專利名稱：治療前列腺癌(PCa)的組合物的制作方法
治療前列腺癌(PCa)的組合物 本發(fā)明涉及活性(免疫刺激性)組合物，其包含至少一種RNA，優(yōu)選mRNA，其編碼 至少兩種(優(yōu)選不同的)能夠在哺乳動物中引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)的抗原，其中所述抗 原選自由PSA (前列腺特異性抗原)，PSMA(前列腺特異性膜抗原)，PSCA (前列腺干細(xì)胞抗 原)，和 STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原(Six Transmembrane Epithelial Antigen))組 成的組。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含所述活性(免疫刺激性)組合物的疫苗，以及所述活性(免 疫刺激性)組合物的用途(用于制備疫苗)，和/或疫苗的用途，所述疫苗用于引發(fā)(適應(yīng) 性)免疫反應(yīng)來治療前列腺癌(PCa)，優(yōu)選腫瘤輔助治療和/或激素-難治性前列腺癌，及 其相關(guān)的疾病或病癥。最后，本發(fā)明涉及試劑盒，特別是多部件的試劑盒，其包含所述(免 疫刺激性)組合物和/或疫苗。目前，前列腺癌是排名第二位的最常見診斷癌癥，在全球發(fā)達(dá)國家中是男性癌癥 相關(guān)死亡的第四大主要原因。有效醫(yī)療療法日益削弱，目前只可用于地方性疾病。在激 素難治性前列腺癌中，尚未顯示有藥劑延長大約1年以上的壽命(參見例如Pavlenko， M. , A. K. Roos, ^ A (2004). " Aphase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specificantigen in patients with hormone-refractory prostate cancer.(用表達(dá)前列腺特異性抗原的質(zhì)粒DNA接種激素難治性前列腺癌患者 的I期實(shí)驗(yàn))"Br JCanceH英國癌癥雜志)91 (4) =688-94.) 0在一些高度發(fā)達(dá)的西方 國家，如美國，前列腺癌甚至是目前最常診斷的惡性腫瘤，并且在美國(參見例如Jemal， A.，R. Siegel，等人(2006). “ Cancer statistics (癌癥統(tǒng)計(jì)學(xué))，2006. “ CACancer J Clin 56 (2) 106-30.)和歐洲(參見例如 Thomas-Kaskel，A. K.，C. F. Waller,等人 (2007) " Immunotherapy with dendritic cells for prostatecancer.(關(guān)于前列腺癌用 樹突細(xì)胞進(jìn)行免疫療法)"Int T Cancer (國際癌癥雜志)121 (3) :467_73)分別是男性中 第三大致死癌癥病因。大多數(shù)被診斷的腫瘤是腺癌，其最初是以激素依賴型的方式增殖的。 前列腺癌是這樣的疾病，其中在男性生殖系統(tǒng)的一種腺體，即前列腺中發(fā)展癌癥。它是當(dāng)前 列腺細(xì)胞突變，并開始不受控制地增殖時發(fā)生的。與正常對照相比前列腺癌細(xì)胞顯示過表 達(dá)的典型抗原特別是像PSA，PSMA, PAP，PSCA，HER-2和Ep-CAM的抗原。這些前列腺癌細(xì)胞 可以從前列腺擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)到身體的其它部分，特別是骨骼和淋巴結(jié)。前列腺癌可以引發(fā) 疼痛，排尿困難，勃起功能障礙和其它癥狀。一般，前列腺癌在五十歲以上的男性中最頻繁 地發(fā)展，其代表最常見的患者群。不過，前列腺癌經(jīng)常未被發(fā)現(xiàn)，即使確診是有可能的。通 常通過身體檢查或通過篩選血液測試，如PSA (前列腺特異性抗原)測試來實(shí)現(xiàn)前列腺癌的 確診。當(dāng)懷疑是前列腺癌時，通常通過切除一片前列腺(活組織檢查)并在顯微鏡下檢查 它來確認(rèn)癌癥?？梢赃M(jìn)行其它的測試，如X射線和骨掃描來確認(rèn)前列腺癌是否擴(kuò)散。前列腺癌的治療將仍是未解決的挑戰(zhàn)。對于前列腺癌的治療可以應(yīng)用傳統(tǒng)的治療 方法，如手術(shù)，放射治療，激素治療，有時候進(jìn)行化學(xué)治療，質(zhì)子療法，或這些療法的一些組 合。不過，男性的年齡和基本健康狀況以及擴(kuò)散程度，顯微鏡下的外觀，以及癌癥對初始治 療的反應(yīng)在確定疾病結(jié)果中是重要的。由于前列腺癌通常是對于老年男性診斷的疾病，許 多人將會在緩慢發(fā)展的前列腺癌能夠擴(kuò)散或引發(fā)癥狀之前死于其它原因。這使得治療選擇困難。是否用醫(yī)療手段治療局部的前列腺癌(包含在前列腺內(nèi)的腫瘤)的決定是在關(guān)于患 者生存和生活質(zhì)量的預(yù)期有益和有害作用之間的患者權(quán)衡。不過，以上治療方法，如手術(shù)，放射治療，激素治療和化學(xué)治療等，全部都會伴有嚴(yán) 重的限制。例如，手術(shù)切除前列腺，或前列腺切除術(shù)，對于早期前列腺癌或?qū)τ趯Ψ派渲委?沒有響應(yīng)的癌癥來說都是常用的治療。它可以引發(fā)顯著改變生活質(zhì)量的神經(jīng)損傷。最常見 的嚴(yán)重并發(fā)癥是小便失禁和陽萎。不過，即使前列腺癌可以成功切除，但前列腺癌在整個生 物體中的擴(kuò)散仍是未解決的問題。在前列腺癌治療中放射治療是最常用的。對于早期癌癥可以使用它而非手術(shù)，并 且它也可以用于前列腺癌晚期以治療疼痛的骨轉(zhuǎn)移。當(dāng)單獨(dú)的放射治療不太可能治愈癌癥 時， 放射治療也可以結(jié)合激素療法用于中間性的危險(xiǎn)疾病。不過，放射治療還具有高風(fēng)險(xiǎn)并 且經(jīng)常導(dǎo)致免疫防御的完全喪失，因?yàn)榛颊呙庖呦到y(tǒng)受到破壞。另外，放射治療一般在癌癥 生長位點(diǎn)上局部應(yīng)用，因此不可避免前列腺癌在整個生物體中擴(kuò)散的以上問題。如果全身 應(yīng)用，放射治療可能導(dǎo)致細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。化學(xué)治療長期以來被認(rèn)為對于前列腺癌是一種較少有效的治療，因?yàn)樯踔林挥蟹?常少數(shù)的患者對這種療法產(chǎn)生響應(yīng)。不過，某些患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者(響應(yīng)者)，可 以從化學(xué)治療獲益。響應(yīng)率大約為20%并且因此化學(xué)治療將在腫瘤復(fù)發(fā)和激素治療失敗的 治療期間發(fā)揮作用。不過，化學(xué)治療通常將只是緩解性的，并不帶來患者前列腺癌的完全消 除。典型的化學(xué)治療劑包括環(huán)磷酰胺，多柔比星，5-氟尿嘧啶，阿霉素，蘇拉明和其它藥劑， 不過這些藥物中沒有一種能夠帶來患者的明顯更長存活。在最近發(fā)表于新英格蘭醫(yī)藥雜志 (New England Journal of Medicine) 2004的研究中，每三周接受一劑多西他賽的患者可以 顯示平均值為2. 5個月的更長存活。激素治療通常使用藥物或激素療法與手術(shù)的結(jié)合以阻抑前列腺癌細(xì)胞獲得二氫 睪酮(DHT)，二氫睪酮(DHT)是一種在前列腺中產(chǎn)生的激素并且是大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞的 生長和擴(kuò)散所必需的。阻抑DHT通常引起前列腺癌停止生長，甚至縮小。不過，激素治療很 少治愈前列腺癌，因?yàn)樽畛蹴憫?yīng)激素治療的癌癥通常在一到兩年后變得耐藥。例如緩解性 雄激素缺失治療能夠誘發(fā)高達(dá)80%患者的癥狀緩和，但是在15-20個月后，腫瘤細(xì)胞變得 對激素不敏感并且發(fā)展了不依賴雄激素的前列腺癌。在這種情況下治療選擇很少，因?yàn)榛?學(xué)治療效力有限(見上面)。所以通常當(dāng)癌癥已經(jīng)從前列腺擴(kuò)散時使用激素治療。它還可 以給予某些接受放射治療或手術(shù)的男性以幫助阻止他們的癌癥反復(fù)。因此患有正常前列腺癌的患者，還有患復(fù)發(fā)性或晚期前列腺癌的患者急需備選的 治療策略。作為一種方法，上面討論的用于器官限制性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法，包括根治性 前列腺切除術(shù)或放射治療如外(射線)照射和近程放射治療還可以在某些情況下結(jié)合腫 瘤輔助治療或佐劑激素治療(參見例如Totterman，Τ. H.，A. Loskog，等人(2005). “ The immunotherapy ofprostate and bladder cancer.(前列腺禾口膀腕癌的免疫治療)〃 BJU Int 96(5) :728-35.)。盡管這些療法在短期內(nèi)是相對有效的，但相當(dāng)部分(30-40%)最初 患有局部性疾病的患者最終將復(fù)發(fā)。對于轉(zhuǎn)移性的前列腺癌主要的療法是雄激素切除術(shù) (androgen ablation) 0盡管這通常帶來細(xì)胞減少和減輕，但在14-20個月內(nèi)通常會出現(xiàn)激 素難治性疾病發(fā)展。在化學(xué)治療領(lǐng)域?qū)τ谕砥诓灰蕾囆奂に氐那傲邢侔┮呀?jīng)報(bào)告了許多臨 床研究。只有最近的兩次試驗(yàn)揭示化學(xué)治療稍微改善了患有激素難治性疾病的患者的整體存活。綜上所述，諸如上述手術(shù)、放射治療、激素治療、偶而使用的化學(xué)治療、質(zhì)子療法等 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如果單獨(dú)應(yīng)用的話，似乎不適于進(jìn)行有效治療前列腺癌(PCa)。所以一種改進(jìn) 的治療方式可以包括這些治療或可以補(bǔ)充這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的補(bǔ)充性治療。因而，本文建議在 使用前列腺癌(PCa)的治療或補(bǔ)充治療方法中使用適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。如本領(lǐng)域所知，免疫系統(tǒng)在多種疾病的治療和預(yù)防中起著重要的作用。按照目前 的知識水平，哺乳動物提供了多種機(jī)制通過識別和殺死例如腫瘤細(xì)胞來保護(hù)生物體。為了 本發(fā)明的目的，這些腫瘤細(xì)胞必須檢測到并且與生物體的正常(健康)細(xì)胞和組織區(qū)別開 來。脊椎動物如人的免疫系統(tǒng)由多種類型的蛋白、細(xì)胞、器官、和組織組成，其以精細(xì) 的和動態(tài)的網(wǎng)絡(luò)相互作用。作為該種復(fù)雜的免疫反應(yīng)的部分，脊椎動物系統(tǒng)隨時間適應(yīng)更 有效地識別特定病原體或腫瘤細(xì)胞。適應(yīng)過程產(chǎn)生免疫學(xué)記憶，并且允許在將來相遇過程 中甚至更有效的保護(hù)。該適應(yīng)性或獲得性免疫性過程形成接種策略的基礎(chǔ)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是抗原特異性的，并且需要在稱為抗原呈遞的過程中識別特定的 “自體”或“非自體”抗原。抗原特異性允許產(chǎn)生專門針對特定病原體或病原體-感染細(xì)胞 或腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)。固定這些專門反應(yīng)的能力在體內(nèi)通過所謂的“記憶細(xì)胞”保持。如果 病原體不止一次感染機(jī)體，則這些特異性記憶細(xì)胞用來快速清除其。因此，適應(yīng)性免疫系統(tǒng) 允許更強(qiáng)的免疫反應(yīng)以及允許免疫學(xué)記憶，其中每種病原體或腫瘤細(xì)胞被一種或多種特征 抗原“記住”。脊椎動物中適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要成分在細(xì)胞水平主要包括淋巴細(xì)胞，在分子水 平主要包括抗體。淋巴細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分包括B細(xì)胞和T細(xì)胞，其來源 于骨髓中的造血干細(xì)胞。B細(xì)胞參與體液反應(yīng)，而T細(xì)胞參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。B細(xì)胞 和T細(xì)胞攜帶識別特定靶標(biāo)的受體分子。僅在抗原(例如，病原體的小片段)已經(jīng)被處理 且與稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的“自我”受體組合呈遞后，T細(xì)胞識別“非自 我”靶標(biāo)，如致病性靶標(biāo)結(jié)構(gòu)。相反，B細(xì)胞抗原特異性受體是在B細(xì)胞表面上的抗體分子， 并且當(dāng)其表面上的抗體與特異性外源抗原結(jié)合時，識別這樣的病原體。該抗原/抗體復(fù)合 體被B細(xì)胞吸收，并且通過蛋白質(zhì)水解作用處理成肽。然后，B細(xì)胞在其表面II類MHC分 子上展示這些抗原肽。MHC和抗原的這種組合吸引匹配的輔助T細(xì)胞，其釋放淋巴因子并且 激活B細(xì)胞。因?yàn)榛罨腂細(xì)胞然后開始分化，其后代分泌數(shù)百萬拷貝的識別該抗原的抗 體。這些抗體在血漿和淋巴中循環(huán)，結(jié)合病原體或表達(dá)所述抗原的腫瘤細(xì)胞，并且將它們標(biāo) 記，用以通過補(bǔ)體激活進(jìn)行分解或用以通過吞噬細(xì)胞吸收和分解。作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的 細(xì)胞成分，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(⑶8+)還可以形成CTL-反應(yīng)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(⑶8+)可以識 別來自內(nèi)源性病原體的肽和由I型MHC分子結(jié)合的自體抗原。CD8+-T細(xì)胞通過在細(xì)胞中釋 放細(xì)胞毒性蛋白而行使它們的殺傷功能。免疫系統(tǒng)機(jī)制由此形成多種疾病的有療效的治療的靶標(biāo)。適當(dāng)?shù)姆椒ǖ湫偷鼗?施用佐劑，以引發(fā)先天性免疫反應(yīng)，或者基于施用抗原或免疫原，以激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。 由于抗原典型地是基于病原體(例如，表面蛋白)或其片段的特定成分，所以還考慮向患者 施用核酸然后其表達(dá)需要的多肽、蛋白或抗原。例如，基于已知前列腺相關(guān)抗原的接種研究已經(jīng)在Noguchi等人(2003)和(2004)中開展(參見例如 Noguchi，M.，K. Itoh,等人(2004). “ Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA_A2-positive patients withmetastatic hormone-refractory prostate cancer.(在轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌HLA-A2-陽性患者 中的患者定向接種的I期試驗(yàn))‘‘Cancer Sci (癌癥科學(xué))95(1) -Jl-M ；和Noguchi, M.， K. Kobayashi,等人(2003) · “ Induction ofcellular and humoral immune responses to tumor cells and peptide inHLA~A24 positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptidevaccination.(通過肽接種在HLA-A24陽性激素難治性前列腺癌患 者中誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞和肽的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng))“Prostate (前列腺)57 (1) =80-92. Noguchi 等人 2003 和 Noguchi 等人 2004)。Noguchi 等人(2003)和(2004)在轉(zhuǎn)移性激素 耐受型前列腺癌患者中用接種的多種肽試驗(yàn)開展了兩次I期研究，顯示對于選定靶標(biāo)的增 強(qiáng)的細(xì)胞以及體液免疫反應(yīng)。接種策略是安全的，良好耐受，無嚴(yán)重毒性作用。不過，也觀 察到前列腺特異性抗原(PSA)水平的穩(wěn)定或降低，只有一名患者顯示骨轉(zhuǎn)移的消失。這種 方法的主要限制取決于需要患者HLA單倍型以及前列腺癌細(xì)胞的肽表達(dá)的現(xiàn)有知識，這使 得它難以進(jìn)行臨床應(yīng)用。一些其它的近期方法利用基于細(xì)胞的接種策略，例如在接種策略中使用不同 的抗原或使用加載了不同抗原或其片段的樹突細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)例，在臨床試驗(yàn)中使 用用重組人PSA脈沖的自體樹突細(xì)胞測試前列腺癌患者的接種(參見例如Barrou， B. , G.Benoit,等人(2004). “ Vaccination ofprostatectomized prostate cancer patients in biochemical relapse, withautologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA(用重組人PSA脈沖的自體樹突細(xì)胞接種具有生化復(fù)發(fā)的前列腺 切除的前列腺癌患者).〃 Cancer Immunol Immunother (癌癥免疫學(xué)免疫療法)53 (5): 453-60)。在用加載了 PSCA和PSA肽的樹突細(xì)胞接種晚期前列腺癌患者期間，10名患者 中有5名顯示針對至少一種抗原的免疫反應(yīng)(參見例如Thomas-Kaske 1，A. K.，R. Zeiser, 等人(2006). “ Vaccination of advanced prostate cancer patientswith PSCA and PSA peptide—loaded dendritic cells induces DTH responses thatcorrelate with superior overall survival.(用加載PSCA和PSA肽的樹突細(xì)胞接種晚期前列腺癌患 者誘導(dǎo)了與良好總體存活相關(guān)的DTH反應(yīng))“Int JCanceH國際癌癥雜志)119(10): 2428-34.)。在另一個實(shí)例中，Murphy等人(1996)用兩種HLA-A*0201 PSMA表位接種處于 相應(yīng)I期試驗(yàn)的前列腺癌患者，以便與用單獨(dú)的肽接種或與用經(jīng)脈沖的DCs的接種相比 較。結(jié)果顯示如果用經(jīng)脈沖的DCs接種患者，更多患者對接種有應(yīng)答。這一研究顯示用 加載了肽或蛋白質(zhì)的DCs接種至少部分地導(dǎo)致可檢測到的免疫反應(yīng)，以及暫時性的PSC 下降或穩(wěn)定(參見例如 Murphy，G.，B. Tjoa，等人(1996). “ Phase I clinical trial T-cell therapyfor prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed withHLA-A0201-specific peptide from prostate-specific membrane antigen (I 期臨床 試驗(yàn)關(guān)于前列腺癌使用用來自前列腺特異性膜抗原的HLA-A0201特異性肽脈沖的自體樹 突細(xì)胞的T細(xì)胞療法)· “ Prostate (前列腺)29 (6) 371-80)。前列腺癌患者的接種還可以組合加載到樹突細(xì)胞上的肽來進(jìn)行，例如用肽混 合物加載的樹突細(xì)胞(參見例如Fuessel，S.，A.Meye，等人(2006). “ Vaccinationof hormone-refratory prostate cancer patients with peptidecocktail-loaded dendritic cells results of a phase I clinical trial.(用肽混合物負(fù)載的樹突細(xì) 胞接種激素難治性前列腺癌患者1期臨床試驗(yàn)的結(jié)果)"Prostate (前列腺)66 (8) 811-21)。所述混合物包含來自PSA，PSMA，存活蛋白，Prostein和Trp-p8 (瞬時型感受 器電位p8 (transient receptor potentialp8))的肽。還用基于樹突細(xì)胞的激素難治性 前列腺癌的多表位免疫療法來進(jìn)行臨床試驗(yàn)(參見例如Waeckerle-Men，Y.，E. Uetz-von Allmen, 等 人(2006). “ Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy ofhormone-refratory prostate carcinoma(激素難治性前列腺癌的基于樹突細(xì)胞的多表 位免疫療法).〃 Cancer Immunol Immunother (癌癥免疫學(xué)免疫療法)55 (12) 1524-33)。 Waeckerle-Men, Y.，E. Uetz-von Allmen，等人(2006)測試了用來自 PSCA，PAP(前列腺酸 性磷酸酶)，PSMA和PSA的肽接種激素難治性前列腺癌。盡管用抗原蛋白或肽，例如當(dāng)加載到樹突細(xì)胞時，進(jìn)行接種是引發(fā)免疫反應(yīng)的常 用方法，免疫或接種還可以基于核酸的使用以便將所需的遺傳信息結(jié)合到細(xì)胞中。一般地， 已經(jīng)發(fā)展了多種方法用于將核酸引入細(xì)胞中，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，polyprene轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融 合，電轉(zhuǎn)化，顯微注射和脂轉(zhuǎn)染，特別是脂轉(zhuǎn)染已經(jīng)被證明是一種合適的方法。根據(jù)一個實(shí)例，前列腺癌的接種治療可以基于將來自自體腫瘤的總mRNA 轉(zhuǎn)染到DCs中(見Heiser等人(2002)(參見例如Heiser, A.，D. Coleman,等人 (2002). “ Autologous dendritic cells transfected withprostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastaticprostate tumors (Mltf歹 Ι· 胃 生 原RNA轉(zhuǎn)染自體樹突細(xì)胞刺激針對轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤的CTL反應(yīng)).“J Clin Invest (臨 床研究雜志)109(3) 409-17.)。這一策略具有下列益處，其靶向多種I類和II類HLA患 者特異性腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)，而無先前的HLA分型。另外，甚至基質(zhì)抗原也可以被這種策 略所靶向，因?yàn)閙RNA獲自手術(shù)樣本而非獲自腫瘤細(xì)胞系。例如，Heiser等人開發(fā)了基于DC 的免疫治療方案，其中用編碼PSA的mRNA轉(zhuǎn)染DCs。所述接種被良好耐受并誘導(dǎo)了增強(qiáng)的 針對PSA的T細(xì)胞反應(yīng)。不過，這些基于DC的抗前列腺癌疫苗似乎生成了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反 應(yīng)，其可以伴隨臨床反應(yīng)，盡管后者的頻率仍然令人不滿意。在接種策略中DNA也可以用作核酸以便將所需的遺傳信息結(jié)合到細(xì)胞中。根據(jù)具體的實(shí)例，DNA病毒可以用作DNA載體。由于它們的感染特性，這些病毒獲得非常高的轉(zhuǎn)染 率。所用的病毒以這種方式進(jìn)行遺傳修飾，即在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中不形成功能性感染顆粒。例如， 在Eder等人(2000)中使用表達(dá)PSA的重組痘苗病毒進(jìn)行了 I期試驗(yàn)。作者表明了針對 PSA的T細(xì)胞免疫反應(yīng)并且還表明了在選定的患者中的血清PSA穩(wěn)定。(參見例如Eder， J. P. , P. W. Kantoff,等人(2000). “ A phase I trial of a recombinantvaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer.(在晚期前歹[J腺 癌中表達(dá)前列腺特異性抗原的重組痘苗病毒的I期試驗(yàn))"Clin Cancer Res (臨床癌癥研 究)6(5) =1632-8. )0由來自重組病毒的高度免疫原性肽促發(fā)的炎性反應(yīng)可以增強(qiáng)外源蛋 白質(zhì)的免疫原性，但據(jù)顯示免疫系統(tǒng)減少重組病毒的復(fù)制并由此限制了臨床效果。即使重 組疫苗已經(jīng)顯示免疫原性并且在若干試驗(yàn)中顯示了腫瘤應(yīng)答的證據(jù)，但這些結(jié)果需要加以 證實(shí)。根據(jù)另一種方法，用表達(dá)PSA的DNA質(zhì)粒進(jìn)行激素難治性前列腺癌患者的接種(參見例如 Pavlenko，Μ·，A. K. Roos，等人(2004). “ A phase Itrial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen inpatients with hormone-refratory prostate cancer.(在激素難治性前列腺癌患者中用表達(dá)前列 腺特異性抗原的質(zhì)粒進(jìn)行DNA接種的I期試驗(yàn))"Br J Cancer (英國癌癥雜志)91 (4) 688-94)。Garcia-Hernandez等人(2007)顯示用編碼STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原) 的質(zhì)?；虿《緲訌?fù)制子進(jìn)行治療性和預(yù)防性接種延長了腫瘤侵襲的小鼠的存活(參見例 如 Garcia-HernandezMde，L，A.Gray，等人(2007). ” In vivo effects of vaccination withsix-transmembrane epithelial antigen of the prostate :a candidate antigen fortreating prostate.(用前列腺的6跨膜上皮抗原接種的體內(nèi)作用用于治療前列腺的 候選抗原)"Cancer Res (癌癥研究)67 (3) : 1344-51)。近來STEAP被鑒定為晚期人前列 腺癌的指示蛋白，其在人前列腺癌中高度過表達(dá)。它的功能當(dāng)前是未知的。不過，在使用DNA作為遺傳信息的載體時，不可能排除導(dǎo)入基因或病毒基因的不 受控制的增殖的危險(xiǎn)，例如由于潛在的重組事件。這也需要承擔(dān)DNA通過例如重組插入到 宿主細(xì)胞基因組的完整基因中的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果是這一基因可能突變并由此完全或部分地失活 或該基因可能引起錯誤信息。換句話說，細(xì)胞必需的基因產(chǎn)品的合成可能被完全抑制或者 表達(dá)出經(jīng)修飾的或不正確的基 因產(chǎn)品。如果DNA被整合入?yún)⑴c細(xì)胞生長調(diào)控的基因中，則 發(fā)生一種特定的風(fēng)險(xiǎn)。在這種情況下，宿主細(xì)胞可能退化并導(dǎo)致癌癥或腫瘤形成。另外，如 果導(dǎo)入到細(xì)胞中的DNA要被表達(dá)，相應(yīng)的DNA載體必需包含強(qiáng)啟動子，如病毒CMV啟動子。 這些啟動子整合到處理細(xì)胞的基因組中可以導(dǎo)致細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控的有害變化。使用 DNA作為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)試劑(例如作為疫苗)的另一個風(fēng)險(xiǎn)是在導(dǎo)入了外源DNA的患者中 誘導(dǎo)病原性抗DNA抗體，從而帶來(可能是致命的)免疫反應(yīng)?？偨Y(jié)以上方法的結(jié)果，無疑對于前列腺癌(PCa)的治療取得了一些進(jìn)展，即使這 樣，考慮到高致死率，對于其它選擇性的或改進(jìn)的治療途徑仍有強(qiáng)烈需求。因而總之，對于有效系統(tǒng)有空間和需求，其可以用于有效刺激免疫系統(tǒng)來進(jìn)行前 列腺癌(PCa)的治療，同時避免由于基于DNA的組合物而導(dǎo)致的導(dǎo)入基因不受控制增殖的 問題。因而本發(fā)明的一個目的是提供組合物，其a)能夠通過刺激免疫系統(tǒng)來治療前列 腺癌(PCa)，同時b)避免上述缺點(diǎn)。這一目的通過本發(fā)明的主題而得以解決，特別是通過活性(免疫刺激性)組合物 得以解決，其包含編碼選自下列抗原的至少兩種、三種或甚至四種(優(yōu)選不同的)抗原的至 少一種RNA · PSA (前列腺特異性抗原)=KLK3 (激肽釋放酶_3)，· PSMA (前列腺特異性膜抗原)，· PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)，· STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)。令人驚訝的是，據(jù)發(fā)現(xiàn)上述組的至少兩種抗原、抗原蛋白或抗原性肽的特定組合， 優(yōu)選這些抗原、抗原蛋白或抗原性肽的兩種、三種或四種的組合，當(dāng)包含在根據(jù)本發(fā)明的活 性(免疫刺激性)組合物中時，能夠有效刺激(適應(yīng)性)免疫系統(tǒng)以治療前列腺癌(PCa)， 優(yōu)選腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，及其相關(guān)的疾病或病癥。在此，術(shù)語抗原、抗原蛋白或抗原性肽可以同義使用。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明的活性(免疫刺激性) 組合物應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解為一種組合物，其能夠引發(fā)免疫反應(yīng)，優(yōu)選本文所定義的適應(yīng)性免 疫反應(yīng)，這是由于所述活性(免疫刺激性)組合物的組分所包含或編碼的組分之一的作用， 優(yōu)選是編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA，優(yōu)選是(m)RNA。 與正常對照相比，諸如PSA，PSMA和PSCA的抗原已經(jīng)顯示被前列腺癌細(xì)胞過 表達(dá)。所以這些抗原代表了免疫療法的可能靶標(biāo)(參見例如Marrari，A.，M. Iero，等 A (2007). ‘‘ Vaccination therapy in prostate cancer. ( ^ fr ^lJ Φ W ft ft ^n 療)“Cancer Immunol Immunother (癌癥免疫學(xué)免疫治療)56 (4) 429-45.)。所述活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以是PSA。在本發(fā)明的上下文 中“PSA”是“前列腺特異性抗原”并且在文獻(xiàn)中可以同義地稱之為KLK3 (激肽釋放酶-3)。 前列腺特異性抗原(PSA)是一種33kDa的蛋白質(zhì)并且是雄激素調(diào)控的激肽釋放酶樣絲氨酸 蛋白酶，其是所有類型的良性和惡性前列腺組織的上皮細(xì)胞所特有產(chǎn)生的。具體地，PSA由 正常前列腺上皮細(xì)胞高度表達(dá)并代表前列腺癌中最具特征性的腫瘤相關(guān)抗原中的一種。在 生理上，它以高濃度存在于精液中，并作用來將負(fù)責(zé)精液凝結(jié)的高分子量蛋白質(zhì)剪切成較 小的多肽。這一作用導(dǎo)致凝結(jié)物的液化。PSA也存在于血清中并可以通過單克隆放射免疫 測定或多克隆免疫放射測定可靠地進(jìn)行測量。今天對于篩選、診斷和監(jiān)測前列腺癌來說PSA 是最廣泛使用的腫瘤標(biāo)記。具體地，幾種用于檢測血清PSA的免疫測定正廣泛用于臨床。 近來，對于血清中的PSA mRNA已經(jīng)開發(fā)出反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測試。不 過，PSA未被認(rèn)作疾病特異性標(biāo)記，因?yàn)樵诟甙俜直鹊幕糂PH和前列腺炎的患者(25-86% ) (Gao等人，1997，Prostate (前列腺)31 :264_281)中，以及在其它非惡性病癥和在一些正常 男性中可檢測到升高水平的PSA，這是顯著限制這一標(biāo)記診斷特異性的因素。在本發(fā)明的上 下文中編碼PSA (前列腺特異性抗原)的至少一種RNA，優(yōu)選mRNA的優(yōu)選序列，一一如果用 于根據(jù)本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物，一一則包含或含有登記號為NM_001648的序 列，更加優(yōu)選地，它包含或含有

圖1 (SEQ ID NO :1)所示的序列，甚至更加優(yōu)選地，所述至少 一種RNA，如果編碼PSA (前列腺特異性抗原)，則包含或含有圖2或3 (SEQ ID NOs :2或3) 的任一個所示的編碼序列。根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，活性(免疫刺激性)組合物的至 少一種RNA可以備選地或另外地編碼PSA抗原序列，其選自登記號為NM_001648或如圖1， 2或3(SEQ ID N0s:l，2或3)中任一個所示的PSA序列的片段，變體或表位。所述活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以是PSMA。在本發(fā)明的上下 文中“PSMA”是“前列腺特異性膜抗原”并且可以同義地稱之為F0LH1 (葉酸水解酶1)或 “PSM”。PSMA是IOOkDa的II型跨膜糖蛋白，其中PSMA表達(dá)在很大程度上局限于前列腺組 織，但在腦、唾液腺、小腸和腎細(xì)胞癌中已經(jīng)觀察到可檢測水平的PSMA mRNA (Israe 1 i等人， 1993，Cancer Res (癌癥研究)53 :227_230)。PSMA在大多數(shù)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中 高度表達(dá)，但是也在大多數(shù)正常上皮內(nèi)腫瘤樣本中表達(dá)(Gao等人(1997)，同上)。具體地， PSMA在前列腺癌細(xì)胞和非前列腺實(shí)體腫瘤新脈管系統(tǒng)中高度表達(dá)，是抗癌成像和治療劑的 靶標(biāo)。PSMA充當(dāng)小分子底物，包括葉酸，抗癌藥物甲氨蝶呤和神經(jīng)肽N-乙?；?L-天冬氨 酰-L-谷氨酸的谷氨酸羧肽酶(GCPII)。在前列腺癌中，已經(jīng)顯示PSMA表達(dá)與疾病進(jìn)程相 關(guān)聯(lián)，在激素難治性和轉(zhuǎn)移性疾病中具有最高水平表達(dá)。PSMA的細(xì)胞定位是細(xì)胞質(zhì)和/或 膜。PSMA被認(rèn)為是前列腺癌(PCa)的生物標(biāo)記并且進(jìn)行積極研究用作成像和治療靶標(biāo)。在本發(fā)明的上下文中編碼PSMA (前列腺特異性膜抗原)的至少一種RNA，優(yōu)選mRNA的優(yōu)選序 列，一如果用于根據(jù)本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物，一一則包含或含有登記號為 NM_004476的序列，更加優(yōu)選地，它包含或含有圖4(SEQ ID NO :4)所示的序列，還要更加優(yōu) 選地，所述至少一種RNA，如果編碼PSMA (前列腺特異性抗原)，包含或含有圖5或6 (SEQ ID NOs :5或6)的任一個所示的編碼序列。根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，活性(免疫刺激性)組 合物的至少一種RNA可以備選地或另外地編碼PSMA抗原序列，其選自登記號為NM_004476 或如圖5或6 (SEQ ID NOs 5或6)中任一個所示的PSMA序列的片段、變體或表位。所述活 性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以是PSCA。在本發(fā)明的上下 文中“PSCA”是“前列腺干細(xì)胞抗原”。在前列腺癌的所有階段，包括高級前列腺上皮內(nèi)瘤形 成(PIN)，雄激素依賴型和雄激素不依賴型前列腺腫瘤，PSCA被廣泛過表達(dá)。PSCA基因顯 示與干細(xì)胞抗原_2有30 %的同源性，所述干細(xì)胞抗原_2是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定細(xì) 胞表面抗原的Thy-I/Ly-6家族的成員，編碼具有氨基末端信號序列、羧基末端GPI錨定序 列和多個N-糖基化位點(diǎn)的123個氨基酸的蛋白質(zhì)。PSCA mRNA表達(dá)在雄激素依賴型和雄 激素不依賴型前列腺癌異種移植體中都高度上調(diào)。原位mRNA分析將PSCA表達(dá)定位于前列 腺的基細(xì)胞上皮，即推定的干細(xì)胞區(qū)室。流式細(xì)胞分析表明PSCA主要在細(xì)胞表面表達(dá)并通 過GPI連接所錨定。熒光原位雜交分析將PSCA基因定位于染色體8q24. 2，即80%以上前 列腺癌所具有的等位基因區(qū)。PSCA可以用作前列腺癌標(biāo)記以區(qū)分惡性前列腺癌，正常前列 腺腺體和非惡性瘤。例如，相對于良性前列腺增生(BPH)，PSCA在前列腺癌中以非常高的水 平表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，編碼PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)的至少一種RNA，優(yōu)選mRNA 的優(yōu)選序列，一一如果用于根據(jù)本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物，一一則包含或含有 登記號為NM_005672的序列，更加優(yōu)選地，它包含或含有圖7 (SEQ IDNO 7)所示的序列，還 要更加優(yōu)選地，所述至少一種RNA，如果編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)，包含或含有圖8或 9 (SEQ ID N0s:8或9)的任一個所示的編碼序列。根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，活性(免 疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以備選地或另外地編碼PSCA抗原序列，其選自登記號 為NM_005672或如圖8或9 (SEQ ID NOs 8或9)中任一個所示的PSCA序列的片段、變體或 表位。所述活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以是STEAP。在本發(fā)明的上下文 中“STEAP”是前列腺的六跨膜上皮抗原并且可以同義地稱之為STEAPl。STEAP或STEAP-I 是新型細(xì)胞表面蛋白，主要表達(dá)在人前列腺組織中和在其它常見惡性腫瘤包括前列腺、膀 胱、結(jié)腸和卵巢癌中，以及在尤因肉瘤中，提示它可以充當(dāng)幾乎通用的腫瘤抗原。具體地， STEAP在原發(fā)性前列腺癌中高度表達(dá)，在正常組織中限制表達(dá)。STEAP在骨髓樣本中的陽性 與Kaplan Meier分析中的新轉(zhuǎn)移存活性高度相關(guān)聯(lián)(ρ = 0. 001)。在本發(fā)明的上下文中，編 碼STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)的至少一種RNA、優(yōu)選mRNA的優(yōu)選序列，一一如果用 于根據(jù)本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物，一一則包含或含有登記號為NM_012449的序 列，更加優(yōu)選地，它包含或含有圖10 (SEQ ID NO: 10)所示的序列，甚至更優(yōu)選地，所述至少 一種RNA，如果編碼STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)，包含或含有圖11或12 (SEQ ID NOs 11或12)的任一個所示的編碼序列。根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，活性(免疫刺激性)組 合物的至少一種RNA可以備選地或另外地編碼STEAP抗原序列，其選自登記號為NM_012449 或如圖11或12 (SEQ ID NOs 11或12)中任一個所示的STEAP序列的片段、變體或表位。
上述定義的可以由本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 編碼的抗原、抗原蛋白或抗原肽，可以包括那些序列的片段或變體。所述片段或變體可以典 型地包括與上文提及的抗原、抗原蛋白或抗原肽或序列或它們的編碼核酸序列之一具有至 少5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選地至少80 %，等價地更 優(yōu)選地至少85 %，甚至更優(yōu)選地至少90 %且最優(yōu)選地至少95 %或甚至97 %，至完整的野生 型序列的序列同源性的序列，不管是在核酸水平還是在氨基酸水平上。
在本發(fā)明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的“片段”可以包括如上文定義的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，關(guān)于其氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)，與原始(天 然)蛋白的氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)相比較，其是N端、C端和/或序列內(nèi)部截 短的。所述截短可以因此發(fā)生在氨基酸水平或者相對應(yīng)的發(fā)生在核酸水平上。因此，關(guān)于 如上文定義的所述片段的序列同源性可以優(yōu)選地是指如上文定義的完整的抗原、抗原蛋白 或抗原肽或所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的完整(編碼)核酸序列。在本發(fā)明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段還可以包括如上述定義的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，其具有約6-約20個或甚至更多個氨基酸的長度，例如，由 I類MHC分子處理和呈遞的片段，優(yōu)選地具有約8-約10個氨基酸的長度，例如，8，9，或10 個，(或者甚至6，7，11，或12個氨基酸)，或由II類MHC分子處理和呈遞的片段，優(yōu)選地具有 約13個以上的氨基酸的長度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20個或甚至更多個氨基酸，其 中這些片段可以選自所述氨基酸序列的任一部分。這些片段典型地以由所述肽片段和MHC 分子組成的復(fù)合體形式被T細(xì)胞識別，即，所述片段典型地不以它們的天然形式被識別。如本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段還可以包括那些抗原、抗原蛋白或 抗原肽的表位。在本發(fā)明的上下文中，表位(還稱為“抗原決定簇”)典型地是位于本文定 義的(天然)抗原、抗原蛋白或抗原肽的外表面的片段，優(yōu)選地具有5-15個氨基酸，更優(yōu)選 地具有5-12個氨基酸，甚至更優(yōu)選地具有6-9個氨基酸，其可以被抗體或B細(xì)胞受體識別， 艮口，以它們的天然形式被識別?？乖⒖乖鞍谆蚩乖牡乃霰砦贿€可以選自本文提及的 所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的變體的任一種。在該情形中，抗原決定簇可以是構(gòu)象或不連 續(xù)的表位，其由本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段組成，所述片段在本文定義的抗 原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列中是不連續(xù)的，但是在三維結(jié)構(gòu)中是在一起的或是由 單一多肽鏈組成的連續(xù)的或線性表位。如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的“變體”可以由本發(fā)明所述的活性(免疫 刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼，其中編碼如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽 的所述至少一種(m)RNA的核酸是交換的。由此，可以產(chǎn)生具有在一個或多個突變，如一個 或多個取代的、插入的和/或刪除的氨基酸而與原始序列不同的氨基酸序列的抗原、抗原 蛋白或抗原肽。優(yōu)選地，與全長天然抗原或抗原蛋白相比較，這些片段和/或變體具有相同 的生物學(xué)功能或特異性活性，例如，其特異性抗原特性。本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼上文定 義的抗原或抗原蛋白，其中與其生理學(xué)序列相比較，所編碼的氨基酸序列包括保守氨基酸 取代。那些編碼的氨基酸序列以及它們的編碼核苷酸序列特別落入如上文定義的術(shù)語變體 中。來源于相同種類的氨基酸與另一種交換的取代稱為保守取代。特別地，這些是具有脂肪 族側(cè)鏈、帶正電荷或負(fù)電荷的側(cè)鏈、在側(cè)鏈中具有芳香族基團(tuán)的氨基酸，或其側(cè)鏈可以進(jìn)入氫橋的氨基酸，例如，具有羥基官能的側(cè)鏈。這意味著，例如，具有極性側(cè)鏈的氨基酸被具有 同樣極性側(cè)鏈的另一種氨基酸替換，或者例如，以疏水側(cè)鏈為特征的氨基酸被具有同樣的 疏水側(cè)鏈的另一種氨基酸取代(例如，絲氨酸(蘇氨酸)被蘇氨酸(絲氨酸)置換或亮氨酸 (異亮氨酸)被異亮氨酸(亮氨酸)置換)。插入和取代是可能的，特別是在對三維結(jié)構(gòu)沒 有引起修飾或不影響結(jié)合區(qū)的那些序列位置上。插入或刪除對三維結(jié)構(gòu)的修飾可以容易地 確定，例如，使用 CD 光譜確定(圓二色譜)(Urry，1985，Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polyp印tides (多肽的吸附、圓二色性和 ORD)，在Modern Physical Methods in Biochemistry (生物化學(xué)的現(xiàn)代物理方法)中，Neuberger等，(ed.)，Elsevier，阿姆斯 特丹)。此外，如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的變體，其可以由本發(fā)明所述的活性 (免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼，還可以包括那些序列，其中所述至少一種 (m)RNA的核酸按照遺傳密碼的簡并性進(jìn)行交換，不導(dǎo)致所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的各 自氨基酸序列的改變，即，所述氨基酸序列或至少其部分可以以在上述意義內(nèi)的一個或多 個突變而并不在原始序列上不同。為了確定兩個序列(核酸序列，例如，如本文定義的RNA或mRNA序列，或氨基酸序 列，優(yōu)選地它們編碼的氨基酸序列，例如，如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸 序列)相同的百分比，可以比對序列，以隨后與另一種進(jìn)行比較。因此，例如，可以在第一序 列的序列中插入缺口，并且可以比較在第二序列的相對應(yīng)位置處的成分。如果在第一序列 中的位置由與在第二序列中位置處的情形相同的成分占據(jù)，則這兩個序列在該位置處是相 同的。兩個序列相同的百分比是相同的位置數(shù)目除以位置總數(shù)的函數(shù)。兩個序列相同的 百分比可以使用數(shù)學(xué)算法確定?？梢詰?yīng)用的數(shù)學(xué)算法的一個優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例是 Karlin 等，(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877 或 Altschul 等，(1997)，Nucleic Acids Res. (核酸研究)，25:3389-3402的算法。這樣的算法結(jié)合在BLAST程序中?？梢酝ㄟ^該程序 鑒定與本發(fā)明的序列在某種程度上相同的序列。本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物包括，如上文定義，至少一種RNA，其編碼 選自上述組的任意抗原的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，原因在于按照本發(fā)明，前文提及的 組的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的特定組合能夠有效刺激(適應(yīng)性)免疫系統(tǒng)，以允許 治療前列腺癌(PCa)。然而，本發(fā)明還可以提供這樣的活性(免疫刺激性)組合物，其包括 編碼選自上述組任意抗原的三種或四種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA，其中這些抗原 的任意組合是可能的和由本發(fā)明涵蓋。更優(yōu)選地，本發(fā)明還可以提供包括至少一種RNA的活性(免疫刺激性)組合物，所 述至少一種RNA編碼選自上述組的任意抗原的至少三種或四種(優(yōu)選不同的)抗原，其中 這些抗原的任意組合是可能的。因此，由于另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，所述抗原選自上文提及的包括(至 少)任一種下述抗原組合的組的任意抗原· PSA 和 PSMA，或· PSA 和 PSCA，或· PSA 和 STEAP，或
· PSMA 和 PSCA，或· PSMA 和 STEAP，或· PSCA 和 STEAP，或· PSA，PSMA 禾口 PSCA，或· PSA，PSMA 和 STEAP，或· PSMA, PSCA 和 STEAP，或· PSA，PSCA 和 STEAP，或或 · PSA, PSMA, PSCA 和 STEAP.根據(jù)另一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種活性(免疫刺激性)組合物，其包括編 碼至少兩種、三種或四種(優(yōu)選地不同抗原)的至少一種RNA，a)其中至少一種抗原選自· STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)；和b)其中其它的抗原選自任意下列抗原或其特定組合的至少一種抗原· PSA (前列腺特異性抗原)，或· PSMA (前列腺特異性膜抗原)，或· PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)；或· PSA 和 PSMA，或參 PSA 禾口 PSCA，或· PSMA 和 PSCA ；或· PSA，PSMA 禾口 PSCA。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供活性(免疫刺激性)組合物，其包括編碼 四種(優(yōu)選不同的)選自PSA，PSMA, PSCA和STEAP的抗原的活性(免疫刺激性)組合物。本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA典型地是任意RNA，優(yōu)選地，但不限于此，編碼RNA，環(huán)形或線性RNA，單鏈或雙鏈RNA (其還可以視為是由于兩個 單鏈RNA的非共價締合形成的RNA)或部分雙鏈或部分單鏈的RNA，其至少部分是自身互補(bǔ) 性的(這些部分雙鏈或部分單鏈的RNA分子二者典型地由更長和更短的單鏈RNA分子形 成，或者由兩個單鏈RNA分子形成，其在長度上大約相等，其中一個單鏈RNA分子部分與另 一而單鏈RNA分子互補(bǔ)，并且因此二者在該區(qū)域形成雙鏈RNA，即，相對于完整的RNA序列部 分是雙鏈或部分是單鏈的RNA)。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所 述至少一種RNA是單鏈RNA，甚至更優(yōu)選地是線性RNA。最優(yōu)選地，本發(fā)明所述的活性(免 疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA是信使RNA (mRNA)。在該情形中，信使RNA (mRNA)典 型地是這樣的RNA，其由(至少)一些結(jié)構(gòu)元件組成，例如，任選的5’ -UTR區(qū)，位于上游的 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，之后是編碼區(qū)，任選的3’-UTR區(qū)，其可以后接聚腺苷酸尾(和/或聚胞苷 酸尾)。由于一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的每一種，可以由一種(單順反子)RNA編碼，優(yōu)選地一種(單順 反子)mRNA編碼。換言之，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包含至少兩種(單順 反子)RNAs，優(yōu)選mRNAs，其中這些兩種(單順反子)RNAs、優(yōu)選mRNAs的每一種可以僅編碼 一種(優(yōu)選不同的)抗原，所述抗原選自上文提及的組或亞組之一，優(yōu)選地以上文提及的組合之一
按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包括 (至少)一種雙順反子或者甚至多順反子RNA，優(yōu)選mRNA，S卩，攜帶至少兩種(優(yōu)選不同的) 抗原的兩種或甚至多種編碼序列的(至少)一種RNA，所述抗原選自上文提及的組或亞組之 一，優(yōu)選地在上文提及的組合之一中。所述(至少)一種雙順反子或甚至多順反子RNA的 至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的所述編碼序列可以由至少一個下文定義的IRES(內(nèi)部核糖 體進(jìn)入位點(diǎn))序列分開。因此，術(shù)語“編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原”可以意指，但不限 于，所述(至少)一種(雙順反子或甚至多順反子)RNA，優(yōu)選mRNA，可以編碼上文提及的抗 原組的至少兩種、三種或四種(優(yōu)選不同的)抗原或在它們上述定義內(nèi)的片段或變體。更優(yōu) 選地，但不限于此，所述(至少)一種(雙順反子或甚至多順反子)RNA，優(yōu)選mRNA，可以編 碼，例如，上文提及的抗原亞組的至少兩種、三種或四種(優(yōu)選不同的)抗原或它們在上述 定義內(nèi)的片段或變體。在該情形中，如上文定義的所謂的IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序 列可以作為唯一的核糖體結(jié)合位點(diǎn)行使功能，但是它還可以作用為提供如上文定義的編碼 幾種蛋白的雙順反子或甚至多順反子RNA，所述蛋白將由彼此獨(dú)立的核糖體翻譯。按照本發(fā) 明可以使用的IRES序列的實(shí)例是選自小RNA病毒(例如FMDV)，鼠疫病毒(CFFV)，脊髓灰 質(zhì)炎病毒(PV)，腦心肌炎病毒(ECMV)，口蹄疫病毒(FMDV)，丙型肝炎病毒(HCV)，豬霍亂病 毒(CSFV)，小鼠角膜白斑病毒(MLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的 那些。按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包括 如上文定義的至少一種單順反子RNA、優(yōu)選mRNA和如上述定義的至少一種雙順反子或甚至 多順反子RNA、優(yōu)選mRNA的混合物。所述至少一種單順反子RNA和/或所述至少一種雙順 反子或甚至多順反子RNA優(yōu)選地編碼不同的抗原或它們在上述定義內(nèi)的片段或變體，所述 抗原優(yōu)選地選自上文提及的抗原組或亞組之一，更優(yōu)選地在上文提及的組合之一中。然而， 所述至少一種單順反子RNA和所述至少一種雙順反子或甚至多順反子RNA可以優(yōu)選地還編 碼選自上文提及的抗原組或亞組之一的(部分)相同的抗原，優(yōu)選地在上文提及的組合之 一中，條件是本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物完全提供如上文定義的至少兩種(優(yōu)選 不同的)抗原。這樣的實(shí)施方案可以有利的用于，例如交錯的，例如時間依賴性的向需要其 的患者施用本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物。本發(fā)明的所述活性(免疫刺激性)組合 物的成分，特別是編碼所述至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的不同RNAs，可以，例如，包含在部 分組合物試劑盒(的不同部分)中，或者可以，例如，作為本發(fā)明所述的不同活性(免疫刺 激性)組合物的成分分開施用。優(yōu)選地，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，其編碼選自上文定 義的抗原組、更優(yōu)選地在上述組合中的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，典型地包括約50-約 20000個，或100-約20000個核苷酸的長度，優(yōu)選地約250-約20000個核苷酸，更優(yōu)選地約 500-約10000個，甚至更優(yōu)選地約500-約5000個核苷酸長度。
按照一個實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，其編碼 選自上文定義的抗原組或亞組、更優(yōu)選地在上述組合中的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原， 可以采用修飾的RNA的形式，其中如本文定義的任何修飾可以引入到所述活性(免疫刺激 性)組合物的所述至少一種RNA中。如本文定義的修飾優(yōu)選地導(dǎo)致本發(fā)明的活性(免疫刺 激性)組合物的穩(wěn)定的至少一種RNA。按照第一實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可 以因此提供為“穩(wěn)定的RNA”，優(yōu)選穩(wěn)定的mRNA，也就是說，作為基本上抗體內(nèi)降解(例如， 由外切-或內(nèi)切-核酸酶進(jìn)行)的(m)RNA。所述穩(wěn)定可以，例如，通過本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物的所述至少一個(m)RNA的修飾的磷酸酯骨架實(shí)現(xiàn)。關(guān)于本發(fā)明的骨架 修飾是其中化學(xué)修飾RNA中包含的核苷酸骨架的磷酸酯的修飾。可以優(yōu)選地用在該情形 中的核苷酸包含，例如，硫代磷酸酯_修飾的磷酸酯骨架，優(yōu)選地磷酸酯骨架中所包含的至 少一個磷酸氧被硫原子取代。穩(wěn)定的(m)RNAs還可以包括，例如非離子磷酸酯類似物，諸 如例如，烷基和芳基磷酸酯，其中帶電荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替換，或磷酸二酯和烷基 磷酸三酯，其中帶電荷的氧殘基以烷基化形式存在。所述骨架修飾典型地包括，但不暗示 任何限制，來自由下列各項(xiàng)組成的組的修飾甲基膦酸酯，磷酰胺和硫代硫酸酯(例如，胞 苷-0-(l-硫代磷酸))。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以另外或備選地還包 含糖修飾。與本發(fā)明有關(guān)的糖修飾是對所述至少一種RNA的核苷酸的糖的化學(xué)修飾，并且 典型地包括，不暗示任何限制，選自由下列各項(xiàng)組成的組的糖修飾2'-脫氧-2'-氟-寡 核糖核苷酸(2'-氟-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氟-2'-脫氧尿苷-5'-三磷 酸)，2'-脫氧-2'-脫氨寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氨 基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸)，'-0-烷基寡核糖核苷酸，2'-脫氧-2' -C-烷基寡 核糖核苷酸(2 ‘ -0-甲基胞苷-5'-三磷酸，2'-甲基尿苷-5'-三磷酸)，‘-C-烷 基寡核糖核苷酸，和它們的異構(gòu)體(2'-阿糖胞苷(araCytidine)-5'-三磷酸，2'-阿 糖尿苷(araUridine)-5'-三磷酸)，或疊氮三磷酸(2'-疊氮-2'-脫氧胞苷-5'-三 磷酸，2'-疊氮-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸)。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以另外或備選地還包含至少一種堿基修飾，與未改變的、即天然(natural)(=天然(native))RNA序列相此較， 其優(yōu)選地適于顯著增加由所述至少一種RNA序列編碼的蛋白的表達(dá)。在這種情形中，顯著 性意指與天然RNA序列的表達(dá)相比，蛋白表達(dá)增加至少20%，優(yōu)選地至少30%，40%，50% 或60 %，更優(yōu)選地至少70 %，80 %，90 %或甚至100 %，并且最優(yōu)選地至少150 %，200 %或者 甚至300%以上。關(guān)于本發(fā)明，具有這樣的堿基修飾的核苷酸優(yōu)選地選自由下列各項(xiàng)組成的 堿基-修飾的核苷酸組2_氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸，2-氨基腺苷-5'-三磷酸， 2_硫胞苷-5'-三磷酸，2-硫尿苷-5'-三磷酸，4-硫尿苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙 基胞苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，5-溴尿 苷-5'-三磷酸，5-碘胞苷-5'-三磷酸，5-碘尿苷-5'-三磷酸，5-甲基胞苷-5'-三 磷酸，5-甲基尿苷-5'-三磷酸，6-氮胞苷-5'-三磷酸，6-氮尿苷-5'-三磷酸，6-氯 嘌呤核苷-5'-三磷酸，7-脫氮腺苷-5'-三磷酸，7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸，8-氮雜 腺苷-5'-三磷酸，8-疊氮腺苷-5'-三磷酸，苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸，Nl-甲基腺苷-5'-三磷酸，Nl-甲基鳥苷-5'-三磷酸，N6-甲基腺苷-5'-三磷酸，06-甲基鳥 苷-5'-三磷酸，假尿苷-5'-三磷酸，或嘌呤霉素-5'-三磷酸，黃苷-5'-三磷酸。 對于堿基修飾特別優(yōu)選的核苷酸選自由下列各項(xiàng)組成的堿基_修飾的核苷酸組5-甲基胞 苷-5'-三磷酸，7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，和假尿苷-5'-三 磷酸。 按照另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 同樣可以通過引入進(jìn)一步修飾的核苷酸進(jìn)行修飾(且優(yōu)選地進(jìn)行穩(wěn)定)，所述進(jìn)一步修飾 的核苷酸包含它們的核糖或堿基結(jié)構(gòu)部分的修飾。通常，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組 合物的所述至少一種(m)RNA可以包含任何天然的(=天然存在的)核苷酸，例如，鳥苷， 尿嘧啶，腺苷，和/或胞嘧啶或它們的類似物。在該情形中，核苷酸類似物定義為天然存 在的核苷酸的非天然存在的變體。因此，類似物是化學(xué)衍生的具有非天然存在的官能團(tuán) 的核苷酸，所述非天然存在的官能團(tuán)優(yōu)選地添加或由天然存在的核苷酸刪除，或其取代核 苷酸的天然存在的官能團(tuán)。因此，天然存在的核苷酸的每個成分可以進(jìn)行修飾，即，形成 RNA序列的骨架(見上文)的堿基成分、糖(核糖)成分和/或磷酸酯成分。鳥苷、尿嘧 啶、腺苷和胞嘧啶的類似物包括，不暗示任何限制，已經(jīng)化學(xué)改變的任何天然存在的或非天 然存在的鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶，例如，通過乙?；?、甲基化、羥基化等化學(xué)改 變，其包括1-甲基-腺苷，I-甲基-鳥苷，1-甲基-肌苷，2，2_ 二甲基-鳥苷，2，6_ 二氨 基嘌呤，2'-氨基-2'-脫氧腺苷，2'-氨基-2'-脫氧胞苷，2'-氨基-2'-脫氧 鳥苷，2'-氨基-2'-脫氧尿苷，2-氨基-6-氯嘌呤核苷，2-氨基嘌呤-核苷，2'-阿 糖腺苷(Araadenosine)，2'-阿糖胞苷(Aracytidine)，2 ‘-阿糖尿苷(Arauridine)， 2'-疊氮-2'-脫氧腺苷，2'-疊氮-2'-脫氧胞苷，2'-疊氮-2'-脫氧鳥苷， 2'-疊氮-2'-脫氧尿苷，2-氯腺苷，2'-氟-2'-脫氧腺苷，2'-氟-2'-脫氧胞 苷，2'-氟-2'-脫氧鳥苷，2'-氟-2'-脫氧尿苷，2'-氟胸苷，2-甲基-腺苷，2-甲 基-鳥苷，2-甲基-硫-N6-異戊烯基(isopenenyl)-腺苷，2' -0-甲基_2_氨基腺苷， 2' -0-甲基-2'-脫氧腺苷，2' -0-甲基-2'-脫氧胞苷，2' -0-甲基-2'-脫氧鳥 苷，2' -0-甲基-2'-脫氧尿苷，2' -0-甲基-5-甲基尿苷，2' -0-甲基肌苷，2' -0-甲 基假尿苷，2-硫代胞苷，2-硫代-胞嘧啶，3-甲基-胞嘧啶，4-乙?；?胞嘧啶，4-硫尿苷， 5-(羧基羥甲基)-尿嘧啶，5，6- 二氫尿苷，5-氨基烯丙基胞苷，5-氨基烯丙基-脫氧-尿 苷，5-溴尿苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶，5-氯-阿 糖胞苷，5-氟-尿苷，5-碘尿苷，5-甲氧基羰基甲基-尿苷，5-甲氧基-尿苷，5-甲基-2-硫 代_尿苷，6-氮胞苷，6-氮尿苷，6-氯-7-脫氮-鳥苷，6-氯嘌呤核苷，6-巰基-鳥苷，6-甲 基_巰基嘌呤_核苷，7-脫氮-2 ‘-脫氧-鳥苷，7-脫氮腺苷，7-甲基-鳥苷，8-氮腺苷， 8_溴-腺苷，8-溴-鳥苷，8-巰基-鳥苷，8-氧代鳥苷，苯并咪唑-核苷，β-D-甘露糖基-辮 苷((β-D-marmosyl-queosine)，二氫-尿嘧啶，肌苷，Nl-甲基腺苷，Ν6_([6_氨基己基] 氨基甲?；谆?_腺苷，Ν6-異戊烯基-腺苷，Ν6-甲基-腺苷，Ν7-甲基-黃苷，N-尿嘧 啶-5-羥基乙酸甲酯，嘌呤霉素，辮苷(Queosine)，尿嘧啶-5-羥基乙酸，尿嘧啶-5-羥基乙 酸甲酯，Wybutoxosine，黃苷，和木-腺苷。所述類似物的制備是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的， 例如，由美國專利 4，373，071，US 4，401，796，US 4，415，732，US4, 458，066，US 4，500，707， US 4，668，777，US 4，973，679，US 5，047，524，US5, 132，418，US 5，153，319，US 5，262，530和5，700，642可知。在上述類似物的情形中，按照本發(fā)明可以特別優(yōu)選增加本發(fā)明活性(免 疫刺激性)組合物的RNA的免疫原性和/或不干擾已經(jīng)引入的RNA進(jìn)一步修飾的那些類似 物。按照特別的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 可以包含脂質(zhì)修飾。所述脂質(zhì)_修飾的RNA典型地包括如本文定義的RNA，其編碼選自上述 定義的抗原組的、優(yōu)選在上述組合中的至少兩種抗原。所述脂質(zhì)_修飾的RNA典型地進(jìn)一 步包含與所述RNA共價連接的至少一個連接體，和與各自的連接體共價連接的至少一個脂 質(zhì)。備選地，所述脂質(zhì)_修飾的RNA包括如本文定義的(至少一個)RNA和與所述RNA共價 連接(無連接體)的至少一個(雙官能性)脂質(zhì)。按照第三備選方案，所述脂質(zhì)-修飾的 RNA包括如本文定義的RNA，與所述RNA共價連接的至少一個連接體，和與各自的連接體共 價連接的至少一個脂質(zhì)，和與所述RNA共價連接(無連接體)的至少一個(雙官能性)脂 質(zhì)。在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA中包含的脂質(zhì)(與 其復(fù)合或共價結(jié)合)典型地是脂質(zhì)或優(yōu)選自身是生物活性的親脂殘基。所述脂質(zhì)優(yōu)選地 包括天然物質(zhì)或化合物，諸如例如，維生素，例如，α “生育酚(維生素Ε)，包括RRR- α -生 育酚(以前為D-α-生育酚)，L-α-生育酚，外消旋D，L-α -生育酚，維生素E琥珀酸 酯(VES)，或維生素A及其衍生物，例如視黃酸，視黃醇，維生素D及其衍生物，例如維生素 D以及其麥角固醇前體，維生素E及其衍生物，維生素K及其衍生物，例如維生素K和相關(guān) 的醌或植醇化合物，或類固醇，如膽汁酸，例如膽酸，脫氧膽酸，脫氫膽酸，可的松，洋地黃毒 苷(digoxygenin)，睪酮，膽固醇或硫代膽固醇。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它脂質(zhì)或親脂殘基 包括，不暗示任何限制，聚二醇(Oberhauser等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1992，20， 533)，脂肪族基團(tuán)，諸如例如，C1-C20-鏈烷，C1-C20-鏈烯或C1-C20-鏈烷醇化合物，等等， 諸如例如，十二烷二醇，十六醇或i^一烷基殘基(Saison-Behmoaras等，，EMBO J，1991，10， 111 ；Kabanov 等，，F(xiàn)EBS Lett. (FEBS 通信)，1990，259，327 ；Svinarchuk 等，，Biochimie, 1993，75，49)，磷脂，諸如例如，磷脂酰甘油，二?；字８视?，磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂 酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，雙十六烷基_外消旋_甘油 (di-hexadecyl-rac-glycerol)，鞘脂，腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，或三乙基銨1，2_ 二 _0_十六 烷基_外消旋_甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，，Tetrahedron Lett.(四面體通信)， 1995，36，3651 ；Shea 等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1990，18，3777)，聚胺或聚二醇，諸 如例如，聚乙二醇(PEG) (Manoharan 等，，Nucleosides & Nucleotides (核苷和核苷酸)， 1995，14，969)，六甘醇(HEG)，棕櫚酸甘油酯或棕櫚基殘基(Mishra等，，Biochim. Biophys. Acta (生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào))，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇?xì)?基(Crooke 等，，J. Pharmacol. Exp. Ther.(藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)治療雜志)，1996，277，923)，以及蠟， 萜烯，脂環(huán)烴，飽和的和單_或多-不飽和脂肪酸殘基，等等。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以同樣進(jìn)行穩(wěn)定，以防止RNA在體內(nèi)被各種途徑降解。在本領(lǐng)域已知mRNA或RNA的體內(nèi)不穩(wěn)定性和(快速) 降解通?？梢栽诨赗NA的組合物應(yīng)用中代表著嚴(yán)重的問題。這種RNA不穩(wěn)定性典型地是 由于RNA-降解酶“RNA酶”(核糖核酸酶)引起，其中所述核糖核酸酶的污染有時可以完全 降解溶液中的RNA。因此，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的天然mRNA降解非常精細(xì)地調(diào)控，并且RNA酶污染通?？梢酝ㄟ^在使用所述組合物之前進(jìn)行專門的處理而去除，特別是用焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理。在現(xiàn)有技術(shù)中，在該情形中，可以使用的多種天然降解機(jī)制是已知的。例如， 在體內(nèi)，末端結(jié)構(gòu)典型地對于mRNA是至關(guān)重要的。例如，在天然存在的mRNAs的5'末端通 常存在所謂的“帽結(jié)構(gòu)”(修飾的鳥苷核苷酸)，且在3'末端典型地是多至200個腺苷的核 苷酸的序列(所謂的聚腺苷酸尾)。本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，特別是如果作為mRNA提 供，因此可以通過添加所謂的“5'帽”結(jié)構(gòu)而抗RNA酶降解被穩(wěn)定。在這種情形中，特別優(yōu) 選 m7G(5' )ppp(5' (A, G(5' )ppp(5' )A 或 G(5' )ppp(5' )G 作為 “5'帽”結(jié)構(gòu)。然 而，僅在如果還沒有在本發(fā)明的免疫刺激性組合物的(m)RNA 5'末端引入修飾如脂質(zhì)修飾 時或者如果所述修飾 不干擾所述(未修飾的或化學(xué)修飾的)(m) RNA的免疫原性特性時引入 這樣的修飾。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA,特別是如果所述RNA采用mRNA形式時，可以在3'末端包含典型地約10-200個腺苷 核苷酸、優(yōu)選約10-100個腺苷核苷酸、更優(yōu)選約20-100個腺苷核苷酸或甚至更優(yōu)選地約 40-80個腺苷核苷酸的聚腺苷酸尾。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA，特別是如果所述RNA采用mRNA形式時，可以在3'末端包含典型地約10-200個胞嘧啶 核苷酸、優(yōu)選地約10-100個胞嘧啶核苷酸、更優(yōu)選地約20-70個胞嘧啶核苷酸或甚至更優(yōu) 選地約20-60個或甚至10-40個胞嘧啶核苷酸的聚胞苷酸尾。按照另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 可以進(jìn)行修飾，并且因此被穩(wěn)定，特別是如果所述RNA采用mRNA形式時，通過改變所述RNA 的G/C含量，優(yōu)選是至少一種RNA的編碼區(qū)的G/C含量進(jìn)行。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與其具體的野生型(m)RNA，即未修飾的(m) RNA編碼區(qū)的G/C含量相比較，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA 的編碼區(qū)的G/C含量被改變，特別是增加。與具體的野生型(m) RNA所編碼的氨基酸序列相 比較，所述至少一種(m) RNA所編碼的氨基酸序列優(yōu)選不被改變。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA的這種修飾是基于 要翻譯的任意(m) RNA區(qū)序列對于所述(m) RNA的有效翻譯是重要的事實(shí)。因此，多種核苷酸 的組成和序列是重要的。特別地，具有增加的G(鳥苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增 加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更穩(wěn)定。按照本發(fā)明，因此與其野生型(m)RNA相比 較，所述(m)RNA的密碼子不同，同時保留所翻譯的氨基酸序列，以致它們包括增加量的G/C 核苷酸。關(guān)于一些密碼子編碼一種且是相同的氨基酸的事實(shí)(所謂的遺傳密碼簡并性)，可 以確定對穩(wěn)定性最有利的密碼子(所謂的備選密碼子應(yīng)用)。取決于由所述至少一種(m) RNA編碼的氨基酸，與其野生型序列相比較，對于所述 (m) RNA序列的修飾存在多種可能性。在由專門包含G或C核苷酸的密碼子編碼的氨基酸的 情形中，不需要密碼子的修飾。因此，對于Pro (CCC或CCG)，Arg (CGC或CGG)，Ala (GCC或 GCG)和Gly (GGC或GGG)的密碼子不需要修飾，因?yàn)椴淮嬖贏或U。相反，包含A和/或U核苷酸的密碼子可以通過編碼相同的氨基酸但是不含有A 和/或U的其它密碼子的取代而進(jìn)行修飾。這些的實(shí)例如下Pro的密碼子可以由CCU或CCA修飾為CCC或CCG ；Arg的密碼子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修飾為CGC或CGG ；Ala的密碼子可以由GCU或GCA修飾為GCC或GCG ；Gly的密碼子可以由GGU或GGA修飾為GGC或GGG。在其它情形中，盡管不從所述密碼子中去除A或U核苷酸，然而，可以通過使用含 有較低的A和/或U核苷酸含量的密碼子而降低A和U含量。這些的實(shí)例如下Phe的密碼子可以由UUU修飾為UUC ；Leu的密碼子可以由UUA，UUG, CUU或CUA修飾為CUC或CUG ；Ser的密碼子可以由UCU或UCA或AGU修飾為UCC，UCG或AGC ；Tyr的密碼子可以由UAU修飾為UAC ；Cys的密碼子可以由UGU修飾為UGC ；His的密碼子可以由CAU修飾為CAC ；Gln的密碼子可以由CAA修飾為CAG ；Ile的密碼子可以由AUU或AUA修飾為AUC ；Thr的密碼子可以由A⑶或ACA修飾為ACC或ACG ；Asn的密碼子可以由AAU修飾為AAC ；Lys的密碼子可以由AAA修飾為AAG ；Val的密碼子可以由GUU或GUA修飾為GUC或⑶G ；Asp的密碼子可以由GAU修飾為GAC ；Glu的密碼子可以由GAA修飾為GAG ；終止密碼子UAA可以修飾為UAG或UGA。另一方面，在Met (AUG)和Trp (UGG)的密碼子的情形中，不存在序列修飾的可能性。上文列出的取代可以單獨(dú)的或以所有可能的組合使用，以在與其具體的野生型 (m) RNA (S卩，原始序列)相比較時，提高本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少 一種(m)RNA的G/C含量。因此，例如，在野生型序列中存在的所有Thr密碼子可以修飾為 ACC (或ACG)。然而，優(yōu)選地，例如，使用上述取代可能性的組合將原始序列(野生型(m) RNA)中編碼Thr的所有密碼子取代為ACC (或ACG)和將原始編碼Ser的所有密碼子取代為UCC (或UCG或AGC)；將原始序列中編碼Ile的所有密碼子取代為AUC和將原始編碼Lys的所有密碼子取代為AAG和將原始編碼Tyr的所有密碼子取代為UAC ；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Glu的所有密碼子取代為GAG和將原始編碼Ala的所有密碼子取代為GCC (或GCG)和將原始編碼Arg的所有密碼子取代為CGC (或CGG)；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Glu的所有密碼子取代為GAG和將原始編碼Ala的所有密碼子取代為GCC (或GCG)和
將原始編碼Gly的所有密碼子取代為GGC (或GGG)和將原始編碼Asn的所有密碼子取代為AAC ；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Phe的所有密碼子取代為UUC和將原始編碼Cys的所有密碼子取代為UGC和將原始編碼Leu的所有密碼子取代為CUG (或CUC)和將原始編碼Gln的所有密碼子取代為CAG和將原始編碼Pro的所有密碼子取代為CCC(或CCG)；等等。優(yōu)選地，與編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或變體的野生型(m) RNA的G/C含量相比較，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m) RNA的編 碼區(qū)的G/C含量增加至少7%，更優(yōu)選地至少15%，特別優(yōu)選地至少20%。按照具體實(shí)施方 案，在編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或變體的區(qū)域中或野生型(m)RNA 序列的完整序列中至少5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，更優(yōu)選地至少70%，甚至 更優(yōu)選地至少80%和最優(yōu)選地至少90%，95%或者甚至100%的可取代的密碼子被取代， 由此增加所述序列的GC/含量。在該情形中，與野生型序列相比較，特別優(yōu)選將本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合 物的所述至少一種(m) RNA的G/C含量增加至最大值(S卩，可取代的密碼子100%被取代)， 特別是在編碼蛋白的區(qū)域中。按照本發(fā)明，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA的另一 種優(yōu)選修飾基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即翻譯效率也通過細(xì)胞中tRNA出現(xiàn)的不同頻率確定。因此， 如果在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m) RNA中存在所謂的“罕用密 碼子”達(dá)到增多的程度，則相應(yīng)修飾的至少一種(m) RNA序列被翻譯至比其中存在編碼相對 “頻繁” tRNA的密碼子的情形顯著更差的程度。按照本發(fā)明，在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述修飾的至少一種(m) RNA中，編碼輔助蛋白的區(qū)域與野生型(m)RNA的相應(yīng)區(qū)域相比被修飾，以致編碼細(xì)胞中相 對稀有的tRNA的野生型序列的至少一個密碼子交換成編碼細(xì)胞中相對頻繁的tRNA的密碼 子并攜帶與相對稀有tRNA相同的氨基酸。通過該變化，改變本發(fā)明的活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種(m)RNA的序列，從而插入可以獲得頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子。換 言之，按照本發(fā)明，在各種情形中，通過該變化，野生型序列的編碼細(xì)胞中相對稀有的tRNA 的所有密碼子可以交換成編碼細(xì)胞中相對頻繁的tRNA的密碼子，并且其，在各種情形中， 攜帶與相對稀有tRNA相同的氨基酸。哪些tRNA在細(xì)胞中相對頻繁出現(xiàn)和相反地哪些相對罕見出現(xiàn)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的，cf.例如Akashi，Curr. Opin. Genet. Dev.(當(dāng)前遺傳發(fā)育觀點(diǎn))2001，11 (6) 660-666。特別優(yōu)選對于特定氨基酸，使用最頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子，例如Gly密碼子， 其使用在(人)細(xì)胞中最頻繁出現(xiàn)的tRNA。按照本發(fā)明，特別優(yōu)選的是將本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述修飾的 至少一種(m) RNA中增加的特別是最大化的序列G/C含量與不改變由所述(m) RNA編碼區(qū)編 碼的蛋白的氨基酸序列的“頻繁”密碼子相連。這個優(yōu)選的實(shí)施方案容許提供本發(fā)明的活 性(免疫刺激性)組合物的特別有效翻譯和穩(wěn)定(修飾)的至少一種(m)RNA。
如上述的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的修飾的至少一種(m)RNA的確定 (增加的G/C含量；tRNA的交換)可以利用WO 02/098443中解釋的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行——其 公開內(nèi)容全文包括在本發(fā)明中。利用該計(jì)算機(jī)程序，任何所需的(m)RNA的核苷酸序列可以 借助于遺傳密碼或其簡并性質(zhì)來修飾，由此最大G/C含量結(jié)果，與使用編碼細(xì)胞中盡可能 頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子相結(jié)合，導(dǎo)致由所述修飾的至少一種(m) RNA編碼的氨基酸序列 與未修飾的序列相比，優(yōu)選不被改變。備選地，與原始序列相比，還可能僅改變G/C含量或 僅改變密碼子的使用。Visual Basic (視覺基礎(chǔ))6. 0(使用的開發(fā)環(huán)境具有Servic印ack3 的 Microsoft Visual StudioEnterprise6. 0)中的源碼也記述在 WO 02/098443 中。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的活性(免疫刺激性) 組合物的至少 一種(m) RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含量與其特定野生型(m) RNA的核糖體結(jié)合 位點(diǎn)環(huán)境中A/U含量相比是增加的。該修飾(在核糖體結(jié)合位點(diǎn)周圍增加的A/U含量) 增加核糖體結(jié)合所述至少一種(m)RNA的效率。核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Kozak序列 GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO 27)，AUG形成起始密碼子)的有效結(jié)合又具有有效翻譯所述至 少一種(m) RNA的作用。按照本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種 (m) RNA可以關(guān)于潛在地促降解序列元件(destabilizingsequence elements)而被修飾。 具體地，所述至少一種(m)RNA的編碼區(qū)和/或5’和/或3’非翻譯區(qū)與特定野生型(m)RNA 相比可以被修飾，從而不包含促降解序列元件，所修飾的至少一種(m)RNA的編碼氨基酸序 列與其特定野生型(m) RNA相比優(yōu)選不被改變。已知，例如，在真核生物的RNA序列中存在 促降解序列元件(DSE)，信號蛋白與其結(jié)合并在體內(nèi)調(diào)節(jié)RNA的酶降解。為了進(jìn)一步穩(wěn)定所 修飾的至少一種(m)RNA，任選地在編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的區(qū)域內(nèi)，可以 因此進(jìn)行與野生型(m)RNA的相應(yīng)區(qū)域相比的一種或多種這樣的修飾，從而使其中不含有 或基本上不含有促降解序列元件。按照本發(fā)明，也可以通過所述修飾，從本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA中除去非翻譯區(qū)(3'-和/或5' -UTR)中存在的 DSE。所述促降解序列是例如富含AU的序列(AURES)，其存在于許多不穩(wěn)定RNA的 3 ‘ -UTR 部分(Caput 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))1986，83 1670-1674)。因此按照本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA與野生型 (m)RNA相比，優(yōu)選被修飾使得該所述至少一種(m)RNA不含有所述促降解序列。這還應(yīng)用于 那些由可能的核酸內(nèi)切酶識別的序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 的基因的 3' -UTR 片段中(Binder 等，EMBO J. (ΕΜΒ0 雜志)1994，13 1969-1980)。在本發(fā) 明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA中，這些序列基序優(yōu)選地被去除。按照本發(fā)明還優(yōu)選地，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA，以 修飾的形式，具有如上文定義的以修飾形式存在的至少一個IRES和/或至少一個5'和/ 或3'穩(wěn)定序列，例如，以增強(qiáng)核糖體結(jié)合或允許位于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物 的至少一種(雙_或甚至是多順反子)RNA上的不同編碼的抗原的表達(dá)。按照本發(fā)明，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA還更優(yōu) 選地具有至少一個5'和/或3'穩(wěn)定序列。這些位于5’和/或3’非翻譯區(qū)的穩(wěn)定序列具 有增長所述至少一種(m)RNA在細(xì)胞溶膠中半衰期的作用。這些穩(wěn)定序列可以與在病毒、細(xì)菌和真核生物中存在的天然存在序列具有100%序列同源性，但也可以是部分或完全合成 的。例如來自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的珠蛋白基因的不翻譯 序列(UTR)可以作為可以在本發(fā)明中關(guān)于穩(wěn)定的RNA使用的穩(wěn)定序列的實(shí)例提及。穩(wěn)定序 列的另一個實(shí)例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID N0:28)，其包含在編 碼珠蛋白、(I) _膠原蛋白、15-脂加氧酶或編碼酪氨酸羥化酶的非常穩(wěn)定的RNA的3’UTR中 (參見 Holcik 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))1997,94 =2410-2414)。 所述穩(wěn)定序列當(dāng)然可以單獨(dú)或彼此組合使用，并且還與本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其他穩(wěn)定 序列組合使用。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA因此優(yōu)選表示為 珠蛋白UTR(非翻譯區(qū))_穩(wěn)定的RNA，特別地表示為珠蛋白UTR-穩(wěn)定的RNA。然而，關(guān)于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA優(yōu)選地進(jìn)行堿基 的置換、添加或去除，其利用用來制備本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA 的DNA基質(zhì)使用公知的基因定點(diǎn)誘變或寡核苷酸連接策略技術(shù)進(jìn)行(參見例如Maniatis 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，第三版，Cold Spring Harbor(冷泉港)， 紐約，2001)。在該過程中，為了制備所述至少一種(m)RNA，可以在體外轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的DNA分 子。該DNA基質(zhì)優(yōu)選地包括合適的啟動子，例如T7或SP6啟動子，以用于體外轉(zhuǎn)錄，其后是 待制備的所述至少一種RNA的理想核苷酸序列和體外轉(zhuǎn)錄的終止信號。形成至少一種目 的RNA基質(zhì)的DNA分子可以通過發(fā)酵增殖和隨后分離為可以在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的質(zhì)粒的一部分 來制備?？梢宰鳛檫m合于本發(fā)明提及的 質(zhì)粒是例如質(zhì)粒pT7Ts (GenBank編號U26404 ；Lai 等，Development (發(fā)育)1995，121 2349-2360)，pGEM 系列，例如pGEM -l (GenBank 編號 X65300 ；來自 Promega)和 pSP64(GenBank 編號 X65327)；還參考Mezei 和 Storts， Purification of PCRProducts (PCR 產(chǎn)物的純化)，在Griffin 和 Griffin (編)，PCR Technology =Current Innovation (PCR 技術(shù)當(dāng)前改革)中，CRC Press (CRC 出版社)，Boca Raton, FL,2001 ο本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的穩(wěn)定可以同樣通過 將所述至少一種RNA與陽離子化合物締合或復(fù)合、或與其結(jié)合而進(jìn)行，所述陽離子化合物 特別是聚陽離子化合物，例如，(聚)陽離子肽或蛋白。特別地，使用魚精蛋白、核仁蛋白 (nucleoline)、精胺(spermin)或亞精胺作為聚陽離子，針對RNA的核苷酸結(jié)合蛋白是特別 有效的。此外，同樣可以使用其它陽離子肽或蛋白，諸如聚-L-賴氨酸或組蛋白。用于穩(wěn)定 RNA的這一方法記述在EP-A-1083232中，其公開內(nèi)容通過弓I用完全結(jié)合在本發(fā)明中。可以 用于穩(wěn)定本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的RNA的其它優(yōu)選的陽離子物質(zhì)包括陽離子 多糖，例如，脫乙酰殼多糖、聚凝胺(polybrene)、聚氮丙啶(PEI)或聚-L-賴氨酸(PLL)等。 本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA與陽離子化合物(例如，作為基于脂 質(zhì)的復(fù)合劑的陽離子蛋白或陽離子脂質(zhì)，例如，oligofectamine)的締合或復(fù)合優(yōu)選地增加 作為藥物活性成分存在的所述至少一種RNA向待治療的細(xì)胞或待治療的生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。 關(guān)于通過復(fù)合穩(wěn)定本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的穩(wěn)定作用， 還參考本文的公開內(nèi)容，其也支持RNA的穩(wěn)定。按照另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一 種RNA可以另外或備選地編碼分泌信號肽。所述信號肽是這樣的序列，其典型地表現(xiàn)出約15-30個氨基酸的長度，且優(yōu)選地位于所編碼的肽的N端，并不限于此。如本文定義的信號 肽優(yōu)選地允許由所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼的抗原、抗原蛋 白或抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)到限定的細(xì)胞區(qū)室中，優(yōu)選地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶 體區(qū)室中。如本文定義的分泌信號肽序列的實(shí)例包括，但不限于此，經(jīng)典或非經(jīng)典MHC-分 子的信號序列(例如，MHC I和II分子的信號序列，例如，I類MHC分子HLA-A*0201的信號 序列)，如本文定義的細(xì)胞因子或免疫球蛋白的信號序列，如本文定義的免疫球蛋白或抗體 的不變鏈的信號序列，Lampl、Tapasin、Erp57、Calretikulin、鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)、和其它 膜締合蛋白或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶體區(qū)室締合的蛋白的信號序列。特別優(yōu)選地，按 照本發(fā)明可以使用I類MHC分子HLA-A*0201的信號序列。任何上述修飾可以應(yīng)用于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA上，并且還應(yīng)用于在本發(fā)明的情形中所使用的任意(m) RNA上，并且可以，如果合適或需 要，以任意組合彼此組合，條件是這些修飾組合在各自的至少一種RNA中彼此互不干擾。本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠因此進(jìn)行他的選擇。按照另一個實(shí)施方案，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物可以包括佐劑。 在該情形中，佐劑可以理解為適于支持本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的施用 和遞送的任何化合物。此外，所述佐劑可以，不限于此，起始或增加先天免疫系統(tǒng)的免疫反 應(yīng)，即，非特異性免疫反應(yīng)。換言之，當(dāng)施用時，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物 典型地由于由包含在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物中的至少一種RNA編碼的至少 兩種抗原而起始適應(yīng)性免疫反應(yīng)。另外，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物可以由 于加入如本文為本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物限定的佐劑而產(chǎn)生(支持性) 先天性免疫反應(yīng)。所述佐劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和適用于本情形的任何佐劑， 即，支持在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任何佐劑。優(yōu)選地，所述佐劑可以選自由下列各項(xiàng) 組成的組，但不限于此TDM，MDP，胞壁酰二肽，泊洛沙姆(pluronics)，明礬溶液，氫氧化 鋁，ADJUMER (聚磷腈)；磷酸鋁凝膠；源自藻類的葡聚糖；algammulin ；氫氧化鋁凝膠(明 礬)；高蛋白吸附性氫氧化鋁凝膠；低粘性氫氧化鋁凝膠；AF或SPT(角鯊?fù)槿闋钜?5% )， 吐溫80(0. 2% )，泊洛沙姆L121(1.25% )，磷酸鹽緩沖液，pH 7.4) ；AVRIDINE (丙烷二 胺)；BAYR1005 ((N-(2-脫氧-2-L-亮氨酰氨基_b_D_吡喃葡糖基)_N_十八烷基-十二 烷酰-酰胺氫化乙酸(hydroacetate)) ；CALCITRI0L (1-α，25-二羥基-維生素D3)；磷 酸鈣凝膠；CAPTM(磷酸鈣納米顆粒)；霍亂全毒素，霍亂-毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合 蛋白，霍亂毒素的B亞基；CRL 1005(嵌段共聚物Ρ1205)；包含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體；DDA(二 甲基雙十八烷基溴化銨)；DHEA(脫氫表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿)；DMPG(二 肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DOC/明礬復(fù)合物(脫氧膽酸鈉鹽)；弗氏完全佐劑；弗氏不完全佐 齊U; Y菊粉；Gerbu佐劑(下列各項(xiàng)的混合物i)N-乙酰葡糖胺基-(Pl-4)-N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨?；?D-谷氨酰胺(GMDP)，ii) 二甲基雙十八烷基氯化銨(DDA)，iii)鋅-L-脯 氨酸鹽復(fù)合物(ZnPro-8) ；GM-CSF) ；GMDP (N-乙酰葡糖胺基-(bl_4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙 氨?；?D-異谷氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)； ImmTher (N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala- 二棕櫚酸甘油酯)； DRVs (由脫水-再水合小泡制備的免疫脂質(zhì)體)；干擾素-Y ；白介素-1 β ；白介素-2;白介 素-7 ；白介素-12 ； ISC0MS ； ISC0PREP 7. 0. 3. ；脂質(zhì)體；L0X0RIBINE (7-烯丙基-8-氧代鳥苷)；LT 口服佐劑(大腸桿菌(E.coli)易變腸毒素-前毒素)；任意組成的微球體和微 粒；MF59 ;(角鯊烯-水乳狀液)；MONTANIDE ISA51 (純化的不完全弗氏佐劑)；MONTANIDE ISA 720 (可代謝的油佐劑)；MPL (3-Q-去酰基-4'-單磷?；|(zhì)A) ；MTP-PE和MTP-PE 脂質(zhì)體((N-乙?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰基-L-丙氨酸-2- (1，2- 二棕櫚?；?sn-甘 油 _3-(羥基磷酰氧基))-乙基酰胺，一鈉鹽)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH 3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-異 Gln-sn-甘油二棕櫚酰)； NAGO(唾液酸苷酶-半乳糖氧化酶)；任意組成的納米球體或納米顆粒；NISVs (非離子表 面活性劑小泡)；PLEURAN ( β -葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA (乳酸和乙醇酸的同聚物-和共 聚物；微球體/納米球體)；PLUR0NICL121 ;PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；P0DDS (類蛋白 微球體)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚_rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸復(fù)合物)；聚山 梨酸酯80 (吐溫80)；螺旋狀蛋白(Avanti極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids, Inc.), Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS-21) ；Quil-A (Quil-A 皂角苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二 甲基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-ItmC Syntex佐劑制劑〃)； Sendai脂蛋白體(proteoliposomes)和包含Sendai的脂質(zhì)基質(zhì)；Span-85 (失水山梨糖醇 三油酸酯)；Specol (Marcol 52，司盤85和吐溫85的乳液)；角鯊烯或Robane (2,6,10, 15，19，23-六甲基二十四燒和 2，6，10，15，19，23—六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四燒 己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸鹽酸鹽)；Theramid (N-乙酰葡糖胺基-N-乙 ?；邗?L-Ala-D-異 Glu-L-Ala- 二棕櫚氧基丙酰胺)；Theronyl-MDP (Termurtide 或[thr U-MDP ；N-乙?；邗?L-threonyl-D-異谷氨酰胺)；Ty顆粒(Ty-VLPs或病 毒樣顆粒)；Walter-Reed脂質(zhì)體(包含吸附在氫氧化鋁上的脂質(zhì)A的脂質(zhì)體)，和脂質(zhì) 肽，其包括Pam3Cys，特別是鋁鹽，諸如Adju-phos，鋁膠(Alhydrogel)，Rehydragel ；乳狀 液，其包括 CFA，SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin ；共聚物，其包 括 Optivax (CRL1005)，L121, Poloaxmer4010)，等；脂質(zhì)體，其包括 Stealth，cochleates, 包括BIORAL ；植物來源的佐劑，其包括QS21，Quil A，Iscomatrix, ISCOM ；適于共刺激的佐 齊IJ，其包括番茄素，生物聚合物，其包括PLG，ΡΜΜ，菊粉；微生物來源的佐劑，其包括羅莫肽， DET0X，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR 1-10的配體，鼠TLR 1-13的配體， ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，阿普林津，Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs，霍亂毒素，熱變性 毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI錨定子，LNFPII I/Lewis X，抗微生物肽，UC-1V150，RSV融合 蛋白，cdiGMP ；和適合用作拮抗劑的佐劑，包括CGRP神經(jīng)肽。 合適的佐劑還可以選自陽離子或聚陽離子化合物，其中所述佐劑優(yōu)選地在本發(fā)明的活性(免疫刺激性組合物)的所述至少一種RNA與所述陽離子或聚陽離子化合物復(fù)合 時制備。所述活性(免疫刺激性)組合物的RNA與本文定義的陽離子或聚陽離子化合物 的締合或復(fù)合優(yōu)選地為佐劑提供特性，并且賦予所述活性(免疫刺激性)組合物的所述 至少一種RNA的穩(wěn)定作用。特別地，所述優(yōu)選的陽離子或聚陽離子化合物選自陽離子或 聚陽離子肽或蛋白，其包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，或其它陽離子肽或蛋白， 諸如聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，穿透細(xì)胞的肽(CPPs)，其包括HIV-結(jié) 合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin, VP22 來源的或類似物肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP，KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精 氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降鈣素肽，觸角足來源的肽(特另1J是來自 Drosophila antennapedia), ρAntp, plsl, FGF,乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-來源的肽，SAP，魚精蛋白，精胺，亞精 胺，或組蛋白。其它優(yōu)選的陽離子或聚陽離子化合物可以包括陽離子多糖，例如，脫乙酰 殼多糖，聚凝胺，陽離子聚合物，例如聚氮丙啶(PEI)，陽離子脂質(zhì)，例如DOTMA :[1-(2， 3-sioleyloxy)丙基)]-N，N, N-三甲基氯化銨，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol， BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨， DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 :0，O-雙十四烷酰-N- ( α -三甲基氨 溶乙?；?二乙醇胺氯，CLIPl 外消旋-[(2，3-雙十八烷基氧基丙基)(2-羥基乙基)]_ 二 甲基氯化銨，CLIP6:外消旋-[2(2，3_雙十六烷基氧基丙基-羥甲基氧基)乙基]三甲基 銨，CLIP9:外消旋-[2 (2，3-雙十六烷基氧基丙基-羥基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基銨， oligofectamine，或陽離子或聚陽離子聚合物，例如改性聚氨基酸，諸如β -氨基酸-聚 合物或反轉(zhuǎn)聚酰胺，等，改性聚乙烯，諸如PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，等， 改性丙烯酸脂，諸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，等，改性酰氨基胺 (Amidoamines)諸如pAMAM(聚(酰氨基胺))，等，改性聚β氨基酯(PBAE)，諸如二胺末端 改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，等，樹狀聚體，諸如聚丙胺樹 狀聚體或基于PAMAM的樹狀聚體，等，聚亞胺，諸如PEI 聚(乙烯亞胺)，聚(丙烯亞胺)， 等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，諸如基于環(huán)糊精的聚合物，基于葡萄糖的聚合物，脫 乙酰殼聚糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，諸如PMOXA-PDMS共聚物，等，嵌段聚合 物，其由一個或多個陽離子嵌段(例如，選自如上文提及的陽離子聚合物)的組合和一個或 多個親水_或疏水_嵌段(例如，聚乙二醇)的組合組成；等。另外，可以通過與所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA復(fù)合而 用作佐劑的優(yōu)選的陽離子或聚陽離子蛋白或肽，可以選自具有下述總式(I)的蛋白或肽 (Arg)1 ； (Lys) m ； (His)n ； (Orn)。；(Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15，并且 1，111，11或0 彼此獨(dú)立 地可以是選自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15 的任一數(shù)字，條件是 Arg，Lys， His和Orn的總含量占該寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是選自除Arg，Lys, His或Orn外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是選自0， 1,2, 3或4的任一數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過該寡肽所有氨基酸的50%。在該情形中 特別優(yōu)選的低聚精氨酸是，例如，Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9，R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y (RKH) 2R，等。此外，合適的佐劑可以選自具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鳥苷，尿嘧啶或 是鳥苷或尿嘧啶的類似物；χ是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的類 似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核 苷酸是鳥苷或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ;其中當(dāng)m= 3時，X是尿嘧啶或其類似物， 當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或其類似物；η是1_40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時，G 是鳥苷或其類似物，當(dāng)η > 1時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物。其它合適的佐劑還可以選自具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的類似物；X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核 苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ；其中當(dāng)m = 3時，X是尿嘧 啶或其類似物，當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或其類似物；η是1_40的整數(shù)，其 中當(dāng)η = 1時，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)η > 1時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似 物。按照一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明還可以提供包含本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以另外包含藥用載體和/或其它輔助物質(zhì)和添加劑和 /或佐劑。按照特別優(yōu)選的實(shí)施方案，由包含在本發(fā)明的疫苗中的所述活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種RNA編碼的抗原選自上述提及的組。本發(fā)明的疫苗典型地包括安全且有效量的如上述定義的所述活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種RNA，其編碼如上述定義的至少兩種抗原，更優(yōu)選地編碼選自上述組 的任一項(xiàng)的至少兩種抗原，最優(yōu)選地以所示組合的任一種。當(dāng)用于本文時，“安全且有效量” 意指所述疫苗中所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的量，所述量足以顯 著誘導(dǎo)前列腺癌(PCa)，優(yōu)選腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病 或病癥的積極緩和。然而，同時，“安全且有效量”是足以避免嚴(yán)重副作用的少量，即，足以允 許優(yōu)點(diǎn)和風(fēng)險(xiǎn)之間的合理關(guān)系。這些限制的確定典型地在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍之內(nèi)。關(guān) 于本發(fā)明的疫苗，表述“安全且有效的量”優(yōu)選地意指這樣的RNA量(和由此所編碼的至少 兩種抗原的量)，其適于以這樣的方式刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，以致不獲得過量的或破壞性的 免疫反應(yīng)，但是，優(yōu)選地，也沒有低于可測量水平的這樣的免疫反應(yīng)。如上文定義的疫苗中 活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的所述“安全且有效量”還可以取決于RNA 的類型進(jìn)行選擇，例如，單順反子、雙_或甚至多順反子RNA，這是因?yàn)殡p-或甚至多順反子 RNA可以導(dǎo)致比使用等量單順反子RNA顯著更高的編碼抗原的表達(dá)。包含在本發(fā)明疫苗中 的如上文定義的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA的“安全且有效量”，還將與待 治療的特定病癥相關(guān)而不同，并且還與待治療的患者的年齡和身體條件、病癥的嚴(yán)重性、治 療的持續(xù)時間、伴隨治療的性質(zhì)、所用的特定藥用載體、以及類似因素相關(guān)，這在陪同醫(yī)師 的知識和經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)。按照本發(fā)明的疫苗可以按照本發(fā)明作為藥物組合物或作為疫苗用于 人以及用于獸醫(yī)醫(yī)學(xué)目的。按照本發(fā)明的疫苗典型的包含藥用載體。當(dāng)用于本文時，表述“藥用載體”優(yōu)選 地包括基于液體或非液體的本發(fā)明的疫苗。如果本發(fā)明的疫苗以液體形式提供，則載體典 型地是無熱原的水；等滲鹽水或緩沖的(水性)溶液，例如，磷酸鹽_、檸檬酸鹽等-緩沖溶 液，等等。特別地對于本發(fā)明疫苗的注射，可以使用水，或者優(yōu)選地使用緩沖液，更優(yōu)選地 使用水性緩沖液，其包含鈉鹽，優(yōu)選至少50mM的鈉鹽，鈣鹽，優(yōu)選至少0，OlmM的鈣鹽，和任 選地鉀鹽，優(yōu)選至少3mM的鉀鹽。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述鈉、鈣和任選地鉀鹽可以以它們 的鹵化物形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、 或硫酸鹽等形式存在。不限于此，鈉鹽的實(shí)例包括，例如NaCl，NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4，任選地鉀鹽的實(shí)例包括，例如KC1，KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4，和鈣鹽的實(shí)例包括 例如CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)20此外，緩沖液中可以包含前述陽離子的有 機(jī)陰離子。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，如上文定義適于注射目的的緩沖液可以包含選自氯化 鈉(NaCl)，氯化鈣(CaCl2)和任選地氯化鉀(KCl)的鹽，其中除了氯化物之外可以存在其它 陰離子。CaCl2也可以被另一種鹽如KCl替換。典型地，注射緩沖液中的鹽以至少50mM氯化鈉(NaCl)，至少3mM氯化鉀(KCl)和至少0，OlmM氯化鈣(CaCl2)的濃度存在。所述注射緩沖液可以相對于特定的參照介質(zhì)是高滲的、等滲的或低滲的，即，相對于特定的參照介 質(zhì)，所述緩沖液可以具有更高、相等或更低的鹽含量，其中優(yōu)選地可以使用前文提及的鹽的 所述濃度，其不導(dǎo)致由于滲透或其它濃度影響引起的對細(xì)胞的損傷。參照介質(zhì)為，例如，在 “體內(nèi)”方法中存在的液體，如血液、淋巴、細(xì)胞質(zhì)液體、或其它體液，或者例如可以在“體外” 方法中用作參照介質(zhì)的液體，諸如普通緩沖劑或液體。所述普通緩沖劑或液體是技術(shù)人員 已知的。Ringer-乳酸鹽溶液特別優(yōu)選地用作液體基礎(chǔ)。然而，還可以使用適用于施用給人的一種或多種相容的固體或液體填充劑或稀釋 劑或包封化合物。術(shù)語“相容”用在本文意指本發(fā)明疫苗的組成能夠以在典型的使用條件下 不發(fā)生顯著降低本發(fā)明疫苗的藥物效用的相互作用的方式與所述活性(免疫刺激性)組合 物的、編碼如上文定義的至少兩種抗原的所述至少一種RNA相混合。當(dāng)然，藥用載體、填充 劑和稀釋劑具有充分高的純度和充分低的毒性，以使得它們適用于施用給待治療的人?？?以用作藥用載體、填充劑或其組成的化合物的一些實(shí)例為糖，諸如例如，乳糖、葡萄糖和蔗 糖；淀粉，諸如例如玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，諸如例如，羧甲基纖維素 鈉，乙基纖維素，醋酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；牛脂；固體助流劑，諸如例如，硬 脂酸，硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，諸如例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄欖油，玉米油和可 可油；多元醇，諸如例如，聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；褐藻酸。藥用載體的選擇主要由施用本發(fā)明疫苗的方式?jīng)Q定。例如，本發(fā)明的疫苗可以系 統(tǒng)性或口服施用。系統(tǒng)性施用的途徑通常包括，例如，透皮、口服、腸胃外途徑，包括皮下、靜 脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)和腹膜內(nèi)注射和/或鼻內(nèi)施用途徑。局部施用途徑通常包括，例 如，局部施用途徑以及皮內(nèi)、透皮、皮下、或肌內(nèi)注射或損傷內(nèi)、顱骨內(nèi)、肺內(nèi)、心臟內(nèi)、和舌 下注射。更優(yōu)選地，疫苗可以通過皮內(nèi)、皮下、或肌內(nèi)途徑施用。因此，組合物/疫苗優(yōu)選地 配制為液體或固體形式。本發(fā)明的疫苗施用的適合量可以通過用動物模型進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)確 定。所述模型包括，但不暗示任何限制，兔、綿羊、小鼠、大鼠、狗和非人靈長動物模型。優(yōu)選 的用于注射的單位劑型包括無菌水溶液、生理鹽水或它們的混合物。所述溶液的PH應(yīng)該調(diào) 節(jié)為約7. 4。用于注射的合適載體包括水凝膠、可控或延遲釋放的裝置、聚乳酸和膠原基質(zhì)。 用于局部應(yīng)用的合適的藥用載體包括適合用在洗液、膏劑、凝膠等中的那些。如果本發(fā)明的 疫苗應(yīng)該經(jīng)口施用，片劑、膠囊等是優(yōu)選的單位劑型。用于制備可以用于口服施用的單位劑 型的藥用載體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。其選擇取決于次要的考慮，如口味、成本和保存性， 其對于本發(fā)明的目的不是至關(guān)重要的，并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員不費(fèi)力的確定。本發(fā)明的疫苗可以另外包含一種或多種輔助物質(zhì)，以進(jìn)一步增加免疫原性。由此 優(yōu)選地獲得如上文定義的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA和如上文所述 還可以任選地包含在本發(fā)明疫苗中的輔助物質(zhì)的協(xié)同作用。取決于輔助物質(zhì)的各種類型， 在這一方面可以考慮多種機(jī)制。例如，允許樹突細(xì)胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖， TNF-α或⑶40配體，形成第一類合適的輔助物質(zhì)。通常，可以使用以“危險(xiǎn)信號”(LPS， GP96，等)方式影響免疫系統(tǒng)的任何試劑或以靶向方式允許由本發(fā)明所述的免疫刺激佐劑 產(chǎn)生的免疫反應(yīng)被增強(qiáng)和/或被影響的細(xì)胞因子如GM-CFS作為輔助物質(zhì)。特別優(yōu)選的輔 助物質(zhì)為細(xì)胞因子，諸如，單核因子，淋巴因子，白介素或趨化因子，其一一除了通過所編 碼的至少兩種抗原誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)之外促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)，諸如IL-1，IL-2，IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-12， IL-13， IL-14， IL-15， IL-16， IL-17, IL-18, IL-19, IL-20， IL-21， IL-22， IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28， IL-29, IL-30, IL-31, IL-32，IL-33，INF-α，IFN-β，INF- γ , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β 或TNF-α，生長因子，如hGH?？梢园诒景l(fā)明的疫苗中的其它添加劑為乳狀液，諸如例如，Tween _潤劑， 諸如例如，十二烷基硫酸鈉；著色劑；口味賦予劑，藥用載體；片劑形成劑；穩(wěn)定劑；抗氧化 劑；防腐劑。本發(fā)明的疫苗還可以另外包含任何其它化合物，已知其由于其針對人Tol 1-樣受 體 TLR1，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRlO 的結(jié)合親和力(作為配 體)、或由于其針對鼠 Toll-樣受體 TLRl，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRl 1，TLR12或TLR13的結(jié)合親和力(作為配體)而是免疫刺激性的。在該情形中，可以添加到本發(fā)明疫苗中的另一類化合物可以是CpG核酸，特別 是 CpG-RNA 或 CpG-DNA。CpG-RNA 或 CpG-DNA 可以是單鏈 CpG-DNA (ss CpG-DNA)，雙鏈 CpG-DNA (dsDNA)，單鏈 CpG-RNA (ssCpG-RNA)或雙鏈 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。CpG 核酸優(yōu)選 地以CpG-RNA形式存在，更優(yōu)選地以單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)形式存在。CpG核酸優(yōu)選地 包含至少一個或多個(促有絲分裂的)胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。按照第 一個優(yōu)選的備選方案，包含在這些序列中的至少一個CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶) 和G(鳥嘌呤)，是未甲基化的。任選地包含在這些序列中的所有其它胞嘧啶或鳥嘌呤可以 是甲基化的或未甲基化的。然而，按照更優(yōu)選的備選方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鳥 嘌呤)還可以以甲基化形式存在。按照本發(fā)明另一個優(yōu)選的目的，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以(用于 制備本發(fā)明所述的疫苗)用于治療前列腺癌(PCa)，優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性 前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥。按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選的目的，如本文定義的本發(fā)明的疫苗或編碼至少兩種 (優(yōu)選地)不同的抗原的至少一種RNA可以用于治療前列腺癌(PCa)，優(yōu)選地腫瘤輔助治療 和/或激素難治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥。在該情形中，治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺 癌和與其相關(guān)的疾病或病癥的方法也包含在本發(fā)明中，所述方法通過向需要其的患者施用 藥物有效量的本發(fā)明的疫苗、或藥物有效量的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物進(jìn)行。 所述方法典型地包括制備本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物、或本發(fā)明的疫苗的任選的 第一步驟，和第二步驟，其包括向需要其的患者施用(藥物有效量的)所述本發(fā)明的活性 (免疫刺激性)組合物或所述本發(fā)明的疫苗。需要其的患者典型地選自任何哺乳動物。在 本發(fā)明的情形中，哺乳動物任選地選自包括但不限于下列各項(xiàng)的組例如，山羊、牛、豬、狗、 貓、猴、猿，嚙齒動物如小鼠、倉鼠、兔，以及特別是人，其中所述哺乳動物典型地患有前列腺 癌(PCa)，優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌和與其相關(guān)的疾病或病癥。本發(fā)明還涉及如本文定義的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種 (優(yōu)選地)不同抗原的所述至少一種RNA (用于制備本發(fā)明的疫苗)、優(yōu)選地用于在哺乳動 物中引發(fā)免疫反應(yīng)、優(yōu)選地用于治療前列腺癌(PCa)、更優(yōu)選地用于治療腫瘤輔助治療和/ 或激素難治性前列腺癌和與其相關(guān)疾病或病癥的應(yīng)用。
類似地，本發(fā)明還涉及如本文定義的本發(fā)明的疫苗本身或編碼至少兩種(優(yōu)選 地)不同抗原的所述至少一種RNA用于在哺乳動物中引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)、優(yōu)選地用于治 療前列腺癌(PCa)、更優(yōu)選地用于治療腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，和與其相 關(guān)疾病或病癥的應(yīng)用。 預(yù)防或治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，和 與其相關(guān)的疾病或病癥可以通過一次性或以時間交錯方式施用本發(fā)明的活性(免疫刺激 性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗而進(jìn)行，例如，作為多部件的試劑盒，每個部件包含至少一 種優(yōu)選不同的抗原。對于施用，優(yōu)選地可以使用如上文定義的任何施用途徑。例如，人們可 以通過基于由本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA編碼的至少兩種(特別選 擇的)抗原誘導(dǎo)或增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)而治療前列腺癌(PCa)，優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或 激素難治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥。然后，可以在施用另一種如本文定義的本 發(fā)明的創(chuàng)造性活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗之前、同時和/或隨后進(jìn)行施 用本發(fā)明的創(chuàng)造性活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗，其中所述另一種本發(fā) 明的創(chuàng)造性活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗可以包含編碼不同抗原的RNA 的另一種組合，其中由本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA編碼的每種抗原 可以優(yōu)選地適用于治療前列腺癌(PCa)，更優(yōu)選地適用于治療腫瘤輔助治療和/或激素難 治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥。在該情形中，如本文定義的治療還可以包括與前 列腺癌(PCa)相關(guān)的疾病、優(yōu)選腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，和與其相關(guān)疾病 或病癥的調(diào)節(jié)。按照另一個實(shí)施方案，本發(fā)明還包括如本文定義的本發(fā)明活性(免疫刺激性)組 合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不同的抗原的至少一種RNA (用于制備(本發(fā)明)疫苗)用 于在哺乳動物中調(diào)節(jié)、優(yōu)選誘導(dǎo)或增強(qiáng)如本文定義的免疫反應(yīng)的、更優(yōu)選地治療和/或支 持前列腺癌(PCa)、特別是腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，或與其相關(guān)的疾病或 病癥的應(yīng)用。在該情形中，前列腺癌(PCa)的治療的支持可以是諸如手術(shù)、放射治療、激素 治療、偶爾的化療、質(zhì)子治療或者這些中的一些的組合的常規(guī)前列腺癌治療方法的任意組 合，和使用如本文定義的本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的治療。對前列腺癌(PCa)的 治療的支持還可以在本文定義的任意其它實(shí)施方案中討論。如本文定義的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不 同的抗原的至少一種RNA或本發(fā)明的疫苗的施用可以在時間交錯治療中進(jìn)行。時間交錯的 治療可以是，例如，在前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素_難治性前列腺癌， 和與其相關(guān)的疾病或病癥的常規(guī)療法之前、同時和/或隨后施用如本文定義的本發(fā)明的活 性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不同的抗原的至少一種RNA或本發(fā)明 的疫苗，例如，通過在治療性適于治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素-難 治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥的治療或施用之前、同時和/或隨后施用本發(fā)明 的藥物或活性本發(fā)明(免疫刺激性)組合物或疫苗。所述時間交錯的治療可以使用例如試 劑盒、優(yōu)選如下文定義的多部件的試劑盒進(jìn)行。時間交錯的治療可以另外或備選地還包括以這樣的形式施用本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物或疫苗、優(yōu)選地如上述定義的編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少 一種RNA，其中如上文定義的編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA(其優(yōu)選地形成本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或疫苗的一部分)與如上文定義的編碼至少兩種 (優(yōu)選不同的)抗原的另一種至少一種RNA(其優(yōu)選地形成同一份本發(fā)明的活性(免疫刺 激性)組合物或疫苗的一部分)平行、在其之前或之后施用。優(yōu)選地，(所有至少一種RNA 的)施用在1小時內(nèi)、更優(yōu)選在30分鐘內(nèi)、甚至更優(yōu)選地在15，10，5，4，3，或2分鐘或者甚 至1分鐘內(nèi)進(jìn)行。所述時間交錯的治療可以使用試劑盒、優(yōu)選如下文定義的多部件的試劑 盒進(jìn)行。 按照最后一個實(shí)施方案，本發(fā)明還提供試劑盒，特別是多部件的試劑盒，其包括所 述活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合物、和/或本發(fā)明的疫苗，和任選地具有所述本發(fā)明的 活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗的施用和劑量的信息的技術(shù)說明書。所述 技術(shù)說明書可以包含關(guān)于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物、和/或本發(fā)明的疫苗的施 用和劑量的信息。所述試劑盒、優(yōu)選多部件的試劑盒，可以用于，例如，任何上文提及的應(yīng)用 或用途，優(yōu)選地用于至少一種本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物(用于制備本發(fā)明的藥 物，優(yōu)選地疫苗)以治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌， 和與其相關(guān)的疾病或病癥的應(yīng)用。所述試劑盒還可以用于至少一種本發(fā)明的活性(免疫刺 激性)組合物(用于制備)治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前 列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥的(的本發(fā)明的疫苗)的應(yīng)用，其中本發(fā)明的活性(免疫 刺激性)組合物)和/或所述疫苗由于所編碼的至少兩種抗原可以能夠在如上文定義的哺 乳動物中誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)。所述試劑盒還可以用于至少一種本發(fā)明的活性(免疫刺激 性)組合物(用于制備)在如上文定義的哺乳動物中調(diào)節(jié)、優(yōu)選引發(fā)、例如誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫 反應(yīng)、且優(yōu)選地支持前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素難治性前列腺癌，和 與其相關(guān)的疾病或病癥的支持治療(的本發(fā)明的藥物，優(yōu)選疫苗)的應(yīng)用。多部件的試劑 盒，作為試劑盒的特殊形式，可以在試劑盒的不同部件中包含一種或多種相同或不同的活 性本發(fā)明的(免疫刺激)組合物和/或一種或多種相同或不同的本發(fā)明的疫苗。多部件的 試劑盒還可以在試劑盒的不同部件中包含(例如一種)活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合 物、(例如一種)本發(fā)明的疫苗和/或如上文定義編碼至少一種抗原的至少一種RNA，例如， 試劑盒的每個部件包含編碼優(yōu)選不同的抗原的至少一種RNA。另外，兩種類型的多部件試劑 盒的組合是可以的。例如，當(dāng)考慮時間交錯治療時，例如，當(dāng)在同一體內(nèi)治療過程中使用不 同制劑和/或增加濃度的活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合物、本發(fā)明的疫苗和/或如上 文定義的編碼至少一種抗原的至少一種RNA時，可以使用多部件試劑盒。還可以在考慮本 發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的不同抗原(例如，在部件中)的分開的配制或施用時或 有此需要時(例如，為了技術(shù)原因)，但是例如仍然實(shí)現(xiàn)不同抗原在體內(nèi)的組合存在時，使 用多部件試劑盒。特別地，考慮作為特殊形式的試劑盒的多部件試劑盒，其中所述試劑盒的 每個部件包含如上文定義的至少一種優(yōu)選不同的抗原，所述多部件試劑盒的所有部件優(yōu)選 形成如本文定義的所述活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合物或本發(fā)明的疫苗。所述特殊的 多部件試劑盒可以特別是合適的，例如，如果不同抗原作為該試劑盒的不同部分分別配制， 但是然后一起一次性或以時間交錯方式施用至需要其的哺乳動物。在后一種情形中，所述 試劑盒的所有不同部件的施用典型地在短時間限制內(nèi)施用，以致所有抗原在緊隨試劑盒最 后部件的施用之后幾乎同時存在于哺乳動物中。上述任一種試劑盒可以用在如上文所述的 治療中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供用于治療前列腺癌(PCa)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述組 合物包括至少一種RNA、優(yōu)選mRNA，其編碼能夠在哺乳動物中引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)的至 少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，其中所述抗原選自由下列各項(xiàng)組成的組PSA(前列腺特異性 抗原)，PSMA (前列腺特異性膜抗原)，PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)和STEAP (前列腺六跨膜 上皮抗原)。所述活性(免疫刺激性)組合物允許前列腺癌(PCa)的有效治療，或者在使用 常規(guī)治療時的補(bǔ)充治療。此外，它通過利用RNA作為醫(yī)療方法的途徑而進(jìn)一步避免所引入 的DNA序列的不可控增殖的問題。例如，在免疫反應(yīng)、免疫或接種中，用在本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物的RNA比DNA表達(dá)系統(tǒng)具有其它相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)特別包括引入 到細(xì)胞中的RNA不整合到基因組中。這避免該基因的突變的風(fēng)險(xiǎn)，否則所述基因可以完全 或部分被滅活或者產(chǎn)生錯誤信息。它還避免使用DNA作為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的試劑(例如，作 為疫苗)的其它風(fēng)險(xiǎn)，諸如在已經(jīng)引入外源DNA的患者中誘導(dǎo)病原性抗-DNA抗體，因此導(dǎo) 致(可能是致死性的)免疫反應(yīng)。相反，尚未檢測到抗-RNA抗體。附圖下述附圖意欲進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。它們不意欲另外限制本發(fā)明的主題。圖 1 描述了質(zhì)粒構(gòu)建體 RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID NO 1), 其編碼PSA (前列腺特異性抗原)(=KLK3).所述構(gòu)建體包含下列序列元件關(guān)于穩(wěn)定和更好密碼子使用的GC最優(yōu)化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ -末端的 30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；該DNA構(gòu)建體對應(yīng)于編碼mRNA并且作為通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)制備相應(yīng)的RNA構(gòu)建 體的基礎(chǔ)。圖 2 描述了 對應(yīng)于 RNA 構(gòu)建體 RNActiveCAP_KLK3 (GC) -muag-A70-C30 的野生 型“編碼序列(SEQ IDNO 2)，其編碼PSA (前列腺特異性抗原)(=KLK3)，即無GC最優(yōu)化 序列的編碼PSA (前列腺特異性抗原)的編碼序列(CDS)。圖 3 描述 RNA 構(gòu)建體 RNActive CAP-KLK3 (GC) -muag-A70_C30 的 GC 最優(yōu)化編碼 序列(SEQ ID NO :3)，其編碼PSA(前列腺特異性抗原)( = KLK3)，即具有GC最優(yōu)化序列的 編碼PSA (前列腺特異性抗原)的編碼序列(CDS)。圖 4 描述質(zhì)粒構(gòu)建體RNActive CAP-F0LH1 (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID N0:4)，其 編碼PSMA (前列腺特異性膜抗原)(=F0LH1)。所述構(gòu)建體包含下列序列元件關(guān)于穩(wěn)定和更好密碼子使用的GC最優(yōu)化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ -末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；該DNA構(gòu)建體對應(yīng)于編碼mRNA并且作為通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相應(yīng)的RNA構(gòu)建體的基礎(chǔ)。圖 5 描述對應(yīng)于 RNA 構(gòu)建體 RNActiveCAP-FOLHl (GC) -muag-A70_C30 野生型編碼 序列(SEQ ID NO :5)，其編碼PSMA (前列腺特異性膜抗原)(=F0LH1)，即編碼PSMA (前列 腺特異性膜抗原)(=F0LH1)的編碼序列(CDS)，無GC最優(yōu)化序列。圖 6 描述 RNA 構(gòu)建體 RNActive CAP-F0LH1 (GC) -muag-A70_C30 的 GC-最優(yōu)化編碼序列(SEQ ID NO :6)，其編碼PSMA (前列腺特異性膜抗原)(=F0LH1)，即編碼PSMA (前 列腺特異性膜抗原)(=F0LH1)的編碼序列(CDS)，其具有GC-最優(yōu)化序列。圖 7 描述質(zhì)粒構(gòu)建體 RNActive CAP-PSCA (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID NO :7)，其 編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)。所述構(gòu)建體包含下列序列元件關(guān)于穩(wěn)定和更好密碼子使用的GC最優(yōu)化序列在3，-末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；該DNA構(gòu)建體對應(yīng)于編碼mRNA并且作為通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相應(yīng)的RNA構(gòu)建 體的基礎(chǔ)。圖 8 描述對應(yīng)于 RNA 構(gòu)建體 RNActiveCAP-PSCA(GC)-muag-A70-C30 的野生型編 碼序列(SEQ IDNO :8)，其編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)，即編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗 原)的編碼序列(CDS)，其無GC最優(yōu)化序列。圖 9 描述 RNA 構(gòu)建體 RNActiveCAP-PSCA (GC) -muag-A70_C30GC-的 GC 最優(yōu)化編 碼序列(SEQ ID NO :9)，其編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)，即編碼PSCA (前列腺干細(xì)胞抗 原)的編碼序列(CDS)，其具有GC-最優(yōu)化序列。圖 10 描述質(zhì)粒構(gòu)建體 RNActive CAP-STEAP (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID NO: 10)， 其編碼STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)。所述構(gòu)建體包含下列序列元件關(guān)于穩(wěn)定和更好密碼子使用的GC最優(yōu)化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；該DNA構(gòu)建體對應(yīng)于編碼mRNA并且作為通過體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相應(yīng)的RNA構(gòu)建 體的基礎(chǔ)。圖 11 描述對應(yīng)于 RNA 構(gòu)建體 RNActiveCAP-STEAP (GC) -muag-A70_C30 的野生型 編碼序列(SEQ IDNO :11)，其編碼STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)，即編碼STEAP (前列 腺的六跨膜上皮抗原)的編碼序列(CDS)，其無GC最優(yōu)化序列。圖 12 描述 RNA 構(gòu)建體 RNActive CAP-STEAP (GC) -muag-A70_C30 的 GC-最優(yōu)化編 碼序列(SEQ ID N0:12)，其編碼STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)，即編碼STEAP(前列腺 的六跨膜上皮抗原)的編碼序列(CDS)，其具有GC-最優(yōu)化序列。圖13 描述通過檢測抗原特異性抗體檢測抗原特異性免疫反應(yīng)(B-細(xì)胞免疫反 應(yīng))。如從圖13可見，施用RNA-Mix，即包含分別編碼PSA，PSMA, PSCA或STEAP的mRNA的 PCa-RNA混合物，顯示抗原特異性免疫反應(yīng)(B-細(xì)胞免疫反應(yīng))的顯著減少，這是由于與包 含緩沖液或?qū)φ盏臉悠废啾柔槍SA的IgG2a抗體的明顯形成。圖14 顯示通過ELISP0T檢測抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。如從圖15可見，用 RNA-Mix接種小鼠，即用包含分別編碼PSA，PSMA，PSCA或STEAP的mRNA的PCa-RNA混合物 接種，或用分別編碼PSA，PSMA, PSCA或STEAP的mRNA接種，導(dǎo)致抗原特異性免疫反應(yīng)(CTL) 的顯著減少，這是由于與自然小鼠和接種緩沖液的小鼠相比，IFNy的明顯形成。圖15 描述通過使用包含5 μ g分別編碼PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的本 發(fā)明PCa-RNA混合物的免疫和腫瘤攻擊。如從圖15可見，，用按照a)包含分別編碼PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的PCa-RNA混合物以2x i. m.(肌內(nèi))免疫后，腫瘤體積明顯 減少。當(dāng)將按照a)的PCa-RNA混合物以4xi.m.(肌內(nèi))施用時，腫瘤體積進(jìn)一步減少。圖16 描述PSA-特異性IgGl抗體的誘導(dǎo)。圖16特別顯示在用mRNA疫苗接種的 小鼠中特異于腫瘤抗原PSA的IgGl抗體的存在，所述疫苗由4種成分存在，包含編碼人前 列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。每一個用陽離子肽魚精蛋白 配制。將對照小鼠用緩沖液(林格_乳酸鹽)或用無關(guān)RNA(Pp Luc)進(jìn)行處理對照小鼠， 所述無關(guān)RNA用魚精蛋白類似物配制為mRNA疫苗。合并每個組中來自5只小鼠的血清并 進(jìn)行滴定來進(jìn)行分析。誤差條表示兩次重復(fù)與平均值的偏差。圖17 顯示PSA-特異性IgG2a抗體的誘導(dǎo)。圖17特別顯示在用mRNA疫苗接種 的小鼠中特異于腫瘤抗原PSA的IgG2a抗體的存在，所述mRNA疫苗由4種成分組成，每種 包含編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。每種用陽離子 肽魚精蛋白配制。將對照小鼠用緩沖液(林格_乳酸鹽)或用無關(guān)RNA(Pp Luc)處理，所 述無關(guān)RNA用魚精蛋白類似物配制成mRNA疫苗。合并每個組中來自5只小鼠的血清并進(jìn) 行滴定來進(jìn)行分析。誤差條表示兩次重復(fù)與平均值的偏差。圖18 描述了 PSCA-特異性IgGl抗體的誘導(dǎo)的結(jié)果。具體地，圖18顯示在用mRNA 疫苗接種的小鼠中特異于腫瘤抗原PSCA的IgGl抗體的存在，所述mRNA疫苗由4種成分組 成，每種包含編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。每種 用陽離子肽魚精蛋白配制。將對照小鼠用緩沖液(林格_乳酸鹽)處理。合并每個組中來 自5只小鼠的血清并進(jìn)行滴定來進(jìn)行分析。誤差條表示兩次重復(fù)與平均值的偏差。圖19 顯示PSMA-特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。將每組5只小鼠用mRNA疫苗或 以魚精蛋白類似物配制為mRNA疫苗的無關(guān)mRNA(Pp Luc)接種，所述mRNA疫苗由4種成分 組成，每種包含編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。將 來自接種和對照小鼠的脾細(xì)胞在最后一次接種后第6天分離，并且用PSMA-衍生的肽文庫 或用對照肽文庫進(jìn)行刺激。使用ELISP0T技術(shù)離體測量IFN-γ的分泌。線表示單獨(dú)分析 的每組5只小鼠的中位值和范圍。用GraphPadPrism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用單Mann-Whitney 檢驗(yàn)(one-sidedMann-ffhitney test)計(jì)算 ρ 值。圖20 顯示PSMA-特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo)。用mRNA疫苗以三次接種周期皮內(nèi)接種C57BL/6小鼠，所述mRNA疫苗由4種成分組成，每種包含編碼人前列腺分化 抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。將對照小鼠用對照mRNA Pp Luc接種 或用緩沖液(林格_乳酸鹽)處理。在最后一次注射后第6天，將30xl06差異標(biāo)記的脾細(xì) 胞(用PSMA-衍生的或?qū)φ针奈膸旒虞d的，以1 1的比率混合的低群和高群)靜脈內(nèi)輸 注。16小時后，分離來自受體小鼠的脾細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖顯示每只小鼠的單 個數(shù)據(jù)點(diǎn)。線表示數(shù)值的中位值和范圍。分析每組5只小鼠。用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析，用Marm-Whitney檢驗(yàn)計(jì)算ρ值。圖21 顯示在最后一次接種后10周，PSA-特異性記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。將 C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以兩個接種周期接種，所述mRNA疫苗由4種成分組成，每種包含 編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。將對照小鼠用緩 沖液(林格-乳酸鹽)處理。在最后一次注射后10周，將30xl06差異標(biāo)記的脾細(xì)胞(用 PSA-衍生的或?qū)φ针奈膸旒虞d的，以1 1的比率混合的低群和高群)靜脈內(nèi)移植。16小時后，分離來自受體小鼠的脾細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖顯示單個數(shù)據(jù)點(diǎn)，線表示單獨(dú) 分析的每組6只小鼠的中位值。用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Mann-Whitney檢 驗(yàn)計(jì)算P值。圖22 顯示最后一次接種后10周PSCA-特異性記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。將 C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以兩次接種周期接種，所述mRNA疫苗由4種成分組成，每種包含 編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。將對照小鼠用緩 沖液(林格-乳酸鹽)處理。在最后一次注射后10周，將30xl06差異標(biāo)記的脾細(xì)胞(用 PSCA-衍生的或?qū)φ针奈膸旒虞d的，以1 1的比率混合的低群和高群)靜脈內(nèi)移植。16小 時后，分離來自受體小鼠的脾細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖顯示單個數(shù)據(jù)點(diǎn)，并且線表示 單獨(dú)分析的每組6只小鼠的中位值。用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Mann-Whitney 檢驗(yàn)計(jì)算P值。圖23 顯示在接種了 mRNA疫苗的小鼠中的腫瘤生長抑制，所述mRNA疫苗由4種 成分組成，每種包含編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs。 將C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以兩次接種周期皮內(nèi)接種。將對照小鼠用緩沖液處理。最后 一次接種后15天，將小鼠用1x106同源TRAMP-Cl腫瘤細(xì)胞皮下攻擊。監(jiān)測腫瘤生長。圖 顯示在腫瘤攻擊后第5 2天測量的腫瘤體積的對數(shù)值。用GraphPadPrism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 用Mann-Whitney檢驗(yàn)計(jì)算ρ值。
實(shí)施例下述實(shí)施例意欲進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。它們不意欲另外限制本發(fā)明的主題。1.制備編碼的質(zhì)粒在下述實(shí)驗(yàn)中，分別制備對應(yīng)于編碼下述抗原的各自mRNA序列末端的DNA序列· PSA (前列腺特異性抗原)，· PSMA (前列腺特異性膜抗原)，· PSCA (前列腺干細(xì)胞抗原)，和· STEAP (前列腺六跨膜上皮抗原)，并且用于體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。其中，對對應(yīng)于天然抗原編碼mRNA的DNA序列 (包含圖2，5，8和11所述的編碼序列的序列，即SEQ ID NOs :2，5，8和11)關(guān)于更好密碼子 使用進(jìn)行GC-最優(yōu)化，從而獲得包含圖3，6，9和12所述的編碼序列的序列，即SEQ ID NOs 3，6，9和12。接著，將編碼序列轉(zhuǎn)移到GC-最優(yōu)化構(gòu)建體(CureVac GmbH, Tubingen,德國)， 將其用聚腺苷酸標(biāo)記和聚胞苷酸標(biāo)記(A70-C30)進(jìn)行修飾。將最終的構(gòu)建體分別稱為RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30(SEQ ID NO 1),RNActive CAP-F0LH1 (GC)-muag-A70_C30(SEQ ID NO 4),RNActive CAP-PSCA (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID N0:7)，和RNActive CAP-STEAP (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID NO: 10)。最終的構(gòu)建體分別包含根據(jù)顯示在圖1，4，7和10中的序列的序列(SEQID NOs 1，4，7和10)，其包含下列序列元件關(guān)于穩(wěn)定和更好密碼子使用的GC-最優(yōu)化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)
在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；2.體外轉(zhuǎn)錄基于在實(shí)施例1中獲得的重組質(zhì)粒DNA，通過體外轉(zhuǎn)錄制備RNA序列。因此，將所 述重組質(zhì)粒DNA線性化，并且隨后使用T7RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄。然后通過DNA酶I消化 降解DNA模板，并且通過LiCl沉淀回收RNA，并且通過HPLC提取(PUREMessenger , CureVac GmbH, Tubingen，德國)進(jìn)一步純化。3.與龜 精蛋白復(fù)合為了將所述RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞和生物體中，將通過體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA優(yōu)選地復(fù)合， 更優(yōu)選地當(dāng)將所述RNA與魚精蛋白混合時與魚精蛋白復(fù)合。4.免疫實(shí)驗(yàn)對于免疫，將通過如上述體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得的RNA(見實(shí)驗(yàn)2)轉(zhuǎn)染到小鼠(小鼠 C57BL/6)中，優(yōu)選地在與魚精蛋白復(fù)合時。接種發(fā)生在不同組中，其中一組(對照組)小鼠 用緩沖液作為對照進(jìn)行注射。將每組4只小鼠用20 μ g與魚精蛋白復(fù)合的mRNA(5 μ g/基 因)皮內(nèi)免疫四次，其中所述RNA編碼PSA、PSMA、PSCA和STEAP。5.檢測丨杭原-特異件免,瘡反應(yīng)(B-細(xì)胞為鹿反應(yīng))抗原-特異性免疫反應(yīng)(B-細(xì)胞免疫反應(yīng))的檢測通過檢測抗原_特異性抗體進(jìn) 行。因此，在最后一次接種后一周從接種的小鼠采集血液樣品，并且制備血清。將MaxiSorb 板(Nalgene Nunc International)用人 PSA 蛋白(0. 5 μ g/孔)包被。在用包含 0.05%吐 溫-20和BSA的IXPBS封閉之后，將板用稀釋的小鼠血清(1 30，1 90，1 270， 1 810)溫育。隨后，加入生物素-偶聯(lián)的二抗(抗-小鼠_IgG2a Pharmingen)。洗滌 后，將板用辣根過氧化物酶_鏈霉抗生物素蛋白溫育，并且隨后測量ABTS底物(2，2’-連氮 基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)的轉(zhuǎn)化。如從圖13可見，施用RNA-Miχ，即包含分別編碼PSA，PSMA, PSCA或STEAP的 mRNA(如分別在圖1，4，7禾口 10中顯示的序列(SEQ ID NOs :1，4，7禾口 10))的PCa-RNA混合 物，與來自對照小鼠的樣品比較，顯示出由于顯著形成針對PSA的IgG2a抗體所導(dǎo)致的抗原 特異性免疫反應(yīng)(B-細(xì)胞免疫反應(yīng))的顯著減少。6.通過ELISP0T檢測抗原-特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)在最后一次接種后2個月，將小鼠處死，移去脾并分離脾細(xì)胞。在存在IL-4的情 況下，將脾細(xì)胞溫育7天從而選擇樹突細(xì)胞。為了確定抗原_特異性免疫反應(yīng)，在再刺激 后測量INFy分泌。作為靶細(xì)胞，使用來自天然小鼠的脾細(xì)胞，將其用PCa-mRNA-混合物 (Mix)或用編碼PSA，PSMA，PSCA或STEAP的mRNA (分別如在圖1，4，7和10顯示的序列(SEQ IDNOs :1，4，7和10))進(jìn)行電穿孔。為了檢測INFy，將包被多篩選板(Millipore)用包括針對INFy的抗體(BD Pharmingen, Heidelberg，德國)的包被緩沖液0. IM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液pH 9.6， 10. 59g/l Na2CO3,8. 4g/l NaHCO3)溫育過夜。在所述板中以1 20的比率一起溫育靶細(xì) 胞和效應(yīng)器細(xì)胞24小時。將板用IXPBS洗滌，并且用生物素-偶聯(lián)的二抗溫育。在用 1XPBS/0. 05%吐溫-20洗滌后，向板中加入底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基藍(lán)四 唑液體底物系統(tǒng)，來自Sigma Aldrich(西格瑪奧德里奇)，Taufkirchen，德國)，并且可以 視覺檢測底物的轉(zhuǎn)化。
如從圖14可見，與天然小鼠和用緩沖液接種的小鼠比較，用編碼PSA，PSMA, PSCA或STEAP (分別如在圖1，4，7和10中顯示的序列(SEQ IDNOs :1，4，7和10))的PCaiRNA-混 合物接種小鼠導(dǎo)致針對所有四種抗原的抗原特異性免疫反應(yīng)(CTL)的顯著減少，該減少是 由于INFy的顯著形成所導(dǎo)致的。7.腫瘤攻擊a)免疫將20 μ g mRNA (包含 5 μ g 分另Ij 編碼 PSA, PSMA, PSCA 禾口 STEAP 的 mRNA,例如構(gòu) 建體 RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30，RNActiveCAP-FOLHl(GC)-muag-A70_C30， RNActive CAP-PSCA(GC)-muag_A70-C30，和 RNActive CAP-STEAP(GC)-muag-A70_C30(如圖 1，4，7和10顯示的序列，即SEQ ID NOs :1，4，7和10)的PCa-RNA混合物)肌內(nèi)注射在小 鼠中。在7周內(nèi)，重復(fù)免疫1或3次。在最后一次免疫后40天，將IMioTramp-Cl腫瘤細(xì)胞 皮下注射到小鼠中。在50天內(nèi)，測定腫瘤體積。b)結(jié)果如從圖15可見，在用根據(jù)a)包含分別編碼PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的 PCa-RNA混合物以2x i. m(肌內(nèi))免疫后，腫瘤體積被顯著減少。當(dāng)將根據(jù)a)的PCa-RNA 混合物以4x i.m.(肌內(nèi))施用時，腫瘤體積進(jìn)一步減少。8.
Iij8. 1 制備 mRNA 疫苗所述mRNA疫苗由編碼人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA (按照SEQ ID NOs :3，6，9和12)的GC-最優(yōu)化mRNAs組成，每種抗原用溶解在80% (ν/ν)林格-乳酸鹽 溶液中的陽離子肽魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比率(RNA 魚精蛋白)配制。8. 2 接種將C57BL/6小鼠用64 μ g(16 μ g/抗原)如在上述8. 1中所述的mRNA疫苗皮內(nèi)接 種。將對照小鼠用緩沖液(林格_乳酸鹽)或用無關(guān)RNA(編碼Photinus pyralis螢光素 酶的富含GC的mRNA)處理，所述無關(guān)RNA用魚精蛋白類似物配制成mRNA疫苗。接種在第 1，3(和7)周包括2或3個免疫周期。每個周期由在一周的第1，2，3和4天進(jìn)行的4次注 射組成。8. 3腫瘤攻擊在結(jié)束接種后15天，皮下移植1x106TRAMP_C1細(xì)胞(小鼠前列腺細(xì)胞系1的轉(zhuǎn)基 因腺癌，表達(dá)人PSMA，PSCA和STEAP的小鼠同源物)/每只小鼠。在腫瘤細(xì)胞接種后4周， 腫瘤是可觸及的。通過用測徑器測量腫瘤大小來監(jiān)測腫瘤生長。8. 4監(jiān)測抗原特異性抗體最后一次接種后14天，后眼窩采集血液樣品(200 μ 1)，并且使用下列ELISA方法 分析血清中抗原特異性抗體亞型IgGl和IgG2a的存在。將96-孔ELISA板用重組蛋白PSCA 或人純化的PSA(均在包被緩沖液中10yg/ml)包被，并且(在封閉和洗滌后)用血清在 37°C溫育4小時。在用針對小鼠IgGl或IgG2a的生物素標(biāo)記的抗體溫育再用HRP-鏈霉抗 生物素蛋白溫育后，加入TMB-底物。使用Tecan ELISA讀數(shù)儀在450nm處測量比色反應(yīng)。8. 5ELISP0T-檢測CTL (細(xì)胞毒性T細(xì)胞)反應(yīng)
為了檢測CTL (細(xì)胞毒性T細(xì)胞)反應(yīng)，使用ELISP0T技術(shù)，可以在單細(xì)胞水平顯 現(xiàn)響應(yīng)特定刺激的IFN-Y的分泌的分析。在第三個接種周期的最后一次接種后6天分離用如8. 1所述的mRNA疫苗接種的小鼠和對照小鼠的脾細(xì)胞，接著將其轉(zhuǎn)移到用a-IFN-γ捕捉抗體包被的96-孔ELISP0T 板。接著將細(xì)胞在37°C用PSMA-衍生的肽文庫或用HIV-衍生的文庫作為對照刺激24小時。 兩種文庫以Iyg/肽/ml的濃度使用。在溫育周期后，將細(xì)胞從板上洗下并且使用針對鼠 IFN- γ的生物素化的二次抗體，隨后用鏈霉抗生物素蛋白-AKP檢測由細(xì)胞分泌的IFN- γ。 使用BCIP/NBT底物顯現(xiàn)斑點(diǎn)并且使用自動的ELISP0T讀數(shù)儀(Immunospot Analyzer，CTL Analyzers LLC)計(jì)數(shù)。8. 6體內(nèi)細(xì)胞毒性為了檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性，分析接種和對照小鼠中的特異性靶細(xì)胞的體內(nèi) 裂解。在最后一次免疫后一周以及10周進(jìn)行測定法從而檢測記憶細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的 誘導(dǎo)。分離來自首次用于實(shí)驗(yàn)的供體小鼠的脾細(xì)胞并將其用兩個不同濃度的熒光染料 CFSE標(biāo)記。其中產(chǎn)生高和低熒光強(qiáng)度的兩個群。將具有低熒光的細(xì)胞在37°C用PSMA-， PSA-或PSCA-衍生的限制性肽文庫(lyg/ml/肽)加載3小時。相應(yīng)地，將具有高熒光的 對照細(xì)胞用HIV Pol-衍生的肽文庫(1 μ g/ml/肽)加載。將兩個群以1 1的細(xì)胞細(xì) 胞比率混合并將其靜脈內(nèi)移植到首次用于實(shí)驗(yàn)的或接種的受體小鼠。16小時后，分離來自 受體小鼠的脾細(xì)胞，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析熒光細(xì)胞的存在。在接種的小鼠中低和高熒 光細(xì)胞之間比率的改變代表體內(nèi)靶細(xì)胞的特異性殺傷。將觀察到的特異性靶細(xì)胞數(shù)和觀察 到的對照細(xì)胞數(shù)之間的精確比率估計(jì)為所有對照小鼠中的平均值。該比率容許在接種小鼠 中基于觀察到的對照細(xì)胞的預(yù)測預(yù)期的特異性靶標(biāo)。在特異性靶標(biāo)的觀察數(shù)和預(yù)測數(shù)之間 的比率代表存活(未被殺死)的特異性靶標(biāo)的百分比。應(yīng)用下列公式比率=在對照小鼠中的特異性靶標(biāo)(觀察到的)/在對照小鼠中的對照靶標(biāo)(觀察到的)比率χ在接種小鼠中的觀察到的對照靶標(biāo)數(shù)=在接種的小鼠中特異性靶標(biāo)的預(yù)測數(shù)%殺傷=(1_(觀察到的特異性靶標(biāo)/預(yù)測的特異性靶標(biāo))8. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism軟件，5. 01版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于缺少樣品群體的正態(tài) 分布和小的樣品尺寸，將非參數(shù)Marm Whitney檢驗(yàn)用于分析在測試組之間的差異，顯著水 平為5%。8. 9結(jié)果和討論將小鼠用mRNA疫苗接種小鼠，所述mRNA疫苗由編碼人前列腺分化抗原PSMA， STEAP, PSA和PSCA的GC-最優(yōu)化mRNAs組成，其中每種分別用陽離子肽魚精蛋白以4 1 的質(zhì)量比率(RNA 魚精蛋白)配制。用緩沖液(林格_乳酸鹽)或用無關(guān)RNA(Pp Luc) 處理對照小鼠，將所述無關(guān)RNA用魚精蛋白類似物配制成mRNA疫苗。a)響應(yīng)于用mRNA疫龍的接種 秀導(dǎo)抗 Φ寺異+?？贵w
受到檢測抗體所需要的重組蛋白的可用性的限制，檢測關(guān)于四種抗原中的兩種的 特異性抗體的誘導(dǎo)。對于兩種分析的蛋白質(zhì)PSA和PSCA，在用mRNA疫苗接種的小鼠血清中 檢測到抗原特異性抗體，這證實(shí)兩種mRNAs在體內(nèi)是功能性和免疫原性的(見圖16-18)。b) 口_刊1^離貞細(xì)漏，_漏、,鼎麵謝牛1~麵另外，應(yīng)用下述兩個獨(dú)立的功能測定來分析響應(yīng)于mRNA疫苗的施用的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的活化=IFN-Y的分泌和體內(nèi)細(xì)胞毒性測定法。IFN-Y是Thl反應(yīng)的主要指示物并 且由激活的CTLs分泌。因此，使用ELISP0T技術(shù)來研究在來自接種的小鼠的脾細(xì)胞中抗原 特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的存在。使用限制性的PSMA-衍生的肽文庫作為脾細(xì)胞的抗原刺激 物。用該文庫刺激導(dǎo)致高IFN-γ分泌，但 是僅在來自用mRNA疫苗接種的小鼠的脾細(xì)胞中， 而不在用編碼無關(guān)蛋白螢光素酶(Pp Luc)的mRNA接種的對照小鼠中。沒有脾細(xì)胞與HIV 衍生的對照肽文庫反應(yīng)(圖19)?？梢酝ㄟ^體內(nèi)細(xì)胞毒性測定法來證實(shí)針對PSMA的抗原特異性細(xì)胞免疫性。在所 有的5只接種mRNA疫苗的小鼠中觀察到用限制性PSMA-衍生的肽文庫加載的靶細(xì)胞的特 異性殺傷，然而，細(xì)胞毒性作用在12和90%之間。用對照RNA(Pp Luc)或注射溶液(林 格_乳酸鹽溶液)接種的小鼠不能消除輸注的靶細(xì)胞(見圖20)。在另一個實(shí)驗(yàn)中，研究用mRNA疫苗進(jìn)行的接種是否在體內(nèi)誘導(dǎo)持續(xù)的記憶作用。 為了解決這個問題，在接種結(jié)束后10周通過體內(nèi)細(xì)胞毒性測試確定抗原-特異性記憶細(xì)胞 毒性τ細(xì)胞的存在。在用PSA以及PSCA接種后觀察到靶細(xì)胞的特異性殺傷(圖21-22)。 總之，mRNA疫苗在小鼠中誘導(dǎo)持續(xù)長久(至少10周)的細(xì)胞免疫性。最終，在小鼠中測試mRNA疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的能力。為了解決這個問題，我們 使用TRAMP-Cl腫瘤細(xì)胞系。TRAMP-Cl表達(dá)人抗原PSMA，PSCA和STEAP的小鼠同源物，所述 人抗原PSMA，PSCA和STEAP包含在作為抗原編碼mRNAs的mRNA疫苗中。在小鼠和人之間 的同源性關(guān)于不同抗原在50-80%之間改變。由于小鼠用編碼人蛋白的mRNAs接種的事實(shí)， 可以僅通過交叉反應(yīng)性來介導(dǎo)針對TRAMP-Cl腫瘤細(xì)胞的保護(hù)。如在圖23中可見，用mRNA 疫苗接種小鼠介導(dǎo)針對移植的TRAMP-Cl腫瘤生長的保護(hù)。這種觀察指示mRNA疫苗在小鼠 中誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性的能力。
權(quán)利要求
活性(免疫刺激性)組合物，其包括編碼至少兩種、三種或四種不同抗原的至少一種RNA，a)其中至少一種抗原選自·STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)；和b)其中其它的抗原選自任意下列抗原或其特定組合的至少一種抗原·PSA(前列腺特異性抗原)，或·PSMA(前列腺特異性膜抗原)，或·PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)；或·PSA和PSMA，或·PSA和PSCA，或·PSMA和PSCA；或·PSA，PSMA和PSCA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的活性(免疫刺激性)組合物，其包括編碼選自PSA，PSMA，PSCA和 STEAP的四種不同抗原的至少一種RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA包 括250-20000個核苷酸的長度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA是 mRNA。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 為單順反子、雙順反子或甚至是多順反子RNA。
6.按照權(quán)利要求5的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少兩種抗原每種由單順 反子RNA編碼。
7.按照權(quán)利要求5的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少兩種抗原由雙順反子 或多順反子RNA編碼。
8.按照權(quán)利要求5的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少兩種抗原由單順反子、 雙順反子和/或甚至多順反子RNAs的混合物編碼。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 包括編碼權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)定義的抗原的片段、變體或表位的RNA序列。
10.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中至少一種RNA包括 選自與圖2，5，8或11(SEQ ID而8:2，5，8或11)的1 離序列相同或至少5%，10%，20%， 30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNAs 的 RNA。
11.按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 是修飾的RNA，特別是穩(wěn)定的mRNA。
12.按照權(quán)利要求11的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA編碼區(qū)的 G/C含量與野生型RNA編碼區(qū)的G/C含量相比增加，與野生型RNA編碼的氨基酸序列相比 較，所述至少一種RNA編碼的氨基酸序列優(yōu)選地不被改變。
13.按照權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含量與野生型RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含 量相比較增加。
14.按照權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述修飾的mRNA 的編碼區(qū)和/或5'和/或3'非翻譯區(qū)與野生型RNA相比較被修飾，以致其不包含促降解 序列元件，與野生型RNA相比較，所述修飾的mRNA編碼的氨基酸序列優(yōu)選地不被改變。
15.按照權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述修飾的mRNA 具有5'帽結(jié)構(gòu)和/或聚腺苷酸尾，優(yōu)選地為10-200個腺苷核苷酸，和/或聚胞苷酸尾，優(yōu) 選地為10-200個胞嘧啶核苷酸，和/或至少一個IRES和/或至少一個5 ‘和/或3 ‘穩(wěn)定 序列。
16.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中至少一種RNA包 括選自與圖 1，3，4，6，7，9，10 或 12(SEQ ID NOs 1，3，4，6，7，9，10 或 12)的 RNA 序列相同或 至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNAs 的 RNA。
17.按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 與一種或多種聚陽離子復(fù)合，優(yōu)選地與魚精蛋白或oligofectamine、最優(yōu)選與魚精蛋白復(fù)口 O
18.按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述活性組合物 另外包括至少一種佐劑。
19.按照權(quán)利要求18的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種佐劑選自由下 列各項(xiàng)組成的組陽離子或聚陽離子化合物，其包括陽離子或聚陽離子肽或蛋白，包括魚精蛋白，核仁蛋 白，精胺或亞精胺，聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，穿透細(xì)胞的肽(CPPs)，其包 括HIV-結(jié)合肽，Tat, HIV-1 Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin，VP22來源的或類似物 肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP, KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620,富含脯氨酸的肽， 富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，MPG-肽，P印-1，L-寡聚物，降鈣素肽，觸角足來源的肽 (特別是來自 Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF,乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-來源的肽，SAP,魚精蛋白，精胺，亞精胺， 或組蛋白，陽離子多糖，其包括脫乙酰殼多糖，聚凝胺(polybrene)，陽離子聚合物，其包括 聚氮丙啶腫1)，陽離子脂質(zhì)，其包括0(^獻(xiàn)[1-(2，3-&01巧1(^)丙基)]-N，N，N-三甲基 氯化銨，DMRIE，二 -C14-脒，D0TIM，SAINT, DC-Chol，BGTC，CTAP, D0PC, D0DAP, DOPE 二油基 磷脂酰乙醇胺，D0SPA，D0DAB,D0IC,DMEPC,DOGS :Dioctadecylamidoglicylspermin,DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨，D0TAP:二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙 烷，DC-6-14 :0，0_雙十四烷酰-N-(a-三甲基氨溶乙?；?二乙醇胺氯化物，CLIP1 外消 旋-[(2，3_雙十八烷基氧基丙基)(2-羥基乙基)]-二甲基氯化銨，CLIP6 外消旋_[2(2， 3-雙十六烷基氧基丙基-羥甲基氧基)乙基]三甲基銨，11 9:外消旋-[2(2，3-雙十六 烷基氧基丙基-羥基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基銨，oligofectamine，或陽離子或聚陽離 子聚合物，其包括改性聚氨基酸，包括3 “氨基酸_聚合物或反轉(zhuǎn)聚酰胺，改性聚乙烯，包括 PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，改性丙烯酸脂，包括pDMAEMA (聚(二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯))，改性酰氨基胺(Amidoamines)，包括pAMAM(聚(酰氨基胺))，改性聚 3氨基酯(PBAE)，包括二胺末端改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，樹狀聚體，包括聚丙胺樹狀聚體或基于pAMAM的樹狀聚體，聚亞胺，包括PEI 聚(乙烯 亞胺)，聚(丙烯亞胺)，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，包括基于環(huán)糊精的聚合物，基于 葡萄糖的聚合物，脫乙酰殼多糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，諸如PM0XA-PDMS共 聚物，等，嵌段聚合物，其由選自如前文提及的陽離子聚合物的一個或多個陽離子嵌段的組 合與一個或多個親水_或疏水嵌段(例如，聚乙二醇)的組合組成；或陽離子或聚陽離子蛋白或肽，其選自具有下述總式(I)的蛋白或肽(Arg)1;(LyS)m; (His)n;(0rn)。；(Xaa)x，其中1+m+n+o+x = 8-15，并且l，m，n或o彼此獨(dú)立地可以是選自0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或 15 的任一數(shù)字，條件是 Arg，Lys，His 和 Orn 的總 含量占該寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是選自除Arg，Lys, His或Orn外的 天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且x可以是選自0，1，2，3或4的 任一數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過該寡肽所有氨基酸的50% ；或具有式(II)的核酸 GiXfn，其中G是鳥苷，尿嘧啶或是鳥苷或尿嘧啶的類似物；X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、 胞嘧啶或上述提及的核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，G是鳥苷或其類 似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ；其中當(dāng)m =3時，X是尿嘧啶或其類似物，當(dāng)m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或尿嘧啶類似物； n是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)n= 1時，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)11> 1時，至少50%的核苷酸 是鳥苷或其類似物；或具有式(III)的核酸，其中C是胞嘧啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶 或尿嘧啶的類似物；X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的類似物；1 是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)1 > 1時，至少50%的核苷酸 是胞嘧啶或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ;其中當(dāng)m = 3時，X是尿嘧啶或其類似物，當(dāng) m > 3時，存在至少3個連續(xù)的尿嘧啶或尿嘧啶類似物；n是1_40的整數(shù)，其中當(dāng)n = 1時， C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)n > 1時，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物。
20.疫苗，其包括按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物。
21.按照權(quán)利要求20的疫苗，其中按照要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合 物引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
22.按照權(quán)利要求20和21中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗還包括藥用載體。
23.按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物用于制備疫苗的應(yīng)用， 所述疫苗用于治療前列腺癌(PCa)，優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素_難治性前列腺癌，和 與其相關(guān)的疾病或病癥。
24.試劑盒，優(yōu)選多部件的試劑盒，其包括按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺 激性)組合物，和/或按照權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的疫苗，和任選地具有關(guān)于所述活性組 合物和/或所述疫苗的施用和劑量的信息的技術(shù)說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性(免疫刺激性)組合物，其包括至少一種RNA，優(yōu)選mRNA，其編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)能夠在哺乳動物中引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)的抗原，其中所述抗原選自由PSA(前列腺特異性抗原)，PSMA(前列腺特異性膜抗原)，PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)和STEAP(前列腺六跨膜上皮抗原)組成的組。本發(fā)明還涉及包括所述活性(免疫刺激性)組合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)組合物(用于制備疫苗)的應(yīng)用和/或所述疫苗用于引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)以用于治療前列腺癌(PCa)、優(yōu)選地腫瘤輔助治療和/或激素-難治性前列腺癌，和與其相關(guān)的疾病或病癥的應(yīng)用。最后，本發(fā)明涉及試劑盒，特別是多部件的試劑盒，其包含所述活性(免疫刺激性)組合物和/或所述疫苗。
文檔編號A61K39/00GK101820900SQ200880110986
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者托馬斯·蘭德爾, 約亨·普羅布斯特, 英馬爾·霍伊爾 申請人:庫瑞瓦格有限責(zé)任公司