專利名稱：分離的細胞群的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及具有出色的向組織遷移能力和植活能力的細胞群，含有所述細胞的藥 物制備物，以及所述細胞的移植方法。
背景技術(shù)：
由于進行細胞療法最主要的目的是治療受損的組織，因此已經(jīng)進行了使用造血干 細胞或造血祖細胞的移植。此外，已經(jīng)報道在活體的各種不同的組織和器官中存在成年組 織干細胞和祖細胞，使用它們的治療也已被嘗試。成年組織干細胞是在各種不同的活體組織中存在的干細胞。據(jù)認為，這些細胞具 有自我更新能力和分化能力，有助于保持組織的穩(wěn)態(tài)。干細胞增殖并維持在組織中。同時， 干細胞僅具有非常有限的增殖能力，以至于干細胞分化成祖細胞，其中分化的方向是固定 的，并進一步分化成具有特定功能的組織細胞。例如，造血干細胞在成年人中主要存在于骨 髓組織中，并分化成造血祖細胞。通過它的進一步分化，造血干細胞成熟成為所有類型的血 細胞，例如紅細胞、白細胞、血小板和淋巴細胞。通過這種方式，血細胞通過造血干細胞進行 的生產(chǎn)得以維持。造血干細胞移植是一種治療性方法，其中為了增加抗腫瘤效果，進行了高強度治 療(移植前治療)，使用超過骨髓的最大耐受劑量的大量抗腫瘤藥劑或全身輻射照射，這 導致惡性腫瘤與患者的骨髓一起完全破壞，然后通過輸入源自于同種異體供體或患者自身 (自體)的事先低溫保存的造血干細胞，使造血能力得到恢復。造血干細胞移植根據(jù)收集造 血干細胞的方法分類為骨髓移植、外周血干細胞移植和臍帶血移植，根據(jù)造血干細胞的來 源進一步分類為同種異體移植和自體移植。進行移植，例如骨髓移植、臍帶血移植、外周血 干細胞移植等，不僅用于治療血液腫瘤例如白血病、淋巴瘤等，而且可用于治療嚴重疾病例 如實體癌、自身免疫疾病等。此外，已經(jīng)嘗試了通過細胞移植治療患病組織，其中不僅使用造血干細胞和造血 祖細胞，而且使用了包括間充質(zhì)干細胞和血管內(nèi)皮祖細胞的骨髓細胞，包含了通過粒細胞 集落刺激因子(G-CSF)等而從骨髓移動到外周血的各種不同干細胞和祖細胞的細胞群，臍 帶血衍生的干細胞和祖細胞，以及從骨髓、脂肪組織分離的間充質(zhì)干細胞等。已經(jīng)檢查了通 過向患者移植這些細胞，對許多疾病進行治療的可能性，這些疾病例如為移植物抗宿主病 (GVHD)，Crohn' s病，心肌梗塞，骨質(zhì)疏松，腦梗塞，肝炎，肺炎，糖尿病，脊髓損傷，腎炎，骨 折，下肢局部缺血等(參見非專利參考文獻1到12)。如上所述，根據(jù)供體細胞的不同，造血干細胞移植分類為骨髓移植、外周血移植和 臍帶血移植。近年來，移植、特別是臍帶血移植的病例數(shù)不斷增加，這是由于它具有各種不 同的優(yōu)點，臍帶血可以容易地使用而不對其供體構(gòu)成負擔，因為它原本是廢物，即使在組織 相容性抗原匹配程度低的情況下也能夠移植臍帶血，并且由于制備了臍帶血庫，執(zhí)行緊急 措施也是可能的(參見非專利參考文獻13)。但是，因為臍帶血中細胞的數(shù)量少，臍帶血移 植的缺點在于它移植的目標主要是兒童，不適合于成人(參見非專利參考文獻14)。此外，與骨髓移植和外周血移植相比，臍帶血移植的移植結(jié)果不佳，這是因為移植后植活不足，以 及血小板和嗜中性粒細胞恢復的延遲(參見非專利參考文獻13和15)。對于骨髓和臍帶血 造血干細胞移植的臨床結(jié)果來說，已知當被移植的造血干細胞(CD 34陽性細胞)的數(shù)量大 時，存活率高，血小板和嗜中性粒細胞恢復快(參見非專利參考文獻16到18)。因此，在移 植領域中，需要保持大量的造血干細胞，并實現(xiàn)造血干細胞的有效植活，預計能夠解決這些 問題的技術(shù)和產(chǎn)品將改進造血干細胞的移植結(jié)果，并有助于挽救生命、降低醫(yī)療費用和提 高患者的生活品質(zhì)。在成體中，造血干細胞通過在骨髓組織中重復其增殖和分化來維持造血系統(tǒng)。移 植的造血干細胞最后經(jīng)外周血通往骨髓并植入骨髓內(nèi)部。這種遷移到某個組織并在其中植 活的方式被稱為歸巢(homing)。造血干細胞與骨髓血管的相互作用，對于造血干細胞向骨 髓的歸巢是重要的。這種相互作用發(fā)生在造血干細胞引起滾動和附著在骨髓血管內(nèi)皮細 胞上的步驟中，作為這種相互作用的結(jié)果，造血干細胞通過血管內(nèi)皮細胞并遷移到骨髓內(nèi) 部。滾動和附著由造血干細胞和骨髓血管內(nèi)皮細胞上的黏附分子控制。已知E-選擇蛋白和 P-選擇蛋白，作為在骨髓血管內(nèi)皮細胞中表達的與造血干細胞的植活相關(guān)的分子，是重要 的(參見非專利參考文獻19)。另一方面，在造血干細胞中表達的兩種或兩種以上黏附分子 作為糖蛋白出現(xiàn)。作為P-選擇蛋白的配體，已知的有P-選擇蛋白糖蛋白配體-l(PSGL-l) (參見非專利參考文獻20到23)。作為E-選擇蛋白的配體，已知的有ci-4整合蛋白(參見 非專利參考文獻24)、CD 44 (參見非專利參考文獻25)和E-選擇蛋白配體_1 (ESL-1)(參 見非專利參考文獻26)。通過這些核心蛋白上的a2，3_唾液酸化和al，3_巖藻糖基化而 形成的唾液酸基路易斯X糖鏈，起到了選擇蛋白配體的功能。催化a 1，3-巖藻糖基化的酶被稱為a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FT)，在人類中已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了 6 禾中(FT 3，F(xiàn)T 4，F(xiàn)T 5，F(xiàn)T 6，F(xiàn)T 7 禾口 FT 9)。其中，F(xiàn)T 4,FT 7 禾口 FT 9 在血細胞中 的表達已被證實。每種FT具有不同的酶反應性，通過FT 7的巖藻糖基化只形成唾液酸基 路易斯(Lewis)X糖鏈，但是通過FT 6的巖藻糖基化，除了唾液酸基路易斯X糖鏈之外，還 形成了路易斯X糖鏈。盡管路易斯X糖鏈表達在血細胞例如單核細胞、粒細胞等中，但是它 不具有作為選擇蛋白配體的功能。到目前為止，關(guān)于上面提到的6種FT的表達區(qū)域、表達 控制機制、反應特異性等，還沒有被足夠地揭示(參見非專利參考文獻27)。已經(jīng)報道了通過用FT離體處理造血干細胞和添加唾液酸基路易斯X糖鏈增加 選擇蛋白配體的量的方法。Xia等證實，當用FT 6處理細胞系時，唾液酸基路易斯X糖鏈 增加了，與E-選擇蛋白和P-選擇蛋白的結(jié)合能力增加了(參見非專利參考文獻28)。此 外，Hindalgo等提出了一種可能性，即PSGL-1的翻譯后修飾是重要的，因為臍帶血衍生的 CD 34陽性細胞表達PSGL-1，但是不具有與P-選擇蛋白的結(jié)合能力(參見非專利參考文獻 29)。此外，已知用FT 6處理的臍帶血衍生的⑶34陽性細胞具有增加的唾液酸基路易斯 X糖鏈，增加的與E-選擇蛋白和P-選擇蛋白的結(jié)合能力，增強的骨髓血管內(nèi)皮細胞和所述 CD34陽性細胞在移植中的相互作用(滾動和停滯)(參見專利參考文獻1)。但是，已發(fā)現(xiàn) 所述細胞向骨髓的歸巢效率沒有提高。已經(jīng)提出，盡管通過添加唾液酸基路易斯X糖鏈增 加了它與血管內(nèi)皮細胞的相互作用，并且通過FT 6增加了它與E-選擇蛋白和P-選擇蛋白 的結(jié)合能力，但對歸巢步驟以及其后遷移和植活到骨髓內(nèi)部沒有影響(參見非專利參考文 獻30)。另一方面，Xia等報道，在類似用FT 6處理的源自人類臍帶血的單核細胞移植試驗
6中，在移植后6周，骨髓中人類血細胞的比率s~Dli了大約2倍(參見非專利參考文獻3l和專利參考文獻2)。[OOl0] 此外，報道了通過離體F／6處理間充質(zhì)干細胞添加唾液酸基路易斯X糖鏈來t~Dli選擇蛋白配體的量的方法。在F／6處理的間充質(zhì)干細胞的移植試驗中，觀察到了遷移到骨髓中的間充質(zhì)干細胞數(shù)量的增加(參見非專利參考文獻32)。[OOl、] 此外，報道了通過離體F／6處理神經(jīng)干細胞添加唾液酸基路易斯X糖鏈來增加選擇蛋白配體的量的方法(參見專利文獻3)。[OOl2] 盡管已有上述的這些報道，但關(guān)于FT的種類和特異性的差異對造血干細胞的歸巢能力的影響，尚無了解。此外，對于路易斯X糖鏈的表達對干細胞向骨髓組織等的遷移能力和植活能力的影響，完全沒有了解。此外，對于作為一種o l，3一巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FT 7對造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞等向組織的遷移能力和植活能力的影響，尚無了解。[OOl 3] 專利參考文獻lWO 2005／017115[OOl 4] 專利參考文獻2WO 2004／0946 19[OOl 5] 專利參考文獻3US2008／0044383[OOl 6] 非專利參考文獻lSaishin Igaku，Gendai Iryo no Saizensen，ExtraIssue，March，2003，Saishin Igaku Company[OOl 7] 非專利參考文獻2Igaku no Ayumi，v01．217，No．5，2006，工shiyakuPub．Inc．[OOl 8] 非專利參考文獻3Current Opinion in工nVeStigati。nal Drugs，工，473—8 l(2006)[OOl9] 非專利參考文獻4Stem Cells，24，2292—2298(2006)
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明待解決的問題當在各種不同細胞例如造血干細胞、造血祖細胞等的移植中，可以獲得移植的細 胞向骨髓和損傷組織的出色遷移和植活的情況下，可以期望使用較少細胞獲得治療效果， 并可以期望不僅改進治療效果，而且解決了上面提到的問題。本發(fā)明的目的是提供具有出色的向組織遷移能力和植活能力的細胞群，含有所述 細胞群的藥物制備物，以及所述細胞群的移植方法。解決問題的手段本發(fā)明涉及下列(1)到(49)(1)分離的細胞群，其中表達了唾液酸基路易斯X糖鏈，路易斯X糖鏈基本上不表 達。(2) (1)的細胞群，通過細胞分級處理獲得。(3) (1)或(2)的細胞群，通過在存在巖藻糖供體的情況下用a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶處理細胞來獲得。(4) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7。(5) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ ID NO 1的氨基酸序列 構(gòu)成的多肽。(6) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由與由SEQ ID NO 1的氨基酸序 列構(gòu)成的多肽具有60%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn) 移酶活性。(7) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由其中在SEQ IDN0:1的氨基酸序 列中至少一個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有a 1，3-巖藻糖基 轉(zhuǎn)移酶活性。(8) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ ID NO 2的核苷酸序列 構(gòu)成的DNA編碼的多肽。(9) (3)的細胞群，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼的多肽，并且也是具有a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。(10) (1)到(9)任一項的細胞群，其中細胞是干細胞或祖細胞。(11) (10)的細胞群，其中干細胞或祖細胞是造血干細胞或造血祖細胞。(12) (11)的細胞群，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陽性造血干細胞或 ⑶34-陽性造血祖細胞。(13) (12)的細胞群，其中⑶34-陽性造血干細胞是⑶38-陰性造血干細胞。(14) (11)的細胞群，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陰性和譜系陰性造 血干細胞或⑶34-陰性和譜系陰性造血祖細胞。(15) (10)的細胞群，其中干細胞是間充質(zhì)干細胞。(16) (10)的細胞群，其中干細胞或祖細胞是神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞。(17) (16)的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是巢蛋白(Nestin)陽性神經(jīng) 干細胞或巢蛋白陽性神經(jīng)祖細胞。(18) (16)的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Sox2-陽性神經(jīng)干細胞或 Sox2-陽性神經(jīng)祖細胞。(19) (16)的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Musashil-陽性神經(jīng)干細胞 或Musashi 1-陽性神經(jīng)祖細胞。(20) (16)的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是CD34-陽性神經(jīng)干細胞或 ⑶34-陽性神經(jīng)祖細胞。(21) (16)的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是CD133-陽性神經(jīng)干細胞或 ⑶133-陽性神經(jīng)祖細胞。(22) (1)到(21)任一項的細胞群，其中細胞是源自人類的細胞。(23) (1)到(22)任一項的細胞群，其中細胞是源自于選自骨髓、脾臟、臍帶血、外 周血、脂肪組織和神經(jīng)組織的組織的細胞。(24)藥物制備物，含有(1)到(23)任一項的細胞群。(25)移植細胞群的方法，包括向活體施加(1)到(23)任一項的細胞群。(26)用于產(chǎn)生表達唾液酸基路易斯X糖鏈、但是基本上不表達路易斯X糖鏈的細 胞的方法，包括通過分級處理獲得細胞。(27)用于生產(chǎn)表達唾液酸基路易斯X糖鏈、但是基本上不表達路易斯X糖鏈的細 胞的方法，包括在存在巖藻糖供體的情況下通過用a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶處理來獲得細 胞。(28) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7。(29) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ IDN0 1的氨基酸序 列構(gòu)成的多肽。(30) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由與由SEQID NO 1的氨基 酸序列構(gòu)成的多肽具有60%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有a 1，3_巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。(31) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由其中在SEQ ID N0:1的氨 基酸序列中至少一個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有a 1，3_巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
(32) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ IDN0 2的核苷酸序 列構(gòu)成的DNA編碼的多肽。(33) (27)的生產(chǎn)方法，其中a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，是由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼，并且也具有a 1， 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。(34) (26)到(33)任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是干細胞或祖細胞。(35) (34)的生產(chǎn)方法，其中干細胞或祖細胞是造血干細胞或造血祖細胞。(36) (35)的生產(chǎn)方法，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陽性造血干細胞 或⑶34-陽性造血祖細胞。(37) (36)的生產(chǎn)方法，其中⑶34-陽性造血干細胞是⑶38-陰性造血干細胞。(38) (35)的生產(chǎn)方法，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陰性和譜系陰性 造血干細胞或⑶34-陰性和譜系陰性造血祖細胞。(39) (34)的生產(chǎn)方法，其中干細胞是間充質(zhì)干細胞。(40) (34)的生產(chǎn)方法，其中干細胞或祖細胞是神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞。(41) (40)的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是巢蛋白陽性神經(jīng)干細胞或 巢蛋白陽性神經(jīng)祖細胞。(42) (40)的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Sox2-陽性神經(jīng)干細胞或 Sox2-陽性神經(jīng)祖細胞。(43) (40)的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Musashil-陽性神經(jīng)干細 胞或Musashi 1-陽性神經(jīng)祖細胞。(44) (40)的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是⑶34-陽性神經(jīng)干細胞或 ⑶34-陽性神經(jīng)祖細胞。(45) (40)的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是⑶133-陽性神經(jīng)干細胞 或⑶133-陽性神經(jīng)祖細胞。(46) (26)到(45)任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是源自人類的細胞。(47) (26)到(46)任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是源自于選自骨髓、脾臟、臍帶血、 外周血、脂肪組織和神經(jīng)組織的組織的細胞。(48)藥物制備物，含有通過(26)到(47)任一項的生產(chǎn)方法獲得的細胞。(49)用于移植細胞的方法，包括向活體施加通過(26)到(47)任一項的生產(chǎn)方法 獲得的細胞。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了具有出色的向組織遷移能力和植活能力的細胞群，含有所述 細胞群的藥物制備物，以及所述細胞群的移植方法。本發(fā)明的細胞群可用于恢復損傷的組
幺口絕 云/、寸o


圖1是顯示了從臍帶血單核細胞分離的CD34-陽性細胞的FACS分析結(jié)果的圖。分 離的⑶34細胞的純度是95%或以上。一組⑶34-陽性、⑶-38陰性的細胞，作為人類造血 干細胞，被門控(gated)到左側(cè)圖的A中并進行分析。
圖2是顯示用FT 6或FT 7處理的人類造血干細胞(⑶34-陽性⑶-38陰性細胞) 的唾液酸基路易斯X糖鏈和路易斯X糖鏈的表達量與未處理細胞的表達量的比較結(jié)果的 圖。唾液酸基路易斯X糖鏈的表達量顯示在A、C和E中，路易斯X糖鏈的表達量顯示在B、 D禾口 F中。圖3是顯示了用FT 6或FT 7處理的人類造血干細胞(⑶34-陽性⑶-38陰性細 胞)的選擇蛋白結(jié)合能力與未處理細胞的結(jié)合能力的比較結(jié)果的圖。作為陰性對照，顯示 了用⑶40-Fc嵌合蛋白處理的細胞的分析結(jié)果。圖4是顯示了用FT 6或FT 7處理的人類造血干細胞(⑶34-陽性⑶-38陰性細 胞)的骨髓遷移能力與未處理細胞的遷移能力的比較結(jié)果的圖。在右側(cè)圖中顯示了移植12 到18小時后，遷移到N0D/SCID小鼠的骨髓的人類造血干細胞(⑶45-陽性⑶-34陽性細 胞)的FACS分析的例子。圖5是顯示了用FT 6或FT 7處理的人類造血干細胞(⑶34-陽性⑶-38陰性細 胞)在骨髓中的人類血細胞植活比率與未處理細胞的植活比率的比較結(jié)果的圖。它顯示 了在移植8到9周后，人類血細胞植入到N0D/SCID小鼠的骨髓中。通過門顯示的人類⑶ 45-陽性細胞表示人類血細胞，小鼠⑶45-陽性細胞表示小鼠血細胞。圖6顯示了用FT 6或FT 7處理的人類造血干細胞(⑶34-陽性⑶-38陰性細胞) 在骨髓中的人類血細胞植活比率與未處理細胞的植活比率的比較結(jié)果的圖。它顯示了在移 植8到9周后，人類血細胞植入到N0D/SCID小鼠的骨髓中?？v坐標軸是人類血細胞植活比 率(人類血細胞比率)的對數(shù)表示?？v坐標軸的值顯示了人類血細胞的比率(％ )的平均 值 士 SD。圖7顯示了通過流式細胞術(shù)分析酶未處理的或FT 7處理的人類間充質(zhì)干細胞 (hMSC)的結(jié)果?！盁o抗體”顯示了沒有用抗體處理的hMSC的分析結(jié)果，“抗唾液酸基路易斯 X抗體”顯示了用抗唾液酸基路易斯X糖鏈抗體處理、然后用FITC標記的抗小鼠IgG抗體 作為第二抗體處理的hMSC的分析結(jié)果，“抗路易斯X抗體”顯示了用FITC標記的抗人類⑶ 15抗體處理的hMSC的分析結(jié)果?？v坐標軸顯示細胞數(shù)量，橫坐標軸顯示熒光強度。圖8是下述試驗的結(jié)果將FT 7酶處理的hMSC或未處理的hMSC(陰性對照) 以1X105個細胞的劑量(對于每組來說，n = 5)移植到小鼠四氯化碳肝病模型中；24小 時后提取肝臟并用膠原酶處理它；將這樣獲得的細胞用生物素標記的小鼠譜系組(Mouse Lineage Panel)處理；然后用PerCP標記的鏈親和素和PE標記的抗人類⑶90抗體處理 它們；然后通過流式細胞術(shù)分析獲得的細胞。計算了每大約1. 5X106個肝細胞中PE陽性 細胞的數(shù)量，作為移植的hMSC向肝臟的遷移比率(％ )?？v坐標軸的值顯示了每個個體中 遷移比率的平均值士SD。圖9是通過下列實驗獲得的結(jié)果分別將5X105個細胞的FT7酶處理的hMSC或未 處理的hMSC(陰性對照)移植到小鼠四氯化碳肝病模型中(對于每組來說，n = 6) ；18小 時后提取肝臟并用膠原酶處理它；將這樣獲得的細胞，在用PE_Cy7標記的鏈親和素、FITC 標記的抗小鼠⑶45抗體、FITC標記的抗小鼠Ter 119抗體和PE標記的抗人類⑶90抗體 處理它們后，通過流式細胞術(shù)進行分析。計算了每IX 106個肝細胞中PE陽性細胞的數(shù)量， 作為向肝臟遷移的hMSC的數(shù)量?？v坐標軸的值顯示了每個個體中遷移細胞數(shù)量的平均值 士 SD。
圖10是通過下列實驗獲得的結(jié)果分別將5X 105個細胞的FT 7酶處理的hMSC 或未處理的hMSC(陰性對照)或溶劑(PBS)施加到小鼠四氯化碳肝病模型中(對于每組來 說，n = 6)，并在18小時后通過Fuji Dry Chem測量血液生物化學參數(shù)[(A)總膽紅素，(B) AST, (C)ALT，(D)ALP，(E)LDH]?？v坐標軸的值顯示了每個個體中值的平均值士SD。圖11是通過下列實驗獲得的結(jié)果分別將5X105個細胞的FT 7酶處理的hMSC或 未處理的hMSC(陰性對照)移植到小鼠四氯化碳肺病模型中(對于每組來說，n = 5)；在18 小時后提取肺，并用膠原酶_彈性蛋白酶處理它們；將這樣獲得的細胞，在用PE_Cy7標記的 鏈親和素、FITC標記的抗小鼠⑶45抗體、FITC標記的抗小鼠Ter 119抗體和PE標記的抗 人類⑶90抗體處理它們后，通過流式細胞術(shù)進行分析。計算了每IX 105個肺細胞中PE陽 性細胞的數(shù)量，作為向肺遷移的hMSC的數(shù)量?？v坐標軸的值顯示了每個個體中遷移細胞數(shù) 量的平均值士 SD。圖12是用FT7處理的神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞的唾液酸基路易斯X糖鏈和路易 斯X糖鏈表達量與未處理細胞的情況下比較的結(jié)果。圖13是顯示了用FT7處理的神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞對各種不同種類的選擇蛋 白的結(jié)合能力與未處理細胞的情況下比較的結(jié)果的圖。本發(fā)明的最佳實施方案1.本發(fā)明的細胞本發(fā)明的細胞群，可以通過從含有表達唾液酸基路易斯X糖鏈但是基本上不表達 路易斯X糖鏈的細胞進行分離來制備。盡管含有本發(fā)明的細胞群的細胞可以是任何細胞， 只要它們含有本發(fā)明的細胞群就行，但理想情況下其中包含干細胞或祖細胞。就此而言，術(shù)語“基本上不表達路易斯X糖鏈”，是指路易斯X糖鏈陰性或相當于陰 性，其程度與唾液酸基路易斯X糖鏈的表達相比明顯較低。它還意味著路易斯X糖鏈的表 達與沒有人工表達路易斯X糖鏈時具有相同的表達水平。盡管含有本發(fā)明的細胞群的細胞可以是任何動物來源的細胞，但人類來源的細 胞、非人類靈長類來源的細胞、牛來源的細胞、馬來源的細胞、豬來源的細胞、綿羊來源的細 胞、山羊來源的細胞、狗來源的細胞、貓來源的細胞或嚙齒動物來源的細胞是優(yōu)選的；人類 來源的細胞或非人類靈長類來源的細胞是更優(yōu)選的；人類來源的細胞是進一步更加優(yōu)選 的。此外，盡管含有本發(fā)明的細胞群的細胞可以是源自任何組織的細胞，但源自骨髓的細 胞、源自脾臟的細胞、源自臍帶血的細胞、源自外周血的細胞、源自脂肪組織的細胞或源自 神經(jīng)組織的細胞是優(yōu)選的；源自骨髓的細胞、源自臍帶血的細胞、源自外周血的細胞或源自 脂肪組織的細胞是更優(yōu)選的；源自骨髓的細胞或源自臍帶血的細胞是進一步更加優(yōu)選的。干細胞的例子優(yōu)選包括造血干細胞、間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞。造血干細胞的 例子包括⑶34-陽性造血干細胞、⑶34-陽性⑶38-陰性造血干細胞、⑶34-陰性譜系 陰性造血干細胞等。神經(jīng)干細胞的例子包括⑶34-陽性神經(jīng)干細胞、⑶133-陽性神經(jīng)干 細胞、巢蛋白(Nestin)-陽性神經(jīng)干細胞、Sox2_陽性神經(jīng)干細胞、Musashil-陽性神經(jīng)干細 胞等。祖細胞的例子包括造血祖細胞、神經(jīng)祖細胞等。造血祖細胞的例子包括⑶34-陽 性造血祖細胞、⑶34-陰性譜系陰性造血祖細胞等。神經(jīng)祖細胞的例子包括⑶-34陽性 神經(jīng)祖細胞、⑶133-陽性神經(jīng)祖細胞、巢蛋白-陽性神經(jīng)祖細胞、Sox2-陽性神經(jīng)祖細胞、Musashil-陽性神經(jīng)祖細胞等。在從動物個體回收這些細胞后，它們也可以通過培養(yǎng)進行增殖。此外，可以使用剛 剛回收后的細胞群，或者可以使用保存處理、例如冷凍等后的細胞，或細胞分級處理或酶處 理后的細胞群。本發(fā)明的細胞，在它們結(jié)合E-選擇蛋白的能力、向活體組織遷移的能力和植入到 活體組織中的能力方面非常出色，因此它們可用于造血干細胞移植，以及使用干細胞移植 恢復損傷組織。本發(fā)明的細胞向其遷移和植入的活體組織的例子包括骨髓組織或損傷組織。骨髓 組織的例子包括經(jīng)歷化療或放療的患者的骨髓組織。損傷組織的例子包括損傷的腦、心臟、 肺、腸道、腎臟、胰臟、肝臟、皮膚、血管等組織。2.本發(fā)明的細胞的制備方法制備用于本發(fā)明的細胞群的方法，可以是任何可以分離其中表達唾液酸基路易斯 X糖鏈但基本上不表達路易斯X糖鏈的細胞群的方法。具體方法的例子包括通過細胞分級 處理的制備方法，在存在巖藻糖供體的情況下用a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進行處理的方法寸。通過細胞分級處理的制備方法的例子，包括通過分辨唾液酸基路易斯X糖鏈與路 易斯X糖鏈來回收所需細胞的方法等。所述方法的例子包括了使用能夠識別唾液酸基路易 斯X糖鏈和路易斯X糖鏈的抗體的方法，使用了微珠和磁體的方法，使用其上固定化有抗體 的載體制備的柱子的方法等。使用能夠識別唾液酸基路易斯X糖鏈和路易斯X糖鏈的抗體的方法的例子包括這 樣的方法，即允許能夠識別相應糖鏈的抗體與細胞反應，然后通過細胞分揀器回收顯示出 唾液酸基路易斯X糖鏈的高表達和路易斯X糖鏈的低表達的細胞群。具有高表達的細胞群， 是指與陰性對照細胞群相比顯示出較高熒光強度的細胞群。陰性對照的例子包括使用同種 型對照抗體反應的細胞群。具有低表達的細胞群，是指與陽性對照相比顯示出較低熒光強 度的細胞群。在例如血細胞的情況下，陽性對照的例子包括與抗CD 45抗體反應的細胞群。使用微珠和磁體的方法的例子包括其中路易斯X糖鏈陽性細胞級份被移除、然后 回收唾液酸基路易斯X糖鏈陽性細胞級份的方法，或其中唾液酸基路易斯X糖鏈陽性細胞 級份被回收、然后回收路易斯X糖鏈陰性細胞級份的方法，等等。在存在巖藻糖供體的情況下用a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進行處理的方法的例子， 包括在存在巖藻糖供體的情況下將a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶添加到細胞中的方法，將細胞 在保留a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的柱子、盤、包或注射器中進行處理的方法，等等。此外，細 胞可以使用轉(zhuǎn)染了 a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的細胞系或其提取物進行處理。對于a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶來說，a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7是優(yōu)選的。人類 a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7的例子包括由SEQ ID NO :1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。此外， a 1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可以是由與由SEQ IDN0 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有60 %或以 上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并且也具有1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，由其中在SEQ IDN0 1的氨基酸序列中至少一個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成、并且也具 有a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，由SEQ ID NO 2的核苷酸序列構(gòu)成的DNA編碼的多 肽，或由在嚴緊條件下與由SEQ IDN0 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼、并且也具有a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。此外，當細胞使用轉(zhuǎn)染了 a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的細胞系或其提取物 進行處理時，使用的基因可以是編碼人類al，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7的基因，由與由SEQ ID NO 1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有60%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并且也具有1， 3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的編碼基因，由其中在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中至少一 個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成、并且也具有a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性 的多肽的編碼基因，或是在嚴緊條件下與由SEQ IDN0 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列 構(gòu)成的DNA雜交的DNA，并且也編碼具有a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因。根據(jù)本發(fā)明，與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有60%或以上同源性、并且也具 有的a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，是指當使用分析軟件例如BLAST[J.Mol.Biol.， 215,403(1990)1、FASTA[Methods inEnzymology,183,63 (1990)]等進行計算時，與由 SEQ ID N0:1的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有至少60%或以上，優(yōu)選70%或以上，更優(yōu)選80%或 以上，更優(yōu)選90%或以上，特別優(yōu)選95%或以上，最優(yōu)選97%或以上的同源性的多肽。根據(jù)本發(fā)明，由其中在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中至少一個氨基酸被缺失、 取代、插入和/或添加的氨基酸序列構(gòu)成、并且也具有a 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的 蛋白，包括可以通過使用定點突變在具有SEQID N0:1的氨基酸序列的蛋白的編碼DNA 中導入定點突變來獲得的蛋白，使用的定點突變方法描述在例如《分子克隆》(第二 版)(MolecularCloning, 2nd edition)，《分子生物學現(xiàn)代方法》(Current Protocols inMolecular Biology), Nucleic Acids Research,10,6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79,6409(1982)，Gene,34'315(1985)，Nucleic AcidsResearch,13,4431(1985)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,488 (1985)等中。盡管被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的數(shù) 量是一個或多個，并且對于數(shù)量沒有具體的限制，但數(shù)量的程度應該使得通過常規(guī)的已知 技術(shù)、例如上面提到的定點突變技術(shù)等，可以將它們?nèi)笔?、取代或添加。例如，它是?到數(shù) 十個，優(yōu)選從1到20，更優(yōu)選從1到10，進一步優(yōu)選為1到5。根據(jù)本發(fā)明，在嚴緊條件下雜交的DNA，是指這樣的DNA，例如具有SEQ ID NO 2 的核苷酸序列的DNA，或可以使用其部分片段作為探針，通過菌落雜交、噬斑雜交、Southern 印跡雜交等獲得的DNA。其具體的例子是可以通過下述方法鑒定的DNA，即使用其上固定 化有源自于菌落或噬斑的DNA分子的濾膜，在65°C下，在存在0. 7到1. 0mol/l氯化鈉的情 況下進行雜交，然后在65°C下使用0. 1到2倍濃度的SSC溶液(1XSSC溶液的組合物由 150mmol/l氯化鈉和15mmol/l檸檬酸鈉組成)清洗濾膜。雜交可以按照在下述文獻中描 述的方法來進行《分子克隆第二版》(Molecular Cloning, 2nd edition)，《分子生物學現(xiàn) 代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，《DNA克隆1 核心技術(shù)，實用方法》 (第二版)(DNA Cloning 1 :Core Techniques, APractical Approach, Second Edition, Oxford University (1995))，等等。可雜交的DNA的例子包括與SEQ ID NO :2的核苷酸序 列具有至少60%或以上同源性的DNA，或具有優(yōu)選70%或以上，更優(yōu)選80%或以上，進一步 優(yōu)選90%或以上，特別優(yōu)選95%或以上，最優(yōu)選97%或以上的同源性的DNA。巖藻糖的供體可以是任何供體，只要它能夠向a 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶提供巖藻 糖就行。其例子包括⑶P-巖藻糖等。3.檢杳本發(fā)日月的細朐詢活體組jR^li千篇能力禾時釘舌能力的方法
檢查本發(fā)明的細胞群向活體組織的遷移能力和植活能力的方法的例子，包括在小 鼠骨髓中檢查移植到小鼠中的人類造血干細胞的存在的方法?？梢酝ㄟ^在用半致死劑量的 X-射線輻照小鼠后，通過尾靜脈注射來移植人類造血干細胞，然后從股骨和脛骨回收骨髓 細胞，來檢查小鼠骨髓中的細胞。例如，可以通過分析人類⑶-45陽性和人類⑶-34陽性細 胞的細胞數(shù)量，來檢查向小鼠骨髓遷移的能力，可以通過計算人類CD-45陽性細胞占人類 ⑶-45陽性細胞和小鼠⑶-45陽性細胞的總數(shù)的比率，來檢查向小鼠骨髓植入的能力。
方法還包括在小鼠組織中檢查以同樣的方式移植到小鼠中的人類間充質(zhì)干細胞 的存在的方法。例如，可以通過尾靜脈或其他靜脈、或通過向組織直接施加，將人類間充質(zhì) 干細胞移植到四氯化碳誘導的肝病或肺病[BioFactors，巡，81-92 (2006)]模型動物中，來 檢查組織中的細胞。例如，因為人類間充質(zhì)干細胞是CD90陽性的，并且肝細胞、肺細胞等與 鏈親和素結(jié)合，因此可以通過計算CD90陽性細胞在鏈親和素結(jié)合細胞中的比率，來檢查人 類間充質(zhì)干細胞向每種組織遷移的能力。方法還包括在小鼠組織中檢查以同樣的方式移植到小鼠中的小鼠神經(jīng)干細胞的 存在的方法。例如，可以通過尾靜脈或其他靜脈、或通過向組織直接施加，將熒光標記的小 鼠神經(jīng)干細胞移植到動物中，來檢查組織中的細胞。對于熒光標記細胞來說，可以使用從表 達熒光蛋白綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠分離的細胞[FEBS Lett.，迎I，313-319 (1997)]，或 通過使用PKH的活細胞標記方法[Eur. J. Immunol. ,28,3066-3074(1998)]制備的細胞等。4.含有本發(fā)明的細胞的藥物制備物因為本發(fā)明的細胞群在其與E-選擇蛋白的結(jié)合能力、向活體組織的遷移能力和 向活體組織的植活能力方面非常出色，因此含有本發(fā)明的細胞的藥物制備物可用于造血干 細胞移植，以及使用干細胞移植恢復損傷組織。作為活性成分，含有本發(fā)明的細胞群的藥物制備物可以含有單獨的本發(fā)明的細 胞，或與其可藥用的鹽一起，或作為與用于其他可選治療的活性成分的混合物。此外，這樣 的藥物制備物通過在細胞藥物技術(shù)領域公知的任選方法，通過將本發(fā)明的細胞群與一種或 多種可藥用載體混合在一起來生產(chǎn)。優(yōu)選情況下，在實施治療中使用最有效的給藥途徑，對于含有本發(fā)明的細胞群的 藥物制備物來說，其例子包括靜脈內(nèi)等途徑。適合于注射等的藥物制備物由含有活性化合物、優(yōu)選與受體血液等滲的無菌水性 制備物組成。在例如注射的情況下，可以使用載體等來制備注射溶液，載體等根據(jù)需要包括 鹽溶液，葡萄糖溶液，或鹽水和葡萄糖溶液的混合物。此外，也可以根據(jù)需要加入一種或多 種輔助成分，選自稀釋劑、防腐劑、香料、填充劑、崩解劑、潤滑劑、黏合劑、表面活性劑、塑化劑等。盡管含有本發(fā)明的細胞群或其可藥用的鹽的藥物制備物的劑量和給藥頻率，隨著 給藥方式、每個患者的年齡和體重、待治療的癥狀的性質(zhì)或嚴重性等而變化，但優(yōu)選情況下 每次給藥細胞的數(shù)量為100個或以上。5.本發(fā)明的細胞的移植方法本發(fā)明的細胞的移植方法可以是任何方法，只要它是可向人類移植的方法就行。 具體來說，盡管方法包括了通過滴注或靜脈內(nèi)注射的方法，但它也可以是直接施加到各種 不同組織、例如骨髓、腦、心臟、肺、腸道、腎臟、胰臟、肝臟等的方法。
盡管在下面根據(jù)實施例對本發(fā)明進行了描述，但下面的實施例的公開僅僅是出于 說明的目的。因此，本發(fā)明的范圍不限于下面的實施例。[實施例1] 杭體、詵擇蛋白-IgG融合蛋白禾口 α 1，3_巖藻糖某轉(zhuǎn)的制各熒光素異硫氰酸酯(FITC)-標記的抗人類路易斯X抗體(HI 98)，F(xiàn)ITC-標記的 抗小鼠IgM抗體(11/41)，IgM同種型對照抗體(11E10)，藻紅蛋白(PE)-標記的抗人類 CD38抗體(HIT 2)，PE-標記的抗小鼠CD45抗體(30-F11)，PE-標記的抗小鼠TER-119抗 體(TER-119)和別藻藍蛋白(APC)-標記的人類CD34抗體(581)購自BectonDickinson Pharmingen。FITC-標記的和APC-標記的人類 CD45抗體(HI30)購自 eBioscience。FITC_標 記的抗人類IgG抗體購自DAKOCytomation。作為抗人類唾液酸基路易斯X糖鏈抗體(KM 93)，使用了從雜交瘤培養(yǎng)上清液收 集的抗體[Hanai 等，Cancer Research, 46 4438-4443 (1986) ] 人類E-選擇蛋白與人類IgG恒定區(qū)(Fe)的融合蛋白(在后文中被稱為E-選 擇蛋白-Fc嵌合蛋白)和人類P-選擇蛋白與Fc的融合蛋白(在后文中稱為P-選擇蛋 白-Fc嵌合蛋白)的生產(chǎn)，按照常規(guī)的已知方法進行[Yago等，Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997) ]0此外，人類L-選擇蛋白與Fc的融合蛋白(在后文中被稱為L-選擇 蛋白-Fc 嵌合蛋白)[Siegelman 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 86,5562-5566(1989)]和 人類CD 40與Fc的融合蛋白(在后文中被稱為CD 40-Fc嵌合蛋白)[Hollenbaugh等， EMBO J.，11，4313-4321(1992)]的生產(chǎn)，以與上面的描述相同的方式進行。al，3_巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶6和7(FT 6和FT 7)在Namalwa細胞中表達并純化[Shinoda等，Journal of BioloRicalChemistry,272，31992-31997(1997)]。人類臍帶血細胞和⑶34-陽性細胞對于源自人類臍帶血的造血干細胞來說，臍帶血單核細胞從AllCells購買。冷凍 細胞的融化和清洗，按照AllCells的說明書進行。在通過放置在37°C的水浴中將小管中的冷凍細胞快速融化后，緩慢加入含有 10%胎牛血清(FBS，由JRH Bioscience制造)的DMEM(由Gibco制造)(在后文中稱為 10%FBS/DMEM)，直到體積變?yōu)?0ml。離心操作(1.8k rpm，室溫，8分鐘)后，丟棄上清液， 只留下幾毫升的上清液。細胞清洗操作進行兩次。為了從臍帶血單核細胞回收造血干細胞，使用⑶34微珠試劑盒(由Miltenyi Biotec制造)和分離裝置AutoMACS (由Miltenyi Biotec制造)，按照產(chǎn)品隨附的說明書 來分離⑶34陽性細胞。免疫缺陷小鼠N0D/SCID 小鼠購自實驗動物中心研究所(Central Institute forExperimental Animal)和CLEA Japan，飼養(yǎng)在動物飼養(yǎng)房的隔離間中。α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶處理將上面獲得的從0. 1到10 X IO6個源自臍帶血的⑶34陽性細胞，加入并懸浮在100 到1，000 μ 1巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液中，該溶液含有l(wèi)Ommol/1 MnCl2 (由Sigma制造)、 lmmol/1鳥苷二磷酸(⑶P)-巖藻糖(由Kyowa Hakko Kogyo制造)、0. 人血清白蛋白 (HSA,由Sigma制造)和20mmol/l N_2_羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES，由Gibco制造)。對于每0. 1-1 X IO6個細胞，在加入16 μ g α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7 (FT 7)或3μβα1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6(FT 6)后，或用其中沒有加入酶的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液代替加過酶的 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液作為沒有用酶處理過的組后，將反應在37°C，在5% CO2的條件下 進行1小時。抗體染餼和流式細胞分析在用染色溶液、即含有5% FBS的PBS清洗用酶處理過的細胞后，使用抗體進行細 胞染色。IgM同種型對照抗體被用作陰性對照，F(xiàn)ITC標記的抗人類CD45抗體用作陽性對 照。在細胞表面上的唾液酸基路易斯X糖鏈的表達量分析中，抗人類唾液酸基路易斯X糖 鏈抗體KM 93被用作第一抗體，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠IgM抗體用作第二抗體。在細胞表面上 的路易斯X糖鏈的表達量分析中，使用了 FITC標記的抗人類路易斯X糖鏈抗體。此外，為 了檢測作為人類造血干細胞的⑶34陽性和⑶38陰性細胞，使用PE標記的抗人類⑶38抗 體和APC標記的抗人類CD34抗體進行了細胞的抗體染色。為了在移植小鼠中分別檢測小 鼠和人類血細胞，使用FITC標記的抗人類⑶45抗體和PE標記的抗小鼠⑶45抗體進行了 染色。此外，在嵌合體比率低的情況下，為了移除紅細胞，使用FITC標記的抗小鼠CD45抗 體、PE標記的抗小鼠TER-119抗體和APC標記的抗人類⑶45抗體進行了染色。為了在細胞清洗后通過流式細胞術(shù)(FACS)分析移除死細胞，向細胞懸浮液中加 入碘化丙啶(由Invitrogen制造)至終濃度為1 μ g/ml。使用流式細胞術(shù)裝置FACSAria (由 Becton Dickinson制造)，分析了在作為活細胞的碘化丙啶陰性細胞中，⑶34陽性和⑶38 陰性細胞群中唾液酸基路易斯X糖鏈、路易斯X糖鏈和CD45的表達量。選擇蛋白結(jié)合分析將細胞懸浮在含有0.5% HSA和0. lg/1 CaCl2的D-PBS (+)(由Gibco制造)(在 后文中稱為0.5% HSA%/D-PBS (+))中，在每IO6個細胞中分別加入1 μ g E-選擇蛋白-Fc 嵌合蛋白、2yg P-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白、2yg L-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白，以及作為陰性 對照的2. 2 μ g⑶40-Fc嵌合蛋白。使用FITC標記的抗人類IgG抗體作為第二抗體進行染 色。蛋白結(jié)合和第二抗體反應分別在4°C進行30分鐘。在用0. 5% HSA% /D-PBS(+)進行 細胞清洗后，通過加入PE標記的抗人類⑶38抗體和APC標記的抗人類⑶34抗體，在4°C和 30分鐘的條件下進行染色。為了在細胞清洗后通過FACS分析移除死細胞，向細胞懸浮液中 加入碘化丙啶至終濃度為1 μ g/ml。在使用FACSAria的FACS分析中通過定位碘化丙啶陰 性細胞中的CD34陽性和CD38陰性細胞群作為活細胞，分析了選擇蛋白的蛋白結(jié)合能力。N0D/SCID小鼠中人類造血干細胞的骨髓遷移分析將FT7或FT6處理過的源自臍帶血的⑶34陽性細胞或作為陰性對照的沒有用酶 處理過的⑶34陽性細胞，移植到N0D/SCID小鼠中。在將小鼠飼養(yǎng)1周或以上以適應環(huán)境 后，在8到10周齡時，使用X-射線輻照裝置MBR-1505R(由Hitachi Medico制造)以400cGy 的半致死劑量進行輻照。通過尾靜脈注射，以每只動物3X IO5個細胞的劑量移植CD34陽性 細胞。在移植12到18小時后，將每只小鼠安樂死，從股骨和脛骨收集骨髓細胞。將骨髓細 胞用FITC標記的抗人類⑶45抗體、PE標記的抗小鼠⑶45抗體和APC標記的抗人類⑶34 抗體進行染色。在清洗細胞后，通過加入氯化銨溶血劑將紅細胞裂解，向其中加入碘化丙啶 至終濃度為lyg/ml。使用FACSAria，通過FACS分析分析了作為活細胞的碘化丙啶陰性細 胞中的人類⑶45陽性和人類⑶34陽性細胞。通過在2X IO6個活細胞上獲得數(shù)據(jù)，對人類⑶45陽性和人類⑶34陽性細胞進行分析。人類誥血干細朐移棺的N0D/SCID小鼠的棺活分析將FT7或FT6處理過的源自臍帶血的⑶34陽性細胞或作為陰性對照的沒有用酶 處理過的⑶34陽性細胞，移植到用250到300cGy的半致死X-射線劑量輻照過的N0D/SCID 小鼠中。在將小鼠飼養(yǎng)1周或以上以適應環(huán)境后，在8到10周齡時，使用X-射線輻照裝置 MBR-1505R(由Hitachi Medico制造)進行X_射線輻照，然后進行移植。通過尾靜脈注射， 以每只動物2 X IO5個細胞的劑量移植CD34陽性細胞。此 外，對于臍帶血單核細胞進行了同 樣的處理，將IX IO7個細胞類似移植到用X-射線輻照過的小鼠中。在移植8到9周后，將 每只小鼠安樂死，從股骨和脛骨收集骨髓細胞。將骨髓細胞用FITC標記的抗人類CD45抗 體和PE標記的抗小鼠CD45抗體進行染色。在嵌合體比率低的情況下，為了檢測低頻率的 人類血細胞，將它們用FITC標記的抗小鼠⑶45抗體、PE標記的抗小鼠TER-119抗體和APC 標記的抗人類CD45抗體進行染色。在清洗細胞后，通過加入氯化銨溶血劑將紅細胞裂解，向其中加入碘化丙啶至終 濃度為1 μ g/ml。使用FACSAria，通過FACS分析分析了作為活細胞的碘化丙啶陰性細胞中 的人類⑶45陽性和小鼠⑶45陽性細胞。當使用小鼠TER-119抗體時，分析了 TER-119陰 性細胞中的人類CD45陽性細胞和小鼠CD45陽性細胞。人類血細胞的植活率，被計算為人 類CD45陽性細胞占人類CD45陽性細胞和小鼠CD45陽性細胞的總數(shù)量的比率(％ )。顯著件檢騎所有值都顯示為平均值士SD。在顯著性檢驗中使用了 Student’ s t_檢驗。 [on ] k 類 cd34χ mmm^m χ _ 毎車的表達分析從臍帶血單核細胞分離的人類CD34陽性細胞的分析結(jié)果顯示在圖1中。如圖1中 所示，純度是95到99%。為了分離人類造血干細胞，⑶34陽性⑶38陰性細胞被門控到由 圖IA的空心方形圍繞的區(qū)域中(5到10% )。在⑶34陽性⑶38陰性細胞中唾液酸基路易 斯X糖鏈和路易斯X糖鏈表達量的分析結(jié)果顯示在圖2Α和2Β中。如圖2Α和2Β中所示， 盡管在該細胞群中表達了唾液酸基路易斯X糖鏈，但路易斯X糖鏈的表達較低。接下來，分析了 FT 6或FT 7處理的⑶34陽性⑶38陰性細胞中唾液酸基路易斯 X糖鏈的表達量。結(jié)果分別顯示在圖2C和圖2Ε中。如圖2C和2Ε中所示，兩種酶都顯著 增加了唾液酸基路易斯X糖鏈的表達量。接下來，分析了路易斯X糖鏈的表達量。結(jié)果分 別顯示在圖2D和圖2F中。如圖2F中所示，在FT 7處理的⑶34陽性⑶38陰性細胞中，路 易斯X糖鏈的表達量沒有增加，而如圖2D中所示，在FT 6處理的⑶34陽性⑶38陰性細胞 中，路易斯X糖鏈的表達量顯著增加了。分析的數(shù)字結(jié)果顯示在表1中。[表 1] 類似的分析獨立地進行了 5次，結(jié)果顯示在表2中。如表2中所示，通過5次分析， 上述的結(jié)果顯示出可重復性。[表 2]N= 5 人類CD34陽件細胞對詵擇蛋白的結(jié)合活件分別分析了 FT 6或FT 7處理的⑶34陽性細胞與E-選擇蛋白、P-選擇蛋白和 L-選擇蛋白的結(jié)合。結(jié)果顯示在圖3和表3中。如圖3和表3中所示，人類⑶34陽性細 胞與E-選擇蛋白的結(jié)合能力被FT 7處理顯著增加了。此外，與P-選擇蛋白的結(jié)合能力也 增加了。與E-選擇蛋白和P-選擇蛋白的結(jié)合能力的增加，與FT 6處理的情況下的結(jié)果相 同。[表 3] 人類誥血干細朐在N0D/SCID小鼠中的骨髓i千移活件通過靜脈內(nèi)注射移植到外周血中的造血干細胞，在幾小時內(nèi)從外周血消失，并遷 移到骨髓組織并植入其中。將FT6或FT7處理的源自臍帶血的CD34陽性細胞或作為陰性 對照的未處理細胞移植到N0D/SCID小鼠中，在12到18小時后在骨髓中檢測到了人類CD45 陽性人類⑶34陽性細胞。結(jié)果顯示在圖4和表4中。如圖4和表4中所示，用FT6處理沒 有增加骨髓遷移活性，而用FT7處理時它顯著增加了 3. 1到3. 5倍。根據(jù)上述結(jié)果，顯示出 在通過巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FT 6和FT 7進行的兩種處理中，F(xiàn)T 6處理完全沒有增加骨髓遷移 活性，但是FT 7處理顯著增加了骨髓遷移活性。[表 4]人類⑶45陽性、小鼠⑶45陰性和人類⑶34陽性細胞的數(shù)量未處理 FT7處理 ρ倍數(shù)試驗1 253 士 62 773 士 133 0.00363 3.1
試驗2 95 士 13 313 士 72 0.00693 3.3試驗3 167 士 44 590 士 95 0.00223 3.5未處理 FT6處理試驗4 358 士 110 435 士 181 0.62試驗5 113 士 38 100 士 22 0.57人類誥血干細胞,在N0D/SCID小鼠中的棺活活件將巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶處理的⑶34陽性細胞移植到N0D/SCID小鼠中，在8到9周后 檢查了骨髓中人類血細胞的比率。結(jié)果顯示在圖5中。如圖5中所示，因為FT 6處理的細 胞移植組顯示出與沒有用酶處理的組相似的結(jié)果，因此沒有植活增強效應。另一方面，F(xiàn)T 7 處理的移植組顯示出98到99%的源自人類的細胞植活比率。這表明，幾乎所有小鼠血細胞 都被人類血細胞取代。相似的分析獨立地進行了 4次，結(jié)果顯示在圖6中。如圖6中所示，顯示出FT 6處 理沒有植活率增加效應，而以高的可重復性和穩(wěn)定性獲得了 FT 7處理的植活率增加效應。 此外，F(xiàn)T 7處理的植活率增加效應和FT 6處理的不具有植活率增加效應，在將移植細胞的 數(shù)量減少到一半數(shù)量、即1乂106個細胞后移植0034陽性細胞的試驗中，也得到了證實。就此而言，在沒有將CD34陽性細胞分離出來的臍帶血單核細胞用FT7處理后進行 移植的情況下，與沒有用酶處理的細胞相比，證實了短時間內(nèi)顯著的植活增加效應。另一方 面，移植用FT6處理的臍帶血單核細胞的情況下，與沒有用酶處理的細胞相比，不能證實顯 著的植活增強效應。[實施例2]在肝炎it型Φ丨旬充Jii干細朐詢mii.mmι. ^f.Kmm^M=FmmMmfr χ mmmmmm^m χ 的表達分析人類間充質(zhì)干細胞(在后文中稱為hMSC)購自CAMBREX。將hMSC在CO2培養(yǎng)箱中，使用MSCGM培養(yǎng)基(由CAMBREX制造)，在37°C和5% CO2條件下進行培養(yǎng)。在用磷酸鹽緩 沖鹽水(在后文中稱為PBS(-))清洗后，通過加入TrypLE Select (由Invitrogen制造)并 在37°C處理2分鐘，使細胞剝離，然后通過加入含有5% FBS的PBS(-)溶液終止反應。通 過以1，OOOrpm(轉(zhuǎn)/分鐘)離心5分鐘回收細胞，用PBS (-)清洗，然后將1_2X IO6個細胞 懸浮在80-100 μ 1的Hanks'平衡鹽溶液(HBSS)反應液中[25mmol/l HEPES (由Gibco制 造)，10mmol/lMnCl2 (由 SIGMA 制造),0. 1% HAS，HBSS (-)(由 Gibco 制造)]。在每 1 X IO6 個細胞加入4-16 μ g FT 7后，將⑶P-巖藻糖(由Kyowa Hakko Kogyo制造)調(diào)整到終濃度 為lmmol/1，在37°C溫育1小時。另一方面，作為陰性對照，單獨使用HBSS (-)反應液將hMSC 在37°C溫育1小時。在用PBS(-)清洗細胞三次后，將細胞懸浮在含有5% FBS的PBS(-)溶 液中，分配成1 X IO5個細胞的部分。作為抗路易斯X糖鏈抗體，以5 %的濃度加入FITC標 記的抗人類⑶15抗體(由BectonDickinson制造)，使其在4°C反應1小時。另一方面， 作為抗唾液酸基路易斯X糖鏈抗體，以5%的濃度加入抗人類唾液酸基路易斯X糖鏈抗體 KM93 (由CALBI0CHEM制造)，使其在4°C反應30分鐘。在用含有5% FBS的PBS (-)溶液清 洗后，以4，500rpm離心1分鐘回收細胞，并懸浮在含有5% FBS的PBS (-)溶液中。以5% 的濃度加入作為第二抗體的FITC標記的抗小鼠IgG抗體(由Becton Dickinson制造)，使 其在4°C反應30分鐘。將用抗人類路易斯X糖鏈抗體處理過的細胞和用抗唾液酸基路易斯X糖鏈抗體處理、然后用第二抗體處理過的細胞，用含有5% FBS的PBS(-)溶液清洗三次， 然后懸浮在Iml含有5% FBS的PBS (-)溶液中，并通過流式細胞術(shù)(Becton Dickinson ； FACSAria)進行分析。結(jié)果顯示在圖7中。如圖7中所示，在hMSC中，路易斯X糖鏈的表 達沒有發(fā)現(xiàn)，唾液酸基路易斯X糖鏈的表達幾乎不能發(fā)現(xiàn)。此外，發(fā)現(xiàn)路易斯X糖鏈沒有增 力口，但是單獨的唾液酸基路易斯X糖鏈被FT7處理選擇性增加。此外，還將細胞懸浮在含有0. 5% HAS和0. lg/1 CaCl2的D-PBS(+)(由Gibco制 造)中[在后文中稱為0.5% HSA%/D-PBS⑴]，對于每1-5X IO5個細胞，分別向其中加入 lug E-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白、2 μ g P-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白或2yg L-選擇蛋白-Fc 嵌合蛋白。使用FITC標記的抗人類IgG抗體作為第二抗體進行染色。蛋白結(jié)合和第二抗 體反應，分別在4°C進行30分鐘。在用0.5% HSA%/D-PBS (+)清洗細胞后，為了通過FACS 分析消除死細胞，向細胞懸液中加入碘化丙啶至終濃度為1 μ g/ml。在FACS分析中，通過 FACSAria分析了作為活細胞的碘化丙啶陰性細胞的選擇蛋白蛋白結(jié)合能力。結(jié)果顯示在 表5中。如表5中所示，證實了通過FT7處理后平均熒光強度(MFI)、即E、P、L-選擇蛋白 結(jié)合能力的增加。[表 5] 2.小鼠四氯化碳肝病模型的制備將5周齡的雄性BALB/c-nu/nu Slc小鼠(Japan SLC)適應性飼養(yǎng)1周。將四 氯化碳(由 Wako Pure Chemical Industries 制造)用橄欖油(由 Wako Pure Chemical Industries制造)稀釋10倍，以lml/kg的比率將四氯化碳腹膜內(nèi)給藥到BALB/c-nu/nu Slc小鼠中，以誘導急性肝病。3. hMSC移植到小鼠四氯化碳肝病模型中以及肝臟遷移細胞的分析(1)按照與上面描述相同的方式，將FT 7酶處理的hMSC和陰性對照hMSC懸浮在 PBS (-)中，并調(diào)整到IXlO6個細胞/ml。將給藥四氯化碳后過去24小時的BALB/c-nu/ nu Slc小鼠，通過肌肉內(nèi)注射40 μ 1/頭的混合麻醉液[Dormicum注射液(由Astellas Pharma 制造)、Domitor (由 Meiji Seika 制造)、戊巴比妥鈉(由 Dainippon Sumitomo Pharmaceutical制造)和生理鹽水的3 3 10 110的混合物]進行麻醉。通過進行 腹部切口，將FT 7酶處理的hMSC或?qū)φ説MSC以1 X IO5個細胞/頭的劑量(對于每組來說 η = 5)移植到脾臟中。在移植24小時后，取出肝臟，在膠原酶反應液
中切成碎塊，然后在37 °C溫育2小 時。使用ΙΟΟμπι膜(由Becton Dickinson制造)將它過濾，用含有5% FBS的PBS(-)清 洗三次。在懸浮于同樣的溶液中之后，將其分配成IXlO8個細胞的部分。向其中加入濃度 為2%的生物素標記的小鼠譜系組(由Becton Dickinson制造)，使其在4。C反應1小時。在用含有5%血清的PBS(-)溶液清洗后，以4，500rpm離心1分鐘回收細胞，并懸浮在含有 5% FBS的PBS(-)溶液中。進一步向其中加入濃度為10%的PerCP標記的鏈親和素(由 Becton Dickinson制造)和PE標記的抗人類CD 9O抗體(由Becton Dickinson制造)，使 其在4V反應2小時。在用含有5% FBS的PBS(-)溶液清洗3次后，將細胞懸浮在Iml同 樣的溶液中，通過流式細胞術(shù)進行分析。因為源自肝臟的血細胞用小鼠譜系組處理，然后用 PerCP標記的鏈親和素處理，并且肝細胞與鏈親和素結(jié)合，因此所有收集到的源自小鼠肝臟 的細胞都可以被檢測為PerCP陽性細胞。另一方面，因為源自小鼠肝臟的細胞不與人類CD 90抗體反應，因此hMSC可以被特異性染色。因此，每一定數(shù)量的PerCP陽性細胞中PE陽性 細胞的數(shù)量，可以表示成移植的hMSC向肝臟的遷移比率(％ )。通過流式細胞術(shù)分析的結(jié) 果顯示在圖8中。如圖8中所示，通過FT 7酶處理的移植的hMSC顯示出增加的向肝臟的 遷移比率。這顯示出在沒有添加路易斯X糖鏈而通過FT 7酶處理添加了單獨的唾液酸基 路易斯X糖鏈的細胞中，向損傷區(qū)域遷移的性質(zhì)得到改進。4. hMSC移棺到小鼠四氯化碳肝病樽型中以及肝臟遷移細胞的分析(2)
將FT 7酶處理的hMSC或陰性對照hMSC按照上面的描述懸浮在PBS (-)中，并調(diào) 整到2. 5X IO6個細胞/ml。在給藥四氯化碳24小時后，從BALB/c-nu/nu Slc小鼠的微靜 脈，以5X IO5個細胞/頭的劑量移植FT7酶處理的hMSC或?qū)φ説MSC(對于每組來說η = 6)。在移植18小時后，取出肝臟，按照上面的描述進行處理，然后進行溶血處理，將細胞分 配成3Χ IO6個的部分。以10%的濃度向其中添加PE_Cy7標記的鏈親和素(由BectonDickinson制造) 和PE標記的人類⑶90抗體，以5 %的濃度添加FITC標記的小鼠⑶45抗體(由Becton Dickinson制造)和FITC標記的小鼠Ter 119抗體(由Becton Dickinson制造)，使其在 4°C反應2小時。將細胞用含有5% FBS的PBS (-)溶液清洗三次，懸浮在Iml同樣的溶液 中，然后通過流式細胞術(shù)進行分析。在移除FITC標記的血細胞后，F(xiàn)ITC陰性PE-Cy7陽性細 胞被當作肝細胞，PE陽性細胞被當作hMSC，并計算每一百萬個肝細胞中hMSC細胞的數(shù)量。 結(jié)果顯示在圖9中。如圖9中所示，使用FT7處理時，發(fā)現(xiàn)了向肝臟遷移的細胞數(shù)量的顯著 增加。5. hMSC移植到小鼠四氯化碳肝病模型中和血清生物化學參數(shù)的分析通過與上述第4項中相同的方法，將FT7酶處理的hMSC或陰性對照hMSC移植到 肝病小鼠中，或?qū)⑷軇?PBS)給藥到其中(對于每組來說，η = 6)。在移植18小時后，收集 血樣，通過Fuji Dry Chem(由Fuji Photo Film制造)測量血清中的總膽紅素(T-BIL), 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙氨酸磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶 (LDH)。結(jié)果顯示在圖10中。如圖10中所示，使用FT7處理時，發(fā)現(xiàn)了血液生物化學參數(shù) 的顯著增加。[實施例3]在月市炎it型Φ丨旬^M^mmMfl市部mm1.制備小鼠四氯化碳肺病模型將5周齡的雄性BALB/c-nu/nu Slc小鼠(Japan SLC)適應性飼養(yǎng)1周。通過將 四氯化碳(由 Wako Pure Chemical Industries 制造)用橄欖油(由 Wako Pure Chemical Industries制造)稀釋10倍，以lml/kg的劑量進行四氯化碳向BALB/c-nu/nu Slc小鼠的腹膜內(nèi)給藥，誘導急性肺病[Mizuguchi等，BioFactors，巡，81-92 (2006)]。
2. hMSC移棺到小鼠四氯北碳肺病It型中以及分析通過與實施例2相同的方法，將FT 7酶處理的hMSC或陰性對照hMSC懸浮在 PBS(-)中，并調(diào)整到2. 5X IO6個細胞/ml。在給藥四氯化碳24小時后，以5X IO5個細胞 /頭的劑量將FT 7酶處理的hMSC或?qū)φ説MSC移植到BALB/c-nu/nu Slc小鼠中(每組5 只動物)。在移植18小時后，取出肺，在膠原酶-彈性蛋白酶反應液[150U/ml膠原酶類型 IV (由 SIGMA 制造)，10U/ml 彈性蛋白酶(由 Nakalai Tesque 制造)，DMEM(由 Invitrogen 制造)]中切成碎塊，然后在37°C溫育2小時。使用100 μ π!膜(由Becton Dickinson制 造)通過過濾收集細胞；進行溶血處理；用含有5% FBS的PBS (-)溶液清洗兩次，然后懸浮 在同樣的溶液中，以分配成3X IO6個細胞的部分。以10%的濃度向其中加入PE-Cy7標記 的鏈親和素和PE標記的人類⑶90抗體，以5 %的濃度添加FITC標記的抗小鼠⑶45抗體和 FITC標記的抗小鼠Ter 119抗體，使其在4°C反應2小時。將細胞用含有5% FBS的PBS (-) 溶液清洗三次，懸浮在Iml同樣的溶液中，然后通過流式細胞術(shù)進行分析。在移除FITC標 記的血細胞后，F(xiàn)ITC陰性PE-Cy7陽性細胞被當作肺細胞，PE陽性細胞被當作hMSC，并計算 每十萬個肺細胞中hMSC細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示在圖11中。如圖11中所示，使用FT7處理 時，發(fā)現(xiàn)了向肺遷移的細胞數(shù)量的顯著增加。[實施例4]杭體、詵擇蛋白-IgG融合蛋白禾口 α 1，3_巖藻糖某轉(zhuǎn)的制各熒光素異硫氰酸酯(FITC)-標記的抗路易斯X抗體(HI 98)，F(xiàn)ITC-標記的抗小 鼠 IgM 抗體(11/41)和 IgM 同種型對照抗體(11E10)購自 Becton Dickinson Pharmingen0 FITC-標記的或APC-標記的人類CD45抗體(HI30)購自eBioscience。FITC-標記的抗人 類 IgG 抗體購自 DAKOCytomation。作為抗唾液酸基路易斯X糖鏈抗體(KM 93)，使用了從雜交瘤培養(yǎng)上清液回收的 抗體[Hanai 等，Cancer Research，堅，4438-4443 (1986)]。人類E-選擇蛋白與人類IgG恒定區(qū)(Fe)的融合蛋白(在后文中被稱為E-選 擇蛋白-Fc嵌合蛋白)和人類P-選擇蛋白與Fc的融合蛋白(在后文中稱為P-選擇蛋 白-Fc嵌合蛋白)的生產(chǎn)，按照常規(guī)的已知方法進行[Yago等，Journal of Immunology, 15, 707-714 (1997)]。此外，人類L-選擇蛋白與Fc的融合蛋白(在后文中被稱為L-選擇蛋 白-Fc 嵌合蛋白)[Siegelman 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 86,5562-5566(1989)]和人 類⑶40與Fc的融合蛋白(在后文中被稱為⑶40-Fc嵌合蛋白)[Hollenbaugh等，EMBO J.，旦，4313-4321 (1992)]的生產(chǎn)，以與上面的描述相同的方式進行。由Namalwa細胞表達 α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 7 (FT 7)并純化[Shinoda等，Journal of Biological Chemistry, 272,31992-31997(1997)1 ο神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)神經(jīng)球(Neurosphere)是含有神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞的細胞。使用源自小鼠 胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)(皮層)的冷凍神經(jīng)球(由Stem CellTechnologies制造)，按照Stem Cell Technologies的說明書進行冷凍細胞的融化、清洗和培養(yǎng)。在冷凍細胞融化后，使用 NeuroCult增殖培養(yǎng)基(由Stem Cell Technologies制造)并通過離心清洗細胞，懸浮 在補充有20ng/ml重組人類表皮生長因子(rh EGF，由Stem CellTechnologies制造)的NeuroCult增殖培養(yǎng)基中，在5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)7天?；厥者@樣增殖的神經(jīng)球，使用NeuroCult化學解離試劑盒(由Stem Cell Technologies制造)將神經(jīng)球分離成單 細胞并懸浮。α 1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶處理將上面獲得的并懸浮成單細胞的從0. 1到IOX IO5個源自神經(jīng)球的細胞，加入 到巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液中，制成100到1，000 μ 1的懸液，所述反應溶液含有IOmmol/ 1 MnCl2 (由 Sigma 制造)、lmmol/1 鳥苷二磷酸(GDP)-巖藻糖(由 Kyowa Hakko Kogyo 制 造)、0. 人血清白蛋白(HSA，由SIGMA制造)和20mmol/l N_2_羥乙基哌嗪_N_2_乙磺 酸(HEPES，由Gibco制造)。使用了對于每0. 1-1 X IO5個細胞在其中加入16 μ g α 1，3_巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶7 (FT 7)的反應溶液，或其中沒有加入酶的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液代替加 過酶的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶反應溶液作為沒有用酶處理過的組，允許細胞在37°C和5% CO2條 件下進行1小時的反應?？贵w染餼和流式細胞術(shù)分析在用染色溶液、即含有5% FBS的PBS清洗用酶處理過的細胞后，使用抗體進行細 胞染色。IgM同種型對照抗體被用作陰性對照。在細胞表面上的唾液酸基路易斯X糖鏈的 表達量分析中，抗人類唾液酸基路易斯X糖鏈抗體KM 93被用作第一抗體，F(xiàn)ITC標記的抗 小鼠IgM抗體用作第二抗體。在細胞表面上的路易斯X糖鏈的表達量分析中，使用了 FITC 標記的抗路易斯X糖鏈抗體。為了在細胞清洗后通過流式細胞術(shù)(FACS)分析去除死細胞，向細胞懸浮液中加 入碘化丙啶(由Invitrogen制造)至終濃度為1 μ g/ml。使用流式細胞儀FACSAria (由 Becton Dickinson制造)，分析了活細胞，碘化丙啶陰性細胞的唾液酸基路易斯X糖鏈和路 易斯X糖鏈的表達量。選擇蛋白結(jié)合分析將細胞懸浮在含有0.5% HSA和0. lg/1 CaCl2的D-PBS (+)(由Gibco制造)(在 后文中稱為0.5% HSA%/D-PBS (+))中，在每IO6個細胞中分別加入1 μ g E-選擇蛋白-Fc 嵌合蛋白、2 μ g P-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白、2 μ g L-選擇蛋白-Fc嵌合蛋白或2. 2 μ g陰性 對照⑶40-Fc嵌合蛋白。使用FITC標記的抗人類IgG抗體作為第二抗體進行染色。蛋白 結(jié)合和第二抗體反應分別在4°C進行30分鐘。在用0. 5% HSA% /D-PBS(+)清洗細胞后， 為了通過FACS分析去除死細胞，向細胞懸浮液中加入碘化丙啶至終濃度為1 μ g/ml。在使 用FACSAria的FACS分析中，分析了作為活細胞的碘化丙啶陰性細胞的選擇蛋白蛋白結(jié)合 能力。小鼠神經(jīng)球的唾液酸基路易斯X糖鏈和路易斯X糖鏈的表達分析小鼠神經(jīng)球的唾液酸基路易斯X糖鏈和路易斯X糖鏈表達量的分析結(jié)果，顯示在 圖12中。如圖12的上排(未處理的組)中所示，小鼠神經(jīng)球的唾液酸基路易斯X糖鏈和 路易斯X糖鏈的表達為陰性。接下來，分析了 FT7處理過的小鼠神經(jīng)球的唾液酸基路易斯X糖鏈和路易斯X糖 鏈的表達量。結(jié)果顯示在圖12的下排(FT7處理)中。如圖12的下排中所示，F(xiàn)T7處理顯著增 加了唾液酸基路易斯X糖鏈的表達量。另一方面，路易斯X糖鏈的表達量沒有變化。
神經(jīng)干細胞對詵擇蛋白的結(jié)合活件分析了 FT7處理的源自小鼠神經(jīng)球的神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞對P-選擇蛋白、 E-選擇蛋白和L-選擇蛋白的每種的結(jié)合。結(jié)果顯示在圖13中。如圖13中所示，源自小鼠 神經(jīng)球的神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞對E-選擇蛋白的結(jié)合能力，被FT7處理顯著增加了。工業(yè)實用性 根據(jù)本發(fā)明，提供了具有出色的向組織遷移能力和植活能力的細胞群，含有所述 細胞群的藥物制備物，以及所述細胞群的移植方法。本發(fā)明的細胞群可用于恢復損傷組織等。
權(quán)利要求
分離的細胞群，其中表達唾液酸基路易斯X糖鏈，路易斯X糖鏈基本上不表達。
2.權(quán)利要求1的細胞群，通過細胞分級處理獲得。
3.權(quán)利要求1或2的細胞群，通過在存在巖藻糖供體的情況下用al，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶處理細胞來獲得。
4.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7。
5.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ IDNO :1的氨基酸序列 構(gòu)成的多肽。
6.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由與由SEQID NO :1的氨基酸序 列構(gòu)成的多肽具有60%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn) 移酶活性。
7.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶由其中在SEQID NO :1的氨基酸 序列中至少一個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有α 1，3-巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶活性。
8.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQ IDNO :2的核苷酸序列 構(gòu)成的DNA編碼的多肽。
9.權(quán)利要求3的細胞群，其中α1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼的多肽，并且也是具有 α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
10.權(quán)利要求1到9任一項的細胞群，其中細胞是干細胞或祖細胞。
11.權(quán)利要求10的細胞群，其中干細胞或祖細胞是造血干細胞或造血祖細胞。
12.權(quán)利要求11的細胞群，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陽性造血干細胞或 ⑶34-陽性造血祖細胞。
13.權(quán)利要求12的細胞群，其中⑶34-陽性造血干細胞是⑶38-陰性造血干細胞。
14.權(quán)利要求11的細胞群，其中造血干細胞或造血祖細胞是CD34-陰性和譜系陰性造 血干細胞或⑶34-陰性和譜系陰性造血祖細胞。
15.權(quán)利要求10的細胞群，其中干細胞是間充質(zhì)干細胞。
16.權(quán)利要求10的細胞群，其中干細胞或祖細胞是神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞。
17.權(quán)利要求16的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是巢蛋白陽性神經(jīng)干細胞或 巢蛋白陽性神經(jīng)祖細胞。
18.權(quán)利要求16的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Sox2-陽性神經(jīng)干細胞或 Sox2-陽性神經(jīng)祖細胞。
19.權(quán)利要求16的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Musashil-陽性神經(jīng)干細 胞或Musashi 1-陽性神經(jīng)祖細胞。
20.權(quán)利要求16的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是CD34-陽性神經(jīng)干細胞或 ⑶34-陽性神經(jīng)祖細胞。
21.權(quán)利要求16的細胞群，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是CD133-陽性神經(jīng)干細胞或 ⑶133-陽性神經(jīng)祖細胞。
22.權(quán)利要求1到21任一項的細胞群，其中細胞是源自人類的細胞。
23.權(quán)利要求1到22任一項的細胞群，其中細胞是源自于選自骨髓、脾臟、臍帶血、外周血、脂肪組織和神經(jīng)組織的組織的細胞。
24.藥物制備物，含有權(quán)利要求1到23任一項的細胞群。
25.移植細胞群的方法，包括向活體施加權(quán)利要求1到23任一項的細胞群。
26.用于產(chǎn)生表達唾液酸基路易斯X糖鏈、但是基本上不表達路易斯X糖鏈的細胞的方 法，包括通過分級處理獲得細胞。
27.用于生產(chǎn)表達唾液酸基路易斯X糖鏈、但是基本上不表達路易斯X糖鏈的細胞的方 法，包括在存在巖藻糖供體的情況下通過用α 1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶處理來獲得細胞。
28.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是al，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶7。
29.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQID NO 1的氨基酸 序列構(gòu)成的多肽。
30.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由與由SEQ ID Ν0:1的 氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有60%或以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有α 1，3-巖 藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
31.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由其中在SEQ ID NO=I 的氨基酸序列中至少一個氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序列構(gòu)成，并且也具有α 1， 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
32.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由SEQID NO 2的核苷酸 序列構(gòu)成的DNA編碼的多肽。
33.權(quán)利要求27的生產(chǎn)方法，其中α1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO 2的核苷酸序列互補的核苷酸序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼，并且也具有α 1， 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。
34.權(quán)利要求26到33任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是干細胞或祖細胞。
35.權(quán)利要求34的生產(chǎn)方法，其中干細胞或祖細胞是造血干細胞或造血祖細胞。
36.權(quán)利要求35的生產(chǎn)方法，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陽性造血干細胞 或⑶34-陽性造血祖細胞。
37.權(quán)利要求36的生產(chǎn)方法，其中⑶34-陽性造血干細胞是⑶38-陰性造血干細胞。
38.權(quán)利要求35的生產(chǎn)方法，其中造血干細胞或造血祖細胞是⑶34-陰性和譜系陰性 造血干細胞或⑶34-陰性和譜系陰性造血祖細胞。
39.權(quán)利要求34的生產(chǎn)方法，其中干細胞是間充質(zhì)干細胞。
40.權(quán)利要求34的生產(chǎn)方法，其中干細胞或祖細胞是神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞。
41.權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是巢蛋白陽性神經(jīng)干細胞 或巢蛋白陽性神經(jīng)祖細胞。
42.權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Sox2-陽性神經(jīng)干細胞 或Sox2-陽性神經(jīng)祖細胞。
43.權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是Musashil-陽性神經(jīng)干 細胞或Musashi 1-陽性神經(jīng)祖細胞。
44.權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是⑶34-陽性神經(jīng)干細胞 或⑶34-陽性神經(jīng)祖細胞。
45.權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其中神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞是⑶133-陽性神經(jīng)干細胞 或⑶133-陽性神經(jīng)祖細胞。
46.權(quán)利要求26到45任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是源自人類的細胞。
47.權(quán)利要求26到46任一項的生產(chǎn)方法，其中細胞是源自于選自骨髓、脾臟、臍帶血、 外周血、脂肪組織和神經(jīng)組織的組織的細胞。
48.藥物制備物，含有通過權(quán)利要求26到47任一項的生產(chǎn)方法獲得的細胞。
49.用于移植細胞的方法，包括向活體施加通過權(quán)利要求26到47任一項的生產(chǎn)方法獲 得的細胞。
全文摘要
需要在造血干細胞移植，利用干細胞移植修復損傷組織等中能表現(xiàn)出出色的向組織遷移的能力和出色的附著組織的能力的細胞。因此，本申請公開了具有出色的向組織遷移的能力和出色的附著組織的能力的細胞群；含有所述細胞體的藥物；以及所述細胞的移植方法。所述細胞可用于造血干細胞移植以及使用干細胞移植修復損傷組織等。
文檔編號A61L27/00GK101848991SQ200880109220
公開日2010年9月29日 申請日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者一角昌廣, 佐藤秀尚, 宮地宏昌 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社