專利名稱：水痘帶狀皰疹病毒-病毒樣顆粒(vlp)和抗原的制作方法
水痘帶狀皰疹病毒-病毒樣顆粒(VLP)和抗原相關(guān)申請本申請要求2007年7月19日提交的美國申請60/950，707的優(yōu)先權(quán)，本文出于所有目的通過提及而完整收錄。對電子形式提交的文本文件的描述本文通過提及而完整收錄與本文一起以電子形式提交的文本文件的內(nèi)容計(jì)算機(jī) 可閱讀形式拷貝的序列列表(文件名:N0VV 019 01W0SeqList_ST25. txt，2008年7月21日 記錄的數(shù)據(jù)，文件大小106千字節(jié))。
背景技術(shù)：
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)(也稱為人皰疹病毒3(HHV_3))是病毒皰疹病毒科 (Herpesviridae)白勺 α(alphaherpesvirus subfamily)白勺。VZV i—禾中 有包膜病毒，具有約125，000個(gè)核苷酸的線性雙鏈DNA基因組。它的基因組被二十面體核 殼體裝入。位于核殼體和病毒包膜間間隔的間層是由病毒編碼的蛋白質(zhì)和酶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。 病毒包膜是從宿主細(xì)胞膜獲得的，并且含有病毒編碼的糖蛋白。人皰疹病毒中最小的VZV基因組編碼至少70個(gè)可讀框，其中8個(gè)編碼推定的 糖蛋白(gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM)，它們在病毒復(fù)制周期的不同步驟中發(fā)揮功能。 糖蛋白E(gE，也稱為ORF 68)對于病毒復(fù)制是必要的(Mallory等(1997) J. Virol. 71 8279-8288 ；Mo等(2002) Virology 304 176-186)，并且是受感染細(xì)胞以及成熟病毒體中存 在的最豐富的糖蛋白(Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gl glycoproteincomplex,In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg 禾口 Bogner (編)，Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY)。糖蛋白I (gl，也稱為ORF 67)在受感染的細(xì)胞中與gE形成復(fù)合物，這便于兩種糖蛋 白質(zhì)的胞吞，并將它們引導(dǎo)至反式高爾基體(trans-Golgi)，在那里獲得最終的病毒包膜 (Olson 和 Grose (1998) J.Virol. 72 1542-1551)。糖蛋白 B(gB，也稱為 ORF 31)(認(rèn)為其在 病毒進(jìn)入中發(fā)揮作用)結(jié)合中和性抗體，并且是第二普遍的糖蛋白(綜述于Arvin(1996) Clin. Microbiol. Rev. 9 361-381) 0認(rèn)為糖蛋白H(gH)具有便于病毒的細(xì)胞間傳播的 融合功能。針對gE、gB、和gH的抗體在天然感染后和疫苗接種后是普遍的，并且已經(jīng)顯 示了在體外中和病毒感染性(Keller 等(1984) J. Virol. 52 293-297 ；Arvin 等(1986) J. Immunol. 137 1346-1351 ；Vafai 等(1988)J.Virol. 62 :2544_2551 ；Forghani 等(1990) J.Clin. Microbiol. 28 :2500_2506)。用VZV的初次感染引起禽痘(水痘)，其特征在于主要在面部和軀干上發(fā)生的極端 傳染性的皮疹。初始感染后，病毒DNA可以整合入宿主神經(jīng)元細(xì)胞的基因組中，并保持潛伏 達(dá)數(shù)年。病毒可以再活化，并在成人中引起疾病帶狀皰疹(shingles，herpes zoster) 0帶 狀皰疹產(chǎn)生的皮疹不同于初次感染過程中產(chǎn)生的。皮疹與嚴(yán)重的疼痛有關(guān)，并且可以導(dǎo)致 更嚴(yán)重的疾患，諸如皰疹后神經(jīng)痛(post-herpetic neuralgia)。水痘疫苗(Varivax)是公眾可獲得的，并且已經(jīng)在數(shù)個(gè)國家(包括美國)被添加 至推薦的兒童疫苗接種日程表。更濃的水痘疫苗(Zostavax)配制劑已得到食品藥品管理局(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)用于在人群的老年成員中預(yù)防帶狀皰疹。雖然已經(jīng)證明了水痘疫苗是安全的，但是有一些如下的證據(jù)，即由疫苗賦予的對VAV感染的免 疫隨時(shí)間而減弱(Chaves等(2007) N. Engl. J. Med. 356 :1121_1129)。因此，經(jīng)過疫苗接種的 個(gè)體仍會(huì)對帶狀皰疹，即由VZV引起的更為嚴(yán)重的疾患易感。另外，疫苗是由活的減毒病毒 制成的，這產(chǎn)生從疫苗接種形成禽痘或帶狀皰疹的個(gè)體的可能性。實(shí)際上，已經(jīng)有數(shù)例報(bào)告 的似乎由疫苗中使用的毒株所引起的帶狀皰疹病例(Matsubara等(1995). Acta Paediatr Jpn 37 648-50 ；Hammerschlag 等(1989). J Infect Dis. 160 :535_7)。疫苗中存在的活的 減毒病毒還限制了疫苗在無免疫應(yīng)答的個(gè)體中的應(yīng)用。病毒樣顆粒(virus like particle ；VLP)在結(jié)構(gòu)上類似于成熟的病毒體，但是缺 乏病毒基因組而使其不可能發(fā)生病毒復(fù)制。VLP含有類似完整病毒的抗原性蛋白質(zhì)，諸如殼 體和病毒包膜蛋白，并且也可以進(jìn)行構(gòu)建以在其表面上表達(dá)外來結(jié)構(gòu)蛋白。因此，VLP可以 作為免疫原性組合物(例如疫苗)安全施用。此外，因?yàn)閂LP類似天然病毒，而且是多價(jià)顆 粒結(jié)構(gòu)，所以VLP可以比可溶性抗原更有效地誘導(dǎo)中和性抗體。先前已經(jīng)從不同皰疹病毒科成員生成了表達(dá)糖蛋白或間層蛋白的VLP。由有包膜 的間層蛋白構(gòu)成的輕顆粒(L顆粒)已經(jīng)獲自用單純皰疹病毒1型(HSV-I)、馬皰疹病毒 1 型(EHV-I)、或假狂犬病病毒感染的細(xì)胞(McLauchlan 和 Rixon (1992) J. Gen. Virol. 73 269-276 ；美國專利號(hào)5，384，122)?？梢酝ㄟ^在存在病毒DNA復(fù)制抑制劑的情況中用HSV-I 感染細(xì)胞來生成不同類型的VLP，其稱作病毒DNA復(fù)制前包膜顆粒(PREP)。PREP在結(jié)構(gòu)上 類似L顆粒，但是含有不同的蛋白質(zhì)組成(Dargan等(1995) J. Virol. 69 :4924_4932 ；美國 專利號(hào)5，994，116)。已經(jīng)通過使用由酵母Ty反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的蛋白pi進(jìn)行的技術(shù)來 生成表達(dá)來自VZV的gE蛋白的片段的雜合VLP (Garcia-Valcarcel等(1997) Vaccine 15 709-719 ；Welsh 等(1999) J. Med. Virol. 59 :78_83 ；美國專利號(hào) 6，060，064)。本發(fā)明描述了 自VZV衍生的新型抗原和VLP，其不需要酵母Ty蛋白的表達(dá)，也不需要用病毒自身進(jìn)行感 染。這些新的VLP作為抗原性配制劑或疫苗制劑是有用的。發(fā)明概述本發(fā)明包含一種純化的來自水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的病毒樣顆粒(VLP)，其包 含VZV gE蛋白，但是不包含VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP進(jìn) 一步包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的 另外的蛋白質(zhì)來自病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自真菌。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自寄生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外 的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP基本上由VZV gE組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP衍生自包含克隆的gE VZV的重組表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還包括一種純化的VZV-VLP，其包含VZV gE蛋白和另外的VZV蛋白，但是不 含VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gl (0RF 67)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的 VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述另外的VZV蛋白是間層蛋白(tegument protein) 0在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP 進(jìn)一步包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供一種生成VLP的方法，包括將編碼VZV gE蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的 宿主細(xì)胞中，并在容許形成、分離和/或純化VLP的條件下表達(dá)所述VZV gE蛋白，其中所 述宿主細(xì)胞不包含酵母Ty蛋白，并且所述VLP不包含VZV核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 VZV-VLP進(jìn)一步包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自 感染原的另外的蛋白質(zhì)來自病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì) 來自真菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自寄生物。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染 原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP基 本上由VZV gE組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述宿主細(xì)胞是禽類細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是兩棲動(dòng)物細(xì)胞。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞 是昆蟲細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述昆蟲細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。本發(fā)明還包括一種生成VLP的方法，包括將編碼VZV gE蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的 宿主細(xì)胞中，并在容許形成、分離和/或純化VLP的條件下表達(dá)所述VZV gE蛋白，其中所述 宿主細(xì)胞不包含酵母Ty蛋白，并且所述VLP不包含VZV核酸，且其中所述VLP進(jìn)一步包含 另外的VZV蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述另外的VZV蛋白是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白 是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外 的VZV蛋白是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP進(jìn)一步包含來自感染原的另外的 蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包含一種抗原性配制劑，其包含VZV-VLP，其中所述VLP-VLP包含VZV gE且其中所述VLP不包含酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 VZV-VLP進(jìn)一步包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自 感染原的另外的蛋白質(zhì)來自病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì) 來自真菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自寄生物。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感 染原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP 基本上由VZV gE組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性配制劑進(jìn)一步包含佐劑。本發(fā)明還包含一種抗原性配制劑，其包含如下的VZV-VLP，所述VZV-VLP包含VZV gE蛋白和另外的VZV蛋白，但是不含VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另 外的VZV蛋白是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gM(0RF 50)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋 白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述VZV-VLP進(jìn)一步包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括一種疫苗，其包含VZV-VLP，其中所述VZV-VLP包含VZVgE且其中所述VLP不包含酵母Ty蛋白并且不包含VZV核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP進(jìn)一步 包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外 的蛋白質(zhì)來自病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自真菌。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自寄生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的 蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP基本上由VZV gE組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗進(jìn)一步包含佐劑。本發(fā)明還包括一種疫苗，其包含如下的VZV-VLP，其包含VZV gE蛋白和另外的VZV 蛋白，但是不含VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述另外的VZV蛋白是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP進(jìn)一步包含 來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括一種在人或動(dòng)物中引發(fā)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，包括給所述 人或動(dòng)物施用包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VLP-VLP包含VZV gE且其中 所述VLP不包含酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP進(jìn) 一步包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的 另外的蛋白質(zhì)來自病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自真菌。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自寄生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自感染原的另外 的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP基本上由VZV gE組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP衍生自包含克隆的gE VZV的重組表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還包括一種在人或動(dòng)物中引發(fā)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，包括給所述 人或動(dòng)物施用包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VLP-VLP包含VZV gE和另外 的VZV蛋白，但是不含VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白 是gI(0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP 進(jìn)一步包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。附圖簡述

圖1描繪了 VZV表達(dá)構(gòu)建體的SDS PAGE和兩次Western印跡。圖2描繪了對gE VLP S400凝膠過濾的顆粒分析。圖3描繪了㈧含有在AcMNPV桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子(PolH)的轉(zhuǎn)錄控制下的IE62(ICP4)間層基因的pFastBacl質(zhì)粒的圖示。(B)描繪了用考馬斯藍(lán)染色的 SDS-PAGE (左側(cè)小圖)和針對抗IE62單克隆抗體的Western印跡(右側(cè)小圖)。第1道.表 達(dá)重組IE62的總體受感染的Sf9細(xì)胞的樣品，第2道.勻漿化并通過離心除去細(xì)胞碎片后 的細(xì)胞溶胞物，第3道.TMAE離子交換柱的流過物，第4道和第5道.含有IE62的TMAE級(jí) 分，第6道.加載至Fractogel陽離子交換硫酸鹽(SO3)柱上的樣品，第7道.S03-柱流過 物，第8道.純化的IE62洗脫物。圖4描繪了(A)用于構(gòu)建在Sf9細(xì)胞中表達(dá)VZV gE和gl的串聯(lián)重組桿狀病毒的 PFastBacl轉(zhuǎn)移載體。gE和gl基因在桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子(PolH)的轉(zhuǎn)錄控制下。 gl具有其天然的、可切割的信號(hào)肽，而gE用來自桿狀病毒包膜糖蛋白GP64的信號(hào)序列替 換。(B)描繪了用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠(左側(cè)小圖)和針對抗gE的Western印跡(中間小圖)、或針對抗完整病毒VZV的Western印跡(右側(cè)小圖)。第1道.S200凝膠 過濾柱的加載物和第2道.出S200柱的最終的純化的gE/gl異二聚物?？筭E識(shí)別分泌的 gE，其中主要的蛋白質(zhì)是預(yù)測質(zhì)量為約60KDa的gE(中間小圖)，并且多克隆抗體與30KDa gl起反應(yīng)(右側(cè)小圖)。圖5描繪了(A)含有C末端截短的VZV gE基因的pcDNA3. 1質(zhì)粒(Invitrogen)。(B)描繪了用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE (左側(cè)小圖)和針對抗gE單克隆抗體的Western印 跡(右側(cè)小圖)。在第1道中的是蛋白質(zhì)大小標(biāo)志物，第2道是加載的來自用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn) 染后4天的HEK293細(xì)胞的2 μ 1組織培養(yǎng)物上清液，而凝膠的第3道是出凝集素親和柱的 4 μ 1純化的gE。發(fā)明詳述本發(fā)明的VLP和制備VLP的方法如本文中所使用的，術(shù)語“病毒樣顆?！?VLP)指在至少一種屬性上類似病毒但是 已經(jīng)證明其沒有感染性的結(jié)構(gòu)。依照本發(fā)明的病毒樣顆粒不攜帶編碼所述病毒樣顆粒的蛋 白質(zhì)的遺傳信息。一般而言，病毒樣顆粒缺乏病毒基因組，并且不能復(fù)制。另外，病毒樣顆 粒通?？梢酝ㄟ^異源表達(dá)來大量生產(chǎn)，而且可以容易地純化。該術(shù)語還指通過下文所描述 的方法生成的任何亞病毒顆粒。此術(shù)語包括可以通過下文所描述的或本領(lǐng)域中已知的任何 方法純化的蛋白質(zhì)聚集物。如本文中所使用的，術(shù)語“抗原性配制劑”或“抗原性組合物”指在給脊椎動(dòng)物(例 如哺乳動(dòng)物)施用時(shí)會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的制備物。如本文中所使用的，術(shù)語“純化的VLP ”指本發(fā)明的VLP制備物，其至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大地不含混合物 中其它分子(不包括溶劑在內(nèi))。例如，本發(fā)明的VLP可以基本上沒有與制備本發(fā)明的VLP 有關(guān)的其它病毒、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、和碳水化合物。該術(shù)語還涵蓋已經(jīng)從具有污染的VZV基因 組DNA或其部分的VLP分離的VLP。如本文中所使用的，術(shù)語“嵌合VLP”指含有來自至少兩種不同感染原的蛋白質(zhì) (異源蛋白質(zhì))或其部分的VLP。通常，所述蛋白質(zhì)之一衍生自可以驅(qū)動(dòng)VLP自宿主細(xì)胞形 成的病毒(例如VZV gE)，而另一種蛋白質(zhì)來自異源感染原。術(shù)語“感染原”指在脊椎動(dòng)物中引起感染的微生物。感染原可以是病毒、真菌、細(xì) 菌和/或寄生物。可以在VZV VLP的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)可以源自病毒、真菌、細(xì)菌和/或 寄生物。源自病毒、真菌、細(xì)菌和/或寄生物的蛋白質(zhì)可以在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(細(xì) 胞的和/或體液的)，其會(huì)在所述脊椎動(dòng)物中預(yù)防、治療、控制(manage)和/或改善傳染病。如本文中所使用的，術(shù)語“疫苗”指含有本發(fā)明VLP的配制劑，其處于能夠向脊椎 動(dòng)物施用的形式，而且其誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答足以誘導(dǎo)免疫以預(yù)防和/或改善感染和/ 或減輕至少一種感染癥狀和/或增強(qiáng)另一劑VLP的功效。如本文中所使用的，術(shù)語“有效量”指實(shí)現(xiàn)想要的生物學(xué)效應(yīng)所必需的或足以實(shí)現(xiàn) 想要的生物學(xué)效應(yīng)的VLP的量。組合物的有效量將是達(dá)到選定結(jié)果的量，并且該量可以由 本領(lǐng)域技術(shù)人員作為常規(guī)事項(xiàng)確定。例如，用于預(yù)防、治療和/或改善感染的有效量可以是 引起免疫系統(tǒng)活化所必需的量，其導(dǎo)致在暴露于本發(fā)明VLP時(shí)形成抗原特異性免疫應(yīng)答。 該術(shù)語也是“足夠量”的同義詞。
如本文中所使用的，術(shù)語“保護(hù)性免疫”或“保護(hù)性免疫應(yīng)答”指由脊椎動(dòng)物(例 如人)展現(xiàn)出的針對感染原的免疫或引發(fā)針對感染原的免疫應(yīng)答，其阻止或改善感染或減 少至少一種其癥狀。如本文中所使用的，術(shù)語“脊椎動(dòng)物”或“受試者”或“患者”指脊椎動(dòng)物亞門 (subphylum cordata)的任何成員，包括但不限于人和其它靈長類，包括非人靈長類，諸如 黑獲獲(cgunoabzee)禾口其它猿類(apes)禾口猴物禾中(monkey species)。家畜(farm animal) (諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬)；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(domestic mammal)(諸如狗和貓)；實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物(包括嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠)；鳥類(包括家禽、野鳥和獵禽， 諸如雞、火雞及其它鶉雞類鳥類、鴨、鵝)等也是非限制性例子。該定義中包括術(shù)語“哺乳動(dòng) 物”和“動(dòng)物”。意圖涵蓋成體和新生個(gè)體兩者。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在細(xì)胞中表達(dá)VZV gE蛋白誘導(dǎo)VLP形成。如此，本發(fā)明包含通 過表達(dá)VZV gE形成的VZV VLP。發(fā)明人還已經(jīng)開發(fā)了來自表達(dá)gE和至少一種另外的VZV 蛋白的宿主細(xì)胞的新型VLP。另外，這些VLP還可以表達(dá)來自其它感染原的抗原性蛋白質(zhì)。 本發(fā)明還涵蓋制備和施用由本發(fā)明的VZV VLP構(gòu)成的“抗原性配制劑”的方法。本發(fā)明還 涵蓋制備和施用由本發(fā)明的VZV VLP構(gòu)成的疫苗的方法。此新型疫苗配制劑克服了使用目 前可用的由活的減毒病毒制成的疫苗遇到的一些問題和憂慮。本發(fā)明包含包含VZV gE的VZV VLP，其中所述VZV VLP不包含VZV核酸或酵母Ty 蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP基本上由gE蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述VZV VLP不包含VZV殼體蛋白(例如ORF 20、0RF40、0RF 41)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的VLP包含至少一種摻入VLP中的另外的VZV蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外 的VZV蛋白包含gl (0RF 67)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gM(0RF 50)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另 外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含至少一種間層蛋白。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gl、gM、gH、gB或間層蛋白的組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包含嵌合VZV VLP，其包含VZV gE蛋白和至少一種來自 另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白 質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另 一種感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染 原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。 另一種類型的本發(fā)明嵌合VLP還包含如下的VLP，其包含VZV gE蛋白、至少一種來 自VZV的其它蛋白質(zhì)、和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來 自VZV的其它蛋白質(zhì)是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是 gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是間層蛋白。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感 染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是來 自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)?？梢匝苌龈腥驹鞍踪|(zhì)的病毒的非限制性例子如下流感(甲型和乙型，例如HA和/或NA)、冠狀病毒(例如SARS)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊3型肝炎病毒、 人免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹病毒1、2、6和7，巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹、乳頭瘤病毒、 埃巴病毒(Epstein Barr virus)、腺病毒、布尼亞病毒(bunya virus)(例如漢坦病毒 (hanta virus))、柯薩奇病毒(coxsakievirus)、小 RNA 病毒(pi coma virus)、輪狀病毒、 鼻病毒、風(fēng)疹病毒(rubella virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒(measles virus)、風(fēng)疹病毒 (Rubella virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(多種類型)、腺病毒(多種類型)、副流感病毒(多 種類型)、禽流感(各種類型)、運(yùn)輸熱病毒(shipping fever virus)、西方和東方馬腦 W"·炎(Western andEastern equine encephalomyelitis) > H ^lSf WM iit (Japanese enc印halomyelitis)、禽痘、狂犬病病毒、腦慢病毒(slow brain virus)、勞斯肉瘤病毒 (rous sarcomavirus)、乳多空病毒禾斗(Papovaviridae)、細(xì)小病毒禾斗(Parvoviridae)、 小 RNA 病毒科(Picomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(諸如天花(Smallpox)或 牛痘(Vaccinia))、呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如輪狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科 (Retroviridae) (HTLV-I、HTLV-II、慢病毒屬(Lentivirus))、披膜病毒科(Togaviridae) (例如風(fēng)疹病毒屬(Rubivirus))、新城疫病毒、西尼羅河熱病毒(West Nile fever virus)、 蜱媒腦炎(Tick borne enc印halitis)、黃熱病、屈曲病毒(chikungunya virus)、呼吸道合 胞病毒、和登革病毒(所有血清型)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來自病毒的特定蛋白質(zhì)可以包含來自流感病毒(包括禽 流感病毒)的HA和/或NA、來自冠狀病毒的S蛋白、來自HIV的gpl60、gpl40和/或gp41， 來自呼吸道合胞病毒的F或G蛋白、來自黃熱病毒、登革病毒(所有血清型)或任何黃病毒 (flavivirus)的E和preM/M。還包括的是能在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(細(xì)胞的和/或 體液的)的來自病毒的任何蛋白質(zhì)，其可以預(yù)防、治療、控制和/或改善所述脊椎動(dòng)物中的 傳染病?？梢詮闹醒苌龈腥驹鞍踪|(zhì)的細(xì)菌的非限制性例子可以從下列各項(xiàng)衍生百 日咳桿菌(B. pertussis)、波摩那鉤端螺旋體(Leptospira Pomona)、甲型和乙型副傷寒沙 門氏菌(S. paratyphi A and B)、白喉棒桿菌(C. diphtheriae)、破傷風(fēng)梭菌(C. tetani)、 肉毒梭菌(C.botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. perfringens)、費(fèi)氏梭菌(C. feseri)及其它 氣性壞疽細(xì)菌，炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)、鼠疫巴斯德氏菌(P. pestis)、多殺巴斯德 氏菌(P. multocida)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏球菌 (N. gonorrheae)、流感嗜血菌(Hemophilus influenzae)、方文線菌屬(Actinomyces)(例 如諾卡氏菌屬(Norcardia))、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽胞桿菌科(Bacillaceae) (例如炭疽桿菌(Bacillus anthracis))、擬桿菌屬(Bacteroides)(例如脆弱擬桿菌 (Bacteroides fragilis))、芽生菌病(Blastomycosis)、博德特氏菌屬(Bordetella)、 疏螺旋體屬(Borrelia)(例如布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi))、布魯氏菌 屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chlamydia)、球孢子菌屬 (Coccidioides)、棒桿菌屬(Corynebacterium)(例如白喉棒桿菌(Corynebacterium diptheriae))、大腸桿菌(E. coli)(例如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌)、 腸桿菌屬(Enterobacter)(例如產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes))、腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例 如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis))、沙 雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella))、丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)(例如乙型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza type B))、螺桿菌屬(Helicobacter)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)(例如侵肺軍 團(tuán)菌(Legionellapneumophila))、鉤端螺方寵體屬(L印tospira)、禾丨J其jf特菌屬(Listeria) (例如單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes))、支原體屬(Mycoplasma)、分枝 桿菌屬(Mycobacterium)(例如麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)和結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis))、弧菌屬(Vibrio)(例如霍舌L弧菌(Vibriocholerae))、 巴斯德氏菌屬(Pasteurellacea)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例 如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、立克次氏體科(Rickettsiaceae)、螺體屬 (Spirochetes)(例如密螺旋體(Treponema spp.)、鉤端螺旋體(Leptospira spp.)、疏螺旋 體(Borrelia spp.))、志賀氏菌(Shigella spp.)、腦膜炎球菌屬(Meningiococcus)、肺炎 球菌屬(Pneumococcus)禾口鏈球菌屬(Streptococcus)(例如月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和A組、B組、和C組鏈球菌)、尿枝原體屬(Ureaplasmas)、蒼白密螺旋 體(Tr印onemapollidum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血巴斯德氏 菌(Pasteurellahaemolytica)、白喉棒桿菌類毒素(Corynebacterium diptheriae toxoid)、腦膜炎球菌多糖(Meningococcal polysaccharide)、百日咳博德特氏菌 (Bordetellapertusis)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、破傷風(fēng)梭菌類毒素 (Clostridium tetani toxoid)、禾口牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。可以從中衍生所述感染原蛋白質(zhì)的寄生物的非限制性例子如下利什曼病 (leishmaniasis)(墨西哥熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica mexicana)、熱帶利 什曼原蟲(Leishmania tropica)、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、±矣塞俄比亞 禾1JffMJI^ii (Leishmania aethiopica) > EiM^'Jff MHi ife (Leishmaniabraziliensis) > 杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)、 恰氏利什曼原蟲(Leishmania chagasi))、錐蟲病(trypanosomiasis)(岡比亞布氏 HI 蟲(Trypanosoma brucei gambiense)、羅■西亞 ^f1[？氏 Ifl 蟲(Trypanosoma brucei rhodesiense))、弓形體病(toxoplasmosis)(剛地弓形體(Toxoplasma gondii))、 血吸蟲病(schistosomiasis) ( ±矣及血吸蟲(Schistosomahaematobium)、日本血吸 蟲(Schistosoma japonicum)、曼森氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、湄公血吸蟲 (Schistosoma mekongi)、間插血吸蟲(Schistosoma intercalatum))、皰疾(間日皰原蟲 (Plasmodium virax)、惡性皰原蟲(Plasmodium falciparium)、三曰皰原蟲(Plasmodium malariae)和卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale))、阿米巴病(溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica))、巴貝西蟲病(Babesiosis)(田鼠巴貝西蟲(Babesiosis microti))、 Kt ？fe ^ ^ ^！ (Cryptosporidiosis) ( W Kt ？fe ^ ^ (Cryptosporidium parvum)
阿米巴病(Dientamoebiasis)(脆弱雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis))、賈第蟲病 (Giardiasis)(蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblis))、蠕蟲病(Helminthiasis)和毛滴蟲 屬(Trichomonas)(陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis))。可以衍生所述感染原蛋白質(zhì)的真菌的非限制性例子來自下組犁頭霉屬(Absidia)(例如傘狀犁頭霉(Absidia corymbifera))、阿耶羅菌屬 (Ajellomyces)(例如莢膜阿耶羅菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎組織胞 漿菌(Ajellomycesdermatitidis))、節(jié)皮菌屬(Arthroderma)(例如苯黑末節(jié) 皮菌(Arthrodermabenhamiae)、粉節(jié)皮菌(Arthroderma fulvum)、石膏樣節(jié)皮 菌(Arthrodermagypseum)、內(nèi)彎節(jié)皮菌(Arthroderma incurvatum)、太田節(jié)皮 菌(Arthrodermaotae)、萬博節(jié)皮菌(Arthroderma vanbreuseghemii))、曲霉 屬(Aspergillus)(例如煙曲霄(Aspergillus fumigatus)、黑曲霄(Aspergillus niger))、念珠菌屬(Candida)(例如白念珠菌(Candida albicans)、白念珠菌星狀變 /[本(Candida albicans var. stellatoidea)、者P # i _ 胃(Candida dublinensis)、 光滑念珠菌(Candidaglabrata)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)(季也 蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii))、克魯斯念珠菌(Candida krusei)(東方伊 薩酵母(Issatschenkiaorientalis))、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、 菌膜滑念珠菌(Candidapelliculosa)(異常畢赤酵母(Pichia anomala))、熱帶 念珠菌(Candidatropicalis))、球孢子菌屬(Coccidioides)(例如粗球孢子菌 (Coccidioidesimmitis))、隱球菌屬(Cryptococcus)(例如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)(新型線黑粉菌(Filobasidiella neoformans))、組織胞漿菌屬 (Histoplasma)(例如夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)(莢膜阿耶羅菌)、小孢 子菌屬(Microsporum)(例如犬小孢子菌(Microsporum canis)(太田節(jié)皮菌)、黃褐色小孢 子菌(Microsporum fulvum)(粉節(jié)皮菌)、石膏樣小孢子菌(Microsporumgypseum)、畢赤酵 母屬(Genus Pichia)(例如異常畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母)、肺囊蟲(Pneumocystis)(例 如耶氏肺孢子蟲(Pneumocystis jirovecii))、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、糠秕馬拉 色菌(Malassezia furfur)、副球孢子菌(Paracoccidiodes)。上文的目錄意圖是例示性的， 并且決不意圖將發(fā)明限制于那些具體的細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物生物體。本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明VLP之上或之中所表達(dá)的所述糖蛋白(或蛋白質(zhì))的變體 (包括所述嵌合物)。所述變體可以含有在組分蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的變化。術(shù)語“變 體”就多肽而言指相對于參照序列改變了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。變體可以具有 “保守的”變化，其中用于替代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如用異亮氨酸替換 亮氨酸。或者，變體可以具有“非保守的”變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的次要變 化還可以包括氨基酸缺失和/或插入。使用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序，例如DNASTAR軟件， 可以找到確定哪些氨基酸殘基可供取代、插入或缺失而不消除生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的 指導(dǎo)。描述可應(yīng)用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)(諸如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等)的通 用教禾斗書包括 Berger 禾口 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods 于 Enzymology 卷 152Academic Press，Inc.，San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook 等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第 3 片反)，卷 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N. Y.，2000( ‘‘Sambrook，，)禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，Current Protocols，ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc. and John Wiley & Sons，Inc.，( ‘‘Ausubel，，)。 這些教科書描述了誘變、載體的應(yīng)用、啟動(dòng)子和許多其它相關(guān)的主題，所述主題涉及例如VZV的gE、gl、gM、gH、gB或間層蛋白的克隆和突變等。如此，本發(fā)明還涵蓋使用已知的 蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法來改進(jìn)或改變在本發(fā)明VLP之上或之中表達(dá)的蛋白 質(zhì)的特性?？梢允褂枚喾N類型的誘變來產(chǎn)生和/或分離編碼蛋白質(zhì)分子的變體核酸和 /或進(jìn)一步修飾/突變本發(fā)明VLP之中或之上的蛋白質(zhì)。它們包括但不限于定點(diǎn)誘變、 隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組(DNA改組)、使用含尿嘧啶模板進(jìn)行的誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變 (oligonucleotide-directed mutagenesis)、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈體 DNA的誘變等。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)(pointmismatch repair)、使用修復(fù)缺陷的 宿主株的誘變，限制選擇和限制純化、缺失誘變、通過全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等?？寺”景l(fā)明VZV蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以從感染了 VZV病毒的細(xì) 胞提取多聚腺苷酸化mRNA，通過RT-PCR從中分離出編碼特定VZV蛋白的基因。所得的產(chǎn)物 基因可以作為DNA插入物克隆入載體中。術(shù)語“載體”指可用于擴(kuò)增(propagate)核酸和 /或在生物體、細(xì)胞、或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移核酸的手段。載體包括自主復(fù)制或可整合入宿主 細(xì)胞的染色體中的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等。載體還可以 是非自主復(fù)制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一條鏈內(nèi)由DNA和RNA兩者組成 的多核苷酸、聚賴氨酸綴合的DNA或RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質(zhì)體綴合的DNA等。在許 多但不是所有的常見實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。如此，本發(fā)明包括克隆入表達(dá)載體的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸，所述載體可在細(xì)胞中 表達(dá)，誘導(dǎo)本發(fā)明嵌合VLP的形成?！氨磉_(dá)載體”是能夠促進(jìn)摻入其中的核酸的表達(dá)以及復(fù) 制的載體，諸如質(zhì)粒。通常，要表達(dá)的核酸與啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子“可操作連接”，并受該啟 動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸編碼VZV gE(0RF 68) 蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含如下的核苷酸，其編碼VZV gE和至少一種另外 的來自感染源的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含如下的核苷酸，其編碼VZV gE 蛋白和gI(0RF 67)、gM(0RF 50)、gH、gB和/或間層VZV蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 表達(dá)載體是桿狀病毒載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以包含含有如下變化的突變，所述變化產(chǎn) 生沉默的取代、添加或缺失，但是不改變所編碼蛋白質(zhì)的特性或活性或者生成所述蛋白質(zhì) 的方式?？梢猿鲇诙喾N原因而產(chǎn)生核苷酸變體，例如為了針對特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá) (將人mRNA中的密碼子改變?yōu)槔ハx細(xì)胞諸如Sf9細(xì)胞優(yōu)選的那些密碼子)。另外，可對核苷酸測序以確保正確的編碼區(qū)得到克隆，且不含有任何不想要的突 變?？梢詫⑺龊塑账醽喛寺∪氡磉_(dá)載體(例如桿狀病毒)中用于在任意細(xì)胞中表達(dá)。上 文僅僅是如何能夠克隆VZV病毒蛋白的一個(gè)例子。本發(fā)明技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，其它方 法也是可用和可能的。本發(fā)明還提供了如下的構(gòu)建體和/或載體，其包含編碼VZV蛋白(包括gE、gI、gM、 gH、gB、間層蛋白、或其部分)的VZV核苷酸。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒、或逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體。包含VZV基因(包括§6^1、811、811、88、間層蛋白、或其部分)的構(gòu)建體和 /或載體應(yīng)當(dāng)與合適的啟動(dòng)子可操作連接，諸如AcMNPV多角體蛋白啟動(dòng)子(或其它桿狀病 毒)、X噬菌體PL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、phoA和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子、和 逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子是非限制性例子。根據(jù)想要的宿主細(xì)胞和/或表達(dá)率，本領(lǐng)域技 術(shù)人員會(huì)知道其它合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體將進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)、以及被轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所述構(gòu)建體所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選在要 翻譯的多肽的起始處包含翻譯起始密碼子，而在該多肽末尾處的合適位置上含有終止密碼 子。表達(dá)載體將優(yōu)選包含至少一種選擇標(biāo)志物。此類標(biāo)志物包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的 二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉 素或氨芐青霉素抗性基因。優(yōu)選的載體包括病毒載體，諸如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病 毒、禽痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、浣熊痘病毒、豬 痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？膳c本發(fā)明一起使用的其它 載體包括用于細(xì)菌的載體，包括pQE70、pQE60和pQE_9，pBluescript載體、Phagescript載 體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的 真核載體是 pFastBacl pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、和 pSVL。 其它合適的載體會(huì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。接下來，上文所提及的重組構(gòu)建體可以用來轉(zhuǎn)染、感染、或轉(zhuǎn)化入真核細(xì)胞和/或 原核細(xì)胞中，并且可以表達(dá)VZV蛋白，包括gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白或其部分。如此，本 發(fā)明提供了包含載體(或多個(gè)載體)的宿主細(xì)胞，所述載體含有的核酸編碼VZV蛋白，包括 gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白或其部分，并且允許在容許形成VLP的條件下在所述宿主細(xì)胞 中表達(dá)VZV基因，包括gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白或其部分。真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物、禽類、植物、秀麗隱桿線蟲(C. elegans) (或線蟲)和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的非限制性例子有草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf)細(xì)胞、例如 Sf9、Sf21，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細(xì)胞，例如 High Five細(xì)胞，和果蠅(DrOSOphila)S2細(xì)胞。真菌(包括酵母)宿主細(xì)胞的例子有釀酒 酵母(S. cerevisiae)、乳克魯維酵母(Kluyveromyceslactis ；K. lactis)、假絲酵母屬 (Candida)菌種包括白色假絲酵母(C. albicans)和光滑假絲酵母(C. glabrata)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe ；S. pombe)、巴其jf德 畢赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 例子有COS細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞、人胚 腎(HEK)細(xì)胞和非洲綠猴細(xì)胞、CV1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero和H印-2細(xì)胞。非洲 爪蟾(Xenopus laevis)卵母細(xì)胞，或兩棲動(dòng)物來源的其它細(xì)胞也可以使用。原核宿主細(xì)胞 包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和分枝桿菌?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域公知的方法將載體，例如包含VZV gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白或 其部分的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。例如，可以通過磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微 注射、脂轉(zhuǎn)染、和采用多胺轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染來將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述載體是重組桿狀病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組桿狀病毒被轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞中。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述昆蟲細(xì)胞是 Sf9細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含如下的核苷酸，所述核苷酸 編碼VZV蛋白gE、或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞基本上由編碼 VZV蛋白gE、或其部分的核苷酸組成。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含 如下的核苷酸，其編碼嵌合VZV蛋白gE、gI、gM、gH、gB、間層蛋白或其部分。上文所描述的載體和/或宿主細(xì)胞含有VZV gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白、或其部分，和任選地任何來自感 染源的另外的蛋白質(zhì)，并且可以含有另外的細(xì)胞組分，諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、 碳水化合物等，但是不含Ty轉(zhuǎn)座子或任何由Ty轉(zhuǎn)座子編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了生成VLP的方法，所述方法包括在容許VLP形成的條件下表達(dá)VZV 基因(包括gE、gI、gM、gH、gB、間層蛋白或其部分)和任選地來自感染原的任何另外的蛋白 質(zhì)。根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞，在表達(dá)重組蛋白和形成VLP的條件下通過培養(yǎng)用表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來生成VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含生成VLP的方法，包括 將編碼VZV gE蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述 VZV gE蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞選自由酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì) 胞、禽類細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞組成的組。合適的培養(yǎng)條件的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的 技術(shù)之內(nèi)。培養(yǎng)經(jīng)過工程化改造而生成本發(fā)明VLP的細(xì)胞的方法包括但不限于分批、分批補(bǔ) 料、連續(xù)和灌注(perfusion)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)意思是在生物反應(yīng)器(發(fā)酵室)中 使細(xì)胞生長和增殖，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖并表達(dá)蛋白(例如重組蛋白)以供純化和分 離用。典型地，細(xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中無菌、受控的溫度和大氣條件下進(jìn)行。生物反應(yīng)器 是用于培養(yǎng)細(xì)胞的腔室(chamber)，其中可以監(jiān)控環(huán)境條件諸如溫度、大氣、攪拌和/或pH。然后使用保持VLP完整性的方法來分離VLP，諸如通過梯度離心，例如氯化銫、蔗 糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度離心，以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括例如離子交換和凝膠過濾 層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含本發(fā)明的純化的VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的 所述 VLP 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或更多地沒有混合物中存在的其它分子(不包括溶劑在內(nèi))。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的所述VLP基本上沒有與制備本發(fā)明的VLP有關(guān)的其它病毒、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、和碳水 化合物。以下是可以如何制備、分離和純化本發(fā)明的VLP的一個(gè)例子。通常，VLP是由重組 細(xì)胞系生成的，所述細(xì)胞系經(jīng)過工程化改造從而當(dāng)所述細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)(見上文)中生長 時(shí)產(chǎn)生VLP。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以使用其它的方法來制備和純化本發(fā)明的 VLP，如此本發(fā)明不限于所述的方法。本發(fā)明VLP的生產(chǎn)可首先將Sf9細(xì)胞(未感染的)接種到搖瓶中，使細(xì)胞隨著細(xì)胞 生長繁殖而膨脹和規(guī)模放大(例如從125ml燒瓶到50L Wave袋)。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基 是為合適的細(xì)胞系配制的(優(yōu)選無血清培養(yǎng)基，例如昆蟲培養(yǎng)基ExCell-420，JRH)。接著， 用重組桿狀病毒以效率最高的感染復(fù)數(shù)(例如每個(gè)細(xì)胞約1個(gè)到約3個(gè)噬斑形成單位)感 染所述細(xì)胞。一旦發(fā)生感染，VZV gE和/或其它蛋白質(zhì)自裝配成VLP，并在感染后大約24 到72小時(shí)從細(xì)胞分泌。通常，在細(xì)胞處于生長的對數(shù)中期(mid-log phase) (4-8xl06個(gè)細(xì) 胞/ml)且至少約90%存活時(shí)，感染效率最高。可以在感染后大約48到96小時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中VLP水平接近最大值但在廣泛 的細(xì)胞溶解之前收獲本發(fā)明的VLP。收獲時(shí)的Sf9細(xì)胞密度和生存力可以為約0. 5xl06個(gè) 細(xì)胞/ml至約1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/ml，生存力至少為20%，如染料排除測定法所示。接著，取出 培養(yǎng)基并將其澄清?？梢韵蚺囵B(yǎng)基添加NaCl至濃度為約0. 4至約1. 0M，優(yōu)選至約0. 5M，以 避免VLP聚集?？衫靡淮涡允褂玫念A(yù)滅菌中空纖維0. 5或1. 00 y m筒式濾器或類似的裝 置，通過切向流過濾(TFF)來實(shí)現(xiàn)從含有本發(fā)明VLP的細(xì)胞培養(yǎng)基中除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
接著，可以使用一次性的、預(yù)滅菌的500，000分子量截留中空纖維筒通過超濾來 濃縮經(jīng)過澄清的培養(yǎng)基中的VLP。可以將經(jīng)過濃縮的VLP對10倍體積的含0. 5M NaCl的 pH 7. 0至8. 0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行滲濾(diafiltrate)來除去殘余的培養(yǎng)基成 分。可以將經(jīng)過濃縮、滲濾的VLP在含0. 5M NaCl的pH7. 2PBS緩沖液中20% -60%不連續(xù) 蔗糖梯度上，于約4°C至約10°C以6，500xg離心18小時(shí)來進(jìn)一步純化。通常，VLP將在約 30%至約40%蔗糖之間或者在界面上(在20%和60%的分步梯度中)形成顯著可見的條 帶，可從該梯度中收集該條帶并保存?？上♂屧摦a(chǎn)物使其包含200mM NaCl,以準(zhǔn)備純化過程 的下一步。該產(chǎn)物含有VLP，并可能含有完整的桿狀病毒顆粒?？梢酝ㄟ^陰離子交換層析或者44%等密度蔗糖墊層(cushion)離心來實(shí)現(xiàn)VLP 的進(jìn)一步純化。在陰離子交換層析中，將來自蔗糖梯度(見上文)的樣品上樣入含有帶陰 離子的介質(zhì)(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并經(jīng)由鹽梯度(從約0. 2M至約 1.0M NaCl)洗脫，該梯度可以將VLP與其它雜質(zhì)(例如桿狀病毒和DNA/RNA)分開。在蔗糖 墊層方法中，將包含VLP的樣品添加到44%蔗糖墊層，并在30，000g離心約18小時(shí)。VLP在 44%蔗糖的頂部形成條帶，而桿狀病毒沉淀于底部，其它污染蛋白停留在頂部的0%蔗糖層 中。收集VLP峰或VLP帶。若想要的話，可以將完整的桿狀病毒滅活?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法，例如甲醛或丙 內(nèi)酯(BPL)滅活。還可以使用本領(lǐng)域已知的選擇性沉淀和層析方法，如上文例示的，來大部 分實(shí)現(xiàn)完整桿狀病毒的除去和/或滅活。滅活方法包括將含有VLP的樣品在0. 2% BPL中 于約25°C至約27°C溫育3小時(shí)。還可以通過將含有VLP的樣品在0. 05% BPL于4°C溫育 3天，然后在37°C溫育1小時(shí)，來滅活桿狀病毒。滅活/除去步驟后，可使含有VLP的產(chǎn)物運(yùn)行經(jīng)過另一滲濾步驟以除去任何來自 滅活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖，并將VLP置入期望的緩沖液(例如PBS)中。包含 VLP的溶液可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如無菌過濾)滅菌，并保存在冰箱或冷凍箱中。上文的技術(shù)可以在多種規(guī)模上實(shí)施。例如，T形瓶(T-flasks)、搖瓶、轉(zhuǎn)瓶 (spinner bottle)、乃至工業(yè)尺寸的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可包括不銹鋼罐或預(yù)滅菌的 塑料袋(例如，Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道用 于其目的的最佳選擇。 藥物或疫苗配制劑和施用 本文中有用的藥物組合物含有本發(fā)明的VLP和藥學(xué)可接受載體(包括任何合適的 稀釋劑或賦形劑)，所述藥學(xué)可接受載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的脊椎動(dòng)物 有害的免疫應(yīng)答、并且可以不帶有異常毒性地(without undue toxicity)施用的任何藥 劑。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”指獲得聯(lián)邦或州政府監(jiān)管部門批準(zhǔn)，或者在美 國藥典、歐洲藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出的用于哺乳動(dòng)物，更具體地用于人類中。這些組 合物可以用作疫苗和/或抗原性配制劑，用于在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明 涵蓋抗原性配制劑，其包含如下的VLP，所述VLP包含VZV gE蛋白，但不包括VZV核酸或酵 母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性配置及包含基本上由gE蛋白組成的VLP。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性配制劑包含如下的VLP，其包含至少一種另外的摻入VLP中的 VZV蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gI(0RF 67)蛋白。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gM(0RF 50)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述另外的VZV蛋白包含間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gI、gM、 gH、gB或間層蛋白的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV VLP不包含VZV殼體蛋白(例 如 ORF 20、ORF 40、ORF 41)。本發(fā)明還包括抗原性配制劑，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含VZV gE蛋 白和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的 蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白 質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。本發(fā)明還提供抗原性配制劑，其包含純化的嵌合VLP，所述純化的嵌合VLP包含 VZV gE蛋白、至少一種來自VZV的其它蛋白質(zhì)、和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來 自VZV的其它蛋白質(zhì)是gM(0RF50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它 蛋白質(zhì)是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種 感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的 蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。通常，疫苗包含本發(fā)明組合物懸浮或溶解于其中的常規(guī)鹽水或緩沖的水溶液介 質(zhì)。處于這種形式，便可以方便地使用本發(fā)明的組合物以預(yù)防、改善或以其它方式治療感 染。導(dǎo)入宿主中后，疫苗能夠刺激免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體和/或細(xì)胞因子的生成和/ 或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹突細(xì)胞的活化和/或其它細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明還包括疫苗配制劑，其包含如下的VLP，所述VLP包含VZV gE蛋白，但不包 括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗配制劑包含基本上由gE蛋白組 成的VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗配制劑包含如下的VLP，其包含至少一種另外的 摻入VLP中的VZV蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gl (0RF 67)蛋 白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gM(0RF 50)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV 蛋白包含gI、gM、gH、gB或間層蛋白的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合VZV VLP不包 含 VZV 殼體蛋白(例如 ORF 20、0RF40、0RF 41)。本發(fā)明還包括疫苗配制劑，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含VZVgE蛋白 和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋 白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來 自另一種感染原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。
本發(fā)明還提供疫苗配制劑，其包含嵌合VLP，所述嵌合VLP包含VZV gE蛋白、至少 一種來自VZV的其它蛋白質(zhì)、和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋 白質(zhì)是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gH。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是間層蛋 白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另 一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白 質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)在VLP 的表面上表達(dá)。本發(fā)明的所述抗原性和疫苗配制劑包含如上文所描述的本發(fā)明的VLP和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。藥學(xué)可接受載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖(dextrose)、 水、甘油、無菌等滲緩沖水溶液，和它們的組合。對藥學(xué)可接受載體、稀釋劑和其它賦形劑 的全面討論呈現(xiàn)于 Remington’ sPharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N. J. current edition)中。配制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，配制劑適于給人施用， 優(yōu)選是無菌、非顆粒性(non-particulate)和/或非熱原性的。若想要的話，藥學(xué)組合物還可以含有小量的潤濕劑或乳化劑，或PH緩沖劑。組合 物可以是固體形式，諸如適于重構(gòu)的凍干粉末；液體溶液；懸液；乳液；片劑；丸劑；膠囊； 持續(xù)釋放配制劑；或粉劑?？诜渲苿┛砂?biāo)準(zhǔn)的載體，諸如藥品級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀 粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。本發(fā)明提供了 VLP配制劑包裝在標(biāo)示組合物量的密封容器諸如安瓿或小藥囊 (sachette)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP組合物作為液體提供，在另一個(gè)實(shí)施方案中， 作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末或無水濃縮物提供，并且可以用例如水或鹽水重構(gòu)為 用于向受試者施用的合適濃度。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，在標(biāo)示VLP組合物的量和濃度的密封容器中以液體形 式提供VLP組合物。優(yōu)選地，在密封容器中以至少約50 μ g/ml、更優(yōu)選至少約100 μ g/ml、 至少約200 μ g/ml、至少500 μ g/ml、或至少lmg/ml提供液體形式的VLP組合物。一般而言，本發(fā)明的VZV VLP以足以刺激針對一種或多種VZV毒株的免疫應(yīng)答的 有效量或數(shù)量施用。優(yōu)選地，施用本發(fā)明的VLP引發(fā)針對VZV的免疫。典型地，可以根據(jù) 例如年齡、身體健康狀況(physical condition)、體重、性別、飲食、施用時(shí)間和其它臨床因 素，在該范圍內(nèi)調(diào)節(jié)該劑量。預(yù)防性疫苗配制劑是全身施用的，例如通過使用針頭和注射 器或無針頭注射裝置進(jìn)行皮下或肌內(nèi)注射來施用。或者，疫苗配制劑是鼻內(nèi)施用的，通過滴 齊U、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)、或噴霧入上呼吸道中。雖然上文的任何遞送途徑均導(dǎo) 致免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)施用還帶來額外的益處，即在許多病毒(包括VZV)進(jìn)入的部位引發(fā)粘 膜免疫。如此，本發(fā)明還包括誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中針對感染或其至少一種癥狀的免疫的疫苗或 抗原性組合物的配制方法，包括向所述配制劑添加有效劑量的VZVVLP。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述感染是VZV感染?！坝行┝俊?一般指足以誘導(dǎo)免疫、預(yù)防和/或改善感染或減輕至少 一種感染癥狀、和/或增強(qiáng)另一劑VLP的功效的本發(fā)明VLP的量。有效劑量可以指足以延遲感染發(fā)作或使之最小化的VLP的量。有效劑量還可以指在感染的治療或控制中提供治療益處的VLP的量。此外，有效劑量是就單獨(dú)的或與其它療法組合在感染的治療或控制中提 供治療益處的本發(fā)明VLP而言的量。有效劑量還可以是足以增強(qiáng)受試者(例如人)自己針 對后來向感染原暴露的免疫應(yīng)答的量。免疫水平可以通過例如測量中和性分泌抗體和/或 血清抗體的量來加以監(jiān)測，所述測量例如通過噬斑中和(plaque neutralization)、補(bǔ)體結(jié) 合(complement fixation)、酶聯(lián)免疫吸附、或微中和(microneutralization)測定法來進(jìn) 行。在疫苗的情況中，“有效劑量”是預(yù)防疾病和/或降低癥狀嚴(yán)重性的劑量。雖然優(yōu)選用單劑刺激免疫，但是可以通過相同或不同路徑施用額外的劑量，以達(dá) 到想要的效果。例如在新生兒和嬰兒中，可能需要多次施用來引發(fā)足夠的免疫水平。按照 維持足夠水平的抗感染(例如VZV感染)保護(hù)的需要，可以在整個(gè)兒童期以一定間隔繼續(xù) 進(jìn)行施用。類似地，特別容易受到反復(fù)或嚴(yán)重的感染的成年人，例如衛(wèi)生保健工作者、日間 護(hù)理工作者、幼兒的家人、老年人、以及心肺功能受損的個(gè)體等，可能需要進(jìn)行多次免疫來 建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^例如測量中和性分泌和血清抗體的量來監(jiān)測誘 導(dǎo)產(chǎn)生的免疫的水平，并按照引發(fā)和維持期望的保護(hù)水平的需要來調(diào)整劑量或重復(fù)接種。包含VLP的組合物(疫苗和/或抗原性配制劑)的施用方法包括，但不限于，胃腸 外施用(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜夕卜、和粘膜(例如鼻內(nèi)和口腔或肺途徑或通 過栓劑)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜 脈內(nèi)或皮下施用。組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或推注，通過經(jīng)由上 皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、結(jié)腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱和腸粘膜等) 的吸收，并且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。在一些實(shí)施方案中，含本發(fā)明VLP的組合 物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑可以誘導(dǎo)顯著高于其它施用途徑的抗體或其它免疫應(yīng)答。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，含本發(fā)明VLP的組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑可誘導(dǎo)這樣的抗體 或其它免疫應(yīng)答，所述抗體或其它免疫應(yīng)答會(huì)誘導(dǎo)針對其它VZV毒株的交叉保護(hù)。施用可 以是全身性的或者是局部的。本發(fā)明的疫苗和/或抗原性配制劑還可以按照劑量日程表(dosageschedule)來 施用，例如用疫苗組合物進(jìn)行初次施用，隨后進(jìn)行加強(qiáng)施用。在具體的實(shí)施方案中，第二劑 組合物在初次施用后大約兩周至一年的任何時(shí)間，優(yōu)選約1個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4 個(gè)月、約5個(gè)月到約6個(gè)月施用。另外，可以在第二劑之后，且在距初次施用后約3個(gè)月至 約兩年甚至更長時(shí)間，優(yōu)選約4個(gè)月、約5個(gè)月、或者約6個(gè)月、或者約7個(gè)月至約1年施用 第三劑。在第二劑后在受試者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中沒有檢測到或者檢測到低 水平的特異性免疫球蛋白時(shí)，可任選地施用第三劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二劑在第 一次施用后約1個(gè)月施用，而第三劑在第一次施用后約6個(gè)月施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 第二劑在第一次施用后約6個(gè)月施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的VLP可以作為 聯(lián)合療法的一部分施用。例如，本發(fā)明的VLP可以與其它免疫原性組合物、抗病毒劑和/或 抗生素一起配制。技術(shù)人員可以容易地確定藥物配制劑的劑量，例如通過首先鑒定有效引發(fā)預(yù)防性 或治療性免疫應(yīng)答的劑量，例如通過測量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價(jià)或通過測量血 清樣品或尿樣品或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所述劑量可以由動(dòng)物研究確定。用于研究 疫苗功效的動(dòng)物的非限制性目錄包括豚鼠、倉鼠、雪貂(ferret)、灰鼠(chinchilla)、小鼠和棉鼠。大多數(shù)動(dòng)物不是感染原的天然宿主，但仍可用于該疾病的各個(gè)方面的研究。例如， 可以對任何上文的動(dòng)物定量給予疫苗候選物，例如本發(fā)明的VLP，以部分地表征所誘發(fā)的免 疫應(yīng)答，和/或確定是否生成了任何中和性抗體。例如，已經(jīng)在小鼠模型中進(jìn)行了許多研 究，因?yàn)樾∈篌w型小，而且它們的成本低使得研究者可以進(jìn)行更大規(guī)模研究。另外，技術(shù)人員可以進(jìn)行人體臨床研究來確定用于人的優(yōu)選有效劑量。這樣的臨 床研究是常規(guī)的，且為本領(lǐng)域公知。要使用的確切劑量還將依賴于施用途徑?？梢詮脑醋?體外或動(dòng)物試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量_應(yīng)答曲線外推得到有效劑量。如本領(lǐng)域中還公知的，可以使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物來增強(qiáng)特定組合物的 免疫原性，這樣的刺激物稱為佐劑。術(shù)語“佐劑”指這樣的化合物，在其與特定的免疫原(例 如VLP)在配制劑中組合使用時(shí)，會(huì)增進(jìn)或以其它方式改變或修飾由此所致的免疫應(yīng)答。對 免疫應(yīng)答的修飾包括對抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)化或使其特異性增寬。對免疫應(yīng)答的 修飾還可以意味著降低或抑制某些抗原特異性免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)使用佐劑來促進(jìn)針對 未知抗原的免疫的普遍增加(例如美國專利號(hào)4，877，611)。免疫規(guī)程使用佐劑來刺激應(yīng)答 已有多年，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對佐劑是熟知的。有些佐劑影響抗原呈遞的方式。例 如，在蛋白抗原被明礬沉淀時(shí)，免疫應(yīng)答增加?？乖娜榛惭娱L抗原呈遞的持續(xù)時(shí)間。本 發(fā)明的范圍意圖涵蓋Vogel 等，"ACompendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第 2版)，”(本文通過提述收錄該文獻(xiàn)全部內(nèi)容用于所有目的)中所述任何佐劑。例示性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，含有已殺死 的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。其 它佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如thur_MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、月旨 質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A (MPL)。還設(shè)想使用RIBI，其在2%角鯊烯/Tween 80乳劑中含有從細(xì) 菌提取的3種成分MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)。還可以使用MF-59、 Novasomes 、MHC 抗原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是少片層(paucilamellar)脂質(zhì)小泡，其具有大約2到10個(gè)雙層，它們排列成多個(gè)基本呈球形的殼的形式，其由水性層隔開，所述 水性層圍繞著不含脂質(zhì)雙層的無定形中心大空腔。少片層脂質(zhì)小泡可以通過數(shù)種方式起 作用來刺激免疫應(yīng)答作為非特異性刺激物、作為抗原的載體、作為其它佐劑的載體，以及 這些方式的組合。例如，在通過混合抗原與預(yù)先形成的小泡，使得抗原相對于小泡保持在 胞外的方法制備疫苗時(shí)，少片層脂質(zhì)小泡起非特異性免疫刺激物的作用。通過將抗原包囊 在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原載體兩方面的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，小泡主要由非磷脂小泡構(gòu)成。在其它實(shí)施方案中，小泡是Novasomes 。Novasomes 是約IOOnm到約500nm范圍的少片層非磷脂小泡。它們包含Brij 72、膽固醇、油酸和角鯊 烯。Novasomes已被證明是流感抗原的有效佐劑(參見美國專利5，629，021、6，387，373和 4,911,928,本文通過提述收錄它們的全部內(nèi)容用于所有目的)。本發(fā)明的VLP還可以與“免疫刺激物” 一起配制。術(shù)語“免疫刺激物”指經(jīng)由身體 自身的化學(xué)信使(細(xì)胞因子)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、免疫 強(qiáng)化和促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，諸如白介素(例如IL-I、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)集落刺激因子(CSF))； 及其它免疫刺激分子，諸如巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3配體、B7. 1 ；B7. 2等。免疫刺激物分子可以在與本發(fā)明VLP相同的配制劑中施用，或者可以分開施用。可以施用蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含包含佐劑和 /或免疫刺激物的抗原性和疫苗配制劑。刺激免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明的VLP可用于制備刺激賦予針對感染原的免疫或?qū)嵸|(zhì)免疫(substantial immunity)的免疫應(yīng)答的組合物。粘膜和細(xì)胞免疫兩者可以促成針對感染原和疾病的免疫。 上呼吸道中局部分泌的抗體是抗天然感染的主要因子。分泌性免疫球蛋白A(SlgA)牽涉對 上呼吸道的保護(hù)，而血清IgG牽涉對下呼吸道的保護(hù)。對呼吸道的保護(hù)在VZV感染的情況 下是重要的，因?yàn)椴幌衿渌捳畈《?，VZV可經(jīng)由呼吸系統(tǒng)傳染。由感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答針 對用相同病毒或在抗原方面類似的病毒株的再次感染進(jìn)行保護(hù)。本發(fā)明的VLP可以刺激抗體的生成，所述抗體能例如中和感染原、阻斷感染原進(jìn) 入細(xì)胞、阻斷所述感染原的復(fù)制、和/或保護(hù)宿主免于感染和破壞。所述術(shù)語還指如下的免 疫應(yīng)答，其由針對感染原的T淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)，由脊椎動(dòng)物(例如人)展現(xiàn)， 預(yù)防或改善VZV感染或減輕它的至少一種癥狀。本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，其包括給所述受試者 施用包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VZV-VLP包含VZV gE蛋白，但是不包 括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是由病毒引起的。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述感染是由真菌引起的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是由寄生物引起的。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是由細(xì)菌引起的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP基本上 由VZV gE蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP源自包含克隆的VZVgE的重組表 達(dá)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VZV-VLP包含至少一種摻入VLP中的另外的VZV蛋白。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gl (0RF 67)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述另外的VZV蛋白包含gM(0RF50)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是 gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的 VZV蛋白包含間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白包含gl、gM、gH、gB或 間層蛋白的組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括在受試者中誘導(dǎo)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，其 包括給所述受試者施用包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VZV-VLP包含嵌合 VLP，所述嵌合VLP包含VZV gE蛋白和至少一種來自另一種感染原的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另 一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白 質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的 蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。本發(fā)明還提供在受試者中誘導(dǎo)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，包括向所述受試者 施用包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VZV-VLP包含嵌合VLP，所述嵌合VLP 包含VZV gE蛋白、至少一種來自VZV的其它蛋白質(zhì)、和至少一種來自另一種感染原的蛋白 質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是gl (0RF 67)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是gM(0RF 50)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是 gH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的VZV蛋白是gB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自VZV的其它蛋白質(zhì)是間層蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是病毒 蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是細(xì)菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述來自另一種感染原的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來 自另一種感染原的蛋白質(zhì)是來自寄生物的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自另一種 感染原的蛋白質(zhì)在VLP的表面上表達(dá)。如上文所提及的，本發(fā)明的VLP預(yù)防或減少受試者中VZV感染的至少一種癥狀。由 VZV感染引起的兩種疾病的癥狀是本領(lǐng)域公知的。由初次VZV感染產(chǎn)生的禽痘(水痘)的 癥狀包括發(fā)熱、不適、頭痛、腹痛、疲勞、食欲缺乏、和主要在頭皮、面部、和軀干上發(fā)生的皮 膚損傷(skin lesion)。源自于潛伏VZV的再活化的帶狀皰疹的特征在于下列癥狀通常 在胸部生皮節(jié)單側(cè)出現(xiàn)的皮疹、急性神經(jīng)炎痛(neuritic pain)、和超敏感性。如此，本發(fā)明 的方法包括預(yù)防或減輕與VZV感染有關(guān)的至少一種癥狀。癥狀的減輕可以主觀地或者客觀 地確定，例如通過受試者的自我評估、由內(nèi)科醫(yī)生評估、或通過實(shí)施合適的測定或測量(例 如體溫)，包括例如生活質(zhì)量評價(jià)、VZV感染或其它癥狀的進(jìn)展減慢、VZV癥狀的嚴(yán)重程度降 低或者合適的測定法(例如抗體效價(jià)和/或T細(xì)胞活化測定法)。客觀評價(jià)包括動(dòng)物和人 的評價(jià)。通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步例示本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制性的。本文通 過提述收錄本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和已公開的專利申請，以及附圖的內(nèi)容用 于所有目的。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞、病毒、和構(gòu)建體將草地夜蛾Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL-1711)于28°C作為HyQ-SFX昆蟲無血清培養(yǎng) 基(HyClone，Logan，UT)中的懸浮培養(yǎng)物維持。將Bac-to-Bac (細(xì)菌至細(xì)菌)桿狀病毒表 達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad, CA)與大腸桿菌DHlOBac細(xì)胞中的pFastBacl轉(zhuǎn)移載體一 起使用以產(chǎn)生表達(dá)流感基因的重組桿狀病毒載體。VZV基因基于GenBank序列NC_001348。對編碼蛋白質(zhì)(參見下文)的基因進(jìn)行 密碼子優(yōu)化以在Sf9細(xì)胞中高水平的表達(dá)，并于GeneArt (Regensburg，Germany)合成。將 合成的基因轉(zhuǎn)移入PFastBacl中，在AcMNPV多角體蛋白啟動(dòng)子的下游，如先前關(guān)于流感病 毒所詳細(xì)描述的(Pushko等，2005.)。如下產(chǎn)生重組桿狀病毒，即將含有感興趣的VZV基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中后進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組，所述大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞含 有AcMNPV桿狀病毒基因組(Invitrogen)。從大腸桿菌細(xì)胞提取重組桿粒(bacmid) DNA，并 使用CellFectin(Invitrogen)轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞中?；厥罩亟M桿狀病毒，進(jìn)行噬斑純化、擴(kuò) 增，并通過使用Sf9細(xì)胞進(jìn)行的瓊脂糖噬斑測定法來測定重組桿狀病毒儲(chǔ)液(stock)的效 價(jià)。以下是在rBV載體中克隆和表達(dá)并針對VLP形成進(jìn)行評估的VZV蛋白和基因序列 的列表0RF50 3 型包膜糖蛋白 MMGTQKKGraSEKVSPYDTTTPEVEALDHQMDTLNWRIWIIQVMMFTLGAVMLLATLIAASSEYTGIPCFYAAVVDYELFNATLDGGVWSGNRGGYSAPVLFLEPHSVVAFTYYTALTAMAMAVYT LITAAIIHRETKNQRVRQSSGVAWLVVDPTTLFWGLLSLffLLNAVVLLLAYKQIGVAATLYLGHFATSVIFTTYFCG RGKLDETNIKAVANLRQQSVFLYRLAGPTRAVFVNLMAALMAICILFVSLMLELVVANHLHTGLWSSVSVAMSTFST LSVVYLIVSELILAHYIHVLIGPSLGTLVACATLGTAAHSYMDRLYDPISVQSPRLIPTTRGTLACLAVFSVVMLLL RLMRAYVYHRQKRSRFYGAVRRVPERVRGYIRKVKPAHRNSRRTNYPSQGYGYVYENDSTYETDREDELLYERSNSG WE (SEQID NO 1)0RF62 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 ICP4MDTPPMQRSTPQRAGSPDTLELMDLLDAAAAAAEHRARVVTSSQPDDLL FGENGVMVGREHEIVSIPSVSGLQPEPRTEDVGEELTQDDYVCEDGQDLMGSPVIPLAEVFHTRFSEAGAREPTGAD RSLETVSLGTKLARSPKPPMNDGETGRGTTPPFPQAFSPVSPASPV⑶AAGNDQREDQRSIPRQTTRGNSPGLPSVV HRDRQTQSISGKKPGDEQAGHAHASGDGVVLQKTQRPAQGKSPKKKTLKVKVPLPARKPGGPVPGPVEQLYHVLSDS VPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSPVEKKPKSREFVSSSSS SSSWGSSSEDEDDEPRRVSVGSETTGSRSGREHAPSPSNSDDSDSNDGGSTKQNIQPGYRSISGPDPRIRKTKRLAG EPGRQRQKSFSLPRSRTPIIPPVSGPLMMPDGSPWPGSAPLPSNRVRFGPSGETREGHWEDEAVRAARARYEASTEP VPLYVPEL⑶PARQYRALINLIYCPDRDPIAWLQNPKLTGVNSALNQFYQKLLPPGRAGTAVTGSVASPVPHVGEAM ATGEALffALPHAAAAVAMSRRYDRAQKHFILQSLRRAFASMAYPEATGSSPAARISRGHPSPTTPATQAPDPQPSAA ARSLSVCPPDDRLRTPRKRKSQPVESRSLLDKIRETPVADARVADDHVVSKAKRRVSEPVTITSGPVVDPPAVITMP LDGPAPNGGFRRIPRGALHTPVPSDQARKAYCTPETIARLVDDPLFPTAWRPALSFDPGALAEIAARRPGGGDRRFG PPSGVEALRRRCAWMRQIPDPEDVRLLIIYDPLPGEDINGPLESTLATDPGPSWSPSRGGLSVVLAALSNRLCLPST HAWAGNWTGPPDVSALNARGVLLLSTRDLAFAGAVEYLGSRLASARRRLLVLDAVALERWPRDGPALSQYHVYVRAP ARPDAQAVVRWPDSAVTEGLARAVFASSRTFGPASFARIETAFANLYPGEQPLCLCRGGNVAYTVCTRAGPKTRVPL SPREYRQYVLPGFDGCKDLARQSRGLGLGAADFVDEAAHSHRAANRWGLGAALRPVFLPEGRRPGAAGPEA⑶VPTW ARVFCRHALLEPDPAAEPLVLPPVAGRSVALYASADEARNALPPIPRVMWPPGFGAAETVLEGSDGTRFVFGHHGGS ERPSETQAGRQRRTADDREHALELDDWEVGCEDAWDSEEGG⑶DGDAPGSSFGVSIVSVAPGVLRDRRVGLRPAVKV ELLSSSSSSEDEDDVWGGRGGRSPPQSRG(SEQID NO 2)0RF63 調(diào)節(jié)蛋白 ICP22MFCTSPATRGDSSESKPGASVDVNGKMEYGSAPGPLNGRDTSRGPGAFCT PGWEIHPARLVEDINRVFLCIAQSSGRVTRDSRRLRRICLDFYLMGRTRQRPTLACWEELLQLQPTQTQCLRATLME VSHRPPRGEDGFIEAPNVPLHRSALECDVSDDGGEDDSDDDGSTPSDVIEFRDSDAESSDGEDFIVEEESEESTDSC EPDGVPGDCYRDGDGCNTPSPKRPQRAIERYAGAETAEYTAAKALTALGEGGVDWKRRRHEAPRRHDIPPPHGV(SE Q ID NO 3)Orf9 間層蛋白 VP22MASSDGDRLCRSNAVRRKTTPSYSGQYRTARRSVWGPPDDSDDSLGYITTV GADSPSPVYADLYFEHKNTTPRVHQPNDSSGSEDDFEDIDEVVAAFREARLRHELVEDAVYENPLSVEKPSRSFTKN AAVKPKLEDSPKRAPPGAGAIASGRPISFSTAPKTATSSWCGPTPSYNKRVFCEAVRRVAAMQAQKAAEAAWNSNPP RNNAELDRLLTGAVIRITVHEGLNLIQAANEADLGEGASVSKRGHNRKTGDLQGGMGNEPMYAQVRKPKSRTDTQTT GRITNRSRARSASRTDTRK(SEQID NO 4) OrflO 間層蛋白 VP16MECNLGTEHPSTDTWNRSKTEQAVVDAFDESLF⑶VASDIGFETSLYSHAV KTAPSPPWVASPKILYQQLIRDLDFSEGPRLLSCLETWNEDLFSCFPINEDLYSDMMVLSPDPDDVISTVSTKDHVE MFNLTTRGSVRLPSPPKQPTGLPAYVQEVQDSFTVELRAREEAYTKLLVTYCKSIIRYLQGTAKRTTIGLNIQNPDQ KAYTQLRQSILLRYYREVASLARLLYLHLYLTVTREFSWRLYASQSAHPDVFAALKFTWTERRQFTCAFHPVLCNHG IVLLEGKPLTASALREINYRRRELGLPLVRCGLVEENKSPLVQQPSFSVHLPRSVGFLTHHIKRKLDAYAVKHPQEPRHVRADHPYAKWENRNYGSSIEAMILAPPSPSEILP⑶PPRPPTCGFLTR(SEQ ID NO 5)Orf68E 1 型包膜糖蛋白 E(gE)MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHTDED KLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQM SAQEDL⑶DTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQY⑶VFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYT ETWSFLPSLTCTCDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDEL ELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVF SVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTV YQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIE ERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLAAVVLLCLVIFLICTAKRMRVKAYRVDKSPYNQSMYY AGLPVDDFEDSESTDTEEEFGNAIGGSHGGSSYTVYIDKTR(SEQ IDNO 6)gE的Orf68TCM變體；用甲型流感/Fujian TM域和COOH替換gE的跨膜(TM)域 和 COOH(標(biāo)示下劃線的)MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDraTDEDKLDTNSVYEPYYH SDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLiiDDTGIH VIPTLNGDDRHKIVNVDQRQY⑶VFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTG DAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLK VLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQ YKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAY CLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPA TTKPKEITPYNPGTSPLLRDffILffISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI(SEQ ID NO 7)針對昆蟲細(xì)胞進(jìn)行過密碼子優(yōu)化的VZV DNA序列進(jìn)入桿狀病毒載體中，并評估 VLP的裝配。0RF37 糖蛋白 H (gH) MFALVLAVVILPLffTTANKSYVTPTPATRSIGHMSALLREYSDRNMSLKLEA FYPTGFDEELIKSLHWGNDRKHVFLVIVKVNPTTHE⑶VGLVIFPKYLLSPYHFKAEHRAPFPAGRFGFLSHPVTPD VSFFDSSFAPYLTTQHLVAFTTFPPNPLVWHLERAETAATAERPFGVSLLPARPTVPKNTILEHKAHFATWDALARH TFFSAEAIITNSTLRIHVPLFGSVWPIRYWATGSVLLTSDSGRVEVNIGVGFMSSLISLSSGPPIELIVVPHTVKLN AVTSDTTWFQLNPPGPDPGPSYRVYLLGRGLDMNFSKHATVDICAYPEESLDYRYHLSMAHTEALRMTTKADQHDIN EESYYHIAARIATSIFALSEMGRTTEYFLLDEIVDVQYQLKFLNYILMRIGAGAHPNTISGTSDLIFADPSQLHDEL SLLFGQVKPANVDYFISYDEARDQLKTAYALSRGQDHVNALSLARRVIMSIYKGLLVKQNLNATERQALFFASMILL NFREGLENSSRVLDGRTTLLLMTSMCTAAHATQAALNIQEGLAYLNPSKHMFTIPNVYSPCMGSLRTDLTEEIHVMN LLSAIPTRPGLNEVLHTQLDESEIFDAAFKTMMIFTTWTAKDLHILHTHVPEVFTCQDAAARNGEYVLILPAVQGHS YVITRNKPQRGLVYSLADVDVYNPISVVYLSRDTCVSEHGVIETVALPHPDNLKECLYCGSVFLRYLTTGAIMDII IIDSKDTERQLAAMGNSTIPPFNPDMH⑶DSKAVLLFPNGTVVTLLGFERRQAIRMSGQYLGASLGGAFLAVVGFGI IGWMLCGNSRLREYNKIPLT(SEQ ID NO 8)0RF67 糖蛋白 I (gl)MFLIQCLISAVIFYIQVTNALIFK⑶HVSLQVNSSLTSILIPMQNDNYTEIK GQLVFIGEQLPTGTNYSGTLELLYADTVAFCFRSVQVIRYDGCPRIRTSAFISCRYKHSWHYGNSTDRISTEPDAG VMLKITKPGINDAGVYVLLVRLDHSRSTDGFILGVNVYTAGSHHNIHGVIYTSPSLQNGYSTRALFQQARLCDLPAT PKGSGTSLFQHMLDLRAGKSLEDNPWLHEDVVTTETKSVVKEGIENHVYPTDMSTLPEKSLNDPPENLLIIIPIVAS VMILTAMVIVIVISVKRRRIKKHPIYRPNTKTRRGIQNATPESDVMLEAAIAQLATIREESPPHSVVNPFVK(SEQ ID NO 9)
0RF31 糖蛋白B (gB) MFVTAWSVSPSSFYESLQVEPTQSEDITRSAHL⑶⑶EIREAIHKSQDAET KPTFYVCPPPTGSTIVRLEPTRTCPDYHLGKNFTEGIAVVYKENIAAYKFKATVYYKDVIVSTAWAGSSYTQITNRY ADRVPIPVSEITDTIDKFGKCSSKATYVRNNHKVEAFNEDKNPQDMPLIASKYNSVGSKAWHTTNDTYMVAGTPGTY RTGTSVNCIIEEVEARSIFPYDSFGLSTCDIIYMSPFFGLRDGAYREHSNYAMDRFHQFEGYRQRDLDTRALLEPAA RNFLVTPHLTVGWNWKPKRTEVCSLVKWREVEDVVRDEYAHNFRFTMKTLSTTFISETNEFNLNQIHLSQCVKEEAR AIINRIYTTRYNSSHVRTCDIQTYLARGGFVWFQPLLSNSLARLYLQELVRENTNHSPQKHPTRNTRSRRSVPVEL RANRTITTTSSVEFAMLQFTYDHIQEHVNEMLARISSSWCQLQNRERALWSGLFPINPSALASTILDQRVKARILGD VISVSNCPELGSDTRIILQNSMRVSGSTTRCYSRPLISIVSLNGSGTVEGQLGTDNELIMSRDLLEPCVANHKRYFL FGHHYVYYEDYRYVREIAVHDVGMISTYVDLNLTLLKDREFMPLQVYTRDELRDTGLLDYSEIQRRNQMHSLRFYDI DKVVQYDSGTAIMQGMAQFFQGLGTAGQAVGHVVLGATGALLSTVHGFTTFLSNPFGALAVGLLVLAGLVAAFFAY RYVLKLKTSPMKALYPLTTKGLKQLPEGMDPFAEKPNATDTPIEEI⑶SQNTEPSVNSGFDPDKFREAQEMIKYMTL VSAAERQESKARKKNKTSALLTSRLTGLALRNRRGYSRVRTENVTGV(SEQ ID NO: 10)經(jīng)過密碼子優(yōu)化并克隆入桿狀病毒表達(dá)載體中的VZV gE基因序列。0rf68 gEATGGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGTTTCGGTATCATCACCGGCA CCCTGCGTATCACCAACCCCGTGCGTGCTTCCGTGCTGCGTTACGACGACTTCCACACCGACGAGGACAAGCTGGAC ACCAACTCCGTGTACGAGCCCTACTACCACTCCGACCACGCTGAGTCCTCTTGGGTGAACCGTGGCGAGTCCTCCCG TAAGGCTTACGACCACAACTCCCCCTACATCTGGCCCCGTAACGACTACGACGGTTTCCTCGAGAACGCTCACGAGC ACCACGGTGTCTACAACCAGGGTCGTGGTATCGACTCCGGCGAGCGTCTGATGCAGCCCACCCAGATGTCCGCTCAG GAGGACCTGGGCGACGACACCGGTATCCACGTGATCCCCACCCTGAACGGTGACGACCGTCACAAGATCGTGAACGT GGACCAGCGCCAGTACGGTGACGTGTTCAAGGGTGACCTGAACCCCAAGCCCCAGGGCCAGCGTCTGATCGAGGTGT CCGTGGAGGAGAACCACCCCTTCACCCTGCGTGCTCCCATCCAGCGTATCTACGGTGTCCGTTACACCGAGACCTGG TCCTTCCTCCCCTCCCTGACCTGCACCGGTGACGCTGCTCCCGCTATCCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTG CTTCCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGACTGCGCTGAGAACACCAAGGAGGACCAGCTGGCTGAGATCTCCTACAGGT TCCAGGGCAAGAAGGAGGCTGACCAGCCCTGGATCGTGGTGAACACCTCCACCCTGTTCGACGAGCTGGAGCTGGAC CCCCCCGAGATCGAGCCCGGTGTCCTGAAGGTGCTGCGTACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACAT GCGTGGTTCCGACGGCACCTCCACCTACGCTACCTTCCTCGTGACCTGGAAGGGTGACGAAAAGACCCGTAACCCCA CCCCCGCTGTGACCCCCCAGCCCCGTGGTGCTGAATTCCATATGTGGAACTACCACTCTCACGTGTTCTCCGTGGGT GACACCTTCTCCCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAGGCTCCCTTCGACCTGCTGCTCGAGTGGCTGTA CGTGCCCATCGACCCCACCTGCCAGCCCATGCGCCTGTACTCCACCTGCCTGTACCACCCCAACGCTCCCCAGTGCC TGTCCCACATGAACTCCGGTTGCACCTTCACCTCCCCCCACCTGGCCCAGCGTGTGGCTTCCACCGTGTACCAGAAC TGCGAGCACGCTGACAACTACACCGCTTACTGCCTGGGTATCAGCCACATGGAGCCTTCCTTCGGTCTGATCCTGCA CGACGGTGGCACCACCCTGAAGTTCGTGGACACCCCCGAGTCCCTGTCCGGTCTGTACGTGTTCGTGGTGTACTTCA ACGGTCACGTGGAGGCTGTCGCTTACACCGTGGTGTCCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCTATCGAGGAGCGTGGT TTCCCCCCCACCGCTGGCCAGCCCCCTGCTACCACCAAGCCCAAGGAGATCACCCCCGTCAACCCCGGCACCTCCCC TCTGCTGCGCTACGCTGCTTGGACCGGTGGTCTGGCTGCTGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGCA CCGCTAAGAGGATGCGTGTGAAGGCTTACCGTGTGGACAAGTCCCCTTACAACCAGTCCATGTACTACGCTGGTCTG CCCGTCGACGACTTCGAGGACTCCGAGTCCACCGACACCGAGGAGGAGTTCGGTAACGCTATCGGTGGTTCCCACGG TGGTTCCTCCTACACCGTGTACATCGACAAGACCCGCTAA(SEQ ID NO 11) 0rf68TCM的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列，標(biāo)示下劃線的起始和終止密碼子MSGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGTTTCGGTATCATCACCGGCACCCTGCGTATCACCAACCCCGTGCG TGCTTCCGTGCTGCGTTACGACGACTTCCACACCGACGAGGACAAGCTGGACACCAACTCCGTGTACGAGCCCTACT ACCACTCCGACCACGCTGAGTCCTCTTGGGTGAACCGTGGCGAGTCCTCCCGTAAGGCTTACGACCACAACTCCCCC TACATCTGGCCCCGTAACGACTACGACGGTTTCCTCGAGAACGCTCACGAGCACCACGGTGTCTACAACCAGGGTCG TGGTATCGACTCCGGCGAGCGTCTGATGCAGCCCACCCAGATGTCCGCTCAGGAGGACCTGGGCGACGACACCGGTA TCCACGTGATCCCCACCCTGAACGGTGACGACCGTCACAAGATCGTGAACGTGGACCAGCGCCAGTACGGTGACGTG TTCAAGGGTGACCTGAACCCCAAGCCCCAGGGCCAGCGTCTGATCGAGGTGTCCGTGGAGGAGAACCACCCCTTCAC CCTGCGTGCTCCCATCCAGCGTATCTACGGTGTCCGTTACACCGAGACCTGGTCCTTCCTCCCCTCCCTGACCTGCA CCGGTGACGCTGCTCCCGCTATCCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTCCAGGACGTGGTGGTGGACGTG GACTGCGCTGAGAACACCAAGGAGGACCAGCTGGCTGAGATCTCCTACAGGTTCCAGGGCAAGAAGGAGGCTGACCA GCCCTGGATCGTGGTGAACACCTCCACCCTGTTCGACGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCCGGTGTCC TGAAGGTGCTGCGTACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGTGGTTCCGACGGCACCTCCACC TACGCTACCTTCCTCGTGACCTGGAAGGGTGACGAAAAGACCCGTAACCCCACCCCCGCTGTGACCCCCCAGCCCCG TGGTGCTGAATTCCATATGTGGAACTACCACTCTCACGTGTTCTCCGTGGGTGACACCTTCTCCCTGGCTATGCACC TGCAGTACAAGATCCACGAGGCTCCCTTCGACCTGCTGCTCGAGTGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACCTGCCAG CCCATGCGCCTGTACTCCACCTGCCTGTACCACCCCAACGCTCCCCAGTGCCTGTCCCACATGAACTCCGGTTGCAC CTTCACCTCCCCCCACCTGGCCCAGCGTGTGGCTTCCACCGTGTACCAGAACTGCGAGCACGCTGACAACTACACCG CTTACTGCCTGGGTATCAGCCACATGGAGCCTTCCTTCGGTCTGATCCTGCACGACGGTGGCACCACCCTGAAGTTC GTGGACACCCCCGAGTCCCTGTCCGGTCTGTACGTGTTCGTGGTGTACTTCAACGGTCACGTGGAGGCTGTCGCTTA CACCGTGGTGTCCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCTATCGAGGAGCGTGGTTTCCCCCCCACCGCTGGCCAGCCCC CTGCTACCACCAAGCCCAAGGAGATCACCCCCGTCAACCCCGGCACCTCCCCTCTGCTGCGCGACTGGATCTTGTGG ATCTCCTTCGCTATCTCCTGCTTCCTGCTGTGCGTGGCTCTGCTGGGTTTCATCATGTGGGCTTGCCAGAAGGGTAA CATCCGTTGCAACATCTGCATCTAA(SEQ ID NO 12)來自GenBank NC_001348 (VZV Dumas 株)的 0RF62 蛋白與來自 GenBankAB097933 (VZV Oka 親本株)的 0RF62 蛋白的比對查詢I-Oka親本株查詢 2-Dumas 株同一性=(99% )查詢1 MDTPPMQRSTPQRAGSPDTLELMDLLDMMMEHRARWTSSQPDDLLFGENGVMVGRE 60MDTPPMQRSTPQRAGSPDTLELMDLLDAAAAMEHRARVVTSSQPDDLLFGENGVMVGRESbjct 1 MDTPPMQRSTPQRAGSPDTLELMDLLDAAAAAAEHRARWTSSQPDDLLFGENGVMVGRE 60 查詢61 HEIVSIPSVSGLQPEPRTEDVGEELTQDDYVCEDGQDLMGSPVIPLAEVFHTRFSEAGAR 120HEIVSIPSVSGLQPEPRTEDVGEELTQDDYVCEDGQDLMGSPVIPLAEVFHTRFSEAGARSbjct 61 HEIVSIPSVSGLQPEPRTEDVGEELTQDDYVCEDGQDLMGSPVIPLAEVFHTRFSEAGAR 120 查詢121 EPTGADRSLETVSLGTKLARSPKPPMNDGETGRGTTPPFPQAFSPVSPASPVGDAAGNDQ 180EPTGADRSLETVSLGTKLARSPKPPMNDGETGRGTTPPFPQAFSPVSPASPVGDMGNDQSbjct 121 EPTGADRSLETVSLGTKLARSPKPPMNDGETGRGTTPPFPQAFSPVSPASPVGDAAGNDQ 180 查詢181 REDQRSIPRQTTRGNSPGIPSVVHRDRQTQSISGKKPGDEQAGHAMSGDGVVLQKTQRP 240REDQRSIPRQTTRGNSPGLPSWHRDRQTQSISGKKPGDEQAGHAHASGDGWLQKTQRP
Sbjct 181REDQRSIPRQTTRGNSPGIPSVVHRDRQTQSISGKKPGDEQAGHAMSGDGVVLQKTQRP 240查詢241 AQGKSPKKKTLKVKVPLPARKPGGPVPGPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPR 300AQGKSPKKKTLKVKVPLPARKPGGPVPGPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRSbjct 241AQGKSPKKKTLKVKVPLPARKPGGPVPGPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPR 300查詢 301 KHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSPVEKKPKSREFVSSSSSSSS 360KHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSPVEKKPKSREFVSSSSSSSSSbjct 301KHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSPVEKKPKSREFVSSSSSSSS 360查詢 361 WGSSSEDEDDEPRRVSVGSETTGSRSGREHAPSPSNSDDSDSNDGGSTKQNIQPGYRSIS 420WGSSSEDEDDEPRRVSVGSETTGSRSGREHAPSPSNSDDSDSNDGGSTKQNIQPGYRSISSbjct 361WGSSSEDEDDEPRRVSVGSETTGSRSGREHAPSPSNSDDSDSNDGGSTKQNIQPGYRSIS 420查詢421 GPDPRIRKTKRUGEPGRQRQKSFSLPRSRTPIIPPVSGPLMMPDGSPWPGSAPLPSNRV 480GPDPRIRKTKRUGEPGRQRQKSFSLPRSRTPIIPPVSGPLMMPDGSPWPGSAPLPSNRVSbjct 421GPDPRIRKTKRUGEPGRQRQKSFSLPRSRTPIIPPVSGPLMMPDGSPWPGSAPLPSNRV 480查詢 481 RFGPSGETREGHWEDEAVRAARARYEASTEPVPLYVPELGDPARQYRALINLIYCPDRDP 540
RFGPSGETREGHWEDEAVRAARARYEASTEPVPLYVPELGDPARQYRALINLIYCPDRDPSbjct 481RFGPSGETREGHWEDEAVRAARARYEASTEPVPLYVPELGDPARQYRALINLIYCPDRDP 540查詢 541 IAWLQNPKLTGVNSALNQFYQKLLPPGRAGTAVTGSVASPVPHVGEAMATGEALWALPHA 600IAWLQNPKLTGVNSALNQFYQKLLPPGRAGTAVTGSVASPVPHVGEAMATGEALWALPHASbjct 541IAWLQNPKLTGVNSALNQFYQKLLPPGRAGTAVTGSVASPVPHVGEAMATGEALWALPHA 600查詢 601 AAAVAMSRRYDRAQKHFILQSLRRAFASMAYPEATGSSPAARISRGHPSPTTPATQTPDP 660AAAVAMSRRYDRAQKHFILQSLRRAFASMAYPEATGSSPAARISRGHPSPTTPATQ PDPSbjct 601MAVAMSRRYDRAQKHFILQSLRRAFASMAYPEATGSSPMRISRGHPSPTTPATQAPDP 660查詢 661 QPSAMRSLSVCPPDDRLRTPRKRKSQPVESRSLLDKIRETPVADARVADDHWSKAKRR 720QPSAMRSLSVCPPDDRLRTPRKRKSQPVESRSLLDKIRETPVADARVADDHWSKAKRRSbjct 661QPSAMRSLSVCPPDDRLRTPRKRKSQPVESRSLLDKIRETPVADARVADDHWSKAKRR 720查詢 721 VSEPVTITSGPWDPPAVII1PLDGPAPNGGFRRIPRGALHTPVPSDQARKAYCTPETIA 780VSEPVTITSGPWDPPAVII1PLDGPAPNGGFRRIPRGALHTPVPSDQARKAYCTPETIASbjct 721VSEPVTITSGPWDPPAVII1PLDGPAPNGGFRRIPRGALHTPVPSDQARKAYCTPETIA 780查詢 781 RLVDDPLFPTAWRPALSFDPGALAEIMRRPGGGDRRFGPPSGVEALRRRCAWMRQIPDP 840RLVDDPLFPTAWRPALSFDPGALAEIMRRPGGGDRRFGPPSGVEALRRRCAWMRQIPDPSbjct 781RLVDDPLFPTAWRPALSFDPGALAEIMRRPGGGDRRFGPPSGVEALRRRCAWMRQIPDP 840查詢 841 EDVRLLIIYDPLPGEDINGPLESTLATDPGPSWSPSRGGLSWLAALSNRLCLPSTHAWA 900EDVRLLIIYDPLPGEDINGPLESTLATDPGPSWSPSRGGLSWLAALSNRLCLPSTHAWASbjct 841EDVRLLIIYDPLPGEDINGPLESTLATDPGPSWSPSRGGLSWLAALSNRLCLPSTHAWA 900查詢901 GNWTGPPDVSALNARGVLLLSTRDLAFAGAVEYLGSRLASARRRLLVLDAVALERWPRDG 960GNWTGPPDVSALNARGVLLLSTRDLAFAGAVEYLGSRLASARRRLLVLDAVALERWPRDGSbjct 901 GNWTGPPDVSALNARGVLLLSTRDLAFAGAVEYLGSRLASARRRLLVLDAVALERWPRDG 960查詢 961 PALSQYHVYVRAPARPDAQAWRWPDSAVTEGLARAVFASSRTFGPASFARIETAFANLY 1020PALSQYHVYVRAPARPDAQAWRWPDSAVTEGLARAVFASSRTFGPASFARIETAFANLY
Sbjct 961 PALSQYHVYVRAPARPDAQAWRWPDSAVTEGLARAVFASSRTFGPASFARIETAFANLY 1020查詢 1021 Pgeqplclcrggnvaytvctragpktrvplspreyrqyvlpgfdgckdlarqsrglglga iosoPGEOPLCLCRGGNVAYTVCTRAGPKTRVPLSPREYRgYVLPGFDGCHLARgSRGLGLGASbjct 1021 PGEOPLCLCRGGNVAYTVCTRAGPKTRVPLSPREYRgYVLPGFDGCHLARgSRGLGLGA 1080查詢 1081 ADFVDEMHSHRMNRWGLGMLRPVFLPEGRRPGMGPEAGDVPTWARVFCRHALLEPD 1140
adfvdemhshrmnrwglgmlrpvflpegrrpgmgpeagdvptwarvfcrhallepdSbjct 1081 ADFVDEMHSHRMNRWGLGMLRPVFLPEGRRPGMGPEAGDVPTWARVFCRHALLEPD 1140查詢 1141 PAAEPLVLPPVAGRSVALYASADEARNALPPIPRVMWPPGFGAAETVLEGSDGTRFVFGH 1200PAAEPLVLPPVAGRSVALYASADEARNALPPIPRVMWPPGFGAAETVLEGSDGTRFVFGHSbjct 1141 PAAEPLVLPPVAGRSVALYASADEARNALPPIPRVMWPPGFGAAETVLEGSDGTRFVFGH 1200查詢 1201 HGGSERPAETQAGRQRRTADDREHALEPDDWEVGCEDAWDSEEGGGDDGDAPGSSFGVSI 1260HGGSERP+ETQAGRQRRTADDREHALE DDWEVGCEDAWDSEEGGGDDGDAPGSSFGVSISbjct 1201 HGGSERPSETQAGRQRRTADDREHALELDDWEVGCEDAWDSEEGGGDDGDAPGSSFGVSI 1260查詢 1261 VSVAPGVLRDRRVGLRPAVKVELLSSSSSSEDEDDVWGGRGGRSPPQSRG(SEQ ID NO 13)VSVAPGVLRDRRVGLRPAVKVELLSSSSSSEDEDDVWGGRGGRSPPQSRG(SEQ ID NO 14)Sbjct 1261 VSVAPGVLRDRRVGLRPAVKVELLSSSSSSEDEDDVWGGRGGRSPPQSRG(SEQ ID NO 15)實(shí)施例2單獨(dú)的VZV gE蛋白的表達(dá)形成VLP在SF9細(xì)胞中表達(dá)僅含有VZV gE的桿狀病毒構(gòu)建體，并依照上文的規(guī)程進(jìn)行分 析。使用上文所描述的方法經(jīng)由20%-60%蔗糖密度梯度步驟從用BV-VZV gE載體感染的 Sf9細(xì)胞純化顆粒。凝膠和Western印跡證實(shí)，在蔗糖梯度的顆粒級(jí)分中回收了 VZV gE。在 SDS凝膠上運(yùn)行樣品(圖1A)，并對分離的上清液的Western印跡探查VZV gE(圖1B)或流 感基質(zhì)蛋白(圖1C)。如圖IB的第2道和第3道中所顯示的，單獨(dú)的VZV gE蛋白表達(dá)導(dǎo)致 VZV-VLP的形成。另外，實(shí)施對梯度純化的顆粒的分析，通過在Sijphacryl S-400凝膠滲透層析柱上 進(jìn)行的大小分級(jí)來分析。大部分gE蛋白大于6，OOOkDa，這與此為VLP相符合(圖2)。如 此，單獨(dú)的VZV gE的表達(dá)足以形成病毒樣顆粒。另外，作為對照，單獨(dú)表達(dá)或與嵌合gE (與 流感HA的跨膜域和胞質(zhì)域融合的gE) —起表達(dá)流感Ml。這些對照顯示，有通過流感Ml的 表達(dá)和Ml與嵌合VZV gE蛋白一起的表達(dá)所產(chǎn)生的VLP形成。實(shí)施例3IE62 的表達(dá)IE62是主要的VZV間層蛋白。免疫接種誘導(dǎo)特異性抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)， 其在用VZV攻擊時(shí)保護(hù)豚鼠。所描述的是克隆入桿狀病毒表達(dá)載體中的全長VZV IE62基 因(圖3A)、在Sf9昆蟲細(xì)胞中生成的重組IE62、和用于提取和純化胞內(nèi)IE62的非變性方法。方法。對桿狀病毒進(jìn)行工程化改造以表達(dá)全長、經(jīng)過密碼子優(yōu)化的來自VZV Oka 株的IE62基因。合成該基因(GeneArt，Germany)，并克隆入pFastBacl載體中，在桿狀 病毒多角體蛋白啟動(dòng)子(Invitrogen)的控制下。將此基因轉(zhuǎn)移至AcMNPV桿狀病毒桿粒 (Invitrogen)，使用桿粒DNA來轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞。對所得的重組桿狀病毒進(jìn)行噬斑純化，并在Sf9細(xì)胞中制備病毒儲(chǔ)液。
Orf IE62 ICP4 全長。ATGGACACCCCCCCCATGCAGCGTTCCACCCCCCAGCGTGCTGGTTCCCC CGACACCCTCGAGCTGATGGACCTGCTGGACGCTGCTGCTGCCGCTGCCGAGCACCGTGCTCGTGTGGTGACCTCCT CCCAGCCCGACGACCTGCTGTTCGGCGAGAACGGTGTCATGGTCGGTCGTGAGCACGAGATCGTGTCCATCCCTTCC GTGTCCGGTCTGCAGCCCGAGCCCCGTACCGAGGACGTGGGCGAAGAGCTGACCCAGGACGACTACGTGTGCGAGGA CGGCCAGGACCTGATGGGTTCCCCCGTGATCCCCCTGGCTGAGGTGTTCCACACCCGTTTCTCCGAGGCTGGTGCTC GTGAGCCCACCGGTGCTGACCGTTCCCTCGAGACCGTGTCCCTGGGCACCAAGCTGGCTCGTTCCCCCAAGCCCCCC ATGAACGACGGCGAGACCGGTCGTGGCACCACCCCCCCCTTCCCTCAGGCTTTCTCCCCTGTGTCCCCCGCTTCCCC CGTGGGTGACGCTGCTGGTAACGACCAGCGTGAGGACCAGCGTTCCATCCCTCGTCAGACCACCCGTGGTAACTCCC CCGGTCTGCCCTCCGTGGTGCACCGTGACCGTCAGACCCAGTCCATCTCCGGCAAGAAGCCCGGCGACGAGCAGGCT GGTCACGCTCACGCTTCCGGTGACGGTGTTGTGCTGCAAAAAACCCAACGTCCCGCCCAGGGAAAGTCTCCCAAGAA GAAAACCCTGAAGGTCAAGGTGCCCCTGCCCGCTCGTAAGCCCGGTGGTCCCGTGCCCGGTCCCGTGGAGCAGCTGT ACCACGTGCTGTCCGACTCCGTGCCCGCTAAGGGTGCTAAGGCTGACCTGCCTTTCGAGACCGACGACACCCGTCCC CGTAAGCATGACGCTAGGGGCATCACTCCTCGTGTGCCCGGTCGTTCCTCCGGTGGCAAGCCCCGTGCTTTCCTGGC TCTGCCTGGTCGTTCCCACGCTCCCGACCCCATCGAGGACGACTCCCCCGTGGAGAAGAAGCCCAAGTCCCGCGAGT TCGTGTCCTCCTCCTCCAGCTCCTCCTCCTGGGGTTCCAGCTCCGAGGACGAGGACGACGAGCCCCGTCGTGTGTCC GTGGGTTCCGAGACCACCGGTTCCCGTTCCGGTCGCGAGCACGCCCCCTCCCCATCCAACTCTGACGACTCCGACTC CAACGACGGTGGTTCCACCAAGCAGAACATCCAGCCCGGCTACCGTTCCATTTCTGGTCCCGACCCCCGTATCCGTA AGACCAAGCGTCTGGCTGGCGAACCAGGCCGTCAGCGTCAGAAGTCCTTCTCCCTGCCCCGTTCCCGTACCCCTATC ATCCCTCCTGTCTCCGGCCCTCTGATGATGCCCGACGGTTCCCCCTGGCCCGGTTCCGCTCCCCTGCCCTCCAACCG TGTGCGTTTCGGTCCCTCCGGCGAGACCCGTGAGGGCCACTGGGAGGACGAGGCTGTGCGTGCTGCTCGTGCTCGTT ACGAGGCTTCCACCGAGCCCGTGCCCCTGTACGTGCCCGAACTGGGTGACCCTGCCCGTCAGTACCGTGCTCTGATC AACCTGATCTACTGCCCCGACCGTGACCCCATCGCTTGGCTGCAGAACCCCAAGCTGACCGGTGTCAACTCCGCTCT GAACCAGTTCTACCAGAAGCTGCTGCCCCCTGGTCGTGCTGGCACCGCTGTGACCGGTTCCGTGGCTTCCCCTGTGC CCCACGTGGGAGAGGCTATGGCTACCGGCGAGGCTCTGTGGGCTCTGCCTCACGCTGCCGCCGCTGTGGCTATGTCC CGTCGTTACGACCGTGCTCAGAAGCACTTCATCCTGCAGTCCCTGCGTCGTGCTTTCGCTTCCATGGCTTACCCCGA GGCTACCGGTTCCTCCCCCGCTGCTCGTATCTCCCGTGGTCACCCCTCCCCCACCACCCCCGCTACCCAGGCTCCAG ACCCCCAACCCTCTGCTGCTGCTCGTTCCCTGTCCGTGTGCCCCCCTGACGACCGTCTGCGTACCCCCCGTAAGCGC AAGTCCCAGCCCGTGGAGTCCCGTTCCCTGCTGGACAAGATCCGTGAGACCCCAGTGGCTGACGCTCGCGTGGCTGA CGACCACGTCGTGTCCAAGGCTAAGAGGCGCGTGTCCGAGCCTGTGACCATCACCTCCGGTCCTGTGGTGGACCCCC CTGCTGTGATCACCATGCCCCTGGACGGTCCCGCTCCCAACGGTGGTTTCCGTCGTATCCCTCGTGGTGCTCTGCAC ACCCCCGTGCCCTCCGACCAGGCTCGTAAGGCTTACTGCACCCCCGAGACCATCGCTCGTCTGGTGGACGACCCCCT GTTCCCCACCGCTTGGCGTCCTGCTCTGTCCTTCGACCCCGGTGCTCTGGCTGAGATCGCTGCTCGCCGTCCCGGTG GCGGTGATCGTCGCTTCGGTCCTCCCTCCGGTGTCGAGGCTCTGCGTCGTCGTTGCGCTTGGATGCGTCAGATCCCC GACCCTGAGGACGTGCGCCTGCTGATCATCTACGACCCTCTGCCCGGCGAGGACATCAACGGTCCTCTCGAGTCCAC CCTGGCTACCGACCCCGGTCCCTCCTGGTCCCCCTCCCGTGGTGGTCTGTCCGTGGTGCTGGCTGCCCTGTCCAACC GTCTGTGCCTGCCTTCCACCCACGCTTGGGCTGGTAACTGGACCGGTCCCCCCGACGTGTCCGCCCTGAACGCTCGC GGTGTCTTGCTCCTGTCCACCCGTGATCTGGCTTTCGCTGGTGCTGTGGAGTACCTGGGTTCCCGTCTGGCTTCCGC TCGTCGTCGTCTGCTGGTCCTGGACGCTGTGGCTCTCGAGCGTTGGCCCCGTGACGGTCCAGCCCTGTCTCAATACCACGTGTACGTGCGCGCTCCCGCTCGTCCCGACGCTCAGGCTGTGGTGCGCTGGCCCGACTCCGCTGTCACCGAGGGT CTGGCTCGTGCTGTGTTCGCTTCCTCCCGTACCTTCGGTCCCGCTTCCTTCGCTCGTATCGAGACCGCTTTCGCTAA CCTGTACCCCGGCGAGCAGCCCCTGTGCCTGTGCCGTGGTGGTAACGTGGCTTACACCGTGTGCACCCGTGCTGGTC CCAAGACCCGTGTGCCTCTGTCCCCCCGTGAGTACCGCCAGTACGTGCTGCCCGGTTTCGACGGTTGCAAGGACCTG GCTCGTCAGTCCCGCGGTCTGGGTCTGGGTGCTGCTGACTTCGTCGACGAGGCTGCTCACTCCCACCGTGCTGCTAA CCGTTGGGGCCTGGGCGCTGCTCTGCGTCCCGTGTTCCTGCCCGAGGGTCGTCGTCCTGGTGCTGCTGGTCCCGAGG CTGGCGACGTGCCCACCTGGGCTCGTGTGTTCTGCCGTCACGCTCTGCTCGAGCCCGACCCTGCTGCCGAGCCTCTG GTGCTGCCCCCCGTGGCTGGTCGTTCTGTGGCTCTGTACGCTTCCGCCGACGAGGCTCGCAACGCTCTGCCCCCCAT CCCCCGTGTGATGTGGCCCCCTGGTTTCGGCGCTGCTGAGACCGTCCTCGAGGGTTCCGACGGCACCCGTTTCGTGT TCGGTCACCACGGCGGTTCCGAGCGTCCCTCCGAGACCCAGGCTGGTCGCCAGCGCCGTACCGCTGACGACCGTGAG CACGCTCTCGAGCTGGACGACTGGGAGGTCGGCTGCGAGGACGCTTGGGACTCCGAAGAGGGTGGTGGCGACGACGG TGACGCTCCCGGCTCCTCCTTCGGTGTCTCCATCGTGTCCGTGGCTCCCGGTGTCCTGCGTGACCGTCGTGTGGGTC TGCGTCCTGCTGTGAAGGTGGAGCTGCTGTCCTCCTCTTCCTCTTCTGAGGATGAGGATGACGTGTGGGGTGGTCGT GGTGGTCGCTCCCCCCCTCAGTCCCGTGGTTAA(SEQ ID NO 16)用表達(dá)IE62的重組桿狀病毒以每個(gè)細(xì)胞1-3個(gè)感染性顆粒(pfu)的感染復(fù)數(shù) (MOI)感染約800ml Sf9細(xì)胞(在IL搖瓶中約2xl06個(gè)細(xì)胞/ml)，于27°C在不斷搖動(dòng)的情 況中溫育，然后在感染后約64小時(shí)時(shí)收獲。通過低速離心來除去培養(yǎng)基，并通過6000rpm 高剪切勻漿化(Silverson L4RT-A勻漿器)在25mMTrisCl pH 7. 5,250mM NaCl中溶解細(xì) 胞。離心后，將細(xì)胞溶胞物加載至陰離子交換柱(Fractogel TMAE,Merck KGaA，Germany)， 并用 25mM TrisCl pH 7. 5,500mM NaCl 洗脫。用 S 印hadex G25 (GE Healthcare)層析 柱對洗脫液進(jìn)行緩沖液交換，交換成25mM NaPi pH 7. 5,375mM NaCl0在陽離子交換柱 (FractogelS03-, Merck KGaA, Germany)上加載來自 G25 柱的流過級(jí)分，并用 25mM NaPipH 7. 5,625mM NaCl洗脫。來自S03-柱的洗脫液變成最終產(chǎn)物，即純化的IE62 (圖3B ；第8 道)。結(jié)果。純化的重組IE62具有大于90%的純度(90%prure)，并且含有全長 (150KDa)和約6KDa的小蛋白質(zhì)(p6)兩者。IE62和p6沒有通過大小排阻層析分開并以近 似相等的摩爾量存在。IE62和p6可以形成異二聚物或其它穩(wěn)定的復(fù)合物。實(shí)施例4gE/gl的表達(dá)和純化描述了重組VZV gE/gl受體異二聚物自Sf9昆蟲細(xì)胞的表達(dá)和新的純化方法。gE和gl是表面糖蛋白，并在人和經(jīng)過免疫接種的動(dòng)物中引發(fā)針對VZV的中和性抗體。開發(fā)如 在Sf9昆蟲細(xì)胞中所生成的gE/gl異二聚物的可溶形式和純化方法以分開分泌的蛋白質(zhì)復(fù) 合物與宿主細(xì)胞和桿狀病毒污染物。方法。對桿狀病毒進(jìn)行工程化改造以表達(dá)截短的、經(jīng)過密碼子優(yōu)化的來自VZV Oka 株的gE和gl的基因(參見下文)。gE和gl兩者都被除去了它們的跨膜域和羧基端域。 使用天然的gl信號(hào)肽來制備gl，并用桿狀病毒GP64信號(hào)肽替換gE信號(hào)肽序列。合成該 基因(GeneArt，Germany)，并串聯(lián)地克隆入pFastBacl載體中，其中每個(gè)基因在桿狀病毒多 角體蛋白啟動(dòng)子的控制下(圖4A)。將串聯(lián)的基因盒(gene cassette)轉(zhuǎn)移至AcMNPV桿 狀病毒桿粒(Invitrogen)，然后純化桿粒DNA，并用于轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞。對所得的重組桿狀病毒進(jìn)行噬斑純化，并在Sf9細(xì)胞中制備病毒儲(chǔ)液。gE DeltaTMCTATGGTGTCCGCTATCG
TGCTGTACGTGCTGCTGGCTGCTGCTGCTCACTCCGCTTTCGCTCGTATCACCAACCCCGTGCGTGCTTCCGTGCTG
CGTTACGACGACTTCCACACCGACGAGGACAAGCTGGACACCAACTCCGTGTACGAGCCCTACTACCACTCCGACCA
CGCTGAGTCCTCTTGGGTGAACCGTGGCGAGTCCTCCCGTAAGGCTTACGACCACAACTCCCCCTACATCTGGCCCC
GTAACGACTACGACGGTTTCCTCGAGAACGCTCACGAGCACCACGGTGTCTACAACCAGGGTCGTGGTATCGACTCC
GGCGAGCGTCTGATGCAGCCCACCCAGATGTCCGCTCAGGAGGACCTGGGCGACGACACCGGTATCCACGTGATCCC
CACCCTGAACGGTGACGACCGTCACAAGATCGTGAACGTGGACCAGCGCCAGTACGGTGACGTGTTCAAGGGTGACC
TGAACCCCAAGCCCCAGGGCCAGCGTCTGATCGAGGTGTCCGTGGAGGAGAACCACCCCTTCACCCTGCGTGCTCCC
ATCCAGCGTATCTACGGTGTCCGTTACACCGAGACCTGGTCCTTCCTCCCCTCCCTGACCTGCACCGGTGACGCTGC
TCCCGCTATCCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTCCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGACTGCGCTGAGA
ACACCAAGGAGGACCAGCTGGCTGAGATCTCCTACAGGTTCCAGGGCAAGAAGGAGGCTGACCAGCCCTGGATCGTG
GTGAACACCTCCACCCTGTTCGACGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCCGGTGTCCTGAAGGTGCTGC
GTACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGTGGTTCCGACGGCACCTCCACCTACGCTACCTT
CCTCGTGACCTGGAAGGGTGACGAAAAGACCCGTAACCCCACCCCCGCTGTGACCCCCCAGCCCCGTGGTGCTGAA
TTCCATATGTGGAACTACCACTCTCACGTGTTCTCCGTGGGTGACACCTTCTCCCTGGCTATGCACCTGCAGTACA
AGATCCACGAGGCTCCCTTCGACCTGCTGCTCGAGTGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACCTGCCAGCCCATGCG
CCTGTACTCCACCTGCCTGTACCACCCCAACGCTCCCCAGTGCCTGTCCCACATGAACTCCGGTTGCACCTTCACC
TCCCCCCACCTGGCCCAGCGTGTGGCTTCCACCGTGTACCAGAACTGCGAGCACGCTGACAACTACACCGCTTACT
GCCTGGGTATCAGCCACATGGAGCCTTCCTTCGGTCTGATCCTGCACGACGGTGGCACCACCCTGAAGTTCGTGGA
CACCCCCGAGTCCCTGTCCGGTCTGTACGTGTTCGTGGTGTACTTCAACGGTCACGTGGAGGCTGTCGCTTACACC
GTGGTGTCCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCTATCGAGGAGCGTGGTTTCCCCCCCACCGCTGGCCAGCCCCCTG
CTACCACCAAGCCCAAGGAGATCACCCCCGTCAACCCCGGCACCTCCCCTCTGCTGCGCTAA(SEQ ID NO 17)
gE DeltaTMCTMVSAIVLYVL LAAAAHSAFA RITNPVRASV LRYDDFHTDE DKLDTNSVYEPYYHSDHAES
SffVNRGESSR KAYDHNSPYI WPRNDYDGFL ENAHEHHGVYNQGRGIDSGE RLMQPTQMSA QEDLGDDTGI
HVIPTLNGDD RHKIVNVDQRQYGDVFKGDL NPKPQGQRLI EVSVEENHPF TLRAPIQRIY
GVRYTETWSFLPSLTCTCDA APAIQHICLK HTTCFQDVVV DVDCAENTKE DQLAEISYRFQGKKEADQPff
IVVNTSTLFD ELELDPPEIE PG^KVLRTE KQYLGVYIffNMRGSDGTSTY ATFLVTffKGD EKTRNPTPAV
TPQPRGAEFH MffNYHSHVFSVGDTFSLAMH LQYKIHEAPF DLLLEffLYVP IDPTCQPMRL YSTCLYH
PNAPQCLSHMNSG CTFTSPHLAQ RVASTVYQNC EHADNYTAYC LGISHMEPSFGLILHDGGTT LKFVDTPESL
SGLYVFVVYF NGHVEAVAYT VVSTVDHFVNAIEERGFPPT AGQPPATTKP KEITPVNPGT SPLLR(SEQ
ID NO :18)gl DeltaTMCTATGTTCCTCATCCAGTGCCTGATCTCCGCTGTGATCTTCTACATCCAAGTGA
CCAACGCTCTGATCTTCAAGGGTGACCACGTGTCCCTGCAGGTCAACTOCTCCCTGACCTCCATCCTGATCCCC
ATGCAGAACGACAACTACACCGAGATCAAGGGCCAGCTGGTGTTCATCGGCGAGCAGCTGCCCACCGGCACCAA
CTACTCCGGCACCCTCGAGCTGCTGTACGCTGACACCGTCGCTTTCTGCTTCCGTTCCGTGCAGGTGATCCGTT
ACGACGGTTGCCCCCGTATCCGTACCTCCGCTTTCATCTCCTGCCGTTACAAGCACTCCTGGCACTACGGTAAC
TCCACCGACCGTATCTCCACCGAGCCCGACGCTGGTGTCATGCTGAAGATCACCAAGCCCGGTATCAACGACGC
TGGCGTGTACGTGCTGCTGGTCCGTCTGGACCACTCCCGTTCCACCGACGGTTTCATCCTGGGTGTCAACGTGT
ACACCGCTGGTTCCCACCACAACATCCACGGTGTCATCTACACCTCCCCCTCCCTGCAGAACGGTTACTCCACC
CGTGCTCTGTTCCAGCAGGCTCGTCTGTGCGACCTGCCCGCTACCCCCAAGGGTTCCGGCACCTCCCTCTTCCAGCACATGCTGGACCTGCGTGCTGGCAAGTCCCTCGAGGACAACCCCTGGCTGCACGAGGACGTGGTGACCACCGAGACCAAGTCCGTGGTGAAGGAAGGTATCGAGAACCACGTGTACCCCACCGACATGTCCACCCTGCCCGAGA AGTCCCTGAACGACCCCCCCGAGTAA(SEQ ID NO :19)gl DeltaTMCTMFLIQCLISA VIFYIQVTNA LIFK⑶HVSL QVNSSLTSIL IPMQNDNYTEIKGQLVFIGE QLPTGTNYSG TLELLYADTV AFCFRSVQVI RYDGCPRIRTSAFISCRYKH SffHYGNSTDR ISTEPDAGVM LKITKPGIND AGVYVLLVRLDHSRSTDGFI LGVNVYTAGS HHNIHGVIYT SPSLQNGYST RALFQQARLCDLPATPKGSG TSLFQHMLDL RAGKSLEDNP WLHEDWTTE TKSVVKEGIENHVYPTDMST LPEKSLNDPP E (SEQ ID NO 20)用表達(dá)C末端截短的gE和gl基因的重組桿狀病毒以每ml 1-3個(gè)感染性顆粒 (Pfu)的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染約800ml Sf9細(xì)胞(在IL搖瓶中約2xl06個(gè)細(xì)胞/ml)，于 27°C在不斷搖動(dòng)的情況中溫育，然后在感染后64小時(shí)時(shí)收獲。通過低速離心來除去細(xì) 胞，并收集培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基中的gE/gl 二聚物加載至扁豆凝集素親和柱，并用500mM甲 基-a-D-甘露吡喃糖苷(Marmopyranoside)洗脫糖蛋白。用S印hadex G25柱對來自凝集 素柱的洗脫液進(jìn)行緩沖液交換，交換成25mM TrisCl pH 8.0 50mM NaCl。在用相同緩沖液 平衡的Fractogel TMAE離子交換柱上加載G25層析蛋白質(zhì)峰。gE/gl結(jié)合該柱，并用線性 NaCl梯度將它們洗脫。用Amicon Ultra IOkDa濾器濃縮后，在S印hacryl S200大小排阻 柱上加載所述材料以除去高分子量的污染物。通過SDS-PAGE和Western印跡分析來分析 最終的產(chǎn)物(圖4B)。結(jié)果。在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的全長gE不是糖基化的，并且不結(jié)合扁豆凝集素親 和樹脂，是不溶性的，而且保持與細(xì)胞結(jié)合。C末端胞內(nèi)域(endodomain)和跨膜序列的截短 導(dǎo)致非糖基化的，且可能為變性形式的抗原的分泌(未顯示)。重組gE和gl在Sf9細(xì)胞中 的共表達(dá)產(chǎn)生gE/gl異二聚物，其由于gl的糖基化而結(jié)合凝集素親和柱層析，并可以通過 凝集素親和柱層析來純化。此可溶性VZV糖蛋白復(fù)合物可以誘導(dǎo)中和性和保護(hù)性抗體，并 且是VZV疫苗的一種成分。另外，此異二聚物可以與IE62—起配制以得到卓越的疫苗或抗 原性配制劑。實(shí)施例5gE在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)描述了分泌型VZV gE糖蛋白在人HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。也可以在人或其它哺乳 動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞系中表達(dá)VZV糖蛋白(例如gE、gl或gE/gl、gB)，并且預(yù)期其是完全 糖基化的?？梢允褂眉兓奶堑鞍鬃鳛槔缗c昆蟲細(xì)胞中制備的重組IE62混合的VZV疫 苗的一種成分。方法。經(jīng)由Bam HI和Hind III位點(diǎn)(Invitrogen)將具有GP64信號(hào)肽但除去跨 膜/羧基末端域的VZV gE的編碼序列插入PCDNA3. 1質(zhì)粒中(圖5A)。使用最終的質(zhì)粒來 轉(zhuǎn)染HEK293自由式細(xì)胞(freestyle cell) (Invitrogen和如所描述的)。轉(zhuǎn)染后96小時(shí) 收獲HEK 293自由式細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基。將所述培養(yǎng)基加載在扁豆凝集素親和柱上并用 500mM甲基-α -D-甘露吡喃糖苷洗脫。來自單一扁豆凝集素柱的gE具有大于90 %的純度。結(jié)果。gE蛋白被分泌入培養(yǎng)基中，因?yàn)槠淇缒び虮怀?圖5B)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的gE蛋白具有真實(shí)的糖基化模式。自HEK293細(xì)胞表達(dá)的可溶性gE(約70kDa)與 自昆蟲細(xì)胞表達(dá)的非糖基化gE (約60kDa)相比是重度糖基化的。本文通過提及而收錄所有專利、出版物和專利申請，其程度就像明確且單獨(dú)指明通過提及而收錄每篇單獨(dú)的專利、出版物或所引用的專利申請一樣。僅為了理解的清楚而提供了上述詳細(xì)的說明書，并且不應(yīng)當(dāng)將此理解成不必要的 限制，因?yàn)楦鞣N修飾形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。并不承認(rèn)本文中所提供的 任何信息都是現(xiàn)有技術(shù)或與目前要求保護(hù)的發(fā)明有關(guān)，或者明確或隱含提及的任何出版物 都是現(xiàn)有技術(shù)。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。雖然已經(jīng)描述了本發(fā)明以及其具體的實(shí)施方案，但是可理解的是，其能夠進(jìn)一步 進(jìn)行修飾，并且本申請意圖覆蓋本發(fā)明的任何變化、用途、或改編，它們一般遵循本發(fā)明的 原理，并且包括對本公開內(nèi)容在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或習(xí)慣實(shí)踐之內(nèi)的、且可適用于 上文所列出的和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的本質(zhì)特征的偏離。
權(quán)利要求
一種純化的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)病毒樣顆粒(VLP)，其包含VZV gE，其中所述VLP不包含酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。
2.權(quán)利要求1的VZV-VLP，其中所述VZV-VLP包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的VZV-VLP，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)衍生自病毒、真菌、寄 生物或細(xì)菌或其組合。
4.權(quán)利要求3的VZV-VLP，其中所述病毒蛋白質(zhì)衍生自流感病毒、登革病毒、黃熱病毒、 單純皰疹病毒I或II、副流感病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、人免疫 缺陷病毒、冠狀病毒或肝炎病毒。
5.權(quán)利要求2的VZV-VLP，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表 面上表達(dá)。
6.權(quán)利要求4的VZV-VLP，其中所述來自VZV的蛋白質(zhì)選自下組gl(0RF67)、 gM(0RF50)、gH、gB和間層或其組合。
7.權(quán)利要求6的VZV-VLP，其中所述VZV-VLP包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求1的VZV-VLP，其中所述VLP基本上由gE組成。
9.權(quán)利要求1的VZV-VLP，其中所述VLP衍生自包含克隆的gEVZV的重組表達(dá)系統(tǒng)。
10.一種生成VLP的方法，包括將編碼VZV gE蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并 在容許形成、分離和/或純化VLP的條件下表達(dá)所述VZV gE蛋白，其中所述宿主細(xì)胞不包 含酵母Ty蛋白，并且所述VLP不包含VZV核酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述VZV-VLP包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)衍生自病毒、真菌、寄生 物或細(xì)菌或其組合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述病毒蛋白質(zhì)衍生自流感病毒、登革病毒、黃熱病毒、 單純皰疹病毒I或II、副流感病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、人免疫 缺陷病毒、冠狀病毒或肝炎病毒。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面 上表達(dá)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述來自VZV的蛋白質(zhì)選自下組gI(ORF67)、 gM(0RF50)、gH、gB和間層或其組合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述VZV-VLP包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述VLP基本上由gE組成。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自下組酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物、禽類或哺 乳動(dòng)物細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述昆蟲細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
21.一種抗原性配制劑，其包含VZV-VLP，其中所述VLP-VLP包含VZV gE且其中所述 VLP不包含酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。
22.權(quán)利要求21的抗原性配制劑，其中所述VZV-VLP包含至少一種來自感染原的另外 的蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的抗原性配制劑，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)衍生自病毒、 真菌、寄生物或細(xì)菌或其組合。
24.權(quán)利要求23的抗原性配制劑，其中所述病毒蛋白質(zhì)衍生自流感病毒、登革病毒、 黃熱病毒、單純皰疹病毒I或II、副流感病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病 毒、人免疫缺陷病毒、冠狀病毒或肝炎病毒。
25.權(quán)利要求22的抗原性配制劑，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)在所述 VZV-VLP的表面上表達(dá)。
26.權(quán)利要求24的抗原性配制劑，其中所述來自VZV的蛋白質(zhì)選自下組gI(0RF67)、 gM(0RF50)、gH、gB和間層或其組合。
27.權(quán)利要求26的抗原性配制劑，其中所述VZV-VLP包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求21的抗原性配制劑，其中所述VLP基本上由gE組成。
29.權(quán)利要求21的抗原性配制劑，其中所述抗原性配制劑包含佐劑或免疫刺激劑。
30.權(quán)利要求21的抗原性配制劑，其中所述配制劑是通過口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹 膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下向脊椎動(dòng)物施用的。
31.一種疫苗，其包含VZV-VLP，其中所述VLP-VLP包含VZV gE且其中所述VLP不包含 酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。
32.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述VZV-VLP包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的疫苗，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)衍生自病毒、真菌、寄生 物或細(xì)菌或其組合。
34.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述病毒蛋白質(zhì)衍生自流感病毒、登革病毒、黃熱病毒、 單純皰疹病毒I或II、副流感病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、人免疫 缺陷病毒、冠狀病毒或肝炎病毒。
35.權(quán)利要求32的疫苗，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的表面 上表達(dá)。
36.權(quán)利要求34的疫苗配制劑，其中所述來自VZV的蛋白質(zhì)選自下組gl(ORF67)、 gM(0RF50)、gH、gB和間層或其組合。
37.權(quán)利要求36的疫苗，其中所述VZV-VLP包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
38.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述VLP基本上由gE組成。
39.權(quán)利要求32的疫苗，其中所述疫苗是與佐劑或免疫刺激劑一起配制的。
40.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述疫苗是通過口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈 內(nèi)或皮下向脊椎動(dòng)物施用的。
41.一種在人或動(dòng)物中引發(fā)針對感染的保護(hù)性免疫的方法，包括給所述人或動(dòng)物施用 包含VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述VLP-VLP包含VZV gE且其中所述VLP不包 含酵母Ty蛋白，并且不包含VZV核酸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述感染是由病毒、真菌、寄生物或細(xì)菌或其組合引起的。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述VZV-VLP包含至少一種來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)衍生自病毒、真菌、寄生 物或細(xì)菌或其組合。
45.權(quán)利要求44的VZV-VLP，其中所述病毒蛋白質(zhì)衍生自流感病毒、登革病毒、黃熱病 毒、單純皰疹病毒I或II、副流感病毒、水痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、人 免疫缺陷病毒、冠狀病毒或肝炎病毒。
46.權(quán)利要求43的VZV-VLP，其中所述來自感染原的另外的蛋白質(zhì)在所述VZV-VLP的 表面上表達(dá)。
47.權(quán)利要求45的VZV-VLP，其中所述來自VZV的蛋白質(zhì)選自下組gl(0RF67)、 gM(0RF50)、gH、gB和間層或其組合。
48.權(quán)利要求47的VZV-VLP，其中所述VZV-VLP包含來自感染原的另外的蛋白質(zhì)。
49.權(quán)利要求41的VZV-VLP，其中所述VLP基本上由gE組成。
50.權(quán)利要求41的VZV-VLP，其中所述VLP衍生自包含克隆的gEVZV的重組表達(dá)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)病毒樣顆粒(VLP)，其包含VZV的糖蛋白E。本發(fā)明還公開了VZV-VLP的疫苗配制劑和在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)A61K39/245GK101801412SQ200880108051
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者彼得·普什科, 蓋爾·史密斯 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司