專利名稱：含有來自紫杉形成層或原形成層的植物干細(xì)胞系的抗癌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，所述組合物含有作為活性成分的來自 紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系；其溶解產(chǎn)物；其提取物或者其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
凋亡是根據(jù)程序化信號(hào)通過細(xì)胞中各種基因表達(dá)和蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)而發(fā)生的 細(xì)胞死亡的主動(dòng)過程。通過該過程形成的凋亡體通過吞噬細(xì)胞諸如周圍細(xì)胞(surrounding cell)或者巨噬細(xì)胞(macrophage)的作用而被除去，使它們不引起炎癥。這種凋亡在活的 有機(jī)體的各種正常生理過程中頻繁地被觀察到并且已知其在各種疾病的發(fā)展過程中深深 地涉及。也就是說，異常凋亡的發(fā)展可導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病、免疫疾病和心血管疾病，并且凋 亡的異常抑制可引起癌癥。由凋亡的異常發(fā)展和抑制引起的疾病的更具體的例子包括由諸如p53、pl6和 Bcl-2基因的異常表達(dá)誘導(dǎo)的癌癥，HIV Herpes和流感病毒引起的感染，以及自體免疫疾病 諸如1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和重癥肌無力。個(gè)體的細(xì)胞凋亡是從個(gè)體中 除去異常細(xì)胞即基因不可恢復(fù)的損傷細(xì)胞的常規(guī)機(jī)制，以便防止由基因受到損傷的細(xì)胞或 者由分化刺激的不恰當(dāng)分化的誘導(dǎo)引起的腫瘤的發(fā)展。這種觀念得到常用抗癌劑通過與癌 細(xì)胞增殖的抑制有關(guān)的凋亡過程誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的事實(shí)的支持(BanT，M. A.等人，Biochem Pharmacol. ,402353,1990 ；Hickman, J. A. ，Cancer Metastasis Rev. ，11 121,1992)。因此，凋亡過程的紊亂誘導(dǎo)了損傷細(xì)胞和開始受到損傷的細(xì)胞的生存以及這些細(xì) 胞的生長，因此凋亡的抑制在致癌過程中起到重要作用。另外，已經(jīng)報(bào)道具有癌癥預(yù)防效 果的物質(zhì)誘導(dǎo)了這些異常細(xì)胞的凋亡，并且由這些物質(zhì)引起的凋亡的誘導(dǎo)至少與其防癌活 性有關(guān)(Fesus, L.，J. Cell Biochem. ,22 151,1995 ；Reddy, B. S.，Cancer Res. ,57 :420， 1997)。同時(shí)，在有關(guān)癌癥的發(fā)展機(jī)制和治療的研究上已經(jīng)付出了高昂的研究費(fèi)用，但 是癌癥仍然為不可治愈的疾病，并且各種癌癥治療會(huì)引起副作用(Goodman等人，Cancer Res.，9 :2295，1987)。因此，已經(jīng)付出了許多努力來研究并開發(fā)用于抑制癌癥的新的藥物和 制劑，特別是，有關(guān)具有很小副作用的來自天然材料的抗癌物質(zhì)的開發(fā)已經(jīng)引起了興趣。本發(fā)明的一些發(fā)明人開發(fā)了提供克服去分化引起的變異問題的來自形成層或原 形成層的細(xì)胞系的方法，其可穩(wěn)定增殖并具有很高的遺傳穩(wěn)定性，并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)這些細(xì)胞 系中來自紫杉的細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，以很高的產(chǎn)量得到紫杉醇(PCT/KR2006/001544)。但 是，來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系本身的抗癌效果仍未見報(bào)道。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力來開發(fā)來自天然物質(zhì)的抗癌組合物，其 與常用抗癌劑相比具有更小的副作用，并顯示了極佳的抗癌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自紫杉形成 層(Taxus cambium)或原形成層(procambium-)的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物或者其培 養(yǎng)基顯示了癌細(xì)胞殺死活性，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來自天然物質(zhì)的組合物，其與現(xiàn)有的抗癌劑相比具有更小 的副作用并顯示了預(yù)防和治療癌癥的活性。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)防和治療癌癥的藥物組合物，其 含有選自包括來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基 的任何一種或多種，所述細(xì)胞系具有下列特征(a)其形態(tài)學(xué)特征為具有大量的液泡；(b)其處于天然未分化的狀態(tài)；并且(c)其為同質(zhì)的細(xì)胞系。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或改善癌癥的功能食品，其含有選自包括來自紫 杉形成層或原形成層的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基的組的任何一種或多 種。在還一方面，本發(fā)明提供了來自紫杉形成層或原形成層細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提 取物以及其培養(yǎng)基的預(yù)防或治療癌癥的用途。在又一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療癌癥的方法，所述方法包括使用選自下組 的任何一種或多種所述來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及
其培養(yǎng)基。通過下列詳細(xì)描述和隨附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和方面將是容易想到 的。


圖1示出了顯示根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系誘導(dǎo)過程的照片、分離的原形成層和形成層 的圖像以及去分化細(xì)胞與來自紫杉原形成層細(xì)胞之間的比較。圖2示出了 R0S的量的比較圖形與DCFH熒光照片，其顯示了當(dāng)通過使用H202處理 而誘導(dǎo)人類皮膚二倍體成纖維母細(xì)胞(diploidfibroblasts，HDFs)的老化時(shí)，根據(jù)本發(fā)明 的細(xì)胞系提取物的抗氧化活性。在圖2中，p-WE 原形成層的蒸餾水提取物；C-WE 形成層 的蒸餾水提取物。圖3示出了顯示根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系給藥2周后對(duì)照組與細(xì)胞系給藥組之間的癌 組織大小比較的照片。圖4是顯示根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系給藥三周時(shí)對(duì)照組與細(xì)胞系給藥組的體積的圖表。圖5是根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系給藥三周時(shí)從小鼠身上切割下來的對(duì)照組和細(xì)胞給 藥組的癌組織的照片。圖6是在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系給藥三周后切割下來的癌組織的內(nèi)部組織的照片。圖7示出了顯示使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系提取物處理癌細(xì)胞系之后的細(xì)胞死亡 程度的照片。圖8是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞 系之后的細(xì)胞死亡程度的照片。
圖9是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理肺癌細(xì)胞系 之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖10是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理前列腺癌細(xì) 胞系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖11是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理骨肉瘤細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖12是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理口腔癌細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖13是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理皮膚癌細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖14是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理白血病細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖15是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理子宮癌細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖16是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理皮膚癌(人 類)細(xì)胞系之后細(xì)胞死亡程度的照片圖17是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理胰腺癌細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖18是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理乳腺癌細(xì)胞 系之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖19是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理胃癌細(xì)胞系 之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖20是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理腎癌細(xì)胞系 之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖21是顯示使用根據(jù)本發(fā)明的各種濃度的細(xì)胞系的甲醇提取物處理肝癌細(xì)胞系 之后細(xì)胞死亡程度的照片。圖22圖解顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系中紫杉醇存在性的分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式除非特別限定，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理 解的具有相同含義。一般說來，這里使用的各種術(shù)語的定義在本領(lǐng)域是公知且常用的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中使用的主要術(shù)語的定義如下。在本文中，術(shù)語“形成 層”指的是使莖和根加厚以允許植物體積加權(quán)(volumetrically)生長的組織。據(jù)報(bào)道當(dāng)形 成層，在其中發(fā)生最活躍的細(xì)胞分裂的分生組織被用作植物組織培養(yǎng)的外植體時(shí)，細(xì)胞的 快速大量生產(chǎn)成為可能(韓國專利10-0533120)。在本文中，術(shù)語“原形成層”指的是來自初始細(xì)胞組的初級(jí)分生組織，并且作為初 級(jí)分生組織的形成層來自原形成層而不需永久組織的介入。在本文中，術(shù)語“溶解產(chǎn)物”指的是通過經(jīng)化學(xué)方法例如使用去垢劑或物理方法破 碎細(xì)胞得到的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。術(shù)語細(xì)胞系的“提取物”指的是通過將細(xì)胞溶解在溶劑中并分離細(xì)胞得到的物質(zhì)，并且提取物可通過蒸餾或蒸發(fā)濃縮。在本文中，術(shù)語“天然未分化”的意思是細(xì)胞不以經(jīng)過去分化步驟的未分化狀態(tài)存 在，而是天然保持為前分化狀態(tài)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其含有選自下組的 任何一種或多種，包括來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其
培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系具有如下特征(a)其形態(tài)學(xué)特征為具有大量的液泡；(b)其處于天然未分化的狀態(tài)；并且(c)其為同質(zhì)的細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系的其他特征在于(a)其在懸 浮培養(yǎng)過程中以單個(gè)細(xì)胞存在；(b)與來自紫杉形成層或原形成層以外的其他組織的細(xì)胞 系相比，其具有較高的生長速度并可被穩(wěn)定培養(yǎng)；以及(c)與來自紫杉形成層或原形成層 以外的其他組織的細(xì)胞系相比，其在生物反應(yīng)器中具有對(duì)剪切應(yīng)力較低的敏感性。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系優(yōu)選使用包括下列步驟的分離方法得到(a)得到含有紫杉形成層或原形成層的組織；(b)通過培養(yǎng)得到的含有形成層或原形成層的組織，誘導(dǎo)從形成層或原形成層增 殖的形成層層或原形成層層，并誘導(dǎo)從形成層或原形成層以外的其他組織增殖的無定形愈 傷組織層；以及(c)收集來自形成層層或原形成層層的細(xì)胞系。在分離方法中，步驟(c)優(yōu)選通過在培養(yǎng)基中增殖組織然后收集增殖的細(xì)胞 系來進(jìn)行，所述培養(yǎng)基含有3-5襯％的粗糖或糖以及至少一種選自下組的物質(zhì)，包括甲 基茉莉酮酸酯(methyl jasmonate)、真菌提取物、細(xì)菌提取物、酵母提取物、殼聚糖、 葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水楊酸、花生四烯酸(arachonic acid)、STS、 mevalonalonateN-benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯利(eth印hon)、馬尿酸 (hippuric acid)、硝酸銫銨(amminoium eerie nitrate)、AgN03、硫酸氧 凡、p-氨基苯 甲酸、油菜素類固醇(brassinosteroid)，藻酸鈉、醋酸鈉。這里，甲基茉莉酮酸酯優(yōu)選以 10-100 iiM的量被包含。在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基是用于植物組織培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，其例子可包括但不 限于N6培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、AA培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、LP 培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、GD培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基、DCR培養(yǎng)基等等。在本發(fā)明中，提取物優(yōu)選使用選自下組的溶劑得到，包括蒸餾水、乙醇、丙酮、 DMS0(二甲亞砜)以及它們的混合溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的來自紫杉形成層的細(xì)胞系和來自原形成 層的細(xì)胞系具有抑制由H202誘導(dǎo)的活性氧的效果，表明它們具有抗氧化效果。由于體內(nèi)產(chǎn) 生的活性氧(R0S)通過與細(xì)胞分子諸如細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂類結(jié)合引起細(xì)胞突變，并且 通過抑制細(xì)胞的正常功能而參與了腫瘤組織的形成，可以看到本發(fā)明的細(xì)胞系具有抗癌效果。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的來自紫杉形成層的細(xì)胞系和來自原形成層的細(xì)胞系被給藥到小鼠，然后觀察從小鼠中切割下來的癌組織。結(jié)果顯示，本發(fā)明的來自紫 杉形成層的細(xì)胞系和來自原形成層的細(xì)胞系抑制了腫瘤組織的生長，作為抗腫瘤基質(zhì)之一 抑制血管生成(angiogenesis)，并增強(qiáng)了免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中。在本發(fā)明的還一實(shí)施例中，結(jié)腸癌、口腔癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宮 癌、皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌和肝癌分別使用細(xì)胞系的蒸餾水提取物、甲醇提取 物和丙酮提取物的處理以便檢查提取物對(duì)癌細(xì)胞死亡的效果。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的細(xì) 胞系提取物對(duì)于下列癌癥的預(yù)防和治療是有效的，包括但不限于結(jié)腸癌、口腔癌、肺癌、前 列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宮癌、皮膚癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌和肝癌。因此，如上所述，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系及其提取物具有預(yù)防和治療癌癥的活性。因此，即便 在本發(fā)明中，不存在顯示含有細(xì)胞系的溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)物的組合物顯示預(yù)防和治療癌癥效 果的特定實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的溶解產(chǎn)物 和培養(yǎng)基也可顯示預(yù)防和治療癌癥的效果。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，分析了本發(fā)明的細(xì)胞系中紫杉醇的存在性。當(dāng)根據(jù)本 發(fā)明的細(xì)胞系在含有誘導(dǎo)子(elicitor)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其可產(chǎn)生高濃度的紫杉醇。沒 有在允許紫杉醇產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)或者在特定條件下處理以便不產(chǎn)生紫杉醇的本發(fā)明的 細(xì)胞系被檢測以便檢查其是否含有紫杉醇，并且分析了 LC數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，細(xì)胞系不含紫 杉醇。因此，考慮本發(fā)明的細(xì)胞系的抗癌活性不是已知由紫杉產(chǎn)生的紫杉醇的作用，而是細(xì) 胞系本身的抗癌活性。另外，由于當(dāng)口服給藥時(shí)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系顯示了抗癌效果，本發(fā) 明的細(xì)胞系的抗癌效果不被認(rèn)為是用作注射液的紫杉醇的作用，因?yàn)楫?dāng)口服給藥時(shí)紫杉醇 是無效的。根據(jù)本發(fā)明的含有細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基的組的任何一種 或多種的用于預(yù)防和治療癌癥的組合物可以作為含有一種或多種選自下組的藥物組合物 單獨(dú)或者與至少一種藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結(jié)合的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、 其提取物以及其培養(yǎng)基。基于疾病及其嚴(yán)重程度、患者年齡、體重、健康狀況和性別、給藥途 徑和治療周期，細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基可以作為藥物組合物以治療上 的有效量而被包含。在本文中，術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的組合物”指的是當(dāng)給藥到人類時(shí)生理上可接受 并且不引起胃病、過敏反應(yīng)諸如眩暈或類似反應(yīng)的組合物。所述載體、賦形劑或稀釋劑的例子可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木 糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠、藻酸鹽、白明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、羥基苯甲酸丙酯 (propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物組合物可另外含有填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑和防腐劑。 而且，本發(fā)明的藥物組合物可使用本領(lǐng)域公知的方法制成制劑，使其在給藥到哺乳動(dòng)物之 后能夠提供快速、持續(xù)或延遲的活性成分釋放。制劑可以是粉末、顆粒、片劑、乳液、糖漿、氣 霧劑、軟和硬凝膠膠囊、無菌注射液、無菌粉末等。在另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或改善癌癥的功能性食品，其含有選自下組 的一種或多種，該組包括來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物或
者其培養(yǎng)基。
在本文中，術(shù)語“功能性食品”指的是通過加入根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系、細(xì)胞系的溶 解產(chǎn)物、提取物或者培養(yǎng)基而改善其功能的食品。例如，本發(fā)明的細(xì)胞系或者細(xì)胞系提取物 的抗癌效果可被用于制備預(yù)防并緩解癌癥的功能性食品。本發(fā)明的功能性食品可包括各種營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))、調(diào)味劑諸如 合成調(diào)味劑和天然調(diào)味劑、著色劑、填充劑、胃酸或其鹽、海藻酸或其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性凝 膠增稠劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、乙醇、在含碳飲料中使用的碳化劑。實(shí)施例此后，將參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的 是，這些實(shí)施例僅僅用于解釋的目的，而不是用于限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施例可被 修改成其他各種形式。特別是，雖然來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系及其提取物的癌癥預(yù)防效果和 癌癥抑制效果在下列實(shí)施例中被確認(rèn)，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，使用細(xì)胞 系的溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基可提供與使用細(xì)胞系或其提取物的結(jié)果相同的結(jié)果。實(shí)施例1 來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系的制備1-1 植物材料的制備分別收集Taxus spp.的嫩枝和莖，然后將其立即浸泡在100mg/L的抗氧化劑、 L-抗壞血酸(DUCHEFA，The Netherlands)中。然后，將它們運(yùn)輸并儲(chǔ)存。然后，使用 苯菌靈(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1 % WH 菌清(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1 % 的硫酸鏈霉素(sterptomycin sulphate,DUCHEFA,The Netherlands)和0. 的氨噻胍頭孢菌素鈉(cefotaxime sodium, DUCHEFA，The Netherlands)的混合溶液將植物預(yù)處理24小時(shí)，然后用自來水洗滌30分鐘 以便除去酚化合物和剩余的化學(xué)物質(zhì)。然后，將植物在70%的乙醇(DC Chemical, Korea) 中1分鐘,30%的過氧化氫(LG Chemical,Korea)中15分鐘，1 %的CL0R0X溶液中15分鐘 和3%的CL0R0X溶液中5分鐘進(jìn)行表面滅菌，然后用水洗滌3-4次。1-2 從嫩枝和莖中分離原形成層和形成層將已經(jīng)進(jìn)行滅菌處理的嫩枝和莖的外層組織通過沿著長度方向拉動(dòng)它們很容易 去皮。將去皮的組織暴露出木質(zhì)部、原形成層(嫩枝)或者形成層(莖)，韌皮部、皮層和表 皮，然后將它們以使去皮組織的最內(nèi)側(cè)組織即木質(zhì)部與培養(yǎng)基接觸的方式進(jìn)行培養(yǎng)。1-3 來自紫杉原形成層和形成層的細(xì)胞系的誘導(dǎo) 在初始培養(yǎng)的4-7天，肉眼觀察到來自原形成層和形成層的細(xì)胞的分裂，并在培 養(yǎng)15天之后，通過去分化形成的無定形愈傷組織開始從由韌皮部、皮層和表皮構(gòu)成的層中 被誘導(dǎo)。但是，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，在木質(zhì)部中沒有發(fā)生細(xì)胞分裂，因此形成層層與木質(zhì)部 自然分離。培養(yǎng)30天后，組織開始分成形成層層和含有韌皮部的上層，即無定形愈傷組織 層(圖1(a))，并且在組織完全自然分成兩層之后，將這些層分別在不同培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(圖 1(b))。在圖1(a)中，上部表示含有韌皮部、皮層和表皮的組織，中部表示形成層，底部表示 木質(zhì)部，并且箭頭表示形成層層與含有韌皮部、皮層和表皮的組織之間的分離。在圖1(b) 中，“A”表示來自含有韌皮部/皮層/表皮的組織的細(xì)胞系，其由于細(xì)胞之間分裂的差別而 不規(guī)則增殖，“B”表示來自形成層的細(xì)胞系，其通過規(guī)則的細(xì)胞分裂增殖形成均勻的細(xì)胞 層，“C”表示木質(zhì)部，其中不發(fā)生細(xì)胞分裂。圖1(c)顯示了來自原形成層的細(xì)胞系被誘導(dǎo)。在圖1(c)中，“A”顯示培養(yǎng)30天后觀察到的嫩枝，其為顯示原形成層(底部)與來自包括 初級(jí)韌皮部、皮層和表皮的組織的愈傷組織細(xì)胞分離的照片，“B”是在培養(yǎng)35天之后的照 片，顯示誘導(dǎo)的原形成層層被分離并培養(yǎng)，“C”是培養(yǎng)40天后的照片，顯示包括初級(jí)韌皮 部、皮層和表皮的組織的愈傷組織在原形成層層分離之后增殖。在如上所述分離組織之后，將其具有良好生長速度的白色易碎部分在與誘導(dǎo)培養(yǎng) 基相同的新鮮培養(yǎng)基中以21天為間隔傳代培養(yǎng)，同時(shí)，僅僅用于誘導(dǎo)來自原形成層和形成 層的細(xì)胞系的培養(yǎng)基在下表1中顯示。將生長調(diào)節(jié)因子生長素以l_3mg/L的濃度加入到培養(yǎng)基中，在受控暗室中 25 士 1°C下培養(yǎng)。表1 用于從Taxus spp.誘導(dǎo)細(xì)胞系的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1) 為了比較，將紫杉胚芽和針葉外植體(needle explant)滅菌，然后在表1的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。結(jié)果，可以觀察到胚芽和針葉外植體通過去分化形成愈傷組織。與含有韌皮部的組織的情況類似，由胚芽和針葉外植體誘導(dǎo)的愈傷組織由于各種細(xì)胞之間的分裂速度的 差異而具有不規(guī)則的形狀，顯示不穩(wěn)定的生長速度并且很容易變褐。由胚芽和針葉外植體 誘導(dǎo)的褐色聚合愈傷組織由于從其分泌的苯酚化合物而顯示緩慢生長，并最終死亡。也就 是說，在培養(yǎng)6個(gè)月之后，由胚芽和針葉外植體誘導(dǎo)的愈傷組織難以保持并培養(yǎng)。但是，當(dāng) 將它們長期培養(yǎng)超過20個(gè)月時(shí)，來自原形成層和形成層的細(xì)胞系得以穩(wěn)定保持而在它們 的生長速度、生長模式和聚合方面沒有變化表明大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)是可能的。
1-4 分離的細(xì)胞系的生長和特性的觀察將來自原形成層和形成層的細(xì)胞系置于含有下表2中所示的液體培養(yǎng)基的燒瓶 中。然后，將燒瓶中的細(xì)胞系在旋轉(zhuǎn)搖床中100rpm、25士 1°C下培養(yǎng)。傳代設(shè)定為2周，使培 養(yǎng)的細(xì)胞在指數(shù)生長期可始終保持較高的活力。表2 用于來自Taxus spp.的細(xì)胞系的懸浮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2) 同時(shí)，將來自胚芽和針葉的愈傷組織也在表2的培養(yǎng)基2中培養(yǎng)并將其與來自本發(fā)明的原形成層和形成層的細(xì)胞系進(jìn)行比較。使用生物學(xué)顯微鏡CX31 (Olympus, Japan)觀察細(xì)胞聚集的程度。結(jié)果，如下表3 所示，可以看到當(dāng)懸浮培養(yǎng)時(shí)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系超過90%的細(xì)胞以單細(xì)胞存在。如圖 1(d)所示，可以觀察到根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)特征為存在大量的液泡并處于未分化 狀態(tài)。圖1(d)中的箭頭表示來自紫杉原形成層的細(xì)胞的液泡。表3 紫杉長期培養(yǎng)的細(xì)胞聚集類型 同時(shí)，為了檢查大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的可能性，將來自胚芽/針葉的愈傷組織和來 自原形成層和形成層的細(xì)胞在內(nèi)體積為3L的氣升式生物反應(yīng)器(airlift bioreactor, Sung-ffon Cytec, Korea)中培養(yǎng)。培養(yǎng)在黑暗條件下在表2中的液體培養(yǎng)基中25士 1°C下 進(jìn)行。結(jié)果，如在下表4中看到的那樣，觀察到根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉原形成層和形成 層的細(xì)胞培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中的倍增時(shí)間為4-5天，這與在燒瓶中一樣或者與在燒瓶中 相比更短，而來自胚芽/針葉的細(xì)胞系的非同質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的倍增時(shí)間在燒瓶中為12天， 但在生物反應(yīng)器中為21天。換言之，可以看到當(dāng)在燒瓶中培養(yǎng)時(shí)，與來自紫杉原形成層或 形成層以外的其他組織的細(xì)胞系相比，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系顯示了大約高出2-3倍的生長 速度，并且當(dāng)在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)，與來自原形成層或形成層以外的其他組織的細(xì)胞系 相比，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系顯示了大約高出5-6倍的生長速度。這被認(rèn)為是由于在培養(yǎng)過 程中在生物反應(yīng)器中形成生長環(huán)、植物細(xì)胞凝集以及剛性細(xì)胞壁對(duì)剪切應(yīng)力的靈敏度而使 細(xì)胞活力迅速下降的原因。根據(jù)本發(fā)明的來自原形成層和形成層的細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中形成非常小的生 長環(huán)，并且當(dāng)簡單刺激被施加到培養(yǎng)器中以搖動(dòng)培養(yǎng)基時(shí)，在其內(nèi)壁上形成的生長環(huán)容易 地被消除。而且，顯示本發(fā)明的細(xì)胞系具有較低的凝集并且含有大量的液泡，因此對(duì)剪切應(yīng) 力具有較低的靈敏度，從而使細(xì)胞活力不降低。換言之，觀察到根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系對(duì)大量 生產(chǎn)中在生物反應(yīng)器中的搖動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力具有較低的靈敏度，因此可在生物反應(yīng)器中 迅速大量生產(chǎn)。考慮到燒瓶培養(yǎng)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)之間細(xì)胞系的生長速度的差別，可以看 到根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉原形成層或形成層的細(xì)胞系對(duì)剪切應(yīng)力的靈敏性比來自紫杉原 形成層或形成層以外的組織的細(xì)胞系低2-3倍。表 4 1-5 使用糖和甲基茉莉酮酸酯處理將在實(shí)施例1-4中描述的已經(jīng)懸浮培養(yǎng)14天的細(xì)胞系在培養(yǎng)基(含有無菌水， 3-5wt% (g/L)的粗糖和100 μ M的甲基茉莉酮酸脂)中在黑暗條件下培養(yǎng)10天，然后收集 細(xì)胞并在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用。實(shí)施例2 來自紫杉原形成層或形成層的細(xì)胞系的提取物的制備按照如下步驟從實(shí)施例1中制備的細(xì)胞系中提取活性成分。(i)將已經(jīng)除去培養(yǎng)基的500g細(xì)胞系在在50°C下在500mL蒸餾水中攪拌6小時(shí) 使其溶解。(ii)在溶解完全之后，將細(xì)胞溶液以3，OOOg離心10分鐘，并收集上清液，由此得 到蒸餾水溶解的物質(zhì)。(iii)在得到蒸餾水溶解的物質(zhì)之后，將剩余的蒸餾水不溶性物質(zhì)在室溫下在 500mL甲醇中攪拌6小時(shí)使其溶解。(iv)在溶解完全之后，將細(xì)胞溶液以3，OOOg離心10分鐘，并收集上清液，由此得 到甲醇溶解的物質(zhì)。(ν)在得到蒸餾水溶解的物質(zhì)之后，將剩余的甲醇不溶性物質(zhì)在室溫下在500mL 丙酮中攪拌6小時(shí)使其溶解。(vi)在溶解完全之后，將細(xì)胞溶液以3，OOOg離心10分鐘，并收集上清液，由此得 到丙酮溶解的物質(zhì)。(vii)將如上所述得到的蒸餾水、甲醇和丙酮溶解的物質(zhì)使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀濃縮。(viii)使用冷凍干燥器將濃縮的樣品干燥并溶解在蒸餾水、甲醇和丙酮中，由此 得到細(xì)胞培養(yǎng)物的蒸餾水提取物、甲醇提取物和丙酮提取物。實(shí)施例3 來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系提取物的抗氧化活性的測定由于抗氧化效果與預(yù)防癌癥之間的關(guān)系是已知的，進(jìn)行下面的檢測以便檢查根據(jù) 本發(fā)明的細(xì)胞系是否具有預(yù)防癌癥的效果。3-1 人類二倍體成纖維母細(xì)胞(HDF)的培養(yǎng)將HDF細(xì)胞從胎兒陰莖包皮中分離并培養(yǎng)。通過將56°C加熱30分鐘失活的10% 的胎牛血清(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA) UOO 單位 /mL 的青霉素、100 μ g/mL 的鏈 霉素和 300μ g/mL 的谷氨酸加入到 DMEM 培養(yǎng)基(Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austria)中制備培養(yǎng)基。將細(xì)胞在上面描述的培養(yǎng)基中在5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C的溫度 和95%濕度下培養(yǎng)并以3-4天為間隔在細(xì)胞即將開始彼此融合之前傳代。根據(jù)傳代次數(shù) (代數(shù))將傳代細(xì)胞分成不超過20代的早期培養(yǎng)細(xì)胞、21-49代的中期培養(yǎng)細(xì)胞以及超過 50代的晚期培養(yǎng)細(xì)胞。3-2 由H2O2誘導(dǎo)的活性氧的測定
為了檢查當(dāng)使用實(shí)施例2中得到的提取物中的蒸餾水提取物處理皮膚二倍體成 纖維母細(xì)胞(HDF細(xì)胞)時(shí)由H202誘導(dǎo)的活性氧是否被抑制，進(jìn)行了活性氧(R0S)的測定。細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定通過使用對(duì)活性氧敏感的DCFDA(2’，7’ - 二氯二氫熒光素二 乙酸(dichlorofluorescin diacetate)，F(xiàn)luka Cat 35847Molecular Probes，USA)熒光染 料的Facscan分析來進(jìn)行。根據(jù)每PD的HDF細(xì)胞在100-mm培養(yǎng)板上生長，然后使用5 u M 的DCFDA在黑暗條件下37°C培養(yǎng)30分鐘。然后，使用PBS將細(xì)胞洗滌兩次并通過使用胰島 素-EDTA處理進(jìn)行收集。然后，通過900rpm離心4分鐘收集細(xì)胞，然后測定每10，000個(gè)細(xì) 胞的活性氧(圖2(a)和2(b))。將5x10s個(gè)細(xì)胞分散到6孔板中，然后單獨(dú)或者與在實(shí)施例2中得到的提取物結(jié)合 使用H202處理。作為提取物，在實(shí)施例2中得到的提取物中的蒸餾水提取物以10-100 i! g/ mL、優(yōu)選50 u g/mL的濃度被使用。然后，將細(xì)胞使用HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)洗滌2_3 次并在HBSS中固定大約30分鐘。然后，使用10 ii M的DCFDA (Molecular Probes USA)在 黑暗條件中37°C下將細(xì)胞染色1小時(shí)，使用HBSS洗滌3次，然后使用熒光顯微鏡觀察(圖 2(c))。如上所述，將HDF細(xì)胞使用200 ii M的H202和在實(shí)施例2中得到的10-100 ii g/ mL (優(yōu)選50 u g/ml)的蒸餾水提取物處理，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。在細(xì)胞使用H202處理之后24小時(shí)，HDF細(xì)胞通過氧化應(yīng)力(oxidativestress)產(chǎn) 生活性氧(R0S)。由于非熒光DCFDA通過活性氧被氧化形成顯示強(qiáng)熒光的DCF，可測定活性 氧。在該實(shí)施例中，F(xiàn)ACS Calibur(BectonDickinson Analytic Flow Cytometer, USA)被 用于測定。結(jié)果，如圖2所示，來自紫杉形成層的細(xì)胞系提取物和來自紫杉原形成層的細(xì)胞 系提取物都抑制了活性氧(R0S)的產(chǎn)生。在圖2中，P-WE 原形成層的蒸餾水提取物，C-WE 形成層的蒸餾水提取物。也就是說，可以觀察到兩種細(xì)胞系提取物都抑制活性氧的產(chǎn)生。具有極佳抗氧化活性的物質(zhì)是抑制由細(xì)胞氧化引起的細(xì)胞損傷的活性物質(zhì)，并且 在體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(R0S)與細(xì)胞分子諸如細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂類結(jié)合引起細(xì)胞突變， 并通過抑制細(xì)胞的正常功能在癌組織形成中涉及。因此，由于在上面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的來自紫杉形成層的細(xì)胞系和來自原形成 層的細(xì)胞系具有抗氧化效果，本發(fā)明的來自紫杉形成層的細(xì)胞系和來自原形成層的細(xì)胞系 具有預(yù)防癌癥的效果。實(shí)施例4 通過來自紫杉形成層和原形成層的細(xì)胞系給藥的抗癌活性(1)在該實(shí)施例中，根據(jù)一般動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)從Damool Science (Daejeon, Korea)購買的Balb/C小鼠。特別是，購買6周齡小鼠并飼養(yǎng)大約5天。然后，將lx 106CT_26 結(jié)腸癌細(xì)胞(Korean Cell Line BankKCLB80009)皮下注射到小鼠背部的右部。在注射癌細(xì)胞之后大約3天，觀察到癌細(xì)胞生長到大約與去皮栗子相等的尺寸。 因此，從癌細(xì)胞注射3天開始，將在實(shí)施例1中得到的來自形成層的細(xì)胞系和來自原形成層 的細(xì)胞系自由喂養(yǎng)小鼠。對(duì)照組喂養(yǎng)含有常規(guī)養(yǎng)分的鼠飼料，并且細(xì)胞系給藥通過將細(xì)胞 系以1 1的比例加入到精細(xì)粉碎的相同飼料制備成具有與常規(guī)飼料相同形狀的飼料并允 許小鼠自由接近制備的飼料來進(jìn)行。這里，細(xì)胞系的每天平均劑量為2-3g細(xì)胞鮮重/小鼠。 對(duì)照組與試驗(yàn)組之間所有的其他條件都相同，并觀察3周癌細(xì)胞的大小。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和細(xì)胞系飼養(yǎng)組每組包括15只動(dòng)物(7只動(dòng)物用于來自形成層的細(xì)胞系，8只動(dòng)物用于來自 原形成層的細(xì)胞系)，并將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)細(xì)胞系給藥三周后癌細(xì)胞尺寸的觀察結(jié)果在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系給藥之后2周，觀察模型小鼠中癌組織的大小。結(jié)果，如圖 3所示，可以觀察到與對(duì)照組相比使用來自形成層的細(xì)胞系和來自原形成層的細(xì)胞系給藥 的組中癌組織的生長受到抑制。而且，如圖4所示，在使用細(xì)胞系給藥之后3周，使用細(xì)胞系給藥的組中癌組織的 體積大約為100mm3，而對(duì)照組顯示癌組織的體積比細(xì)胞系給藥的組的體積大6倍。另外，癌 組織被切除并被拍照，結(jié)果，如圖5所示，對(duì)照組與細(xì)胞系給藥組之間在體積方面存在明顯 差別。測定了切除的癌組織的重量，結(jié)果觀察到，對(duì)照組中癌組織的平均重量為2. 16g，相反 細(xì)胞系給藥組中癌組織的平均重量為0. 21g，大約是對(duì)照組的1/10。因此，可以發(fā)現(xiàn)根據(jù)本 發(fā)明的細(xì)胞系抑制了癌細(xì)胞的常規(guī)生長，表明這些細(xì)胞系具有預(yù)防和治療癌癥的效果。(3)同時(shí)，將癌組織從對(duì)照組和細(xì)胞系給藥組切除，然后在不同放大倍數(shù)下觀察其 內(nèi)部組織。觀察結(jié)果在圖6中顯示。在觀察結(jié)果中，對(duì)照組特征是沒有顯示被稱為凋亡的細(xì)胞死亡區(qū)域，其整個(gè)區(qū)域 中的組織致密，并且正在分裂的細(xì)胞(在圖6(a)中由“b”表示的部分)很大。正在分裂的 細(xì)胞很大的事實(shí)意味著對(duì)照組中的癌組織繼續(xù)生長并膨大。但是，在細(xì)胞系給藥組中，組織不致密，并且大多數(shù)細(xì)胞顯示被稱為凋亡體的核濃 縮(在圖6(b)中由“c”表示的部分)或者分裂成各種組織。這些凋亡體在對(duì)照組中基本 上不出現(xiàn)。另外，非常具有特征性的現(xiàn)象是顯示組織中的血管的紅細(xì)胞染色(在圖6(a)中由 “a”表示的部分)。對(duì)照組顯示許多血管，但細(xì)胞給藥組不顯示血管。在細(xì)胞給藥組中，被預(yù) 測為免疫細(xì)胞的顯示圓形細(xì)胞核的細(xì)胞被顯著地觀察到(在圖6(b)由“d”表示的部分)， 但在對(duì)照組中基本上觀察不到。因此，可以看到本發(fā)明的來自紫杉形成層或者原形成層的細(xì)胞系在腫瘤生長中直 接涉及以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，表明其通過抑制癌組織的正常生長而具有預(yù)防和治療癌癥的效 果。另外，可以看到其抑制在癌發(fā)生中出現(xiàn)的血管形成并增強(qiáng)了免疫細(xì)胞對(duì)癌組織的浸潤 以誘導(dǎo)強(qiáng)免疫活性，由此顯示強(qiáng)的抗癌活性。實(shí)施例5 來自紫杉形成層和原形成層的細(xì)胞系提取物的制備和癌細(xì)胞殺死活性(1)癌細(xì)胞培養(yǎng)人類癌細(xì)胞系口腔癌細(xì)胞系(KB細(xì)胞，Korean Cell Line BankKCLB10017)、肺 癌細(xì)胞系(HCC95，Korean Cell Line Bank KCLB70095)、前列腺癌細(xì)胞系(PC-3，Korean Cell Line Bank KCLB21435)、骨肉瘤細(xì)胞系(U2-0S，Korean Cell Line Bank KCLB30096)、 白血病細(xì)胞系(K-562，Korean Cell Line Bank KCLB10243)、子宮癌細(xì)胞系(HeLa， Korean CellLine Bank KCLB10002)、皮膚癌細(xì)胞系(HT1080，Korean Cell Line BankKCLB 10121)、胰腺癌細(xì)胞系(MIA CaPa-2, Korean Cell Line BankKCLB21420)、乳腺癌細(xì)胞系 (MCF-7, Korean Cell Line BankKCLB30022)、胃癌細(xì)胞系(AGS, Korean Cell Line Bank KCLB21739)，腎癌細(xì)胞系(Caki-1，Korean Cell Line Bank KCLB30046)和肝癌細(xì)胞系 0fepG2，Korean Cell Line Bank KCLB88065)。
小鼠癌細(xì)胞系皮膚癌細(xì)胞系(B16F10，Korean Cell Line BankKCLB8008)和結(jié)腸 癌細(xì)胞系(CT-26，Korean Cell Line Bank KCLB80009)。細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞種類，將每種細(xì)胞系在RPMI或者DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將通過 56°C加熱30分鐘失活的10%的胎牛血清(FBS)、青霉素(100單位/mL)、鏈霉素(100 yg/ mL)和300y g/mL的谷氨酸鹽加入到培養(yǎng)基中。將每種細(xì)胞系在培養(yǎng)基中37°C下在濕度為 95%的5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并以3-4天為間隔在細(xì)胞即將彼此融合之前傳代。在實(shí)驗(yàn) 中，僅僅使用傳代總數(shù)少于30代的細(xì)胞。使用提取物處理并測定細(xì)胞殺死活性1x10s個(gè)細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，并在6小 時(shí)之后當(dāng)細(xì)胞完全附著于6孔板時(shí)，分別使用蒸餾水、甲醇和丙酮提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理 (150,400,800ug/mL的培養(yǎng)物)。然后，在使用提取物處理之后3天測定細(xì)胞死亡的程度。 細(xì)胞的增殖根據(jù)MTT測定(3-[4，5_ 二甲基噻唑-2-yl]-2，5-溴化二苯基四唑)法進(jìn)行測定。將在使用提取物處理的組中細(xì)胞生長的降低程度與未使用任何物質(zhì)處理的對(duì)照 組、具有甲醇和丙酮加入到其中的賦形劑組以及使用來自紫杉的紫杉醇(Sigma)作為抗癌 劑處理的陽性對(duì)照組進(jìn)行比較。將細(xì)胞使用給定時(shí)間內(nèi)加熱到37°C的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌2 次，然后將lmL MTT溶液(5mg/mL，不含酚紅)加入到其中。然后，將細(xì)胞再次培養(yǎng)4小時(shí)。 除去上清，并將產(chǎn)生的甲暨(formazen)沉淀溶解在lmL DMS0中并在570nm測定吸光度。在 使用提取物處理并使用結(jié)晶紫對(duì)附著的存活細(xì)胞進(jìn)行染色后3天通過使用50%的甲醇固 定細(xì)胞來觀察存活細(xì)胞的數(shù)目。(2)通過使用提取物處理得到的試驗(yàn)結(jié)果在分別使用蒸餾水、甲醇和丙酮提取物(800 u g/mL)的處理細(xì)胞之后3天存活的 細(xì)胞將已經(jīng)除去培養(yǎng)基的每種來自紫杉的細(xì)胞系順序溶解在蒸餾水、甲醇和丙酮中以 得到細(xì)胞系提取物，然后使用每種提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果，在大多數(shù)試驗(yàn)細(xì)胞中甲醇 提取物顯示了最高的凋亡活性，并且該凋亡活性類似于使用大約10 y g/mL的紫杉醇處理 的陽性對(duì)照組(圖7的Taxol (紫杉醇))中的凋亡效果。蒸餾水和丙酮提取物也顯示了凋亡效果，但顯示了普遍低于甲醇提取物的凋亡活 性。但是，僅僅使用甲醇和丙酮處理的賦形劑對(duì)照組(圖7的賦形劑)不具有凋亡效果。這 表明細(xì)胞系的提取物含有顯示癌細(xì)胞殺死活性的物質(zhì)。在接著的步驟中，使用各種濃度的 甲醇提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并測定細(xì)胞凋亡的程度。根據(jù)使用各種濃度的甲醇提取物處理的凋亡活性將甲醇提取物以200mg/mL的濃度溶解在甲醇中并分別以150，400和800 y g/mL 的濃度加入lmL的測試細(xì)胞系培養(yǎng)基中。在加入甲醇提取物之后，通過MTT方法以1天為 間隔從第1天到第3天測定細(xì)胞的生長，在添加甲醇提取物三天后，使用甲醇固定存活的細(xì) 胞，然后使用結(jié)晶紫染色。對(duì)于14癌細(xì)胞系的測定結(jié)果在圖8到圖21中示出。在上述結(jié)果中，根據(jù)本發(fā)明的來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系的甲醇提取物 在14癌細(xì)胞系中以濃度依賴的方式顯示了凋亡活性。800 y g/mL的甲醇提取物在所有細(xì)胞 系中顯示了強(qiáng)凋亡活性，并且該凋亡活性與在陽性對(duì)照組中使用的紫杉醇(lOyg/mL)的 凋亡活性類似。但是，在CT-26(圖8)和B16F10(圖13)中，800 y g/mL的甲醇提取物顯示了比陽性對(duì)照組高的凋亡活性。在陽性對(duì)照組中使用的紫杉醇與根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的甲 醇提取物之間的量的差別是由于紫杉醇是純度很高的物質(zhì)，而細(xì)胞系提取物是大量化合物 的混合物的事實(shí)。因此認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的凋亡活性可通過純化步驟進(jìn)一步得到提
尚o實(shí)施例6 來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系是否含有紫杉醇的測定同時(shí)，為了證明根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的抗癌活性不是紫杉醇的活性的事實(shí)，以下 列方式檢查了本發(fā)明的細(xì)胞系中紫杉醇的存在。在該實(shí)施例中使用的紫杉醇(Taxol)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma，并將HPLC水 (J. T. Baker)、乙腈和甲醇經(jīng)0. 2 y m過濾器過濾然后用作流動(dòng)相。將0. 2g在實(shí)施例1中制備的細(xì)胞系在0. 4mL的MeOH中渦旋5分鐘，然后在室溫 下提取1小時(shí)。將提取物13000rpm離心5分鐘然后經(jīng)0. 2 y m過濾器過濾，并通過UPLC定 量分析濾液。在UPLC (Waters，MA, USA)分析中，使用 UPLC BEH C18 柱(100mmx2. 1mm i.d.xl.7um)將提取物與標(biāo)準(zhǔn)品相比較定量分析。作為流動(dòng)相，水和乙腈在梯度洗脫中以 0. 4mL/min的流速被使用，并在UV 227nm的吸光率下進(jìn)行UV檢測。通過UPLC在227nm和280nm處的吸光度分析紫杉醇(taxol)標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果，如圖 22(a)所示，保留時(shí)間(retention time)為4. 67分鐘。另外，據(jù)報(bào)道紫杉醇必須顯示大約 0. 05的UV吸收比(227nm/280nm) (Castor&Tyler 1993)，并且在該實(shí)施例中測定了紫杉醇 標(biāo)準(zhǔn)品，UV吸光度比值A(chǔ)(280nm)/A(227nm)為0. 048。同時(shí)，通過UPLC分析了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系(樣品)在227nm和280nm的吸光度。 結(jié)果，如圖22(b)所示，保留時(shí)間為4. 70分鐘。另外，細(xì)胞系(樣品)提取物被分析，結(jié)果， 227nm和280nm的UV吸光度比值為A(280nm)/A(227nm) = 1. 24，表明細(xì)胞提取物不含有紫杉醇。另外，分析了紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系提取物的PDA波譜。如圖22(c) 和圖22(d)所示，分析結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系不含紫杉醇。實(shí)施例7 藥物制劑的制備制劑1 片劑的制備將在實(shí)施例1中制備的100mg細(xì)胞系提取物與100mg玉米淀粉、100mg乳糖和2mg 硬脂酸鎂混合，并根據(jù)常規(guī)制作藥片的方法將混合物壓縮成片劑。制劑2 膠囊劑的制備將在實(shí)施例1中制備的500mg細(xì)胞系提取物填充到軟凝膠膠囊中制備膠囊劑。制劑3 糖漿劑的制備將在實(shí)施例1中制備的lmg細(xì)胞系與10g異構(gòu)糖、5g山梨醇和適量純凈水混合，并 根據(jù)常規(guī)方法將混合物制備成100mL糖漿劑。制劑4:注射劑的制備將在實(shí)施例1中制備的200mg細(xì)胞系提取物加熱并溶解到200mg的含有聚氧乙烯 氫化蓖麻油的生理鹽水中，由此制備含有濃度為0. 的混合的提取物的注射液。實(shí)施例8 功能性食品的制備功能飲料的制備制備1 將在實(shí)施例1中制備的200mg細(xì)胞系溶解在96mL水中，然后將作為填充劑的500mg維生素C、作為增香劑的檸檬酸和寡糖各lg和作為防腐劑的苯甲酸鈉0. 05g加 入到其中。然后，將純凈水加入到其中，由此制備100mL功能飲料。制備2 將在實(shí)施例1中制備的200mg細(xì)胞系提取物溶解在96mL水中，然后將作 為填充劑的500mg維生素C、作為增香劑的檸檬酸和寡糖各lg和作為防腐劑的苯甲酸鈉 0.05g加入到其中。然后，將純凈水加入到其中，由此制備lOOmL功能飲料。工業(yè)實(shí)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、提取物和培養(yǎng)基來自天然物質(zhì)，與 現(xiàn)有技術(shù)的治療藥物相比具有更小的副作用，對(duì)人體安全，在腫瘤生長中直接涉及以誘導(dǎo) 癌細(xì)胞死亡，并顯示了抑制在癌發(fā)生(carcinogenesis)中出現(xiàn)的血管生成的抗癌活性。因 此，它們對(duì)于預(yù)防、治療和環(huán)節(jié)癌癥來說是有用的。雖然已經(jīng)參照特定特征對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說容易想 到的是該描述僅僅用于優(yōu)選實(shí)施方式而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍 由隨附的權(quán)利要求書及其等同物限定。
權(quán)利要求
一種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其含有選自下組的一種或多種的，該組包括細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基，所述細(xì)胞系來自紫杉形成層或原形成層，并具有下列特征(a)其形態(tài)學(xué)特征為具有大量的液泡；(b)其處于天然未分化的狀態(tài)；并且(c)其為同質(zhì)的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述細(xì)胞 系的其他特征為(a)其在懸浮培養(yǎng)過程中以單個(gè)細(xì)胞存在；(b)與來自紫杉形成層以外的 其他組織的細(xì)胞系相比，其具有較高的生長速度并可被穩(wěn)定培養(yǎng)；以及(c)與來自紫杉形 成層以外的其他組織的細(xì)胞系相比，其在生物反應(yīng)器中具有對(duì)剪切應(yīng)力較低的敏感性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述細(xì)胞 系使用包括下列步驟的分離方法得到(a)得到含有紫杉形成層或原形成層的組織；(b)通過培養(yǎng)得到的含有形成層或原形成層的組織，誘導(dǎo)從形成層或原形成層增殖形 成層層或原形成層層，并誘導(dǎo)從形成層或原形成層以外的其他組織增殖的無定形愈傷組織 層；以及(c)收集來自形成層層或原形成層層的細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，在所述 其中步驟(c)通過在培養(yǎng)基中增殖組織然后收集增殖的細(xì)胞來進(jìn)行，所述培養(yǎng)基含有 3-5wt %的粗糖或糖以及至少一種選自下組的物質(zhì)，該組包括甲基茉莉酮酸酯、真菌提取 物、細(xì)菌提取物、酵母提取物、殼聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水楊酸、花生 四烯酸、STS、mevalonalonate N_benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯禾丨』、馬尿酸、 硝酸銫銨、AgN03、硫酸氧釩、p-氨基苯甲酸、油菜素類固醇、藻酸鈉和醋酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在于，所述提取 物使用選自下組的溶劑得到，包括蒸餾水、乙醇、丙酮、DMS0以及它們的混合溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意之一所述的用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其特征在 于，所述癌癥選自下組，包括結(jié)腸癌、口腔癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宮癌、皮膚 癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌和肝癌。
7.一種用于預(yù)防或改善癌癥的功能食品，其特征在于，含有選自下組的一種或多種，該 組包括細(xì)胞系、其溶解產(chǎn)物、其提取物以及其培養(yǎng)基，所述細(xì)胞系來自紫杉的形成層或原形 成層并具有如下特征(a)其形態(tài)學(xué)特征為具有大量的液泡；(b)其處于天然未分化的狀態(tài)；并且(c)其為同質(zhì)的細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或改善癌癥的功能性食品，其特征在于，所述細(xì)胞 系的其他特征為(a)其在懸浮培養(yǎng)過程中以單個(gè)細(xì)胞存在；(b)與來自紫杉形成層以外的 其他組織的細(xì)胞系相比，其具有較高的生長速度并被穩(wěn)定培養(yǎng)；以及(c)與來自紫杉形成 層以外的其他組織的細(xì)胞系相比，其在生物反應(yīng)器中具有對(duì)剪切應(yīng)力較低的敏感性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于預(yù)防或改善癌癥的功能性食品，其特征在于，所述細(xì)胞系使用包括下列步驟的分離方法得到(a)得到含有紫杉形成層或原形成層的組織；(b)通過培養(yǎng)得到的含有形成層或原形成層的組織，誘導(dǎo)從形成層或原形成層增殖形 成層層或原形成層層，并誘導(dǎo)從形成層或原形成層以外的其他組織增殖的無定形愈傷組織 層；以及(c)收集來自形成層層或原形成層層的細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，所述組合物含有作為活性成分的來自紫杉形成層或原形成層的細(xì)胞系；其溶解產(chǎn)物；其提取物或者其培養(yǎng)基。與常用抗癌劑相比，所述細(xì)胞系、溶解產(chǎn)物、提取物和培養(yǎng)基具有更小的副作用，在癌癥生長中直接涉及以誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，并以抑制在癌發(fā)生中出現(xiàn)的血管生成而顯示抗癌活性。因此，所述細(xì)胞系、溶解產(chǎn)物、提取物和培養(yǎng)基對(duì)于預(yù)防、治療和緩解癌癥來說是有用的。
文檔編號(hào)A61K36/13GK101842112SQ200880111207
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日
發(fā)明者吳日錫, 樸重鉉, 李大熙, 李恩景, 李政昶, 林敏政, 陳榮雨 申請(qǐng)人:云火公司