專利名稱：：用于治療淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的組織激肽釋放酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括阿爾茨海默病、阿爾茨海默病先兆遺忘型輕度認(rèn)知缺損(Alzheimer'sprecursoramnesicmildcognitiveimpairment)及相關(guān)病癥。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病是一種致死性神經(jīng)退化障礙，目前世界上超過(guò)2千萬(wàn)人患有此病，并且發(fā)病率正在增加。據(jù)估計(jì)，該病的發(fā)病率在未來(lái)30年中會(huì)翻倍從而使阿爾茨海默病成為導(dǎo)致老年人死亡的主要原因(vanLeeuwenetal.,NeurobiologyofAging,2000,21:879-891)。特征包括智力功能(記憶力、語(yǔ)言、視覺(jué)能力和問(wèn)題解決能力)的下降和抽象推理的降低以及異常行為。阿爾茨海默病導(dǎo)致最終喪失運(yùn)動(dòng)功能、營(yíng)養(yǎng)不足和死亡(Friedlanderetal.，ClinicalPractice2006，1371240-1251)。阿爾茨海默病通常發(fā)生于生命晚期，被稱為“晚發(fā)”。阿爾茨海默病在65-74歲的人中的發(fā)生率為3%，而在75-84歲和85歲以上的人中的發(fā)生率分別為19%和47%(Friedlanderetal.，2006)。診斷患有阿爾茨海默病的個(gè)體的平均壽命為發(fā)病后8-10年(Friedlanderetal.，2006)。作為被診斷為阿爾茨海默病的先兆，許多人首先經(jīng)歷遺忘性輕度認(rèn)知缺損(MCI)，其被認(rèn)為是正常老化和阿爾茨海默病之間的過(guò)渡階段或者阿爾茨海默病的前臨床期(ArchNeurol.2004Jan;61(l):59_66)。當(dāng)記憶喪失為主要特征時(shí)，這種類型的缺損被稱為遺忘性MCI，其一般會(huì)隨著認(rèn)知下降的增加在一定時(shí)間后轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ?。阿爾茨海默病被分為七個(gè)階段，每個(gè)階段都被上一個(gè)階段更虛弱。第一階段的特征為回顧性分析，一旦阿爾茨海默病的癥狀發(fā)展為由營(yíng)養(yǎng)不足和嚴(yán)重認(rèn)知功能下降構(gòu)成的最后階段，經(jīng)常需要專職家庭護(hù)理(Friedlanderetal.，2006)，造成巨大的護(hù)理支出。阿爾茨海默病的發(fā)生似乎與某些危險(xiǎn)因素有關(guān)。這些危險(xiǎn)因素包括頭部外傷、種族、高熱量高脂肪低葉酸飲食、教育程度有限、高膽固醇血癥、糖尿病和久坐的生活方式。在約5%的表現(xiàn)家族性發(fā)病的病例中觀察到了一種常染色體顯性遺傳模式(Friedlanderetal.，2006)。目前尚不了解阿爾茨海默病的確切原因，然而，該病是以極度復(fù)雜的方式通過(guò)多種通路被調(diào)控的。通路包括淀粉樣蛋白(Αβ)的缺陷代謝、異常神經(jīng)傳遞(谷氨酰胺、腎上腺素能、血清素和多巴胺)、炎癥、激素和氧化通路(Franketal.,Ann.Clin.Psychiatry2005,17(4):269_286)。四種基因似乎與阿爾茨海默病有關(guān)。這些基因編碼淀粉樣前體蛋白(APP)、早老素1、早老素2和載脂蛋白E(Franketal.，2005)。由于存在纖維斑塊或纏結(jié)，阿爾茨海默病的特征在于存在于腦區(qū)中。斑塊是胞外沉積物，而在胞內(nèi)可觀察到纏結(jié)。斑塊含有Αβ及其片段Αβ40和Αβ42，而纏結(jié)含有稱為tau的微管相關(guān)蛋白(Franketal.，2005)。所述Αβ片段為包括APP(前體)的異常蛋白水解切割事件產(chǎn)物。斑塊可在涉及記憶形成和信息獲得的腦區(qū)形成。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體被認(rèn)為涉及阿爾茨海默病的神經(jīng)毒性事件，而Αβ可能直接參與。當(dāng)tau蛋白被蛋白激酶在特異位點(diǎn)超磷酸化后聚集在一起時(shí)形成纏結(jié)。具體地，所述蛋白激酶糖原合成酶激酶_3β(GSK-3β)涉及tau的超磷酸化(ProcNatlAcadSciUSA.2005May10；102(19):6990_5)，導(dǎo)致纏結(jié)形成和軸突微管分解。Aβ已被證明在神經(jīng)元內(nèi)刺激GSK-3β的活性(Neuroscience2002；115(1)201-11)。微管的分解阻止軸突運(yùn)輸，導(dǎo)致突觸的喪失和神經(jīng)退化。對(duì)認(rèn)知和功能下降的常規(guī)治療方法包括膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。精神病和焦慮事件可用非典型抗精神病藥物(如奧氮平和利培酮)和情緒穩(wěn)定劑治療。最后，抑郁和焦慮可用選擇性血清素再吸收抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、去甲腎上腺素再吸收抑制劑和中央Q2腎上腺素自身受體和異身受體拮抗劑治療(Friedlanderetal，2006)。對(duì)于普通人群，大多數(shù)人在年齡較大時(shí)才發(fā)生阿爾茨海默病，但唐氏綜合癥(也稱為“21號(hào)染色體三體性”或“DS”)患者會(huì)更早地發(fā)生阿爾茨海默病。大多數(shù)患唐氏綜合癥的人在中年晚期發(fā)生阿爾茨海默病，并且斑塊形成蛋白Αβ的沉積經(jīng)常比大多數(shù)其他阿爾茨海默病患者更嚴(yán)重。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供組織激肽釋放酶或其變體或活性片段在治療阿爾茨海默病或其癥狀中和治療遺忘性輕度認(rèn)知缺損中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于消化或切割淀粉樣蛋白和治療從淀粉樣蛋白的消化或切割受益的病癥的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種治療患有(a)阿爾茨海默病或其癥狀；或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與用于治療阿爾茨海默病或遺忘性輕度認(rèn)知缺損的第二種治療性化合物共同給藥。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種配制用于口服給藥的藥物組合物，其含有約1-約1000IU/天的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種配制用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物，其每個(gè)給藥頻率(dosagefrequency)含有約0.001-5000IU的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種佐劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是一種乳化劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及親脂膠束。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包括用于治療阿爾茨海默病的第二種治療性化合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于制備治療(a)阿爾茨海默病或其癥狀，或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療(a)阿爾茨海默病或其癥狀，或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的應(yīng)用還包括與用于治療阿爾茨海默病或遺忘性輕度認(rèn)知缺損的第二種治療性化合物共同使用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二種治療性化合物包括一種乙酰膽堿前體、一種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物、一種乙酰膽堿酯酶抑制劑、一種毒蕈堿激動(dòng)劑、一種抗氧化劑、一種抗炎藥、一種激素、一種鈣通道阻滯劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一種益智劑(nootropicagent)、一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子小分子模擬物、NMDA受體拮抗劑、一種5-HT1A受體激動(dòng)劑、一種抗淀粉樣蛋白生成劑、一種抗組胺藥、一種甲磺酸雙氫麥角堿、銀杏或石杉?jí)A甲。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰膽堿酯酶前體選自膽堿、卵磷脂或乙酰-1-肉毒堿。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物為4-氨基吡啶或利諾吡啶(Iinopridine)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰膽堿酯酶抑制劑選自毒扁豆堿、他克林(tacrine)、多奈哌齊(don印ezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加蘭他敏(glanthamine)、舌夂百蟲(metrifonate)、石杉?jí)A甲或依其Jf的明(eptastigmine)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒蕈堿激動(dòng)劑選自米拉美林(milameline)、口占諾美林(xanomeline)、檳榔堿(arecoline)、氧化震亶員素(oxotremorine)、沙可美林(sabcomeline)或他沙利定(talsaclidine)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗氧化劑選自維生素E、艾地苯醌(iedbenone)、輔酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或維生素C。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗炎藥是一種非留類抗炎藥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述激素是雌激素或睪酮。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述益智劑是吡拉西坦(piracetam)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述甲磺酸雙氫麥角堿是氫化麥角堿。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段是鼻內(nèi)給藥的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療有效劑量為每個(gè)給藥頻率約0.001-約5000國(guó)際單位(IU)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段是口服給藥的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的治療有效量為每天約0.001-約1000IU。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于消化或切割需要所述治療的患者體內(nèi)的淀粉樣蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者的神經(jīng)脈管系統(tǒng)的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者的腦部氧攝取的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者的腦部血流的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者腦中斑塊清除的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者的腦部葡萄糖攝取的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于降低需要所述治療的患者腦中tau磷酸化的應(yīng)用。圖1為顯示組織激肽釋放酶(KLKl)在體外切割淀粉樣蛋白原纖維的質(zhì)譜圖。A)只有β-淀粉樣蛋白(Αβ)；B)只有KLKl；和OKLKl和Αβ。圖2為顯示組織激肽釋放酶在體外切割可溶性淀粉樣蛋白的質(zhì)譜圖。Α)只有可溶性Αβ；B)可溶性Aβ和KLKl。圖3是顯示對(duì)經(jīng)組織激肽釋放酶處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在ΑβH2(10μM終濃度)損傷之前24小時(shí)和30分鐘時(shí)向細(xì)胞中加入組織激肽釋放酶。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(10μMAβ㈠孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。***ρ<0.0001(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(vehicle)(=10μMAβ^42)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖4是顯示經(jīng)組織激肽釋放酶處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的神經(jīng)元存活的柱狀圖。在Αβ^αΟμΜ終濃度)損傷之前24小時(shí)和30分鐘向細(xì)胞中加入組織激肽釋放酶。在與10μMAβi_42接觸48小時(shí)后計(jì)算NeuN-免疫活性神經(jīng)元的數(shù)量。此數(shù)據(jù)表示為存活神經(jīng)元的百分比，以平均值+SD的形式表示。<0.0001(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(=ΙΟμΜΑβ^)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖5是顯示對(duì)經(jīng)組織激肽釋放酶處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在ΑβH2(IC)μM終濃度)損傷之前-30分鐘和Aβ^損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入組織激肽釋放酶。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μΜNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。***ρ=0.0002(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(=ΙΟμΜΑβ^)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖6是顯示經(jīng)組織激肽釋放酶處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的神經(jīng)元存活的柱狀圖。在Αβi_42損傷之前30分鐘和Αβi_42損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入組織激肽釋放酶。在與10μMAβi_42接觸48小時(shí)后計(jì)算NeuN-免疫活性神經(jīng)元的數(shù)量。此數(shù)據(jù)表示為存活神經(jīng)元的百分比，以平均值+SD的形式表示。<0.0001(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(=ΙΟμΜΑβ^42)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖7是顯示對(duì)經(jīng)10μg/ml組織激肽釋放酶處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在Aβ卜42損傷之前24小時(shí)和30分鐘(研究方案Α)、在Aβ卜42損傷之前30分鐘和損傷之后24小時(shí)(研究方案B)、以及在Αβi_42損傷之前24小時(shí)和30分鐘及之后24小時(shí)(研究方案C)向細(xì)胞中加入激肽釋放酶。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(10μM八旦⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。<0.0001(單因素ANOVA)表示與空白溶劑(=ΙΟμΜAβ^42)相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖8是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在八^_42損傷之前30分鐘和24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜΑβ^孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。圖9是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在AβH2損傷之前30分鐘和Aβ^42損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。圖10是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在六^吣損傷之前24小時(shí)和30分鐘以及損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜAβ工^孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。圖11是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的細(xì)胞計(jì)數(shù)的柱狀圖。在ΑβH2損傷之前24小時(shí)和30分鐘向細(xì)胞中胰激肽。在與10μMAβH2接觸48小時(shí)后計(jì)算NeuN-免疫活性神經(jīng)元的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜAβ^42孔)的存活神經(jīng)元的百分比，300μΜNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。圖12是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的細(xì)胞計(jì)數(shù)的柱狀圖。在AβH2損傷之前30分鐘和AβH2損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。在與10μMAβH2接觸48小時(shí)后計(jì)算NeuN-免疫活性神經(jīng)元的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜ八^^孔)的存活神經(jīng)元的百分比，300μΜNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表不。圖13是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的細(xì)胞計(jì)數(shù)的柱狀圖。在Ai^_42損傷之前24小時(shí)和30分鐘以及損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。在與10μMAβ卜42接觸48小時(shí)后計(jì)算NeuN-免疫活性神經(jīng)元的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)it(ΙΟμΜ六日^孔)的存活神經(jīng)元的百分比，300μΜNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。圖14是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在々^_42損傷之前24小時(shí)和30分鐘向細(xì)胞中胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜ八旦⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。<0.0001(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(=ΙΟμΜAβ^42)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯者差升。圖15是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在六日㈠損傷之前30分鐘和六日㈠損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(ΙΟμΜ六^^孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。*p<0.05(單因素ANOVA)表示與空白溶劑(=10μMAβ^42)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖16是顯示對(duì)經(jīng)胰激肽處理的大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)的LDH測(cè)量的柱狀圖。在^㈠損傷之前24小時(shí)和30分鐘以及損傷之后24小時(shí)向細(xì)胞中加入胰激肽。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)基礎(chǔ)值(10μMAβ工⑷孔)增加的百分比，300μMNMDA設(shè)定為100%，數(shù)據(jù)以平均值+SD的形式表示。*#ρ<0.0001(單因素AN0VA)表示與空白溶劑(=10μMAβ^42)組相比存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。圖17是顯示各種濃度的激肽釋放酶的淀粉樣蛋白β切割的百分比的對(duì)數(shù)線圖。具體實(shí)施方案定義“組織激肽釋放酶”或"KLKl"是一種最初由于其通過(guò)將激肽原切割為賴氨酰舒緩激肽(胰激肽)來(lái)控制高血壓的作用而被注意到的絲氨酸蛋白酶(Yousefetal.，EndocrineRev.2001；22184-204)。由于在KLK家族包括很多酶，本發(fā)明人認(rèn)為KLKl似乎是遍在的或多標(biāo)靶作用的酶，除了其已知的在高血壓調(diào)控中的作用以外，還可對(duì)于治療阿爾茨海默病起明確的作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“組織激肽釋放酶”是下列術(shù)語(yǔ)的同義詞血管舒緩素(callicrein)、舒血管素(glumorin)、胰激肽釋放酶(padreatin)、帕杜丁(padutin)ffJfiliW^(kallidinogenase)>bradykininogenase、月夷(panceatickallikrein)、onokreinP、血管舒緩素D(dilminalD)、d印ot-Padutin、尿血管舒緩素(urokallikrein)或尿激月太釋放Sl(urinarykallikrein)。如上所述，“胰激肽”是指賴氨酰舒緩激肽。激肽釋放酶將激肽原切割為胰激肽。激肽釋放酶可激活舒緩激肽2受體，其被已知增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)。MMP-9也可切割淀粉樣蛋白。組織激肽釋放酶多肽的序列如下(SEQIDN0:1)NP_001001911GI:50054435野豬(Susscrofa)1-17信號(hào)肽18-24前肽25-263成熟肽>giI50054435|refINP_001001911.1激肽釋放酶1[野豬]MWSLVMRLALSLAGTGAAPPIQSRIIGGRECEKDSHPWQVAIYHYSSFQCGGVLVDPKWVLTAAHCKNDNYQVWLGRHNLFENEVTAQFFGVTADFPHPGFNLSLLKNHTKADGKDYSHDLMLLRLQSPAKITDAVKVLELPTQEPELGSTCQASGWGSIEPGPDDFEFPDEIQCVELTLLQNTFCADAHPDKVTESMLCAGYLPGGKDTCMGDSGGPLICNGMWQGITSWGHTPCGSANKPSIYTKLIFYLDWINDTITENPAnotherembodimentincludesNP_002248GI4504875Homosapiens另一個(gè)實(shí)施方案包括NP_002248GI4504875人類(Homosapiens)1-18信號(hào)肽19-24前肽25-262成熟肽>giI4504875|ref|NP_002248.11激肽釋放酶1前蛋白原[人類]MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGF匪SLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCV⑶SGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQIDNO2)術(shù)語(yǔ)“活性片段”是指保留全長(zhǎng)KLKl多肽活性的KLKl多肽的較小部分。起始或參照多肽的“變體”或“突變體”是一種這樣的多肽，所述多肽1)具有與所述起始或參照多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列和2)通過(guò)自然或人工(人造)突變從所述起始或參照多肽衍生而來(lái)。這些變體包括，例如，在目的多肽的氨基酸序列中刪除和/或插入和/或取代殘基。在此背景下，變體氨基酸是指與起始或參照多肽序列(如一個(gè)源抗體或抗原結(jié)合片段的多肽序列)中對(duì)應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸?？蛇M(jìn)行刪除、插入和取代的任意組合以獲得最終的變體或突變構(gòu)建體，只要所述最終構(gòu)建體具有所需的功能特性。所述氨基酸改變也可影響所述多肽的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。產(chǎn)生多肽的氨基酸序列變體的方法在美國(guó)專利No.5，534，615被描述，該公開明確地以引用的方式納入本文中?！耙吧汀被颉皡⒄铡毙蛄谢颉耙吧汀被颉皡⒄铡钡鞍?多肽的序列可為通過(guò)引入突變衍生出變體多肽的參照序列。通常，特定蛋白的“野生型”序列是自然界中最常見的序列。類似地，“野生型”基因序列是自然界中最常見的基因的序列。突變可通過(guò)自然加工或通過(guò)人為誘導(dǎo)手段被引入“野生型”基因中(并因此引入到該基因編碼的蛋白中)。這些加工的產(chǎn)物為原始“野生型”蛋白或基因的“變體”或“突變”形式。本文指定多肽的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定義為在比對(duì)序列和在必要時(shí)引入間隙以達(dá)到最大序列同一性百分比，并且不將任何保守性取代當(dāng)作序列同一性的一部分之后，候選序列中的氨基酸殘基與參照序列中的氨基酸殘基相同的百分比。為確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可通過(guò)屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MegAlign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員確定適合用于測(cè)量比對(duì)的參數(shù)，包括在比較序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。所述ALIGN-2程序是公眾可通過(guò)Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,California獲得的。出于本文的目的，給定氨基酸序列A與給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(也可表述為給定氨基酸序列A具有或包含的與給定氨基酸序列B的某個(gè)氨基酸序列同一性％)的計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y，其中X是被序列比對(duì)程序在該程序的A和B的比對(duì)中認(rèn)定為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)量，其中Y是B的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)理解，當(dāng)氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A與B的氨基酸序列同一性％不等于B與A的氨基酸序列同一性％。“核酸序列同一性百分比(％)”被定義為在比對(duì)序列和在必要時(shí)引入間隙以達(dá)到最大序列同一性百分比之后，候選序列中與編碼參照多肽的核酸序列中核苷酸相同的核苷酸的百分比?！睘榇_定核酸序列同一性百分比的比對(duì)可通過(guò)屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或MegAlign(DNASTAR)軟件?？赏ㄟ^(guò)已知的方法確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在比較序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。出于本文的目的，給定核酸序列C與給定核酸序列D的核酸序列同一性％(也可表述為給定核酸序列C具有或包含的與給定核酸序列D的某個(gè)核酸序列同一性％)的計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)W/Z，其中W是被序列比對(duì)程序在該程序的C和D的比對(duì)中認(rèn)定為相同匹配的核苷酸的數(shù)量，而其中ζ是D的核苷酸的總數(shù)。應(yīng)理解，當(dāng)核酸序列C的長(zhǎng)度不等于核酸序列D的長(zhǎng)度時(shí)，C與D的核酸序列同一性％不等于D與C的核酸序列同一性％。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”使用其最廣泛的意義并意圖包括天然La-氨基酸或殘基。本文使用了常用的天然氨基酸的一個(gè)和三個(gè)字母的簡(jiǎn)寫(Lehninger，A.L.，Biochemistry,2ded.,pp.71-92,(1975),WorthPublishers,NewYork)。該術(shù)語(yǔ)包括所有的D-氨基酸以及化學(xué)修飾的氨基酸如氨基酸類似物、蛋白通常不包含的天然氨基酸如正亮氨酸和具有本領(lǐng)域已知的氨基酸特性的化學(xué)合成的化合物。例如，氨基酸的定義包括苯基丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬物，其使得所述肽化合物與天然Phe或Pro有相同的構(gòu)象限制。這些類似物和模擬物在本文中被稱為氨基酸的“功能等價(jià)物”。Roberts和Vellaccio在ThePeptidesAnalysis,Synthesis,Biology,GrossandMeiehofer,Eds.,Vol.5p341,AcademicPress,Inc,N.Y.1983中列出了氨基酸的其他實(shí)例，所述文獻(xiàn)以引用的方式納入本文中。術(shù)語(yǔ)“蛋白”的氨基酸序列比肽要長(zhǎng)?！半摹焙?到約50個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括蛋白和肽。蛋白的實(shí)例包括但不限于，抗體、酶、凝集素和受體；脂蛋白和脂多肽；以及糖蛋白和糖多肽?！叭诤系鞍住焙汀叭诤隙嚯摹笔侵负袃蓚€(gè)共價(jià)連接部分的多肽，其中所述兩個(gè)部分中的每個(gè)均是具有不同性質(zhì)的多肽。所述性質(zhì)可為生物學(xué)性質(zhì)，例如體外或體內(nèi)活性。所述性質(zhì)也可為簡(jiǎn)單的化學(xué)或物理性質(zhì)，如與標(biāo)靶抗原結(jié)合、反應(yīng)催化作用等。所述兩個(gè)部分可通過(guò)一個(gè)單肽鍵直接相連，或通過(guò)一個(gè)含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽接頭相連。通常，所述兩個(gè)部分和所述接頭互在對(duì)方的閱讀框內(nèi)。優(yōu)選地，所述多肽的兩個(gè)部分來(lái)自異種或不同的多肽。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指有效“減輕”或“治療”受試者或哺乳動(dòng)物中疾病或障礙的本發(fā)明組合物的量。通常，疾病或障礙的減輕或治療包括減輕與所述疾病或障礙有關(guān)的一種或多種癥狀或醫(yī)學(xué)問(wèn)題。在某些實(shí)施方案中，“治療有效量”是改善神經(jīng)脈管系統(tǒng)、氧攝取、血流、斑塊清除、葡萄糖攝取、原纖維切割、斑塊分解、斑塊負(fù)荷、降低tau磷酸化或它們的組合的量。術(shù)語(yǔ)“治療”和“處理”是指抑制、減輕和治愈淀粉樣蛋白相關(guān)疾病，包括但不限于阿爾茨海默病、遺忘性MCI和它們的病癥或癥狀?！爸委煛焙汀疤幚怼笔侵钢委熜灾委熀皖A(yù)防或防止方法，其目標(biāo)是防止或減緩(減輕)標(biāo)靶生理病癥或障礙。治療可通過(guò)給予治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物進(jìn)行。本文所用的“治療有效量”包括預(yù)防量，例如有效減輕或治愈上述疾病或其癥狀的量。這些評(píng)估所述疾病的成功治療和改善的參數(shù)可通過(guò)醫(yī)師熟悉的常規(guī)方法容易地測(cè)量。術(shù)語(yǔ)“改善的神經(jīng)脈管系統(tǒng)”是指血管密度的增加和通過(guò)血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)腦部營(yíng)養(yǎng)遞送的增加。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的高分辨率的磁共振成像(MRI)可建立成像腦部的三維(3D)脈管網(wǎng)絡(luò)圖。使用內(nèi)源血氧水平依賴的對(duì)比和外源對(duì)比劑可使所述3D圖像中的動(dòng)脈和靜脈結(jié)構(gòu)可視化(Bolanet.al，2006)。在治療前、治療中和治療后比較所述脈管網(wǎng)絡(luò)，使得可評(píng)估被治療的某個(gè)阿爾茨海默病患者的神經(jīng)脈管系統(tǒng)的改善?！霸黾印笔侵秆苊芏然?qū)δX部的營(yíng)養(yǎng)遞送比治療前的血管密度或營(yíng)養(yǎng)遞送更高。術(shù)語(yǔ)“改善的氧攝取”是指增加的對(duì)腦部和腦細(xì)胞的氧遞送，而術(shù)語(yǔ)“改善的血流”是指循環(huán)流過(guò)腦部的血液體積的增加。使用本領(lǐng)域建立的功能MRI可使腦中的血流可視化(Daviset.al，1998)。處于活動(dòng)狀態(tài)的腦區(qū)需要氧氣以幫助葡萄糖代謝產(chǎn)生能量。這是通過(guò)血流的大量增加實(shí)現(xiàn)的，從而克服了氧氣的擴(kuò)散限制并將充足的氧氣供給處于活動(dòng)狀態(tài)的腦組織。這種血流的增加和伴隨的氧氣增加是通過(guò)以下方式檢測(cè)的利用功能MRI的內(nèi)源血氧水平依賴對(duì)比中的變化。然后增加的信號(hào)被用于推出血流以及氧攝取和代謝的增力口。通過(guò)對(duì)阿爾茨海默病患者的腦中血流和氧攝取不足區(qū)域的繪圖，可用年齡匹配的非阿爾茨海默病患者為對(duì)照在治療中或治療后評(píng)估改善?！霸黾印笔侵钢委熀蠡颊咧醒鯏z取或血流比治療前患者中的氧攝取或血流更多。術(shù)語(yǔ)“斑塊清除”是指斑塊區(qū)域的可測(cè)量的減少。正電子發(fā)射斷層顯像(PET)和使用對(duì)斑塊有特異性的對(duì)比劑(如硫磺素衍生的匹茲堡化合物B，PIB)(Khmketal,2004)是本領(lǐng)域已知的使阿爾茨海默病患者的腦中的斑塊沉積可視化的方法。通過(guò)生成斑塊負(fù)荷的圖像，人們可評(píng)估斑塊清除的改善，作為與治療前相比以及與年齡匹配的未患阿爾茨海默病的對(duì)照受試者相比的治療結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“改善的葡萄糖攝取”是指腦部利用來(lái)自血流的葡萄糖的能力增強(qiáng)。阿爾茨海默病的特征之一是腦部細(xì)胞的葡萄糖攝取和代謝的降低(代謝減退)；這種疾病發(fā)作的標(biāo)志是通過(guò)用氟標(biāo)記的葡萄糖對(duì)比劑(FDG-PET)進(jìn)行的腦部PET成像測(cè)定的(Buckneret.al，2005)。通過(guò)比較在治療之前、期間和之后用此方法生成的圖像，在用年齡匹配的未患阿爾茨海默病的受試者作為對(duì)照時(shí)，可評(píng)估到到以前表現(xiàn)葡萄糖攝取下降的阿爾茨海默病患者腦區(qū)中葡萄糖攝取的提高。術(shù)語(yǔ)“改善的原纖維切割”是指蛋白水解消化原纖維的能力增強(qiáng)。術(shù)語(yǔ)“斑塊分解”是指原纖維的蛋白水解切割的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“斑塊負(fù)荷”是指構(gòu)成斑塊的聚集原纖維的總量。術(shù)語(yǔ)“tau磷酸化的下降”是指腦部細(xì)胞內(nèi)的tau蛋白磷酸化的量下降。治療阿爾茨海默病和遺忘性輕度認(rèn)知缺損的方法本發(fā)明提供了治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段在治療阿爾茨海默病或其癥狀中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段可與第二種用于治療阿爾茨海默病的治療性化合物共同給藥。下面更詳細(xì)地討論用于治療阿爾茨海默病的化合物的實(shí)例。治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段可口服給藥或更優(yōu)選地鼻內(nèi)給藥。下面更詳細(xì)地討論給藥方法。本發(fā)明還提供組織激肽釋放酶或其變體或活性片段在治療阿爾茨海默病相關(guān)病癥中的應(yīng)用，其中所述病癥包括神經(jīng)學(xué)病癥如記憶、語(yǔ)言、視覺(jué)能力和問(wèn)題解決，以及心理學(xué)病癥如情感淡漠、易怒、焦慮、沮喪、妄想、幻覺(jué)、失眠、厭食、精神空虛、失禁或回避社交。阿爾茨海默病與胰島素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的腦部特異性異常有關(guān)(Lester-Colletal.,J.AlzheimersDis.2006,9(1)13-33(只有摘要))。動(dòng)物模型示出了由于磷酸化tau蛋白和Αβ的水平上升以及編碼tau蛋白和淀粉樣前體蛋白的基因的上調(diào)表達(dá)而導(dǎo)致的神經(jīng)退化。這些基因表達(dá)的改變直接導(dǎo)致編碼胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子II和多種胰島素相關(guān)受體(胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體、胰島素受體底物-I、胰島素樣生長(zhǎng)因子II受體受體)的基因的表達(dá)下降以及與所述胰島素受體結(jié)合的配體減少(Lester-Colletal.，2006)。阿爾茨海默病患者經(jīng)常具有由胰島素異常導(dǎo)致的腦細(xì)胞中葡萄糖攝取和代謝的下降。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善患者腦部葡萄糖攝取的應(yīng)用。淀粉樣斑塊沉積是與阿爾茨海默病有關(guān)的主要病狀。已發(fā)現(xiàn)，斑塊清除可能與內(nèi)源蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)有關(guān)(Yan，2006)。由于KLKl具有抗淀粉樣蛋白攻擊的保護(hù)能力，KLKl也可有益于治療唐氏綜合癥患者。唐氏綜合癥是由21號(hào)染色體的額外拷貝引起的，這可導(dǎo)致某些蛋白的過(guò)表達(dá)?？杀磺懈疃纬搔ˇ?APP)的淀粉樣前體蛋白位于21號(hào)染色體上，并且推測(cè)其產(chǎn)生的增加促進(jìn)了唐氏綜合癥患者的阿爾茨海默病的早發(fā)。KLKl可直接切割纖維淀粉樣蛋白斑塊。切割這些淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的標(biāo)記的能力可減少阿爾茨海默病和唐氏綜合癥中的斑塊。這些纖維淀粉樣斑塊的直接切割可治療這些疾病，例如幫助與阿爾茨海默病有關(guān)的認(rèn)知下降。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于消化或切割淀粉樣蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者腦中斑塊清除的應(yīng)用。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段可用于改善原纖維的切割。原纖維的蛋白水解切割導(dǎo)致構(gòu)成纖維淀粉樣斑塊的聚集原纖維的總量降低并因此導(dǎo)致染病患者腦中斑塊清除的改善。GSK-3β激酶的活性是通過(guò)其對(duì)tau和APP的磷酸化在阿爾茨海默病的發(fā)展中起重要作用的因子。Tau磷酸化導(dǎo)致的纏結(jié)的形成造成神經(jīng)退化，而磷酸化有利于APP轉(zhuǎn)變?yōu)棣ˇ碌倪^(guò)程，從而導(dǎo)致淀粉樣蛋白斑塊的形成。用特異抑制劑如鋰對(duì)GSK-3i3的直接抑制可減少tau磷酸化、纏結(jié)、神經(jīng)退化和APP轉(zhuǎn)變?yōu)锳β的過(guò)程(Biochemistry2004Jun8；43(22)6899-908；ProcNatlAcadSciUSA.2005May10；102(19):6990_5)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于減少需要所述治療的患者腦中tau磷酸化的應(yīng)用。GSK-3β的活性通常受Akt的絲氨酸9磷酸化的調(diào)控。值得注意的是，由激肽激活的舒緩激肽Β2受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(JBiolChem.2005Mar4；280(9):8022_30)和NGF-乙酰膽堿通路(JNcurosci.19935??；13(9)3956-63；NeurobiolAging2006Mar；27(3)413-22.)導(dǎo)致GSK-3i3磷酸化增加。這兩種通路都被認(rèn)為受胞外蛋白酶包括KLKl的調(diào)控(FEBSLett.1990Jul16；267(2)207-12；Hypertension2006Apr；47(4):752_61)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于減少需要所述治療的患者腦中tau磷酸化的應(yīng)用。已知神經(jīng)脈管系統(tǒng)功能障礙促進(jìn)阿爾茨海默病的病理和發(fā)展。神經(jīng)脈管系統(tǒng)功能障礙可能會(huì)是由不良斑塊清除導(dǎo)致的發(fā)炎引起。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要所述治療的患者的神經(jīng)脈管系統(tǒng)的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括需要所述治療的患者腦部血流的改善和/或氧攝取的改善。遺忘性MCI代表正常認(rèn)知和見于阿爾茨海默病的癡呆之間的中間狀態(tài)。因此，不足為奇地，遺忘性MCI的神經(jīng)病理學(xué)表達(dá)顯示其自身為向阿爾茨海默病發(fā)展的過(guò)渡狀態(tài)。具體地，在遺忘性MCI發(fā)現(xiàn)了腦內(nèi)側(cè)顳葉結(jié)構(gòu)內(nèi)的tau纏結(jié)的優(yōu)勢(shì)表達(dá)和更類似于正常健康個(gè)體中存在的淀粉樣負(fù)荷(ArchNeurol.2006May；63(5):665_72)。如此，在所述阿爾茨海默病病理學(xué)中涉及的機(jī)制也在遺忘性MCI中起作用，因此KLKl用于治療阿爾茨海默病的治療作用也同樣適用于治療遺忘性MCI和向阿爾茨海默病的發(fā)展。如此，通過(guò)給予KLK1、其變體或活性片段來(lái)治療阿爾茨海默病或遺忘性MCI的方法可改善腦中的斑塊清除。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療遺忘性MCI的應(yīng)用。一個(gè)實(shí)施方案包括一種通過(guò)口服或更優(yōu)選地通過(guò)鼻內(nèi)給予治療有效量的組織激肽釋放酶來(lái)治療哺乳動(dòng)物中遺忘性MCI的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織激肽釋放酶可與第二種用于治療阿爾茨海默病或遺忘性MCI的治療性化合物共同給藥。下面更詳細(xì)地描述這些化合物的實(shí)例。組織激肽釋放酶的給藥治療腦部營(yíng)養(yǎng)疾病(aliment)的的傳統(tǒng)給藥模式包括口服以及靜脈內(nèi)給藥途徑。這些模式并非總是理想的?；衔锏目诜o藥導(dǎo)致有限的生物利用度(溶解性、首過(guò)肝臟降解、血腦屏障限制)以及時(shí)間釋放問(wèn)題和潛在的不希望的腸胃副作用。然而，組織激肽釋放酶(KLKl)似乎能夠通過(guò)并可繞開血腦屏障以對(duì)腦部產(chǎn)生作用。靜脈內(nèi)(i.v.)給藥需要經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的醫(yī)務(wù)專業(yè)人員，這對(duì)衛(wèi)生保健系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是費(fèi)時(shí)和昂貴的。其還會(huì)導(dǎo)致患者順應(yīng)性問(wèn)題。與靜脈內(nèi)給藥有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括注射點(diǎn)的感染以及對(duì)患者和給予所述劑量的專業(yè)人員都存在的安全問(wèn)題。然而，在受控環(huán)境下，靜脈內(nèi)給藥可為有效的。鼻內(nèi)給藥允許藥物“快速作用”，因?yàn)槠淠軌蛲ㄟ^(guò)更直接的途徑到達(dá)腦部。鼻內(nèi)給藥很方便并且實(shí)際上消除了見于靜脈內(nèi)給藥時(shí)的患者順應(yīng)性問(wèn)題。嗅覺(jué)上皮細(xì)胞是選擇性透過(guò)的。因此，蛋白如KLKl可通過(guò)并可經(jīng)鼻內(nèi)途徑繞過(guò)血腦屏障。因此KLKl的鼻內(nèi)給藥可直接對(duì)腦部產(chǎn)生作用——從而也使外周作用最小化。這是由于在鼻通道上部的嗅覺(jué)區(qū)域的參與。鼻內(nèi)給藥的物質(zhì)可在嗅覺(jué)區(qū)域遵循兩種可能的途徑——神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外卜。神經(jīng)院內(nèi)途徑包括將肽攝取到嗅覺(jué)神經(jīng)元中，其中肽沿著軸突移動(dòng)以繞開血腦屏障。通過(guò)嗅覺(jué)區(qū)域上皮細(xì)胞中唯一的細(xì)胞間裂是一種允許肽擴(kuò)散到蛛網(wǎng)膜下隙的胞外途徑。由于能夠快速到達(dá)腦部、避開神經(jīng)元內(nèi)途徑包括的蛋白水解降解(Bornetal.,Nat.Neurosci.2002,5(6):514_6)以及在腦部多個(gè)位點(diǎn)上快速誘發(fā)生物學(xué)作用(Throneetal.，2004)，因此胞外途徑是更加優(yōu)選的。鼻內(nèi)給藥相對(duì)于口服給藥的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可將KLKl更直接地遞送到所需的作用位點(diǎn)(腦部)。藥物組合物可通過(guò)口服或鼻內(nèi)給藥。適于鼻內(nèi)給藥的制劑包括軟膏劑、乳劑、洗齊、貼劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、油劑等。溶液或懸浮液可通過(guò)傳統(tǒng)工具例如點(diǎn)滴器、移液器或噴霧器直接施用于鼻腔。制劑可以單次或多次劑量的形式提供。對(duì)于用點(diǎn)滴器或移液器的后一種情況，可通過(guò)給予患者合適的預(yù)設(shè)體積的所述溶液或懸浮液實(shí)現(xiàn)。噴霧劑包括一個(gè)定量霧化噴霧泵。用于氣霧劑給藥，特別是給予包含鼻腔和嗅覺(jué)區(qū)域的上呼吸道，的制劑的給藥方式包括鼻內(nèi)給藥?；钚猿煞直谎b在一個(gè)帶有合適的推進(jìn)劑的加壓包中，所述推進(jìn)劑包括但不限于含氯氟烴(CFC)、二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或者二氧化碳或其他合適的氣體。氣霧劑也可包含一種表面活性劑如卵磷脂。藥物劑量可通過(guò)定量閥來(lái)控制?；蛘呋钚猿煞挚梢愿煞鄣男问教峁?。所述化合物的粉末混合物可存在于合適的粉末基質(zhì)如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(如羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷(PVP))中。所述粉末空白溶劑可在鼻腔內(nèi)形成凝膠。粉末組合物可以單位劑量的形式存在，所述單位劑量的形式包括但不限于膠囊或藥筒(如可通過(guò)吸入器給予其中所述粉末的明膠或泡狀包)?？诜o藥包括溶液、片劑、緩釋膠囊、腸衣膠囊、口服崩解片劑和糖漿的經(jīng)腸給藥?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊笔侵笩o(wú)毒但足以提供所需效果的藥物或試劑的量。在一種組合治療中，所述組合的一種成分的“有效量”是當(dāng)所述化合物與所述組合的其他成分組合使用時(shí)可有效提供所需效果的量?！坝行А钡牧繒?huì)隨受試者的不同而變動(dòng)，依賴于個(gè)體的年齡和綜合情況、一種或多種特定活性試劑等。對(duì)于任何個(gè)案，合適的“有效”量可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。用于治療上述疾病或其癥狀的本發(fā)明化合物的治療有效量可在所述疾病或癥狀發(fā)作之前、發(fā)作同時(shí)或發(fā)作之后給藥。本發(fā)明的化合物可在所述疾病或癥狀發(fā)作的同時(shí)給藥。本文所用的“共同給藥”和“同時(shí)給予”包括以混合物的形式(如以藥物組合物或以溶液的形式)給予本發(fā)明的多肽和另一種治療劑，或分別給予本發(fā)明的化合物和另一種治療齊U，例如相繼、同時(shí)或在不同時(shí)間給予單獨(dú)的藥物組合物或溶液，但所述不同時(shí)間之間不能相距遠(yuǎn)到使本發(fā)明的化合物和另一種治療劑不能相互作用和不能給予較低劑量的活性成分。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括如本文所述的一種方法，所述方法還包含共同給予另一種用于治療阿爾茨海默病的治療性化合物。阿爾茨海默病的治療性化合物包括但不限于乙酰膽堿前體、增加一種乙酰膽堿前體、一種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物、一種乙酰膽堿酯酶抑制劑、一種毒蕈堿激動(dòng)劑、一種抗氧化劑、一種抗炎藥、一種激素、一種鈣通道阻滯齊U、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一種益智劑、一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子小分子模擬物(Massaetal.,.J.Mol.Neurosci.2002,19107-111)、NMDA受體拮抗劑、一種5-HT1A受體激動(dòng)劑、一種抗淀粉樣蛋白生成劑如tramiprosate(Alzemed)、一種抗組胺藥如迪姆朋(Dimebon)、一種甲磺酸雙氫麥角堿(HYDERGINE)、銀杏或石杉?jí)A甲。這些化合物也可用于治療遺忘性MCI。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括一種可為膽堿、卵磷脂或乙酰-1-肉毒堿的乙酰膽堿前體。—種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物包括但不限于4-氨基吡啶或利諾吡啶。一種乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChE)包括但不限于毒扁豆堿、他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏(RAZADYNE)、敵百蟲、石杉?jí)A甲或依斯的明。一種毒蕈堿激動(dòng)劑包括但不限于米拉美林、咕諾美林、檳榔堿、氧化震顫素、沙可美林或他沙利定。一種抗氧化劑選自但不限于維生素E、艾地苯醌、輔酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或維生素C。一種抗炎藥包括非留類抗炎藥。一種激素包括但不限于雌激素或睪酮。一種益智劑包括但不限于吡拉西坦、阿尼西坦(aniracetam)、法索西坦(fosracetam)、奈非西坦(nefiracetan)、普拉西坦(pramiracetam)、奈拉西坦(nebracetam)禾口奧拉西坦(oxiracetam)。一種NMDA受體拮抗劑包括但不限于美金胺(memantine)；克他命(ketamine)；MK-801；L-70U324；L_689、560；GV196771A；2-氨基-5-膦?；焖?AP5)；(R)-CPP-ene；和(2S*，3R*)-l-(聯(lián)苯基-4-羰基)哌嗪_2，3-二羧酸(PBPD)。“治療”和“處理”是指防止、抑制和/或減輕疾病及相關(guān)癥狀，以及治愈侵染哺乳動(dòng)物器官和組織的疾病病癥或癥狀。本發(fā)明的組合物可在任何提及的病癥發(fā)生之前、期間和之后以治療有效量被給藥。藥物組合物本發(fā)明提供適于口服或鼻內(nèi)給藥的包含組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的藥物組合物在治療阿爾茨海默病、遺忘性MCI及其癥狀中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種配制用于口服給藥的藥用組合物，其每個(gè)給藥頻率含有約0.001-約1000國(guó)際單位(IU)的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種鼻內(nèi)給藥劑量可為約0.001-100IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種鼻內(nèi)給藥劑量可為約0.001-10IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種鼻內(nèi)給藥劑量可為約0.Ol-IOiuo組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種鼻內(nèi)給藥劑量可為約0.Ol-Iiuo組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種鼻內(nèi)給藥劑量可為約0.1-Iiuo本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種配制用于鼻內(nèi)給藥的藥用組合物，其每個(gè)給藥頻率含有約0.001-約5000IU的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.001-500IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.001-50IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.01-50IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.01-5IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.1-5IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的一種口服劑量可為約0.I-1IU所述藥物組合物還可包含如上所述的第二種可用于治療阿爾茨海默病或遺忘性MCI的治療性化合物。本發(fā)明的藥物組合物口服或鼻內(nèi)給藥的制劑。適于鼻內(nèi)給藥的制劑包括粉末劑、粒劑、溶液、滴劑、軟膏劑、乳劑、洗劑、貼劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、油劑等。本發(fā)明的溶液或懸浮液可通過(guò)傳統(tǒng)工具如點(diǎn)滴器、移液器或噴霧器直接施用于鼻腔。制劑可以單次或多次劑量的形式提供。溶液可為無(wú)菌、等滲或低滲的，或者適于通過(guò)注射或其他方式給藥并可含有合適的佐劑、緩沖液、防腐劑和鹽。溶液如滴鼻劑可含有抗氧化劑、緩沖液等。粉末或顆粒形式的藥物組合物可與溶液以及與稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑結(jié)合。用于氣霧劑給藥的制劑包括被設(shè)計(jì)用于鼻內(nèi)給藥的制劑?；钚猿煞挚杀谎b在一個(gè)帶有合適的推進(jìn)劑的加壓包中，所述推進(jìn)劑包括但不限于含氯氟烴(CFC)(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他合適的氣體。氣霧劑也可包含一種表面活性劑如卵磷脂。藥物劑量可通過(guò)定量閥來(lái)控制?；蛘呋钚猿煞挚梢愿煞鄣男问奖惶峁?，例如存在于合適的粉末基質(zhì)如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(如羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷(PVP))中的所述化合物的粉末混合物。所述粉末空白溶劑可在鼻腔內(nèi)形成凝膠。粉末組合物可以單位劑量的形式存在，如在膠囊或藥筒(如可通過(guò)一種裝置給予其中所述粉末的明膠或泡狀包)中。一種配制用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物包含約0.001-約5000IU的KLKl或其變體或活性片段，任選地還包含一種藥學(xué)可接受的賦形劑。適于口服給藥的制劑包括液體、丸齊、溶液、片劑、緩釋膠囊、腸衣膠囊或糖漿。一種配制用于口服給藥的藥物組合物包含約0.001-1000IU的KLKl或其變體或活性片段，任選地還包含一種藥學(xué)可接受的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種配制用于口服給藥的藥物組合物包含至少約ι.Oμg/ml的KLKl或其變體或活性片段，任選地還包含一種藥學(xué)可接受的賦形劑。一種組合物可包含至少約2.0μg/ml、2.5μg/ml,5μg/ml、7.5μg/ml或10μg/ml的KLKl或其變體或活性片段。用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物及其應(yīng)用本發(fā)明的一個(gè)方面包括一種配制用于鼻內(nèi)給藥的組合物，其包含約0.001-約5000IU的KLKl或其變體或活性片段，任選地包含一種藥學(xué)可接受的賦形劑。一種組合物可對(duì)人類或其他哺乳動(dòng)物的鼻腔給藥，通過(guò)所述嗅覺(jué)神經(jīng)通路到達(dá)腦部的患病區(qū)域。本方法可采用一種能夠?qū)LKl轉(zhuǎn)運(yùn)到腦部患病神經(jīng)元的藥物組合物。一種本發(fā)明的方法可通過(guò)逆行和順行跨神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將化合物遞送到腦部患病區(qū)域。通過(guò)該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將神經(jīng)試劑向腦部的遞送可以數(shù)種方式實(shí)現(xiàn)。一種技術(shù)包含將一種神經(jīng)試劑單獨(dú)遞送到鼻腔。在這種情況下，KLKl的化學(xué)特征可促進(jìn)其到腦部患病神經(jīng)元的轉(zhuǎn)運(yùn)。可利用所述嗅覺(jué)神經(jīng)通路的外周神經(jīng)細(xì)胞來(lái)將KLKl遞送到與嗅球相連的腦部區(qū)域中受損神經(jīng)元處。KLKl可單獨(dú)對(duì)鼻腔給藥，或結(jié)合第二種可用于治療阿爾茨海默病的治療性化合物給藥。KLKl可結(jié)合空白溶劑和/或其他佐劑以形成一種藥物組合物。可能的佐劑包括但不限于，GM-1、磷脂酰絲氨酸(PS)和乳化劑(如聚山梨醇酯80)。其他補(bǔ)充物質(zhì)包括但不限于親脂性物質(zhì)如神經(jīng)節(jié)糖苷和磷脂酰絲氨酸(PS)。一種本發(fā)明的方法將KLKl遞送到哺乳動(dòng)物的鼻腔中。優(yōu)選地，將KLKl遞送到鼻腔上三分之一的嗅覺(jué)區(qū)域，特別是遞送到嗅覺(jué)上皮細(xì)胞以促進(jìn)所述試劑被轉(zhuǎn)運(yùn)到外周嗅覺(jué)神經(jīng)元中而不是呼吸上皮細(xì)胞內(nèi)的毛細(xì)血管中。從而將KLKl通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到腦部和腦中的受損神經(jīng)元。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，KLKl可與由親脂性物質(zhì)構(gòu)成的膠束結(jié)合。這些膠束可改變鼻黏膜的滲透性并增強(qiáng)所述試劑的吸收。親脂性膠束包括神經(jīng)節(jié)糖苷，特別是GM-I神經(jīng)節(jié)糖苷，以及磷脂酰絲氨酸(PS)。一旦KLKl通過(guò)嗅覺(jué)上皮細(xì)胞，本發(fā)明還提供KLKl沿嗅覺(jué)神經(jīng)通路的轉(zhuǎn)運(yùn)。KLKl能夠在嗅覺(jué)系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。具體地，已經(jīng)證明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)軸突生長(zhǎng)物質(zhì)可快速進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞膜和具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞受體位點(diǎn)的親和性。為將KLKl轉(zhuǎn)運(yùn)到嗅覺(jué)神經(jīng)元，可將KLKl單獨(dú)或結(jié)合其他物質(zhì)作為一種藥物組合物給藥到位于鼻腔上三分之一的嗅覺(jué)區(qū)域。可用注射器、packtail、棉棒(pledget)或粘膜下輸注通過(guò)軟管或?qū)Ч軐⑺鼋M合物以粉末或液體的鼻噴霧劑、滴鼻劑、凝膠或軟膏劑形式分散給藥到鼻內(nèi)。鼻內(nèi)給藥的藥物組合物可被配制為粉末、顆粒、溶液、軟膏劑、乳劑、氣霧劑、粉末或滴劑。溶液可為無(wú)菌、等滲或低滲的，或者適于通過(guò)注射或其他方式給藥。除了KLK1，溶液可含有合適的佐劑、緩沖液、防腐劑和鹽。粉末或顆粒形式的藥物組合物可與溶液以及與稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑結(jié)合。溶液如滴鼻劑可含有抗氧化劑、緩沖液等。所述嗅覺(jué)系統(tǒng)提供外部環(huán)境和腦部的直接連接，因此可快速和方便地遞送KLKl用于治療阿爾茨海默病和遺忘性輕度認(rèn)知缺損。此外，鼻內(nèi)應(yīng)用藥物組合物的方式可為多種形式，如粉末、噴霧劑、或滴鼻劑，這些形式可省卻靜脈或肌肉注射并且簡(jiǎn)化治療性藥劑的給藥。本發(fā)明將就多種具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)進(jìn)行描述。然而，應(yīng)理解在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)還可進(jìn)行許多變化和改進(jìn)。實(shí)施例實(shí)施例1體外淀粉樣蛋白切割測(cè)定原纖維的制備將合成人淀粉樣蛋白Αβ1-42或Αβ1_40溶解于二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,St.Louis,MO)至5mM濃度，然后在即將使用前在MilliQ水中稀釋至終濃度25mM。為制備淀粉樣蛋白原纖維(fAβ)，將5mM的Aβ1-42或Aβ1-40的DMSO溶液在IOmMHCl中稀釋至100μM(對(duì)于Aβ1-42)或200福(對(duì)于々01-40)，渦旋混合30s，在37°C下孵育5天。原纖維的消化KLKl(Sigma)用于在下列緩沖液中進(jìn)行消化反應(yīng)ECE、0.IMMES,0.IMNaCl(pH6.0)；IDE、50mMTrisUMNaCl(pH7.5)；ΝΕΡ、0·IMMES(pH6.5)；禾口MMP_9、50mMTris-HCKpH7.5)UOmMCaCl2、150mMNaCl.O.05%Brij35。將其在37°C下孵育4小時(shí)到5天。消化后，用質(zhì)譜分析所述反應(yīng)。原纖維切割的分析將所述樣品加入50mM甘氨酸(pH9.2)/2mM硫磺素T(ThT)(Sigma)中，終體積為2ml。熒光用分光光度計(jì)測(cè)量，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為435和485nm。分析說(shuō)明KLKl可切割淀粉樣蛋白原纖維(圖1)和可溶性淀粉樣蛋白寡聚物(圖2)。在圖1中，圖A只示出了Αβ，其中有大塊淀粉樣蛋白原纖維并且無(wú)小片段出現(xiàn)。圖B只示出了KLK1，其中無(wú)明顯的小肽片段。然而，在圖C中，在約2423Μ/Ζ(質(zhì)量與電荷比)處有一個(gè)明顯的峰，這說(shuō)明發(fā)生了切割。在圖2中，圖A示出了可溶性淀粉樣蛋白在約4000-5000M/Z之間有可見峰。在圖B中，當(dāng)將KLKl加入至可溶性淀粉樣蛋白時(shí)無(wú)可見峰。這說(shuō)明KLKl將可溶性淀粉樣蛋白切割為更小的片段。該結(jié)果顯示KLKl可切割原纖維和可溶形式的淀粉樣蛋白，表明KLKl可用于治療與原纖維斑塊和可溶性淀粉樣蛋白有關(guān)的疾病。實(shí)施例2組織激肽釋放酶對(duì)Αβ丨在大鼠混合皮層培養(yǎng)物中毒件的作用研究了用組織激肽釋放酶預(yù)處理是否可保護(hù)大鼠混合皮層培養(yǎng)物免于接觸人淀粉樣β肽(Αβ^)。通過(guò)一種細(xì)胞壞死的標(biāo)志——LDH釋放分析了細(xì)胞死亡，并通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析了細(xì)胞存活率。第一(研究方案Α)，進(jìn)行Ah_42損傷前(-24小時(shí)和-30分鐘)將組織激肽釋放酶加入所述細(xì)胞中。而在第二部分(研究方案B)中，在Ah_42損傷之前(-30分鐘)以及損傷之后+24小時(shí)將組織激肽釋放酶加入所述細(xì)胞中。在+24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)不更換細(xì)胞培養(yǎng)基(將組織激肽釋放酶或相應(yīng)量的空白溶劑加入至孔中)，而在-24小時(shí)和-30分鐘的時(shí)間點(diǎn)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。TffeRNAC細(xì)胞培養(yǎng).從E18Wistar大鼠胚胎(NationalAnimalCenter,Kuopio,Finland)獲得混合皮層培養(yǎng)物。將所述皮層解剖取出，并將該組織切成小片。通過(guò)用DNA酶(DNase)和木瓜蛋白酶孵育15分鐘分離所述細(xì)胞。通過(guò)離心(1500rpm，5分鐘)收集所述細(xì)胞。用移液器將所述組織研碎，并將所述細(xì)胞以300000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度置于聚-L-賴氨酸包覆的48孔板上，補(bǔ)加有2mM谷氨酰胺、0.1μg/ml慶大霉素、10%熱滅活的胎牛血清(FBS-HI)和10%熱滅活的馬血清(HS-HI)的MEM(2g/L葡萄糖)中。3_4小時(shí)后，將所述培養(yǎng)基更換為補(bǔ)加有2mM谷氨酰胺、0.1μg/ml慶大霉素、5%HS-HI的MEM(2g/L葡萄糖)。體外培養(yǎng)三天后，對(duì)所述細(xì)胞更換補(bǔ)加有谷氨酰胺、慶大霉素、和5%的兩種血清的MEM(2g/L葡萄糖)培養(yǎng)基。在體外培養(yǎng)的第6天，通過(guò)加入胞嘧啶阿拉伯糖苷(10μM終濃度)抑制不想要的細(xì)胞分化24小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)前對(duì)所述培養(yǎng)物重新添加補(bǔ)加有谷氨酰胺、慶大霉素和5%HS-HI的MEM(2g/L葡萄糖)。ΑβH2接觸.將組織激肽釋放酶(SEQIDNO1)溶于補(bǔ)加有葡萄糖、谷氨酰胺、慶大霉素和5%HS-HI的MEM并用此培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋。作為全部神經(jīng)元死亡的對(duì)照，使用300μMN-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)孵育48小時(shí)和10μMAβ^42孵育48小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)大約30-50%的細(xì)胞死亡。只用培養(yǎng)基處理過(guò)的孔用作0-對(duì)照。在加入10μMAβ!_42前-24小時(shí)和-30分鐘將組織激肽釋放酶或空白溶劑用移液器加入細(xì)胞中。在接觸后+24小時(shí)再次將組織激肽釋放酶或空白溶劑用移液器加入細(xì)胞中。LDH測(cè)量.48小時(shí)后，收集全部孔的培養(yǎng)基，并通過(guò)離心(13000rpm，3分鐘)除去可能的細(xì)胞殘骸。將100μ1的等分試樣用移液器加入微量滴定板中作為多個(gè)重復(fù)，再向這些孔中用移液器加入等量的LDH試劑。然后立即在MultiskanELISA讀出器中用3分鐘動(dòng)力學(xué)檢測(cè)法測(cè)量340nm處的吸光度。測(cè)定吸光度/分的改變，此結(jié)果與所釋放的LDH成正比。剩下的上清液(50μ1)在干冰中速凍以貯存。神經(jīng)元存活的免疫細(xì)胞化學(xué)。為進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)，用含有4%多聚甲醛的0.OlMPB將所述培養(yǎng)物固定30分鐘，然后用PBS洗滌兩次。所固定的細(xì)胞首先被通透化，然后通過(guò)用含有牛血清白蛋白和0.3%TritonX-100的PBS封閉緩沖液孵育30分鐘來(lái)封閉非特異性的結(jié)合。抗神經(jīng)細(xì)胞核抗體(抗-NeuN，稀釋度1500，Chemicon,Temecula,CA)用作第一抗體。所述細(xì)胞用第一抗體孵育48小時(shí)，然后用生物素化的第二抗體(1200，VectorLabs)孵育2小時(shí)，再用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC-試劑，1200，VectorABCEliteKit,VectorLabs)孵育2小時(shí)。使用Ni-增強(qiáng)的DAB作為底物(DABSubstratekit,VectorLabs)使陽(yáng)性細(xì)胞可視化。NeuN免疫陽(yáng)性神經(jīng)元用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)?？偣驳?，對(duì)每孔的2個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。此結(jié)果表示為存活神經(jīng)元的百分比。數(shù)據(jù)分析。所用的每種化合物濃度的孔數(shù)為6(η=6)。在兩個(gè)研究方案中都研究T5種組織激肽釋放酶的濃度(0.001，0.01，0.1，1，10μg/ml)。統(tǒng)計(jì)分析用StatsDirect統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。先用單因素方差分析再用Durmet檢驗(yàn)分析所得數(shù)值(與空白溶劑處理組相比)。結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的形式表示，并且P<0.05水平的差異被認(rèn)為是在統(tǒng)計(jì)意義上顯著的。MM組織激肽釋放酶結(jié)果。(研究方案A)只在AiBp42損傷(10μM終濃度)之前-24小時(shí)和-30分鐘將組織激肽釋放酶加入所述細(xì)胞中。在-24小時(shí)和-30分鐘的時(shí)間點(diǎn)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。以NMDA對(duì)照導(dǎo)致的LDH釋放為100%，在不存在組織激肽釋放酶的情況下AβH2導(dǎo)致39.14%的LDH釋放。濃度為0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml禾口1.0μg/ml的組織激肽釋放酶不改變Aβ工吣損傷后的LDH釋放(圖3)。然而，10μg/ml的組織激肽釋放酶顯著地降低了LDH釋放。同樣，較低濃度的組織激肽釋放酶不影響AβH2損傷后的(存活)細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖4)。與被Ai^_42損傷并無(wú)組織激肽釋放酶的RMCC相比，l.Oyg/ml和10μg/ml的組織激肽釋放酶的保護(hù)使RMCC計(jì)數(shù)增加。10μg/ml的保護(hù)是在統(tǒng)計(jì)意義上顯著的。(研究方案B)在AβH2損傷(10μM終濃度)之前(-30分鐘)和Aβ卜42損傷之后+24小時(shí)將組織激肽釋放酶加入所述細(xì)胞中。在+24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，不更換細(xì)胞培養(yǎng)基(將組織激肽釋放酶或相應(yīng)量的空白溶劑加入孔中)，而在-30分鐘的時(shí)間點(diǎn)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。以NMDA對(duì)照導(dǎo)致的LDH釋放為100%，在不存在組織激肽釋放酶的情況下Aβ卜42導(dǎo)致43.87%的LDH釋放。濃度為0.001μg/ml、0.01μg/ml和0.1μg/ml的組織激肽釋放酶不改變Aβi_42損傷后的LDH釋放(圖5)。然而，1.0μg/ml和10μg/ml的組織激肽釋放酶減少了LDH釋放，且給予10μg/ml的組織激肽釋放酶使LDH釋放產(chǎn)生了在統(tǒng)計(jì)意義上顯著的降低。同樣，較低濃度的組織激肽釋放酶不影響Aβ工吣損傷后的(存活)細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖6)。與被Aβ!_42損傷并且無(wú)組織激肽釋放酶的RMCC相比，當(dāng)對(duì)RMCC應(yīng)用1.0μg/ml和10μg/ml的組織激肽釋放酶時(shí)可觀察到細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加。10μg/ml的保護(hù)是在統(tǒng)計(jì)意義上顯著的。如通過(guò)測(cè)量LDH釋放和神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)(兩個(gè)試驗(yàn)都是統(tǒng)計(jì)意義上顯著的)確定的，在兩種組織激肽釋放酶給藥方案(上述研究方案A和研究方案B)中，10μg/ml的組織激肽釋放酶都降低了Αβi_42誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。這些結(jié)果表明組織激肽釋放酶的預(yù)處理(-24小時(shí)和-30分鐘)以及組織激肽釋放酶的結(jié)合預(yù)處理(-30分鐘)與后處理(+24小時(shí))可保護(hù)大鼠皮層培養(yǎng)物免于Aβi_42誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。實(shí)施例3使用不同處理方案時(shí)10μR/ml的組織激肽釋放酶對(duì)Aβ在大鼠混合皮層培養(yǎng)細(xì)胞中毒件的作用還檢測(cè)了10μg/ml的組織激肽釋放酶對(duì)Aβ^42在大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)中毒性的作用。用于檢測(cè)激肽釋放酶作用的方法與在實(shí)施例2中用于檢測(cè)組織激肽釋放酶的方法相同。檢測(cè)了三種不同的激肽釋放酶(10μg/ml)對(duì)RMCC的給藥方案——研究方案A)在Aβ卜42損傷前24小時(shí)和30分鐘，研究方案B)在Aβ卜42損傷前30分鐘和在Aβ卜42損傷后24小時(shí)，以及研究方案C)在Aβi_42損傷前24小時(shí)和30分鐘并且在Aβ^42損傷后24小時(shí)。結(jié)果示于圖7。用10μg/ml的激肽釋放酶處理RMCC確實(shí)保護(hù)了免于Aβ^損傷，因?yàn)樵谌咳N處理方案中均觀察到LDH釋放在統(tǒng)計(jì)意義上顯著的降低。這些結(jié)果表明用固定濃度的組織激肽釋放酶(10μg/ml)的預(yù)處理(-24小時(shí)和-30分鐘)，結(jié)合預(yù)處理(-30分鐘)與后處理(+24小時(shí))，和結(jié)合預(yù)處理(-24小時(shí)和-30分鐘)與后處理(+24小時(shí))可保護(hù)大鼠皮層培養(yǎng)物免于Aβi_42誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。實(shí)施例4:胰激肽(InM-IOOnM)對(duì)Aβ丨在大鼠混合皮層培養(yǎng)物中毒件的作用還檢測(cè)了胰激肽對(duì)Αβ工吣在大鼠混合皮層培養(yǎng)物RMCC)中毒性的作用。用于檢測(cè)胰激肽作用的方法與實(shí)施例2中用于檢測(cè)組織激肽釋放酶的方法相同。檢測(cè)了三種不同的胰激肽對(duì)RMCC的給藥方案——研究方案Α)在Αβi_42損傷前24小時(shí)和30分鐘，研究方案B)在Aβ卜42損傷前30分鐘和在Aβ卜42損傷后24小時(shí)，以及研究方案C)在Aβ卜42損傷前24小時(shí)和30分鐘并且在AβH2損傷后24小時(shí)。在研究方案A、B和C中，用胰激肽(ΙηΜ、5nM、10nM、50nM和IOOnM)處理RMCC不改變Aβ^42損傷后的LDH釋放(圖8_10)并且不影響Aβ^42損傷后的(存活)細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖11-13)。這是反直覺(jué)的，因?yàn)橐燃る募せ钍婢徏る摩?受體，這會(huì)引起可切割淀粉樣蛋白的ΜΜΡ-9表達(dá)的增加。人們會(huì)推測(cè)，由胰激肽給藥引起的ΜΜΡ-9增加會(huì)導(dǎo)致對(duì)淀粉樣蛋白的切割并且抵御Aβi_42誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。實(shí)施例5胰激肽(1μΜ-100μΜ)對(duì)Aβ卜42在大鼠混合皮層培養(yǎng)物中毒性的作用根據(jù)實(shí)施例4的方法和研究方案再次檢測(cè)了塍激肽對(duì)AβH2在大鼠混合皮層培養(yǎng)物(RMCC)中毒性的作用。結(jié)果示于圖14-16的研究方案Α、Β和C中。用IyM和IOyM的胰激肽處理RMCC確實(shí)在研究方案Α、Β或C中改變了AβH2損傷后的LDH釋放。然而，非常意外的是，與只有Aβ^42損傷相比，用100μM的適激肽處理RMCC顯著地造成了Aβ^42損傷后的細(xì)胞死亡，表明此濃度的塍激肽對(duì)RMCC具有毒性。這是反直覺(jué)的，因?yàn)殡蠹る募せ钍婢徏る摩?受體，這會(huì)引起可切割淀粉樣蛋白的ΜΜΡ-9表達(dá)的增加。人們會(huì)推測(cè)，由胰激肽給藥引起的ΜΜΡ-9增加會(huì)導(dǎo)致對(duì)淀粉樣蛋白的切割并目.抵御Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。^MM6鼻內(nèi)組jR激肽釋放勿代i射云力力學(xué)研究此研究的目的是確定對(duì)麻醉大鼠鼻內(nèi)給藥后到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外圍組織的組織釋放激酶(KLKl)的量。在KLKl給藥后30分鐘，先用冰冷鹽溶液再用多聚甲醛固定劑經(jīng)心臟灌注動(dòng)物，然后將組織切下。利用Y計(jì)數(shù)確定每個(gè)組織樣品中的放射標(biāo)記的KLKl的量，并用組織重量和給藥溶液標(biāo)準(zhǔn)品的Y計(jì)數(shù)計(jì)算組織濃度。動(dòng)物使用成年雄性SpragueDawley大鼠(η=10，平均335.4g±4.57gSE)進(jìn)行此研究。將動(dòng)物分組飼養(yǎng)在地區(qū)醫(yī)院動(dòng)物養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)所(RegionsHospitalAnimalCareFacility)，自由取食和進(jìn)水。動(dòng)物保持在12小時(shí)光照循環(huán)下。全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程都由地區(qū)醫(yī)院的動(dòng)物養(yǎng)殖和使用委員會(huì)(AnimalCareandUseCommittee)根據(jù)IACUC規(guī)程號(hào)08-022批準(zhǔn)。MM將組織激肽釋放酶送入Perkin-Elmer中進(jìn)行125I-標(biāo)記(QuoteNEX-084，lotC1541583)。也使用了來(lái)自Sigma的未標(biāo)記的KLKl(cat#K3627-lKU，lot018K1441)。將未標(biāo)記的KLKl溶于IXPBSdOXPBS,Sigma,cat#P5493,lot027K8405稀釋在無(wú)菌水中)中。平均劑量為48.1μL、75μCi和2.6mg。a.麻醉前，對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱重。b.制備麻醉混合物并根據(jù)動(dòng)物體重以含有30mg/kg激肽釋放酶、6mg/kg甲苯噻唑和lmg/kg乙酰丙嗪的全劑量計(jì)算全麻醉劑量、半麻醉劑量和1/4麻醉劑量。c.裝配配有25G或27G，1/2英寸針頭的l_cc注射器并將全劑量吸入注射器以用于注射。d.如下將大鼠控制在一塊毛巾中。將大鼠腹部朝下置于一塊手巾中間。將毛巾圍繞頭部和肩部包裹以進(jìn)行控制。將包裹的動(dòng)物保持腹面朝下，同時(shí)固定左后腿。e.將左后腿拉向一邊并將針頭恰好插入大腿上方的皮膚下(皮下)。確保針頭位于皮下(而非肌肉內(nèi))后，注射全劑量。將大鼠置于鼠籠中并記錄注射時(shí)間。動(dòng)物應(yīng)在5分鐘內(nèi)被麻醉。f.通過(guò)捏掐后爪或尾巴評(píng)估反射，從而在在整個(gè)過(guò)程中監(jiān)控麻醉。如果存在反射，根據(jù)需要再給予半劑量或1/4劑量加強(qiáng)麻醉。g.在給藥期間，動(dòng)物在第一次給藥約20-25分鐘后接受半劑量加強(qiáng)麻醉。mI-KLKl的鼻內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)a.將被麻醉大鼠的背部向下置于金屬手術(shù)托盤中的加熱墊中。所述加熱墊與恒溫器相連，基于直腸探頭的連續(xù)測(cè)量進(jìn)行自動(dòng)調(diào)節(jié)以保持37°C。b.將2"χ2"紗布?jí)|緊緊地卷成一個(gè)枕頭，綁在一起并置于頸下以使頸部保持與操作臺(tái)水平的正確位置。c.將鉛浸漬的屏蔽板置于所述手術(shù)托盤和實(shí)驗(yàn)者之間以保護(hù)實(shí)驗(yàn)者免于輻射。溶液、移液器、吸頭和廢物容器都置于所述屏蔽板后以便于使用。d.在所述屏蔽板后將6μL液滴裝入所述移液器。e.使用以石蠟?zāi)ぐ驳拿藓炌耆氯粋€(gè)鼻孔(將所述棉簽的平頭部分輕推入所述鼻孔以阻擋氣流)，而將所述6μL液滴從所述移液器(與大鼠中線保持45°)慢慢推出，在所述吸頭上形成一個(gè)液滴。將所述液滴滴到開放鼻孔中以被吸入。f.兩分鐘后，將本來(lái)開放的鼻孔堵塞并以相同的方式給予本來(lái)堵塞的鼻孔6μL液滴。g.每隔兩分鐘按照如上所述交替給予鼻孔一滴，直至14分鐘后總共給予8滴(每鼻孔4滴)。h.記錄每滴的給藥時(shí)間以及關(guān)于動(dòng)物呼吸或給藥成功的任何細(xì)節(jié)。對(duì)每種給藥溶液的三個(gè)3μL等分試樣進(jìn)行Y計(jì)數(shù)以確定測(cè)量的比活。經(jīng)心臟灌注a.在所需終點(diǎn)時(shí)間之前兩分鐘，將被麻醉動(dòng)物的背部向下平放在金屬手術(shù)托盤中。移除所述加熱墊、直腸探頭和頸枕。使用膠帶以將前肢固定在托盤上。將所述托盤的背部輕微抬高以使血液從動(dòng)物中流出。b.通過(guò)切開皮膚使胸骨暴露。用止血鉗夾住胸骨并橫向切開胸廓，使橫膈膜暴露。c.橫向切開橫膈膜以暴露胸膜腔。d.用手術(shù)剪剪開胸廓朝向動(dòng)物腋下的一側(cè)，制造一個(gè)暴露心臟的V型切口。e.將夾住胸骨的止血鉗綁在頭上以保持胸腔打開。f.用鈍手術(shù)鉗穩(wěn)定心臟，同時(shí)在左心室上開一個(gè)小切口。將帶有18G，1〃鈍針頭的Icc注射器插入左心室并抽出大約0.Iml血液并置于預(yù)先稱重的試管中以進(jìn)行γ計(jì)數(shù)。g.將與注滿60cc鹽溶液的延長(zhǎng)管連接的第二個(gè)18G鈍針頭經(jīng)過(guò)左心室插入動(dòng)脈。h.將一把大動(dòng)脈夾置于心臟上方的動(dòng)脈上，固定所述鈍針頭的位置。i.用注射泵以15ml/min的速率對(duì)所述動(dòng)物先灌注60mL鹽溶液再灌注360mL的多聚甲醛。腦部解剖a.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，遵守嚴(yán)格的注意事項(xiàng)以防止動(dòng)物組織、手術(shù)器具和設(shè)備的輻射污染。蓋革計(jì)數(shù)器置于每個(gè)工作地點(diǎn)以連續(xù)檢測(cè)工具、工作區(qū)和工作人員。一直都要穿戴個(gè)人保護(hù)裝置包括雙層手套、實(shí)驗(yàn)服、眼防護(hù)物、面具和護(hù)士帽。鉛浸漬的屏蔽板用于將輻射照射減至最低。工作人員還要在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中佩戴放射性監(jiān)測(cè)標(biāo)記以確定照射量。b.收集后，立即將每個(gè)組織樣品放入預(yù)先標(biāo)記和預(yù)先稱重的Y試管中用于隨后的測(cè)量。c.為除去頭，用手術(shù)刀恰好在肩胛骨的上方切開頸部周圍的皮膚和肌肉，并用一把大剪刀剪下所述動(dòng)物的頭，切開時(shí)從背面向腹面進(jìn)行以避免來(lái)自氣管和食道的污染。d.為暴露腦部，在顱骨的背面切開一個(gè)中線切口，然后剝?nèi)テつw，并用一把直頭止血鉗打破骨頭，注意使背面硬腦膜保持連接。e.收集背部硬腦膜。f.為從所述顱骨上取出腦組織，將頭倒轉(zhuǎn)，并用一把小鏟將腦組織與腦腔分離。在接近腦組織處剪斷后視神經(jīng)和三叉神經(jīng)。然后將腦組織置于干凈的培養(yǎng)皿中以進(jìn)行解剖。g.通過(guò)在腹面顱骨壁上用手術(shù)鉗刮擦從所述顱骨的基底上收集腹面硬腦膜。收集垂體、視交叉和三叉神經(jīng)。所述三叉神經(jīng)的前部由顱骨中的可見分支之前的部分構(gòu)成，而包含三叉神經(jīng)節(jié)的剩余部分被看做后部。然后將頭放在一邊并用kimiipe紙蓋住用于隨后的解剖。h.使用手術(shù)鉗、顯微手術(shù)剪和30G針頭將基底動(dòng)脈和大腦動(dòng)脈環(huán)取出并置于預(yù)先稱重的紙上(使用紙是因?yàn)榇私M織重量很小)。針頭用于抬起所述血管以與腦組織分開，手術(shù)鉗用于固定，顯微手術(shù)剪用于進(jìn)行剪切。收集后立即將此組織稱重，然后將整片紙褶皺并置于試管底部。i.用刀片以自然角度切下嗅球，然后將腦組織置于冠狀基質(zhì)(coronalmatrix)中。j.在所述冠狀腦基質(zhì)中，將一個(gè)刀片插在之前除去視交叉的區(qū)域中央，以將每只動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化到相同的位置(前因)。從所述第一個(gè)刀片開始，每隔2mm再放入一個(gè)刀片，產(chǎn)生6個(gè)2mm的薄片，3個(gè)視交叉嘴側(cè)的和3個(gè)視交叉尾側(cè)的。k.取下刀片，將組織從每個(gè)薄片(1-6)切下。并將任何剩余的腦組織也從每個(gè)薄片切下。1.將皮層和海馬的剩余部分從所述基質(zhì)中的剩余腦組織中切下并置于不同試管中。m.收集上頸部脊髓。η.然后將剩余腦組織沿中線剖開，并切成中腦、腦橋、延髓和小腦。ο.回到頭部，將頸部的腹側(cè)向前切開并將皮向后剝開，以暴露淋巴結(jié)、唾液腺和頸部肌肉。p.將淺表淋巴結(jié)、深頸淋巴結(jié)、頸動(dòng)脈和甲狀腺切下并清除結(jié)締組織。q.用刀片將顱骨沿中線剖開。收集嗅覺(jué)上皮和呼吸上皮。軀干解剖a.收集后，立即將每個(gè)組織樣品放入預(yù)先標(biāo)記和預(yù)先稱重的Y試管中用于隨后的測(cè)量。a.將軀干背面向下放置并用手術(shù)刀向下打開腹腔至膀胱。b.收集肝(淺部右葉)、腎(左側(cè)頂端)、腎動(dòng)脈、脾(頂端)、肺(右側(cè)上葉)和心的3mm2的樣品。c.收集約0.1-0.2mL的尿液。d.將軀干翻轉(zhuǎn)使腹面向下，沿動(dòng)物縱向向下從肩膀到臀部沿脊柱切開一個(gè)淺表切口。將兩側(cè)的皮膚與下面的組織剝離開以暴露肩胛骨。e.將腋下的腋窩淋巴結(jié)切下并清除立即結(jié)締組織。f.收集一片右側(cè)三角肌肌肉(約3mm2)。g.用手術(shù)刀將脊柱上的肌肉劃開。為暴露脊髓，將一把小止血鉗插入脊柱并且用于夾下上面的椎骨和組織。用一把小壓舌刀將脊髓從脊髓腔中弄松，用手術(shù)鉗將脊髓取出并置于培養(yǎng)皿中。用手術(shù)刀將硬脊膜從脊髓中剝下。將脊髓切為下頸部、胸部和腰部。丟棄下頸部頂端的約2mm。h.從軀干上切下2cm段的食管和器官并將結(jié)締組織除去。丟棄兩者頂端的0.5cm(最靠近斬首點(diǎn)的部分)。組織計(jì)數(shù)將裝有樣品的預(yù)先稱重的、管重新稱重以確定組織重量。用COBRAII自動(dòng)、計(jì)數(shù)器對(duì)來(lái)自全部大鼠的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)125I規(guī)程，5分鐘計(jì)數(shù)時(shí)間，升降機(jī)位置1)。每周校準(zhǔn)所述計(jì)數(shù)器以確保計(jì)數(shù)效率等于或大于80%。對(duì)于全部大鼠都使用一個(gè)背景方案，其中從用所述Y計(jì)數(shù)器測(cè)量的計(jì)數(shù)中自動(dòng)減去平均測(cè)量的背景計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)分析和計(jì)算計(jì)算每種組織的nM濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。每種組織的平均值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差以外的任何值都被認(rèn)為是異常值而被從所在數(shù)據(jù)組中除去。異常值在動(dòng)物數(shù)據(jù)表中被標(biāo)記為“X”Excel電子表格用測(cè)量的給藥溶液的比活、每種組織的CPM和每種組織的體積(假設(shè)Ig=ImL)自動(dòng)計(jì)算出每種組織的nMKLKl濃度。樣品計(jì)算nM濃度=組織計(jì)數(shù)(CPM)/測(cè)量的比活(cpm/fmol)/組織體積(mL)/IO3(fmol/pmol)示例嗅球的KLKl(4130CPM)/(2.76CPM/fmol)/(0.07734mL)/(103fmol/pmol)=19.35pmol/mL=19.35nMMM結(jié)果匯總于表1。KLKl有效地到達(dá)以下標(biāo)靶區(qū)域以治療神經(jīng)疾病1)額葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、海馬和其他已知的涉及阿爾茨海默氏癥神經(jīng)病理學(xué)的區(qū)域；2)腦血管壁、在阿爾茨海默病中淀粉樣蛋白血管病的位點(diǎn)；和3)對(duì)于治療神經(jīng)性炎癥可能重要的淋巴系統(tǒng)的頸淋巴節(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>BE0200)按照每個(gè)試劑盒的說(shuō)明重組為1.Oμg/mL。在PBS中制備組織激肽釋放酶(SEQID1)的原液和約0.5摩爾當(dāng)量的大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma，T6522)，連續(xù)稀釋成hAi342肽的固定濃度為500pg/mL的同樣的三份。將溶液分別孵育3和18小時(shí)，每次孵育后添加蛋白酶(1/100稀釋度的蛋白酶抑制劑混合溶液，SigmaP8340)。按照每個(gè)試劑盒的說(shuō)明，加入50μL上述樣品，并將ELISA板在4°C下孵育過(guò)夜。ELISA板發(fā)展的剩余步驟根據(jù)每個(gè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，然后用多孔ELISA板讀出器在450nm讀數(shù)。切割百分?jǐn)?shù)的確定如下100-[(平均KLKl-平均空白)/(平均對(duì)照-平均空白)X100]=切割％MM表2-KLK1對(duì)淀粉樣蛋白β的切割百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>多種濃度的KLKl對(duì)淀粉樣蛋白β的切割百分?jǐn)?shù)可在圖17中找到。權(quán)利要求一種治療患有(a)阿爾茨海默病或其癥狀；或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與第二種用于治療阿爾茨海默病或遺忘性輕度認(rèn)知缺損的治療性化合物共同給藥。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第二種治療性化合物包括一種乙酰膽堿前體、一種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物、一種乙酰膽堿酯酶抑制劑、一種毒蕈堿激動(dòng)劑、一種抗氧化劑、一種抗炎藥、一種激素、一種鈣通道阻滯劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一種益智劑(nootropicagent)、一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子小分子模擬物、NMDA受體拮抗劑、一種5-HT1A受體激動(dòng)劑、一種抗淀粉樣蛋白生成劑、一種抗組胺藥、一種甲磺酸雙氫麥角堿、銀杏或石杉?jí)A甲。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述乙酰膽堿酯酶前體選自膽堿、卵磷脂或乙酰-1-肉毒堿。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物為4-氨基吡啶或利諾吡啶(Iinopridine)。6.權(quán)利要求2的方法，其中所述乙酰膽堿酯酶抑制劑選自毒扁豆堿、他克林(tacrine)、多奈哌齊(don印ezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加蘭他敏(glanthamine)、舌夂百蟲(metrifonate)、石杉?jí)A甲或依其Jf的明(eptastigmine)。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述毒蕈堿激動(dòng)劑選自米拉美林(Hiilameline)Ji諾美林(xanomeline)、檳榔堿(arecoline)、氧化震亶員素(oxotremorine)、沙可美林(sabcomeline)或他沙利定(talsaclidine)。8.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗氧化劑選自維生素E、艾地苯醌(iedbenone)、輔酶Q-10、n-乙酰半胱氨酸或維生素C。9.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗炎藥是一種非留類抗炎藥。10.權(quán)利要求2的方法，其中所述激素是雌激素或睪酮。11.權(quán)利要求2的方法，其中所述益智劑是吡拉西坦(piracetam)。12.權(quán)利要求2的方法，其中所述甲磺酸雙氫麥角堿是氫化麥角堿。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段是鼻內(nèi)給藥的。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述治療有效劑量為每個(gè)給藥頻率約0.001-約5000國(guó)際單位(IU)。15.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段是口服給藥的。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的治療有效量為每個(gè)給藥頻率約0.001-約1000IU。17.一種配制用于口服給藥的藥物組合物，其每個(gè)給藥頻率含有約0.001-約1000IU的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。18.一種配制用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物，其每個(gè)給藥頻率含有約0.001-約5000IU的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段，以及一種藥學(xué)可接受的賦形劑。19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與一種佐劑結(jié)合。20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述佐劑是一種乳化劑。21.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與親脂性膠束結(jié)合。22.根據(jù)權(quán)利要求17-21任一項(xiàng)的藥物組合物，還包含第二種用于治療阿爾茨海默病或遺忘性輕度認(rèn)知缺損的治療性化合物。23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述第二種治療性化合物包括一種乙酰膽堿前體、一種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物、一種乙酰膽堿酯酶抑制劑、一種毒蕈堿激動(dòng)劑、一種抗氧化劑、一種抗炎藥、一種激素、一種鈣通道阻滯劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一種益智劑、一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子小分子模擬物、NMDA受體拮抗劑、一種5-HT1A受體激動(dòng)劑、一種抗淀粉樣蛋白生成劑、一種抗組胺藥、一種甲磺酸雙氫麥角堿、銀杏或石杉?jí)A甲。24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述乙酰膽堿酯酶前體選自膽堿、卵磷脂或乙酰-1-肉毒堿。25.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物為4-氨基吡啶或利諾吡啶。26.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述乙酰膽堿酯酶抑制劑選自毒扁豆堿、他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、敵百蟲、石杉?jí)A甲或依斯的明。27.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述毒蕈堿激動(dòng)劑選自米拉美林、咕諾美林、檳榔堿、氧化震顫素、沙可美林或他沙利定。28.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述抗氧化劑選自維生素E、艾地苯醌、輔酶Q-10、N-乙酰半胱氨酸或維生素C。29.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述抗炎藥是一種非留類抗炎藥。30.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述激素是雌激素或睪酮。31.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述益智劑是吡拉西坦。32.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述甲磺酸雙氫麥角堿是氫化麥角堿。33.組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于制備治療(a)阿爾茨海默病或其癥狀，或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的藥物的應(yīng)用。34.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療(a)阿爾茨海默病或其癥狀，或(b)遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的應(yīng)用。35.根據(jù)權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的應(yīng)用還包括與第二種用于治療阿爾茨海默病或治療遺忘性輕度認(rèn)知缺損的治療性化合物共同使用。36.權(quán)利要求35的應(yīng)用，其中所述第二種治療性化合物包括一種乙酰膽堿前體、一種增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物、一種乙酰膽堿酯酶抑制劑、一種毒蕈堿激動(dòng)劑、一種抗氧化齊U、一種抗炎藥、一種激素、一種鈣通道阻滯劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、一種益智劑、一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子小分子模擬物、NMDA受體拮抗劑、一種5-HT1A受體激動(dòng)劑、一種抗淀粉樣蛋白生成劑、一種抗組胺藥、一種甲磺酸雙氫麥角堿、銀杏或石杉?jí)A甲。37.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述乙酰膽堿酯酶前體選自膽堿、卵磷脂或乙酰-1-肉毒堿。38.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述增強(qiáng)乙酰膽堿釋放的化合物為4-氨基吡啶或利諾吡啶。39.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述乙酰膽堿酯酶抑制劑選自毒扁豆堿、他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、敵百蟲、石杉?jí)A甲或依斯的明。40.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述毒蕈堿激動(dòng)劑選自米拉美林、咕諾美林、檳榔堿、氧化震顫素、沙可美林或他沙利定。41.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述抗氧化劑選自維生素E、艾地苯醌、輔酶Q-10、η-乙酰半胱氨酸或維生素C。42.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述抗炎藥是一種非留類抗炎藥。43.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述激素是雌激素或睪酮。44.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述益智劑是吡拉西坦。45.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述甲磺酸雙氫麥角堿是氫化麥角堿。46.根據(jù)權(quán)利要求34-45任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段被配制用于鼻內(nèi)給藥。47.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述治療有效劑量為每個(gè)給藥頻率約0.001-約5000IU。48.根據(jù)權(quán)利要求34-45任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段被配制用于口服給藥。49.根據(jù)權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的治療有效量為每個(gè)給藥頻率約0.001-約1000IU。50.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于在需要治療的患者體內(nèi)消化或切割淀粉樣蛋白的應(yīng)用。51.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要治療的患者的神經(jīng)脈管系統(tǒng)的應(yīng)用。52.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要治療的患者的腦部氧攝取的應(yīng)用。53.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要治療的患者的腦部血流的應(yīng)用。54.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要治療的患者腦中斑塊清除的應(yīng)用。55.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善需要治療的患者的腦部葡萄糖攝取的應(yīng)用。56.治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于降低需要治療的患者腦中tau磷酸化的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及治療阿爾茨海默病或其癥狀以及遺忘性輕度認(rèn)知缺損或其癥狀的方法。本發(fā)明的方法包括給予治療有效量的組織激肽釋放酶、其變體或其活性片段。本發(fā)明還涉及組織激肽釋放酶或者其變體或活性片段用于消化或切割淀粉樣蛋白的應(yīng)用和治療會(huì)受益于對(duì)淀粉樣蛋白的消化或切割的病癥的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及配制用于口服或鼻內(nèi)給藥的包含治療有效量的組織激肽釋放酶、其變體或其活性片段的藥物組合物。文檔編號(hào)A61K38/48GK101801406SQ200880107033公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者M(jìn)·威廉姆斯申請(qǐng)人:基因塞斯投資有限公司