專(zhuān)利名稱(chēng)：流感病毒抗原送遞載體和構(gòu)建體的制作方法
流感病毒抗原送遞載體和構(gòu)建體
背景技術(shù)：
流感是指由流感病毒引起的疾病或感染的概括性術(shù)語(yǔ)。流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒成員，包括兩個(gè)屬A型和B型流感病毒，以及C型流感病毒。A 型、B型和C型流感病毒基于每種病毒類(lèi)型專(zhuān)有的內(nèi)部核蛋白和基質(zhì)蛋白進(jìn)行區(qū)分。A型流 感病毒天然能夠感染一系列動(dòng)物物種，包括人、豬、鳥(niǎo)類(lèi)、海豹和馬。然而，B型流感病毒僅 感染人，而C型流感病毒可感染人和豬。A型流感病毒還被進(jìn)一步分類(lèi)成亞型，由表面糖蛋 白、血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)的抗原性決定。在歷史上，A型流感病毒的人感染由3種血凝素亞型(H1、H2和H3)和2種神經(jīng)氨 酸酶亞型(m和N2)引起；最近還報(bào)道了以前僅局限于鳥(niǎo)類(lèi)的亞型H5、H7和H9導(dǎo)致的人感 染。迄今為止已經(jīng)鑒定了總共16種不同血凝素和9種神經(jīng)氨酸酶的A型流感病毒亞型；這 些都流行于鳥(niǎo)類(lèi)。像人一樣，豬和馬局限于更窄的亞型范圍。A型和B型病毒體是多形結(jié)構(gòu)，球形實(shí)例的直徑為80-120nm，而細(xì)絲形式的長(zhǎng)度最 長(zhǎng)可達(dá)300nm。每個(gè)顆粒有大約500個(gè)表面刺突糖蛋白(通常以4_5個(gè)血凝素蛋白比1個(gè) 神經(jīng)氨酸酶的比例)嵌入源自宿主的脂雙層膜中。在該膜內(nèi)有跨膜離子通道蛋白M2，而結(jié) 構(gòu)蛋白Ml位于所述雙層之下。在病毒核心中，反義單鏈RNA與病毒基因組表達(dá)的6種其他 病毒蛋白關(guān)聯(lián)核蛋白(NP)、3種轉(zhuǎn)錄酶(PB2、PB1和PA)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)。 流感病毒基因組包含8個(gè)片段；一個(gè)使得能夠進(jìn)行“基因交換”重配的特征。血凝素使得病 毒可結(jié)合于宿主細(xì)胞受體，并有利于病毒進(jìn)入所述病毒將在其中復(fù)制的細(xì)胞中。神經(jīng)氨酸 酶蛋白可酶切末端的唾液酸殘基，并且被認(rèn)為可協(xié)助病毒轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)呼吸道的粘蛋白層，以 及有助于后代病毒從宿主細(xì)胞芽出。對(duì)人健康威脅較小的C型流感病毒具有單獨(dú)一種表面 蛋白，該蛋白集合了血凝素、融合活性和受體破壞活性。由于RNA聚合酶容易出錯(cuò)，流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種蛋白都易于發(fā)生 點(diǎn)突變，這不一定會(huì)影響病毒復(fù)制的能力。在被宿主抗體反應(yīng)所識(shí)別的一個(gè)位點(diǎn)處，這樣一 個(gè)突變(或多個(gè)一致的突變(coincident mutation))可能導(dǎo)致通過(guò)疫苗接種或在先感染 誘導(dǎo)產(chǎn)生的宿主抗體不能有效地結(jié)合該“新”病毒毒株，從而使感染持續(xù)發(fā)生。由于人流感 病毒毒株不斷地經(jīng)這些點(diǎn)突變進(jìn)行演化，病毒能夠避開(kāi)人免疫反應(yīng)中有限的全部抗體并導(dǎo) 致流行。因此，流感病毒感染有規(guī)律的“季節(jié)性”爆發(fā)是由發(fā)生抗原性漂移的人群中的循環(huán) 毒株引起的。在季節(jié)性流行過(guò)程中，流感病毒可迅速蔓延至全世界，并且在醫(yī)院開(kāi)支和其他保 健開(kāi)支方面造成很大的經(jīng)濟(jì)壓力并且會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)力降低。該病毒在空氣中以飛沫在人與人 之間傳播，并靶向上呼吸道氣管和支氣管的上皮細(xì)胞。流感病毒還可能被從污染的表面粘 染，進(jìn)入口腔。疾病可通過(guò)咳嗽和打噴嚏迅速傳播，尤其是在擁擠的環(huán)境中。低相對(duì)濕度和 低溫有利于病毒的穩(wěn)定性，因此溫帶地區(qū)的季節(jié)性流行傾向于在冬季出現(xiàn)。更高的發(fā)病率 和死亡率出現(xiàn)于A型流感病毒毒株，B型流感病毒通常與較低的攻擊率和更溫和的疾病有 關(guān)。然而，B型流感病毒有時(shí)可導(dǎo)致嚴(yán)重度與A型病毒相同的流行疾病。B型流感病毒主要 是兒童病原體，通常不會(huì)呈現(xiàn)與A型相同的抗原變異度。
典型的非并發(fā)性流感病毒感染的特征在于發(fā)病迅速(頭疼、咳嗽、發(fā)冷)，然后是發(fā)熱、嗓子痛、嚴(yán)重肌痛、乏力和食欲降低。其他的癥狀可包括鼻溢、胸骨下方緊繃和眼部癥 狀。最主要的感染癥狀是通常溫度范圍為38-40°C的發(fā)熱。雖然大多數(shù)人不需要任何醫(yī)學(xué) 治療即可在1-2周內(nèi)從流感病毒感染恢復(fù)，但是對(duì)于人群中的某些成員來(lái)說(shuō)，該疾病可能 代表著嚴(yán)重危險(xiǎn)。這樣的個(gè)體包括嬰幼兒、老年人和患有諸如肺疾病、糖尿病、癌癥、腎或心 臟問(wèn)題的醫(yī)學(xué)病癥的人。在該“處于危險(xiǎn)的”人群中，感染可能導(dǎo)致潛在疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥、 細(xì)菌性肺炎(由呼吸系統(tǒng)病原體例如肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)、流感嗜血 桿菌(Haemophilus influenzae)禾口金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)弓|起)以 及死亡。在兒童中，流感病毒感染的臨床特征是類(lèi)似的，但他們的發(fā)熱可能更高并可能出現(xiàn) 熱性驚厥。另外，兒童具有更高的嘔吐和腹痛，以及中耳炎并發(fā)癥、哮吼和肌炎發(fā)病率。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)估計(jì)，在年度流感流行中，人群中 的5-15%發(fā)生上呼吸道感染。住院治療和死亡主要出現(xiàn)在高危組中(老年人和慢性病患 者)。雖然難以估計(jì)，但是這些年度流行被認(rèn)為每年在全世界造成3百萬(wàn)至5百萬(wàn)的嚴(yán)重病 例和大約250000-500000例死亡。在工業(yè)化國(guó)家，現(xiàn)在與流感有關(guān)的死亡中超過(guò)90%出現(xiàn) 在65歲以上的老人中。在美國(guó)，其⑶C估計(jì)平均每年超過(guò)200000人由于季節(jié)性流感病毒 感染引起的并發(fā)癥住院，記錄了大約36000例超額死亡?？煽刂茝牧鞲胁《靖腥净謴?fù)的宿主免疫反應(yīng)是由針對(duì)表面蛋白的血清抗體、粘膜 分泌型抗體IgA和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)聯(lián)合賦予。在最初感染后大約1-2周，在血清中可 檢測(cè)到中和性血凝抑制(HAI)抗體以及神經(jīng)氨酸酶抗體，在大約3-4周時(shí)達(dá)到峰值。在再 次感染后，抗體反應(yīng)更加迅速。流感病毒抗體可維持?jǐn)?shù)月或數(shù)年，但在一些高危組中抗體水 平可在疫苗接種后數(shù)月內(nèi)開(kāi)始下降。分泌型抗體IgA在感染大約14天后出現(xiàn)峰值，并且可 在唾液、鼻液、痰液和氣管洗液中檢測(cè)到。在產(chǎn)生抗體的細(xì)胞出現(xiàn)之前，特異性針對(duì)流感病 毒特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)并通過(guò)以下方式起到限制感染的作用減少最大病毒 載量，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)抗病毒細(xì)胞因子而介導(dǎo)更快的病毒清除并且裂解感染的細(xì)胞。另外，單 核細(xì)胞可浸潤(rùn)感染的氣管，提供針對(duì)被流感病毒感染的細(xì)胞的抗體依賴(lài)性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性。迄今為止，抗呼吸器官病毒感染如流感的疫苗方法在本質(zhì)上依賴(lài)于誘導(dǎo)抗體，所 述抗體通過(guò)中和病毒體及阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞而抵御病毒感染。這些體液免疫反應(yīng)靶向?qū)τ?給定毒株保守的外部的病毒表面蛋白。因此，抗體介導(dǎo)的保護(hù)可有效地對(duì)抗同源的病毒毒 株，但不足以對(duì)抗具有血清學(xué)上不同的表面蛋白的異源毒株。這種差異影響重大，這是因?yàn)?許多病毒的表面蛋白能快速突變；例如基于有效體液反應(yīng)來(lái)對(duì)抗一種類(lèi)型流感病毒的疫苗 對(duì)于下季的變體可能是無(wú)效的。現(xiàn)在主要有兩類(lèi)獲得許可的流感病毒疫苗。一組疫苗含有作為活性免疫原的病毒 表面蛋白血凝素和神經(jīng)氨酸酶。這些包括全滅活的病毒疫苗、由經(jīng)洗滌劑處理破壞的滅活 病毒顆粒組成的裂解病毒疫苗、含有已從中除去其他病毒組分的基本純化表面蛋白的亞單 位疫苗以及其中表面蛋白被呈遞于脂質(zhì)體表面上的病毒體(Virosome)。第二組包含減毒的 且冷適應(yīng)的活病毒毒株。對(duì)于所有這些疫苗，需要通常來(lái)自3或4種病毒毒株的表面抗原 的混合物；現(xiàn)在市售的流感病毒疫苗含有來(lái)自?xún)煞NA亞型H3N2和Hmi以及一個(gè)B型病毒 的抗原。分別在每年的9月和2月，WHO全球流感項(xiàng)目會(huì)推薦用于下季的流感病毒組合物，下季正常在南半球?yàn)?月_6月開(kāi)始而在北半球?yàn)?1月-12月開(kāi)始。所述組合物基于來(lái)自 于全世界國(guó)家流感病毒中心和WHO合作中心的網(wǎng)絡(luò)的監(jiān)視數(shù)據(jù)，并試圖涵蓋可能在9個(gè)月 后流行的毒株。由于這個(gè)原因，制造商被強(qiáng)制每年改變流感病毒疫苗組分，目的是為了確保 實(shí)現(xiàn)與可能流行病毒毒株的正確匹配。大多數(shù)滅活的流感病毒疫苗經(jīng)肌肉途徑給予至三角肌內(nèi)，例外是在嬰兒中的推薦部位為大腿的前外側(cè)面。每年單獨(dú)一個(gè)劑量的滅活疫苗是合適的，具有預(yù)先存在的醫(yī)學(xué)狀 況的以前未接種過(guò)的學(xué)齡前兒童除外，他們應(yīng)接受間隔至少1個(gè)月的2個(gè)劑量。流感病毒 的減毒活疫苗(LAIV)經(jīng)鼻內(nèi)送遞。這些疫苗已經(jīng)在俄羅斯存在多年，并且最近在美國(guó)被許 可用于兒科人群。這樣的疫苗能夠在鼻上皮表面誘發(fā)局部抗體及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。然 而，流感病毒減毒活疫苗在美國(guó)未被許用于老年人群(超過(guò)50歲的老人)。為了增強(qiáng)對(duì)施加于流感病毒表面蛋白的免疫反應(yīng)的廣度和強(qiáng)度，已對(duì)多種佐劑和 其他有免疫能力的試劑進(jìn)行了評(píng)估，用于包括在疫苗制劑中。佐劑在本文中是一種這樣的 試劑，即它能夠調(diào)節(jié)針對(duì)共同給予的抗原的免疫反應(yīng)，而在僅給予其自身之時(shí)幾乎沒(méi)有任 何直接效應(yīng)。最近在流感病毒疫苗領(lǐng)域經(jīng)許可的開(kāi)發(fā)包括MF-59，這是一種亞微米水包油乳 液。含鋁的佐劑也被一些制造商使用。這些佐劑的目的在于放大針對(duì)所給予的抗原而產(chǎn)生 的血清抗體反應(yīng)。如果疫苗毒株和普通人群中循環(huán)毒株之間有良好的抗原匹配，那么滅活流感病毒 疫苗可大約70% -90%的健康成年人中預(yù)防經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的疾病。然而，所述CDC強(qiáng)調(diào)了 老年人(60歲以上老人)中疫苗效力可能會(huì)低至30-40%。與這種考慮相關(guān)的是這樣的發(fā) 現(xiàn)，即人變老會(huì)導(dǎo)致記憶型T細(xì)胞反應(yīng)出現(xiàn)缺陷，這會(huì)降低疫苗的效力并且會(huì)增加自然感 染的風(fēng)險(xiǎn)。再者，在社區(qū)環(huán)境中進(jìn)行的臨床研究證明，在60歲以上老人組中細(xì)胞介導(dǎo)的免 疫(非體液免疫)與流感疾病的保護(hù)有關(guān)。另外，如果疫苗毒株與循環(huán)毒株的抗原不同，那么效力會(huì)顯著降低。抗原變 異研究已表明，在A型流感病毒血凝素的至少2個(gè)抗原位點(diǎn)上的4個(gè)或更多個(gè)氨基 酸置換可形成足夠離散到破壞疫苗效力的漂移突變體(Jin H，Zhou H，Liu H，Chan W, Adhikary L, Mahmood K, et al. “Two residuesin the hemagglutinin of A/ Fujian/411/02-1 ike influenza viruses areresponsible for antigenic drift from A/ Panama/2007/99. "Virology. 2005 ；336 113-9)。在 2003 年第 4 季度用經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的流 感病毒對(duì)50-64歲成年人進(jìn)行的病例對(duì)照研究中，根據(jù)所述CDC，當(dāng)疫苗毒株和循環(huán)A/H3N2 毒株未很好匹配時(shí)，健康個(gè)體中的疫苗效力據(jù)估計(jì)為52%，患有一種或多種高危病癥的個(gè) 體中的疫苗效力據(jù)估計(jì)為38%。這種不匹配的可能性是由有限的時(shí)機(jī)制造窗口(limited manufacturing window of opportunity)導(dǎo)致的；從毒株確認(rèn)，經(jīng)種病毒生產(chǎn)，抗原制造和 純化以及三價(jià)體混合和產(chǎn)品填充(product filling)的時(shí)間一般都必須不超過(guò)6個(gè)月。有時(shí)，新的流感病毒毒株以高致病性和新型抗原性在人群中出現(xiàn)，這會(huì)導(dǎo)致全世 界流行。流行性流感病毒是表面蛋白抗原性轉(zhuǎn)變的結(jié)果，代表了一種對(duì)全球健康的嚴(yán)重威 脅，這是因?yàn)閭€(gè)體沒(méi)有形成預(yù)先存在的免疫性。流行毒株的特征在于它們突然在人群中出 現(xiàn)和它們的新型抗原性。在20世紀(jì)出現(xiàn)了 4次大流行；在1918年致病毒株為H1N1，在1957 年為H2N2，在1968年為H3N2，在1977年為HlNl。對(duì)于抗原性轉(zhuǎn)變的出現(xiàn)有3種不同解釋。第一，由于流感病毒基因組是分段的，兩個(gè)流感病毒毒株在共感染單個(gè)宿主例如豬時(shí)可能交換它們的基因，導(dǎo)致形成攜帶不同親本 病毒遺傳信息的可復(fù)制后代。該過(guò)程稱(chēng)為遺傳重配，被認(rèn)為是1957年和1968年流行的原 因。1968年的流行是這樣產(chǎn)生的來(lái)自鳥(niǎo)類(lèi)供體的H3血凝素基因和另外一個(gè)內(nèi)部基因與 來(lái)自已在循環(huán)的人毒株H2N2的N2神經(jīng)氨酸酶和另外5個(gè)基因重配。第二，非人流感病毒 毒株獲得了感染人的能力。1918年的流行是這樣產(chǎn)生的鳥(niǎo)類(lèi)Hmi毒株突變，使其能夠快 速且有效地在人與人之間傳播。第三，以前引起流行的毒株可能在人群中保持隱蔽且未改 變的狀態(tài)。例如，1977年的Hmi流行毒株實(shí)際上與27年前引起流行的毒株相同，而在中間 的許多年之中沒(méi)有在人和動(dòng)物宿主中檢測(cè)到該毒株。
一旦符合三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，流感病毒流行即將肆虐1.在人群中至少一代沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的HA亞型流感病毒出現(xiàn)(或再次出現(xiàn))。2.所述病毒在人中感染并有效復(fù)制，引起重病。3.所述病毒易于在人之間傳播并且是可持續(xù)的。全球流行在一年內(nèi)可使全球20% -40%的人口患病。例如，1918-19年的流行在 全世界范圍內(nèi)感染了 2億人，殺死超過(guò)3千萬(wàn)人。在美國(guó)有超過(guò)50萬(wàn)人死亡，占人口的 0. 5%。雖然從那時(shí)至今醫(yī)療保健水平已經(jīng)有很大改善，開(kāi)發(fā)了疫苗和抗病毒療法，但是所 述⑶C估計(jì)現(xiàn)在一次流行會(huì)在全球造成2百萬(wàn)至7百萬(wàn)例死亡。從1999年至今，3種不同的流感病毒亞型毒株(H5N1、H7N7和H9N2)已從鳥(niǎo)類(lèi)物 種交叉感染至人，都引起了人死亡。截至2007年8月14日，全球共報(bào)告320例H5W高致 病性禽流感病毒(HPAIV)感染人的病例，死亡193例。與其感染在大多數(shù)健康人中僅造成輕度呼吸系統(tǒng)癥狀的正常季節(jié)性流感不同，由 H5N1引起的疾病遵循一種異常的攻擊性臨床過(guò)程，惡化迅速且死亡率高。經(jīng)常出現(xiàn)原發(fā)的 病毒性肺炎和多器官衰竭。重要的是大多數(shù)病例出現(xiàn)在以前健康的兒童和青壯年中。H5W HPAIV在引起癥狀之前比其他的人流感病毒潛伏時(shí)間長(zhǎng)，在一些病例中達(dá)到8天。在家庭聚 集的病例中，病例之間的時(shí)間一般為2-5天，但有報(bào)道稱(chēng)可長(zhǎng)達(dá)17天。H5N1 HPAIV感染的最初癥狀更可能包括腹瀉，并且最長(zhǎng)可在出現(xiàn)任何呼吸系統(tǒng)癥 狀之前1周時(shí)出現(xiàn)。該特征一一結(jié)合在大便樣品中檢測(cè)到病毒RNA——表明病毒可在胃腸 道中增殖。下呼吸道癥狀如呼吸短促出現(xiàn)于該病的早期階段，而上呼吸器官癥狀如鼻溢很 少出現(xiàn)。H5N1 HPAIV現(xiàn)在符合流行所需的兩個(gè)條件；H5血凝素對(duì)人來(lái)說(shuō)為一種新抗原。沒(méi) 人對(duì)將出現(xiàn)的H5m樣流行病毒具有免疫力。另外，該病毒已感染超過(guò)300人，表觀死亡率 大于60%。因此，流行開(kāi)始的所有先決條件除一項(xiàng)之外都已滿足病毒在人與人之間建立有 效且持續(xù)的傳播。只要存在人感染的機(jī)會(huì)，H5m病毒將獲得該能力的風(fēng)險(xiǎn)就將持續(xù)存在。 通過(guò)逐步的突變或者通過(guò)與人適應(yīng)型毒株進(jìn)行重配，這一點(diǎn)被認(rèn)為有現(xiàn)實(shí)的可能性。在科學(xué)的水平上，在病毒毒株能夠達(dá)到容易地在人與人之間傳播并開(kāi)始流行之 前，需要一種或多種的病毒表型變化。然而，多項(xiàng)最近的觀察結(jié)果都表明H5m病毒正在繼 續(xù)演化最終可有利于在人與人之間傳播的能力，這些結(jié)果包括最近在土耳其的人分離物中 檢測(cè)到具體突變；該循環(huán)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性不斷增加；H5N1 HPAIV宿主范圍擴(kuò)大至包 括以前認(rèn)為對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)流感病毒感染有抗性的其他哺乳動(dòng)物，例如虎和貓。
具有甚至更大流行可能性的其他流感病毒也可能出現(xiàn)。這些包括許多H9和H7病毒毒株，它們?cè)诮陙?lái)也已經(jīng)被傳播至人。現(xiàn)在，H9病毒在亞洲禽類(lèi)中流行，并且在中國(guó)東 南和東部還有效地交叉感染至豬群中。重要的是H9N2毒株擁有典型的人樣受體特異性，并 具有廣的宿主范圍。在2003年早些時(shí)候，在荷蘭的禽類(lèi)中出現(xiàn)了 H7N7 HPAIV爆發(fā)。至少出現(xiàn)了 82例 H7N7病毒從鳥(niǎo)傳播至人的病例。結(jié)膜炎在感染H7毒株的人中是最常見(jiàn)的疾病癥狀，僅7例 表現(xiàn)出典型的流感樣病。該病毒未顯示對(duì)人的高致病性，僅出現(xiàn)1例死亡病例。其他具有 流行可能性的病毒有H2亞型病毒，因?yàn)樗^(guò)去在歷史上是流行病毒；還有H6，因?yàn)樗趤?洲和北美洲的禽類(lèi)物種中的高發(fā)病率。這表明，新的人流感病毒流行的威脅不僅僅只與HPAI H5N1的出現(xiàn)有關(guān)。在用于流感病毒流行的制劑中，已經(jīng)以候選的H5W流感病毒疫苗進(jìn)行了大量臨 床試驗(yàn)。這些始終表明，為了生成預(yù)計(jì)有保護(hù)性的血清抗體反應(yīng)，需要多個(gè)劑量的其量遠(yuǎn)高 于季節(jié)性疫苗中正常使用量的血凝素抗原，或者需要包括一種佐劑。這一點(diǎn)直接反映出人 群不具有針對(duì)H5血凝素在免疫學(xué)抗體。因此，如今可用于流行性流感病毒疫苗的僅有選擇 是二者擇其一用很高的HA含量，這將嚴(yán)重地限制能夠施加的劑量的次數(shù)；或者使用一種 在大多數(shù)國(guó)家還未被許可的佐劑。還應(yīng)了解，從初次在人中分離的時(shí)間開(kāi)始，制備一種與流 行毒株匹配的疫苗將耗時(shí)數(shù)月；在流行發(fā)生之前事先儲(chǔ)備疫苗將很可能在抗原上是不相同 的，因此如果有保護(hù)的話，僅可提供有限的保護(hù)。大多數(shù)最近爆發(fā)的H5W中也已經(jīng)出現(xiàn)了 抗原性漂移的證據(jù)。總之，季節(jié)性和流行性流感病毒疫苗明顯都需要改進(jìn)1.在它們的效力方面有明顯局限性，特別是對(duì)于未接觸過(guò)抗原的個(gè)體。這對(duì)于預(yù) 計(jì)由抗原性轉(zhuǎn)變弓I起的流感流行的情況特別重要。2.依賴(lài)于能夠正確預(yù)測(cè)可能在下一秋/冬季中循環(huán)的流感病毒毒株。疫苗毒株和 實(shí)際引起感染的毒株之間的不匹配將使得大比例的人群對(duì)流感易感。3.需要每年在高危人群中進(jìn)行再次接種，因?yàn)椴《緯?huì)發(fā)生抗原性漂移。4.產(chǎn)能限制，因?yàn)槿騼H有有限數(shù)量的潛在生物制造車(chē)間。5.為老年人群提供的保護(hù)受限與常規(guī)疫苗。因此，改良流感病毒疫苗類(lèi)優(yōu)選地是合成的、穩(wěn)定的、可有效抗所有A型流感病毒 毒株(包括潛在的流行毒株)、在(處于危險(xiǎn)的)老年組中具有提高的效力。T細(xì)胞在抗流感疾病中的保護(hù)作用雖然常規(guī)的流感病毒疫苗技術(shù)已主要聚焦于抗體對(duì)病毒表面蛋白的反應(yīng)，但是它 們可發(fā)生抗原性轉(zhuǎn)變和漂移，這會(huì)破壞效力并形成所述的邏輯脆弱性。相反，介導(dǎo)細(xì)胞免疫 反應(yīng)的T細(xì)胞可靶向在異源病毒毒株和支系中更加高度保守的蛋白。對(duì)于誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì) 胞免疫反應(yīng)的疫苗，這種性質(zhì)賦予其防護(hù)異源性病毒毒株和支系(異源亞型的免疫)的潛 力。對(duì)于流感病毒，PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和NS2蛋白的保守，以及對(duì)應(yīng)的抗原特異 性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的持續(xù)存在使得這些蛋白成為有吸引力的疫苗靶。細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性抗病毒免疫包括誘導(dǎo)由1型⑶4+T輔助淋巴細(xì)胞(Thl)支持的 1型反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致激活免疫效應(yīng)物機(jī)制，除包括誘導(dǎo)及維持免疫刺激細(xì)胞因子如IFN-Y 和IL-2外還包括誘導(dǎo)及維持細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。⑶4+T輔助細(xì)胞主要負(fù)責(zé)通過(guò)以下方式輔助其他免疫細(xì)胞通過(guò)直接細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或者通過(guò)在識(shí)別結(jié)合于主要組織 相容性復(fù)合體(MHC) II類(lèi)分子的抗原性T細(xì)胞肽表位后分泌細(xì)胞因子。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞(CTL)通常表達(dá)⑶8并且誘導(dǎo)⑶8在其上識(shí)別到MHC I類(lèi)分子呈遞的外源抗原的細(xì)胞 的裂解或調(diào)亡，提供對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體如病毒的防御。這種表型和功能的關(guān)聯(lián)不是絕對(duì)的， 原因是CD4+細(xì)胞可呈現(xiàn)細(xì)胞裂解活性，而CD8+細(xì)胞可分泌抗病毒細(xì)胞因子，特別是干擾 素-Y (IFN-y)和腫瘤壞死因子。實(shí)際上，⑶4+CTL活性已被提出作為另一種在人中控制急 性和慢性病毒感染的免疫機(jī)制。CD4+CTL可通過(guò)直接的抗病毒細(xì)胞裂解效應(yīng)而控制病毒擴(kuò) 散，并可通過(guò)產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子如IFN-Y而起到直接抗病毒活性。已知IFN-γ對(duì)病毒 產(chǎn)生具有直接抑制和非細(xì)胞裂解效應(yīng)。在決定B細(xì)胞抗體反應(yīng)和類(lèi)型轉(zhuǎn)換中以及在使得吞 噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的殺細(xì)菌活性最大化中，CD4+T輔助細(xì)胞也是必要的。細(xì)胞免疫反應(yīng)被認(rèn)為在控制流感病毒感染、改善疾病癥狀及促進(jìn)疾病恢復(fù)中起到重要作用。流感病毒特異性細(xì)胞免疫在天然感染后誘發(fā)，數(shù)種病毒蛋白已經(jīng)被鑒定可作為 人記憶異源亞型T細(xì)胞反應(yīng)的靶，包括核蛋白(NP)、聚合酶(PB1、PB2和PA)、M1蛋白和M2 蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白-I(NSl)。NS2也可能被涉及。這些內(nèi)部蛋白包含高度保守的且免疫 顯性的區(qū)域，使得它們是理想的T細(xì)胞靶。具體而言，實(shí)驗(yàn)研究已表明A型流感病毒NP在 小鼠和人中代表亞型特異性CTL和交叉反應(yīng)性CTL的重要靶抗原。這不同于血凝素(HA) 和神經(jīng)氨酸酶(NA)，由于血凝素和神經(jīng)氨酸酶在流感病毒亞型之中和之間的高度序列變異 性，它們不適合作為靶。更具體而言，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在防護(hù)包括高致病毒株的流感疾病中是非常復(fù)雜 的。記憶⑶4+和⑶8+T細(xì)胞存在于肺氣道中，并且正在有證據(jù)表明，通過(guò)在病原體負(fù)荷低 時(shí)在感染部位介導(dǎo)對(duì)病原體的束縛(engagement)，這些細(xì)胞在針對(duì)流感病毒攻擊的肺免疫 中起到重要作用。耗盡CD8+T細(xì)胞會(huì)降低已初次免疫的小鼠對(duì)流感病毒感染反應(yīng)的能力， 這表明了 CD8+T細(xì)胞在保護(hù)性二級(jí)反應(yīng)中的作用。由于病毒復(fù)制被限制于呼吸器官上皮 中的細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞在此部位發(fā)揮其效應(yīng)物的功能，產(chǎn)生抗病毒的細(xì)胞因子并裂解呈遞 病毒決定物的靶細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞攜帶針對(duì)病毒決定物的特異性T細(xì)胞受體。對(duì)感染的上 皮細(xì)胞的裂解除受到Fas機(jī)制介導(dǎo)外，還受到含穿孔素和顆粒酶的胞吐顆粒介導(dǎo)(Thomas PG, Keating R, Hulse-Post DJ, DohertyPC. "Cell-mediated protection in influenza infection. ”EmergInfect Dis. 2006 Jan ； 12(1) :48_54)。活力強(qiáng)的CD4+T細(xì)胞對(duì)流感病毒的反應(yīng)起始于引流淋巴結(jié)，隨后至脾，在感染后 6-7天它們?cè)诜魏椭夤芊闻莘置谖镏羞_(dá)到峰值。這種對(duì)流感病毒感染的原始CD4T細(xì)胞反 應(yīng)的幅度雖然小于CD8反應(yīng)，但是已經(jīng)被證明參與活躍的CD4+擴(kuò)散、Th-I分化及其向感染 部位的遷移。⑶4+T輔助細(xì)胞也是對(duì)流感病毒感染的長(zhǎng)期且有效的⑶8記憶必需的。⑶4 效應(yīng)T細(xì)胞和記憶反應(yīng)經(jīng)多種機(jī)制促進(jìn)抗流感病毒的免疫，所述機(jī)制包括它們?cè)谏闪鞲?病毒特異性CD8+CTL反應(yīng)過(guò)程中作為輔助物的經(jīng)典功能，它們驅(qū)使IgG2a去中和感染性病 毒顆粒的能力，以及它們通過(guò)分泌IFN-Y的直接抗病毒活性。⑶4+和⑶8+T細(xì)胞表位都已 被證明可促進(jìn)病毒清除，并賦予小鼠對(duì)抗流感病毒攻擊的保護(hù)作用。用于A型流感病毒的小鼠模型提供了一種分析T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。具 體而言，針對(duì)流感病毒感染的T細(xì)胞免反應(yīng)疫已在小鼠C57BL/6(H2b)和Balb/C(H2d)及它 們的雜種中被很好地表征。Plotnicky 等人(Plotnicky H, Cyblat-Chanal D，Aubry JP,Derouet F, Klinguer-Hamour C, Beck A, Bonnefoy JY, Corva A “The immunodominant influenza matrix T eellepitope recognized in human induces influenza protection inHLA-A2/K (b) transgenic mice. "Virology. 2003 May 10 ；309 (2) :320_9)證明了流感 病毒基質(zhì)蛋白(Ml)表位58-66對(duì)致死性轉(zhuǎn)基因鼠科動(dòng)物攻擊的保護(hù)效力。保護(hù)作用由T 細(xì)胞介導(dǎo)，因?yàn)樵隗w內(nèi)耗盡CD8+和/或CD4+T細(xì)胞后保護(hù)作用消失。小鼠存活與肺中Ml 特異性T細(xì)胞相關(guān)，所述Ml特異性T細(xì)胞在流感病毒攻擊后對(duì)流感病毒感染細(xì)胞有直接 的細(xì)胞毒性。Woodland 等人(Crowe SR, Miller SC, Woodland DL. "Identification of protectiveand non-protective T cell epitopes in influenza. "Vaccine. 2006 Jan23 ； 24(4) 452-6)也證明，單個(gè)CD4+T細(xì)胞表位HA(211-225)在接種疫苗的小鼠中能夠賦予對(duì) 病毒感染的部分控制。
雖然T細(xì)胞靶傾向具有低于流感病毒表面蛋白B細(xì)胞表位的突變頻率，但是 CD8+和CD4+T細(xì)胞表位在保護(hù)性免疫壓力下也會(huì)隨時(shí)間突變(BerkhoffEG，de Wit Ε, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, FouchierRA, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF. "Fitness costs limit escape fromcytotoxic T lymphocytes by influenza A viruses. ”Vaccine. 2006 NovlO ；24(44-46) :6594_6·)。該逃避(escape)可能來(lái)自病 毒與高度多態(tài)的人白細(xì)胞抗原(HLA)I類(lèi)和II類(lèi)蛋白之間沖突，所述I類(lèi)和II類(lèi)蛋白分 別決定宿主⑶8+和⑶4+T細(xì)胞的抗原加工和表位呈遞。HIV和HCV的這種病毒逃避機(jī)制 已經(jīng)被更加明確地建立，并且已知其會(huì)決定病毒演化的進(jìn)程。因此，選擇具有低內(nèi)在變異 性(熵)的高度保守肽序列是一個(gè)在設(shè)計(jì)能夠特異性地對(duì)抗抗原性轉(zhuǎn)變和漂移的T細(xì)胞 疫苗時(shí)需要考慮的重要因素。這樣的方法已被Berkhoff等人(Berkhoff EG, de Wit Ε, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, Fouchier RA, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF “Functionalconstraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxicT lymphocytes" J Virol. 2005 Sep ；79 (17) 11239-46.)描述。年齡在65歲以上的成年人現(xiàn)在占所有流感病毒相關(guān)死亡的約90%。這也是現(xiàn)有 疫苗最無(wú)效的目標(biāo)組。在人中，年齡增加似乎與從記憶亞群產(chǎn)生T細(xì)胞效應(yīng)物的能力降低 相關(guān)聯(lián)。在老年人疫苗接種后已觀察到了中央型記憶CD4+T細(xì)胞的頻率增加和效應(yīng)型記 憶⑶4+T細(xì)胞的頻率降低，這可能與血清IL-7水平降低相關(guān)。老年受試者還表明了一種 對(duì)流感病毒疫苗接種的鈍1型T細(xì)胞反應(yīng)，這與IgGl反應(yīng)直接相關(guān)聯(lián)。此外，小鼠在初始 A型流感病毒感染過(guò)程中還呈現(xiàn)出與年齡相關(guān)的表位特異性CD8+CTL活性受損。這一點(diǎn)與 CD8+CTL擴(kuò)展的缺陷有關(guān)，而與流感病毒特異性CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)物活性無(wú)關(guān)(Mbawuike IN, Acuna C, Caballero D, Pham-Nguyen K, GilbertB, Petribon P, Harmon Μ. “Reversal of age-related deficientinfluenza virus-specific CTL responses and IFN-gamma production bymonophosphoryl lipid A. "Cell Immunol. 1996 Oct 10 ； 173 (1) :64_78·)。由于T細(xì)胞反應(yīng)的一個(gè)重要因素是清除感染的細(xì)胞，T細(xì)胞疫苗除可在感染后以 治療模式用于增強(qiáng)宿主天然細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中以外，還可以預(yù)防的方式用于產(chǎn)生記憶恢 復(fù)。通過(guò)共同給藥或者通過(guò)分開(kāi)給藥，該T細(xì)胞疫苗還可與常規(guī)的抗體產(chǎn)生(基于體液的 反應(yīng))型流感病毒疫苗結(jié)合使用。T細(xì)胞疫苗的方法一項(xiàng)關(guān)于T細(xì)胞和流感病毒疫苗領(lǐng)域的綜述突出了在設(shè)計(jì)廣交叉保護(hù)性T細(xì)胞疫苗中面臨的許多關(guān)鍵性挑戰(zhàn)。T細(xì)胞疫苗必須首先能夠在大多數(shù)疫苗受體中致敏及加強(qiáng)⑶4+HTL和⑶8+CTL T細(xì)胞記憶和效應(yīng)物功能。另外，這樣的疫苗除必須處理MHC等位基因 多態(tài)性水平上的人遺傳多樣性外，還必須處理病毒遺傳多樣性以及將要發(fā)生的突變。本發(fā) 明通過(guò)將新型的氟肽疫苗送遞系統(tǒng)與高度保守的流感病毒肽結(jié)合在一塊來(lái)尋求解決這些 設(shè)計(jì)問(wèn)題。這些肽優(yōu)選地為已知包含一個(gè)或多個(gè)表位(特別是T細(xì)胞表位)的抗原。傳統(tǒng)基于肽的T細(xì)胞疫苗方法是基于表位，并聚焦于作為單個(gè)表位或重構(gòu)的人 造串送遞的最小CTL表位(8-llaa)或T輔助細(xì)胞表位(13aa)。非天然序列除可能形成 無(wú)關(guān)的新表位外，還面臨無(wú)效抗原加工的限制。在單肽序列中包含重疊T細(xì)胞表位、成簇 T細(xì)胞表位或混雜T細(xì)胞表位的長(zhǎng)天然保守肽序列使得可進(jìn)行天然抗原加工，同時(shí)還實(shí)現(xiàn) 了廣的人群覆蓋度。而且，在一種疫苗制劑中使用多種的這些長(zhǎng)天然肽有可能提供甚至更 廣的人群覆蓋度。先例表明，包含⑶4+和⑶8+T細(xì)胞表位的長(zhǎng)肽(30-35aa)具有在動(dòng)物 和人中誘導(dǎo)多表位反應(yīng)的能力(Coutsinos Z, Villefroy P, Gras-Masse H, Guillet JG, Bourgault-Vi1Iada I.Gahery-Segard H,Pialoux G,Figueiredo S,Igea C,Surenaud M, Gaston J,Gras-Masse H,Levy JP,Guillet JG. "Long-term specific immune responses induced in humansby a human immunodeficiency virus type 1 lipopeptide vaccine characterization of CD8+_T_cell epitopes recognized，，· J Virol. 20030ct ；77 (20) 11220-31.)。為進(jìn)行一種有效的抗病毒CTL反應(yīng)(由⑶8T細(xì)胞驅(qū)動(dòng))，需要一種合適的 Th-I細(xì)胞因子環(huán)境(由CD4細(xì)胞來(lái)確保)，因此CD4和CD8表位的同時(shí)送遞被預(yù)測(cè)可增加 ΜΜ ^&Ι^ (Krowka, JF. ， Singh, B. ，F(xiàn)otedar, Α. ，Mosmann, Τ. ，Giedlin，ΜΑ. ，Pilarski, LM. "A requirementfor physical linkage between determinants recognized by helpermolecules and cytotoxic T cell precursors in the induction ofcytotoxic T cell responses" J. Immunol 1986, Mayl5 ；136(10) :3561_6·)。⑶4+和⑶8+T細(xì)胞可識(shí)別這樣的短肽，即這些肽產(chǎn)生自對(duì)外源和自身蛋白的細(xì)胞 外加工和細(xì)胞內(nèi)加工，并以結(jié)合于由MHC系統(tǒng)編碼的具體細(xì)胞表面分子進(jìn)行呈遞。有兩類(lèi) 無(wú)關(guān)聯(lián)的MHC分子⑴I類(lèi)MHC呈遞內(nèi)源的肽；和(ii) II類(lèi)MHC呈遞外源的肽。I類(lèi)MHC 抗原呈遞的過(guò)程涉及蛋白降解、肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肽-MHC結(jié)合以及肽-MHC復(fù)合體輸出至細(xì) 胞表面外用于CD8+T細(xì)胞識(shí)別。肽結(jié)合于特定的MHC結(jié)合槽中，所述結(jié)合槽的形狀和特征導(dǎo) 致具有共同結(jié)合基序的特定肽亞類(lèi)的結(jié)合。T細(xì)胞在T細(xì)胞受體識(shí)別特定的肽MHC復(fù)合體 時(shí)被激活，并以該方式識(shí)別被細(xì)胞內(nèi)寄生物或病毒感染的細(xì)胞或者含異常蛋白的細(xì)胞(如 腫瘤細(xì)胞)，并且啟動(dòng)合適的免疫反應(yīng)對(duì)抗它們。在觸發(fā)T細(xì)胞識(shí)別(T細(xì)胞表位)的特定 肽MHC復(fù)合體中涉及的肽是用于診斷及治療傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏性疾病和腫 瘤疾病的重要工具。因?yàn)門(mén)細(xì)胞表位是MHC結(jié)合肽的亞類(lèi)，所以精確識(shí)別能夠結(jié)合MHC分 子的蛋白部分對(duì)于設(shè)計(jì)疫苗和免疫治療劑是重要的。MHC多態(tài)性在人群中非常高，迄今為 止已知 580 個(gè) HLA-A、921 個(gè) HLA_B、312 個(gè) HLA_C、527 個(gè) HLA_DR( β )、127 個(gè) HLA_DRQ(3 ) 和86個(gè)HLA-DQ(i3)等位基因。當(dāng)必須設(shè)計(jì)具有廣的人群覆蓋度的基于T細(xì)胞的疫苗時(shí)， 該情況難以被克服。MHC結(jié)合肽包含與MHC分子的槽相互作用的位置特異性氨基酸，促成 肽的結(jié)合。結(jié)合基序中每個(gè)位置的優(yōu)選氨基酸在MHC分子的等位變體之間可不同。計(jì)算模 型有助于對(duì)結(jié)合不同MHC分子的肽進(jìn)行鑒定。多種計(jì)算方法、MHC結(jié)合測(cè)定、X射線晶體學(xué) 研究和本領(lǐng)域中已知的多種其他方法使得鑒定與結(jié)合MHC分子結(jié)合的肽。新型計(jì)算機(jī)抗原鑒定方法賦予了快速處理HLA結(jié)合基序肽序列的篩查中涉及的大量數(shù)據(jù)的能力，所述HLA結(jié)合基序是解讀用于T細(xì)胞疫苗的病毒序列所必需的?；贖LA的生物信息學(xué)方法已被成 功地應(yīng)用于免疫學(xué)的許多領(lǐng)域，并使得它有可能解決人遺傳多樣性的擔(dān)憂，例如=Depil S， Morales 0，Castelli FA, Delhem N，F(xiàn)rancois V，Georges B，Dufosse F，MorschhauserF， Hammer JiMaillere BiAuriault CiPancre V. “Determination of aHLA II promiscuous peptide cocktail as potential vaccine against EBVlatency II malignancies.，，， J Immunother(1997). 2007Feb-Mar ；30 (2) 215-26 ；Frahm N， Yusim K， Suscovich TJ, Adams S，SidneyJ，Hraber P，Hewitt HS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry T，Henry LM, Faircloth K， Listgarten J， Kadie C， JojicN， Sango K， Brown NV, PaeE, Zaman MT, Bihl F，Khatri A，John M，Mallal S，Marincola FM, WalkerBD, Sette A，Heckerman D， Korber BT, Brander C. "Extensive HLA classl allele promiscuity among viral CTL epitopes· nEur J Immunol. 2007Aug 17 ；37 (9) 2419-2433 ；Schulze zur Wiesch J，Lauer GM,Day CL, KimAY,Ouchi K,Duncan JEiWurcel AG,Timm J, Jones AM, Mothe BiAllenTM, McGovern B,Lewis-Ximenez L,Sidney J，SetteA，Chung RT,WalkerBD. "Broad repertoire of the CD4+Th cell response in spontaneouslycontrolied Hepatitis C virus infection includes dominant and highlypromiscuous epitopes. ”J Immunol. 2005 Sep 15 ；175 (6) 3603-13 ；Doolan DL，Southwood S，Chesnut R，Appella E,Gomez E,Richards A， HigashimotoYI， Maewal A， Sidney J， Gramzinski RA, Mason C， Koech D， Hoffman SL, Sette A. “HLA-DR-promiscuous T cell epitopes fromPlasmodium falciparum pre-erythrocytic-stage antigens restricted bymultiple HLA class II alleles. ”J Immunol. 2000 Jull5 ；165(2) :1123_370可結(jié)合多于一種MHC等位基因變體(“混雜肽”)的肽是疫苗和免疫治療幵發(fā)的 主要目標(biāo)，這是因?yàn)樗鼈兣c更大部分的人群相關(guān)?；祀sCD4+T細(xì)胞表位也被報(bào)道可結(jié)合多 禾中 II 類(lèi) MHC 分子(Panina-Bordignon P, Tan A, Termijtelen A, Demotz S, Corradin G, Lanzavecchia A. Universallyimmunogenic T cell epitopes :promiscuous binding to human MHC classll and promiscuous recognition by T cells. Eur J Immunol. 1989Dec ； 19(12) :2237-42.)。在另一方面，一些混雜⑶8+T細(xì)胞表位以前被描述具有結(jié)合多種有 共同結(jié)合特征并形成所謂的超類(lèi)型的I類(lèi)MHC分子的能力(Frahm N, Yusim K，Suscovich TJ, Adams S, Sidney J, Hraber P, HewittHS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry Τ, Henry LM, Faircloth K, Listgarten J, Kadie C, JojicN, Sango K, Brown NV, Pae E, Zaman MT, Bihl F, Khatri A, John M, Mallal S, Marincola FM, Walker BD, Sette A, Heckerman D, Korber BT, Brander C. "Extensive HLA class I allelepromiscuity among viral CTL epitopes. "Eur J Immunol. 2007 Augl7 ；37 (9) 2419-2433 ；Sette A, Sidney J. iHLA supertypes andsupermotifs :a functional perspective on HLA polymorphism. ' CurrOpin Immunol. 1998 Aug ； 10 (4) :478_82)。對(duì)混雜 CD4+和 CD8+T 細(xì) 胞表位進(jìn)行鑒定在以獲得廣的人群覆蓋度為目標(biāo)的疫苗設(shè)計(jì)中代表了一種重要策略。通過(guò) 選擇已知或者被預(yù)測(cè)包含某種MHC結(jié)合基序的肽，MHC多態(tài)性的問(wèn)題也被解決，所述MHC結(jié) 合基序與具體種族中的或跨多個(gè)種族的高頻MHC等位基因相關(guān)。通過(guò)選擇能提供廣的人群覆蓋并在一系列流感病毒毒株上保守(通過(guò)使用例如the National Center for Biotechnology Information (NCBI)或 LosAlamos National Laboratory(LANL)流感病毒序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行識(shí)別)的序列組合，能夠解決病毒遺傳多樣性 的問(wèn)題并實(shí)現(xiàn)防御大多數(shù)——如果不是全部的話——流感病毒毒株。在歷史上，T細(xì)胞疫苗技術(shù)(DNA和病毒載體疫苗)的關(guān)鍵缺點(diǎn)是低百分比的疫苗受試者對(duì)疫苗反應(yīng)，免疫原性的水平和其實(shí)現(xiàn)對(duì)記憶型或效應(yīng)型T細(xì)胞反應(yīng)的加強(qiáng)免疫擴(kuò) 大的能力通常較低。有效的流感病毒T細(xì)胞疫苗的基本目標(biāo)是可促進(jìn)強(qiáng)有力的T細(xì)胞記憶 反應(yīng)，使得在再次暴露于抗原時(shí)有快速擴(kuò)大的效應(yīng)物作用，控制病毒載量并促進(jìn)從肺中清 除病毒。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，需要強(qiáng)有力的指引CD4+和CD8+T細(xì)胞中央型和效應(yīng)型記憶反應(yīng) 的病毒特異性Th-Ι。對(duì)于有活力的商業(yè)產(chǎn)品，該反應(yīng)必須在高百分比的疫苗受者(>90%) 中被誘發(fā)并且能夠產(chǎn)生長(zhǎng)期記憶反應(yīng)，所述長(zhǎng)期記憶反應(yīng)是記憶恢復(fù)和隨后的感染后疾病 防護(hù)所需要的。然而，為了產(chǎn)生這種類(lèi)型的持續(xù)免疫，疫苗還必須能通過(guò)重復(fù)疫苗暴露達(dá)到 強(qiáng)有力的加強(qiáng)免疫放大效應(yīng)?，F(xiàn)在提高由疫苗和免疫治療劑誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的免疫學(xué)策略包括開(kāi)發(fā)活的減毒 形式的病原體以及使用活載體送遞合適的抗原或編碼這樣的抗原的DNA。這樣的方法—— 無(wú)一例外都不能在未挑選的人群中產(chǎn)生有意義的加強(qiáng)免疫反應(yīng)——導(dǎo)致了復(fù)雜的初次免 疫-加強(qiáng)免疫組合并且在日益嚴(yán)格的監(jiān)管環(huán)境下還受安全性考慮的限制。另外，擴(kuò)大制作 工藝帶來(lái)的問(wèn)題和過(guò)高的成本經(jīng)常會(huì)限制生物來(lái)源的產(chǎn)品的商業(yè)生命力。在這種情況下， 合成肽是很有吸引力的抗原，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨瘜W(xué)上是確定的和高度穩(wěn)定的，并且可被設(shè)計(jì)成 包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位。為了刺激體內(nèi)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，疫苗或免疫治療產(chǎn)品中包含的合成肽應(yīng)優(yōu)選地被 抗原呈遞細(xì)胞且尤其樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)化。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)在初級(jí)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的 起始中起到關(guān)鍵作用。這些細(xì)胞以與不同功能相關(guān)的兩種主要成熟狀態(tài)存在。未成熟樹(shù)突 狀細(xì)胞(iDC)位于大多數(shù)組織中或循環(huán)系統(tǒng)中，并且被募集至體內(nèi)的炎癥部位。它們是高 度特化的抗原捕獲細(xì)胞，表達(dá)涉及抗原攝取和吞噬作用的大量受體。在抗原捕獲和加工后， iDC轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)或脾中的局部T細(xì)胞位置。在該過(guò)程中，DC失去其抗原捕獲能力，變成免 疫刺激性成熟DC(mDC)。樹(shù)突狀細(xì)胞是有效的呈遞細(xì)胞，啟動(dòng)宿主對(duì)與I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子相關(guān)的肽抗原 的免疫反應(yīng)。它們能夠刺激未免疫的CD4和CD8T細(xì)胞。根據(jù)現(xiàn)在的抗原加工和呈遞通路模 型，外源性抗原被內(nèi)化至抗原呈遞細(xì)胞的胞吞區(qū)室中，它們?cè)诖吮唤到獬呻模恍╇慕Y(jié)合于 II類(lèi)MHC分子。然后成熟的II類(lèi)MHC/肽絡(luò)合物被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，用于呈遞于CD4T淋巴 細(xì)胞。相反，內(nèi)源性抗原在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)蛋白體的作用降解，然后被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，它們?cè)?此結(jié)合于新生I類(lèi)MHC分子。然后與肽絡(luò)合的穩(wěn)定的分子I類(lèi)MHC被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，以 刺激⑶8CTL。外源性抗原還可在一個(gè)被稱(chēng)作交叉呈遞的過(guò)程被專(zhuān)門(mén)的APC呈遞在I類(lèi)MHC 分子上。含細(xì)胞外抗原的吞噬體可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合，并且抗原可獲得將肽裝載至I類(lèi)MHC分 子上所必需的機(jī)制。經(jīng)過(guò)數(shù)十年，已經(jīng)評(píng)估了多種送遞方法，包括載體例如穿膜肽(Penetratin)、TAT 及其衍生物、DNA、病毒載體、病毒體和脂質(zhì)體。然而，這些系統(tǒng)或者會(huì)誘導(dǎo)很弱的CTL反應(yīng)， 不能產(chǎn)生對(duì)記憶反應(yīng)的加強(qiáng)免疫放大，具有相關(guān)的毒性組織，或者對(duì)于商業(yè)級(jí)制造是復(fù)雜 的和昂貴的。
因此，有一個(gè)公認(rèn)的對(duì)改良載體的需求，即在開(kāi)發(fā)意欲誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗 和藥物中指引細(xì)胞內(nèi)抗原送遞。免疫治療或疫苗領(lǐng)域中載體是任何能夠?qū)⒖乖D(zhuǎn)運(yùn)至或指 引至宿主內(nèi)免疫反應(yīng)細(xì)胞的試劑。氟化的表面活性劑已被證明具有低的臨界微團(tuán)濃度，并因此在低濃度下可自組織 成多分子的微團(tuán)結(jié)構(gòu)。該物理化學(xué)性質(zhì)與氟化鏈的強(qiáng)疏水相互作用和低范德華相互作用 有關(guān)，這可顯著增加氟化的兩親物在水中自裝配以及在界面處聚集的傾向。形成這種結(jié)構(gòu) 有利于它們被細(xì)胞內(nèi)吞攝取，所述細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞(Reichel F. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999，121,7989-7997)。此外，當(dāng)將氟化的鏈導(dǎo)入至表面活性劑中時(shí)溶血活性大大降低 并經(jīng)常被抑制(Riess, J. G. ；Pace, S. ；Zarif，L. Adv. Mater. 1991，3，249-251)，從而導(dǎo)致細(xì) 胞毒性降低。本發(fā)明試圖通過(guò)使用碳氟載體克服向免疫反應(yīng)細(xì)胞送遞流感病毒抗原的問(wèn)題，以增強(qiáng)它們的免疫原性。碳氟載體包含一條或多條來(lái)自全碳氟或混合的碳氟/烴基團(tuán)的鏈， 并且可以是飽和的或不飽和的，每條鏈具有3-30個(gè)碳原子。為了通過(guò)共價(jià)鍵將所述載體和所述抗原連接，將一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)或配體作為所述載 體的組分整合，例如包括C0-、-NH-、S、0或任何其他合適的基團(tuán)；使用這樣的配體獲得共價(jià) 鍵是本領(lǐng)域中公知的。該反應(yīng)基團(tuán)可位于所述碳氟分子上的任意位置。將所述碳氟載體與所述抗原的偶聯(lián)可通過(guò)功能性基團(tuán)如天然存在的 OH、-SH、-C00H、-NH2實(shí)現(xiàn)，或者可將所述碳氟載體導(dǎo)入至所述抗原的任意位點(diǎn)。合適 的連接可以線性或環(huán)形的形式包含氮原子、氧原子或硫原子。通過(guò)連接形成的鍵的實(shí) 例可包括肟鍵、腙鍵、二硫鍵、三唑鍵或任何合適的共價(jià)鍵。具體而言，所述碳氟基團(tuán)可 通過(guò)硫酯鍵引入以增加肽的免疫原性(Beekman，N. J. C.M. et al. "Synthetic peptide vaccines :palmitoylation ofpeptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. "J. Peptide Res. 1997，50，357-364)。任選地，可將間隔元件(肽的、假 肽的或非肽的)整合，以使可將所述抗原從碳氟元件上切割下來(lái)用于在抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)加 工，并且以?xún)?yōu)化抗原呈遞，如以前所示的用于脂肽的內(nèi)容(Verheul，Α. F. Μ. ；Udhayakumar, V. ；Jue, D. L. ；ffohlhueter, R. Μ. ；Lai, A. L. Monopalmitic acid—peptide conjugates induce cytotoxic T cellresponses against malarial epitopes importance of spacer amino acids. Journal of Immunological Methods 1995, volume 182, pp219_226)。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種化學(xué)結(jié)構(gòu)為CmFn-CyHx-(Sp) -R或其衍生物的 碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中 m = 3-30，η <= 2m+1, y = 0-15, χ < = 2y, (m+y) = 3-30 且Sp是一種任選的化學(xué)間隔基團(tuán)，R為源自流感病毒的抗原。在本發(fā)明中，“衍生物”是指對(duì)所述碳氟化合物的相對(duì)很少的修飾，并使得該化合 物仍能夠如本文所述的送遞所述抗原。因此，例如可將多個(gè)氟基團(tuán)以其他鹵素基團(tuán)例如氯 (Cl)、溴(Br)或碘(I)代替。另外還有可能以甲基代替多個(gè)氟基團(tuán)，并仍保持如本文所述 的分子性質(zhì)。在上式的一個(gè)具體實(shí)例中，所述載體可為下式的2H，2H，3H，3H-全氟^^一烷酸
<formula>formula see original document page 14</formula>
因此，在第二方面中，本發(fā)明提供了具有如下結(jié)構(gòu)的碳氟載體-抗原構(gòu)建體
<formula>formula see original document page 15</formula>其中Sp為任選的化學(xué)間隔基團(tuán)，R為源自流感病毒的抗原。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指一種具有被免疫受體如T細(xì)胞受體(TCR)和B細(xì)胞 受體(BCR或抗體)識(shí)別的能力的分子?？乖梢允翘烊坏幕蚍翘烊坏牡鞍?、蛋白亞基、肽、 碳水化合物、脂質(zhì)或它們的組合，條件是它們存在至少一個(gè)表位，例如T細(xì)胞表位或B細(xì)胞 表位。這樣的抗原可通過(guò)純化從天然蛋白獲得，或者通過(guò)重組技術(shù)或化學(xué)合成產(chǎn)生。用 于制備抗原的方法在本領(lǐng)域中是公知的。此外，抗原還包括編碼抗原肽或蛋白的DNA或寡 核苷酸。與所述載體相關(guān)的抗原可以是能夠在動(dòng)物包括人中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任何流感病 毒抗原。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)在所述宿主中具有有益效果。所述流感病毒抗原可包含一種或多種T細(xì)胞表位，一種或多種T細(xì)胞表位，或者T 和B細(xì)胞表位的組合。T細(xì)胞表位可以是I類(lèi)或II類(lèi)MHC限制性的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“表位”包括(i)這樣的⑶4+T細(xì)胞表位，即包含II類(lèi)MHC結(jié)合基序并具有被II類(lèi)MHC分子呈 遞于抗原呈遞細(xì)胞表面的能力的肽序列，(ii)這樣的⑶8+T細(xì)胞表位，即包含I類(lèi)MHC結(jié)合基序并具有被I類(lèi)MHC分子呈 遞于細(xì)胞表面的能力的肽序列，和(iii)這樣的B細(xì)胞表位，即具有B細(xì)胞受體結(jié)合親和性的肽序列。所述抗原可包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自A型流感病毒蛋白、B型流感病毒蛋白和C型流 感病毒蛋白的表位。來(lái)自A型和B型流感病毒的流感病毒蛋白的實(shí)例包括任意這種組合中 的血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)(Ml)蛋白、M2、核蛋白(NP)、PA、PB1、PB2、NS1或NS2。因此在又一方面中，本發(fā)明提供了一種載體-抗原構(gòu)建體，其中所述流感病毒抗 原為蛋白、蛋白亞基、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或它們的組合。為了所述構(gòu)建體是有免疫活性 的，所述抗原必須包含一個(gè)或多個(gè)表位。所述抗原優(yōu)選地是源自流感病毒的肽序列。本發(fā) 明的肽或蛋白包含的序列優(yōu)選至少為7個(gè)氨基酸，更優(yōu)選9-100個(gè)氨基酸，最優(yōu)選15-40個(gè) 氨基酸。優(yōu)選地，選擇攜帶表位的肽的氨基酸序列，以增強(qiáng)所述分子在水性溶劑中的溶解 度。此外，可改變未與所述載體軛合的肽的末端，以通過(guò)形成多分子結(jié)構(gòu)如微團(tuán)、片層、微管 或脂質(zhì)體來(lái)提高所述構(gòu)建體的溶解度。例如，可將帶正電荷的氨基酸加入至所述肽中，目的 是促進(jìn)微團(tuán)的自發(fā)組裝。所述肽的N端或C端均可與所述載體偶聯(lián)以形成所述構(gòu)建體。為 了有助于大規(guī)模合成所述構(gòu)建體，可改變所述肽的N端或C端氨基酸殘基。如果所需肽對(duì) 于肽酶的切割是特別敏感的，那么可將正常肽鍵以非可切割的肽模擬物代替；這種鍵及合 成方法在本領(lǐng)域中是已知的。還可將非標(biāo)準(zhǔn)的非天然氨基酸整合至肽序列中，條件是它們不干擾所述肽的如下 能力與MHC分子相互作用，并且保持與識(shí)別所述天然序列的T細(xì)胞是交叉反應(yīng)的。非天然的氨基酸可用于改善肽對(duì)蛋白酶的抗性或者改善化學(xué)穩(wěn)定性。非天然氨基酸的實(shí)例包括D 氨基酸和半胱氨酸修飾。在連接到所述碳氟載體之前可將一個(gè)以上的抗原連接在一起。一個(gè)這樣的實(shí)例是 使用融合肽，其中混雜T輔助細(xì)胞表位可共價(jià)連接至一個(gè)或多個(gè)CTL表位或者一個(gè)或多個(gè)B 細(xì)胞表位，所述CTL表位和B細(xì)胞表位可為肽、碳水化合物或核酸。作為一個(gè)實(shí)例，所述混 雜T輔助細(xì)胞表位可為PADRE肽、破傷風(fēng)類(lèi)毒素肽(830-843)或流感血凝素HA (307-319)。 或者，所述肽序列可包含兩個(gè)或多個(gè)表位，所述表位可以重疊從而形成連續(xù)或由一段氨基 酸分開(kāi)的密集排列的多特異性表位簇。因此在又一方面中，本發(fā)明提供了一種載體-抗原構(gòu)建體，其中R為一個(gè)以上的連 接在一起的表位或抗原。表位還可以是線性重疊，從而形成密集排列的多特異性表位的簇。由于碳氟化合物的特征性強(qiáng)非共價(jià)分子相互作用，抗原還可與載體非共價(jià)地連接 并且仍然能實(shí)現(xiàn)被抗原呈遞細(xì)胞順利攝取的目的。因此在又一方面中，本發(fā)明提供了一種載體/抗原構(gòu)建體，其中所述抗原與所述 碳氟載體非共價(jià)地連接。還可將攜帶一個(gè)或多個(gè)B細(xì)胞表位的抗原連接至有或無(wú)一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞 表位的碳氟載體。B細(xì)胞表位可使用計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)(Bublil EM, FreundNT, Mayrose I, Penn 0, Roitburd-Berman A, Rubinstein ND, Pupko Τ, Gershoni JM. "Stepwise prediction of conformational discontinuousB-cell epitopes using the Mapitope algorithm. "Proteins. 2007 Jull ；68(1) 294-304 ；Greenbaum JA, Andersen PH, Blythe Μ, Bui HH, CachauRE, Crowe J, Davies Μ, Kolaskar AS, Lund 0, Morrison S, Mumey B, OfranY, Pellequer JL, Pinilla C, Ponomarenko JV, Raghava GP, vanRegenmortel MH, Roggen EL, Sette A,Schlessinger A,Sollner J,ZandM,Peters B. "Towards a consensus on datasets and evaluation metricsfor developing B~cell epitope prediction tools”J Mol Recognit. 2007Mar-Apr ；20 (2) :75_82)。本發(fā)明還提供了包含一種或多種碳氟載體_抗原構(gòu)建體的疫苗和免疫治療劑。這 種類(lèi)型的多組分產(chǎn)品是所需的，這是因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)更有效地在更多個(gè)體中誘發(fā)合適的免 疫反應(yīng)。由于人體內(nèi)的極端HLA多態(tài)性，僅氟肽將不可能在給定人群中較高比例的人體內(nèi) 誘導(dǎo)多表位免疫反應(yīng)。因此，為了使疫苗產(chǎn)品對(duì)整個(gè)人群有效，在所述疫苗制劑中需要存在 許多氟肽，以提供廣的覆蓋度。而且，優(yōu)化的流感病毒疫苗制劑或免疫治療劑制劑可包含源 自不同流感病毒抗原的許多不同肽序列。在這種情況下，可將所述肽一塊連接于單個(gè)碳氟 載體，或者每種肽抗原可結(jié)合于一個(gè)專(zhuān)用的載體。多組分產(chǎn)品可包含一種或多種載體-抗原構(gòu)建體，更優(yōu)選2-約20種載體-抗原 構(gòu)建體，更優(yōu)選3-約10種載體-抗原構(gòu)建體。在具體的實(shí)施方案中，所述多組分疫苗可包 含5、6、7或8種構(gòu)建體。這一點(diǎn)確保了產(chǎn)生具有廣的人群覆蓋度的多表位T細(xì)胞反應(yīng)(即 解決了 HLA多樣性的問(wèn)題)。例如，一種多氟肽的制劑可由僅源自A型流感病毒的肽、僅源 自B型流感病毒的肽或僅源自A型流感病毒的肽組成，或者由一種以上流感病毒類(lèi)型—— 最優(yōu)選A型和B型流感病毒——的結(jié)合物組成。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品包含至少2種載體_抗原構(gòu)建體，第一種構(gòu)建體包含流感病毒肽序列
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK,第二種構(gòu)建體包含流感病毒肽序列YITRNQPEffFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE。在又一實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品包含8種載體-抗原構(gòu)建體，所述載體_抗原構(gòu)建體 包含如下的流感病毒肽序列構(gòu)建體1HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK構(gòu)建體2VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG構(gòu)建體3YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE構(gòu)建體4APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA構(gòu)建體5SPGMMMGMF匪LSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
構(gòu)建體 6KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG構(gòu)建體7DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS構(gòu)建體8DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER或者，可將多個(gè)表位整合至制劑中，以賦予抗一系列病原體的免疫性，所述病原體 之一為流感病毒。例如，呼吸器官感染疫苗可包含來(lái)自流感病毒和呼吸道合胞病毒的抗原。本發(fā)明的組合物包含與抗原連接的碳氟載體，以及任選地一種或多種可藥用的載 體和/或佐劑。這樣的佐劑和/或可藥用載體能夠在幅度和/或細(xì)胞因子譜(profile)方 面進(jìn)一步加強(qiáng)免疫反應(yīng)，并且可包括但不限于(1)天然的或合成來(lái)源的細(xì)菌天然組分的細(xì)分物(refinement)，例如弗氏佐劑及 其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG、單磷酰脂質(zhì)A;(2)其他已知的佐劑或增強(qiáng)劑，例如皂苷、鋁鹽和細(xì)胞因子；(3)配制具有或沒(méi)有外來(lái)佐劑(見(jiàn)上文1和2)的抗原的方法，例如水包油佐劑、油 包水佐劑、免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)、脂質(zhì)體、配制的納米顆粒和微米顆粒；(4)細(xì)菌毒素和類(lèi)毒素；以及(5)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他有用的佐劑。根據(jù)需要，載體的選擇經(jīng)常取決于所述組合物的送遞途徑。在本發(fā)明中，可將組合 物配制成用于任何合適的給藥途徑或方式?？伤幱玫妮d體或稀釋劑包括在適宜于口、眼、直 腸、鼻、局部(包括含服和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌肉、靜脈、真皮內(nèi)、真皮內(nèi))給 藥制劑中使用的那些。所述制劑可以任何合適的形式給藥，例如液體、固體、氣溶膠或氣體。例如，口服制 劑可采取乳劑、糖漿劑、溶液、片劑或膠囊劑的形式，其可被包覆腸衣以防止活性成分在胃 中被降解。鼻制劑可以是噴霧劑或溶液。透皮制劑可適用于它們專(zhuān)門(mén)的送遞系統(tǒng)并且可包 括貼片。注射制劑可以是在蒸餾水或者其他可藥用溶劑或助懸劑中的溶液或懸液。因此在又一方面中，本發(fā)明提供了包含一種或多種載體-抗原構(gòu)建體并且具有或沒(méi)有合適載體和/或佐劑的預(yù)防制劑或治療制劑。計(jì)劃給予患者的所述疫苗和免疫治療劑的合適劑量可在臨床中確定。然而，作為 指導(dǎo)，合適人的劑量——根據(jù)優(yōu)選的給藥途徑——可為1-1000 μ g?？赡苄枰鄠€(gè)劑量達(dá)到 免疫效果或臨床效果，這——根據(jù)需要——一般為間隔2-12周給藥。如果需要在更長(zhǎng)時(shí)間 加強(qiáng)免疫反應(yīng)，那么可間隔1個(gè)月_5年施用重復(fù)劑量。
所述制劑可將載體_抗原構(gòu)建體與另一種活性組分結(jié)合，以使一種以上的疫苗或藥物的給藥起作用。通過(guò)兩種或多種活性物的共同給藥還可觀察到協(xié)同作用。包含一種或多種氟肽的本發(fā)明的疫苗制劑可與基于體液反應(yīng)的流感病毒疫苗 組合使用，例如 Fluzone 、Agrippal 、Begrivac 、Fluvax 、Enz i ra 、Fluarix 、 FlulavalT\FluAd 、Influvac 、Fluvirin 、FluBlok 、包含血凝素作為活性 組分的任意流感病毒疫苗或減毒活流感病毒(包括冷適應(yīng)毒株如Flumist )。給藥可以 結(jié)合的混合物進(jìn)行，或者以單獨(dú)的疫苗劑同時(shí)地或分別地進(jìn)行。在又一方面中，所述流感病毒疫苗制劑可與一種抗病毒治療組合物結(jié)合給藥，包 括神經(jīng)氨酸酶抑制劑治療劑如金剛胺(amanidine)、金剛乙胺(rimantidine)、扎那米韋 (zanamivir)或奧司他韋(oseltamivir)。給藥可同時(shí)地或間隔地進(jìn)行。在另一些方面中，本發(fā)明提供了 i)如本文描述的免疫原構(gòu)建體在制備用于治療或預(yù)防一種疾病或其癥狀的藥劑 中的用途；ii) 一種治療方法，該方法是通過(guò)在給予本文描述的制劑后誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。下面將參考如下的實(shí)施例描述序發(fā)明。這些實(shí)施例突出強(qiáng)調(diào)了與相應(yīng)非氟化的 抗原相比，由將碳氟載體連接于抗原而獲得的差異T細(xì)胞免疫反應(yīng)。從本文定義的流感病 毒序列列表中選擇了八種示例性抗原。這種臨時(shí)選擇利用了包含參數(shù)組合的專(zhuān)有選擇算 法，所述參數(shù)包括免疫信息學(xué)選擇參數(shù)、體外結(jié)合測(cè)定參數(shù)、使用以前以流感病毒感染的人 PBMC的離體再刺激測(cè)定參數(shù)、制造參數(shù)和制劑參數(shù)。最后，在小鼠中的評(píng)估證實(shí)了，這樣選 擇的氟肽單獨(dú)地或以結(jié)合的形式均是免疫原性的，并且所獲得的反應(yīng)優(yōu)于天然的肽抗原。 抗原選擇聚焦于并且希望利用抗原的組合，因?yàn)樵撘呙缭褪沟貌《具z傳和人HLA多樣性 的問(wèn)題在這種合理的疫苗設(shè)計(jì)中都被解決。這曾經(jīng)是肽疫苗領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵性缺點(diǎn)。雖 然可在氟肽疫苗中利用單個(gè)抗原，但是這將限制疫苗在遠(yuǎn)交(或其他)人群中的免疫原性 潛力，因此選擇多個(gè)肽是廣效疫苗必需的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“氟肽”是指綴合于肽基抗原的碳氟載體(鏈)。實(shí)施例參考了如 下附圖

圖1 示出多價(jià)氟肽疫苗與其天然肽等價(jià)物在經(jīng)初次免疫或初次免疫_(dá)加強(qiáng)免疫 后的BALB/c和CBF6小鼠中的免疫原性的比較，通過(guò)離體IFN- y ELIspot測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。將 每組7或8只小鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol) 或等價(jià)的天然肽(由8種配制的天然肽組成，劑量為100 μ 1中每種肽lnmol)經(jīng)皮下免 疫。對(duì)照組被給予僅含賦形劑的制劑。在最后一次注射后10天，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從 每只小鼠取脾并制備單脾細(xì)胞的懸液。依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鼠IFN-γ ELISpot測(cè)定 (Mabtech，Sweden)。在在37°C下和5% CO2中，在總體積200 μ 1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有 10 %胎牛血清的RPMI)中以每種肽濃度為10 μ g/ml的8種單獨(dú)的天然肽對(duì)脾細(xì)胞(5 X IO5) 進(jìn)行刺激18小時(shí)，平行實(shí)驗(yàn)兩次。使用CTL-immunospot讀數(shù)裝置對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于 每只小鼠，對(duì)所有8種肽的總斑點(diǎn)數(shù)目求和，并減去8倍的對(duì)照孔(僅培養(yǎng)基)的值。結(jié)果 對(duì)應(yīng)于每百萬(wàn)個(gè)輸入脾細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖2 示出多價(jià)氟肽疫苗與其天然肽等價(jià)物在經(jīng)初次免疫或初次免疫_(dá)加強(qiáng)免疫 后的BALB/c和CBF6小鼠中的免疫原性的比較，通過(guò)離體IFN- y ELIspot測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。將每組7或8只小鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)或等價(jià)的天然肽(由8種配制的天然肽組成，劑量為100 μ 1中每種肽lnmol)經(jīng)皮下免 疫。對(duì)照組被給予僅含賦形劑的制劑。在最后一次注射后10天，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從 每只小鼠取脾并制備單脾細(xì)胞的懸液。依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鼠IFN-γ ELISpot測(cè)定 (Mabtech，Sweden)。在37°C下和5% CO2中，在總體積200 μ 1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% 胎牛血清的RPMI)中以每種肽濃度為1 μ g/ml的8種肽的混合物對(duì)脾細(xì)胞(5X IO5)進(jìn)行 刺激18小時(shí)，平行實(shí)驗(yàn)兩次。使用CTL-immunospot讀數(shù)裝置對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于每只 小鼠，對(duì)所有8種肽的總斑點(diǎn)數(shù)目求和，并減去8倍的對(duì)照孔(僅培養(yǎng)基)的值。結(jié)果對(duì)應(yīng) 于每百萬(wàn)輸入脾細(xì)胞個(gè)中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖3 示出氟肽與天然肽在經(jīng)初次免疫或初次免疫-加強(qiáng)免疫后的BALB/c和CBF6 小鼠中的單個(gè)肽免疫原性的比較，通過(guò)離體IFN-YELIspot進(jìn)行評(píng)估。將每組7或8只小 鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)或等價(jià)的天然 肽(由8種配制的天然肽組成，劑量為100 μ 1中每種肽lnmol)經(jīng)皮下免疫。對(duì)照組被給 予僅含賦形劑的制劑。在最后一次注射后10天，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從每只小鼠取脾并制 備單脾細(xì)胞的懸液。依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鼠IFN-γ ELISpot測(cè)定(Mabtech，Sweden)。 在37°C下和5% CO2的空氣中，在總體積200 μ 1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清的 RPMI)中以每種肽濃度為10 μ g/ml的8種單獨(dú)的天然肽對(duì)脾細(xì)胞(5 X IO5)進(jìn)行刺激18小 時(shí)，平行實(shí)驗(yàn)兩次。使用CTL-immunospot讀數(shù)裝置對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果對(duì)應(yīng)于每個(gè)百萬(wàn) 輸入脾細(xì)胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖4 示出多價(jià)氟肽疫苗與其天然肽等價(jià)物在經(jīng)初次免疫或初次免疫_(dá)加強(qiáng)免疫 后的BALB/c和CBF6小鼠中的免疫原性的比較；評(píng)估細(xì)胞因子譜。將每組8只小鼠以氟 肽疫苗(由8種配制的氟肽組成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)或等價(jià)的天然肽(由 8種配制的天然肽組成，劑量為100 μ 1中每種肽lnmol)經(jīng)皮下免疫。對(duì)照組被注射僅含 賦形劑的制劑。將小鼠以15天的間隔進(jìn)行免疫。在最后一次注射后10天，將小鼠經(jīng)斷頸 處死。從每只小鼠取脾并制備單脾細(xì)胞的懸液。在37°C下和5% CO2的空氣中，在總體積 200 μ 1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI)中以每種肽濃度為1 μ g/ml的8種 天然肽的混合物對(duì)脾細(xì)胞刺激48小時(shí)。依照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用鼠類(lèi)細(xì)胞計(jì)量珠陣列試 劑盒(CBA ；BD Biosciences, UK)并且使用FacsCanto II流式細(xì)胞儀，對(duì)來(lái)自所述受激細(xì)胞 的培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞因子濃度(白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素_5(IL_5)、干 擾素-Y (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF))進(jìn)行分析。確定每種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 為210-2500pg/ml。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，對(duì)CBA檢測(cè)的下限為2. 5-3. 2pg/ml，依賴(lài)于分析 物。對(duì)于每種細(xì)胞因子，結(jié)果對(duì)應(yīng)于由每組小鼠計(jì)算得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表示為 以Pg/ml為單位的細(xì)胞因子濃度。圖5 在BALB/c小鼠中以所述氟肽疫苗刺激⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞。將每組 4只小鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)經(jīng)皮下 免疫。以15天的間隔對(duì)小鼠給以2次注射(初次免疫一加強(qiáng)免疫)。在最后一次注射后 10天，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從每只小鼠取脾并制備單脾細(xì)胞的懸液。將細(xì)胞以0.5X106/ 孔懸浮，并在37°C下和5% CO2中，僅以培養(yǎng)基或以8種天然肽的混合物(疫苗)刺激72 小時(shí)。在培養(yǎng)的最后5小時(shí)，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)物(PMA/I)給予50ng/ml PMA和0. 5 μ g/ml離子霉素(ionomycin)。在培養(yǎng)的最后5小時(shí)，對(duì)所有培養(yǎng)物給予10 μ 1/ml布雷非德菌素A(Brefeldin Α)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外⑶4和⑶8染色以及細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色，并使用 BD FACSCanto II細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)于單個(gè)的小鼠，結(jié)果顯示為表達(dá)細(xì)胞內(nèi) IFN-Y的⑶4+或⑶8+Τ細(xì)胞的百分比。圖6 示出多價(jià)氟肽疫苗與乳化于CFA中的疫苗在經(jīng)單次免疫后的BALB/c小鼠中 的免疫原性的比較；評(píng)估細(xì)胞因子譜。將每組10只小鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組 成，劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)或乳化于完全弗氏佐劑(CFA)中的氟肽疫苗經(jīng)皮下 免疫。對(duì)照組被注射僅含賦形劑的制劑。在10天后，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從每只小鼠取脾并 制備單脾細(xì)胞的懸液。在37°C下和5% CO2的空氣中，在總體積200μ1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ) 充有10%胎牛血清的RPMI)中以每種肽濃度為1 μ g/ml的8種天然肽的混合物對(duì)脾細(xì)胞刺 激48小時(shí)。依照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用鼠類(lèi)細(xì)胞計(jì)量珠陣列試劑盒(CBA ;BD Biosciences, UK)并且使用FacsCanto II流式細(xì)胞儀，對(duì)來(lái)自所述受激細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞因子 濃度(白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、干擾素-γ (IFN-γ )和腫瘤壞 死因子(TNF))進(jìn)行分析。對(duì)每種細(xì)胞因子確定2.5-2500pg/ml范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)制 造商的說(shuō)明書(shū)，對(duì)CBA檢測(cè)的下限為2. 5-3. 2pg/ml，依賴(lài)于分析物。對(duì)于每種細(xì)胞因子，結(jié) 果對(duì)應(yīng)于由每組小鼠計(jì)算得到的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表示為以pg/ml為單位的平均細(xì) 胞因子濃度。圖7 示出單次免疫的氟肽疫苗在BALB/c小鼠中皮下給藥途徑和真皮內(nèi)給藥途徑 的比較離體IFN- y ELISpot測(cè)定。將每組10只小鼠以氟肽疫苗(由8種配制的氟肽組成， 劑量為100 μ 1中每種氟肽lnmol)經(jīng)皮下(s. c.)或真皮內(nèi)(i. d.)免疫。對(duì)照組被經(jīng)皮下 給予僅含賦形劑的制劑。在10天后，將小鼠經(jīng)斷頸處死。從每只小鼠取脾并制備單脾細(xì)胞 的懸液。依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鼠IFN-YELISpot測(cè)定(Mabtech，Sweden) 0在37°C下 和5% CO2的空氣中，在總體積200μ 1的完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI)中以 每種肽濃度為10 μ g/ml的8種天然肽單獨(dú)地對(duì)脾細(xì)胞(5 X IO5)進(jìn)行刺激18小時(shí)，平行實(shí) 驗(yàn)兩次。使用CTL-immimospot讀數(shù)裝置對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于每只小鼠，對(duì)所有8種肽的 總斑點(diǎn)數(shù)目求和，并減去8倍的對(duì)照孔(僅培養(yǎng)基)的值。結(jié)果對(duì)應(yīng)于每百萬(wàn)個(gè)輸入脾細(xì) 胞中斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)施例1肽實(shí)施例對(duì)于包括在流感的預(yù)防疫苗或治療疫苗中的碳氟載體，綴合于它的候選物可包括 如下的一種或多種肽或其片段，或者它們的類(lèi)似物(包括在LosAlamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室流感病 毒序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Macken,C. ,Lu,H. ,Goodman, J. ,& Boykin,L. , “ The Value of a database in surveillance and vaccineselection. " in Options for the Control of Influenza IV. A. D. Μ. E. Osterhaus, N. Cox & A. W. Hampson (Eds.) 2001，103-106)或者 NCBI 的流感病 毒資源中提及的相應(yīng)共有序列、祖先序列或中心樹(shù)序列)或者天然及非天然變體，但不必 是排他性地。合適肽的具體實(shí)例給出如下，其中使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母編碼。同系物與參照 序列相比具有至少50%的同一性。同系物優(yōu)選地與天然出現(xiàn)的序列具有80、85、90、95、98 或99%的一致性。使用非天然氨基酸必須不干擾所述肽結(jié)合于I類(lèi)或II類(lèi)MHC受體的能 力。這些包含一個(gè)或多個(gè)表位的序列的片段也是用于連接所述碳氟載體的候選肽。
這些序列選自A型流感病毒共有序列。指出了流感病毒蛋白和所述肽在該蛋白中 的位置。蛋白序列收集自流感病毒資源。http//www, ncbi. nlm. nih. rov/Renomes/FLU/SEQ ID N。1PB2位置 027-061
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADKSEQ ID N。2PB2位置 123-157ERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAKSEQ ID N° 3PB2位置 155-189SAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKSEQ ID N° 4PB2位置 203-237VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGSEQ ID N。5PB2位置 249-283EVRNDDVDQSLIIAARNIVRRAAVSADPLASLLEMSEQ ID N。6PB2位置 358-392EGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSEQ ID N。7PB2位置 370-404ATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSEQ ID N。8PB2位置 415-449RGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWSEQ ID N。9PB2位置 532-566SSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQSEQ ID N。10PB2位置 592-626YSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPPSEQ ID N。11PB2位置 607-641LGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRSEQ ID N。12PB2位置 627-659QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK
SEQ ID N° 13PBl位置 012-046VPAQNAISTTFPYTCDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTSEQ ID N° 14PBl位置 114-148VQQTRVDKLTQGRQTYDffTLNRNQPAATALANTIESEQ ID N。15PBl位置 216-250SYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRGSEQ ID N。16PBl位置 267-301EQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFTSEQ ID N。17PBl位置 324-358YITRNQPEffFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESEQ ID N。18PBl位置 340-374APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLASEQ ID N。19PBl位置 404-436SPGMMMGMF匪LSTVLGVSILNLGQKKYTKTTYSEQ ID N。20PBl位置 479-513KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGSEQ ID N。21PBl位置 486-520KTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESSEQ ID N。22PBl位置 526-560GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYRSEQ ID N。23PBl位置 656-690EYDAVATTHSffIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQSEQ ID N。24PBl位置 700-734FPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGRSEQ ID N。25PA位置 107-141PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE
SEQ ID N° 26PA位置 122-156VTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMASEQ ID N。27PA位置 145-179IHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIRSEQ ID N。28PA位置 166-200ESRARIKTRLFTIRQEMASRGLffDSFRQSERGEETSEQ ID N。29PA位置 495-529RRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTDSEQ ID N。30PA位置 642-676AKSVFNSLYASPQLEGFSAESRKLLLIVQALRDNLSEQ ID N。31PA位置 173-207PRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFffSEQ ID N。32NP位置 240-274DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSSEQ ID N° 33Ml位置 002-026SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNSEQ ID N° 34Ml位置 023-057EIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEffLKTRPILSPLTKSEQ ID N。35Ml位置 038-072DLEALMEffLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERSEQ ID N。36Ml位置 055-089LTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDSEQ ID N。37Ml位置 166-200ATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAASEQ ID N。38NSl位置 128-162
IILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISP
SEQ ID N。39NS2位置 026-060EDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDLHSLQN下述序列選自B型流感病毒共有序列。指出了流感病毒蛋白和所述肽在蛋白中的 位置。蛋白序列收集自流感病毒資源。
http//www, ncbi. nlm. nih. rov/Renomes/FLU/SEQ ID N。40PB2位置 016-050NEAKTVLKQTTVDQYNIIRKFNTSRIEKNPSLRMKSEQ ID N。41PB2位置 117-151YESFFLRKMRLDNATWGRITFGPVERVRKRVLLNPSEQ ID N° 42PB2位置 141-175ERVRKRVLLNPLTKEMPPDEASNVIMEILFPKEAGSEQ ID N。43PB2位置 197-231GTMITPIVLAYMLERELVARRRFLPVAGATSAEFISEQ ID N。44PB2位置 311-345DIIRAALGLKIRQRQRFGRLELKRISGRGFKNDEESEQ ID N。45PB2位置 404-438MVFSQDTRMFQGVRGEINFLNRAGQLLSPMYQLQRSEQ ID N° 46PB2位置 519-553VSELESQAQLMITYDTPKMWEMGTTKELVQNTYQffSEQ ID N° 47PB2位置 537-571MWEMGTTKELVQNTYQffVLKNLVTLKAQFLLGKEDSEQ ID N° 48PB2位置 572-606MFQffDAFEAFESIIPQKMAGQYSGFARAVLKQMRDSEQ ID N。49PB2位置 717-751LEKLKPGEKANILLYQGKPVKWKRKRYSALSNDISEQ ID N。50PBl位置 001-035MNINPYFLFIDVPIQAAISTTFPYTGVPPYSHGTG
SEQ ID N。51PBl位置 097-131EEHPGLFQAASQNAMEALMVTTVDKLTQGRQTFDffSEQ ID N° 52PBl位置 227-261MTKDAERGKLKRRAIATAGIQIRGFVLVVENLAKNSEQ ID N。53PBl位置 393-427KPFFNEEGTASLSPGMMMGMF匪LSTVLGVAALGISEQ ID N。54PBl位置 616-650DPEYKGRLLHPQNPFVGHLSIEGIKEADITPAHGPSEQ ID N。55PBl位置 701-735SASYRKPVGQHSMLEAMAHRLRMDARLDYESGRMSSEQ ID N。56PA位置 160-194SSLDEEGKGRVLSRLTELQAELSLKNLffQVLIGEESEQ ID N。57PA位置 491-525ESFDMLYGLAVKGQSHLRGDTDVVTVVTFEFSSTDSEQ ID N。58PA位置 696-723VIQSAYffFNEffLGFEKEGSKVLESVDEIMDESEQ ID N。59NP位置 173-207FLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDVSEQ ID N。60NP位置 253-287EAIRFIGRAMADRGLRDIKAKTAYEKILLNLKNKSEQ ID N。61NP位置 308-342IADIEDLTLLARSMVVVPSVASKVVLPISIYAKISEQ IDN° 62NP位置 338-372IYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSILSEQ ID N。63NP位置 418-452
GFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNE
SEQ ID N。64Ml位置 166-300ARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQKSEQ ID N。65Ml位置 209-237 IGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSS包括至流感的預(yù)防疫苗或治療疫苗中的候選肽可為來(lái)自任意上述組合的血凝素、 神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)(Ml)蛋白、M2、核蛋白(NP)、PA、PB1、PB2、NS1或NS2的任一種病毒蛋白 的肽。氟肽和天然肽(未修飾的肽)的合成8種天然肽和8種氟肽(選自本文包含的肽列表；SEQ ID N。1_65)是通過(guò)固相 肽合成(SPPS)得到。所有肽均是通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的9-芴甲氧羰基(Fmoc)化學(xué)法在Rink酰 胺PEG樹(shù)脂上合成。肽鏈通過(guò)以下方式組裝于樹(shù)脂上通過(guò)以20%的哌啶/N，N-二甲基甲 酰胺處理30分鐘重復(fù)地除去Fmoc保護(hù)基，并且通過(guò)使用1，3- 二異丙基碳二亞胺/1-羥 基_苯并三唑/N-甲基嗎啉偶聯(lián)被保護(hù)的氨基酸120分鐘。在每次偶聯(lián)后進(jìn)行水合茚三酮 (Ninhydrin)測(cè)試，以檢查偶聯(lián)效率。在添加N末端賴(lài)氨酰殘基后，將所述樹(shù)脂嵌段分離以 使得，⑴在所述樹(shù)脂的第一半上，將2H，2H，3H，3H-全氟十一烷酸碳氟鏈(C8F17(CH2)2COOH) 整合至所述N末端賴(lài)氨酸的ε鏈上以衍生出氟肽，以及(2)在所述樹(shù)脂的第二半上，將所 述N末端賴(lài)氨酸的ε鏈乙?；匝苌鎏烊浑?。將樹(shù)脂洗滌并干燥，然后以試劑K處理，用 于切割并去除所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。將粗肽從冷醚中沉淀并通過(guò)過(guò)濾收集。純度通過(guò)RP-HPLC 評(píng)估，并且所有肽的純度都優(yōu)于92%。在氮中制備冷凍干燥的氟肽并將其在_20°C下保存。 氟肽在保存條件下6個(gè)月中的穩(wěn)定性已通過(guò)RP-HPLC和LC-MS進(jìn)行確認(rèn)。疫苗劑量制備配制8種冷凍干燥的氟肽(氟肽1、氟肽2、氟肽3、氟肽4、氟肽5、氟肽6、氟肽7 和氟肽8)和8種冷凍干燥的等量天然肽(肽1、肽2、肽3、肽4、肽5、肽6、肽7和肽8)以 形成一種獲得廣中性PH的等摩爾制劑，用于腸胃外送遞。所述構(gòu)建體的流感病毒肽部分的序列如下氟肽1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-NH2氟肽2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-NH2氟肽3 YITRNQPEffFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-NH2氟肽4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-NH2氟肽5 SPGMMMGMF匪LSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-NH2氟肽6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-NH2氟肽7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-NH2氟肽8 DLEALMEffLKTRP ILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-NH2動(dòng)物和免疫雌性6-8 周齡 BALB/c 或 CB6F1 (BALB/c X C57BL/6J)小鼠購(gòu)自CharlesRiver (UK) 和/或Harlan(UK)。注射使用Iml注射器和22-G號(hào)針頭經(jīng)皮下進(jìn)行。進(jìn)行免疫，使得小鼠 接受單次免疫(初次免疫)或兩次免疫(初次免疫/加強(qiáng)免疫)。進(jìn)行免疫的時(shí)間間隔為每次注射之間間隔14天。氟肽疫苗在BALB/c和CB6F1小鼠中都具有強(qiáng)的免疫原性并優(yōu)于天然肽將氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混合物)在BALB/c和CB6F1小鼠中的免疫原 性與天然肽等價(jià)物(如上所述的8種未修飾肽——稱(chēng)為天然肽——的混合物)相比較。該 研究還使用初次免疫方案或初次免疫-加強(qiáng)免疫方案比較了兩種制劑的免疫原性。在無(wú)佐 劑的情況下將兩種制劑經(jīng)皮下注射于BALB/c和CBF6小鼠中。將小鼠以含lnmol/氟肽的 氟肽疫苗劑量(8種氟肽共Snmol)或lnmol/肽的天然肽疫苗等價(jià)物(8種天然肽共Snmol) 進(jìn)行免疫。兩種疫苗制劑都不含任何佐劑。在最后一次免疫后10天，以10 μ g/ml的每種單 獨(dú)天然肽再次刺激 脾細(xì)胞，并使用IFN- y ELISpot測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)離體IFN- y ELISpot 測(cè)定(圖1和2)，在初次免疫-加強(qiáng)免疫免疫方案后，所述氟肽疫苗的免疫原性?xún)?yōu)于僅賦形 劑和天然肽疫苗等價(jià)物(P <0.001)。這些結(jié)果還證明了，對(duì)于僅氟肽疫苗組，使用初次免 疫-加強(qiáng)免疫方案的斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)目與單次免疫相比增加很多(圖1和2)。這些結(jié)果 可證明連接于肽序列的氟肽鏈的自佐劑活性性質(zhì)。氟肽疫苗在BALB/c和CB6F1小鼠中可誘導(dǎo)強(qiáng)的多表位T細(xì)胞反應(yīng)將氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混合物)在BALB/c和CB6F1小鼠中的免疫原 性與其天然肽等價(jià)物(如上所述的8種未修飾肽——稱(chēng)為“天然肽”——的混合物)相比 較。該研究還比較了兩種制劑在初次免疫方案或初次免疫-加強(qiáng)免疫方案上的免疫原性。 在無(wú)佐劑的情況下將兩種制劑經(jīng)皮下注射于BALB/c和CB6F1小鼠中。將小鼠以含lnmol/ 氟肽的氟肽疫苗劑量(8種氟肽共Snmol)或lnmol/肽的天然肽疫苗等價(jià)物(8種天然肽共 Snmol)進(jìn)行免疫。兩種疫苗制劑都不含任何佐劑。對(duì)照組由僅以賦形劑免疫的小鼠組成。 在免疫后10天，以10 μ g/ml的每種單獨(dú)天然肽再次刺激脾細(xì)胞，并使用IFN- y ELISpot測(cè) 定進(jìn)行評(píng)估。所述氟肽疫苗在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了針對(duì)8種肽中的5種的肽特異性反應(yīng)， 在CB6F1小鼠中誘導(dǎo)了針對(duì)8種肽中的7種的肽特異性反應(yīng)，這優(yōu)于由疫苗等價(jià)物(未修 飾的肽)誘導(dǎo)的反應(yīng)。這可證明，以氟肽免疫接種可誘導(dǎo)在質(zhì)和量上均優(yōu)于其天然肽等價(jià) 物的免疫反應(yīng)。氟肽疫苗依賴(lài)于測(cè)試的鼠系可誘導(dǎo)Thl細(xì)胞因子譜將氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混合物)在BALB/c和CB6F1小鼠中的免疫原 性與天然肽等價(jià)物(如上所述的8種未修飾肽——稱(chēng)為“天然肽”——的混合物)相比較。 在無(wú)佐劑的情況下將兩種制劑經(jīng)皮下注射于BALB/c和CB6F1小鼠中。將小鼠以含lnmol/ 氟肽的氟肽疫苗劑量(8種氟肽共Snmol)或lnmol/肽的天然肽疫苗等價(jià)物(8種天然肽共 Snmol)進(jìn)行免疫。兩種疫苗制劑都不含任何佐劑。在最后一次免疫后10天，以每種肽1 μ g/ ml的8種天然肽的混合物再次刺激脾細(xì)胞。在刺激48小時(shí)后，借助多路珠測(cè)定(CBA)對(duì)培 養(yǎng)物上清液進(jìn)行細(xì)胞因子的評(píng)估。結(jié)果可表明，CBF6小鼠的細(xì)胞因子譜為顯著的Thl譜， 主要產(chǎn)生了 IFN-Y并顯著產(chǎn)生了 TNF-α (圖4)。這種以Thl為主的細(xì)胞因子譜與BALB/c 小鼠相比是更明顯的，這是由于BALB/c小鼠的這些Thl反應(yīng)的強(qiáng)度低于CB6F1小鼠(亦如 IFN-YELISpot的結(jié)果——參考圖1和2)并且Th2細(xì)胞因子會(huì)增加。然而，與其天然肽等 價(jià)物相比，以氟肽免疫的BALB/c小鼠中出現(xiàn)了增強(qiáng)的Thl反應(yīng)。氟肽疫苗可刺激肽特異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ將對(duì)IFN- γ的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色用于提供有關(guān)肽特異性⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的頻率的信息。將小鼠以氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混合物)進(jìn)行免疫，并在以8種天然肽的混合物(疫苗)短時(shí)間刺激后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD4+或CD8+脾細(xì) 胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色評(píng)價(jià)。這些結(jié)果可證明，以氟肽疫苗免疫小鼠能誘發(fā)肽特異性 ⑶4+和⑶8+T細(xì)胞都以0. 5-2. 6%的頻率產(chǎn)生IFN-γ (圖5)。這證實(shí)了氟肽可結(jié)合I類(lèi)和 II類(lèi)MHC抗原加工肽，條件是所述肽包含相關(guān)的I類(lèi)和II類(lèi)MHC表位。實(shí)施例2由氟肽疫苗接種誘發(fā)的免疫反應(yīng)被與佐劑的結(jié)合物加強(qiáng)免疫將氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混合物)的免疫原性與存在一種佐劑——弗 氏完全佐劑(FCA)情況下的氟肽疫苗的免疫原性相比較。將氟肽疫苗(lnmol/肽)或乳化 于CFA中的氟肽疫苗(lnmol/肽)用于免疫BALB/c小鼠。在免疫后10天，以10 μ g/ml單 獨(dú)的肽刺激脾細(xì)胞。在48小時(shí)后，收集培養(yǎng)物上清液并使用多路細(xì)胞因子測(cè)定(CBA)測(cè)試 細(xì)胞因子。結(jié)果表明，使用CFA作為添加的佐劑可顯著地加強(qiáng)Thl細(xì)胞因子產(chǎn)生(IFN-Y 和IL-2)，對(duì)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生無(wú)影響(IL-4、IL-5)(圖6)。因此，在免疫過(guò)程中通過(guò)組 合使用佐劑可以?xún)?yōu)選地加強(qiáng)由氟肽疫苗誘導(dǎo)的Thl反應(yīng)。氟肽疫苗的皮下給藥途徑和真皮內(nèi)給藥途徑都能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)使用真皮內(nèi)給藥途徑或皮下給藥途徑比較了氟肽疫苗(如上所述的8種氟肽的混 合物)在BALB/c小鼠中的免疫原性。在免疫后10天，以10 μ g/ml單獨(dú)的肽刺激脾細(xì)胞， 并借助ELISP0T評(píng)估離體IFN-γ產(chǎn)生。結(jié)果表明，氟肽的皮下給藥途徑和真皮內(nèi)給藥途徑 都適合于誘導(dǎo)強(qiáng)的抗原特異性反應(yīng)(圖7)。
權(quán)利要求
一種結(jié)構(gòu)為CmFn--CyHx-(Sp)-R或其衍生物的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中m＝3-30，n＜＝2m+1，y＝0-15，x＜＝2y，(m+y)＝3-30且Sp是一種任選的化學(xué)間隔基團(tuán)，R為源自流感病毒的抗原。
2.一種具有如下結(jié)構(gòu)的碳氟載體-抗原構(gòu)建體<formula>formula see original document page 2</formula>其中Sp為任選的化學(xué)間隔基團(tuán)，R為源自流感病毒的抗原。
3.權(quán)利要求1或2的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中R包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自流感病毒蛋 白的表位。
4.權(quán)利要求3的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中R包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自A型流感病毒蛋 白、B型流感病毒蛋白或者C型流感病毒蛋白的表位。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的碳氟載體_抗原構(gòu)建體，其中所述抗原為肽。
6.權(quán)利要求5的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中所述肽為免疫原性肽。
7.權(quán)利要求5或6的構(gòu)建體，其中R為由7-100個(gè)氨基酸組成的肽。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中R包含至少一個(gè)I類(lèi)或II類(lèi)MHC結(jié)合表位、B 細(xì)胞結(jié)合表位或者它們的組合。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中R包含兩個(gè)或多個(gè)重疊的表位。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的碳氟載體_抗原構(gòu)建體，其中R為選自NCBI和LosAlamos National Laboratory流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)的肽或者其片段、衍生物、同系物或者這些的組合。
11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中R為選自SEQID Nol、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64或65的肽或者其片段、衍生物、同系物或者這些的組合。
12.權(quán)利要求1的碳氟載體，所述碳氟載體與抗原非共價(jià)連接。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的碳氟載體-抗原構(gòu)建體，其中R包含多個(gè)表位和/或融合肽。
14.一種藥物組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu) 建體，及任選的一種或多種可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑或佐劑。
15.一種藥物組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu) 建體，并且被配制用于腸胃外、口、眼、直腸、鼻、透皮、局部或陰道給藥。
16.一種藥物組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu) 建體，并且采取液體、乳劑、固體、氣溶膠或氣體的形式。
17.一種藥物組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu) 建體與佐劑相結(jié)合，所述佐劑選自(1)天然的或合成來(lái)源的細(xì)菌天然組分的細(xì)分物，例如弗氏佐劑及其衍生物、胞壁酰二 肽(MDP)衍生物、CpG、單磷酰脂質(zhì)A ；(2)佐劑或增強(qiáng)劑，例如皂苷、鋁鹽和細(xì)胞因子；(3)水包油佐劑、油包水佐劑、免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)、脂質(zhì)體、配制的納米顆粒和微米顆粒；以及(4)細(xì)菌毒素和類(lèi)毒素。
18.如權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)要求保護(hù)的藥物組合物，所述組合物包含至少2種載 體-抗原構(gòu)建體，第一種構(gòu)建體包含流感病毒肽序列HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK, 第二種構(gòu)建體包含流感病毒肽序列 YITRNQPEffFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE。
19.如權(quán)利要求18中要求保護(hù)的藥物組合物，所述組合物包含8種載體-抗原構(gòu)建體， 所述載體-抗原構(gòu)建體包含如下的流感病毒肽序列構(gòu)建體 IHMAI IKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYP ITADK 構(gòu)建體 2VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG 構(gòu)建體 3YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE 構(gòu)建體 4APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA 構(gòu)建體 5SPGMMMGMF匪LSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY 構(gòu)建體 6KKKSHNKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG 構(gòu)建體 7DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS 構(gòu)建體 8DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
20.權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu)建體在制備預(yù)防疫苗或免疫治療藥物產(chǎn)品中的 用途。
21.權(quán)利要求1-13的碳氟載體-抗原構(gòu)建體在制備預(yù)防疫苗或免疫治療藥物產(chǎn)品中的 用途，所述疫苗和藥物產(chǎn)品用于腸胃夕卜、粘膜、口、鼻、局部、眼、直腸、透皮或陰道給藥。
22.權(quán)利要求14-19的藥物組合物與基于體液反應(yīng)的流感病毒疫苗相結(jié)合同時(shí)地或分 別地給藥。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述疫苗為包含血凝素的流感病毒疫苗。
24.一種使用權(quán)利要求14-24的組合物的治療方法或免疫方法。
25.一種刺激免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求14-23的制劑給予動(dòng)物。
26.一種刺激免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求14-23的制劑給予鳥(niǎo)。
27.一種刺激免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求14-23的制劑給予哺乳動(dòng)物。
28.一種刺激免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求14-23的制劑給予人。
29.權(quán)利要求24-28的方法，其中所述藥物組合物與抗流感病毒治療劑相結(jié)合。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗流感病毒治療劑為神經(jīng)氨酸酶抑制劑。
31.一種刺激免疫反應(yīng)的方法，所述方法是通過(guò)將權(quán)利要求14-19的預(yù)防或治療制劑 與含血凝素的流感病毒疫苗相結(jié)合同時(shí)地或分別地給藥。
32.—種制備預(yù)防藥物產(chǎn)品或治療藥物產(chǎn)品的方法，包括將權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的碳 氟構(gòu)建體與一種或多種可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑或佐劑相結(jié)合。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述疫苗或產(chǎn)品用于腸胃外、粘膜、口、鼻、局部、眼、直 腸、透皮或陰道給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將流感病毒抗原送遞至免疫反應(yīng)性靶細(xì)胞的碳氟載體。本發(fā)明還涉及碳氟載體-流感病毒抗原構(gòu)建體，以及這種與抗原相關(guān)的載體在動(dòng)物包括人中作為疫苗和免疫治療劑的用途。
文檔編號(hào)A61K39/385GK101827607SQ200880111908
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者B·喬治斯, C·B·布朗, D·鮑蕾特, P·J·賽澤 申請(qǐng)人:免疫目標(biāo)指定系統(tǒng)(Its)有限公司