專利名稱：藤黃胺,一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的選擇性TrkA激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及選擇性TrkA激動(dòng)劑領(lǐng)域，尤其是藤黃胺(gambogic amine)，以 及利用該化合物提供神經(jīng)保護(hù)和/或治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)營養(yǎng)因子在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持中起到關(guān)鍵的作用。神經(jīng)營養(yǎng) 因子的受體是一組高度類似的跨膜酪氨酸激酶(TrkA、TrkB和TrkC)的家族成員。每一種 神經(jīng)營養(yǎng)因子都結(jié)合至該家族中的一種優(yōu)選受體神經(jīng)生長因子(NGF)主要結(jié)合TrkA，腦 源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4)結(jié)合TrkB且神經(jīng)營養(yǎng)因子-3結(jié)合 TrkC，而p75NTR受體非選擇性地與具有類似親合性的神經(jīng)營養(yǎng)因子的所有成員發(fā)生相互 作用。通過NGF使TrkA發(fā)生對(duì)接(docking)以引起受體二聚體形成，受體上細(xì)胞質(zhì)酪氨酸 殘基的催化磷酸化作用，以及包括PI 3-激酶/Akt、RaS/Raf/MAP激酶和PLC- γ 1信號(hào)傳導(dǎo) 通路激活的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件的級(jí)聯(lián)(Kaplan and St印hens，1994)。這些信號(hào)導(dǎo)致阻止凋 亡細(xì)胞的死亡、促進(jìn)細(xì)胞分化和軸突延伸、以及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的上調(diào)。幾種神經(jīng) 元細(xì)胞類型包括涉及各種疾病的感官的、交感的和膽堿能的神經(jīng)元表達(dá)TrkA并因此響應(yīng) 于NGF (Mufson et al.，1997)。在正常成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，包含膽堿能系統(tǒng)的皮 質(zhì)和基底核神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶中起到關(guān)鍵作用。在神經(jīng)變性過程中，例如輕度認(rèn)知受損(MCI)，TrkA密度的損失與神經(jīng)元萎縮癥 有關(guān)，并在阿爾茨海默氏癥(AD)中的神經(jīng)元死亡和嚴(yán)重認(rèn)知損傷之前出現(xiàn)(Counts et al.，2004)。在MCI-AD發(fā)展中，TrkA損失與認(rèn)知下降有關(guān)。在老年大鼠的基底前腦神經(jīng)元 中，NGF受體的表達(dá)降低，但是能夠通過給予NGF而得到逆轉(zhuǎn)(Backman et al.，1997)。據(jù) 建議，NGF療法可以延遲阿爾茨海默氏癥的發(fā)作(Barinaga，1994 ；Lindsay，1996)，并緩解 周圍糖尿病神經(jīng)病變(Ebadi et al.，1997)。所提出的NGF的其他應(yīng)用包括治療神經(jīng)元 損傷(Hughes et al.，1997)和源自神經(jīng)外胚層的腫瘤的靶向(Cortazzo et al.，1996 ； LeSauteur et al.，1995)。在體外和動(dòng)物模型中的研究表明，NGF或許在臨床上適用于治療 CNS疾病(Cormorand Dragunow, 1998)。作為預(yù)期，臨床前和臨床發(fā)現(xiàn)也建議，皮下或靜脈注 射神經(jīng)營養(yǎng)因子可以是一種對(duì)于外周神經(jīng)變性疾病的有效治療(McArthur et al. ,2000 ； McMahon and Priestley,1995)。盡管NGF具有治療潛力，但以這種蛋白為特征的臨床試驗(yàn)卻令人失望(Verrall， 1994)。這有若干個(gè)原因，包括與利用多肽作為藥物有關(guān)的固有缺陷(Saragovi et al., 1992)、體內(nèi)不穩(wěn)定性(Barinaga，1994)、以及由于并不是有意靶向的信號(hào)激活的多效性效應(yīng)(例如，經(jīng)由低親合性NGF受體p75介導(dǎo)的)(Carter和Lewin, 1997)。而且，生產(chǎn)NGF蛋白應(yīng)以用于醫(yī)療應(yīng)用是相對(duì)昂貴的。為了規(guī)避上述限制，人們已經(jīng)做出實(shí)質(zhì)上的努力來設(shè) 計(jì)小的、且蛋白水解穩(wěn)定，同時(shí)又具有神經(jīng)營養(yǎng)活性且對(duì)細(xì)胞表達(dá)TrkA具有選擇性的分子 (Lee 和 Chao，2001 ;Saragovi et al. , 1991 ；Saragovi et al.，1992)。它們?cè)诓淮嬖?NGF 的情況下通過激活TrkA而表現(xiàn)出部分激動(dòng)活性(或促效活性，agonistic activity)。盡 管它們并不直接使受體形成二聚物，但是這些化合物引起了在使其二聚作用穩(wěn)定化的TrkA 上的構(gòu)象改變。因此，它們更像是作為NGF作用的增強(qiáng)劑，而不是作為強(qiáng)有力的TrkA激動(dòng) 劑。提供選擇性TrkA激動(dòng)劑和使用這些化合物的方法是有利的。本發(fā)明提供了這樣 的化合物和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種藤黃胺(gambogic amine)。根據(jù)在胺基上的側(cè)鏈，該化合物可 以是TrkA激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或拮抗劑。這些化合物以相對(duì)較高的親合性而結(jié)合至TrkA。 這些導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的化合物能夠用作抗癌劑，而那些抑制細(xì)胞凋亡的化合物(在那種情況 下它們可以是選擇性的TrkA激動(dòng)劑)能夠用作神經(jīng)保護(hù)性化合物。本文中描述了確定這 些化合物活性的分析。某些藤黃胺選擇性地結(jié)合至TrkA，觸發(fā)其酪氨酸磷酸化作用，引起PI 3_激酶/ Akt和MAP激酶激活，引起PC12細(xì)胞中的神經(jīng)突長出(或生長)，和/或防止神經(jīng)元細(xì)胞死 亡。而且，它們能夠?qū)嵸|(zhì)上降低MCAO之后的梗死體積。因此，這些藤黃胺能夠模擬NGF并 具有有效的神經(jīng)營養(yǎng)活性。選擇性TrkA激動(dòng)劑能夠用于在神經(jīng)受損如中風(fēng)或其他局部缺血性事件之前、之 中或之后提供神經(jīng)保護(hù)作用。這些化合物也能夠用于治療脫髓鞘性病如多發(fā)性硬化癥 (MS)、增強(qiáng)神經(jīng)再生、和/或治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。這種神經(jīng)變性疾病包括但不限于， 癲癇、頭部和脊髓損傷、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、阿爾茨海默氏癥、或肌萎縮側(cè)索硬化癥或 神經(jīng)障礙。參照以下的詳細(xì)描述將會(huì)更好地理解選擇性TrkA激動(dòng)劑、或部分激動(dòng)劑，以及提 供神經(jīng)保護(hù)、或治療和/或預(yù)防神經(jīng)變性疾病或脫髓鞘性病的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了藤黃胺類、包括這種藤黃胺類的藥物組合物、制備這種藤黃胺類的 方法、以及利用這種藤黃胺類進(jìn)行治療和預(yù)防的方法。本發(fā)明源自這一發(fā)現(xiàn)，即藤黃胺類是 選擇性的TrkA調(diào)節(jié)劑(S卩，激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、或拮抗劑)。因此，這些化合物可能適用于 提供神經(jīng)保護(hù)作用、治療脫髓鞘性病、和治療和/或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。I.藤黃胺類藤黃胺類自身一般具有以下結(jié)構(gòu)式。<formula>formula see original document page 5</formula>例如，藤黃胺類能夠采用如下所示的圖解1進(jìn)行制備。在藤黃酸用作前體的情況 下，能夠通過1)制備藤黃粗提取物(來自藤黃科植物藤黃(Garcinia hanburyi Hook)的 樹脂)的吡啶鹽，接著在乙醇中對(duì)該鹽進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶，或2)將該鹽轉(zhuǎn)化成游離酸來進(jìn)行 純化。采用這種工藝步驟，能夠從粗提取物獲得約10wt%的純度>99% (HPLC)的藤黃酸。 在藤黃酰胺用作前體(酰胺被還原為胺)的情況下，能夠采用例如已知的酰胺化化學(xué)方法 通過將藤黃酸轉(zhuǎn)化成酰胺而獲得。藤黃胺的合成在以下反應(yīng)圖解，圖解1中概述。<formula>formula see original document page 6</formula>圖解1如圖解1中所示，藤黃胺衍生物至少能夠利用兩種路徑中的任一種生成1)三步 實(shí)驗(yàn)方案，涉及藤黃酸與各種伯胺和仲胺發(fā)生二酰亞胺偶聯(lián)以形成藤黃酰胺衍生物，接著 生成硫代酰胺，最后在N2氣氛下通過鎳發(fā)生硫代羰基還原；或2)直接由藤黃酰胺形成硫代 酰胺，接著在氮?dú)夥障掳l(fā)生硫代羰基還原以得到游離的伯胺。Rl和R2基團(tuán)可以是任何大小 的烷基或羰基。各種藤黃胺衍生物可以利用不同的Rl和R2基團(tuán)來制備?？商娲?，以未 取代的化合物(Rl和R2都是H)開始，能夠采用烷基鹵、烷芳基鹵(如芐基鹵)，或利用其他 這樣的烷基化劑在氮上放置合適的取代基(包括具有以下描述的取代基的那些)。這樣的 反應(yīng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。藤黃酰胺在保護(hù)海馬神經(jīng)元免于體外OGD (缺氧缺糖)或谷氨酸觸發(fā)的神經(jīng)元細(xì) 胞死亡方面顯示出強(qiáng)有力的神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)。另外，藤黃酰胺能夠強(qiáng)烈地阻斷小鼠大腦中的 紅藻氨酸-誘發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。而且，藤黃酰胺也能夠有效地降低中風(fēng)誘導(dǎo)的梗死體 積。實(shí)施結(jié)構(gòu)活性分析表明，在藤黃酸(和由此獲得的藤黃酰胺)中的羧基對(duì)于藤黃酸家 族成員的神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)并不是關(guān)鍵的。因此，開發(fā)了本文中所述的藤黃胺化合物，以維持藤 黃酰胺的活性，同時(shí)改善該化合物的水溶性。藤黃胺衍生物能夠進(jìn)一步改善藤黃酰胺的生物效應(yīng)。藤黃胺衍生物比藤黃酰胺 具有更好的水溶性，并且在一些實(shí)施方式中，藤黃胺衍生物在抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的神經(jīng)營養(yǎng)活性，在治療神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默氏癥方面產(chǎn)生更好的治療效 能。這些化合物對(duì)于癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡具有某些效應(yīng)，并被認(rèn)為是根據(jù)特定的化合物結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)(即，激動(dòng)(agonize)、部分激動(dòng)或拮抗)TrkA受體。本文中所述的分析能夠 以高通量(high-throughout)方式使用來識(shí)別該化合物家族中的哪些化合物具有所需的 活性。實(shí)際上，具有顯著細(xì)胞凋亡活性的化合物可以作為抗癌藥而具有相當(dāng)明顯的療效，而 具有增強(qiáng)保護(hù)活性的化合物對(duì)于提供神經(jīng)保護(hù)作用，治療神經(jīng)變性疾病等可以具有相當(dāng)明 顯的療效。在能夠被改性的藤黃胺的結(jié)構(gòu)中具有許多官能團(tuán)。這些官能團(tuán)包括但不限于羥 基，其能夠轉(zhuǎn)化成醚、酯或其他官能團(tuán)；C-9和C-IO之間的碳碳雙鍵是α，β -不飽和酮的 部分，其能夠與親核劑反應(yīng)，而被還原成碳碳單鍵，或可以轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物，其又可以進(jìn)行 進(jìn)一步反應(yīng)；C-27和C-28之間的碳碳雙鍵是α，β -不飽和羧基的部分，其也能夠與親核 劑反應(yīng)，而被還原成碳碳單鍵，或可以轉(zhuǎn)化成環(huán)丙烷環(huán)，其又可以進(jìn)行進(jìn)一步地反應(yīng)；C-37/ C-38和C-32/C-33處的兩個(gè)異戊二烯碳碳雙鍵，也可以被還原成碳碳單鍵，斷裂形成醛基 或羧基，二者都可以被改性成其他官能團(tuán)，或轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物，其又可以進(jìn)行進(jìn)一步地反 應(yīng)；C-3和C-4之間的碳碳雙鍵也可以被還原成碳碳單鍵，或轉(zhuǎn)化成可以進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)的 環(huán)氧化物；C-12處的酮基可以被還原成醇，或可以轉(zhuǎn)化成肟、半卡巴腙、或氨基；其他酮基 也可以被還原，或可以轉(zhuǎn)化成其他官能團(tuán)。簡而言之，以上所示的藤黃胺許多衍生物都能夠 制備，且這樣的衍生物都被認(rèn)為是屬于本發(fā)明的范圍。烷基、芳基和芳烷基Rl和R2上的可選取代基包括鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基、 氨基、硝基、氰基、C1-C6?；被?、C1-C6氨基酰基、C1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫 基(alkylthio)、C6-Cltl 芳基、Cd-C7 環(huán)烷基、C2-C6 烯基、C2-C6 炔基、C6-Cltl 芳基(C2-C6)烯基、 C6-Cltl芳基(C2-C6)炔基、飽和或部分飽和的5-7元雜環(huán)基、或雜芳基中的一種或多種。有用的烷基包括直鏈和支鏈的C1,烷基，更優(yōu)選Cp6烷基。典型的C1,烷基包括甲 基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基，其可以是可選取代的。有用的烷氧基包括以上提及的C1,烷基之一取代的氧，其可以是可選取代的。有用的烷硫基包括以上提及的C1,烷基之一取代的硫，其可以是可選取代的。也 包括這種烷硫基的亞砜和砜。有用的氨基包括-NH2、-NHR1、和-NR1R2，其中Rl和R2是Cwtl烷基或環(huán)烷基，或Rl 和R2與N組合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)，如哌啶，或Rl和R2與N和另一雜原子組合而形成可選取代 的、飽和或部分飽和的5-7元雜環(huán)基，如哌嗪。烷基可以是可選取代的。有用的雜原子包括N、0或S。芳基、芳烷基和雜芳基上的可選取代基包括?；?、烷撐二氧基(-OCH2O-)、鹵素、 C1-C6鹵代烷基、C6- "Cio方基、C6_C7環(huán)焼基、C1-C6焼基、C2~C6火布基、C2~C6塊基、Cg-C10 芳基 (C1-C6)焼基、C6_C10 方基(C2~C6)火布基、C6_C10 芳基(C2-C6)炔基、C1-C6-基烷基、硝基、氨基、 脲基、氰基^1-C6?；被?、羥基、巰基、C1-C6酰氧基、疊氮基、C1-C6烷氧基或羧基中的一個(gè) 或多個(gè)。有用的雜烷基含有1-10個(gè)碳原子和1、2或3個(gè)雜原子。雜烷基的實(shí)例包括-CH2C H2OCH2CH3、-CH2CH20CH2CH20CH2CH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2CH2N (CH2CH3) 2、_CH2CH2OCH2CH2NHCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCH3、-CH2CH2NHCH2CH3、-CH2C (CH3) 2CH2N (CH3) 2 或-CH2(N-乙基吡咯烷)，其可 以是可選取代的。雜烷基上的可選取代基包括商素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、烷基W1-C6酰基氨 基、C1-C6氨基?；1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫基、C6-C10芳基、Cd-C7環(huán)烷基、 C2-C6烯基、鏈烯氧基、C2-C6炔基、C6-Cltl芳基(C2-C6)烯基、C6-Cltl芳基(C2-C6)炔基、飽和及 不飽和的雜環(huán)或雜芳基中的一個(gè)或多個(gè)。有用的芳基為C6_14芳基，尤其是C6,芳基。典型的C6_14芳基包括苯基、萘基、菲基、 蒽基、茚基、奧基、聯(lián)苯基、亞聯(lián)苯基(biphenylenyl)和芴基。有用的環(huán)烷基為C3_8環(huán)烷基。典型的環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基 和環(huán)庚基。有用的飽和或部分飽和的碳環(huán)基團(tuán)為如上定義的環(huán)烷基，以及環(huán)烯基，如環(huán)戊烯 基、環(huán)庚烯基和環(huán)辛烯基。有用的鹵素或鹵代基包括氟、氯、溴和碘。有用的芳烷基包括用以上提及的任何C6_14芳基取代的以上提及任何C1,烷基。該 有用的芳烷基包括芐基、苯乙基和萘甲基。有用的鹵代烷基包括用一個(gè)或多個(gè)氟、氯、溴或碘原子取代的C1,烷基，例如氟甲 基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1，1- 二氟乙基、氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。有用的?；被沁B接至氨基氮的任何CV6?；?烷?；?，例如，乙酰胺基、丙酰 胺基、丁酰胺基、戊酰胺基、己酰胺基、以及芳基-取代的C2_6取代的酰基。有用的酰氧基是連接至氧基(-0-)的任何Cp6酰基(烷?；?，例如，甲酰氧基、乙 酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基等。有用的飽和或部分飽和的5-7元雜環(huán)基包括四氫呋喃基、吡喃基、哌啶基、吡嗪 基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、奎寧環(huán)基、嗎啉基、異色滿 基(isochromanyl)、色 薛基(chromanyl)、批唾燒基、批唾琳基、tetronoyl 禾口 tetramoyl。5-7元雜環(huán)基上的可選取代基包括雜芳基、雜環(huán)、烷基、芳烷基、環(huán)烷基、烷氧基羰 基、氨甲?；⒎蓟駽1-C6氨基?；械囊粋€(gè)或多個(gè)。有用的雜芳基包括以下的任一種噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2，3_b]噻吩 基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、異苯并呋喃基、色烯基、咕噸基、吩噻噁基(phenoxanthiinyl)、 2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、 3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔 啉基(quinozalinyl)、噌嗪基、蝶啶基、咔唑基、β -咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮苯 基、菲咯啉基、吩嗪基、異噻唑基、吩噻嗪基、異噁唑基、呋咱基(furazanyl)、吩噁嗪基、1， 4-二氫喹噁啉基-2，3-二酮、7-氨基異香豆素、吡啶并[l，2-a]嘧啶_4_酮、1，2-苯并異噁 唑-3-基、苯并咪唑基、2-羥基吲哚基(2-oxindolyl)和2-氧代苯并咪唑基。其中雜芳基 在環(huán)上含有一個(gè)氮原子，這樣的氮原子可以是以N-氧化物的形式，例如，吡啶N-氧化物、批 嗪N-氧化物、嘧啶N-氧化物等。雜芳基上的可選取代基包括一個(gè)或多個(gè)雜芳基、雜環(huán)、烷基、芳烷基、環(huán)烷基、烷氧 基羰基、氨甲?；?、芳基和C1-C6氨基?；?。某些化合物可以存在立體異構(gòu)體，包括光學(xué)異構(gòu)體。本發(fā)明包括所有的立體異構(gòu)體和這樣的立體異構(gòu)體的外消旋混合物以及可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法進(jìn) 行分離的單個(gè)對(duì)映體。藥用加成鹽的實(shí)例包括無機(jī)和有機(jī)酸加成鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸 鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；以及與堿如氫氧 化鈉、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS，三羥甲基氨基甲烷)和N-甲基-葡糖胺的無機(jī)和有機(jī) 堿加成鹽。前藥的實(shí)例包括藤黃胺與各種含羧酸化合物的簡單酰胺；氨基的亞胺(例如，根 據(jù)本領(lǐng)域已知的方法與Cy醛或酮縮合而獲得的)；和胺基的氨基甲酸酯(或鹽)。II.高通量的篩選方法開發(fā)了以下高通量的篩選分析法以用于理想地以選擇性方式識(shí)別模擬NGF并激 活TrkA的小分子。也就是說，該分析法能夠識(shí)別出屬于TrkA的激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的化 合物，且理想地是對(duì)TrkA比TrkB和TrkC更具選擇性的化合物。能夠采用這種方法評(píng)價(jià)本 文中描述的藤黃胺起到TrkA受體的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或拮抗劑的作用的能力，以及其對(duì) 這種受體的選擇性超過TrkB和TrkC?；诩?xì)胞的細(xì)胞凋亡分析采用半胱天冬(蛋白)酶分析系統(tǒng)，其包括熒光法、比色 法、細(xì)胞增殖法和細(xì)胞成活力分析系統(tǒng)，包括凋亡細(xì)胞的熒光法或比色法標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施 方式中，基于細(xì)胞的細(xì)胞凋亡分析采用細(xì)胞可滲透的熒光染料(如MR(DERD) 2)，其在凋亡 細(xì)胞中一旦半胱天冬酶_3分解后會(huì)變紅。分析中所使用的細(xì)胞能夠來自任何不表達(dá)TrkA 的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是來自鼠細(xì)胞系T17，其來自于基底前腦SN56細(xì)胞。T17 細(xì)胞是TrkA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SN56細(xì)胞。這些選擇性保護(hù)T17細(xì)胞，而不是選擇性保護(hù)SN56細(xì)胞的候選化合物是TrkA激 動(dòng)劑，或通過激活下游通路而起作用。即使它們是TrkA激動(dòng)劑，也還不清楚是否僅由抗細(xì) 胞凋亡活性就能認(rèn)為它們是選擇性TrkA激動(dòng)劑。因此，可以實(shí)施額外的篩選步驟來確定該 化合物是否TrkA激動(dòng)劑，而且如果確實(shí)如此的話，就確定它們是否是選擇性TrkA激動(dòng)劑。為了輔助確證化合物是否對(duì)TrkA起作用，或在下游步驟上起作用，能夠觀察該化 合物是否會(huì)導(dǎo)致TrkA發(fā)生二聚作用。即，促使TrkA發(fā)生二聚的化合物對(duì)TrkA產(chǎn)生作用， 而不是對(duì)下游步驟產(chǎn)生作用。確定測試化合物是否能夠觸發(fā)TrkA 二聚作用的一種方式是 將GFP-TrkA和HA-TrkA共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并使該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于該化合物。正如本文中所用的，TrkA激動(dòng)劑是一種在選擇性保護(hù)T17細(xì)胞而不是SN56細(xì)胞 方面具有至少90%的NGF活性，并且導(dǎo)致TrkA發(fā)生二聚的化合物，而部分激動(dòng)劑是在選擇 性保護(hù)這些細(xì)胞方面具有至少90%的NGF活性，并且導(dǎo)致TrkA發(fā)生二聚的化合物。選擇 性TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng)劑)是對(duì)TrkA比TrkB和/或TrkC表現(xiàn)出顯著結(jié)合親合性， 例如對(duì)TrkA比TrkB和/或TrkC表現(xiàn)出至少4 1的結(jié)合親合性的化合物。抑制細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致TrkA發(fā)生二聚的那些化合物是TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng) 劑)。為了確定化合物是否是選擇性TrkA激動(dòng)劑(即，選擇性優(yōu)先于TrkB或TrkC而結(jié)合 至TrkA)，可以使用TrkB和TrkA受體或TrkC和TrkA受體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如果化合物對(duì) TrkA具有選擇性，則受體將不能發(fā)生二聚。選擇性TrkA激動(dòng)劑也會(huì)引起TrkA中的酪氨酸 磷酸化作用，而不是在TrkB或TrkC受體中(或在細(xì)胞共轉(zhuǎn)染以表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)這些受體， 艮口，TrkA與TrkB和/或TrkC組合)。因此，人們能夠可替代地，或同時(shí)尋找酪氨酸磷酸化作用以確定化合物是否是選擇性TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng)劑)?？梢赃M(jìn)行劑量研究來確定 該化合物是激動(dòng)劑還是部分激動(dòng)劑。一旦確定了具有所需性質(zhì)的化合物，則例如通過確定該化合物是否能引起PC12 細(xì)胞中的神經(jīng)突生長(長出)，和/或阻止神經(jīng)元細(xì)胞死亡來評(píng)價(jià)其實(shí)際活性。具有這些活 性中的一種或兩種的化合物可以是可用于治療神經(jīng)變性疾病和/或提供神經(jīng)保護(hù)作用的 化合物。理想地，可以分析在這兩種篩選中測試陽性的化合物的TrkA酪氨酸磷酸化作用， 和/或Akt和MAP激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)激活作用。下文中將更詳細(xì)地描述每一分析步驟。T17細(xì)胞能夠在多孔板(如96-孔板)中進(jìn)行培養(yǎng)，并用約10 μ M的假定TrkA激 動(dòng)劑預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，例如30分鐘，接著用ΙμΜ星形孢菌素(STS)處理一段時(shí)間，例如9 小時(shí)。當(dāng)染料是MR(DEVD) 2，并且這種染料被引入到細(xì)胞中時(shí)(例如，在熒光顯微鏡下檢測 前1小時(shí))，凋亡細(xì)胞將會(huì)出現(xiàn)紅色，而活細(xì)胞則無信號(hào)。NGF能夠用作陽性對(duì)照。與對(duì)照 (如DMSO對(duì)照)相比，NGF將實(shí)質(zhì)上降低紅色細(xì)胞的數(shù)目。在如以下實(shí)施例部分中所討論的，采用使用半胱氨天冬酶_3活化的熒光染料的 分析法，能夠篩選來自Spectrum Collection Library的生物活性化合物。當(dāng)篩選是針對(duì) 各種藤黃酸衍生物進(jìn)行時(shí)(數(shù)據(jù)未示出)，由STS-引發(fā)的細(xì)胞凋亡識(shí)別的化合物選擇性保 護(hù)T17細(xì)胞，而不是SN56細(xì)胞。這表明該化合物直接通過TrkA受體起作用，或通過其下游 信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)器起作用。類似的篩選分析能夠用于評(píng)價(jià)本文中所描述的藤黃胺。即使是在缺乏NGF時(shí)，T17也比其親本SN56細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)， 表明TrkA的過表達(dá)抑制半胱天冬酶_3激活。NGF處理進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效應(yīng)。作為存活增強(qiáng)劑的化合物的識(shí)別為了比較化合物的細(xì)胞凋亡抑制劑活性，能夠?qū)⑵渑cT17和SN56細(xì)胞一起預(yù)培養(yǎng) (0.5μΜ)，接著用ΙμΜ STS培養(yǎng)9h。細(xì)胞凋亡抑制活性的定量分析將表明哪些化合物幾 乎沒有或沒有能力保護(hù)SN56細(xì)胞免于凋亡，而哪些化合物能夠強(qiáng)有力地抑制T17細(xì)胞的凋 亡，理想地甚至具有比NGF更強(qiáng)的保護(hù)活性。這樣的化合物可以顯示出在神經(jīng)保護(hù)方面的 用途。在篩選中識(shí)別出的增加T17細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的化合物能夠觸發(fā)漸進(jìn)式的 (programmed)細(xì)胞死亡，并可以用作抗癌藥物。TrkA 在海馬神經(jīng)元中是高度表達(dá)的(Culmsee et al.，2002 ；Kume et al.，2000 ； Zhang et al.，1993)。在病理生理?xiàng)l件下，TrkA和p75NTR在海馬和皮層神經(jīng)元中是上調(diào) 的(Kokaia et al. ,1998 ；Leeet al.，1998)。而且，在海馬和皮層神經(jīng)元中的NGF神經(jīng)保 護(hù)效應(yīng)已經(jīng)在體外和體內(nèi)得以證明(Culmsee et al. , 1999 ；Zhang et al.，1993)。為了檢測試驗(yàn)化合物是否能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活，需要能夠制備海馬神經(jīng)元，并用各種試驗(yàn)化合物預(yù)處理初級(jí)神經(jīng)元一段時(shí)間，例如30min，接著用50 μ M的谷氨酸鹽(或 酯)處理一段時(shí)間，例如16小時(shí)。MR(DEVD)2的定量細(xì)胞凋亡分析能夠用于確定這些化合 物是否表現(xiàn)出與陽性對(duì)照NGF相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效應(yīng)(即，細(xì)胞凋亡抑制活性)。NGF過表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因小鼠或心室內(nèi)注射小鼠的梗死體積和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 (Guegan et al. , 1998 ；Luk et al.，2004)。NGF 也有力地保護(hù) PC12 細(xì)胞在 OGD (缺氧缺糖) 模型中免于凋亡(Tabakman et al.，2005)。為了探索試驗(yàn)化合物是否會(huì)對(duì)0⑶中的海馬神經(jīng)元發(fā)揮任何保護(hù)效應(yīng)，可以在OGD刺激之前用NGF或試驗(yàn)化合物預(yù)處理初級(jí)制劑30min。 在3小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞凋亡分析能夠用于證明化合物是否表現(xiàn)出強(qiáng)有力的保護(hù)效應(yīng)。滴定分析 能夠證明化合物是否以劑量依賴的方式保護(hù)神經(jīng)元。因此，該分析能夠識(shí)別出選擇性保護(hù) TrkA表達(dá)細(xì)胞和初級(jí)神經(jīng)元免于發(fā)生凋亡的化合物。 PC12細(xì)胞中神經(jīng)突生長的測定NGF的最顯著的神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)之一是觸發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞中的神經(jīng)突生長并引起分 化。為了探索試驗(yàn)化合物是否具有這一活性，可以用一定濃度的試驗(yàn)化合物(例如，0. 5M的 化合物)培養(yǎng)PC12細(xì)胞一段時(shí)間，例如5天?？梢灾芷谛缘?，例如每隔一天補(bǔ)充含有這些 化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基。在這種類型的分析中，NGF會(huì)在處理5天之后引起PC12細(xì)胞中的顯著神經(jīng)突萌 發(fā)。在上述一個(gè)或多個(gè)分析中具有活性，并且也在PC12細(xì)胞中引起神經(jīng)突生長的那些試驗(yàn) 化合物，就能夠認(rèn)為是神經(jīng)營養(yǎng)/神經(jīng)保護(hù)性的。通過試驗(yàn)化合物產(chǎn)生的神突網(wǎng)絡(luò)能夠用作這些化合物具有強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)活性的證 據(jù)。劑量依賴性分析能夠用于揭示引起PC12細(xì)胞中顯著神經(jīng)突萌發(fā)的理想濃度，并由此識(shí) 別在某濃度下具有與NGF相當(dāng)?shù)挠辛Φ纳窠?jīng)營養(yǎng)活性并強(qiáng)力引起神經(jīng)突生長的化合物。觸發(fā)海馬神經(jīng)元中TrkA酪氨酸磷酸化作用的化合物的鑒別NGF結(jié)合至受體TrkA并引發(fā)其發(fā)生二聚作用和在酪氨酸殘基上的自身磷酸化作 用。TrkA上的許多酪氨酸殘基在受到NGF刺激后發(fā)生磷酸化作用。例如，Y490磷酸化作用 就是Shc關(guān)聯(lián)和MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的活化所需的。Y751磷酸化作用對(duì)于PI 3-激酶對(duì) 接和活化是關(guān)鍵的。為了評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物是否也能夠觸發(fā)TrkA酪氨酸磷酸化作用，可以用以某一濃 度的假定化合物(例如，0.5 μ M)處理初級(jí)海馬神經(jīng)元一段特定時(shí)間(例如，30min)。細(xì)胞 溶解產(chǎn)物能夠例如通過采用抗_磷-TrkA Y490抗體的免疫印跡進(jìn)行分析。NGF處理將會(huì)顯示出引起強(qiáng)烈的TrkA磷酸化作用，并且該分析能夠識(shí)別出像NGF 一樣的類似地引起TrkA磷酸化作用的化合物。海馬神經(jīng)元中的TrkA酪氨酸磷酸化作用也 能夠通過采用抗-TrkA Y490特異抗體的免疫熒光染色而證實(shí)。為了確定試驗(yàn)化合物是否能夠觸發(fā)TrkA 二聚作用，可將GFP-TrkA和HA-TrkA共 轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并用0. 5 μ M藤黃酰胺處理該細(xì)胞30min。共免疫沉淀分析可用于確 定任何試驗(yàn)化合物是否引起TrkA 二聚作用，理想地甚至比NGF更強(qiáng)，更理想地采用陰性對(duì) 照(如DMS0)產(chǎn)生基線。共轉(zhuǎn)染TrkA和TrkB或TrkC受體將不會(huì)發(fā)生二聚作用，無論用NGF還是用也選擇 性觸發(fā)TrkA受體二聚作用的化合物預(yù)處理都是如此。選擇性TrkA激動(dòng)劑將引起TrkA中 而不是TrkB或C受體中的酪氨酸磷酸化作用(或在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染以表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)這些 受體，即，TrkA與TrkB和/或TrkC組合)。一些化合物可以按照這種方式起效以至于與野生型TrkA相比，TrkA-KD將顯示出 酪氨酸磷酸化作用降低，這將會(huì)表明，不僅TrkA發(fā)生自身磷酸化作用，而且其他酪氨酸激 酶也被激活，并有助于Y490磷酸化作用。由此，這些分析能夠識(shí)別模擬NGF和選擇性引起 TrkA 二聚作用和酪氨酸磷酸化作用的化合物。引起Akt和MAP激酶激活的化合物的識(shí)別
NGF通過TrkA受體觸發(fā)PI 3_激酶/Akt和Ras/MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活。為了探究試驗(yàn)化合物是否具有類似的促有絲分裂作用，可以用各種試驗(yàn)化合物處理T17細(xì)胞 30min。分別采用抗-磷-Erkl/2和磷_Akt_473抗體的免疫印跡法來分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。NGF處理刺激可論證的Erkl/2和Akt磷酸化作用。類似地引起Erkl/2和Akt強(qiáng) 烈磷酸化作用的那些化合物將會(huì)表現(xiàn)出是有效的TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng)劑)。不能激活MAP激酶但是能強(qiáng)烈引起Akt激活的化合物可以有差別地通過TrkA受 體或其下游細(xì)胞靶來調(diào)節(jié)PI 3-激酶/Akt和Ras/MAP激酶通路。該分析能夠拓展到初級(jí)海馬神經(jīng)元。NGF和某些試驗(yàn)化合物可以激活A(yù)kt，而其 他化合物可以稍微上調(diào)Akt磷酸化作用。利用海馬神經(jīng)元進(jìn)行的時(shí)程分析(Time course assay)能夠用于證實(shí)某些化合物是否在5min處理之后就引起Akt磷酸化作用，以及Akt激 活是否隨時(shí)間增加，其是否能夠維持，及其是否以劑量依賴的方式引起Akt激活。將這些信 息結(jié)合在一起，就能識(shí)別在神經(jīng)元中模擬NGF和強(qiáng)力激活A(yù)kt和MAP激酶激活作用的化合 物。結(jié)合TrkA受體的細(xì)胞質(zhì)近膜結(jié)構(gòu)域的化合物的識(shí)別鄰近膜的TrkA胞外區(qū)域中的免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域(TrkA_d5結(jié)構(gòu)域)是特 異性結(jié)合NGF所需的(Urfer et al.，1995)。為了研究TrkA受體的哪部分結(jié)合至試驗(yàn)化合 物，并且該化合物基于以上所述的分析看起來也就是TrkA激動(dòng)劑，可以采用通過共價(jià)連接 這些化合物至固體底物如親合膠102(affi-gel 102)的固定化的化合物來實(shí)施體外結(jié)合 分析?？梢灾苽銰FP-標(biāo)記的TrkA截形物(truncate)，并將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。結(jié) 合分析能夠用于證明胞外域是否是關(guān)聯(lián)所必需的。細(xì)胞質(zhì)近膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂潴w結(jié)合是關(guān)鍵 的。盡管Trk家族成員的胞內(nèi)域(ICD)共有較大的同源性，但在近膜區(qū)域是不同的。體外 結(jié)合分析能夠用于證明試驗(yàn)化合物是否選擇性結(jié)合至野生型和/或激酶_失效的TrkA，而 不是TrkB或TrkC。因此，選擇性TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng)劑)能夠被識(shí)別。如果試驗(yàn)化合物對(duì)Trk-KD的親合性比野生型TrkA要弱，和/或不能結(jié)合至 P75NTR、ErbB3或EGF受體，這能夠證明試驗(yàn)化合物特異性關(guān)聯(lián)TrkA而不是其他的神經(jīng)營 養(yǎng)因子受體或跨膜酪氨酸激酶受體。為了確定試驗(yàn)化合物和TrkA之間的結(jié)合常數(shù)，可以采用共價(jià)連接至試驗(yàn)化合物 的GFP-TrkA-結(jié)合珠來實(shí)施競爭分析。如果與珠粒關(guān)聯(lián)的TrkA的濃度隨著試驗(yàn)化合物游 離濃度升高而降低，則競爭數(shù)據(jù)的定量分析將顯示試驗(yàn)化合物的Kd。結(jié)合FITC的試驗(yàn)化合 物與PC12細(xì)胞一起培養(yǎng)lOmin，能夠引起它們與TrkA受體的關(guān)聯(lián)，而僅有FITC不能滲透到 細(xì)胞中。利用這些信息，就能確定試驗(yàn)化合物是否滲透細(xì)胞膜并通過相同或不同于NGF的 區(qū)域緊密結(jié)合于TrkA受體。確定試驗(yàn)化合物是否能夠防止紅藻氨酸觸發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡并降低中風(fēng)大鼠 腦中的梗死體積紅藻氨酸(KA)是一種AMPA受體的強(qiáng)力激動(dòng)劑。KA的外周注射導(dǎo)致海馬中神經(jīng) 元選擇群落反復(fù)發(fā)作和隨后的退化(Nadleret al.，1980 ；Schauwecker和Steward，1997 ； Sperk et al.，1983)。已經(jīng)證實(shí)，半胱天冬酶_3的激活是KA-引起細(xì)胞死亡的必要組成 (Faherty et al.，1999)。為了探究試驗(yàn)化合物是否能夠阻斷KA引發(fā)的神經(jīng)毒性，隨后可以將這些化合物(例如，濃度為2mg/kg)皮下注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，接著注射25mg/kgΚΑ。在5天內(nèi)，對(duì)小鼠進(jìn)行灌注，并將腦切成厚度為5μπι的切片并安裝在載玻片上。在不 存在神經(jīng)保護(hù)化合物的情況下，TUNEL染色顯示KA導(dǎo)致海馬中大量細(xì)胞凋亡。如果這種細(xì) 胞凋亡通過試驗(yàn)化合物顯著降低，則該分析能夠證實(shí)試驗(yàn)化合物是神經(jīng)保護(hù)性的。為了進(jìn)一步確定體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)潛能，可以在成年雄性大鼠的短暫大腦中動(dòng)脈閉塞 (MCAO)中風(fēng)模型中測試試驗(yàn)化合物。在2hMCA0后進(jìn)行再灌注之后，在再灌注開始前5min， 使這些動(dòng)物接受載體或試驗(yàn)化合物(2mg/kg)。如果所有或絕大多數(shù)試驗(yàn)動(dòng)物在局部缺血性 損傷和用試驗(yàn)化合物處理后存活，則證明該化合物是神經(jīng)保護(hù)性的。在載體處理的和化合物處理的大鼠中發(fā)生MCAO后，用TTC將代表性的大腦切片染 色24h，能夠經(jīng)受TTC切片的面積和體積測量表明用化合物處理是否顯著減小了這種暫時(shí) 缺血性中風(fēng)模型中的梗死體積?？蓪㈥栃越Y(jié)果與NGF的結(jié)果進(jìn)行比較，因?yàn)橐阎狽GF能夠 減小局灶性局部缺血中的梗死體積和細(xì)胞凋亡(Guegan et al.，1998)。LDF (激光多普勒血流儀，Iaser-Doppler flowmetry)能夠?qū)ν瑐?cè)頂葉皮質(zhì)進(jìn)行測 定。在隨后接受試驗(yàn)或載體處理的大鼠中5minMCA0內(nèi)能夠測量相對(duì)CBF(腦血流量)的降 低。將上述分析結(jié)合到一起，就能夠識(shí)別強(qiáng)力TrkA激動(dòng)劑(或部分激動(dòng)劑)，其能夠防 止神經(jīng)元細(xì)胞死亡并保護(hù)由興奮性神經(jīng)毒性和中風(fēng)誘發(fā)的神經(jīng)變性。II.采用TrkA激動(dòng)劑提供神經(jīng)保護(hù)的方法選擇性TrkA激動(dòng)劑能夠用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。該方法涉及向動(dòng)物給予 有效量的選擇性TrkA激動(dòng)劑或選擇性TrkA激動(dòng)劑的藥用鹽或前藥，從而提供神經(jīng)保護(hù)作 用，并治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。選擇性TrkA激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑，如利用以上描述的篩選方法識(shí)別的那化合物， 能夠在神經(jīng)損傷如中風(fēng)或其他局部缺血性事件之前、之中或之后用于提供神經(jīng)保護(hù)作用。 該化合物的神經(jīng)保護(hù)作用能夠預(yù)防在這些涉及記憶編碼和表現(xiàn)出阿爾茨海默氏癥和局部 缺血的早期退化的區(qū)域內(nèi)由興奮毒性劑(或外毒素劑，exitotoxicagent)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì) 胞生存力喪失。選擇性TrkA激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑也能夠用于治療脫髓鞘病，例如MS。盡管并不期 望受束縛于具體理論，但是可以認(rèn)為選擇性TrkA激動(dòng)劑通過誘導(dǎo)髓鞘蛋白基因來治療或 預(yù)防例如在多發(fā)性硬化癥(MS)中觀察到的自身免疫脫髓鞘。選擇性TrkA激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑能夠進(jìn)一步用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性病，例如 癲癇、頭部和脊髓損傷、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、阿爾茨海默氏癥、或肌萎縮側(cè)索硬化癥或 神經(jīng)障礙。能夠利用選擇性TrkA激動(dòng)劑來治療的其他神經(jīng)疾病有運(yùn)動(dòng)障礙、疼痛等。選擇性TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑能夠進(jìn)一步用于促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，并能夠保 護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于細(xì)胞死亡，例如，由于神經(jīng)毒性劑作用造成的細(xì)胞死亡。在這些方法的每一種中，TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑，或其藥用鹽或前藥，以有效量 向動(dòng)物給藥，可選地以藥物組合物的方式給藥，從而提供神經(jīng)保護(hù)作用、治療脫髓鞘性病、 增強(qiáng)神經(jīng)再生、和/或治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。這些化合物提供了優(yōu)于NGF的優(yōu)點(diǎn)，即，相對(duì)于NGF而言，由于它們是小分子從而 能夠口服給藥并且能夠以相對(duì)低的廉造價(jià)和相對(duì)高的純度來制備。而且，這些化合物通過選擇性結(jié)合于TrkA，而不是非選擇性地結(jié)合于TrkA、TrkB和TrkC，從而具有比NGF更高的 選擇性。IV.藥物組合物可將本文中描述的化合物結(jié)合到藥物組合物中并用于預(yù)防易感這種病癥或疾病 的受治療者的病癥或疾病，和/或治療患有這種病癥或疾病的受治療者。本文中描述的藥 物組合物包括本文中所述的一種或多種和厚樸酚(honokiol)類似物，和/或其藥用鹽。可 選地，活性化合物能夠作為外消旋混合物、作為純對(duì)映體、或作為不同對(duì)映體純度的化合物 來使用。化合物的給藥方式可以是不同的。該組合物優(yōu)選口服給藥(例如，以在溶劑中的 液體形式給藥，如含水或無水液體，或在固體載體中給藥)。優(yōu)選的口服給藥組合物包括丸 齊U、片劑、膠囊劑、囊片劑(caplet)、糖漿劑、以及溶液，包括硬質(zhì)凝膠膠囊和時(shí)間緩釋膠囊。 組合物可以配置成單位劑量形式，或多倍或亞單位劑量形式。優(yōu)選的組合物是以液體或半 固體形式?？梢允褂冒ㄒ后w藥物惰性載體如水或其他藥物相容性液體或半固體的組合 物。這樣的液體和半固體的使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知。組合物也可以經(jīng)由注射給藥，即靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、動(dòng)脈 注射、胸內(nèi)注射；和腦室內(nèi)注射。靜脈注射給藥是優(yōu)選的注射方法。用于注射的合適載體對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，并且包括5%的葡萄糖溶液、鹽水和磷酸鹽緩沖的鹽 水。該化合物也能夠作為輸注液或注射液給藥(例如，作為在藥用液體或液體混合物中的 混懸液或乳液)。制劑也可以采用其他方式給藥，例如，直腸給藥。適用于直腸給藥的制劑，如栓劑， 是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。該化合物也能夠通過吸入給藥(例如，以氣霧劑的形式鼻吸或 采用授予Brooks等的美國專利第4，922，901號(hào)所述的那些遞送物類型，其公開內(nèi)容以其全 文結(jié)合于本文作為參考)；局部給藥(例如，以洗劑形式)；或經(jīng)皮膚給藥(例如，采用來自 Novartis and Alza Corporation的商用技術(shù)的皮膚貼劑)。盡管也可以以大量活性化學(xué)品 的形式給藥，但優(yōu)選使每種化合物以有效藥物組合物或制劑的形式存在并進(jìn)行有效給藥。可將這些化合物結(jié)合于藥物遞送器件中，如納米顆粒、微粒、微膠囊等。代表性 的微粒/納米顆粒包括那些用環(huán)糊精，如PEG化環(huán)糊精、包括小的單層泡囊的脂質(zhì)體、 以及經(jīng)過尺寸設(shè)計(jì)而駐留在生長中的腫瘤周圍的毛細(xì)管床的脂質(zhì)體來制備的那些。合 適的藥物遞送器件，描述于例如以下文獻(xiàn)中Heidel JD, et al.，Administrationin non-human primates of escalating intravenous doses of targetednanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 ^ 4 3 H ；104(14) 5715-21 ；Wongmekiat et al. , Preparation of drug nanoparticles by co-grindingwith cyclodextrin formation mechanism and factors affectingnanoparticle formation, Chem Pharm Bull (東京).2007 年 3 月；55 (3) 359-63 ；Bartlett 禾口 Davis，Physicochemical and biologicalcharacterization of targeted, nucleic acid-containing nanoparticles, Bioconjug Chem. 2007 年 3-4 月；18(2) 456-68 ；Villalonga et al. , Amperometric biosensor for xanthine with supramoleculararchitecture, Chem Commun(Camb). 2007 年 3 月 7 日；(9) :942_4 ；Defaye et al. ， Pharmaceutical use of cyclodextrines -perspectives fordrug targetingand control of membrane interactions, Ann Pharm Fr. 2007 年 1 月；65(1) :33_49 ； Wang et al. , Synthesis ofOligo(ethylenediamino)-beta-cyclodextrin Modified Gold Nanoparticleas a DNA Concehtrator ；Mol Pharm. 2007 年 3-4 月；4 (2) 189-98 ； Xia etal. ,Controlled synthesis of Y—junction polyaniline nanorods andnanotubes using in situ self-assembly of magnetic nanoparticles, JNanosci Nanotechnol., 2006 年 12 月；6 (12) :3950_4 ；以及 Ni jhuis et al. ,Room-temperature single-electron tunneling in dendrimer-stabilizedgold nanoparticles anchored at a molecular printboard, Small. 2006 年 12 月；2(12) 1422-6。用于給予這種化合物的示例性方法對(duì)于熟練的技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些 制劑的有用性可以取決于所使用的特定組合物和接受治療的特定受治療者。這些制劑可以 含有可以是油性的、水性的、乳化的或含適合于某種給藥模式的溶劑的液體載體。組合物能夠間歇地或以逐漸的、連續(xù)的、恒定的或以受控速率向溫血?jiǎng)游?例如， 哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、貓，兔、狗、豬、奶?；蚝?給藥，但有利的是向人類給藥。另外，給予 該藥物制劑的天數(shù)和每天給予的次數(shù)可以是不同的。優(yōu)選地，給予該組合物以使得活性成分與癌細(xì)胞所在的區(qū)域發(fā)生相互作用。本文 中所描述的化合物在治療這些癌癥時(shí)是非常有效的。在某些情況下，本文中描述的化合物能夠作為與其他預(yù)想預(yù)防或治療具體癌癥的 化合物的藥物組合物的部分一起使用，即組合療法。除了有效量的本文中所述化合物之外， 藥物組合物也能夠包含作為添加劑或佐劑的各種其他組分。組合療法組合療法可以按照以下幾方面進(jìn)行給藥(a)單一一種藥物組合物，包含本文中 所述的選擇性TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑(例如，藤黃胺)、至少一種本文中所述的其他藥 齊U、以及藥用賦形劑、稀釋劑、或載體；或(b)兩種單獨(dú)的藥物組合物，包含(i)第一藥物組 合物，含包本文中所述的選擇性TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑和藥用賦形劑、稀釋劑或載體， 和(ii)第二組合物，包含至少一種本文中所述的其他藥劑和藥用賦形劑、稀釋劑、或載體。 藥物組合物可以同時(shí)或按序和以任何次序進(jìn)行給藥。當(dāng)用于治療脫髓鞘病如MS時(shí)，選擇性TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑能夠與已知用于 治療MS的其他化合物如干擾素和PEG化的干擾素(Pegasys) —起給藥。當(dāng)用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性病(如AD和帕金森氏病)時(shí)，選擇性TrkA激動(dòng)劑或部 分激動(dòng)劑能夠與已知用于治療這種病的其他化合物(如多巴胺和Aric印t ) —起給藥。當(dāng)用于提供神經(jīng)保護(hù)時(shí)，選擇性TrkA激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑能夠與已知用于提供 神經(jīng)保護(hù)作用的其他化合物(如腺苷)一起給藥(Dair Igna et al. , "Neuroprotection by caffeine and adenosine A2a 受體 blockade of -amyloid neurotoxicity" British Journal ofPharmacology(2003)138，1207-1209)。以下實(shí)施例是舉例說明性的，而不是限制本發(fā)明的方法和組合物。在臨床治療中 所遇到的各種條件和參數(shù)，以及對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而言易見的其他合適修改和變化， 都屬于本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1:藤黃酸工藝步驟1:
步驟A干藤黃粉(140g)在室溫下用甲醇提取(3X600mL)l周，過濾后，減壓下除去溶劑， 得到黃色粉末狀的粗提物(122g)。步驟B.藤黃酸吡啶鹽將以上的粗提物(120g)溶解于吡啶(120mL)中，然后向攪拌的溶液中加入溫水(30mL)。冷卻至室溫后，觀察到一些沉淀。向混合物中加入己烷(120mL)，過濾該混合物并 用己烷沖洗固體，干燥。通過乙醇反復(fù)重結(jié)晶而純化該鹽，從而得到藤黃酸吡啶鹽(75g)； HPLC :99%。步驟C.藤黃酸將藤黃酸吡啶鹽(0. 4g)溶解于醚(25mL)中并與HCl水溶液(1N，25mL)振蕩lh。 隨后用水(2 X IOmL)沖洗該醚溶液，干燥并蒸發(fā)而得到標(biāo)題化合物(345mg) ；HPLC :99%。1H NMR(CDCl3) 12. 66 (s, 1H)，7. 43 (d, J = 6. 9Hz, 1H)，6· 48 (d, J = 10. 2Hz, 1H)，5· 97 (t, J = 75Hz, IH)，5. 26 (d, J = 9. 9Hz, 1H)，4. 91 (m, 2H)，3. 37 (m, 1H)，3. 24-2. 98 (m, 2H)，2. 81 (d，J = 6. 6Hz, 1H)，2· 41(d，J = 9Hz, 1Η)，2· 20(m, Jl = 8. 4Hz, J2 = S1HZ, 1Η)，1. 88 (m, 1Η)，1. 63 (s, 3H)，1. 60 (s，3H)，158 (s,3H)，153 (s,3H)，I5I (s,3H)，1. 43 (s, 3H)，1. 26 (s, 3H)，“8 (s, 3H) · MS 627 (M-H)。工藝步驟2:藤黃的粗提物(300mg)采用Combi Flash SG 100分離系統(tǒng)通過反復(fù)柱色譜(Si02， 己烷-EtOAc梯度)來純化，得到18mg藤黃酸；HPLC 94%, MS. 627 (M-H)。由此制備的藤黃酸能夠用于，例如采用以上圖解1中所示出的化學(xué)方法來制備藤黃胺。實(shí)施例2 保護(hù)TrkA表達(dá)細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡的基于細(xì)胞的篩選為了識(shí)別模擬NGF和激活TrkA的小分子，我們開發(fā)了一種采用細(xì)胞滲透性熒光染 料MR(DERD)2的基于細(xì)胞的細(xì)胞凋亡分析法，在凋亡的細(xì)胞中半胱天冬酶-3分解會(huì)使得該 染料變紅。我們利用衍生于基底前腦SN56細(xì)胞的鼠細(xì)胞系T17。T17細(xì)胞是TrkA穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染的SN56細(xì)胞。第一輪篩選選擇性保護(hù)T17而不是SN56細(xì)胞的候選物，隨后對(duì)其進(jìn)行第 二輪篩選的神經(jīng)突生長分析。對(duì)于TrkA酪氨酸磷酸化作用、Akt和MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián) 激活，可以分析陽性化合物。T17細(xì)胞能夠在96-孔板中培養(yǎng)并用10 μ M化合物預(yù)培養(yǎng)30分鐘，接著用1 μ M星 形孢菌素(STS)處理9h。在熒光顯微鏡下檢查前Ih將MR(DEVD)2引入細(xì)胞中。凋亡的細(xì) 胞變紅，而活細(xì)胞則沒有信號(hào)。作為陽性對(duì)照，與DMSO對(duì)照相比，NGF顯著降低了紅色細(xì)胞 數(shù)目。利用半胱天冬酶-3-激活的熒光染料作為可視分析，就能夠篩選出藤黃胺化合物。這些選擇性地保護(hù)T17而不是SN56細(xì)胞免于STS-誘發(fā)的細(xì)胞凋亡的化合物可能 是直接通過TrkA受體或其下游信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)器發(fā)生作用。即使在沒有NGF存在的情況下， T17也會(huì)表現(xiàn)出比其親本SN56細(xì)胞更強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)，這表明TrkA過表達(dá)抑制了半胱 天冬酶-3的激活。NGF處理進(jìn)一步強(qiáng)化了這種效應(yīng)。藤黃胺作為存活增強(qiáng)劑的鑒定為了比較各種化合物的細(xì)胞凋亡抑制活性，可將T17和SN56細(xì)胞與藤黃胺衍生物 (0.5μΜ) 一起預(yù)培養(yǎng)，接著用Iym STS處理9h。細(xì)胞凋亡抑制活性的定量分析能夠確定化合物是否保護(hù)SN56細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡。作為對(duì)照，藤黃酸、藤黃酰胺、藤黃酸二甲酯和二氫藤黃酸在T17細(xì)胞中強(qiáng)力抑制細(xì)胞凋亡，且保護(hù)活性甚至比NGF更強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果間 接表明，一些藤黃酸衍生物能夠觸發(fā)漸進(jìn)性的細(xì)胞死亡，這與先前報(bào)道的它們具有抗癌活 性(Kasibhatla et al.，2005)是一致的。TrkA 在海馬神經(jīng)元中是高度表達(dá)的(Culmsee et al.，2002 ；Kume et al.，2000 ； Zhang et al.，1993)。在病理生理?xiàng)l件下，TrkA和p75NTR在海馬和皮層神經(jīng)元中是上調(diào) 的(Kokaia et al. ,1998 ；Leeet al.，1998)。而且，在海馬和皮層神經(jīng)元中，NGF的神經(jīng)保 護(hù)效應(yīng)已經(jīng)在體外和體內(nèi)得到了證明(Culmsee et al. , 1999 ；Zhang et al.，1993)。為了 檢查這些化合物是否能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活，可以制備海馬神經(jīng)元，并用各種藤黃胺衍生物 預(yù)處理初級(jí)神經(jīng)元30min，接著用50 μ M的谷氨酸鹽處理16h。MR(DEVD) 2定量細(xì)胞凋亡分 析能夠用于證實(shí)藤黃胺是否表現(xiàn)出與陽性對(duì)照NGF相同的保護(hù)效應(yīng)。NGF過表達(dá)降低轉(zhuǎn)基因小鼠或心室內(nèi)注射小鼠中的梗死體積和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 (Guegan et al. , 1998 ；Luk et al.，2004)。NGF 也強(qiáng)力地保護(hù) PC12 細(xì)胞在 OGD (缺氧缺糖) 模型中免于細(xì)胞凋亡(Tabakman et al.，2005)。為了探索藤黃胺是否對(duì)0⑶中海馬神經(jīng)元 發(fā)揮任何保護(hù)效應(yīng)，可以在OGD刺激之前用NGF或各種化合物預(yù)處理初級(jí)制劑30min。在 3h內(nèi)，細(xì)胞凋亡分析能夠用于證明藤黃胺是否表現(xiàn)出強(qiáng)有力的保護(hù)效應(yīng)。滴定分析能夠證 明化合物是否以劑量依賴性的方式保護(hù)神經(jīng)元。這些數(shù)據(jù)能夠鑒別出選擇性保護(hù)TrkA表 達(dá)細(xì)胞和初級(jí)神經(jīng)元免于細(xì)胞凋亡的那些藤黃胺。PC12細(xì)胞中神經(jīng)突生長的引發(fā)NGF的最顯著神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)之一是觸發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞中神經(jīng)突生長并發(fā)生分化。為 了探索藤黃胺化合物是否擁有這一活性，可以用0. 5 μ M藤黃胺培養(yǎng)PC12細(xì)胞5天。含有 這些化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基能夠每隔一天進(jìn)行補(bǔ)充。在處理后5天，NGF引發(fā)PC12細(xì)胞中的 顯著神經(jīng)突萌發(fā)?？梢灶愃频卦u(píng)價(jià)藤黃胺的化合物能夠誘使PC12細(xì)胞中顯著的神經(jīng)突生 長。劑量依賴性分析能夠揭示10 50ηΜ的藤黃胺是否足以引起PC12細(xì)胞中顯著的神經(jīng) 突萌發(fā)。因此，能夠確定藤黃胺在一定濃度時(shí)是否具有相當(dāng)于NGF的強(qiáng)力神經(jīng)營養(yǎng)活性，以 及有力地引起神經(jīng)突生長。海馬神經(jīng)元中TrkA酪氨酸磷酸化作用的觸發(fā)NGF結(jié)合至受體TrkA并引起其發(fā)生二聚作用和在酪氨酸殘基上的自動(dòng)磷酸化作 用。TrkA上的許多酪氨酸殘基在受到NGF刺激后發(fā)生磷酸化作用。例如，Υ490磷酸化作用 就是Shc關(guān)聯(lián)和MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的活化所需的。Y751磷酸化作用對(duì)于PI 3-激酶對(duì) 接和活化是關(guān)鍵的。為了評(píng)價(jià)藤黃胺化合物是否也能夠觸發(fā)TrkA酪氨酸磷酸化作用，可以 用0.5 μ M的各種藥劑處理初級(jí)海馬神經(jīng)元30min。細(xì)胞溶解產(chǎn)物能夠通過采用抗-磷-TrkA Y490抗體的免疫印跡法進(jìn)行分析。NGF處理引起強(qiáng)烈TrkA磷酸化作用，并且藤黃胺能夠評(píng) 價(jià)類地引起這種效應(yīng)的能力。正如通過采用抗_TrkAY490特異抗體的免疫熒光染色所證實(shí) 的，也能夠確定藤黃胺是否在海馬神經(jīng)元中引發(fā)的顯著TrkA酪氨酸磷酸化作用。為了確定 藤黃胺是否能夠觸發(fā)TrkA 二聚作用，可將GFP-TrkA和HA-TrkA共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中， 并用0. 5 μ M藤黃胺處理該細(xì)胞30分鐘。共免疫沉淀分析能夠用于確定藤黃胺是否引起了 甚至比NGF更強(qiáng)的TrkA 二聚作用。也能夠評(píng)價(jià)藤黃胺是否也引了 TrkA受體中而不是TrkB 或TrkC受體中的酪氨酸磷酸化作用。因此，能夠確定藤黃胺是否模擬NGF并選擇性引起TrkA 二聚作用和酪氨酸磷酸化作用。引起Akt和MAP激酶的激活NGF通過TrkA受體觸發(fā)PI 3_激酶/Akt和Ras/MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活。為 了探究藤黃胺是否擁有類似的促有絲分裂作用，可以用各種藤黃胺衍生物處理T17細(xì)胞 30min。分別采用抗-磷-Erkl/2和磷_Akt_473抗體的免疫印跡法來分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。 NGF處理刺激可論證的Erkl/2和Akt磷酸化作用，并且可以評(píng)價(jià)藤黃胺實(shí)施該行為的能 力。也可以將分析拓展至初級(jí)海馬神經(jīng)元。NGF顯著地激活A(yù)kt，并且可以評(píng)價(jià)藤黃胺激活 Akt的能力。利用海馬神經(jīng)元的時(shí)程分析(Time course assay)能夠證實(shí)藤黃胺(0. 5 μ M) 在5min處理之后是否引起Akt磷酸化作用，以及Akt激活是否在IOmin之后增加，并維持 60min。也能夠確定藤黃胺是否以劑量依賴性方式引起Akt激活。將這些觀察結(jié)果結(jié)合到 一起，就能證實(shí)藤黃胺在神經(jīng)元中模擬NGF和強(qiáng)力活化Akt和MAP激酶活化作用。結(jié)合TrkA受體細(xì)胞質(zhì)近膜結(jié)構(gòu)域鄰膜的TrkA胞外區(qū)域中的免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域(TrkA_d5結(jié)構(gòu)域)是特異 性結(jié)合NGF所需的(Urfer et al.，1995)。為了研究TrkA受體的哪部分結(jié)合至藤黃胺，可 以利用通過共價(jià)連接至親合膠102(affi-gel 102)的固定化的藤黃胺來實(shí)施體外結(jié)合分 析。為了在該分析中使用，我們生成了許多GFP-標(biāo)記TrkA截形物，并將其轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞中。結(jié)合分析證明胞外域并不是關(guān)聯(lián)所必需的。有意思的是，細(xì)胞質(zhì)近膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ?配體結(jié)合是關(guān)鍵的。盡管Trk家族成員的胞內(nèi)域(ICD)共有較大的同源性，但在近膜區(qū)域 是不同的。體外結(jié)合分析能夠用于證明藤黃胺是否選擇性結(jié)合至野生型和/或激酶_失效 的TrkA，而不是TrkB或TrkC。如果Trk-KD表現(xiàn)出對(duì)藤黃胺比野生型TrkA具有更弱的親 合性，且這種胺不能結(jié)合于P75NTR、ErbB3或EGF受體，則這些信息將會(huì)強(qiáng)調(diào)藤黃胺特異性 關(guān)聯(lián)TrkA而不是其他神經(jīng)營養(yǎng)素受體或跨膜酪氨酸激酶受體的發(fā)現(xiàn)。為了確定藤黃胺和 與TrkA之間的結(jié)合常數(shù)，可以采用GFP-TrkA-結(jié)合的藤黃胺珠來實(shí)施競爭分析。競爭數(shù)據(jù) 的定量分析能夠用于揭示Kd。結(jié)合FITC-的藤黃胺與PC12細(xì)胞一起培養(yǎng)lOmin，能夠用于 引起其與TrkA受體的關(guān)聯(lián)，而僅有FITC不能滲透到細(xì)胞中。因此，這些信息能夠顯示藤黃 胺是否滲透細(xì)胞膜并通過與NGF不同的區(qū)域緊密結(jié)合至TrkA受體。紅藻氨酸觸發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的預(yù)防和中風(fēng)大鼠腦中梗死體積減小紅藻氨酸(KA)是一種AMPA受體的強(qiáng)力激動(dòng)劑。KA的外周注射導(dǎo)致海馬中神經(jīng)元 選擇群落反復(fù)發(fā)作和隨后的退化(Nadleret al. , 1980 ；Schauwecker and Steward, 1997 ； Sperk et al.，1983)。已經(jīng)證實(shí)，半胱天冬酶_3的激活是KA-引起細(xì)胞死亡的必要組成 (Faherty et al.，1999)。為了探究藤黃胺是否能夠阻斷KA引發(fā)的神經(jīng)毒性，向C57BL/6小 鼠皮下注射2mg/kg藤黃胺，接著注射25mg/kg ΚΑ。在5天內(nèi)，對(duì)小鼠進(jìn)行灌注，并將腦切成 厚度為5 μ m的切片并安裝在載玻片上。TUNEL染色顯示KA是否會(huì)導(dǎo)致海馬中大量細(xì)胞凋 亡，以及這種效應(yīng)是否會(huì)通過藤黃胺而顯著降低。海馬中細(xì)胞凋亡的定量分析顯示，在CAl 和CA3區(qū)域中KA誘導(dǎo)了 47%和53%的細(xì)胞死亡，并將該結(jié)果與藤黃胺的結(jié)果進(jìn)行比較。為了進(jìn)一步確定體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)潛能，可以在成年雄性大鼠的短暫大腦中動(dòng)脈閉塞 (MCAO)中風(fēng)模型中測試藤黃胺。在2h MCAO后進(jìn)行再灌注之后，在再灌注開始前5min，使 這些動(dòng)物受載體或藤黃胺(2mg/kg)。如果所有或絕大多數(shù)動(dòng)物在局部缺血性損傷和用藤黃 胺處理后存活，則證明藤黃胺具有神經(jīng)保護(hù)性潛能。從TTC切片的面積和體積測量能夠表明用藤黃胺處理是否顯著降低了中風(fēng)這種暫時(shí)性局部缺血模型中的梗死體積。如果確實(shí)如 此，則可將這些結(jié)果與NGF能夠減小局灶性局部缺血中的梗死體積和細(xì)胞凋亡的現(xiàn)有報(bào)道 (Guegan et al. , 1998)進(jìn)行比較。LDF(激光多普勒血流儀)能夠?qū)ν瑐?cè)頂葉皮質(zhì)進(jìn)行測 定?？梢栽u(píng)價(jià)藤黃胺對(duì)相對(duì)CBF(腦血流量)的影響。在絲體撤出(filament withdrawal) 后(120min)，在載體處理的組中和藤黃胺處理的組中也能夠測量相對(duì)CBF，并與缺血前水 平比較。對(duì)于兩組之間沒有顯著差異的那些藤黃胺，這些數(shù)據(jù)暗示了相對(duì)局部缺血性損傷 在所有組中是等價(jià)的。越來越多的證據(jù)表明，Trk家族成員在人類的許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到 關(guān)鍵作用(Descamps et al. ,2001 ；Douma et al. ,2004 ；McGregor et al.，1999)。神經(jīng) 營養(yǎng)因子受體家族的成員，在各種人類癌癥，包括前列腺癌(Weeraratna et al.，2000)、胰 腺癌(Zhanget al.，2005)和胸癌中是上調(diào)的。例如，NGF強(qiáng)烈地刺激胸癌細(xì)胞生長，這分 別是由TrkA和p75NTR介導(dǎo)的(Dolle et al.，2004)。新的證據(jù)表明，TrkA在這些癌癥的 發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。在胰腺癌的情況下，TrkA的表達(dá)增加還與疼痛水平增加有關(guān)。來 自C印halon Pharmaceuticals的星形孢菌素Trk抑制劑已經(jīng)顯示出優(yōu)異的臨床前抗腫瘤 效能(George et al.，1999)并已經(jīng)進(jìn)入人類臨床試驗(yàn)(Lippa et al.，2006 ；Marshall et al.，2005)。由于在許多腫瘤中的TrkA異常性激活會(huì)推動(dòng)癌癥發(fā)展，因此像藤黃胺這樣的 小分子可能不僅能防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡，它們可能也會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。藤黃酸已經(jīng)被用于傳統(tǒng)中藥來治療癌癥。其強(qiáng)有力地體外阻斷人體和動(dòng)物中癌細(xì) 胞增殖(ffu et al.，2004 ；Zhang et al.，2004 ；Zhaoet al.，2004)。近來，已經(jīng)表明，轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體作為藤黃酸的細(xì)胞靶而發(fā)揮作用，從而發(fā)揮其抗癌活性。假定藤黃胺可以結(jié)合轉(zhuǎn) 鐵蛋白受體以及TrkA。藤黃酸與轉(zhuǎn)鐵蛋白關(guān)聯(lián)的Kd為2. ZymOiasibhatlaet al.，2005)。 可以設(shè)想，藤黃胺將結(jié)合至TrkA受體，比轉(zhuǎn)鐵蛋白受體更具有特異性并且更加緊密。因此， 它們發(fā)揮的神經(jīng)營養(yǎng)活性可能會(huì)比細(xì)胞凋亡效應(yīng)更加強(qiáng)烈些選擇性更高。NGF通過嚴(yán)格的 蛋白激酶級(jí)聯(lián)作用，如磷酸肌醇3-激酶/Akt和促有絲分裂劑_激活的蛋白激酶途徑來調(diào) 節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。由于神經(jīng)變性是各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括阿爾茨海默氏癥和肌萎縮側(cè) 索硬化)的根本原因，因此識(shí)別對(duì)神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持的分子并界定其行為機(jī)制是很重要 的。除了起到靶衍生的存活因子的作用之外，NGF也調(diào)節(jié)成體神經(jīng)元中活性依賴性的神經(jīng) 元可塑性。而且，NGF可以適用于治療神經(jīng)變性病如阿爾茨海默氏癥(01SOn，1993)。因此， 那些屬于激動(dòng)劑(和部分激動(dòng)劑)并防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡的藤黃胺，在臨床上對(duì)于治療各 種神經(jīng)變性疾病和中風(fēng)是很重要的。材料和方法細(xì)胞和藥劑PC12細(xì)胞于37°C，5% CO2氣氛在調(diào)節(jié)濕度的培養(yǎng)箱中被維持在培養(yǎng)基A(具有10%胎牛血清(FBS)、5%馬血清和100單位的青霉素-鏈霉素的DMEM)中。通過將W8TG2 成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞與來自產(chǎn)后21天隔膜的鼠(菌株C57BL/6)神經(jīng)元融合而產(chǎn)生小鼠中隔 神經(jīng)元χ成神經(jīng)細(xì)胞瘤雜合體SN56細(xì)胞。SN56細(xì)胞在37°C下用5 % CO2氣氛維持于含有ImM 丙酮酸鹽和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。在含有300 μ g/mL G418的相同培養(yǎng)基中孵育大鼠 TrkA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T17細(xì)胞。細(xì)胞是由波士頓大學(xué)(Boston University)的Brygida Berse 博士贈(zèng)送的。NGF來自Roche。磷_Akt_473或308、Akt和核纖層蛋白A/C抗體來自CellSignaling?？?磷-Akt 473 抗體來自 Upstate Biotechnology, Inc.。含有 2000 種生物 活性化合物的化學(xué)物質(zhì)文庫來自 Spectrum Collection (MicroSource DiscoverySystem, Inc. Gaylordsville，CT 06755)。以上沒有包括的所有化學(xué)品都購自Sigma?；诩?xì)胞的篩選可以在100 μ L全部培養(yǎng)基中以10，000細(xì)胞/孔在96孔板中接種T17細(xì)胞。細(xì) 胞孵育過夜，接著用10 μ M化合物在DMSO中(來自Spectrum Collection library的IOmM 原液濃度)預(yù)處理30min。然后用1 μ M星形孢菌素處理細(xì)胞9h。在實(shí)驗(yàn)終止前1小時(shí)，弓丨 入10 μ Md MR(DEVD) 2，其是一種細(xì)胞滲透性半胱天冬酶-3-激活的熒光染料。用4%的多 聚甲醛固定細(xì)胞15min。隨后用PBS沖洗細(xì)胞并與1 μ g Hoechst 33342 一起孵育lOmin。 隨后用PBS沖洗蓋玻片，安裝，并利用熒光顯微鏡檢查。藤黃胺類的固定，以及FITC-藤黃胺的合成藤黃胺類能夠被固定于含有與藤黃胺上的胺基具有反應(yīng)活性的環(huán)氧基團(tuán)的合適 親合膠(如，Bio-Rad的Profinity EpoxideResin)。該反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行。反應(yīng)混合 物經(jīng)過沖洗除去過量的試劑，而藤黃胺_結(jié)合的微珠能夠在黑暗中保持在4°C的1 XPBS中。 熒光素的異氰酸酯形式，F(xiàn)ITC，能夠與藤黃胺結(jié)合。這些胺能夠在合適的溶劑如乙醇中引入 FITC中。在2h室溫下培養(yǎng)之后，反應(yīng)溶液能夠傾入水中，隨后用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層能 夠進(jìn)行干燥并濃縮而得到粗產(chǎn)物，能夠通過色譜(Si02，Et0Ac-己烷)純化而得到所需化合 物。共免疫沉淀和體外結(jié)合分析HEK293細(xì)胞或PC12細(xì)胞的10_cm孔板在PBS中沖洗1次，并在ImL溶胞緩沖劑 (50mM Tris, pH 7. 4,150mM NaClUmMEDTA.O. 5% Triton X-100U. 5mM Na3VO4,50mM NaF、 IOmM焦磷酸鈉、IOmM甘油磷酸鈉、ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mg/ml抑肽酶、lmg/ml亮肽 素、lmg/ml胃酶抑素Α)中溶解，并以14，000 X g在4°C下離心lOmin。將上清液轉(zhuǎn)移至新管 中。在SDS-PAGE之后，將樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。利用各種抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。紅藻氨酸/藤黃胺藥物的給藥對(duì)60日齡的雄性C57BL/6小鼠皮下注射(s. c.)單劑量的鹽水中的30%乙醇或 KA(25mg/kg) (Sigma, M0)或藤黃胺(2mg/kg)接著注射ΚΑ。連續(xù)監(jiān)控這些動(dòng)物2h以監(jiān)控發(fā) 作活性的開始。在治療5天時(shí)，可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，并用0. IM磷酸鹽緩沖鹽水中的4%多 聚甲醛灌注。切除腦，后固定過夜并石蠟包埋處理。切成5μπι的連續(xù)切片，并置于于載玻 片(Superfrost-plus，F(xiàn)isher)上。處理該載玻片以用于TUNEL染色，從而評(píng)價(jià)DNA斷裂的 程度。局灶性局部缺血模型 大鼠可用于局灶性局部缺血研究。對(duì)于研究組包括/不包括大鼠的標(biāo)準(zhǔn)可基于 腦血流量(CBF)的激光多普勒血流儀(LDF)測量結(jié)果。為了確保局部缺血性損傷的相對(duì) 均勻性，從同組中排除平均局部缺血性LDF > 40%基線LDF的動(dòng)物。這個(gè)過程導(dǎo)致始終如 一的較大和較均勻的梗死，降低了實(shí)驗(yàn)的變化性。麻醉能夠通過吸入5%的異氟烷(在N2/ O2 70%/30%混合物中)進(jìn)行并通過吸入2%異氟烷維持。采用SurgiVet (model V3304 ； Waukesha, WI, USA)脈沖血氧定量儀，血液能夠進(jìn)行監(jiān)控SpO2并維持在90%的水平。在整 個(gè)手術(shù)期間監(jiān)控體溫(經(jīng)由直腸探針)并采用加熱毯(HarvardApparatus,South Natick,MA, USA)維持在36. 5 37. 5°C。在顳肌上覆的皮膚中切幵小切口，并將激光多普勒探針(Moor Instruments, Wilmington, Delaware, USA)置于顳骨上部(離前囟點(diǎn)側(cè)向 6mm，后向 2mm)。局部缺血能夠按照先前的描述通過右中腦動(dòng)脈的梗塞誘發(fā)(Sayeed et al.，2006)。 病變體積用過量戊巴比妥鈉溶液(75mg/kg)后閉塞(post-occlusion) 24h將鼠處死。小 心切除腦并置于冰冷鹽水中，隨后從后極Imm處幵始至前極切成具有大鼠腦基質(zhì)(Harvard Apparatus)的厚度為2mm的片7連續(xù)冠狀切片。切片之后，將切片用2 %的氯化2，3， 5-三苯基四唑(TTC，Sigma)鹽水溶液染色并在37°C在黑暗中保持lOmin。隨后將染色的 切片在10%緩沖的福爾馬林中固定。釆用高分辨掃描儀(Epson Perfection 2400Photo) 掃描每一染色的冠狀切片的兩半球，隨后通過數(shù)字圖像分析(Image Pro System, Media Cybernetics, Silver Spring，MD，USA)進(jìn)行評(píng)價(jià)。給藥隨機(jī)分配經(jīng)過MCAO引起局部缺血 性損傷<40%基線LDF的大鼠以接受GA(n = 4)、或載體(η = 4)處理。在再灌注幵始前 5min，按照2mg/kg的劑量通過ip注射給予GA0除了它們接受相同體積/重量的僅僅載體 之外，對(duì)載體組的大鼠實(shí)施相同的實(shí)驗(yàn)方案。參考文獻(xiàn)Arevalo, J. 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權(quán)利要求
一種藤黃酸的胺類似物，其中，所述胺基具有結(jié)構(gòu)式(CH2NR1R2)，其中R1和R2單獨(dú)地是氫、可選取代的低級(jí)烷基、可選取代的芳基、可選取代的低級(jí)芳烷基、或可選取代的低級(jí)烷基芳基基團(tuán)，其中，所述取代基是選自由鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基、氨基、硝基、氰基、C1-C6?；被?、C1-C6氨基?；1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫基、C6-C10芳基、Cd-C7環(huán)烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C2-C6)烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、飽和或部分飽和的5-7元雜環(huán)基、或雜芳基組成的組中一種或多種，或其藥用鹽或前藥。
2.一種藤黃酸的胺類似物或其藥用鹽或前藥，其中，所述酰胺基具有結(jié)構(gòu)式(CONH2)。
3.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的化合物、和藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含除了藤黃酸的胺類似物之外的化合 物，所述化合物具有神經(jīng)保護(hù)活性、髓磷脂保護(hù)活性、或調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。
5.一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中響應(yīng)于TrkA激動(dòng)作用的神經(jīng)變性疾病的方法，包 含向需要這種治療的哺乳動(dòng)物給予有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物或根據(jù)權(quán)利 要求3或4所述的藥物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述疾病是中風(fēng)、帕金森氏癥、輕度認(rèn)知受損、阿 爾茨海默氏癥、癲癇、ALS、和其他的神經(jīng)變性疾病。
7.—種在局部缺血事件之前、期間或之后提供神經(jīng)保護(hù)的方法，包含向需要神經(jīng)保護(hù) 的患者給予根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物或根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述化合物或組合物在中風(fēng)或其他局部缺血事 件之后給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述化合物或組合物在暴露于神經(jīng)毒素之后給藥。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述化合物或組合物與至少一種已知的神經(jīng)保 護(hù)藥劑、或所述神經(jīng)保護(hù)藥劑的藥用鹽一起給藥。
11.一種用于治療或預(yù)防脫髓鞘病的方法，包含向需要這種治療或預(yù)防的患者給予根 據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的化合物或根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的藥物組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述脫髓鞘病是多發(fā)性硬化癥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述化合物或組合物與干擾素或其聚乙二醇 化形式一起給藥。
全文摘要
本文描述了TrkA受體的小分子激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和拮抗劑。這些化合物屬于藤黃胺類，其中藤黃酸的羧酸基(CO2H)被胺基(CH2NR1R2)取代。在一些實(shí)施方式中，該化合物選擇性地結(jié)合于TrkA而不是TrkB或TrkC，強(qiáng)力地誘導(dǎo)其酪氨酸磷酸化作用和下游包括Akt和MAP激酶的信號(hào)傳導(dǎo)激活。而且，它們能夠強(qiáng)烈地阻止谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡并引起PC12細(xì)胞中的突出神經(jīng)突的長出。藤黃胺特異性地與TrkA受體的細(xì)胞質(zhì)近膜結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用并引起其發(fā)生二聚。給予這些化合物可實(shí)質(zhì)上減少紅藻氨酸觸發(fā)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，并減小中風(fēng)的短暫大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型中的梗死體積。因此，這些化合物能夠提供對(duì)衰弱的神經(jīng)變性疾病的有效治療，并為患者提供神經(jīng)保護(hù)以免于發(fā)生中風(fēng)或其他局部缺血性事件。
文檔編號(hào)A61K31/454GK101821262SQ200880107133
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者葉克強(qiáng) 申請(qǐng)人:埃默里大學(xué)