器為配備有針頭保護(hù)系統(tǒng)的注射器o31.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的藥物容器，其中該容器為注射筆內(nèi)的卡普耳。32.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的水性制劑的制備方法，其中聚合物-G-CSF綴合物作為活性成分配制在PH值為4.5至5.5范圍內(nèi)、并且包含表面活性劑和其他藥物賦形劑的水性制劑中。33.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的水性制劑在治療和預(yù)防中性白細(xì)胞減少癥中的用途。34.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的水性制劑在治療和預(yù)防神經(jīng)性疾病中的用途。35.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的水性制劑在骨髓移植法方面的用途。36.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的水性制劑在干細(xì)胞動(dòng)員中的用途。37.根據(jù)權(quán)利要求27所述的水性制劑用于兒科使用的用途。全文摘要本發(fā)明涉及包含與聚合物綴合的粒細(xì)胞集落刺激因子多肽的液體藥物組合物，組合物的pH值在4.5至5.5的范圍內(nèi)。該組合物還包含表面活性劑，以及任選的一種或多種其他可藥用的賦形劑。此外，本發(fā)明組合物不含作為緩沖劑的酒石酸或其鹽和琥珀酸及其鹽，并且不含作為穩(wěn)定劑的氨基酸。該組合物具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且特別用于預(yù)防和治療使用粒細(xì)胞集落刺激因子制劑治療有用的疾病和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。文檔編號(hào)A61P25/00GK101827864SQ200880104971公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年8月27日優(yōu)先權(quán)日2007年8月27日發(fā)明者C·謝克曼,W·因德雷爾申請(qǐng)人:拜奧吉耐里克斯股份公司