專利名稱：含細(xì)胞因子溶液的新組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及含細(xì)胞因子溶液的新組合物(在本文中稱為“CFS”組合物)，包括持續(xù)釋放的含細(xì)胞因子溶液的新組合物(在本文中稱為“SR-CFS”組合物)；制備 這樣的新組合物的方法；以及所述組合物的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)在許多不同的疾病、障礙和損傷的治療中評估了許多單獨的細(xì)胞因子和生長 因子的治療效用。不幸的是，其結(jié)果僅部分地令人振奮。例如，PDGF-BB已被證明可用于治 療糖尿病足潰瘍；GM-CSF在歐洲上市，用于治療靜脈性潰瘍和糖尿病足潰瘍；HGH(人生長 激素)在美國上市，用于小兒燒傷。失敗事件包括BDNF、CNTF和IGF-I，已經(jīng)在被設(shè)計來測 試其治療ALS的有效性的臨床研究中對它們進(jìn)行了評估，每個的結(jié)果都令人失望；TGF3 2 在靜脈性潰瘍的2期研究中沒有成功；IGF-I和PDGF的組合療法在糖尿病足潰瘍治療中沒 有成功。雖然不清楚為什么有這么多單獨的細(xì)胞因子和生長因子在臨床中失敗，但是一個 理論是所給予的蛋白劑量是非生理性的，即這些劑量遠(yuǎn)高于正常出現(xiàn)在體內(nèi)的生理水平。 同時，由于細(xì)胞因子和生長因子在一個給定的生理狀況下的復(fù)雜相互作用，僅施用一種因 子(特別是異常高水平的因子)無法重現(xiàn)所述生理狀況，并且事實上可能會嚴(yán)重干擾其微 妙的平衡。綜合它們在臨床中有限的成功，細(xì)胞因子和生長因子以及其他基于蛋白的治療劑 通常比其他藥物更難以給予患者。由于蛋白的有效性與其形狀有關(guān)，基于蛋白的治療劑不 能經(jīng)受可能引起其中包含的一種或多種蛋白解折疊或變性的條件。因此，在基于蛋白的治 療劑的制備、存儲和給藥方面需要特別小心。除了避免任何的蛋白變性之外，經(jīng)常還需要能夠控制隨時間給予患者的蛋白量。 這有助于避免患者中的蛋白濃度達(dá)到不希望的高或低，或者距希望的水平偏差太多，而是 有助于將患者中的所述治療劑維持在穩(wěn)定水平。為滿足這一點，已經(jīng)開發(fā)出或者正在開發(fā) 許多治療劑(包括基于蛋白的治療劑)的持續(xù)釋放制劑。基于蛋白的持續(xù)釋放治療劑可 通過多種方法進(jìn)行給藥，所述方法包括但不限于片劑或膠囊劑的口服遞送、粉劑的吸入、植 入、整合至基質(zhì)中，或者裝入膠囊的治療劑的局部外用，蛋白從該治療劑中隨時間逐漸釋 放。這些持續(xù)釋放制劑的制備方法是不同的。一種方法包括將蛋白與有機(jī)溶劑相混 合。例如，粉末制劑可通過將蛋白和有機(jī)溶劑的混合物噴霧至液氮中進(jìn)行制備。另一種方法涉及將蛋白與可生物侵蝕/可生物降解聚合物溶于有機(jī)溶劑所得到的溶液相混合，從而通過凝固所述混合物而形成包含所述蛋白和所述聚合物的微粒。在又一種方法中，可將蛋 白、粉化制劑或微粒與有機(jī)溶劑混合，以產(chǎn)生可注射至患者體內(nèi)或外部施用的液體劑或凝 膠劑。不幸的是，使用有機(jī)溶劑的缺點是它們有引起蛋白變性的傾向。添加劑已被用于在存在變性有機(jī)溶劑的情況下穩(wěn)定蛋白。這些添加劑包括表面活 性劑(參見美國專利5，096，885)、氨基酸(參見美國專利4，297，344)、多元醇(參見美國專 利5，589，167)、天然聚合物(參見WO 8903671)、合成聚合物(參見Pharm. Res. 8 =285291, 1991)和金屬(參見美國專利6，191，107B1)，這些文獻(xiàn)的每一篇均通過引用的方式納入本 文。迄今為止，尚沒有這樣的基于蛋白的治療劑(即細(xì)胞因子和生長因子)，即所述治 療劑能有效地重現(xiàn)或模擬在健康狀態(tài)以及疾病或受傷狀態(tài)的體內(nèi)天然出現(xiàn)的生理相關(guān)細(xì) 胞因子和生長因子的復(fù)雜組合和生理水平?，F(xiàn)有的每種基于蛋白的治療劑的給藥劑量均比 體內(nèi)正常出現(xiàn)的細(xì)胞因子或生長因子的水平高許多倍。另外，至今無人能以生理水平給予 這些生理相關(guān)的細(xì)胞因子和生長因子。此外，至今無人能以持續(xù)釋放制劑的形式以生理水 平給予這些生理相關(guān)的細(xì)胞因子和生長因子。因此，申請人在本文中首次提出了本發(fā)明，其 目標(biāo)是滿足這樣的未被滿足的醫(yī)學(xué)需求，即以生理水平提供生理相關(guān)的生長因子和細(xì)胞因 子(CFS組合物)，在一些情況下，使用一種持續(xù)釋放的制劑(SR-CFS組合物)以生理水平遞 送這些生理相關(guān)的生長因子和細(xì)胞因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是，提供含細(xì)胞因子溶液(CFS)的新組合物，所述組合物可對出現(xiàn) 于生物學(xué)狀況中的這些細(xì)胞因子和生長因子的復(fù)雜且獨特的組合和生理水平進(jìn)行重現(xiàn)。本 發(fā)明的另一目標(biāo)是提供持續(xù)釋放的含細(xì)胞因子溶液(SR-CFS)的新組合物，所述組合物含 有天然出現(xiàn)于生物學(xué)狀況中的所述細(xì)胞因子和生長因子的復(fù)雜且獨特的組合和生理水平。 由于所述細(xì)胞因子的存在水平與出現(xiàn)于體內(nèi)的生理水平相當(dāng)，它們最適合在需要介入的治 療應(yīng)用中使用，以支持、啟動、代替、加速又或影響疾病和/或損傷的治療和/或愈合中涉及 的生化過程和生物過程。對于SR-CFS組合物，細(xì)胞因子隨時間緩慢釋放，以提供持續(xù)穩(wěn)定 生理水平的這些因子，以優(yōu)化愈合和/或恢復(fù)。除了本發(fā)明描述的所述新CFS組合物外，本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供用于制備所述 新CFS組合物和SR-CFS組合物的方法及所述組合物的治療用途，所述方法包括合并源自細(xì) 胞的組合物(即合并的ECS組合物和合并的ACCS組合物)。源自細(xì)胞的合并組合物具有數(shù)種重要性質(zhì)和特征，包括與非合并組合物相比，降 低了治療效果所必需的生理相關(guān)細(xì)胞因子水平的變異性。所述細(xì)胞因子的存在水平與出現(xiàn) 于體內(nèi)的生理水平相當(dāng)，因此最適合在需要介入的治療應(yīng)用中使用，以支持、啟動、代替、力口 速又或影響疾病和/或損傷的治療和/或愈合中涉及的生化過程和生物過程。本文描述的 將源自細(xì)胞的組合物合并以降低變異性的新方法有這樣的效果，即使得每個合并物中的 分泌因子的水平優(yōu)化，從而實現(xiàn)其全部治療潛力。除了這種合并組合物的治療價值之外，所 述將樣品合并以降低非合并的組合物與組合物之間的變異性的方法也具有重要的商業(yè)優(yōu) 勢，即可以通過使非合并組合物因不滿足產(chǎn)品規(guī)格而被淘汰的情況最少從而提高產(chǎn)率，其結(jié)果是降低生產(chǎn)成本并增加收益。因此，本發(fā)明的第一方面是一種源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液的組合物，包含生理濃度的a)選自VEGF、TGFii 2、血管生成素和PDGF的至少一種因子；以及b)至少一種 MMP抑制劑。在另一個實施方案中，所述第一方面的組合物包含生理濃度的a)選自VEGF、 TGF β 2、血管生成素和PDGF的至少兩種因子；以及b)至少一種MMP抑制劑。在另一個實施 方案中，所述第一方面的組合物包含生理濃度的a)選自VEGF、TGF β 2、血管生成素和PDGF 的至少三種因子；以及b)至少一種MMP抑制劑。在一個具體的實施方案中，所述MMP抑制 劑選自TIMP-I和TIMP-2。在又一個實施方案中，所述第一方面的組合物包含生理濃度的 VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF和TIMP-I。在又一個實施方案中，所述第一方面的組合物 包含生理濃度的VEGF、TGFi3 2、血管生成素、PDGF和TIMP-2。在一個具體的實施方案中，所 述第一方面的組合物包含生理濃度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF、TIMP-I和 ΜΡ-2。本發(fā)明的第二方面是這樣的，即其中所述源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液為源自羊 膜的細(xì)胞因子溶液。在第二方面的一個具體實施方案中，所述源自羊膜的細(xì)胞因子溶液包 含生理濃度的VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF、TIMP-I和ΤΙΜΡ-2。本發(fā)明的第三方面是一種持續(xù)釋放組合物，所述組合物包含第一方面的源自胚外 細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液或第二方面的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。本發(fā)明的第四方面是一種制備源自羊膜的細(xì)胞因子溶液的方法，包括a)從胎盤 羊膜分離羊膜上皮細(xì)胞，b)從所述羊膜上皮細(xì)胞選取AMP細(xì)胞，c)培養(yǎng)所述AMP細(xì)胞直至 它們匯合，d)更換培養(yǎng)基，e)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及f)收集步驟e)的培養(yǎng)基 以得到源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。在第四方面的一個具體實施方案中，將步驟(f)重復(fù)多 次，并將每個步驟(f)中得到的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液合并以形成合并的源自羊膜的細(xì) 胞因子溶液。本發(fā)明的第五方面是通過第四方面的方法制備的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。在一 個實施方案中，第五方面的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液是這樣的，即其中所述溶液包含生理 濃度的因子^^^、16 0 2、血管生成素106 、111^-1和/或111^-2。在本發(fā)明組合物的一些 實施方案中，VEGF的生理濃度為約5. 0-16ng/mL，血管生成素的生理濃度為約3. 5-4. 5ng/ mL，PDGF的生理濃度為約100_165pg/mL，TGF β 2的生理濃度為約2. 5-2. 7ng/mL, TIMP-I的 生理濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約1. 04 μ g/mL。本發(fā)明的第六方面是一種生理性細(xì)胞因子溶液的組合物，含有基本由生理濃度的 以下成分組成的治療組分a)選自VEGF、TGFβ 2、血管生成素和PDGF的一種或多種因子， b)至少一種MMP抑制劑；以及c)載體，其中VEGF的生理濃度為約5. 0-16ng/mL，血管生成 素的生理濃度為約3. 5-4. 5ng/mL，PDGF的生理濃度為約100_165pg/mL，TGF β 2的生理濃度 為約2. 5-2. 7ng/mL，并且其中所述載體為生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。在 第六方面的一個實施方案中，所述MMP抑制劑為TIMP-I和/或TIMP-2，并且TIMP-I的生理 濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約1. 04 μ g/mL。第六方面的另一個實施方案含 有基本上由生理濃度的以下成分組成的治療組分a)VEGF、TGFi3 2、血管生成素和PDGF，b) TIMP-I和/或TIMP-2 ；以及c)載體；其中VEGF的生理濃度為約5. 0_16ng/mL，血管生成素 的生理濃度為約3. 5-4. 5ng/mL，PDGF的生理濃度為約100_165pg/mL，TGF β 2的生理濃度為 約2. 5-2. 7ng/mL, TIMP-I的生理濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約1. 04 μ g/mL，并且其中所述載體為生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的第七方面是一種生理性細(xì)胞因子溶液的組合物，含有基本上由選自以 下的組合物組成的治療組分和載體組合物A =VEGF和TIMP-I ；組合物B :VEGF、血管生成 素和TIMP-I ；組合物C :VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-I ；組合物D :VEGF、血管生成 素、PDGF-BB, TGF β 2和TIMP-I ；組合物E VEGF和ΤΙΜΡ-2 ；組合物F :VEGF、血管生成素 和TIMP-2 ；組合物G :VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2 ；組合物H :VEGF、血管生成素、 PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 I :VEGF, TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 J :VEGF、血管生成 素、TIMP-I 和 TIMP-2 ；組合物 K :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-I 和 TIMP-2 ；組合物 L VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-l和TIMP-2 ；組合物M 血管生成素和TIMP-I ；組 合物N 血管生成素、PDGF-BB和TIMP-I ；組合物0 血管生成素、PDGF_BB、TGF β 2和TIMP-I ； 組合物P 血管生成素和ΤΙΜΡ-2 ；組合物Q 血管生成素、PDGF-BB和ΤΙΜΡ-2 ；組合物R 血 管生成素、PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 S 血管生成素、PDGF-BB, TGF β 2、TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 T PDGF-BB 和 TIMP-I ；組合物 U =PDGF-BB, TGF β 2 禾口 TIMP-I ；組合物 V =PDGF-BB 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 W =PDGF-BB, TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 X =PDGF-BB, TIMP-I 和ΤΙΜΡ-2 ；以及組合物Y =PDGF-BB, TGF3 2、TIMP-I和ΤΙΜΡ-2 ；其中VEGF、血管生成素、 PDGF-BB、TGF3 2、ΤΙΜΡ-1 和 ΤΙΜΡ-2 為VEGF 約 5. 0_16ng/mL、血管生成素約 3. 5-4. 5ng/mL、 PDGF 約 100-165pg/mL、TGF β 2 約 2. 5-2. 7ng/mL、TIMP_l 約 0. 68 μ g/mL、TIMP_2 約 1· 04 μ g/ mL，并且其中所述載體為生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的第八方面為一種包含第六和第七方面的組合物的持續(xù)釋放組合物。本發(fā)明的第九方面是還包含這樣的藥劑的第八方面的持續(xù)釋放組合物，即該藥劑 能夠?qū)崿F(xiàn)所述源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液的持續(xù)釋放，其中所述藥劑選自聚合物、聚合 物混合物、透明質(zhì)酸顆粒、微囊化材料或納米顆粒。本發(fā)明的第十方面是一種制備持續(xù)釋放組合物的方法，包括這樣的步驟，即將含 細(xì)胞因子溶液的組合物與能夠?qū)崿F(xiàn)含細(xì)胞因子溶液的組合物持續(xù)釋放的藥劑相結(jié)合。本發(fā)明的第十一方面是通過第十方面的方法制備的持續(xù)釋放組合物。本發(fā)明的第 十二方面是包含本發(fā)明第一至第九以及第十一方面中任一方面的組合物的藥物組合物。定義本文中定義的“分離的”是指將材料從其原始環(huán)境取出，因此是“通過手工”從其 天然狀態(tài)改變而來的。本文使用的術(shù)語“蛋白標(biāo)記物”是指細(xì)胞或在一些情況下特定細(xì)胞類型的質(zhì)膜的 任何蛋白分子特征。本文使用的“富集的”是指，通過從混合物中消除不需要的材料或者選擇并分離需 要的材料(即從其中并非所有細(xì)胞都表達(dá)特定細(xì)胞標(biāo)記物的異質(zhì)細(xì)胞群中分離出具有所 述標(biāo)記物的細(xì)胞)，選擇性濃縮一種或多種材料或者增加一種或多種材料的量。本文使用的術(shù)語“基本上純化的”是指就一種具體標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合而言，細(xì)胞群基本上是同質(zhì)的?；旧贤|(zhì)是指就一種具體標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合而言至少90%， 優(yōu)選95%同質(zhì)。本文使用的術(shù)語“胎盤”是指早產(chǎn)胎盤和足月胎盤二者。 本文使用的術(shù)語“全能細(xì)胞”將具有如下含義。在哺乳動物中，全能細(xì)胞具有變成成體中任何細(xì)胞類型的潛能；變成胚外膜(例如胎盤)的任何細(xì)胞類型的潛能。全能細(xì)胞 為受精卵及其卵裂產(chǎn)生的大致最初4個細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“全能干細(xì)胞(pluripotent stem cell) ”將具有如下含義。全能 干細(xì)胞是真正的干細(xì)胞，具有形成任何體內(nèi)分化細(xì)胞的潛能，但不能形成源自滋養(yǎng)層的胚 外膜的組分。羊膜發(fā)育自上胚層，而非滋養(yǎng)層。迄今為止已確認(rèn)了 3種類型的全能干細(xì)胞 胚胎干(ES)細(xì)胞(在靈長類中還可為全能細(xì)胞)、胚胎生殖(EG)細(xì)胞和胚胎癌(EC)細(xì)胞。 這些EC細(xì)胞分離自畸胎癌，畸胎癌是一種有時出現(xiàn)在胎兒生殖腺中的腫瘤。與其他兩種不 同，它們通常是非整倍體。本文使用的術(shù)語“多能干細(xì)胞(multipotent stem cell) ”是真正的干細(xì)胞，但僅 能分化成有限數(shù)量的類型。例如，骨髓中含有這樣的多能干細(xì)胞，即它們能生成所有的血細(xì) 胞，但不能分化成其他細(xì)胞類型。本文使用的術(shù)語“胚外組織”是指位于胚胎體之外參與胚胎的保護(hù)、營養(yǎng)、廢物去 除等的組織。胚外組織在分娩時被丟棄。胚外組織包括但不限于羊膜、絨毛膜(包含臍帶 和血管的滋養(yǎng)層和胚外中胚層)、卵黃囊、尿囊和羊水(包括其中含有的所有組分)。胚外 組織及源自其的細(xì)胞具有與發(fā)育中的胚胎相同的基因型。本文使用的術(shù)語“胚外細(xì)胞因子分泌細(xì)胞”或“ECS細(xì)胞”是指源自胚外組織、具有 以下特征的細(xì)胞群以生理相關(guān)的短暫方式向細(xì)胞外空間或者向周圍培養(yǎng)基中分泌生理相 關(guān)細(xì)胞因子的獨特結(jié)合物，并且所述細(xì)胞未曾在存在任何源自動物的產(chǎn)物情況下被培養(yǎng)， 從而使得這些細(xì)胞以及源自其的細(xì)胞產(chǎn)物適合在人臨床上應(yīng)用。在一個實施方案中，所述 ECS細(xì)胞分泌選自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFi^ 2的至少一種細(xì)胞因子，以及至少一種 MMP抑制劑。在一個具體的實施方案中，所述MMP抑制劑選自TIMP-I和TIMP-2。在另一個 實施方案中，所述ECS細(xì)胞分泌選自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFi^ 2的一種以上細(xì)胞因 子，以及一種以上MMP抑制劑。在一個具體的實施方案中，所述MMP抑制劑選自TIMP-I和 TIMP-2。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述ECS細(xì)胞分泌細(xì)胞因子VEGF、血管生成素、PDGF 和TGFii 2以及MMP抑制劑TIMP-I和/或TIMP-2。在所述獨特的結(jié)合物中，所述一種細(xì) 胞因子或多種細(xì)胞因子的生理范圍如下=VEGF約5. 0-16ng/mL，血管生成素約3. 5-4. 5ng/ mL, PDGF 約 100_165pg/mL，TGF β 2 約 2. 5-2. 7ng/mL, TIMP-I 約 0. 68 μ g/mL, TIMP-2 約 1. 04 μ g/mL。所述ECS細(xì)胞任選地可表達(dá)胸腺素β 4。ECS細(xì)胞可選自本申請和以下專利文 獻(xiàn)中描述的細(xì)胞群和組合物US2003/0235563、US2004/0161419、US2005/0124003、美國臨 時串請 60/666，949,60/699, 257,60/742, 067,60/813, 759、美國申請 11/333，849、美國申 請 11/392，892、PCTUS06/011392、US2006/0078993、PCT/US00/40052、美國專利 7，045, 148、 US2004/0048372和US2003/0032179，這些專利文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用的方式全文納入本文。本文使用的術(shù)語“源自羊膜的多能祖細(xì)胞”或“AMP細(xì)胞”是指源自羊膜的上皮細(xì) 胞的特定ECS細(xì)胞群。除了 ECS細(xì)胞的上述特征外，AMP細(xì)胞還具有如下的特征。它們都 未曾在存在任何源自動物的產(chǎn)物的情況下被培養(yǎng)，從而使得它們以及源自其的細(xì)胞產(chǎn)物適 合在人臨床上應(yīng)用。它們不需要飼養(yǎng)層即可生長，不表達(dá)蛋白端粒末端轉(zhuǎn)移酶并且是非致 瘤的。AMP細(xì)胞不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物⑶34蛋白。在該群中不存在⑶34陽性細(xì)胞，表 明該隔離群未被造血干細(xì)胞例如臍帶血或胚胎成纖維細(xì)胞污染。幾乎100%的細(xì)胞都可與 低分子量細(xì)胞角蛋白的抗體反應(yīng)，證實了它們的上皮性質(zhì)。新鮮分離的AMP細(xì)胞不與干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)記物c-kit (⑶117)和Thy-I (⑶90)的抗體反應(yīng)。多種用于從足月胎盤或早 產(chǎn)胎盤得到細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見，例如US 2004/0110287 ；Anker et al., 2005，Stem cells22 :1338_1345 ；Ramkumar et al.，1995,Am. J. Ob. Gyn. 172 :493_500)。然 而，本文使用的方法可提供改良的組合物和細(xì)胞群。AMP細(xì)胞以前被描述為“源自羊膜的細(xì) 胞”(參見美國臨時申請 60/666，949,60/699, 257,60/742, 067、美國臨時申請 60/813，759、 美國申請11/333，849、美國申請11/392，892和PCTUS06/011392，上述文獻(xiàn)的每一篇均通過 引用的方式全文納入本文)。術(shù)語“無動物的”在述及本文所述的某些組合物、生長條件、培養(yǎng)基等時是指除臨 床級的人材料例如重組產(chǎn)生的人蛋白外，無源自動物的材料例如動物血清用于所述這些組 合物或方法的制備、生長、培養(yǎng)、增殖、存儲或配制中。術(shù)語“無血清”在述及本文描述的某些組合物、生長條件、培養(yǎng)基等時是指，無源自 動物(即無非人)的血清用于所述這些組合物或方法的制備、增殖、培養(yǎng)、擴(kuò)大、保存或配制 中。術(shù)語“增殖的”在述及細(xì)胞組合物時是指與使用以前的方法得到的細(xì)胞群相比，細(xì) 胞群具有顯著更高的細(xì)胞濃度。例如，在5次傳代后，AMP細(xì)胞的增殖組合物中每克羊膜組 織的細(xì)胞水平比原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目高至少50倍，上至150倍，相比較而言，使用以前 的方法時這些細(xì)胞增加約20倍。在另一個實例中，在3次傳代后，AMP細(xì)胞的增殖組合物 中每克羊膜組織的細(xì)胞水平比原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目高至少30倍，上至100倍。因此， “增殖的”群的每克羊膜組織的細(xì)胞數(shù)目比以前的方法提高至少2倍，上至10倍。術(shù)語“增 殖的”僅涵蓋這樣的情況，即人介入其中以提高細(xì)胞數(shù)目。本文使用的術(shù)語“傳代”是指這樣的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，即其中將在組織培養(yǎng)容器中生 長達(dá)到匯合或?qū)⒁_(dá)到匯合的培養(yǎng)物中的細(xì)胞從所述容器取出，以新鮮培養(yǎng)基稀釋(即以 1 5稀釋)，并放置于新的組織培養(yǎng)容器中以使它們繼續(xù)生長和存活。例如，從所述羊膜 分離的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞。通過在本文描述的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)來在培養(yǎng)物中使這種細(xì) 胞增殖。當(dāng)將這種原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，每一輪傳代培養(yǎng)被稱為一個世代。本文使用 的“原代培養(yǎng)物”是指新鮮分離的細(xì)胞群。本文使用的“條件培養(yǎng)基”是指特定細(xì)胞或細(xì)胞群已在其中培養(yǎng)、隨后被除去的培 養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中時，它們可分泌對其他細(xì)胞提供支持或者影響其他細(xì)胞行為 的細(xì)胞因子。這種因子包括但不限于激素、細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)(ECM)、蛋白、小泡、抗體、趨 化因子、受體、抑制劑和顆粒。含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基是所述條件培養(yǎng)基。制備條件培養(yǎng)基的 方法的實例記載于美國專利6，372，494，它通過引用的方式全文納入本文。如本文使用的， 條件培養(yǎng)基還指從條件培養(yǎng)基或者從包括AMP細(xì)胞的ECS細(xì)胞回收和/或純化的組分，例 如蛋白。本文使用的術(shù)語“含細(xì)胞因子溶液”或“CFS”組合物是指這樣的組合物，即該組合物具有生理濃度的選自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFi^ 2的一種或多種因子以及至少一種 MMP抑制劑。合適的MMP抑制劑的實例包括但不限于TIMP-I和TIMP-2。CFS組合物包括源 自ECS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、源自羊膜的細(xì)胞因子溶液組合物(見下文的定義)、生理性細(xì)胞 因子溶液組合物(見下文的定義)和這些CFS組合物的持續(xù)釋放制劑。本文使用的術(shù)語“源自羊膜的細(xì)胞因子溶液”或“ACCS”是指源自AMP細(xì)胞或增殖的AMP細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。源自羊膜的細(xì)胞因子溶液或ACCS以前被稱為“源自羊膜的細(xì)胞因子懸液”。本文使用的術(shù)語“生理性細(xì)胞因子溶液”或“PCS”組合物是一種非細(xì)胞來源并且 具有生理濃度以下成分的組合物選自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFi^ 2的一種或多種因 子以及至少一種MMP抑制劑。合適的MMP抑制劑的實例包括但不限于TIMP-I和TIMP-2。本文使用的術(shù)語“懸液”是指含分散的組分即細(xì)胞因子的液體。所述分散的組分 可以完全溶解、部分溶解、懸浮或者分散于液體中。合適的液體包括但不限于水、滲透溶液 例如鹽溶液和/或糖溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基以及其他水溶液或非水溶液。本文使用的術(shù)語“裂解產(chǎn)物”是指裂解細(xì)胞例如AMP細(xì)胞并任選除去細(xì)胞碎片(如 細(xì)胞膜)時得到的組合物。實現(xiàn)這一點可通過機(jī)械方式、通過凍融、通過超聲、通過使用洗 滌劑例如EDTA、或者通過使用例如透明質(zhì)酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶的酶消化。本文使用的術(shù)語“生理的”或“生理水平”是指物質(zhì)在生命體系中存在的、并且與 生化過程和/或生物過程正確發(fā)揮功能有關(guān)的水平。本文使用的術(shù)語“合并的”是指多種組合物，這些組合物已被合并以形成一種具有 比非合并的組合物更加恒定或更加一致的特征的新組合物。例如，合并的ACCS具有比非 合并的ACCS更加恒定或更加一致的特征。合并的組合物的實例包括“SP合并物”(多于一 份ACCS收集物/胎盤)、“MPl合并物”(一份ACCS收集物/胎盤，多個胎盤)、“MP2合并 物”(多于一份ACCS收集物/胎盤，多個胎盤)。本文使用的術(shù)語“基底”是指細(xì)胞附著于其上、在其上生長和/或在其上遷移的表 面上的確定涂層。本文使用的術(shù)語“基質(zhì)”是指細(xì)胞生長于其中或其上的組分可確定或不 確定的物質(zhì)?；|(zhì)包括生物物質(zhì)和非生物物質(zhì)二者。本文使用的術(shù)語“支架”是指細(xì)胞生 長于其中或其上的三維(3D)結(jié)構(gòu)(基底和/或基質(zhì))。支架可由生物組分、合成組分或上 述二者的組合構(gòu)成。再者，支架可以是由細(xì)胞形成的天然結(jié)構(gòu)或者是人工形成的結(jié)構(gòu)。另 夕卜，支架可包含在合適條件下具有生物活性的組分。本文使用的術(shù)語“一種細(xì)胞產(chǎn)物”或“多種細(xì)胞產(chǎn)物”是指由細(xì)胞制備并分泌的任 何物質(zhì)和全部物質(zhì)，包括但不限于蛋白因子(即生長因子、分化因子、移植因子、細(xì)胞因子、 形態(tài)發(fā)生素)、蛋白酶(即以促進(jìn)內(nèi)源細(xì)胞分層)、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞基質(zhì)組分(即纖連蛋 白等)。術(shù)語“治療有效量”是指達(dá)到所需生理效應(yīng)(即加速傷口愈合)需要的治療劑的量。本文使用的術(shù)語“可藥用的”是指構(gòu)成制劑的除所述治療劑外的組分適合給予本 發(fā)明待治療患者。本文使用的術(shù)語“治療組分”是指在將所述組合物給予受試者時發(fā)揮治療效果的 所述組合物的組分。本文使用的術(shù)語“治療性蛋白”包括多種生物活性蛋白，包括但不限于生長因子、 酶、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子抑制劑、凝血因子、肽生長和分化因子。本文使用的術(shù)語“組織”是指聯(lián)合起來行使具體功能的相似分化細(xì)胞的聚集物。本文使用的術(shù)語“一 (a) ”或“一種(an) ”是指一種或多種；至少一種。本文使用的術(shù)語“附加的”是指共同地、一起、另外地、相結(jié)合地等。
本文使用的術(shù)語“共同給藥”可包括同時或序貫給予兩種或多種藥劑。本文使用的術(shù)語“藥劑”是指一種活性劑或非活性劑。術(shù)語“活性劑”是指當(dāng)給予受試者時能夠具有生理作用的藥劑?；钚詣┑姆窍拗菩詫嵗ㄉL因子、細(xì)胞因子、抗生 素、細(xì)胞、來自細(xì)胞的條件培養(yǎng)基等。術(shù)語“非活性劑”是指在給藥時沒有生理作用的藥劑。 這種藥劑也被稱為“可藥用賦形劑”。非限制性實例包括延時釋放膠囊等。術(shù)語“腸胃外給藥”和“腸胃外給予”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并指非腸內(nèi)給藥和局部給藥的給藥方式，所述給藥方式是通常通過注射并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、 囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、椎管內(nèi)、 硬膜外、腦內(nèi)和胸骨內(nèi)注射或注入。本文使用的術(shù)語“持續(xù)釋放”、“延長釋放”、“延時釋放”、“控制釋放”或“連續(xù)釋放” 是指這樣的藥劑——通常為治療劑或藥物，即該藥劑配制成可緩慢地溶解且隨時間釋放。本文使用的術(shù)語“可生物侵蝕的”或“生物侵蝕”是指導(dǎo)致物質(zhì)崩解的物理過程 (即解體)和化學(xué)過程(即化學(xué)鍵斷裂)的結(jié)合。本文使用的術(shù)語“可生物降解的”或“生物降解”是指生物劑(即酶、微生物或細(xì) 胞)可造成物質(zhì)崩解。本文使用的術(shù)語“可生物再吸收的”或“可生物吸收的”通過細(xì)胞活性(即吞噬作 用)除去崩解產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語“納米顆?！笔侵钢睆叫∮贗OOnm的顆粒，所述顆粒與相同材料的 更大顆粒相比呈現(xiàn)新的或增強的依賴于大小的性質(zhì)。本文使用的術(shù)語“療法”、“治療”或“進(jìn)行治療”涵蓋對哺乳動物(特別是人)的疾 病或病癥的任何治療，包括(a)防止易患所述疾病或病癥但尚未確診的受試者罹患所述 疾病或病癥；(b)抑制所述疾病或病癥，即阻止其發(fā)展；(c)減輕和/或改善所述疾病或病 癥，即引起所述疾病或病癥消退；或者(d)治愈所述疾病或病癥，即終止其發(fā)展或進(jìn)展。本 發(fā)明方法所治療的受試群包括患有不希望的病癥或疾病的受試者，以及處于發(fā)生所述病癥 或疾病的風(fēng)險中的受試者。本文使用的“傷口”是由任何原因引起的正常解剖結(jié)構(gòu)(內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)和/或外 部解剖結(jié)構(gòu))的任何破裂，包括但不限于創(chuàng)傷性損傷，例如機(jī)械損傷(即挫傷、刺入)、熱損 傷、化學(xué)損傷、電損傷、輻射損傷、沖撞損傷和割傷；選擇性損傷，例如外科手術(shù)及產(chǎn)生的切 口疝、瘺等；急性傷口、慢性傷口、感染傷口和無菌傷口，以及與疾病狀態(tài)相關(guān)的傷口(即糖 尿病神經(jīng)病變潰瘍、腸胃道潰瘍或泌尿生殖道潰瘍)。傷口是動態(tài)的，愈合過程是需要一系 列完整的和相互關(guān)聯(lián)的細(xì)胞過程的連續(xù)過程，所述細(xì)胞過程開始于受傷之時，繼續(xù)至最初 的傷口閉合之后，終止于產(chǎn)生穩(wěn)定的瘢痕之時。這些細(xì)胞過程受體液物質(zhì)的介導(dǎo)或調(diào)節(jié)，所 述體液物質(zhì)包括但不限于細(xì)胞因子、淋巴因子、生長因子和激素。根據(jù)本發(fā)明，“傷口愈合” 是指通過一些形式的干涉改善組織修復(fù)的自然細(xì)胞過程和體液物質(zhì)，使得愈合更快和/或 所形成的愈合區(qū)域瘢痕更小和/或受傷區(qū)域具有接近于未損傷組織的組織強度和/或受傷 組織獲得一定程度的功能恢復(fù)。本文使用的術(shù)語“傷口愈合標(biāo)準(zhǔn)動物模型”是指本領(lǐng)域公認(rèn)的任何傷口愈合動物 模型，其中本發(fā)明組合物表現(xiàn)出以加速傷口愈合來衡量的有效性。合適模型的非限制性 實例記載于 Hayward PG, Robson MC :Animal models of wound contraction. In BarbulA，et al :Clinical andExperimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair Normaland Chronic Wounds. John Wiley & SonsiNew York，1990 ；DelBecarro，et al :The use of specific thromboxane inhibitors to preserve thedermal microcirculation after burning. Surgery 87 137-141,1980 ；Robson，et al Increasing dermal perfusion after burning by decreasingthromboxane production. J Trauma 20 722-725,1980 ；Polo,et al :Anin vivo model of human proliferative scar. J Surg Res 74 :187-195，1998。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉其他合適的模型。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力釆用常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA 技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整解釋。參見，例如Sambrook et al，2001，“ Molecular Cloning :A Laboratory Manual “ ；Ausubel, ed.，1994， “ Current Protocols in Molecular Biology “ VolumesI-III ；Celis, ed. , 1994, “ Cell Biology :A Laboratory Handbook “ Volumes I-III ；Coligan，ed.，1994， “ Current Protocols in Immunology “ Volumes I-III ；Gait ed.，1984，“ Oligonucleotide Synthesis “； Hames &Higgins eds. ，1985， “ Nucleic Acid Hybridization “ ；Hames & Higgins， eds. ，1984， “ Transcription And Translation" ；Freshney，ed. ，1986， “ Animal Cell Culture" ；IRL Press，1986，“ Immobilized Cells AndEnzymes" ；Perbal，1984，“ A Practical Guide To Molecular Cloning"。如果給出數(shù)值范圍，應(yīng)理解為，本發(fā)明中涵蓋在所述范圍的上限和下限之間的每 個中間值(除非上下文另外明確指出，否則這些中間值之間間隔下限單位的十分之一)，以 及所述范圍中任何其他規(guī)定值或中間值。本發(fā)明還涵蓋可獨立地包含于這些較小范圍中的 較小范圍的上下限，這些上下限受制于所述范圍內(nèi)任何專門排除的端值。如果所述范圍包 含一個或兩個端值，則不包括這些所包括端值中任一個或兩個的范圍同樣被包括在本發(fā)明 中。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù) 人員普遍理解的含義相同。盡管任何與本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料 都可用于實施或檢驗本發(fā)明，但是下面將描述優(yōu)選的方法和材料。應(yīng)注意，在本文中和隨附的權(quán)利要求書中，除非上下文中明示，否則單數(shù)形式“一 種(a)”、“一個(an)”和“這個(the) ”包括復(fù)數(shù)指代對象。獲得并培養(yǎng)細(xì)胞ECS細(xì)胞——用于從胚外組織分離細(xì)胞的多種方法記載本領(lǐng)域中，所述細(xì)胞 隨后可用于產(chǎn)生本發(fā)明的ECS細(xì)胞(參見，例如US2003/0235563 ；US2004/0161419 ； US2005/0124003 ；美國臨時申請 60/666，949,60/699, 257,60/742, 067,60/813, 759 ；美 國申請 11/333, 849 ；美國申請 11/392, 892 ；PCTUS06/011392 ；US2006/0078993 ；PCT/ US00/40052 ；美國專利 7，045，148 ；US2004/0048372 和 US2003/0032179)。鑒定ECS細(xì)胞——一旦分離了胚外組織，就需要鑒定所述組織中哪些細(xì)胞具有 ECS細(xì)胞相關(guān)特征(見上文的定義)。例如，對細(xì)胞向胞外空間或周圍培養(yǎng)基中分泌獨特 的細(xì)胞因子結(jié)合物的能力進(jìn)行測定。合適的細(xì)胞為那些其中所述一種或多種細(xì)胞因子以以下生理范圍存在的細(xì)胞VEGF約5. 0-16ng/mL,血管生成素約3. 5-4. 5ng/mL, PDGF約 100-165pg/mL,TGF β 2 約 2. 5-2. 7ng/mL,TIMP-I約 0. 68 μ g/mL,TIMP-2 約 1. 04 μ g/mL。所 述細(xì)胞任選地可分泌胸腺素β 4。AMP細(xì)胞——在一個具體的實施方案中，AMP細(xì)胞的組合物使用以下步驟進(jìn)行制備a)從胎盤收集羊膜，b)從所述羊膜離解羊膜上皮細(xì)胞，c)從所述羊膜上皮細(xì)胞分離AMP 細(xì)胞，d)在添加有天然來源的或重組產(chǎn)生的人蛋白的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述AMP細(xì)胞；以 及任選地d)使用另外的添加劑和/或生長因子進(jìn)一步增殖所述細(xì)胞。詳情描述于美國公 開文本2006-0222634-A1中，該公開文本通過引用的方式納入本文。AMP細(xì)胞按如下條件進(jìn)行培養(yǎng)將所述AMP細(xì)胞培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基 包括但不限于 Epilife (Cascade Biologicals)、Opti-pro、VP-SFM、IMDM、Advanced DMEM、 K/0 DMEM、293SFMII (均由 Gibco、Invitrogen 生產(chǎn))、HPGM、Pro 293S-CDM、Pro293A_CDM、 UltraMDCK、UltraCulture (均由 Cambrex 生產(chǎn))、StemlineI 和 Stemline II(均由 Sigma-Aldrich 生產(chǎn))、DMEM、DMEM/F-12、Ham' s F12、M199 和其他等同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。這 種培養(yǎng)基可任選地包含臨床級的人蛋白或者補加有人臨床級蛋白。本文使用的“人蛋白”是 天然產(chǎn)生的蛋白或使用重組技術(shù)產(chǎn)生的蛋白。在一些具體實施方案中，“人蛋白”還包括包 含人蛋白的人體液或者其衍生物或制品，例如人血清或羊水。在一個最優(yōu)選的實施方案中，使用無動物產(chǎn)物的體系培養(yǎng)所述細(xì)胞，以避免外源 性污染。在該實施方案中，培養(yǎng)基為Stemline I或II、Opti-pro、IMDM或者DMEM，并任選 地補加有濃度最高達(dá)10%的臨床級人白蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基除了是非 動物性的之外，還是無血清的。任選地，可使用其他的因子。在一個實施方案中，使用濃度為0-1 μ g/mL的表皮生 長因子(EGF)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述EGF濃度為大約lOng/mL?？墒褂玫钠渌?長因子包括但不限于TGFa或TGFi3 (5ng/mL ；范圍為0. 1-lOOng/mL)、激活素A、霍亂毒素 (優(yōu)選約0. 1 μ g/mL的水平；范圍為0-10 μ g/mL)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 μ g/mL ；范圍為0. I-IOOyg/ mL)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF 40ng/mL(范圍為 0_200ng/mL)、aFGF、FGF-4、FGF-8 (范圍 均為0-200ng/mL))、骨形態(tài)生成蛋白(即BMP-4)或已知可增強細(xì)胞增殖的其他生長因子。 所有補加物都是臨床級的。生成含細(xì)胞因子溶液的條件培養(yǎng)基生成ECS條件培養(yǎng)基——按照下文中針對ACCS的描述進(jìn)行，不同之處是使用ECS 細(xì)胞。生成ACCS——本發(fā)明的AMP細(xì)胞可用于生成ACCS。在一個實施方案中，如本文所 述分離AMP細(xì)胞，并以1 X IO6個細(xì)胞/mL接種至裝有5_30mL培養(yǎng)基、優(yōu)選10_25mL培養(yǎng)基 并且最優(yōu)選約IOmL培養(yǎng)基的T75燒瓶中。將所述細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，更換培養(yǎng)基，在一個實 施方案中，在匯合后1天收集ACCS。在另一個實施方案中，更換培養(yǎng)基并且在匯合后2天收 集ACCS。在另一個實施方案中，更換培養(yǎng)基并且在匯合后4天收集ACCS。在另一個實施方 案中，更換培養(yǎng)基并且在匯合后5天收集ACCS。在一個優(yōu)選的實施方案中，更換培養(yǎng)基并 且在匯合后3天收集ACCS。在另一個優(yōu)選的實施方案中，更換培養(yǎng)基并且在匯合后3、4、5、 6或更多天收集ACCS。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法還考慮到了用于從AMP細(xì)胞 培養(yǎng)物收集ACCS的其他實施方案，例如使用其他組織培養(yǎng)容器包括但不限于細(xì)胞工廠、燒瓶、中空纖維或懸浮培養(yǎng)容器，或者從亞匯合的和/或活躍增殖的培養(yǎng)物收集ACCS。本發(fā)明 還考慮到了在收集所述ACCS后將其深冷藏。本發(fā)明還考慮到了在收集所述ACCS后將其凍 干。本發(fā)明還考慮在收集所述ACCS后將其配制用于持續(xù)釋放。還考慮到了 ACCS生產(chǎn)的規(guī) ?；?，以生成足夠的產(chǎn)物用于臨床試驗及用于市售。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知深冷藏、凍干和持 續(xù)釋放制劑的方法。本發(fā)明還考慮到了在使用前以合適的稀釋劑稀釋CFS組合物例如ACCS和合并的 ACCS。合適的稀釋劑包括但不限于生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、條件細(xì)胞 培養(yǎng)基、水等。這種稀釋度可以是1 2、1 3、1 4、1 5、1 10,1 100等。另外， 稀釋度可低于1 2(即1 1、1 0.5等)。所需的合適稀釋度將取決于擬定目的，因此 將需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。本發(fā)明的CFS組合物(包括ACCS、合并的ACCS、PCS等)的特征在于，對生理 相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其生理相關(guān)范圍分別為VEGF約5-16ng/mL，血管生成素約 3. 5-4. 5ng/mL, PDGF 約 100_165pg/mL，TGF3 2 約 2. 5-2. 7ng/mL, TIMP-1 約 0. 68 u g/mL, TIMP-2約1. 04 u g/mL。任選地檢測ACCS和合并的ACCS中是否存在胸腺素3 4。生成生理性細(xì)胞因子溶液(PCS)組合物非源自細(xì)胞形式的ACCS (本文中稱作生理性細(xì)胞因子溶液(“PCS”))組合物通 過以下方式生成在載體中合并生理水平的VEGF、血管生成素、PDGF、TGF0 2中的一種或多 種以及一種或多種MMP抑制劑(即TIMP-1和/或TIMP-2)。任選地，所述PCS包含胸腺素 3 4。這些細(xì)胞因子的生理水平與在ACCS中出現(xiàn)的生理水平相同。合適的載體包括但不限 于生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、條件細(xì)胞培養(yǎng)基、水等。這樣的組合物適合 于深冷藏、凍干、持續(xù)釋放制劑、規(guī)?；?。本發(fā)明考慮到，可生產(chǎn)PCS使其包含的因子的濃 度水平比在ACCS中出現(xiàn)的濃度水平高，并且可隨后在使用前以合適的稀釋劑將它稀釋。合 適的稀釋劑包括但不限于生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、條件細(xì)胞培養(yǎng)基、 水等。這種稀釋度可以是1 2、1 3、1 4、1 5、1 10,1 100等。另外，這類稀釋 度可低于1 2(即1 1、1 0.5等)。所需的合適的稀釋度將取決于擬定目的，因此將 需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。本發(fā)明的組合物可根據(jù)其擬定目的以多種方式制備。例如，組合物可以是含本發(fā) 明的藥劑(即ACCS、合并的ACCS和PCS)的液體。液體組合物還包括凝膠。所述液體組合 物可以是水性的，或者是軟膏劑、油劑、乳膏的形式。還可以適合噴霧施用或者氣霧施用的 方式配制所述液體組合物。有用的水性懸液可包含一種或多種作為助懸劑的聚合物。有用的聚合物包括水溶 性聚合物如纖維素聚合物以及不溶于水的聚合物如交聯(lián)的含羧基聚合物。本發(fā)明的水性懸 液或溶液/懸液優(yōu)選地是粘稠的或粘附性的，甚至更優(yōu)選地是粘稠的和粘附性的。持續(xù)釋放組合物所述CFS組合物(包括但不限于ACCS、合并的ACCS和PCS)可配制為持續(xù)釋放的 CFS組合物(在本文中稱為“SR-CFS”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備治療劑(包括基于蛋白 的治療劑如ACCS、合并的ACCS或PCS)的持續(xù)釋放組合物的方法。SR-CFS(包括但不限于SR-ACCS和SR-PCS)可由本文中所述的任一方法制備。例 如，多泡脂質(zhì)體制劑技術(shù)可用于蛋白和肽治療劑的持續(xù)釋放。Qui，J.等人(ACTA Pharmacol
15Sin, 2005, 26 (11) =1395-401)描述了用于配制持續(xù)釋放的干擾素a-2b的這一方法。Vyas， S.P.等人(Drug Dev Ind Pharm, 2006, 32 (6) 699-707)描述了在多泡脂質(zhì)體中包封聚乙 二醇化干擾素a。ACCS (包括合并的ACCS)和PCS適合用于多泡脂質(zhì)體持續(xù)釋放制劑中。納米顆粒技術(shù)也可用于制備SR-CFS。例如，Packhaeuser，CB.等人(J Control Release, 2007,123 (2) 131-40)描述了基于裝載胰島素的二烷基氨基烷基-胺-聚(乙烯 醇)-g_聚(丙交酯共乙交酯)納米顆粒的可生物降解的腸胃外貯藏系統(tǒng)，并得出這樣的結(jié) 論，即基于納米顆粒的貯藏體為用于針對生物活性大分子(即蛋白)設(shè)計控制釋放裝置的 合適候選物。Dailey，L.A.等人(Pharm Res 2003,20(12) :2011_20)描述了基于支化聚合 物DEAPA-PVAL-g-PLGA的無表面活性劑的可生物降解納米顆粒用于氣溶膠療法，并得出這 樣的結(jié)論，即DEAPA-PVAL-g-PLGA為多能藥物遞送系統(tǒng)。ACCS (包括合并的ACCS)和PCS適 合用于基于納米顆粒的持續(xù)釋放制劑。
基于聚合物的持續(xù)釋放制劑也是非常有用的。Chan，Y. P.等人(Expert Op in Drug Deliv，2007，4(4) :441_51)提供了 Medusa系統(tǒng)(Flame 1 Technologies)的綜述，所述 Medusa系統(tǒng)用于持續(xù)釋放的蛋白和肽療法。迄今為止，Medusa系統(tǒng)已在動物模型(大鼠、 狗、猴子)中以及在腎癌(IL-2)患者和丙型肝炎(IFN-ci (2b))患者的臨床試驗中應(yīng)用于 皮下注入 IL-2 和 IFN-a (2b)。Chavanpatil，M. D.等人(PharmRes，2007，24 (4) :803_10)描 述了表面活性劑聚合物納米顆粒，作為用于水溶性分子的持續(xù)且增強細(xì)胞遞送的新平臺。 Takeuchi，H.等人(AdvDrug Deliv Res，2001，47 (1) :39_54)描述了用于肽藥物遞送的粘 附性納米顆粒系統(tǒng)，其包含脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒。Wong，H.L.等人(Pharm Res, 2006, 23(7) 1574-85)描述了新的聚合物-脂質(zhì)雜合系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被證明可提高多柔比星對多 藥物抗性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。CFS組合物，包括但不限于ACCS (包括合并的ACCS)和 PCS適合用于上述持續(xù)釋放制劑方法中。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其他持續(xù)釋放方法——雖然未在本文中具體地描 述——也適合與所述CFS組合物一塊使用。包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS (包括合并的ACCS)禾P SR-PCS的 CFS組合物的藥物組合物本發(fā)明提供了 CFS組合物和可藥用載體的藥物組合物。術(shù)語“可藥用”是指由美國 聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者在美國藥典(u. S. Pharmacopeia)或其他普遍公認(rèn) 的針對用于動物、尤其是用于人的藥典中列出。術(shù)語“載體”是指與所述組合物一塊給藥的 稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體。這種藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動 物油、植物油或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、麻油等。合適的藥物賦形劑包 括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、磨粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、 滑石粉、氯化鈉、干脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。根據(jù)需要，所述組合物還可含 有少量的潤濕劑或乳化劑，或者PH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸液、乳劑、片劑、丸 劑、膠囊劑、粉末劑、持續(xù)釋放制劑等的形式。合適的藥物載體的實例由E.W.Martin記載于 "Remington' s Pharmaceutical Sciences”中，并且還被本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其他人記 載。本發(fā)明的藥物組合物可配制為中性形式或鹽形式。可藥用的鹽包括那些用游離氨 基形成的鹽，例如鹽酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽等，以及那些用游離羧基形成
16的鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、氫氧化鐵鹽、異丙胺鹽、三乙胺鹽、2-乙氨基乙醇的鹽、組 氨酸鹽、普魯卡因鹽等。含包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS (包括合并的ACCS)和SR-PCS 的CFS組合物的治療試劑盒本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)制品，包括包裝材料和包含在所述包裝材料中的本發(fā)明 的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含CFS組合物。所述包裝材料包含一個標(biāo)簽或藥物 說明書，其標(biāo)明內(nèi)含的CFS組合物可用于治療性應(yīng)用，例如用于傷口愈合。包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS (包括合并的ACCS)和SR-PCS的 CFS組合物的制劑、劑量和給藥可將包含CFS組合物的組合物給予一名受試者以提供多種細(xì)胞功能或組織功能， 例如以加速傷口愈合。本文使用的“受試者”可以指人或非人動物。這樣的組合物可使用一種或多種生理上可接受的載體(任選地包含賦形劑和輔 劑)以任何常規(guī)的方式配制。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑。所述組合物可以與其 治療用途的書面說明書一塊包裝。所述組合物還可在一種或多種生理上可接受的載體中給 予所述接受者。用于CFS組合物的載體可包括但不限于溶液生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)、含生理濃度的鹽混合物的乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定用于具體的目的合適的CFS組合物劑量。優(yōu) 選的劑量范圍是每平方厘米施用面積約0. 1至1000微克。其他優(yōu)選的劑量范圍為1. 0至 50. 0微克/施用面積。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相對少量的CFS組合物在 治療上是有用的。這種治療效用的一個例證是ACCS(包括合并的ACCS)加速傷口愈合的能 力(詳見美國公開2006/0222634和美國公開2007/1231297，每篇通過引用的方式納入本 文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，給藥的劑量數(shù)目也需要基于例如被治療疾病、病癥或損傷 的嚴(yán)重度和類型根據(jù)經(jīng)驗確定。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，一個劑量足以具有治療效 果(即加速傷口愈合)。其他優(yōu)選的實施方案為實現(xiàn)治療效果而考慮2個、3個、4個或更多 個劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，優(yōu)選的劑量為在對其有需要的患者中產(chǎn)生治療效果例如 加速傷口愈合的劑量(治療有效量)。當(dāng)然，所述CFS組合物的合適劑量需要基于多個變量 在使用時根據(jù)經(jīng)驗確定，所述變量包括但不限于被治療的損傷、障礙或病癥的嚴(yán)重度和類 型；患者的年齡、體重、性別、健康狀態(tài)；正給予所述患者的其他藥劑和治療；等等。本領(lǐng)域 技術(shù)人員還應(yīng)了解，給藥的劑量數(shù)目(劑量方案)還需要基于例如被治療的損傷、障礙或病 癥的嚴(yán)重度和類型根據(jù)經(jīng)驗確定。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，給藥頻率需要基于例如 被治療的損傷、障礙或病癥的嚴(yán)重度和類型根據(jù)經(jīng)驗確定。在一些實施方案中，每天給予一 個劑量，持續(xù)給定的天數(shù)(即每天一次持續(xù)7天，等)。在另一些實施方案中，1天中(每4 小時等)可給予多個劑量。本發(fā)明還考慮每天多個劑量，持續(xù)多天。在本發(fā)明的另一些實施方案中，至少一種另外的藥劑可與所述CFS組合物結(jié)合。 這樣的藥劑可與本發(fā)明的CFS組合物協(xié)同地作用，以增強治療效果。這樣的藥劑包括但不 限于生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體、抑制劑、抗生素、免疫抑制劑、類固醇、抗真菌劑、 抗病毒劑或其他細(xì)胞類型(即干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞，例如AMP細(xì)胞)。非活性劑包括載 體、稀釋劑、穩(wěn)定劑、膠化劑、遞送載體、ECM(天然的及合成的)、支架等。如果所述CFS組合物與其他藥物活性劑結(jié)合給藥，則可以僅需要較少量的CFS組合物即可具有治療效果。CFS組合物可通過注入至受試者的靶位點來給藥，優(yōu)選地經(jīng)遞送裝置例如管如導(dǎo) 管注射。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述管另外包含針頭，例如注射器，通過該針頭可將所 述CFS組合物導(dǎo)入至受試者中的所需位置。向受試者給予所述CFS組合物的具體的非限 制性實例還包括通過以下方式給藥皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、心內(nèi)注 射、皮內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、腦膜外注射、腹膜內(nèi)注射或腦內(nèi)注射。本發(fā)明的方法還考慮到了輸 注(即腦膜下輸注、鞘內(nèi)輸注或腦內(nèi)輸注)。如果是靜脈內(nèi)給藥，可制備一種可注射的液體 懸液，并通過連續(xù)滴注或作為一次推注給藥。在一些情況下，使用輸液泵給予所述CFS組合 物可能是合適的。對給予CFS組合物的時間進(jìn)行確定將取決于被治療的疾病、障礙或損傷的類型和 嚴(yán)重度。在一個實施方案中，在診斷或損傷后盡可能快地給予所述CFS組合物。在另一個實 施方案中，在診斷或損傷后不止一次給予所述CFS組合物。在某些實施方案中，如果需要手 術(shù)，在手術(shù)時給予所述CFS組合物。在另一些實施方案中，在手術(shù)時和手術(shù)后給予所述CFS 組合物。這種手術(shù)后給藥可采取單次給藥形式或多次給藥形式。還可將CFS組合物以不同的形式插入至遞送裝置如注射器中。例如，所述CFS組 合物可以是這類遞送裝置中所包含的溶液的一部分。本文使用的術(shù)語“溶液”包括可藥用 的載體或稀釋劑?？伤幱玫妮d體和稀釋劑包括鹽水、水性緩沖溶液、溶劑和/或分散介質(zhì)。 這些載體和稀釋劑的使用在本領(lǐng)域中是熟知的。所述溶液優(yōu)選地是無菌的，并且流動性達(dá) 到易于注射的程度。優(yōu)選地，所述溶液在制造和保存的條件下是穩(wěn)定的，并且任選地可通過 使用例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，進(jìn)行抗微生物(如細(xì)菌 和真菌)的污染作用的防腐處理。本發(fā)明的溶液可通過將所述CFS組合物整合至可藥用的 載體或稀釋劑中，以及在需要時至上文列舉的其他成分中來制備。CFS組合物可全身給藥(例如經(jīng)靜脈內(nèi))、局部給藥(例如在手術(shù)中通過觀察直接 施用)或外用。為了進(jìn)行這些給藥，所述組合物為可注射的液體懸液制品形式或者為這樣 的生物相容介質(zhì)形式，即該介質(zhì)可以液體形式注射并在受損組織部位變成半固體。還可使 用可控制的內(nèi)窺鏡遞送裝置。所述CFS組合物可整合或植入其中的支持性基質(zhì)包括這樣的基質(zhì)，即這些基質(zhì)是 接受者相容的并且可降解成對所述接受者無害的產(chǎn)物。這種基質(zhì)的實例是天然的和/或合成的可生物降解基質(zhì)。天然的可生物降解基 質(zhì)包括血漿凝塊(例如來自哺乳動物)、膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白基質(zhì)。合適的合成 基質(zhì)材料必須是生物相容的，以排除免疫并發(fā)癥。它還必須是可再吸收的。所述基質(zhì)應(yīng)能 夠被構(gòu)造成多種形狀，并應(yīng)具有足夠強度以防止在植入時坍塌。最近的研究表明，由聚乙 醇酸制成的可生物降解的聚酯聚合物符合所有這些標(biāo)準(zhǔn)(Vacanti，etal. J. Ped. Surg. 23 3-9(1988) ；Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38 145 (1991) ；Vacanti, et al.Plast. Reconstr. Surg. 88 :753_9 (1991))。其他合成的可生物降解的支持基質(zhì)包括合成的聚合物， 例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。合成聚合物的另一些實例以及將組合物整合或植入這些 基質(zhì)的方法也是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。參見，例如美國專利4，298，002和5，308，701。生物可降解的聚合物基質(zhì)的一個優(yōu)點是，可將CFS組合物直接整合至所述支持基 質(zhì)中，使得它可在體內(nèi)隨著所述支持基質(zhì)降解而緩慢釋放。除所述CFS組合物外，還可以將包括以下物質(zhì)的其他因子整合至所述基質(zhì)中或者與所述基質(zhì)結(jié)合提供營養(yǎng)素、生長因子、 誘導(dǎo)分化或去分化(即引起分化的細(xì)胞失去分化特征并獲得諸如增殖和更一般性功能的 特征)的誘導(dǎo)劑、分泌產(chǎn)物、免疫調(diào)節(jié)劑、炎癥抑制劑、消退因子、增強或允許淋巴網(wǎng)絡(luò)或神 經(jīng)纖維向內(nèi)生長的生物活性化合物、透明質(zhì)酸、購自提供商諸如Co 11 aborative Research 和SigmaChemical Co.的藥物(其為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是市售的，同時帶有關(guān) 于多少量構(gòu)成有效量的說明書)、生長因子如表皮生長因子(EGF)以及肝素結(jié)合的表皮生 長因子樣生長因子(HB-EGF)。類似地，可合成含肽如附著肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合 物，用于形成基質(zhì)(參見，例如美國專利4，988，621,4, 792，525,5, 965，997,4, 879，237和 4，789，734)。在另一個實例中，可將所述CFS組合物整合至凝膠基質(zhì)(例如來自Upjohn Company的Gel foam)中。已經(jīng)開發(fā)了多種包封技術(shù)(例如Lacy et al.，Science 254 1782-84(1991) ；Sullivan et al. , Science252 718-712(1991) ；WO 91/10470 ；WO 91/10425 ；美國專利5，837，234 ；美國專利5，011，472 ；美國專利4，892，538)。在涉及直接 物理觸及病態(tài)或損壞組織的開放式手術(shù)過程中，所述CFS組合物遞送制品的全部所述形式 都是可選的。可間斷地重復(fù)給予這些組合物，直至達(dá)到所需的治療效果，即加速傷口愈合。待使用的三維基質(zhì)為提供支架以引導(dǎo)組織愈合和形成過程的結(jié)構(gòu)化基質(zhì)。支架可 采取的形式包括纖維、凝膠、織物、海綿狀片層和使用復(fù)雜的固體自由成型建造(SFFF)方 法建造的有孔和通道的復(fù)雜3-D結(jié)構(gòu)。本文使用的術(shù)語“支架”是指三維(3D)結(jié)構(gòu)(基底 和/或基質(zhì))。它可由生物組分、合成組分或上述兩者的結(jié)合構(gòu)成。此外，它可天然地由細(xì) 胞構(gòu)建或者是人工構(gòu)建的。另外，所述支架可包含在適當(dāng)條件下有生物活性的組分。所述 支架的結(jié)構(gòu)可包括網(wǎng)狀物、海綿，或者可從水凝膠形成。對所述支架進(jìn)行設(shè)計和構(gòu)建以形成三維基質(zhì)是最重要的。所述基質(zhì)應(yīng)該是易彎曲 的、無毒的、可注射多孔模板，用于血管向內(nèi)生長。所述孔應(yīng)使血管向內(nèi)生長。這些通常是 約100-300微米的互聯(lián)孔，即具有100-300微米的間隙空間，但可使用較大的開口。所述基 質(zhì)應(yīng)被定形以使表面積最大化，以使?fàn)I養(yǎng)物、氣體和生長因子足夠地擴(kuò)散。在此時，相對耐 壓縮的多孔結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的，但已經(jīng)證明即使所述基質(zhì)的典型六個面中有一個或兩個面被壓 縮，所述基質(zhì)仍能有效地使組織生長。所述聚合物基質(zhì)可被制成易彎曲的或堅硬的，取決于所需的最終形式、結(jié)構(gòu)和功 能。例如，為了修復(fù)缺損，在植入期間，將所述易彎曲的纖維墊切割約等于整個缺損的大小， 然后根據(jù)需要將之放到外科手術(shù)產(chǎn)生的缺損處。使用纖維基質(zhì)的一個優(yōu)點是，在植入時容 易使所述結(jié)構(gòu)重定形或重排。本發(fā)明還提供了 CFS組合物與上述支持基質(zhì)的任一種以及源自羊膜的膜的結(jié)合 遞送。這樣的膜可作為本發(fā)明所述用于回收AMP細(xì)胞的方法的副產(chǎn)物得到，或者通過例如 以下文獻(xiàn)描述的其他方法得到美國專利6，326，019，其中描述一種用于制備、保存和使用 來自人羊膜的外科移植物的方法；US 2003/0235580，它描述了重建的和重組的羊膜用于向 宿主中的部位持續(xù)遞送治療分子、蛋白或代謝產(chǎn)物；U. S. 2004/0181240，它描述了覆蓋組織 表面的羊膜，所述羊膜可防止粘附、排除細(xì)菌或抑制細(xì)菌活性，或者促進(jìn)愈合或組織生長； 以及美國專利4，361，552，它涉及交聯(lián)羊膜的制備以及所述羊膜在治療燒傷和傷口的方法 中的用途。根據(jù)本發(fā)明，CFS組合物可整合至這些膜之中。
包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS (包括合并的ACCS)和SR-PCS的CFS組合物的示例性治療用途傷口愈合——本發(fā)明的CFS組合物可有效地加速多種原因引起的傷口的傷口愈合，所述原因包括但不限于切割損傷、壓迫損傷、熱損傷、輻射損傷、刺入損傷、沖擊損傷、急 性損傷、慢性損傷、感染損傷和無菌損傷。本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即CFS組合物可加速 所有傷口類型的傷口愈合過程，特別是當(dāng)外部給藥時，即給藥至傷口部位的表面時。使用 CFS組合物時，所有傷口類型——機(jī)械的或熱的、急性的或慢性的、感染的或無菌的——與 使其自然愈合的類似傷口相比或者與以現(xiàn)有方法治療的類似傷口相比，都可發(fā)生更快速地 愈合。本發(fā)明意義上的治療劑的“治療有效量”將由患者的主治醫(yī)師或主治獸醫(yī)確定。這樣 的量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，并且當(dāng)依照本發(fā)明給藥時能夠加速傷口愈合。 影響治療有效量的因素包括所用治療劑的比活性、傷口類型(機(jī)械的或熱的，全厚度的或 部分厚度的，等等)、傷口的大小、傷口深度(如果是全厚度的)、有無感染、從施以損傷起過 去的時間，患者的年齡、身體狀況、其他疾病狀態(tài)的存在情況和營養(yǎng)狀況。另外，患者可能正 使用的其他藥物將會影響待給予治療劑的治療有效量的確定。
實施例給出下列實施例是為了為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何制備和使用本發(fā) 明的組合物和方法的完整公開和描述，非旨在限制本發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍。已努 力確保所使用的數(shù)字(如量、溫度等)的精確度，但是還是應(yīng)該考慮到某些實驗錯誤和誤 差。除非另外指出，否則份數(shù)為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，壓力為大氣壓 或約為大氣壓。 實施例1 制備AMP細(xì)胞組合物AMP細(xì)胞的回收——使用離解劑PXXIII和胰蛋白酶從起始羊膜離解AMP細(xì)胞。羊 膜的平均重量為18_27g。對于從每g羊膜回收的細(xì)胞數(shù)目，以PXXIII離解為10-15X IO6 個，以胰蛋白酶離解為5-8X IO6個。獲得所選擇的AMP細(xì)胞的方法將從羊膜分離的細(xì)胞立即鋪板。在培養(yǎng)基中約 2天后，除去非附著細(xì)胞，保留附著細(xì)胞。這種向塑料組織培養(yǎng)容器的附著是用于得到所 需AMP細(xì)胞群的選擇方法。附著和非附著AMP細(xì)胞似乎具有相似的細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)譜， 但附著細(xì)胞具有更大的生存力，是所需的細(xì)胞群。培養(yǎng)附著的AMP細(xì)胞，直至它們達(dá)到約 120000-150000細(xì)胞/cm2。在這時，培養(yǎng)物匯合。合適的細(xì)胞培養(yǎng)物將在約5_14天達(dá)到該 細(xì)胞數(shù)目。符合該標(biāo)準(zhǔn)是AMP細(xì)胞的增殖能力的指示，不符合該標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞不被選擇用于 進(jìn)一步的分析和使用。一旦AMP細(xì)胞達(dá)到約120000-150000細(xì)胞/cm2，將它們收集并深冷 藏。該收集時間點被稱為p0。實施例2:生成ACCS本發(fā)明的AMP細(xì)胞可用于生成ACCS，包括合并的ACCS。如上述分離AMP細(xì)胞，并 以約IX IO6細(xì)胞/mL接種至裝有約IOmL培養(yǎng)基的T75燒瓶中。將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，更換 培養(yǎng)基并在匯合后3天收集ACCS。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的方法還考慮到了從匯 合培養(yǎng)物收集ACCS的其他實施方案，例如使用其他組織培養(yǎng)容器包括但不限于細(xì)胞工廠、 燒瓶、中空纖維或懸浮培養(yǎng)裝置等(參見上文詳述)。本發(fā)明還考慮在收集所述ACCS后將其深冷藏，凍干或者配制用于持續(xù)釋放。還考慮到了在不同時間點收集ACCS (參見上文詳 述)O實施例3 生成合并的ACCSACCS的獲得基本如上述。在一些實施方案中，從源自一個胎盤的AMP細(xì)胞培養(yǎng)物 中多次收集ACCS，并將這樣的多份ACCS收集物合并在一塊。這樣的合并物被稱為“SP合并 物”(多于一份ACCS收集物/ 一個胎盤)。在另一個實施方案中，AMP細(xì)胞培養(yǎng)物源自數(shù)個 胎盤，即來自5個或10個胎盤。將來自每個胎盤的AMP細(xì)胞培養(yǎng)，從每個培養(yǎng)物收集一份 ACCS收集物，然后將它們都合并在一塊。這樣的合并物稱為“MP1合并物”(一份ACCS收集 物/胎盤，多個胎盤)。在又一實施方案中，AMP細(xì)胞培養(yǎng)物源自數(shù)個胎盤，即來自5個或10 個胎盤。將來自每個胎盤的AMP細(xì)胞培養(yǎng)，從每個AMP細(xì)胞培養(yǎng)物收集多于一份ACCS收集 物，然后合并在一塊。這樣的合并物稱為“MP2合并物”(多于一份ACCS收集物/胎盤，多 個胎盤)。實施例4 使用ELISA檢測非合并的和合并的ACCS中的細(xì)胞因子對來自于獲自10個不同胎盤的AMP細(xì)胞的ACCS進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn) ELISA0除了單獨測定每個ACCS樣品外，還測試合并的ACCS樣品，以確定樣品之間ELISA結(jié) 果的變異性是否減少。按照上文所述得到ACCS。按如下進(jìn)行制備合并物合并物1包含來 自胎盤1-5的ACCS，合并物2包含來自胎盤6-10的ACCS，合并物3包含來自胎盤1_10的 ACCS。另外對SP、MP1、MP2合并物進(jìn)行了 ELISA。實施例5 生成PCS組合物如下的PCS組合物是通過將標(biāo)明的細(xì)胞因子或因子以生理水平結(jié)合于一種載體 中而產(chǎn)生組合物A =VEGF 和 TIMP-1組合物B :VEGF、血管生成素和TIMP-I組合物C :VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1組合物D :VEGF、血管生成素、PDGF_BB、TGF0 2 和 TIMP-1組合物E =VEGF 和 TIMP-2組合物F :VEGF、血管生成素和TIMP-2組合物G :VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2組合物H :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2組合物I :VEGF、TIMP-I 和 TIMP-2組合物J :VEGF、血管生成素、TIMP-I和TIMP-2組合物K :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-I 和 TIMP-2組合物L(fēng) VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2、TIMP-1 和 TIMP-2組合物M 血管生成素和TIMP-I組合物N 血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1組合物0 血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-1組合物P 血管生成素和ΤΙΜΡ-2組合物Q 血管生成素、PDGF-BB和ΤΙΜΡ-2組合物R 血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2
組合物 S 血管生成素、PDGF_BB、TGF0 2、TIMP-1 和 TIMP-2
組合物T =PDGF-BB 和 TIMP-1組合物U PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-1組合物V PDGF-BB 和 ΤΙΜΡ-2組合物W PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2組合物X PDGF-BB、TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2組合物Y PDGF-BB、TGF β 2、TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2組合物A-Y任選地包含胸腺素β 4。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在一些實施方案中， 其他MMP抑制劑(即ΤΙΜΡ-3、ΤΙΜΡ-4或合成的MMP抑制劑)可能是合適的(J. Frederick ffoessner, Jr.，J. Clin. Invest. 108(6) :799_800 (2001) ；Brew, K.，et al, Bioch im Biophvs Acta.2000Mar 7 ； 1477 (1-2) :267_83)。將VEGF、血管生成素、PDGF-BB, TGFβ 2、TIMP-I和ΤΙΜΡ-2以如下的生理水平加 入VEGF 約 5. 0-16ng/mL、血管生成素約 3. 5-4. 5ng/mL、PDGF 約 100_165pg/mL、TGF β 2 約 2. 5-2. 7ng/mL、TIMP-I 約 0. 68 μ g/mL、ΤΙΜΡ-2 約 1. 04 μ g/mL。VEGF 可獲自 Invitrogen, 貨號 #PHG0144、PHGO145, PHGO146, PHGO141 或 PHG0143 ；血管生成素可獲自 R&D Systems, 貨號 #265-AN-050 或 265-AN-250 ；PDGF-BB 可獲自 Invitrogen，貨號 #PHG0044、#PHG0045、 #PHG0046、#PHG0041、#PHG0043 ；TGF β 2 可獲自 Invitrogen，貨號 #PHG9114 ；TIMP-I 可獲自 R&D Systems，貨號 #970-TM-010 ;TIMP-2 可獲自 R&DSystems，貨號 #971-TM_010。將 VEGF、 血管生成素、PDGF-BB, TGF β 2、TIMP-I和ΤΙΜΡ-2加入至一種載體中，所述載體例如生理鹽 水、PBS、乳酸鹽林格溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、水或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他合適水性溶液。在用于傷口愈合的標(biāo)準(zhǔn)動物模型中測試PCS組合物，以評價活性(參見上文對用 于傷口愈合的標(biāo)準(zhǔn)動物模型的定義)。實施例6 生成持續(xù)釋放的CFS組合物SR-CFS組合物如SR-ACCS (包括合并的ACCS)或SR-PCS是通過以下方式產(chǎn)生將 CFS組合物與本文所述的(參見具體實施方式
)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一持續(xù)釋放制 劑技術(shù)相結(jié)合。實施例7 =ACCS在慢性傷口愈合的動物模型中的效應(yīng)將本領(lǐng)域公認(rèn)的慢性肉芽傷口動物模型用于研究ACCS對慢性傷口愈合的效應(yīng) (Hayward P G, Robson MC Animal models of woundcontraction. In Barbul A, et al Clinical and Experimental Approachesto Dermal and Epidermal Repair Normal and Chronic Wounds. JohnWiley&Sons, New York,1990.)。結(jié)果ACCS有效地使組織細(xì)菌生物負(fù)荷未增殖。ACCS使得肉芽傷口的愈合加速， 顯著快于未處理的感染對照組。實施例8 =CFS組合物PCS、SR-ACCS和SR-PCS在慢性傷口愈合動物模型中的應(yīng)用將本領(lǐng)域公認(rèn)的慢性肉芽傷口動物模型(Hay ward PG,RobsonMC =Animal models of wound contraction. In Barbul A,et al :Clinicaland Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair Normal and Chronic Wounds. John Wiley & Sons, New York, 1990)用于研究本發(fā)明的CFS組合物PCS、SR_ACCS或SR-PCS對慢性傷口愈合的效應(yīng)。在不背離本發(fā)明的主旨和基本屬性的前提下，可以其他具體方式實施本發(fā)明。任何等價實施方案均旨在被涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，從前述說明，除本文中顯示和描 述的那些之外，對本發(fā)明的多種改變對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。這樣的改 變也旨在落在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
在說明書全文中引用了多篇出版物。每篇出版物均旨在以引用的方式全文納入本 說明書。
權(quán)利要求
一種源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液組合物，包含生理濃度的a)選自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少一種因子；以及b)選自TIMP-1和TIMP-2的至少一種MMP抑制劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述MMP抑制劑為TIMP-I和/或TIMP-2。
3.權(quán)利要求1的組合物，包含生理濃度的a)選自VEGF、TGFβ 2、血管生成素和PDGF的至少兩種因子； 以及b)至少一種MMP抑制劑。
4.權(quán)利要求1的組合物，包含生理濃度的 a)選自VEGF、TGFβ 2、血管生成素和PDGF的至少三種因子； 以及b)至少一種MMP抑制劑。
5.權(quán)利要求1的組合物，包含生理濃度的VEGF、TGFβ 2、血管生成素、PDGF和TIMP-I。
6.權(quán)利要求1的組合物，包含生理濃度的VEGF、TGFβ 2、血管生成素、PDGF和ΤΙΜΡ-2。
7.權(quán)利要求1的組合物，包含生理濃度的VEGF、TGFβ 2、血管生成素、PDGF, TIMP-I和 ΤΙΜΡ-2。
8.權(quán)利要求1-7的組合物，其中所述含細(xì)胞因子溶液組合物是源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述源自羊膜的細(xì)胞因子溶液包含生理濃度的VEGF、 TGF β 2、血管生成素、PDGF、TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2。
10.一種持續(xù)釋放組合物，包含權(quán)利要求1的源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液。
11.權(quán)利要求10的持續(xù)釋放組合物，其中所述源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶液是源自羊 膜的細(xì)胞因子溶液。
12.—種制備源自羊膜的細(xì)胞因子溶液的方法，包括a)從胎盤羊膜分離羊膜上皮細(xì)胞，b)從所述羊膜上皮細(xì)胞選取AMP細(xì)胞，c)培養(yǎng)所述AMP細(xì)胞直至它們匯合，d)更換培養(yǎng)基，e)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，以及f)收集步驟(e)的培養(yǎng)基以得到源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將步驟(f)重復(fù)多次，并將每個步驟(f)中得到的源自羊 膜的細(xì)胞因子溶液合并以形成合并的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。
14.由權(quán)利要求13的方法制備的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液。
15.權(quán)利要求14的源自羊膜的細(xì)胞因子溶液，其中所述溶液包含生理濃度的因子 VEGF、TGF β 2、血管生成素、PDGF、TIMP-I 和 / 或 ΤΙΜΡ-2。
16.權(quán)利要求1-10、14和15的組合物，其中VEGF的生理濃度為約5.0_16ng/mL，血管 生成素的生理濃度為約3. 5-4. 5ng/mL, PDGF的生理濃度為約100_165pg/mL，TGF β 2的生 理濃度為約2. 5-2. 7ng/mL, TIMP-I的生理濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約`1.04 μ g/mLo
17.—種生理性細(xì)胞因子溶液的組合物，含有基本由生理濃度的以下成分組成的治療 組分a)選自VEGF、TGFβ 2、血管生成素和PDGF的一種或多種因子，b)至少一種MMP抑制劑；以及 c)載體，其中VEGF的生理濃度為約5.0-16ng/mL,血管生成素的生理濃度為約 3. 5-4. 5ng/mL, PDGF 的生理濃度為約 100_165pg/mL，TGF β 2 的生理濃度為約 2. 5-2. 7ng/ mL，并且其中所述載體為生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述MMP抑制劑為TIMP-I和/或TIMP-2，并且TIMP-I 的生理濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約1. 04 μ g/mL。
19.權(quán)利要求17的組合物，含有基本由生理濃度的以下成分組成的治療組分a)VEGF、TGF β 2、血管生成素和PDGF，b)TIMP-I 和 / 或 TIMP-2 ；以及c)載體，其中VEGF的生理濃度為約5.0-16ng/mL,血管生成素的生理濃度為約 3. 5-4. 5ng/mL, PDGF 的生理濃度為約 100_165pg/mL，TGF β 2 的生理濃度為約 2. 5-2. 7ng/ mL, TIMP-I的生理濃度為約0. 68 μ g/mL, TIMP-2的生理濃度為約1. 04 μ g/mL,并且其中所 述載體為生理鹽水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
20.—種生理性細(xì)胞因子溶液的組合物，含有基本上由選自以下的組合物組成的治療 組分和載體組合物A =VEGF和TIMP-I ；組合物B :VEGF、血管生成素和TIMP-I ；組合物C VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1 ；組合物D :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ 2禾口 TIMP-I ；組合物E =VEGF和TIMP-2 ；組合物F :VEGF、血管生成素和TIMP-2 ；組合物G =VEGF, 血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2 ；組合物H VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2和ΤΙΜΡ-2 ； 組合物I :VEGF、TIMP-I和TIMP-2 ；組合物J :VEGF、血管生成素、TIMP-I和TIMP-2 ；組合物 K :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-I 和 TIMP-2 ；組合物 L :VEGF、血管生成素、PDGF-BB、 TGF0 2、TIMP-1和TIMP-2 ；組合物M 血管生成素和TIMP-I ；組合物N 血管生成素、PDGF-BB 和TIMP-I ；組合物O 血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2和TIMP-I ；組合物P 血管生成素和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物Q 血管生成素、PDGF-BB和ΤΙΜΡ-2 ；組合物R 血管生成素、PDGF_BB、TGF β 2 和 TIMP-2 ；組合物 S 血管生成素、PDGF-BB、TGF β 2、TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 T =PDGF-BB 和 TIMP-I ；組合物 U =PDGF-BB, TGF β 2 禾口 TIMP-I ；組合物 V =PDGF-BB 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 W PDGF-BB、TGF β 2 和 ΤΙΜΡ-2 ；組合物 X =PDGF-BB, TIMP-I 和 ΤΙΜΡ-2 ；及組合物 Y =PDGF-BB, TGF3 2、TIMP-I 禾口 ΤΙΜΡ-2 ；其中 VEGF、血管生成素、PDGF-BB, TGF3 2、TIMP-I 禾口 TIMP-2 為VEGF 約 5. 0-16ng/mL、血管生成素約 3. 5-4. 5ng/mL、PDGF 約 100_165pg/mL、TGF β 2 約`2.5-2. 7ng/mL、TIMP-I 約 0. 68 μ g/mL、TIMP-2 約 1. 04 μ g/mL,并且其中所述載體為生理鹽 水、PBS、乳酸鹽林格溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
21.一種持續(xù)釋放組合物，包含權(quán)利要求17-20的組合物。
22.權(quán)利要求21的持續(xù)釋放組合物，還包含能夠?qū)崿F(xiàn)所述源自胚外細(xì)胞的細(xì)胞因子溶 液的持續(xù)釋放的藥劑，其中所述藥劑選自聚合物、聚合物混合物、透明質(zhì)酸顆粒、微囊化材 料或納米顆粒。
23.一種制備持續(xù)釋放組合物的方法，包括步驟將含細(xì)胞因子溶液的組合物與能夠?qū)崿F(xiàn)含細(xì)胞因子溶液的組合物持續(xù)釋放的藥劑相結(jié)合。
24.一種由權(quán)利要求23的方法制備的持續(xù)釋放組合物。
25.一種含有權(quán)利要求1-10和14-24任一項的組合物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含細(xì)胞因子溶液的新組合物(在本文中稱為“CFS”組合物)，包括持續(xù)釋放的含細(xì)胞因子溶液的新組合物(在本文中稱為“SR-CFS”組合物)；制備這樣的新組合物的方法；以及所述組合物的用途。
文檔編號A61K39/395GK101815531SQ200880110113
公開日2010年8月25日 申請日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日
發(fā)明者C·A·斯密斯, E·J·特朗博爾, G·L·辛, L·O·帕拉迪諾, V·S·馬歇爾 申請人:斯丹姆涅恩有限公司