專利名稱：：穩(wěn)定蛋白質(zhì)的輔劑的制作方法穩(wěn)定蛋白質(zhì)的輔劑
背景技術(shù)：
：隨著完善的基因重組技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的蛋白質(zhì)分子被作為醫(yī)用藥物進行研究和開發(fā)。尋找穩(wěn)定的蛋白制劑配方在蛋白質(zhì)分子發(fā)展成臨床藥物的過程中是極為重要的一個步驟。為此，人們就蛋白質(zhì)穩(wěn)定性進行了大量的研究工作，這些研究信息在文獻中很容易獲取。(a.Pearlman，R.andWang，Y.J.，1996.Formulation,characterization,andstabilityofproteindrugs.PlenumPress,NewYork.b.Chang，B.S.andHershensonS.，Chapter1，PracticalApproachestoProteinFormulationDevelopment,RationalDesignofStableProteinFormulations,editedbyCarpenterandManning.KluwerAcademic&PlenumPublishers,NewYord，2002)。然而，基于蛋白質(zhì)分子的根本特性，大多數(shù)蛋白質(zhì)分子在各種制劑中一般不會只以其天然形式存在?；蚨嗷蛏俚兀鞍踪|(zhì)會與一些輔劑一道制成溶液制劑或固體制劑(凍干、噴霧干燥、噴霧凍干)，以優(yōu)化在生產(chǎn)和儲存時蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性。除了各種化學(xué)反應(yīng)之外，例如，二硫鍵異構(gòu)化、脫酰胺反應(yīng)、肽鍵裂解、氧化作用，大部分不穩(wěn)定現(xiàn)象與非共價的聚集有關(guān)，這些聚集通常為免疫原性的，有時會產(chǎn)生沉淀。在溶液制劑中，酸堿度、離子添加劑、氨基酸、表面活性劑、蛋白質(zhì)濃度、原料純度都是可以調(diào)配并改良蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定性的因素。在固體制劑中，蛋白質(zhì)分子通常與緩沖溶液試劑、鹽、大分子試劑(如甘露醇、蔗糖、海藻糖、檸檬酸等)配制在一起，使蛋白質(zhì)分子互相分開，從而減少蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生。據(jù)報道，分子伴侶也能緩解或阻止蛋白質(zhì)分子聚集(AnatBen-Zvi，PaoloDeLosRios，Giova皿iDietler，PierreGoloubinoff，ActiveSolubilizationandRefoldingofStableProteiAggregatesByCooperativeUnfoldingActionoflndividualHsp70Chaperones，TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.279，No.36，IssueofS印tember3，37298-37303，2004)。另外，還有報道稱剛果紅結(jié)合于FK506親合蛋白和P-淀粉狀蛋白多肽能阻止淀粉樣纖維化的發(fā)生(Science,306，865，2004)。以胰島素為例，有各種方法用來減緩胰島素的纖維化變性過程，從而扼止胰島素在溶液中產(chǎn)生聚集體沉淀。在胰島素溶液中添加鋅可以使六個胰島素與兩個鋅離子螯合成胰島素六聚復(fù)合體，這種復(fù)合體比胰島素單體要穩(wěn)定得多。苯酚，間甲基苯酚也有利于胰島素的穩(wěn)定，諾和諾德(NovoNordisk)的科學(xué)家SvendHavelund通過優(yōu)化各種添加劑的配比增加肺吸胰島素溶液的穩(wěn)定性，取得一定進步。(USpatent6，211，144，and6，489，292)安萬特(AventisPharama)的科學(xué)家PeterBoderke用鋅、表面活性劑吐溫-20、吐溫-80、泊洛沙姆171(Poloxamer171)使得胰島素產(chǎn)生纖維沉淀之前的穩(wěn)定時間延長了五至七倍。(USpatent6，960，561B2)據(jù)發(fā)現(xiàn)，胰島素單體應(yīng)用于肺部給藥制劑時比胰島素鋅復(fù)合體更具優(yōu)越性。美國公司MannkindCorporation的科學(xué)家SolomonSteiner等利用哌嗪二酮制備了無鋅胰島素肺吸粉劑(USPatent6，652885B2)，美國公司Aradigm的科學(xué)家IgorConda等制備了賴脯胰島素水霧噴劑。4這些單體胰島素溶解性更好，通過肺膜吸收更快。利用聚乙二醇進行化學(xué)修飾也能改良胰島素的穩(wěn)定性，但通常會由于化學(xué)修飾而降低其生物活性。發(fā)明概要本發(fā)明涉及一類輔劑在蛋白質(zhì)制劑(包括治療性蛋白)制備中的應(yīng)用，該蛋白質(zhì)制劑可以是溶液，膠體或固體，其目的在于減少甚至完全阻止蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及一類輔劑在生產(chǎn)過程中的應(yīng)用，該類輔劑在生產(chǎn)過程中可使得蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。本發(fā)明還涉及該類輔劑在蛋白質(zhì)制劑大量儲存中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及增加蛋白質(zhì)產(chǎn)品(包括治療性蛋白)貨架存放的穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明還涉及增加蛋白質(zhì)的溶解度和使得固體蛋白產(chǎn)品重新制備成溶液更加容易的方法。本發(fā)明還涉及該類輔劑與糖類輔劑(如葡萄糖)一起在蛋白質(zhì)制劑制備中的應(yīng)用，同時還涉及該類輔劑替代糖類輔劑以減低高濃度溶液粘度的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的還有—種利用一類帶有電荷或大體積基團的羰基化合物來減緩蛋白質(zhì)聚集的新的配制方法。羰基功能團與蛋白質(zhì)分子表面的氨基形成可逆的席夫鍵(Schiffbond)，所帶電荷或大體積基團改變蛋白質(zhì)表面特性?！愑糜诘鞍踪|(zhì)制劑的輔劑化合物，具有以下通用化學(xué)結(jié)構(gòu)。除此以外，只要帶有一個或多個羰基，能與蛋白質(zhì)形成席夫堿(Schiffbase)，并且?guī)в姓姾?、負電荷、大體積基團的中的一種或多種，其它結(jié)構(gòu)化合物也能提供所需的結(jié)構(gòu)特征并作為合適的輔劑。其中參在一定制劑pH值，尤其是接近生理pH值的情況下，或者在制劑產(chǎn)品較穩(wěn)定的pH附近，&或R2帶有所需的正電荷或/和負電荷；"m"是1、或2、或3、或4、或5。參或者，&或12帶有大體積基團，包括糖、聚乙二醇、肽、核酸、無美拉德反應(yīng)(Maillardreaction)效力的多羥基基團。參R2是氫原子，或烴基，或芳香基，"n"是1，或2，或3。參&或R2帶有一個或多個羰基以進一步加固席夫堿的形成。參X是連接&和R2的基團，X可以是含碳的直鏈、或環(huán)、或芳香基團、或化學(xué)鍵?！惥哂猩鲜龌瘜W(xué)特征的化合物在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程，蛋白質(zhì)制劑制備中的應(yīng)用，旨在減緩或防止可溶或不可溶蛋白質(zhì)形成聚集體?！N利用上述化合物的蛋白制劑配制方法，包括液體和固體制劑，其中，固體制劑的制備途徑包括但不限于結(jié)晶，沉淀(溫差沉淀或溶劑置換沉淀)，噴霧干燥，噴霧凍干，凍干?！N應(yīng)用上述化合物的蛋白制劑配置方法，應(yīng)用時可以單獨使用，組合使用，或與其它適合的輔劑一起使用。—種應(yīng)用上述化合物的蛋白制劑配置方法，旨在保護治療性蛋白試劑或延長其有效期。該類輔劑在蛋白質(zhì)純化和生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。該類輔劑在蛋白質(zhì)大批量儲存中的應(yīng)用。該類輔劑替代糖類輔劑(如葡萄糖、海藻糖等)在蛋白制劑中的應(yīng)用，以減低蛋白溶液和/或重新配置溶液的粘度和/或泡沫產(chǎn)生。利用上述輔劑制備穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑的方法，旨在延長冷凍和/或非冷凍環(huán)境下儲存時間，以便更容易重新配制蛋白試劑。利用上述輔劑制備穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑的方法，旨在增加蛋白質(zhì)的溶解度，以便藥物使用前更容易重新配制固體制劑。利用上述輔劑制備穩(wěn)定的胰島素制劑中的方法，包括含鋅胰島素、無鋅胰島素、胰島素類似物如賴脯胰島素、含鋅和無鋅天冬胰島素，胰島素制劑可以是液體或固體，給藥方式可以是鼻腔噴霧、肺吸噴霧、肺吸粉劑、注射，注射方式包括但不限于使用注射器、筆式注射器、帶泵注射器。利用上述輔劑配置穩(wěn)定的胰島素液體制劑的方法，旨在冷凍和/或非冷凍環(huán)境中延長儲存時間。利用上述輔劑制備穩(wěn)定的胰島素固體制劑的方法，旨在冷凍和/或非冷凍環(huán)境中延長儲存時間，并方便固體制劑在臨用前的重新配置。圖1A-1C為磷酸吡卩多醛(Pyridoxalphosphate,代號X2)對甲醇誘發(fā)牛血清蛋白聚集體的抑制作用的體積排阻高效液相色譜(SECHPLC)圖。圖2A-2D為有無5-甲酰-l，3-苯二磺酸(5-formy1-1，3-benzenedisulfonicacid，代號X5)對孵育牛血清蛋白影響的體積排阻高效液相色譜圖。圖3為制劑A、B、C和諾合靈R(NovolinR)室溫保存初始降糖藥效示意圖。圖4為制劑A、B、C和諾合靈R室溫保存一星期降糖藥效示意圖。圖5為制劑A、B、C和諾合靈R室溫保存二星期降糖藥效示意圖。圖6為制劑A、B、C和諾合靈R室溫保存四星期降糖藥效示意圖。圖7為制劑A、B、C和諾合靈R室溫保存六星期降糖藥效示意圖。發(fā)明詳述蛋白質(zhì)分子形成聚集體主要是通過分子表面疏水區(qū)域之間的相互親和而完成的。許多用于蛋白質(zhì)制劑的輔劑，例如糖類、氨基酸，一般是通過氫鍵在蛋白質(zhì)分子表面形成一層"外衣"，從而形成能使蛋白質(zhì)分子分離的障礙。通過這種方式，蛋白質(zhì)聚集能夠得到減緩。另外，通常還可通過優(yōu)化PH值來改變蛋白質(zhì)分子表面的電荷分布特性，從而影響蛋白質(zhì)聚集過程。由于許多蛋白質(zhì)和多肽序列中往往會有一定數(shù)量的賴氨酸殘基，賴氨酸的側(cè)鏈帶有一個氨基。在生理PH值或pH值更低的情況下，這些賴氨酸側(cè)鏈多半被質(zhì)子化并帶有正電荷，與N末端氨基酸一樣。本發(fā)明就是針對賴氨酸和N末端氨基酸的存在，利用一類輔劑改變蛋白質(zhì)分子的表面特性，該類輔劑從未在蛋白質(zhì)制劑中使用過?；诨瘜W(xué)和藥學(xué)制劑領(lǐng)域的常識，這些輔劑通常被認為是安全的。第一條途徑是使得賴氨酸側(cè)鏈帶有一個或多個電荷，最好是負電荷。這樣便改變了蛋白質(zhì)分子表面的電荷分布，增加了分子間的靜電排斥，增加了表面的親水性，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解度。為了實現(xiàn)這種分子表面的電荷修飾，而且要維持蛋白質(zhì)分子的化學(xué)完整性，可逆的席夫堿形成可用于促使輔劑在蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)合。如果輔劑分子帶有一個或多個電荷，做好是負電荷，輔劑設(shè)定為優(yōu)化的濃度，蛋白質(zhì)表面會被有效的改變。負電荷有可能來自羧酸、磺酸、次磺酸、硫酸鹽、磷酸、磷酸鹽、肽、核酸、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素，等等。聚乙酰氨基葡糖、殼聚糖、含有組氨酸和精氨酸的多肽、一些表面活性劑能提供正電荷。以下列有若干化合物以闡述這類輔劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，但有用的試劑并不限于這勝。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發(fā)明涉及的輔劑包括2_甲酰苯磺酸、磷酸吡哆醛、4_甲酰-l，3-苯二磺酸，4-甲酰苯甲酸、3_甲酰_4-羥基苯甲酸、4-甲酰-3-羥基苯甲酸、苯乙醛酸、乙醛酸、丙酮酸。第二條途徑是使得賴氨酸側(cè)鏈帶有一個大體積水溶性的基團，用來阻擋蛋白質(zhì)分子相互靠近。為了獲得這種表面修飾作用而不從化學(xué)方面改變蛋白質(zhì)分子，可逆的席夫堿形成可用于促使輔劑在蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)合，同時輔劑分子帶有一個大體積側(cè)鏈，例如聚二乙醇、糖、寡糖、多糖、肽、核酸、聚乙酰氨基葡糖、脫乙酰氨基葡糖、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素，等等。本發(fā)明提供的的用于蛋白質(zhì)制劑的輔劑化合物具有以下通用化學(xué)結(jié)構(gòu)。除此以外，只要帶有一個或多個羰基，能與蛋白質(zhì)形成席夫堿，并且?guī)в姓姾?、負電荷、大體積基團的中的一種或多種，其它結(jié)構(gòu)化合物也能提供所需的結(jié)構(gòu)特征作為合適的輔劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中參在一定制劑pH值，尤其是接近生理pH值的情況下，或者在制劑產(chǎn)品較穩(wěn)定的pH附近，&或R2帶有所需的正電荷或/和負電荷，"m"是1、或2、或3、或4、或5。參或者，&或12帶有大體積基團，例如糖、聚乙二醇、肽、核酸、無美拉德反應(yīng)(Maillardreaction)效力的多羥基基團。參R2是氫原子，或烴基，或芳香基，"n"是1，或2，或3。參&或R2帶有一個或多個羰基以進一步加固席夫堿的形成。參"X"是連接R1和R2的基團，X可以是含碳的直鏈、或環(huán)、或芳香基團、或化學(xué)鍵。實施例實施例1抑制熱誘導(dǎo)牛血清蛋白聚集體的生成將50微升牛血清蛋白原液(BSA，35X，水溶液，含0.85X氯化鈉，Sigma)用450微升磷酸鈉緩沖溶液(PBS，50mM，pH7.4，0.85%NaCl)稀釋成濃度為35mg/ml的BSA溶液。用純水(HPLC級)另配濃度為75mg/ml的輔劑2-甲酰苯磺酸納(Aldrich，75%)溶液，用稀鹽酸將pH值調(diào)為8。將50微升BSA(35mg/ml)用800微升PBS緩沖液(pH7.4)稀釋，添加150微升輔劑溶液使得[BSA]=1.75mg/ml，[輔劑]=11.25mg/ml。另配一份試樣，不加輔劑。兩份樣品加至帶蓋玻璃試管，65t:孵育。在0分鐘和40分鐘后，各取少量樣品用于體積排阻高效液相分析，分析時用PBS緩沖液(50mM，pH7.4，0.85%NaCl)沖洗。不含輔劑的樣品40分鐘后有超過50%的BSA變成聚積體，而加有輔劑的樣品40分鐘后沒有明顯的BSA聚積體。加有輔劑的樣品在孵育60分鐘后繼續(xù)分析，此時聚集體開始顯現(xiàn)，但數(shù)量不顯著。高效液相色譜分析的條件色譜柱TSKgelG3000SW，7.5x300mm，TosohBiosciences,零件號碼05789;流動相是磷酸納緩沖液(50mM，pH7.4，NaCl0.85%);流速為1.0m1/分鐘；紫外檢測280nm;儀器為BuckChromBLC_20。實施例2減緩甲醇誘導(dǎo)牛血清蛋白聚集體的生成50微升牛血清蛋白(BSA，35X，含0.85%氯化鈉，Sigma)用50微升磷酸鈉緩沖溶液(50mM，pH7.4，不含氯化鈉)和50微升純水(HPLC級)稀釋。另一份試樣用同樣方法制備，但將50微升分析純水替換為50微升含有磷酸吡哆醛的輔劑溶液(圖1代號X2，lOOmg/ml水溶液，pH7.4，)。在分別裝有上述兩種樣品的兩個試管中再分別加入350微升聚乙二醇水溶液(75%，分子量3400)，使得混合物變渾濁，然后加入500微升的甲醇(HPLC級)。離心后收集沉淀并重新溶于磷酸鈉緩沖溶液，再作SEC高效液相色譜分析。不含輔劑的樣品約有三分之二的BSA變成聚集體，而加有輔劑的樣品只有明顯的約四分之一的BSA聚集體。實施例3減緩叔丁醇誘導(dǎo)牛血清蛋白聚集體的生成在三支含有50微升牛血清蛋白(BSA，35X，含0.85%氯化鈉)與50微升磷酸緩沖溶液(50mM，pH7.4)的試管中，分別加入10微升水，10微升的2-甲酰苯磺酸鈉(75mg/ml，pH8.0)，IO微升的磷酸妣B多醛(100mg/ml，pH7.4)。在這三個試管中再分別加入500微升聚乙二醇溶液(75%，分子量3400)，然后離心使之沉淀，收集上清液。此時上清液中BSA處于飽和狀態(tài)。在此三個上清液中加入500微升叔丁醇而產(chǎn)生新的沉淀。離心收集沉淀，并用叔丁醇洗滌兩次(每次750微升)，再重新溶于磷酸鈉緩沖溶液(50mM磷酸鈉，pH7.4，0.85%氯化鈉)，作SEC高效液相色譜分析。不含輔劑的樣品約有75%的BSA變成聚積體，而加有輔劑2-甲酰苯磺酸鈉的樣品約有60%的BSA聚積體，而加有輔劑磷酸吡哆醛的樣品有少于50X的BSA聚積體。實施例44-甲酰-1，3-苯二磺酸抑制熱誘導(dǎo)牛血清蛋白聚集體的生成用牛血清蛋白溶液(BSA，350mg/ml，含0.85X氯化鈉，SigmaAldrich)和輔劑4-甲酰-l，3-苯二磺酸原液(SigmaAldrich，圖2代號X5，400mg/ml，pH7.4，用100mM磷酸鈉緩沖液配制)配制含有不同濃度輔劑的BSA溶液試樣(見表l)，最終體積0.5ml，放置于帶蓋玻璃試管。所有樣品放入設(shè)定為65t:的保溫裝置中。表14-甲酰-1，3-苯二磺酸對BSA的穩(wěn)定效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗表明，即使在低濃度(12.5mg/ml)，輔劑4_甲酰-l，3-苯二磺酸能阻止BSA(262.5mg/ml)變?yōu)楣腆w。取10微升上述澄清溶液，各用l.O毫升磷酸緩沖溶液(pH7.4)稀釋，另用同樣的緩沖液配制BSA對照樣品(2.5mg/ml)。5種稀釋樣品各取100微升作SEC高效液相色譜分析(色譜柱TSKgelG3000SW，5mmx300mm)，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4，含0.85%氯化鈉)沖洗，流速為1.Oml/min，紫外檢測280nm，HPLC圖譜如圖2所示。本試驗在pH6.8條件下重復(fù)，有輔劑的BSA溶液(12.5mg/ml)仍為澄清溶液，而沒有輔劑的BSA溶液出現(xiàn)固體。實施例5其它輔劑(pH6.2)用蔗糖作為對照輔劑，試驗各種輔劑阻止BSA形成膠體的能力，試樣配制在丙二酸緩沖溶液中(25mM)，65t:孵育60分鐘。受試輔劑有蔗糖、4_甲酰_1，3_苯二磺酸，4-甲酰苯甲酸、苯乙醛酸、乙醛酸。(見表2、表3、表4、表5、表6)表2蔗糖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗表明輔劑蔗糖對牛血清蛋白形成膠體或固體沒有很強的抑制作用。表34_甲酰-l，3-苯二磺酸的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表44-甲酰苯甲酸對熱誘導(dǎo)下牛血清蛋白聚集體生成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5苯乙醛酸對熱誘導(dǎo)下牛血清蛋白聚集體生成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6乙醛酸對熱誘導(dǎo)下牛血清蛋白聚集體生成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表3至表6可以看出，即使在低濃度，以上四種輔劑對于牛血清蛋白形成膠體或固體都有很強的抑制作用實施例6抑制熱誘導(dǎo)肌紅蛋白聚集體的生成(65°C)將肌紅蛋白(馬骨骼肌，Sigma)溶解于碳酸氫鈉緩沖溶液(100mM，pH9.0)配制成濃度為10mg/ml的備用溶液。500微升該蛋白溶液與100微升的各種輔劑混合制成一系列蛋白濃度相同、輔劑濃度不同的試樣。這些在密封試管中的試樣被同時放進預(yù)熱至65°C的加熱裝置中加熱，持續(xù)孵育一段時間，并觀察纖維狀沉淀(PPT)的形成情況。試驗結(jié)果表明4-甲酰-l，3-苯二磺酸最能阻止肌紅蛋白形成纖維狀沉淀。表7輔劑對減緩熱誘導(dǎo)下馬肌紅蛋白聚集體生成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例7磷酸吡眵醛抑制胰島素纖維化(pH7.4)用磷酸緩沖液(50mM，pH7.4，無氯化鈉)配制無鋅牛胰島素溶液(濃度為1.2mg/ml)。兩份2.0毫升無鋅牛胰島素溶液分別轉(zhuǎn)移到兩個玻璃試管(沸水消毒)，其中一個試管加入O.IO毫升的水，另一個試管加入O.IO毫升磷酸吡哆醛(100毫克/毫升，水溶液，pH7.4)。兩個試管加蓋后放在旋轉(zhuǎn)器上并移到39t:的恒溫箱里讓試管上下顛翻(每分鐘十二次)。不含磷酸吡哆醛的試樣在三小時后變的渾濁，而含磷酸吡哆醛的試樣在五星期后仍然十分澄清。實施例8磷酸吡眵醛抑制胰島素纖維化(pH7.0)用磷酸緩沖液(50mM，pH7.4，無氯化鈉)配制無鋅牛胰島素溶液(濃度為1.2mg/ml)。兩份2.0毫升無鋅牛胰島素溶液分別轉(zhuǎn)移到兩個玻璃試管(沸水消毒)，然后分別再加入0.10ml水。另取4.0毫升無鋅牛胰島素溶液，加入0.2毫升磷酸吡眵醛(100毫克/毫升，pH7.4)，調(diào)至pH7.0，再平分到兩支玻璃試管(沸水消毒)。將此四個試樣加蓋后放在旋轉(zhuǎn)器上并移到39t:的恒溫箱里讓試管上下顛翻(每分鐘十二次)。不含磷酸吡哆醛的兩個試樣在五小時后就變的渾濁，而含磷酸吡哆醛的兩個試樣在四星期后仍保持清澈溶液狀。實施例9不同濃度磷酸吡眵醛抑制胰島素纖維化(pH7.4)取無鋅牛胰島素(50毫克)溶于0.5毫升稀鹽酸(0.10N)，并用0.1N的NaOH中和直至變的渾濁，再重新澄清。然后在胰島素溶液中加入0.667毫升磷酸吡哆醛溶液(167毫克/毫升，pH7.0，水溶液)，用稀NaOH調(diào)pH至7.4，再加水(HPLC級)至2.5毫升。取此少量溶液用水稀釋成胰島素濃度為2.0毫克/毫升、5.0毫克/毫升、10毫克/毫升、15毫克/毫升的四個1.0毫升樣品溶液，再加最后剩余的0.5ml胰島素-磷酸吡哆醛(20毫克/毫升)，共五個試樣。將此五個試樣加蓋后放在旋轉(zhuǎn)器上并移到39t:的恒溫箱里讓試管上下顛翻(每分鐘十二次)。所有試樣在三星期后仍保持清澈溶液狀。實施例10三種含有新輔劑的無鋅重組人胰島素制劑的動物研究取無鋅重組人胰島素(27毫克)，溶于含有0.1毫升鹽酸(0.10N)的1.0毫升水(HPLC級)。在此溶液中加入2.4毫升磷酸鈉緩沖液(0.IOM，pH7.0)，另加3滴氫氧化鈉(0.05N)后成清澈溶液，加水至9.0毫升。將此溶液分成三份A、B、C，每份3毫升。A份與0.166毫升4-甲酰-l，3-苯二磺酸(0.36M，pH6.7)，調(diào)pH至6.9，并加水至6.0毫升。B份與O.60毫升乙醛酸(0.10M，pH7.0)混合，調(diào)pH至6.9，并加水至6.O毫升。C份與0.60毫升3-甲酰-4-羥基苯甲酸(0.10M，pH6.8)和幾滴氫氧化鈉(0.05N)混合，調(diào)pH至6.9，并加水至6.0毫升。所有三份制劑(制劑A，B，C)都經(jīng)過0.2微米過濾膜，并室溫保存，用諾和靈(Novolin，整個試驗中儲存于2-8t:)和生理鹽水作為對照進行動物試驗。這三個新制劑(制劑A，B，C)和諾和靈R在給藥前用生理鹽水稀釋至0.91單位/毫升，給藥劑量為9.1單位/公斤。每個藥劑給八只小鼠進行背部皮下注射，注射前取血和注射后不同時間點取血樣，保用標準Monroe方法測定血糖濃度(mM)。表8制劑室溫保存初始的降糖活性(血糖濃度，mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表10制劑室溫保存兩周后的降糖活性(血糖濃度，mM)13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表11制劑室溫保存四周后的降糖活性(血糖濃度，mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表12制劑室溫保存六周后的降糖活性(血糖濃度，mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例11乙醛酸抑制胰島素纖維化用磷酸緩沖液(50mM，pH7.0，無氯化鈉)配制無鋅重組人胰島素溶液，濃度為1.Omg/ml，其中一個試樣含有20mM的乙醛酸)。用磷酸鈉緩沖液稀釋醫(yī)用諾和銳(NovoRapid，NovoNordisk，100單位/毫升)至25單位/毫升，另配相同稀釋醫(yī)用諾和銳試樣但另加乙醛酸(20mM)。取醫(yī)用優(yōu)泌樂25(Humalog25，共100單位/毫升，EliLilly)離心收集上清液(約含賴脯胰島素25單位/毫升)，再用水和乙醛酸混合成約含賴脯胰島素20單位/毫升，乙醛酸為0和20mM的兩個試樣。每一份樣品(1.0ml)轉(zhuǎn)移到帶蓋的10ml試管，然后放在旋轉(zhuǎn)器上在室溫讓試管上下顛翻(每分鐘十二次)。不含乙醛酸的三個試樣在兩天內(nèi)都變渾濁，而含乙醛酸的三個試樣在四星期后仍保持清澈溶液狀。實施例12乙醛酸抑制含鋅胰島素纖維化如同實施例ll，但采用醫(yī)用優(yōu)泌林R(IOO單位/毫升)，在旋轉(zhuǎn)器上，不含乙醛酸的試樣在兩天內(nèi)都有明顯沉淀，而含乙醛酸的試樣在六天后才變混濁。權(quán)利要求一種減少或防止蛋白質(zhì)聚集體產(chǎn)生的方法，包括將帶有電荷或大體積基團的羰基化合物與蛋白質(zhì)進行反應(yīng)并與蛋白質(zhì)表面的氨基形成可逆的席夫鍵的步驟。2.—類具有分子式I的化合物其中&在生理pH值或臨近該pH值的條件下帶有正電荷或負電荷；或者&為含有一個或多個羰基的基團、糖、聚乙二醇、肽、核酸、無美拉德反應(yīng)效力的多羥基基團中的一種；m為1，或2，或3，或4，或5;X為含碳的直鏈、或環(huán)、或芳香基團、或化學(xué)鍵；R2在生理pH值或臨近該pH值的條件下帶有正電荷或負電荷；或者R2或為含有一個或多個羰基的基團、糖、聚乙二醇、肽、核酸、無美拉德反應(yīng)效力的多羥基基團、烴基、芳香基、氫原子中的一種；n是1，或2，或3。3.—種蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)方法，包括將權(quán)利要求2所述的化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)的步驟。4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)方法，還包括用結(jié)晶、沉淀、噴霧烘干、噴霧凍干、凍干制備固體蛋白質(zhì)制劑的步驟。5.—種蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)方法，包括將蛋白質(zhì)與多種權(quán)利要求2所述的化合物進行反應(yīng)或者將蛋白質(zhì)與一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物和其它適合的輔劑同時進行反應(yīng)的步驟。6.—種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在保護治療性蛋白藥物或延長治療性蛋白藥物的保質(zhì)期中的應(yīng)用。7.—種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在蛋白質(zhì)的純化或蛋白質(zhì)制劑的生產(chǎn)中的應(yīng)用。8.—種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在蛋白質(zhì)制劑的大批量保存中的應(yīng)用。9.一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在降低蛋白質(zhì)溶液粘度、減少蛋白質(zhì)溶液泡沫、蛋白質(zhì)溶液重新配制中的應(yīng)用。10.—種含有蛋白質(zhì)和一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑，其中，所述的制劑在冷凍和非冷凍條件下長時間保持穩(wěn)定。11.一種含有蛋白質(zhì)和一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑，其中，所述的蛋白質(zhì)是可溶的或難溶的。12.—種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在藥物臨用前將固體制劑重新配置成液體制劑中的應(yīng)用。13.—種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑，含有有鋅胰島素、無鋅胰島素、有鋅或無鋅的胰島素類似物中的一種，還含有一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述制劑為液體或固體。14.如權(quán)利要求13所述的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑，其中，制劑的給藥方式包括鼻腔噴霧、肺吸噴霧、肺吸粉劑、注射。15.—種穩(wěn)定的胰島素液體制劑，含有胰島素和一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述的胰島素液體制劑在冷凍和非冷凍條件下長時間保持穩(wěn)定。16.—種穩(wěn)定的胰島素固體制劑，含有胰島素和一種或多種權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述的胰島素液體制劑在冷凍和非冷凍條件下長時間保持穩(wěn)定。17.—種或多種權(quán)利要求2所述的化合物在臨用前將胰島素固體制劑重新配置成液體制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明揭示了一種將一類輔劑應(yīng)用于蛋白質(zhì)制劑的方法，以減緩或消除液體或固體中的蛋白質(zhì)聚集的生成。這類化合物帶有羰基，能與蛋白質(zhì)表面的氨基形成席夫堿，還帶有能使蛋白質(zhì)分離的基團。文檔編號A61K31/192GK101795680SQ200880111421公開日2010年8月4日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日發(fā)明者楊國漢申請人:波蘇蛋白試劑公司