專利名稱：突觸發(fā)生的調(diào)控的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于調(diào)控突觸發(fā)生(synaptogenesis)，以及軸突與樹突生長的組合物和方法。具體地，本發(fā)明包括調(diào)控血小板反應(yīng)蛋白(血小板反應(yīng)蛋白)與鈣通道的 α2δ亞基之間相互作用的試劑的用途。
背景技術(shù)：
突觸是專門化的細胞黏著物，其為神經(jīng)系統(tǒng)的主要功能單元，并且在發(fā)育期間以驚人的精密度和保真度產(chǎn)生。在突觸發(fā)生期間，突觸形成、成熟和穩(wěn)定，并且由下述過程消除，所述過程需要突觸前配偶體和突觸后配偶體之間的密切通訊。另外，可能存在幫助控制時間、位點和突觸數(shù)量的環(huán)境決定因素。突觸存在于神經(jīng)元和神經(jīng)元之間，并且在外周存在于神經(jīng)元和效應(yīng)細胞(例如肌肉)之間。兩個神經(jīng)元之間的功能性接觸可發(fā)生在軸突和胞體、軸突和樹突、胞體和胞體， 或樹突和樹突之間。允許神經(jīng)傳遞的就是該功能性接觸。許多神經(jīng)病和精神病是由神經(jīng)傳遞的病理學過度活動或活動不足引起的；并且許多藥物能夠修飾神經(jīng)傳遞，例如致幻劑、抗神經(jīng)病藥物、抗精神分裂癥藥物、安定藥、鎮(zhèn)靜藥、麻醉劑、止痛藥、阿爾茨海默病藥物和帕金森病藥物。最近數(shù)年期間，研究人員進行了大量努力以表征突觸蛋白質(zhì)(synapticprotein) 的功能，所述突觸蛋白質(zhì)包括突觸結(jié)合蛋白、syntexin、突觸小泡蛋白、小突觸小泡蛋白和突觸蛋白(synapsin)。這些蛋白質(zhì)涉及突觸功能的特定方面，例如突觸小泡再循環(huán)或?qū)?(docking)，涉及軸突發(fā)生(axonogenesis)的組構(gòu)、突觸前末梢的分化，且涉及突觸連接的形成和維護。見例如美國專利申請公開No. 2006/0019880。神經(jīng)細胞只有通過建立突觸連接才能組成網(wǎng)絡(luò)并獲得加工信息的能力，例如學習和記憶。在正常的衰老期間突觸數(shù)量逐漸減少，在神經(jīng)退化(neurodegenerative)疾病期間突觸被嚴重破壞。因此，找到能夠創(chuàng)建和/或維持突觸連接的分子是治療神經(jīng)退化疾病的重要步驟。相反，過量的突觸形成可伴隨中風和精神障礙。對多種神經(jīng)系統(tǒng)障礙的治療而言，突觸形成的調(diào)控非常重要。US 2006/0019880公開了血小板反應(yīng)蛋白能夠引發(fā)突觸形成，血小板反應(yīng)蛋白激動劑或拮抗劑能夠在需要促進或抑制突觸發(fā)生的患者中用于促進或抑制突觸發(fā)生。本文公開的所有參考文獻、出版物和專利申請均在此完整引入作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在個體中促進突觸發(fā)生的方法，其包括對需要突觸發(fā)生的個體施用有效劑量的包含至少一種血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述多肽不是血小板反應(yīng)蛋白，并且其中個體中的突觸形成增加。在一些實施方案中，多肽結(jié)合和/或活化選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3禾口 α 2 δ 4的鈣通道亞基。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域是來自長度從約35到約65個氨基酸的血小板反應(yīng)蛋白同種型的多肽，其至少包含6個半胱氨酸氨基酸，其中主要的結(jié)構(gòu)是雙鏈β-片層，之后為從環(huán)到C-端短雙鏈片層。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白 EGF-樣結(jié)構(gòu)域與人TSPl的氨基酸551-586、588-636或650-689，人TSP2的氨基酸553-588、 590-635 或 652-691，人 TSP3 的氨基酸 316_368、370_412 或 418-455，人 TSP4 的氨基酸 290-324,326-377,379-418或424-461，或人軟骨寡聚體基質(zhì)的氨基酸87_1洸、127-179、 180-222或225-267具有至少95%的序列同一性。在一些實施方案中，多肽包含至少兩個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，多肽包含至少三個血小板反應(yīng)蛋白 EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，多肽缺乏除EGF-樣結(jié)構(gòu)域之外的血小板反應(yīng)蛋白序列。在一些實施方案中，個體由于衰老而遭受突觸減少。在一些實施方案中，個體由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、多發(fā)性硬化、脊髓損傷、腸神經(jīng)系統(tǒng)障礙或青光眼而遭受突觸減少。在一些實施方案中，個體遭受黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。在一些實施方案中，個體由于選自抑郁、精神分裂癥、孤獨癥和攻擊(aggression) 的精神障礙而遭受突觸減少。在一些實施方案中，突觸形成位于神經(jīng)肌肉接合處。在一些實施方案中，突觸形成位于肌肉上。本發(fā)明還提供了治療由過量、活動過度、異常連接或功能失調(diào)的突觸引起的障礙的方法，其包括對個體施用有效量的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑，所述拮抗劑抑制血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生活性。在一些實施方案中，所述試劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白，并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和一個或多個選自Ci2 δ 1、Ci2 δ 2、Ci2 δ 3和α2 δ 4的鈣通道亞基之間的相互作用。本發(fā)明還提供了在個體中治療或預(yù)防疼痛的方法，其包括對個體施用有效量的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑，所述拮抗劑抑制血小板反應(yīng)蛋白的活性。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白，并阻斷血小板反應(yīng)蛋白與一種或多種選自α2δ1、α2δ2, α2δ3和α2δ4的鈣通道亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的抗體。在一些實施方案中，所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體。在一些實施方案中， 所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的第三EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體。在一些實施方案種， 血小板反應(yīng)蛋白是TSP1、TSP2、TSP3、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)。在一些實施方案中，抗體特異性結(jié)合TSPl、TSP2、TSP3、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)。在一些實施方案中，抗體特異性結(jié)合多于一種血小板反應(yīng)蛋白的成員。在一些實施方案中，所述試劑是抗體模擬物的蛋白質(zhì)支架，或是來自支架的結(jié)合蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述試劑是包含選自α2δ1、α2δ2、α 2 δ 3禾Π α 2 δ 4的 丐通道亞基細胞外部分的多肽，其中多肽結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和鈣通道亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，所述試劑是包含鈣通道亞基α 2 S 1的α 2部分的多肽。在一些實施方案中，多肽包含人Q2Sl的約253到約430位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，所述試劑是包含人α2 δ 2鈣通道亞基的Ci2部分的多肽。在一些實施方案中，多肽包含人α 2 δ 2的約291到約469位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ3的Ci2部分的多肽。在一些實施方案中，多肽包含人α 2 δ 3的約256到約438位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ4的Ci2部分的多肽。在一些實施方案中，多肽包含人α2δ4的約 291到約472位氨基酸。在一些實施方案中，多肽包含人α 2 δ 4的約291到約473位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在任何所述方法的一些實施方案中，多肽是免疫黏附素。在一些實施方案中，所述試劑是特異性抑制血小板反應(yīng)蛋白表達的SiRNA、反義 RNA或微小RNA。在一些實施方案中，TSP1、TSP2、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)的表達被抑制。本發(fā)明還提供了在個體中治療或預(yù)防疼痛的方法，其包括對個體施用有效量的下述抗體，所述抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域，并且阻斷血小板反應(yīng)蛋白和所述鈣通道亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，抗體結(jié)合包含人α 2 δ 1的氨基酸253到約430的區(qū)域(VWFA 結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，抗體結(jié)合包含人α 2 δ 2的從約291到約469位氨基酸的區(qū)域(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，抗體結(jié)合包含人α 2 δ 3的從約256到約438位氨基酸的區(qū)域(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，抗體結(jié)合包含人α2 δ 4的從約291到約 473位氨基酸的區(qū)域(VWFA結(jié)構(gòu)域)?？梢酝ㄟ^本文所述的方法治療不同類型的疼痛。疼痛的類型包括但不限于，軀體疼痛；與韌帶、腱、骨、血管、筋膜或肌肉相關(guān)的疼痛；內(nèi)臟疼痛；神經(jīng)系統(tǒng)損傷、化學療法、 輻射、手術(shù)、腫瘤壓迫或事故引起的任何疼痛；癌癥疼痛；炎性疼痛；手術(shù)后疼痛；偏頭痛； 幻覺疼痛；異常性疼痛(allodynia)；或痛覺過敏(hyperalgesia)。在一些實施方案中，疼痛可以是急性或慢性的。本發(fā)明提供了在個體中治療癲癇的方法，其包括對個體施用有效量的下述抗體， 所述抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域， 并且阻斷血小板反應(yīng)蛋白和所述鈣通道亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3禾Π α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提供了在個體中促進軸突生長的方法，其包括對需要的個體施用有效量的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑。在一些實施方案中，個體遭受脊髓損傷。在一些實施方案中，個體由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或多發(fā)性硬化而遭受軸突或樹突退化。在一些實施方案中，個體遭受黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病、癌癥誘導(dǎo)的神經(jīng)病、輻射誘導(dǎo)的神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。在一些實施方案中，個體由于選自抑郁、精神分裂癥、孤獨癥、焦慮癥和攻擊而遭受軸突或樹突退化?？梢允┯帽疚乃龅娜魏窝“宸磻?yīng)蛋白試劑。本發(fā)明還提供了在個體中治療特征為鈣流入過量的障礙的方法，其包括對個體施用有效量的下述試劑，所述試劑阻斷血小板反應(yīng)蛋白和選自α2δ1、α2δ2、α2δ3和 α2 S 4的鈣亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，所述障礙選自肌肉痙攣、偏頭痛、中風、阿爾茨海默病和帕金森病。在一些實施方案中，所述試劑特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白。本發(fā)明還提供了針對增強突觸發(fā)生的活性篩選候選試劑的方法，所述方法包括 a)測量候選試劑與α2δ1，α2δ2，α2δ3，ΟΓ α2δ4多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α 2 δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成，其中與無候選試劑時突觸形成相比存在候選試劑時增加的突觸形成表明所述候選試劑具有增強突觸發(fā)生的活性。本發(fā)明還提供了針對抑制突觸發(fā)生的活性篩選候選試劑的方法，所述方法包括 a)測量候選試劑與α2δ1，α2δ2，α2δ3，ΟΓ α2δ4多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α 2 δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑和血小板反應(yīng)蛋白激動劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成，其中與無候選試劑時突觸形成相比存在候選試劑時減少的突觸形成表明所述候選試劑具有抑制突觸發(fā)生的活性。應(yīng)當理解，本文所述多種實施方案的一種、一些或所有特性可以組合形成本發(fā)明的其他實施方案。附圖概述圖IA 五聚體B亞類血小板反應(yīng)蛋白(TSP)是突觸發(fā)生的。TSP根據(jù)其結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和寡聚化狀態(tài)被分為兩個亞類。A亞類TSP(TSP 1- 是三聚體。B亞類TSP(TSP 3-5) 是五聚體。B亞類TSP的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)差異在于分子的N-端部分。它們具有不同的N-端結(jié)構(gòu)域(黑色卵形)，并且缺乏A亞類TSP中存在的前膠原(小方塊)和備解素樣重復(fù)(矩形)。而所有的TSP在C-末端共享共有的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由由三個EGF-樣重復(fù)(小卵形)、十三個鈣結(jié)合重復(fù)(長矩形)和C-端L-凝集素樣球形結(jié)構(gòu)域(淺色方塊)組成。

圖1B-F:五聚體B亞類血小板反應(yīng)蛋白(TSP)是突觸發(fā)生的。用于突觸前 synaptogamin和突觸后PSD-95共定位RGC的免疫染色顯示，無星形膠質(zhì)細胞時有很少的突觸斑(pimta，B)，但是在存在星形膠質(zhì)細胞飼喂層插入物(+星形膠質(zhì)細胞)或者TSP 3、 4和5模擬星形膠質(zhì)細胞或TSPl的突觸發(fā)生作用時有許多突觸斑，并且增加共定位的突觸斑。圖IG 五聚體B亞類血小板反應(yīng)蛋白(TSP)是突觸發(fā)生的。星形膠質(zhì)細胞、經(jīng)純化的TSPl和經(jīng)純化的重組TSP 4和5(各8nM)對突觸數(shù)量影響的量化。TSP 4和5將突觸斑數(shù)量提高至與星形膠質(zhì)細胞或TSPl相同的程度，表明TSP 4和5也是突觸發(fā)生的。圖IH 五聚體B亞類血小板反應(yīng)蛋白(TSP)是突觸發(fā)生的。通過RGC進行星形膠質(zhì)細胞和過表達的TSP3對突觸數(shù)量影響的量化。在Cos7細胞中過表達TSP3，并用該Cos7 細胞培養(yǎng)物上清飼喂RGC。作為對照條件，用來自空載體轉(zhuǎn)染的Cos7細胞的細胞培養(yǎng)物上清飼喂RGC。含TSP3的培養(yǎng)物上清將突觸斑數(shù)量提高至與星形膠質(zhì)細胞相同的程度，表明 TSP3也是突觸發(fā)生的。圖2A :EGF-樣結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生作用。TSpl和2的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。TSPl和2含有結(jié)合N-端結(jié)構(gòu)域的發(fā)夾(N)，之后是寡聚化結(jié)構(gòu)域和前膠原重復(fù)(PC)、三個備解素樣重復(fù)(1型TSP)、三個EGF-樣重復(fù)O型TSP)和十三個鈣結(jié)合重復(fù)(3型TSP)， 和一個C-端L-型凝集素樣球形結(jié)構(gòu)域(C)。圖2B =EGF-樣結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生作用。量化經(jīng)純化的TSPl 截短構(gòu)建體對突觸數(shù)量的影響。用星形膠質(zhì)細胞、全長TSPl或一組TSPl截短構(gòu)建體(各 8nM)處理RGC。含有TSPl的EGF-樣重復(fù)的構(gòu)建體是突觸發(fā)生的。圖2C =EGF-樣結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生作用。量化TSP2截短構(gòu)建體對突觸數(shù)量的影響。與TSPl構(gòu)建體相似，含有EGF-樣重復(fù)的TSP2片段也是突觸發(fā)生的。 含有與蛋白質(zhì)C-端區(qū)域結(jié)合的第三EGF-樣結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體仍然保留其大部分突觸發(fā)生活性，但是，單獨的第三EGF-樣結(jié)構(gòu)域未顯著提高突觸數(shù)量。圖2D-E =EGF-樣結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生作用?？筎SP的EGF樣重復(fù)的抗體能夠阻斷它們的突觸發(fā)生作用。與單獨培養(yǎng)的RGC相比，用星形膠質(zhì)細胞或用含有第三備解素重復(fù)與三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域的重組的TSPl (圖2D)或TSP2 (圖2E)截短構(gòu)建體培養(yǎng)的RGC形成多得多的突觸。圖3A-E 加巴噴丁阻斷TSP誘導(dǎo)的體外突觸形成。圖4A:鈣通道亞基Ci2 δ 1是涉及突觸發(fā)生的TSP受體。用空載體(pcDNA3， Invitrogen)或表達α 2 δ 1的載體(pCDNA3_ α 2 δ 1)轉(zhuǎn)染RGC。然后定量被轉(zhuǎn)染的細胞所接受的突觸(通過GFP共表達來標記)。在用空載體轉(zhuǎn)染的RGC中，細胞通過將形成的突觸數(shù)量增加超過5倍而應(yīng)答于TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域(SD》。α 2 δ 1的過表達將TSP誘導(dǎo)突觸數(shù)量的能力增強2倍。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*ρ < 0. 05。圖4Β 鈣通道亞基α 2 δ 1是涉及突觸發(fā)生的TSP受體?？梢酝ㄟ^針對α 2 δ ImRNA 的特異性SiRNA集合體(Dharmacon)降低α 2 δ 1表達。使用針對α 2 δ 1的單克隆抗體對來自ΗΕΚ293細胞(用針對大鼠α 2 δ 1和si對照或si α 2 δ 1集合體的表達載體共轉(zhuǎn)染) 的細胞裂解物進行的Western印跡分析顯示，Sia2S 1集合體特異性降低了 α 2 δ 1的表達。 用針對β -肌動蛋白的抗體印跡相同的樣品，作為上樣對照。圖4C 鈣通道亞基α 2 δ 1是涉及突觸發(fā)生的TSP受體。對siRNA轉(zhuǎn)染的RGC (通過GFP共表達標記為藍色)進行免疫染色，用于突觸前突觸結(jié)合蛋白和突觸后PSD-95的共定位。在不存在(單獨的)星形膠質(zhì)細胞時RGC形成很少的突觸斑，但是存在用非靶向的 si對照集合體轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細胞時形成許多突觸斑。另一方面，用si α 2 δ 1轉(zhuǎn)染的RGC 甚至在存在星形膠質(zhì)細胞時也不形成許多突觸。標度棒=30 μ m。圖4D 鈣通道亞基α 2 δ 1是涉及突觸發(fā)生的TSP受體。量化siRNA集合體對RGC 中星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成的影響。用非靶向si對照集合體或用針對另一 TSP受體整聯(lián)蛋白β I(Silntiil)的靶向siRNA集合體轉(zhuǎn)染的RGC應(yīng)答星形膠質(zhì)細胞時仍然形成許多突觸，然而在用Sia2S 1集合體轉(zhuǎn)染的RGC中，星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成被抑制。η =20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*ρ < 0. 05。圖4Ε 鈣通道亞基α 2 δ 1是涉及突觸發(fā)生的TSP受體。量化δ 1過表達對RGC中 TSP-誘導(dǎo)的突觸形成的影響。針對TSP-誘導(dǎo)的突觸形成，分析用僅表達α2δ1的δι部分的載體轉(zhuǎn)染的RGC。量化經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞接受的突觸。用單獨表達GFP的載體轉(zhuǎn)染的RGC 通過顯著提高形成的突觸數(shù)量而應(yīng)答于突觸發(fā)生的TSP結(jié)構(gòu)域(SD2)，然而δ 1的過表達阻斷了 SD2誘導(dǎo)突觸形成的能力。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*ρ < 0. 05。圖5Α:鈣通道功能或表達水平不影響TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的體外突觸形成。量化L-型鈣通道阻斷劑尼莫地平和硝苯吡啶(Sigma)對SD2突觸發(fā)生活性的影響。SD2甚至在存在硝苯吡啶或尼莫地平(分別為4和0.5 μ M)時也能誘導(dǎo)突觸數(shù)量的顯著增加，這表明L-型鈣通道功能不是TSP的突觸發(fā)生功能所需要的。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*ρ < 0. 05。圖5Β:鈣通道功能或表達水平不影響TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的體外突觸形成。量化L-型鈣通道亞基α IC和β的過表達在星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成中的影響。α IC 和β亞基的過表達對星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)突觸形成的能力不具有任何積極或消極的影響。η=20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*p < 0. 05。圖6A α 2 δ 1過表達體內(nèi)提高興奮性突觸的數(shù)量。針對突觸前VGlut2和突觸后 PSD95，對來自同窩出生的野生型(WT)和α2δ1過表達轉(zhuǎn)基因(TG)Ρ21小鼠的皮層進行免疫標記。TG中共定位的VGlut2/PSD95斑的數(shù)量(嵌入圖i和ii中的白色箭頭)比WT中顯著更高。標度棒=20 μ m。圖6B α 2 δ 1過表達體內(nèi)提高興奮性突觸的數(shù)量。量化來自WT和TG小鼠的腦切片中突觸前和突觸后標記VGlut2和PSD95的共定位。與TW腦相比，TG腦顯示VGlut2_PSD95 突觸數(shù)量1. 6倍左右的增加(*p < 0. 05)。圖6C α 2 δ 1過表達體內(nèi)提高興奮性突觸的數(shù)量。還針對VGlutl和PSD95對來自WT和TG小鼠的皮質(zhì)進行免疫標記。TG和WT中共定位的VGlutl/PSD95斑(嵌入圖i和 ii中的白色箭頭)的數(shù)量相似。標度棒=20 μ m0圖6D α 2 δ 1過表達體內(nèi)提高興奮性突觸的數(shù)量。量化來自WT和TG小鼠的腦切片中突觸前和突觸后標記VGlutl和PSD95的共定位。與WT腦相比，在TG腦中觀察到相似數(shù)量共定位的VGlutl/PSD95突觸。圖7A:加巴噴丁抑制TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成。為了突觸前突觸結(jié)合蛋白(紅色)和突觸后PSD-95的共定位而進行的RGC免疫染色顯示，單獨培養(yǎng)RGC時有很少的突觸斑，但是在存在SD2時有許多突觸斑。從SD2處理開始時以32 μ M濃度添加GBP抑制了 TSP誘導(dǎo)的突觸形成，這通過SD2+GBP條件中突觸前斑和突觸后斑共定位的缺乏顯示 (插入圖i比(verse) ii)。標度棒=30 μ m。圖7B 加巴噴丁抑制TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成。量化GBP對SD2-誘導(dǎo)的突觸形成的影響。只有在與突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域SD2同時添加至RGC時，GBP才阻斷TSP的突觸發(fā)生作用。在最后24小時添加至細胞時其不減少突觸數(shù)量。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*P <0. 05。圖7C 加巴噴丁抑制TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成。量化GBP對星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成的影響。在存在或不存在32 μ M GBP時用大鼠或小鼠ACM處理RGC。GBP 能夠阻斷所有ACM突觸發(fā)生活性。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差Zp < 0.05。
圖7D 加巴噴丁抑制TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成。量化來自注射了鹽水和GBP的Ρ7小鼠的腦切片中突觸前和突觸后標記VGlut2和PSD95的共定位。與注射了鹽水的腦相比時，注射了 GBP的腦顯示VGlut2-PSD95突觸數(shù)量的顯著減少Γρ < 0. 05)。圖7Ε 加巴噴丁抑制TSP/星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成。針對突觸前VGlut2和突觸后PSD95，對注射了鹽水和GBP的P7皮質(zhì)進行免疫標記。在50%注射了 GBP的小鼠中， 含有突觸前和突觸后標記VGlut2和PSD95 二者的突觸斑的數(shù)量、大小和共定位存在非常劇烈的減少(白色箭頭，嵌入圖i比ii)。標度棒=20 μ m。圖8 =GABA模擬GBP抑制培養(yǎng)物中TSP誘導(dǎo)的突觸發(fā)生的作用。量化GABA對SD2 誘導(dǎo)的突觸形成的影響。如前文所示，GBP(32yM)阻斷SD2的突觸發(fā)生活性。以ImM濃度添加至RGC時，GABA也是抑制性的。以更低(10和100 μ Μ)濃度使用時，GABA不減少SD2 誘導(dǎo)的突觸數(shù)量。η = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*ρ < 0. 05。圖9Α TSP誘導(dǎo)的突觸形成涉及桶狀皮層(barrel cortex)可塑性。腮須墊 (whisker pad)的組織被概括為指向小鼠的桶狀皮層。實驗范例的示意P1處C-排腮須的切除引起P7處相應(yīng)對側(cè)桶狀表現(xiàn)收縮和融合，同時臨近的桶侵入被切除的桶的領(lǐng)域。圖9B =TSP誘導(dǎo)的突觸形成涉及桶狀皮層可塑性。用針對5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白 (5-HTT)的抗體在切向皮質(zhì)切片中免疫染色，標記了朝向桶狀皮層的丘腦-皮層輸入。左圖顯示完整的腮須墊對側(cè)的桶狀皮層(未損傷的“對照”側(cè))。右圖是注射鹽水(上圖)、 GBP(中圖)的小鼠中腮須毛囊(follicle)切除后損傷誘導(dǎo)的可塑性的代表性實例。底部一排是來自TSP 1/2K0小鼠的對照(左圖)和損傷(右圖)的桶狀皮層。箭頭在對應(yīng)于損傷的腮須的C-排桶兩側(cè)。括號和虛線顯示D-排桶的擴展。星號標記了異常的損傷誘導(dǎo)的可塑性的區(qū)域。圖9C :TSP誘導(dǎo)的突觸形成涉及桶狀皮層可塑性。來自相同小鼠(其桶展示于(B) 中)腮須墊的蘇木精染色顯示缺失C排，但是相鄰各排的毛囊仍然存在。圖10 注射鹽水和GBP的小鼠中桶狀皮層可塑性表型的集合。用針對5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-HTT)的抗體對切向皮質(zhì)切片的免疫染色標記了朝向桶狀皮層的丘腦-皮層傳入。對標記為1-8的每個小鼠而言，左圖顯示完整腮須墊對側(cè)的桶狀皮層(未損傷的對照側(cè))。右圖是注射鹽水(小鼠1-4)、GBP(小鼠5-8)的小鼠中腮須毛囊切除后損傷誘導(dǎo)的可塑性的代表性實例。GBP注射未影響桶狀皮層形成，因為桶以與注射鹽水的小鼠(左圖小鼠1-8)相似的方式形成，然而，在50%的小鼠中，注射GBP誘導(dǎo)了異常的桶狀皮層可塑性表型。在這些小鼠中，通常A、B和C排受損傷的皮層失去形狀、擴散并合并在一起(小鼠5)。 在一種情況下，只有相鄰的D排擴散并與C排合并，并且失去形狀。在一種極端情況下，大部分桶狀皮層失去其形狀并且擴散(小鼠7)。注射鹽水的小鼠均未顯示這些種類的表型， 它們均展示正常的桶狀皮層可塑性(小鼠1-4，右圖)。注射GBP的一半小鼠也顯示異常的桶狀皮層可塑性表型(小鼠8)。圖IlA 血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道亞基α 2 δ 1相互作用。RGC在培養(yǎng)物中表達鈣通道亞基Ci2 δ 1。通過Western印跡，使用針對α 2 δ 1的單克隆抗體，針對α2δ1蛋白質(zhì)的存在分析九個DIV RGC裂解物。在單獨培養(yǎng)(第1道)或者存在星形膠質(zhì)細胞(第2道) 或者存在TSPl(第3道)培養(yǎng)時，RGC表達Ci2 δ 1。使用任何這些處理時，α 2 δ 1水平都不改變，測試每個樣品中的β -肌動蛋白水平，作為上樣對照。圖IlB 血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道亞基Ci2 δ 1相互作用。Ci2 δ 1與來自Ρ5大鼠腦皮質(zhì)裂解物的TSP1、2和4 一起免疫沉淀。使用特異性兔多克隆抗體，將來自P5皮質(zhì)裂解物的TSPl、2和4免疫沉淀。通過對免疫沉淀(IP)級分的Wfestern印跡分析檢測α 2 δ 1。 TSP1、2或4與α2 δ 1共免疫沉淀，而在模擬的兔多克隆抗體的IP級分中未檢測到α2δ1。圖IlC 血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道亞基α 2 δ 1相互作用。α 2 δ 1與TSP2的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域(SD》相互作用。單獨(1)或者在存在SD2Q)或另一無關(guān)分泌型蛋白質(zhì)對照-myC-his(3)時，在HEK293細胞中表達FLAG標記的α2δ1。然后使用與針對FLAG-標簽的抗體綴合的瓊脂糖珠子，從HEK293細胞膜裂解物中免疫沉淀α 2 δ 1 (第1至3道)。使用抗-His-標簽抗體，通過Wfestern印跡分析IP級分中SD2或?qū)φ?myc-his蛋白質(zhì)的存在(第4-6道)。SD2與α 2 δ 1 —起共免疫沉淀(第5道)，而對照-his-myc蛋白質(zhì)未顯示SD2和α 2 δ 1之間的特異性相互作用(第6道)。圖IlD 血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道亞基α 2 δ 1相互作用。SD2與α 2 δ 1相互作用， 但是不與鈣通道亞基α IC相互作用。在HEK 293細胞中以不同的組合共表達SD2和鈣通
11道亞基α 、α 2 δ 1和β。第1道L-型鈣通道的α 2 δ 1、α IC和β亞基。第2道α IC 和β亞基與SD2。第3道α 2 δ 1和SD2。第4道α 1C、α 2 δ 1和β亞基與SD2。通過利用其C-端myc-標簽，從這些溶解的HEK293膜中免疫沉淀SD2蛋白質(zhì)。分析IP級分中鈣通道亞基α 2 δ 1或α IC的存在。共免疫沉淀SD2和α 2 δ 1，與α 1和β亞基的不存在或存在無關(guān)(第7和8道)。在存在或不存在α 2 δ 1亞基時，SD2不與α IC相互作用(第6 和8道)。圖12Α :TSP2突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體SD2的制備和測試。圖示突觸發(fā)生的TSP2構(gòu)建體SD2。該構(gòu)建體含有來自IgG K鏈(SQ的用于分泌的信號序列，之后是TSP的第三備解素樣重復(fù)(P； )和三個突觸發(fā)生的EGF-樣重復(fù)(EH)。為了免疫檢測、免疫沉淀和純化的目的引入C-端myc-和His-標簽。圖12B =TSP突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體SD2的制備和測試。通過在HEK293細胞中過表達來大量生產(chǎn)SD2。然后通過使用鎳-螯合層析，從培養(yǎng)基中將蛋白質(zhì)純化至同質(zhì)。通過 SDS-PAGE分析含有純凈蛋白質(zhì)的柱洗脫級分，并且通過考馬斯(commassie)染色檢驗蛋白質(zhì)的純度(第 1-3 道)。M =分子量標記206、130、87、42、31、17 和 7kDa(BioRad)。圖12C :TSP2突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體SD2的制備和測試。單獨培養(yǎng)RGC時(對照)， 針對突觸前突觸結(jié)合蛋白和突觸后PSD-95的共定位的RGC免疫染色顯示有很少突觸斑，但是存在SD2時有許多突觸斑(嵌入圖ii中的白色箭頭)。標度棒=30μπι。圖12D :TSP2突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體SD2的制備和測試。量化SD2對突觸數(shù)量影響的劑量應(yīng)答。在10-20nM范圍內(nèi)，SD2最有效地提高突觸數(shù)量，但是在高于50nM濃度時喪失其突觸發(fā)生活性。N = 20個細胞，誤差棒為均值士標準差，*p < 0. 05。圖13A 將TSP4蛋白質(zhì)鞘內(nèi)注射進首次實驗的大鼠，以劑量依賴型和可逆的方式誘導(dǎo)了行為超敏感性。TSP蛋白質(zhì)作用的發(fā)作時間是注射后2天，峰作用在注射后2-4天發(fā)生。加巴噴丁或鹽水推注處理注射在TSP4推注(45yg/大鼠)后三天開始，之后是處理注射后1小時的行為測試，再之后是每日行為測試。鞘內(nèi)推注加巴噴丁(而不是鹽水)阻斷了 TSP4的疼痛誘導(dǎo)作用。加巴噴丁作用持續(xù)1-2天。PWT表示針對von Frey細絲刺激的爪退縮閾值。圖UB-C 活性TSP4抗體的鞘內(nèi)注射在脊神經(jīng)結(jié)扎(Iigated)的大鼠中以劑量依賴型方式逆轉(zhuǎn)觸覺異常性疼痛。向兩周L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠中以80 μ g/大鼠或不同劑量鞘內(nèi)推注TSP4抗體(圖13B-C)。推注活性TSP4抗體在損傷位點處逆轉(zhuǎn)了確立的異常性疼痛。在圖13B和C中，丨‘PWT"是指針對von Frey細絲刺激的爪退縮閾值；“活性”表示活性抗體；“無活性”表示煮沸(boind)lO分鐘的抗體；“相反”表示非損傷側(cè)；“Ips”表示損傷側(cè)；誤差棒為均值士標準差；與處理前水平相比"*"表示ρ < 0. 05，“ 表示ρ < 0. 01。圖13D :TSP4抗血清的搶先式(Pre-emptive)鞘內(nèi)注射在脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中阻止了觸覺異常性疼痛的發(fā)生。使用TSP4抗體的搶先式鞘內(nèi)每日處理(80 μ g/大鼠/天) 在結(jié)扎剩余的L5/6脊神經(jīng)之前開始。使用TSP4抗體的搶先式處理延遲損傷誘導(dǎo)的異常性疼痛的發(fā)作顯示針對對機械刺激的降低的爪退縮閾值(PWT)。顯示的數(shù)據(jù)為均值士標準差?！癓”表示左(結(jié)扎)側(cè)；“R”表示右(未損傷)側(cè)?！氨硎九c鹽水(L)相比ρ < 0. 05 ； ‘‘ **"表示與鹽水(L)相比ρ < 0. 01 ； ‘‘ 表示與鹽水(L)相比ρ < 0. 001。
圖13E :TSP4反義寡聚脫氧核苷酸的鞘內(nèi)注射在脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中以序列特異性和可逆的方式逆轉(zhuǎn)了觸覺異常性疼痛。結(jié)扎損傷后5周，向脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中鞘內(nèi)注射(50 μ g/大鼠/天)兩種TSP4反義寡核苷酸(#1和#2)，持續(xù)4天。TSP4反義寡核苷酸 #2的每日鞘內(nèi)注射引起損傷側(cè)中確立的異常性疼痛的完全逆轉(zhuǎn)。在盲目注射之前進行每日行為測試。顯示了每組η = 6中的均值士標準差?！跋喾础笔侵阜菗p傷側(cè)；“Ips"是指 L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎側(cè)?！?〃表示與處理前水平相比ρ < 0. 05。發(fā)明詳述對需要的個體提供下述方法和組合物，其用于保護或治療遭受突觸發(fā)生中缺陷的不利作用的個體，或者防止個體遭受突觸發(fā)生中缺陷的不利作用，或者防止個體遭受不想要的活性突觸發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)對多種臨床病癥具有廣泛的意義，所述病癥包括外傷性腦損傷、癲癇，和其中不能形成突觸或者不適當?shù)匦纬赏挥|的其他病癥。通過將神經(jīng)元與屬于血小板反應(yīng)蛋白特異性激動劑的試劑接觸，增強突觸發(fā)生。相反地，通過將神經(jīng)元與血小板反應(yīng)蛋白抑制物或拮抗劑接觸來抑制突觸發(fā)生。在神經(jīng)肌肉接頭處，例如在脊髓運動神經(jīng)元(spinal motor neuron)和肌肉的接頭處遞送外源血小板反應(yīng)蛋白或其激動劑，在正常的CNS中誘導(dǎo)新的突觸，從而在CNS損傷后促進修復(fù)。在成年人中恢復(fù)突觸發(fā)生的能力具有以下重要意義在正常腦中增強記憶； 治療阿爾茨海默病(其中損失突觸的一種疾病)以及在中風或脊髓損傷后在受損的CNS的修復(fù)和再生中促進新突觸發(fā)生；在肌肉營養(yǎng)不良、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)中增強神經(jīng)肌肉連接等等。外源血小板反應(yīng)蛋白或其激動劑的遞送還適用于與神經(jīng)祖細胞組合施用，或者提高神經(jīng)發(fā)生，從而促進新生神經(jīng)元和其他神經(jīng)元與效應(yīng)細胞之間的功能性聯(lián)系。血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑適用于治療有過量的、不想要的突觸的疾病。成年人腦可在損傷后上調(diào)“反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞”中的血小板反應(yīng)蛋白，這形成神經(jīng)膠質(zhì)疤痕(glial scar)。神經(jīng)膠質(zhì)疤痕與癲癇基因座相關(guān)，并且可誘導(dǎo)成為癲癇基礎(chǔ)的不想要的過量的突觸發(fā)生。類似地存在不想要的額外突觸，其成為成癮癥和/或疼痛的長期藥物成癮的基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了用可溶的因素調(diào)控突觸發(fā)生的方法。發(fā)現(xiàn)血小板反應(yīng)蛋白足以提高神經(jīng)元上的突觸形成，特別是通過血小板反應(yīng)蛋白共享的共有EGF樣結(jié)構(gòu)域(包括第三EGF-樣結(jié)構(gòu)域)的作用增加突觸形成。該結(jié)構(gòu)域與廣泛表達的跨膜神經(jīng)元細胞表面分子——韓通道亞基α 2 δ 1相互作用。阻斷血小板反應(yīng)蛋白和α 2 δ 1之間相互作用的試劑適用于抑制突觸形成，例如適用于治療疼痛、癲癇、焦慮癥、成癮癥和幫助再生的神經(jīng)元的軸突生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與α2 δ 1結(jié)合的加巴噴丁和對血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域特異性的抗體特異性地抑制血小板反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的突觸形成。感興趣的方法包括通過將神經(jīng)元與血小板反應(yīng)蛋白EGF樣結(jié)構(gòu)域或其模擬物(例如對抗性抗體)接觸來增強突觸發(fā)生，并且通過阻斷血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域和％51、(!25 2、(1253或(1254多肽或蛋白質(zhì)之間的相互作用來抑制突觸發(fā)生。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了針對調(diào)控突觸形成(包括抑制突觸形成)的能力篩選候選試劑的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元。在另一個實施方案中，神經(jīng)元是外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。篩選可包括接觸α 2 δ 1、α 2 δ 2、 α2δ3或α2 δ 4多肽或蛋白質(zhì)，并測定試劑與α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3或α2 δ 4結(jié)合或以其他方式相互作用的能力。這類篩選實驗可進一步包括測定候選試劑對表達α 2 δ 1、α 2 δ 2、α2δ3或Ci2 δ 4的細胞的影響。這類試劑是用于治療性處理癲癇和以不想要的突觸發(fā)生為特征的其他病癥的候選者。施用血小板反應(yīng)蛋白、其激動劑和模擬物，以增強突觸發(fā)生，尤其是施用包含至少一個EGF-樣結(jié)構(gòu)域的血小板反應(yīng)蛋白肽，或模擬血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域活性的對抗性抗體。所有5種已知的血小板反應(yīng)蛋白同種型由于共享EGF-樣結(jié)構(gòu)域而具有強突觸誘導(dǎo)活性。施用抑制物(例如抗體、加巴噴丁及其類似物等等)來抑制突觸發(fā)生。TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域可用于在下述區(qū)域中刺激突觸形成，所述區(qū)域中的突觸由于神經(jīng)退化疾病例如阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、多發(fā)性硬化、黃斑變性、青光眼、中風、 神經(jīng)病衰老等等而損失。在其他實施方案中，阻斷TSP介導(dǎo)的突觸形成的試劑例如α2δ1 配體(如加巴噴丁、普瑞巴林等等)、TSP的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的特異性抗體等等可用于抑制突觸形成。這類方法可用于在下述情況下預(yù)防異常的突觸形成對再生的軸突的損傷后，例如對神經(jīng)(包括眼神經(jīng))的損傷后，青光眼或脊髓損傷后的脊髓神經(jīng)元中等等。軸突發(fā)生調(diào)節(jié)劑可以局部施用，例如施用給眼神經(jīng)或脊髓。定義在本文中使用時，突觸發(fā)生表示神經(jīng)元上突觸前和/或突觸后形成的過程。增強突觸發(fā)生導(dǎo)致增加的突觸數(shù)量，而抑制突觸發(fā)生導(dǎo)致突觸數(shù)量的減少，或者在其他情況下應(yīng)當發(fā)生增加時增加的缺乏。在本文中使用時，突觸的“擴大(augmentation)”或“調(diào)控” 表示根據(jù)特定情況所需增強或阻抑形成的突觸數(shù)量。在本文中使用時，術(shù)語“血小板反應(yīng)蛋白”可表示下述蛋白質(zhì)家族之任一，所述蛋白質(zhì)家族包括血小板反應(yīng)蛋白I、II、III、IV和軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白質(zhì)。也可表示一種或多種特定的血小板反應(yīng)蛋白。血小板反應(yīng)蛋白是由三個相同亞基(TSP1和TSP》組成的同源三聚體蛋白質(zhì)或由5個相同亞基(TSP 3-5)組成的同源五聚體蛋白質(zhì)糖蛋白，其具有MW 180，000的二硫鍵連接的亞基。其含有針對凝血酶、凝血因子I、肝素、纖連蛋白、纖溶酶原、 纖溶酶原激活物、膠原、層粘連蛋白、鈣等等的結(jié)合位點，也含有與前膠原、備解素和表皮生長因子(EGF)同源的結(jié)構(gòu)域。其在許多細胞粘附和遷移事件(包括血小板聚集)中發(fā)揮作用。在本文中使用時，術(shù)語“突觸發(fā)生的調(diào)節(jié)劑”是指能夠改變突觸形成的試劑。調(diào)節(jié)劑包括但不限于“活化物”和“抑制物”?！盎罨铩被颉凹觿笔窃鰪娡挥|發(fā)生的物質(zhì)。相反，“抑制物”或“拮抗劑”減少突觸數(shù)量。減少可以是完全或部分的。在本文中使用時，調(diào)節(jié)劑包括血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑和激動劑。在本文中使用時，術(shù)語“軸突和/或樹突生長的調(diào)節(jié)劑”是指能夠改變軸突和/或樹突生長的試劑。調(diào)節(jié)劑包括但不限于“活化物”和“抑制物”。“活化物”或“激動劑”是增強軸突和/或樹突生長的物質(zhì)。相反，“抑制物”或“拮抗劑”降低軸突和/或樹突生長。所述降低可以是全部或者部分的。在本文中使用時，調(diào)節(jié)劑包括血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑和激動劑。本文使用“試劑”是指生物、藥物或化學化合物。非限制性的實例包括單一或復(fù)合的有機或無機分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、糖類、毒素或化學治療化合物?？珊铣啥喾N化合物，例如小分子和寡聚體(例如寡肽和寡核苷酸)，以及基于多種核心結(jié)構(gòu)的合成有機化合物。另外，多種天然來源可提供用于篩選的化合物，例如植物或動物提取物等等。熟練技術(shù)人員可容易地認識到不存在對本發(fā)明試劑結(jié)構(gòu)性質(zhì)的限制。可隨機選擇或理性選擇或設(shè)計本發(fā)明方法使用的試劑。在本文中使用時，在一些實施方案中，當試劑是隨機選擇而不考慮涉及血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道(例如α 1 δ 2鈣通道)結(jié)合的特定序列時，稱該試劑為隨機選擇的。隨機選擇的試劑的一個實例是化學文庫或肽組合文庫的應(yīng)用。激動劑和拮抗劑可包括蛋白質(zhì)(既多肽)、核酸、糖類、抗體，或影響目的蛋白質(zhì)和 /或分子的任何其他分子。在一些實施方案中，拮抗劑可抑制(例如降低)目的蛋白質(zhì)和/ 或分子的一種或多種活性或功能。在一些實施方案中，激動劑可刺激(例如提高)目的蛋白質(zhì)和/或分子的一種或多種功能。術(shù)語“類似物”在本文中用于表示結(jié)構(gòu)或功能上與目的分子類似，但是以定向和受控的方式被修飾的分子，所述修飾通過用替代性的取代基代替參照分子的特定取代基來進行。與初始分子相比，類似物可展示相同、類似護或改進的功用。為了鑒定具有改進的性狀(例如對特定受體類型的更高潛能，或?qū)Π邢虻氖荏w類型的更高選擇性，和對其他受體類型的更低活性水平)的已知化合物的變體而合成和篩選類似物，是制藥化學中公知的一種途徑?！翱贵w”為能夠通過至少一個位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的抗原識別位點與靶標 (例如糖類、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。本文使用該術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、天然變體、包含具有所需特異性的抗原識別位點的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體和包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型。術(shù)語“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括其片段 (例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、單鏈(kFv)、其突變體、含有抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體，和含有所需特異性的抗原識別位點和結(jié)合抗原能力的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型。不旨在限制抗體來源或制備抗體的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉(zhuǎn)基因動物等)?！叭嗽椿笨贵w是指一種分子，其具有主要來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點和基于人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)?？乖Y(jié)合位點可包含與恒定域融合的完整可變結(jié)構(gòu)域，或只包含移植進可變結(jié)構(gòu)域中合適框架區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點可以是野生型的，或被一個或多個氨基酸取代修飾，例如被修飾為與人免疫球蛋白更加近似。一些形式的人源化抗體保留所有CDR序列(例如含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式的人源化抗體具有一個或多個(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)相對于原始抗體改變了的CDR，其還被稱為“衍生自”一個或多個CDR的一個或多個CDR?！扒逗峡贵w”是指這些抗體其中重鏈和輕鏈氨基酸序列各自的一部分與來自于具體物種或?qū)儆诰唧w種類的抗體中相應(yīng)的序列同源，而鏈的剩余區(qū)段與另一抗體中的相應(yīng)序列同源。通常在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈二者的可變區(qū)均模擬來自于一種哺乳動物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與來自于另一物種的抗體序列同源。這類嵌合形式的一個清楚的優(yōu)點在于，例如可以使用容易獲得的來自非人宿主的雜交瘤或B細胞從目前已知的來源便利地獲得可變區(qū)，而恒定區(qū)來自于例如人細胞制劑。盡管可變區(qū)具有易于制備的優(yōu)點并且特異性不受其來源影響，但是注射抗體時與來自非人來源的恒定區(qū)相比，屬于人的恒定區(qū)更少可能引起來自人受試者的免疫應(yīng)答。然而，該定義不限于這一具體的實例。在本文中使用時，術(shù)語“免疫黏附素”是指下述抗體樣分子，其組合了異源蛋白質(zhì) (“黏著物”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能。在結(jié)構(gòu)上，免疫黏附素包括免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列與具有期望的結(jié)合特異性的氨基酸序列的融合物，所述氨基酸序列與抗體的抗原識別和結(jié)合位點不同(既為“異源的”)。免疫黏附素分子的黏附素部分通常是連續(xù)的氨基酸序列，其至少包含受體或配體的結(jié)合位點。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可得自任何免疫球蛋白，例如IgG-I、IgG-2、IgG-3或IgG_4亞型，IgA(包括 IgA-I和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物優(yōu)選地包括用本文所述多肽或抗體的結(jié)構(gòu)域替換Ig分子內(nèi)的至少一個可變區(qū)。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白融合物包含 IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3，或鉸鏈、CHU CH2和CH2區(qū)域。免疫球蛋白融合物的產(chǎn)生也參閱1995年6月27日提交的美國專利No. 5，4 ，130。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了下述免疫黏附素，其包含鈣通道的所有或部分細胞外結(jié)構(gòu)域(例如Q2S亞基或α2亞基) 或其片段和融合配偶體，例如抗體Fc結(jié)構(gòu)域?？贵w“可變區(qū)”是指單獨或組合的抗體輕鏈可變區(qū)或抗體重鏈可變區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自由通過三個互補決定區(qū)(CDR，也已知為高變區(qū))連接的四個框架區(qū)(FR) 組成。每個鏈中的CDR通過FR與來自其他鏈的CDR緊密結(jié)合在一起，有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點。至少存在兩種確定CDR的技術(shù)(1)基于跨物種序列變異性的途徑(即 Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest,(第 5 版，1991, National Institutes ofHealth, Bethesda MD))；和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物晶體學研究的途徑 (ΑΙ-lazikani 等(1997) J. Molec. Biol. 273 :927-948))。在本文中使用時，CDR可以表示通過任一途徑或通過兩種途徑的組合確定的CDR。抗體“恒定區(qū)”是指單獨或組合的抗體輕鏈恒定區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)。如果與結(jié)合其他物質(zhì)相比，抗體以更大的親和力、親合力、更容易和/或以更長的持續(xù)時間與靶標結(jié)合，則抗體與靶標“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。例如，與血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道表位特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體是以與結(jié)合其他血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道表位或非血小板反應(yīng)蛋白和/或非鈣通道表位相比，以更大的親和力、親合力、更容易和 /或以更長的持續(xù)時間結(jié)合該血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道表位的抗體。通過閱讀該定義還應(yīng)理解，例如特異或優(yōu)先結(jié)合第一靶標的抗體(或片段或表位)可以與第二靶標特異或優(yōu)先結(jié)合，或可不與第二靶標特異或優(yōu)先結(jié)合。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不必須要求(盡管可以包括)排他性結(jié)合。通常結(jié)合表示優(yōu)先結(jié)合，但不必須如此。在本文中關(guān)于抗體使用時，術(shù)語“標記的”旨在包括通過將可檢測的物質(zhì)如放射性試劑或熒光團(例如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE))與抗體偶聯(lián)(既物理連接) 來直接標記抗體，以及通過與可檢測物質(zhì)的反應(yīng)性間接標記探針或抗體。在本文中使用時，“基本純凈”表示至少50%純凈(即不含污染物)、更優(yōu)選至少 90%純凈、更優(yōu)選至少95%純凈、更優(yōu)選至少98%純凈、更優(yōu)選至少99%純凈的物質(zhì)。術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換用于表示任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性或分支的，其可包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語還包括被天然修飾或通過間插修飾的氨基酸聚合物，所述修飾例如二硫鍵形成、 糖基化、酯化、乙?；?、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標記組分綴合。還包括在該定義中的是例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括但不限于非天然氨基酸)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。應(yīng)當理解，因為本發(fā)明的多肽以抗體為基礎(chǔ)，所以多肽可作為單鏈或結(jié)合的鏈出現(xiàn)。本文中編碼抗體的“分離的”核酸分子是經(jīng)鑒定并與在其產(chǎn)生環(huán)境中與之常規(guī)結(jié)合的至少一種污染性核酸分子分離的核酸分子。優(yōu)選地，分離的核酸不與產(chǎn)生環(huán)境中結(jié)合的所有組分結(jié)合。本文中編碼多肽和抗體的該分離的核酸分子的形式與其天然形式或環(huán)境不同。因此，分離的核酸分子與細胞中天然編碼本文多肽和抗體的核酸有所區(qū)別。術(shù)語“控制序列”是指有效連接的編碼序列在具體宿主生物中表達必需的DNA序列。適合原核生物的控制序列例如包括啟動子，任選地包括操縱子序列，以及核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。當核酸置于與另一核酸序列的功能性關(guān)系中時，核酸是“有效連接”的。例如，當前序列或分泌前導(dǎo)序列被表達為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)時，所述前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽DNA有效連接；當啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，所述啟動子或增強子與所述編碼序列有效連接；或核糖體結(jié)合位點的位置有助于翻譯時，所述核糖體結(jié)合位點與編碼序列有效連接。通常，“有效連接”表示連接的DNA序列是近鄰的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是近鄰并且按照讀碼框的。然而，增強子不必須是近鄰的。連接通過便利的限制性位點處的連接完成。如果這樣的位點不存在，則可以根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接子。在本文中使用時，術(shù)語“表位帶標簽”表示嵌合多肽，其包含與“標簽多肽”融合的本文所述多肽或抗體。標簽多肽具有足夠的殘基來提供能夠針對它制造抗體的表位，但是足夠短從而不影響與之融合的多肽的活性。標簽多肽優(yōu)選地也非常獨特，從而抗體不與其他表位大量交叉反應(yīng)。合適的標簽多肽通常具有至少六個氨基酸殘基，并且通常在約8和 50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選約10和20個氨基酸殘基之間)?！八拗骷毎卑▊€體細胞或細胞培養(yǎng)物，其可以是或者已經(jīng)是用于摻入多核苷酸插入片段的載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，并且所述后代由于天然、意外或故意的突變而可以不必須與原始親本細胞(在形態(tài)上或者基因組DNA補體上)完全相同。宿主細胞可包括用本發(fā)明的多核苷酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細胞。在本文中關(guān)于肽、多肽或抗體序列的，“百分比(％ )氨基酸序列同一性”和“同源性”是指為了實現(xiàn)最大百分比序列同一性而將序列對齊并在需要時引入缺口后候選序列中與特定肽或多肽序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，并且不考慮保守取代作為序列同一性的部分。為了測定百分比氨基酸序列同一性目的的比對可以用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 MEGALIGNTM(DNASTAR)軟件來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于測量比對的合適的參數(shù)， 包括在所比較的序列全長上實現(xiàn)最大比對所需的任何算法。在本文中使用時，術(shù)語“ RNA干擾”或“ RNAi ” 一般是指下述過程，其中雙鏈RNA分子或短發(fā)夾RNA分子降低或抑制與所述雙鏈或短發(fā)夾RNA分子共享大量或全部同源性的核酸序列的表達。術(shù)語“短干擾RNA”或“siRNA”或“RNAi試劑”是指引起RNA干擾的RNA序列。見 Kreutzer 等，WO 00/44895 ;Zernicka_Goetz 等，WO 01/36646 ；Fire, WO 99/32619 ； Mello和Fire，WO 01/29058o在本文中使用時，siRNA分子包括下述RNA分子，所述RNA分子包含化學修飾的核苷酸和非核苷酸。術(shù)語“ddRNAi試劑”是指由外源載體轉(zhuǎn)錄的DNA定向的RNAi試劑。術(shù)語“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”是指具有雙鏈體區(qū)域和環(huán)區(qū)域的RNA結(jié)構(gòu)。 在某些實施方案中，ddRNAi試劑最初表示為shRNA。在本文中使用時“運載體”包括可藥用的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，其在使用的劑量和濃度下對與之接觸的細胞或哺乳動物無毒。通常生理學可接受的運載體是水性PH緩沖的溶液。生理學可接受的運載體的實例包括緩沖液例如磷酸、檸檬酸和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精類；螯合劑例如 EDTA ；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。“可藥用”緩沖液和鹽包括來自于上述酸和堿的酸和堿加成鹽的緩沖液和鹽。特定的緩沖液和/或鹽包括組氨酸、琥珀酸鹽和乙酸鹽。術(shù)語“藥物配制物”是指下述制劑，其形式允許活性成分的生物活性有效，并且不含有下述額外組分，所述組分對要施用所述配制物的受試者具有不可接受的毒性。這類配制物是無菌的。在本文中使用時，“神經(jīng)”或“認知”功能表示腦中突觸的增加提高患者思考、工作等等的能力。在存在軸突損失和再生長的狀況下，可以存在運動和感覺能力的恢復(fù)。在本文中使用時，術(shù)語“治療”是指被設(shè)計為在臨床病理學過程期間改變被治療的個體或細胞的天然過程的臨床介入。期望的治療效果包括降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)、和減輕或者改善的預(yù)后。例如如果與疾病或病癥相關(guān)的一個或多個癥狀減輕或者消除，則個體被成功地“治療”。在本文中使用時，術(shù)語“預(yù)防”包括在個體中提供關(guān)于疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)的預(yù)防。個體可以是易感染疾病但尚未被診斷罹患所述疾病的?！坝行Я俊笔侵笇崿F(xiàn)想要的治療或預(yù)防結(jié)果所必需的至少有效的量、劑量和時間周期。有效量可以在一次或多次施用中提供?！爸委熡行Я俊笔菍崿F(xiàn)具體障礙的可測量改善所需的至少最小的濃度。本文中治療有效量可根據(jù)下述因素變化，例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和患者體重，和抗體在個體中引起期望的應(yīng)答的能力。治療有效量也是治療有益效果優(yōu)于任何有毒或有害作用的量?！邦A(yù)防有效量”是指實現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果所需的有效量、劑量和時間周期。通常但不必須，因為預(yù)防劑量在受試者中在疾病之前或者早期使用，所以預(yù)防有效量可少于治療有效量?！奥浴笔┯檬侵概c急性模式相反的連續(xù)藥物施用，從而將初始治療效果(活性) 維持延長的時間段。“間歇性”施用是指下述處理，所述處理不是無間隔地連續(xù)進行，而是實際上周期性進行的。在本文中使用時，“組合”施用包括同時施用和/或不同時施用。組合施用還包括作為共同配制物施用，或者作為單獨的組合物施用，包括以不同的給藥頻率或間隔施用，并且使用相同施用途徑或不同施用途徑?！皞€體”或“受試者”是指哺乳動物，包括人、家養(yǎng)動物和農(nóng)場動物，和動物園、運動或?qū)櫸飫游?，例如猩猩和其他猿和猴物種、狗、馬、兔、牛、豬、山羊、綿羊、倉鼠、荷蘭豬、沙鼠、小鼠、白鼬、大鼠、貓等等。優(yōu)選個體為人。該術(shù)語不意味著具體的年齡或性別。在本文中使用時術(shù)語“約”是指該技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員容易已知的個別數(shù)值的常見誤差范圍。涉及“約”時，本文的數(shù)值或參數(shù)包括(并且描述)了涉及該數(shù)值或參數(shù)本身的實施方案。在本文中使用時，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式。應(yīng)當理解，本文所述的本發(fā)明的方面和實施方案包括由方面和實施方案“組成”和 /或“基本由其組成”。調(diào)控軸突牛長和/或突觸發(fā)牛的方法本發(fā)明提供了在個體中調(diào)控軸突生長和/或突觸發(fā)生的方法。所述方法包括施用有效劑量的下述試劑，所述試劑調(diào)控血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道的亞基(例如 Ci2 δ 1、Ci2 δ 2、Ci2 δ 3和Ci2 δ 4)。在一些實施方案中，所述試劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白和/ 或鈣通道的α2δ亞基。在一些實施方案中，所述試劑是激動劑。在一些實施方案中，所述試劑是拮抗劑。鈣通道α V δ亞基在本文所述任何方法的一些實施方案中，鈣通道是由電壓門控的Ca2+(Cav)通道， 所述鈣通道由形成孔的α 1亞基組成，所述α 1亞基至少在CavI和2亞家族的情況下與負責運輸?shù)募毎麅?nèi)β亞基和跨膜α 2 S (例如α 2 S 1)亞基結(jié)合。α 1亞基決定該通道的主要生物物理學特性，并且由其他亞基調(diào)控。CACNA2D 1基因編碼骨骼肌和腦電壓依賴型鈣通道的α J δ亞基，所述α 2/ δ亞基是包含4個亞基的異聚多亞基復(fù)合物α -1、α -2/ δ、β -1和Υ。該分子的替代性名稱包括α 2 δ亞基1 ；Cacnddl ；鈣通道α 2 δ -1 ；鈣通道、電壓依賴型α 2/ δ 1亞基；鈣通道、電壓依賴型α J δ亞基1 ；Cchl2a ；和電壓依賴型鈣通道α 2 δ -1。CACNA2D1改變電壓門控鈣通道的成孔α 1亞基的特性，并且在翻譯后被加工成通過二硫鍵結(jié)合在一起的2個肽—— α-2亞基和δ亞基。α-2亞基/δ蛋白質(zhì)由至少4個不同的基因編碼CACNA2D1 ( α 2 δ 1)、 CACNA2D2 ( α 2 δ 2)、CACNA2D3 ( α 2 δ 3)禾口 CACNA2D4 ( α 2 δ 4)(見例如 Schleithoff 等， 1999Genomics 61 :201-209 ；和 Field 等(2006) Proc. Nat. Acad. ScL 103 :17537-17542, 過參考明確并入本文)?；蚪M序列和蛋白質(zhì)序列是公眾可獲得的。例如，α2δ 1的基因組序列Genbank登錄號為BCl 17470 ； α 2 δ 1的蛋白質(zhì)序列的Genbank登錄號為AAI 17471 ； α2δ2的蛋白質(zhì)序列的Genbank登錄號為ΑΑΙ5Μ39 ； α 2 δ 3的蛋白質(zhì)序列的Genbank登錄號為ΑΑΙ37506和ΑΑΙ37502 ； α 2 δ 4的蛋白質(zhì)序列的Genbank登錄號為ΑΑΙ50187。lies 等(1994)Hum. Molec. Genet. 3 :969-975 克隆和部分測序了 CACNL2A 基因。 CACNL2A在許多組織中表達，包括骨骼肌、腦、心和肺。代表骨骼肌和腦同種型的cDNA序列的比較顯示它們由單個基因編碼。由外顯子37到40編碼的“ δ ”部分在轉(zhuǎn)錄后從蛋白質(zhì) “α”部分的C-端切下。δ部分的跨膜區(qū)由外顯子40編碼。CACNA2D1基因經(jīng)歷外顯子19 和M處的替代性剪接，這兩個外顯子分別對應(yīng)于肌肉和腦同種型。
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α2δ蛋白質(zhì)的拓撲學顯示對所有四種α2δ亞基是普遍的。它們均被預(yù)測為1 型跨膜蛋白質(zhì)，因為均在C-端(CT)具有疏水區(qū)，所述疏水區(qū)可能是跨膜結(jié)構(gòu)域。α2δ由單個基因產(chǎn)物翻譯而來，其被翻譯后切割成％和δ部分，這兩個部分保持通過二硫鍵橋結(jié)合。蛋白質(zhì)的α2部分完全是細胞外的，而δ部分具有與α 2結(jié)合的小細胞外部分，和具有非常短的胞質(zhì)尾的跨膜結(jié)構(gòu)域，所述跨膜結(jié)構(gòu)域使整個分子與膜結(jié)合(Davies等，Trends inPharmacol. Sci. 28 =220-228,2007)。所有均具有預(yù)測的N-端信號序列，表明N端是細胞外的。通過序列同源性在所有α2δ亞基通過細胞外序列中鑒定的一個結(jié)構(gòu)域是Ci2部件中的 von Willebrand 因子 A 型(VWFA)結(jié)構(gòu)域。Canti 等，Curr. Neuropharmacology 1 209-217，2003 ；Canti 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 :11230-11235,2005 ；Arikkath 等， Curr. Opin. Neurobiol 13，298_307，2003。在人 α 2 δ 亞基中，VWFA 結(jié)構(gòu)域包含來自 α2δ1 的約253到約430位的氨基酸(見www. expasy. org/uniprot/P54289)、來自α 2 δ 2的從約 291 到約 469 位的氨基酸(見 www. expasy. org/uniprot/Q9NY47)、來自 α 2 δ 3 的從約 256 到約438位的氨基酸(見www. expasy. org/uniprot/Q8IZS8)、和來自α 2 δ 4的從約291到約473位的氨基酸(見www. expasy. org/uniprot/Q7Z3S7)。氨基酸位置以帶有信號序列的未加工的前體蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。所有的Ci2 δ亞基增強通過高電壓活化的(HVA)CavI和Cav2通道鈣流通。電壓活化的Ca2+通道是許多細胞過程中重要的信號發(fā)放蛋白質(zhì)，所述過程包括肌肉收縮、分泌、突觸功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。Q2S-I蛋白質(zhì)的表達促進α 亞基對膜的靶向，并增強成孔亞基的門控(如通過門控電荷測量時)。通常，α2 δ-1蛋白質(zhì)與高電壓門控鈣通道的α 和β亞基的共表達使活化和失活的電壓依賴性改變至更負性的電勢，并且加速通道活化和失活的速率。除了對鈣通道功能的這些直接作用以外，Ci2 δ-1蛋白質(zhì)介導(dǎo)加巴噴丁和普瑞巴林的作用，所述加巴噴丁和普瑞巴林是神經(jīng)性疼痛治療中使用的試劑。體外研究顯示，該亞基是加巴噴丁的結(jié)合位點，所述加巴噴丁是顯示抗痛覺過敏(antihyperalgesic)作用的抗驚厥劑。體內(nèi)研究進一步證明，α2δ-1蛋白質(zhì)中的點突變消除了神經(jīng)性疼痛的嚙齒動物模型中加巴噴丁的治療效果。脊髓和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中提高的該亞基的表達表明在脊神經(jīng)受損的大鼠對無害機械刺激(異常性疼痛)的增強的傷害感受應(yīng)答中起作用。DRG和脊髓中α 2 δ -1亞基的引入可能受個體神經(jīng)病特異性的因素調(diào)節(jié)，并可有助于加巴噴丁敏感的異常性疼痛。加巴噴丁(1-(氨甲基)環(huán)己烷乙酸)被醫(yī)師認為是治療多種神經(jīng)性疼痛的“黃金標準”。罹患糖尿病性神經(jīng)病或皰疹后神經(jīng)痛的患者中超過50%被開出加巴噴丁的處方。 除了更高劑量時觀察到的鎮(zhèn)定作用，該藥物是被良好耐受的。或者，Y-氨基丁酸(GABA) 的3-取代類似物——普瑞巴林提供了具有改進的藥物代謝動力學模式的相似活性。加巴噴丁和普瑞巴林代表的化合物通過與電壓門控Ca2+通道的Ci2 δ 1亞基結(jié)合而顯示其阻斷神經(jīng)性疼痛的作用(見 Marais 等(2001) MoI. Pharmacol. 59 :1243-1248 和 Wang 等(1999) Biochem. J. 342 =313-320)。認為該相互作用抑制進入神經(jīng)元細胞的鈣流入，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放并阻抑中樞致敏的發(fā)生。研究了 Ci2 δ 1配體數(shù)量的藥物化學，包括β-氨基酸和α-氨基酸種類中的結(jié)構(gòu)變體、非氨基酸前導(dǎo)物和前藥。認為這些配體與α2δ亞基的結(jié)合解釋了它們在治療若干臨床障礙中的有用性，所述障礙包括癲癇、來自糖尿病性神經(jīng)病的疼痛、皰疹后神經(jīng)痛和纖維肌痛，和廣泛性焦慮障礙。血小板反應(yīng)蛋白在本文所述任何方法的一些實施方案中，“血小板反應(yīng)蛋白，，可表示任一蛋白質(zhì)家族，包括血小板反應(yīng)蛋白I、II、III、IV和軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白質(zhì)。也可以參考一種或多種特異性血小板反應(yīng)蛋白。血小板反應(yīng)蛋白是同源三聚體(TSP1和TSP2)或同源五聚體 (TSP3-5)糖蛋白，其具有MW 180,000的二硫鍵連接的亞基。其含有針對凝血酶、凝血因子 I、肝素、纖連蛋白、纖溶酶原、纖溶酶原激活物、膠原、層粘連蛋白等等的結(jié)合位點。其在包括血小板聚集的許多細胞粘附和遷移事件中發(fā)揮功能。血小板反應(yīng)蛋白I (THBS1 ；也稱作TSP1)的人DNA序列具有Genbank登錄號 X04665，人蛋白質(zhì)具有 Genbank 登錄號 TSPlHuman (P07996)(見 www. expasy. org/uniprot/ P07996)。其為與細胞外基質(zhì)結(jié)合的多結(jié)節(jié)分泌型蛋白質(zhì)，并具有多種生物學功能，包括有效的血管生成活性。其他血小板反應(yīng)蛋白基因包括血小板反應(yīng)蛋白II (THBS2 ； 188061)、 III(THBS3 ； 188062)和 IV(THBS4 ；600715)，具有相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列 TSPl Human (P07996)、 TSP2 Human(P35442) ；TSP3 Human(P49746)和 TSP4 Human(P35443)。人血小板反應(yīng)蛋白2 (THBS2 ；也稱作TSP2)的人序列具有Genbank登錄號 L12350 (見 www. expasy. org/uniprot/P35442)。其序列與 THBSl 非常相似。人血小板反應(yīng)蛋白3 (THBS3 ；也稱作TSP3)的人序列具有Genbank登錄號 L38969 (見 www. expasy. org/uniprot/P49476)。蛋白質(zhì)在其 COOH-端結(jié)構(gòu)域中與 THBSl 和 THBS2明顯同源，但是在其NH2-端區(qū)域中顯著不同，表明THBS3獨特的功能特性，但是也涉及THBSl和THBS2的功能特性。956個氨基酸的預(yù)測蛋白質(zhì)是高度酸性的，特別是在序列的第三個四分之一處，該四分之一對應(yīng)于7個III型鈣結(jié)合重復(fù)。還存在4個II型EGF-樣重復(fù)。人THBS4基因(也稱作TSP4)在第三個3型重復(fù)中含有RGD(arg-gly-asp)細胞結(jié)合序列，所述基因人序列的Genbank登錄號為Z19585(見www. expasy. org/uniprot/ P35443)。其為結(jié)合肝素和鈣的五聚體蛋白質(zhì)。Genbank 登錄號為 L32137 (見 www. expasy. org/uniprot/P49474)的軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白質(zhì)(也稱作TSP5)是在軟骨細胞局部基質(zhì)中高水平表達的524-kD蛋白質(zhì)。序列表明其為血小板反應(yīng)蛋白基因家族的一個成員。血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域在本文所述任何方法的一些實施方案中，所述方法包括施用至少一種血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。已知的血小板反應(yīng)蛋白同種型包含大量特異性結(jié)構(gòu)域。對THBSl和 THB S2而言，這些包括肝素結(jié)合N端結(jié)構(gòu)域、與前膠原具有同源性的連接子、三個TSP-I型重復(fù)、三個EGF-樣重復(fù)、七個TSP 3-型鈣結(jié)合重復(fù)，和細胞結(jié)合羧基端結(jié)構(gòu)域。如本文中例如在圖2中所示，EGF-樣結(jié)構(gòu)域足以誘導(dǎo)突觸發(fā)生。EGF-樣結(jié)構(gòu)域具有獨特的基序序列。常見的特征是這些重復(fù)存在于與膜結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞外結(jié)構(gòu)域中或已知將分泌的蛋白質(zhì)中。EGF結(jié)構(gòu)域包含六個半胱氨酸殘基，所述殘基顯示涉及二硫鍵。主要的結(jié)構(gòu)是雙鏈β片層，之后為從環(huán)到C-端短雙鏈片層。保守的半胱氨酸之間的亞結(jié)構(gòu)域長度有所不同。在許多蛋白質(zhì)中遇到二硫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)，例如EGF 及其前體和 TGF-α，例如如 Apella 等(1988) FEBS Lett 231 :1_4 ；和 Engel (1989) FEBS Lett 25 :1-7中所述，每篇文獻通過參考并入本文。小鼠TSP EGF-樣結(jié)構(gòu)域的比對可參閱 Bornstein(1992)FASEB J 6 :3四0_3四9，通過參考并入本文。每個EGF-樣結(jié)構(gòu)域的長度從約35個到約70個氨基酸，更通常長度為從約40個氨基酸到約65個氨基酸。EGF重復(fù)可包括羥基化的氨基酸、羥基天冬氨酸和羥基天冬酰胺。所述重復(fù)也可在結(jié)構(gòu)域的2、 4和5位包含帶負電的氨基酸。示范性的EGF-樣結(jié)構(gòu)域存在于人血小板反應(yīng)蛋白多肽中。對THBSl序列和上述序列而言，EGF-樣結(jié)構(gòu)域存在于氨基酸551-586、588-636和650-689。對THBS2和上述序列而言，EGF-樣結(jié)構(gòu)域存在于氨基酸553-588、590-635和652-691。對THBS3序列和上述序列而言，EGF-樣結(jié)構(gòu)域存在于氨基酸316-368、370-412、418-455。對THBS4序列和上述序列而言，EGF-樣結(jié)構(gòu)域存在于氨基酸四0-324、326-377、379-418和424-461。在本文中使用時，血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域包括但不僅限于，長度從約35到約65個氨基酸的多肽，其包含至少6個半胱氨酸氨基酸，其中主要結(jié)構(gòu)是雙鏈β片層，之后為從環(huán)到C-端短雙鏈片層。所述結(jié)構(gòu)域可與上文定義的來自人血小板反應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域具有至少約95%的序列同一性、至少約98%的序列同一性、至少約99%的序列同一性、 100%的序列同一性。肽可以從氨基端或羧基端或兩端被截短1、2、3、4、5或更多個氨基酸。激動劑本發(fā)明提供了在需要的個體中調(diào)控軸突生長和/或突觸發(fā)生的方法，其包括施用有效劑量的血小板反應(yīng)蛋白激動劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在個體中促進突觸發(fā)生的方法，其包括對需要突觸發(fā)生的個體施用有效劑量的激動劑。在一些實施方案中，所述激動劑是血小板反應(yīng)蛋白激動劑?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法和/或本文所述方法測試一種或多種激動劑活性(例如結(jié)合和活化鈣通道的Ci2 δ亞基)。在任何方法的一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白激動劑包括多肽、核酸、糖類、免疫黏附素、血小板反應(yīng)蛋白變體、肽模擬物、和小分子、抗-血小板反應(yīng)蛋白抗體和免疫球蛋白變體、人血小板反應(yīng)蛋白的氨基酸變體(包括氨基酸替換、缺失和添加變體)、或其任何組合，和嵌合的免疫球蛋白。本發(fā)明的血小板反應(yīng)蛋白激動劑可基于本發(fā)明人對涉及血小板反應(yīng)蛋白與其天然配體(例如鈣通道α2δ亞基)結(jié)合的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的定義。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白激動劑是抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白激動劑是小分子。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白激動劑是多肽。在一些實施方案中，多肽是包含至少一種血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述多肽結(jié)合并活化選自α 2 δ 1、 α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基，并且其中個體中的突觸形成增加。在一些實施方案中，多肽不是血小板反應(yīng)蛋白。在一些實施方案中，多肽是血小板反應(yīng)蛋白。在一些實施方案中，多肽血小板反應(yīng)蛋白激動劑包含EGF-樣結(jié)構(gòu)域。感興趣的 EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽可包含如上文定義的1、2、3或更多個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽可包含一個EGF-樣結(jié)構(gòu)域或由一個EGF-樣結(jié)構(gòu)域組成。在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽包含至少兩個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。 在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽包含至少三個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽包含血小板反應(yīng)蛋白的第三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域、鈣結(jié)合重復(fù)和C-端區(qū)域。在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽缺乏除EGF-樣結(jié)構(gòu)域之外的血小板反應(yīng)蛋白序列。在一些實施方案中，EGF-樣結(jié)構(gòu)域多肽可缺乏以下一種或多種血小板反應(yīng)蛋白層粘連蛋白G結(jié)構(gòu)域、von Willebrand因子C型結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白I型結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白3型重復(fù)，和/或血小板反應(yīng)蛋白C-端區(qū)域。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域是來自于長度從約35到約65個氨基酸的血小板反應(yīng)蛋白同種型的多肽，其包含至少6個半胱氨酸氨基酸，其中主要結(jié)構(gòu)是雙鏈β片層，之后為從環(huán)到 C-端短雙鏈片層。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域與人THBSl的氨基酸 551-586、588-636、650-689，人 THBS2 的氨基酸 553-588,590-635,652-691,人 THBS3 的氨基酸 316-368、370-412、418-455，人 THBS4 的氨基酸 290_324、326-377、379_418 和 424-461 具有至少95%的序列同一性。可以通過本領(lǐng)域已知的多種方式改變血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的序列，以產(chǎn)生定向的序列改變。多肽通常會基本與本文提供的序列相似，即會有至少一個氨基酸不同，并可有至少兩個但是不超過10個氨基酸不同。序列改變可以是替換、插入或缺失?？梢允褂孟到y(tǒng)性引入丙氨酸或其他殘基的掃描突變來確定關(guān)鍵性氨基酸。保守性氨基酸替換通常包括以下組中的替換(甘氨酸，丙氨酸)；(纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸， 谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(絲氨酸，蘇氨酸)；(賴氨酸，精氨酸)；或(苯丙氨酸， 酪氨酸)。不改變主要序列的感興趣的修飾包括多肽的化學衍生化，例如乙?；螋然?。 還包括在內(nèi)的是糖基化修飾，例如在其合成和加工或進一步加工步驟期間，通過修飾多肽的糖基化模式進行的修飾；例如通過將多肽與影響糖基化的酶例如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶接觸進行的修飾。還包括在內(nèi)的是具有磷酸化的氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸、 磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括在本發(fā)明中的是下述多肽，其使用常規(guī)分子生物學技術(shù)和合成化學進行修飾，從而改進它們對蛋白質(zhì)酶解降解的抗性，或者優(yōu)化溶解度特性，或者使其更適合用作治療劑。例如，可以將肽的主鏈環(huán)化以增強溶解度(見Friedler等Q000) J. Biol. Chem. 275 23783-23789)。這類多肽的類似物下述多肽，其含有除天然L-氨基酸之外的其他殘基，例如D-氨基酸或非天然合成氨基酸。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白多肽(包括其免疫原性表位和其他片段)可與異源分子組合，得到治療上有用的融合分子。這提供了能夠?qū)⒂杏玫乃幬锎x動力學和/或藥物效應(yīng)動力學傳遞給血小板反應(yīng)蛋白的融合配偶體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了下述融合分子，所述融合分子包含血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的所有或部分，或其片段和融合配偶體，例如抗體Fc結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的融合分子具有與血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域相比提高的體內(nèi)半衰期?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)方法，通過體外合成制備主題肽?？梢允褂枚喾N商業(yè)合成設(shè)備，例如 Applied Biosystems, Inc.，F(xiàn)oster City, CA, Beckman 的自動化合成儀等等。通過使用合成儀，可以用非天然氨基酸替換天然氨基酸。具體的序列和制備方式可以通過方便性、經(jīng)濟學、需要的純度等等確定。需要時可以在合成期間或表達期間向肽中引入多種基團，所述基團允許與其他分子連接或與表面連接。因此，可以使用半胱氨酸制造硫醚，使用組氨酸與金屬離子復(fù)合物連接，使用羧基形成酰胺或酯，使用氨基形成酰胺等等。也可以根據(jù)重組體合成的常規(guī)方法分離和純化多肽?？梢灾苽浔磉_宿主的裂解物，并使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術(shù)純化裂解物。相對于與產(chǎn)物制備及其純化方法相關(guān)的污染物，大部分使用的組合物會包含按重量計至少20%、更通常按重量計至少約75 %、優(yōu)選地按重量計至少約95 %、和為了治療目的按重量計至少約 99. 5%的目的產(chǎn)物。通常，所述百分比以總蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。拮抗劑本發(fā)明提供了在需要的個體中調(diào)控軸突生長和/或突觸發(fā)生的方法，其包括施用有效劑量的血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道拮抗劑(例如試劑)。在一些實施方案中，所述方法抑制突觸發(fā)生、減少突觸數(shù)量、或降低突觸活性。在一些實施方案中，所述方法促進軸突生長。在一些實施方案中，所述方法促進樹突生長。在一些實施方案中，所述方法促進軸突以及樹突生長。在一些實施方案中，拮抗劑是血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑抑制血小板反應(yīng)蛋白的一種或多種活性，例如突觸發(fā)生活性。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和鈣通道的CI2 δ亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，拮抗劑是鈣通道CI2 δ亞基的拮抗劑。在一些實施方案中，拮抗劑結(jié)合鈣通道的α2δ亞基，并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和鈣通道 α2δ亞基之間的相互作用。另外，本發(fā)明在一些實施方案中提供了在個體中治療疼痛(例如神經(jīng)性疼痛、內(nèi)臟疼痛、癌癥疼痛、炎性疼痛、手術(shù)后疼痛、偏頭痛或幻覺疼痛)的方法，其包括對具有疼痛的個體施用有效量的拮抗劑。在一些實施方案中，疼痛包括但不限于軀體疼痛(例如表皮 (身體表面)或深層組織(肌肉骨骼組織)疼痛)；與韌帶、腱、骨、血管、筋膜和肌肉相關(guān)的疼痛；內(nèi)臟疼痛(例如胸部(胸)疼痛、腹部疼痛或盆腔臟器疼痛，或神經(jīng)性疼痛)；神經(jīng)系統(tǒng)損傷、化學療法、輻射、手術(shù)、腫瘤壓迫或意外導(dǎo)致的任何疼痛；癌癥疼痛(例如突發(fā)性癌癥疼痛、來自胰腺癌，或腹部或骨中轉(zhuǎn)移灶(matastase)的疼痛)；炎性疼痛(例如與類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、瑞特綜合征(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)、強直性脊椎炎、或炎性關(guān)節(jié)炎障礙相關(guān)的疼痛)；手術(shù)后疼痛；偏頭痛；或幻覺疼痛(例如四肢癱瘓者中的截肢痛感 (amputation in quadriplegics))。在一些實施方案中，疼痛可以是急性或慢性的，并且包括異常性疼痛(即由于通常不引起疼痛的刺激導(dǎo)致的疼痛)或痛覺過敏(即對通常會疼痛的刺激的提高的應(yīng)答)。在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了在個體中治療癲癇的方法，其包括對個體施用有效量的拮抗劑。在一些實施方案中，拮抗劑是血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑。在一些實施方案中，拮抗劑是α2δ亞基鈣通道拮抗劑。在一些實施方案中，方法包括對需要的個體施用有效量的拮抗劑(例如試劑)，所述拮抗劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和選自α2δ1、α2δ2、α2δ3和α2δ4的一種或多種鈣通道亞基之間的相互作用。突觸發(fā)生的拮抗劑包括干擾血小板反應(yīng)蛋白和鈣通道亞基α 2 δ之間相互作用的試劑，包括但不僅限于對血小板反應(yīng)蛋白特異性的抗體，尤其是對至少一種血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域特異性的抗體，和α2δ配體，包括加巴噴丁和普瑞巴林及其類似物，例如如美國專利號651擬89、6683112、4087討4、公開的美國專利申請20050192353等等中所述， 其通過參考并入本文。在一些實施方案中，拮抗劑排除加巴噴丁、普瑞巴林和/或其類似
24物。在任何方法的一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑包括多肽、核酸(例如 RNA(例如siRNA、反義RNA或微小RNA)和DNA)、糖類、免疫黏附素、血小板反應(yīng)蛋白變體、 血小板反應(yīng)蛋白肽拮抗劑、肽模擬物、小分子、抗-血小板反應(yīng)蛋白抗體和免疫球蛋白變體、結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的來自支架的結(jié)合蛋白質(zhì)。基于支架的蛋白質(zhì)包括抗體的單個結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白超家族、蛋白酶抑制物、螺旋-束蛋白質(zhì)(helix-bundle protein)、有二硫化物結(jié)的肽(disulphide-knotted ρ印tide)、A蛋白、脂籠蛋白、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、錨蛋白一致重復(fù)結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白和高二硫化物密度的支架蛋白質(zhì)。見例如U. S. 6818418， Lipovsek等；SkerraOOOO) JMoI Recognit. 13(4) :167-87 ；Skerra (2007) Current Opinion in Biotechnology, 18 :295-304 ;www. amunix. com/Technology, html。人血小板反應(yīng)蛋白的氨基酸變體包括氨基酸替換、缺失和添加變體，或其任何組合，和嵌合的免疫來蛋白。本發(fā)明的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑可基于本發(fā)明人對涉及血小板反應(yīng)蛋白與鈣通道α2δ亞基結(jié)合的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的定義。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑是抗體。 在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑是小分子。在一些實施方案中，小分子是加巴噴丁或其類似物。在一些實施方案中，小分子是除加巴噴丁或其類似物之外的其他小分子。在一些實施方案中，拮抗劑(例如試劑)特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白。在一些實施方案中，拮抗劑特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，拮抗劑特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的第三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，血小板反應(yīng)蛋白是TSP1、TSP2、TSP3、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)。在一些實施方案中，拮抗劑是抗體。在一些實施方案中，拮抗劑是抗體模擬物的蛋白質(zhì)支架，或者來自支架的結(jié)合蛋白質(zhì)，其展示如小尺寸、穩(wěn)定性和易于生產(chǎn)的特性。這些包括抗體的單個結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白超家族、蛋白酶抑制物、螺旋-束蛋白質(zhì)、有二硫化物結(jié)的肽、A蛋白、脂籠蛋白、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、錨蛋白一致重復(fù)結(jié)構(gòu)域、硫氧還蛋白和高二硫化物密度的支架蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，拮抗劑是特異性抑制一種或多種血小板反應(yīng)蛋白表達的 siRNA、反義RNA或微小RNA。在一些實施方案中，TSPl、TSP2、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)的表達被抑制。在本文所述任何方法的一些實施方案中，鈣通道α 2 δ亞基的拮抗劑包括多肽、核酸(例如RNA(例如siRNA、反義RNA或微小RNA)和DNA)、糖類、免疫黏附素、鈣通道變體、 鈣通道肽拮抗劑、肽模擬物和小分子、抗-鈣通道抗體和免疫球蛋白變體、結(jié)合α2δ亞基 (例如VWFA結(jié)構(gòu)域)的來自支架的結(jié)合蛋白質(zhì)、人鈣通道的氨基酸變體(包括氨基酸替換、 缺失和添加變體)、或其任何組合，和嵌合的免疫球蛋白。本發(fā)明鈣通道α2δ亞基的拮抗劑可基于本發(fā)明人對涉及鈣通道與血小板反應(yīng)蛋白結(jié)合的鈣通道結(jié)構(gòu)域的定義。在一些實施方案中，鈣通道α2δ亞基的拮抗劑是抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，抗體是1 的抗體。在一些實施方案中，抗體特異性結(jié)合α2δ1的VWFA結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中， 鈣通道Ci2 δ亞基的拮抗劑是小分子。在一些實施方案中，小分子是加巴噴丁或其類似物。 在一些實施方案中，小分子是除加巴噴丁或其類似物之外的其他小分子。在一些實施方案中，調(diào)控和/或拮抗劑蛋白質(zhì)包含鈣通道亞基α2δ的δ部分的多肽序列(例如鈣通道亞基α 2 δ 1的δ 1部分)。在本文所述任何方法的一些實施方案中，拮抗劑包括包含鈣通道α 2 δ亞基細胞外部分的多肽。在一些實施方案中，多肽包含鈣通道α2δ亞基的Ci2部分。在一些實施方案中，多肽包含人α 2 δ 1的約253到約430位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中， 多肽包含鈣通道α2 δ 2的細胞外部分。在一些實施方案中，多肽包含鈣通道亞基α2δ2的 α 2部分。在一些實施方案中，多肽包含人α 2 δ 2的約291到約469位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，多肽包含鈣通道亞基α2 δ 3的細胞外部分。在一些實施方案中， 多肽包含鈣通道亞基α 2 S 3的Ci2部分。在一些實施方案中，多肽包含人α2 δ 3的約256 到約438位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)。在一些實施方案中，多肽包含鈣通道亞基α 2 δ 4的細胞外部分。在一些實施方案中，多肽包含鈣通道亞基α2δ4的Ci2部分。在一些實施方案中，多肽包含人的約291到約472位氨基酸。在一些實施方案中，多肽包含人α2δ4 的約到約473位氨基酸(VWFA結(jié)構(gòu)域)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方式改變多肽序列(包括鈣通道亞基α 2 δ，如鈣通道亞基Ci2 δ的細胞外部分)，以產(chǎn)生定向的序列改變。多肽通常會基本與本文提供的序列相似，即會有至少一個氨基酸不同，并可有至少兩個但是不超過10個氨基酸不同。序列改變可以是替換、插入或缺失?？梢允褂孟到y(tǒng)性引入丙氨酸或其他殘基的掃描突變來確定關(guān)鍵性氨基酸。保守性氨基酸替換通常包括以下組中的替換(甘氨酸，丙氨酸)；(纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸，谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(絲氨酸，蘇氨酸)；(賴氨酸，精氨酸)；或(苯丙氨酸，酪氨酸)。不改變主要序列的感興趣的修飾包括多肽的化學衍生化，例如乙酰化或羧基化。 還包括在內(nèi)的是糖基化修飾，例如在其合成和加工或進一步加工步驟期間，通過修飾多肽的糖基化模式進行的修飾；例如通過將多肽與影響糖基化的酶例如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶接觸進行的修飾。還包括在內(nèi)的是具有磷酸化的氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸、 磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括在本發(fā)明中的是下述多肽，其使用常規(guī)分子生物學技術(shù)和合成化學進行修飾，從而改進它們對蛋白質(zhì)酶解降解的抗性，或者優(yōu)化溶解度特性，或者使其更適合用作治療劑。例如，可以將肽的主鏈環(huán)化以增強溶解度(見Friedler等Q000) J. Biol. Chem. 275 23783-23789)。這類多肽的類似物下述多肽，其含有除天然L-氨基酸之外的其他殘基，例如D-氨基酸或非天然合成氨基酸。在一些實施方案中，鈣通道亞基α2δ (例如鈣通道亞基α2δ的細胞外部分)，包括其免疫原性表位和其他片段可與異源分子組合，得到治療上有用的融合分子。這提供了能夠?qū)⒂杏玫乃幬锎x動力學和/或藥物效應(yīng)動力學傳遞給鈣通道亞基Ci2 δ (例如鈣通道亞基Ci2 δ的細胞外部分)的融合配偶體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了下述融合分子，所述融合分子包含鈣通道亞基α2δ (例如鈣通道亞基 α2δ的細胞外部分)的所有或部分，或其片段和融合配偶體，例如抗體Fc結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)構(gòu)域可以被進一步修飾，以去除一種或多種效應(yīng)器功能。本發(fā)明的融合分子具有與鈣通道亞基Ci2 δ (例如鈣通道亞基Ci2 δ的細胞外部分)相比提高的體內(nèi)半衰期。可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，通過體外合成制備主題肽。可以使用多種商業(yè)合成設(shè)備，例如 Applied Biosystems, Inc.，F(xiàn)oster City, CA, Beckman 的自動化合成儀等等。通過使用合成儀，可以用非天然氨基酸替換天然氨基酸。具體的序列和制備方式可以通過方便性、經(jīng)濟學、需要的純度等等確定。需要時可以在合成期間或表達期間向肽中引入多種基團，所述基團允許與其他分子連接或與表面連接。因此，可以使用半胱氨酸制造硫醚，使用組氨酸與金屬離子復(fù)合物連接，使用羧基形成酰胺或酯，使用氨基形成酰胺等等。也可以根據(jù)重組體合成的常規(guī)方法分離和純化多肽?？梢灾苽浔磉_宿主的裂解物，并使用HPLC、排除層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術(shù)純化裂解物。相對于與產(chǎn)物制備及其純化方法相關(guān)的污染物，大部分使用的組合物會包含按重量計至少20%、更通常按重量計至少約75 %、優(yōu)選地按重量計至少約95 %、和為了治療目的按重量計至少約 99. 5%的目的產(chǎn)物。通常，所述百分比以總蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。突觸發(fā)牛突觸發(fā)生是一個動態(tài)過程。在發(fā)育期間，建立了比最終會保留的更多的突觸。因此，過量突觸輸入的消除是突觸回路成熟中的關(guān)鍵步驟。突觸消除是涉及突觸前和突觸后配偶體的一種競爭性過程。在CNS中，如在NMJ處，發(fā)育的、活性依賴型突觸回路重塑通過下述過程發(fā)生，所述過程可涉及共同活性輸入的選擇性穩(wěn)定化和具有不相關(guān)活性的輸入的消除。突觸回路的解剖學細化通過涉及突觸快速消除的動態(tài)過程而在個體軸突和樹突水平上發(fā)生。在軸突分支和重塑時，突觸形成并且隨著快速發(fā)生的突觸消除而分解。突觸是兩個神經(jīng)元之間或者神經(jīng)元和肌肉細胞之間神經(jīng)肌肉接點(NMJ)處形成的不對稱通信接點?；瘜W突觸使得能夠通過分泌神經(jīng)遞質(zhì)進行細胞到細胞的通信，而電突觸信號通過缺口接點傳遞，所述缺口接點是允許離子流流動的特化的細胞內(nèi)通道。除了離子以外，調(diào)控突觸功能的其他分子(例如ATP和第二信使分子)能夠通過缺口接合孔而擴散。在成熟的NMJ中，突觸前膜和突觸后膜被含有形成基板的細胞外蛋白質(zhì)的突觸縫隙隔開。突觸囊泡在突觸前釋放位點聚集，遞質(zhì)受體在突觸后膜的連接褶中聚集，神經(jīng)膠質(zhì)經(jīng)過神經(jīng)末端周圍。在本文所述任何方法的一些實施方案中，可以增加突觸形成。在一些實施方案中， 突觸由于增加的新突觸形成而增加。在一些實施方案中，突觸由于提高的突觸維護而增加。 在一些實施方案中，突觸在神經(jīng)肌肉接點處。在一些實施方案中，突觸包含興奮性突觸或由興奮性突觸組成。在一些實施方案中，突觸是VGlut2陽性興奮性突觸。在一些實施方案中， 突觸是VGlutl陽性興奮性突觸。在一些實施方案中，在由于衰老的突觸損失后增加突觸形成。在一些實施方案中，在由于損傷的突觸損失后增加突觸形成。大量細胞黏著分子和酪氨酸激酶受體配體涉及調(diào)控突觸發(fā)生。整聯(lián)蛋白、鈣黏著蛋白和神經(jīng)配蛋白是可在突觸形成中起作用的細胞黏著分子。肝配蛋白及其受體(Eph酪氨酸激酶)參與活性無關(guān)的腦回路拓撲組構(gòu)，并且也可參與突觸形成和成熟。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白也涉及突觸發(fā)育和功能的方面。本發(fā)明的方法被用于通過誘導(dǎo)突觸發(fā)生和促進功能改進的細胞改變，來促進改善的由缺血性腦損傷或其他神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的結(jié)果。所述方法還被用于在罹患神經(jīng)退化障礙(例如阿爾茨海默病、癲癇等等)的患者中增強突觸發(fā)生。目的疾病和病癥本文所述方法可以用于治療或預(yù)防多種疾病和病癥。本發(fā)明增強突觸發(fā)生的方法的目的病癥包括但不僅限于，衰老、中風、脊髓損傷、阿爾茨海默病(其中突觸損失的疾病)、帕金森病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、神經(jīng)病、肌營養(yǎng)不良、亨廷頓病、酒精中毒、亞歷山大病、Alper' s疾病共濟失調(diào)毛細管擴張、Batten疾病(也稱作 Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten 疾病)、牛海綿樣腦病(BSE)、canavan 疾病、Cockayne 綜合征、皮質(zhì)延髓(corticobasal)退化、Creutzfeldt-Jakob疾病、HIV-伴隨的癡呆、 Kennedy ‘ s疾病、Krabbe' s疾病、Lewy體癡呆、Machado-Jos印h疾病(3型脊髓小腦共濟失調(diào))、多系統(tǒng)妻縮、發(fā)作個生睡病、neuroborreliosis、Pelizaeus-Merzbacher 疾病、原發(fā)性側(cè)索硬化、朊病毒疾病、進行性核上麻痹、Refsum ‘ s疾病、Sandhoff' s 疾病、khilder ‘ s疾病、惡性貧血繼發(fā)的亞急性脊髓聯(lián)合退化、神經(jīng)分裂癥、 Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten疾病(也稱作Batten疾病)、脊髓小腦共濟失調(diào)(具有不同特征的多種類型)、脊柱肌肉萎縮、Steele-Richardson-Olszewski疾病、脊髓癆 (Tabes dorsalis)，以及促進中風或脊髓損傷后受損的CNS的修復(fù)和再生中新的突觸發(fā)生。 這類病癥得益于血小板反應(yīng)蛋白或血小板反應(yīng)蛋白激動劑的施用，所述血小板反應(yīng)蛋白或血小板反應(yīng)蛋白激動劑提高或增強突觸的發(fā)育。在存在神經(jīng)元損失的一些情況下，可能同樣期望例如通過施用提高神經(jīng)發(fā)生的藥劑或給藥法、移植神經(jīng)元祖細胞等等來增加神經(jīng)發(fā)生?；颊呖稍谥酗L、CNS損傷和神經(jīng)退化疾病后遭受神經(jīng)學和功能的缺乏。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)提供了在CNS損傷或退化后調(diào)控突觸形成和改善功能的手段。通過促進突觸發(fā)生誘導(dǎo)的神經(jīng)聯(lián)接(CONNECTION)會促進中風、損傷、衰老和神經(jīng)退化性疾病后的功能改善。增加的突觸發(fā)生量可包括相對于缺乏這類處理的對照而言可測量的增加，例如至少10%的增加、至少20 %的增加、至少50 %的增加或更多。在一些實施方案中，突觸數(shù)量可提高至少約 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %或60 %之任何。在一些實施方案中，突觸在神經(jīng)肌肉接點處。 在一些實施方案中，突觸包含興奮性突觸或者由其組成。在一些實施方案中，突觸是VGlut2 陽性興奮性突觸。在一些實施方案中，突觸是VGlutl陽性興奮性突觸。在一些實施方案中， 突觸由于增加的新突觸形成而增加。在一些實施方案中，突觸由于提高的突觸維護而增加。在本文所述任何方法的一些實施方案中，個體或受試者由于衰老而遭受突觸損失。在一些實施方案中，個體或受試者可由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、多發(fā)性硬化或青光眼而遭受突觸損失。在一些實施方案中，個體或受試者可遭受黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。在一些實施方案中，個體或受試者可由于選自以下的精神病障礙而遭受突觸損失急性應(yīng)激障礙、廣場恐怖癥、分離型遺忘癥、神經(jīng)性厭食癥、雙相型障礙、身體變形性精神障礙、簡短精神病性障礙、神經(jīng)性暴食癥、轉(zhuǎn)換性障礙、環(huán)性氣質(zhì)障礙、妄想癥、人格解體癥、人格分裂癥(DID)、性交疼痛、心境惡劣障礙、男性勃起障礙、廣泛性焦慮癥、陽痿、疼痛障礙、焦慮癥、恐怖癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、分裂情感性障礙、分裂樣精神病、共有精神病性精神障礙和神經(jīng)藥物濫用。在一些實施方案中，個體可由于損傷例如脊髓損傷或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷而遭受突觸損失。術(shù)語“中風”廣泛地表示與原因無關(guān)的、與朝向腦的受損血流相關(guān)的神經(jīng)學缺陷。 可能的原因包括但不限于血栓形成、出血和栓塞。目前診斷中風的方法包括癥狀評估、醫(yī)療史、胸X-光、ECG (lectrical heart activity，心電效能)、EEG (腦神經(jīng)細胞活性)、評價腦損傷的CAT和獲得內(nèi)部軀體視圖的MRI。血栓、栓塞和系統(tǒng)性低血壓是大腦缺血性發(fā)作的最常見的原因。其他損傷可以由高血壓、高血壓大腦血管疾病、動脈瘤破裂、血管瘤、血液病、心力衰竭、心臟停博、心源性休克、膿毒性休克、頭創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、癲癇發(fā)作、腫瘤出血或其他失血引起?！叭毖园l(fā)作”表示導(dǎo)致組織血液供應(yīng)不足的任何情況。缺血伴隨著中風時，其可以是如下文定義的全局或局部缺血。術(shù)語“缺血性中風”更特別地表示下述類型的中風其具有有限的程度，并且由血流阻斷引起。大腦缺血性發(fā)作由對腦的血供應(yīng)不足引起。也屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)一部分的脊髓對減少的血流導(dǎo)致的缺血同樣易感。衰老是指遞增的年齡的效果或特征，尤其與軀體組織應(yīng)答損傷、疾病和正常使用而再生的降低的能力相關(guān)。或者，衰老可以根據(jù)一般生理特征來定義。衰老速率是非常物種特異性的，其中人可在約50歲時衰老；嚙齒動物在約2歲時衰老。一般而言，身體系統(tǒng)的自然進行的減退開始于早期成年期，但是在數(shù)十年后變得最為明顯。在人中更精確定義老齡的一種備選方式是其開始于常規(guī)的退休年齡——約60歲、約65歲的年齡時。另一定義設(shè)置了與生殖能力損失一致的衰老參數(shù)，其在人中約為45歲左右，更通常為約50歲左右， 但是在個體間有所不同。在衰老個體中可發(fā)現(xiàn)突觸功能的損失，例如溫和的認知不足。在老齡時，阿爾茨海默病是一種嚴重的病癥。阿爾茨海默病是與大腦皮層和皮層下灰質(zhì)中衰老斑塊過量相關(guān)的，進行性的殘酷的認知功能損失，其還含有淀粉樣蛋白和由tau蛋白質(zhì)組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。常見的形式影響大于60歲的人，并且其發(fā)病率隨著年齡的增長而提高。其構(gòu)成老年人中大于65%的癡呆癥。阿爾茨海默病的原因是未知的。該疾病在家族中以約15%到約20%的病例發(fā)生。 剩余的所謂散發(fā)病例具有一些遺傳決定因素。該疾病在大部分早期發(fā)作和一些晚期發(fā)作中具有常染色體顯性遺傳模式，但是具有可變的晚期生命外顯率(late-life penetrance) 0 環(huán)境因素是積極研究的焦點。在該疾病的病程中，大腦皮層、海馬和皮層下結(jié)構(gòu)(包括邁內(nèi)特基底核)、藍斑和中縫背核中有神經(jīng)元損失。在腦的一些區(qū)域中(早期疾病中頂葉和顳皮層，晚期疾病中前額皮層)，大腦葡萄糖使用和灌注降低。神經(jīng)炎性斑或老年斑(由神經(jīng)炎、星形膠質(zhì)細胞和淀粉狀蛋白核周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(由成對的螺旋細絲組成)在阿爾茨海默病的發(fā)病機制中起作用。老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)隨著正常的衰老而發(fā)生，但是在患有阿爾茨海默病的人中流行得多。癡呆的主要特征是短期記憶和長期記憶、抽象思維、和判斷的病損；更高皮層功能的其他擾動；和人格改變。認知病損的進展證實該診斷，并且患有阿爾茨海默病的患者不會改善。本發(fā)明的方法還可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞或組織移植組合使用，其中這類移植物包括如胎兒組織中存在的神經(jīng)祖細胞、神經(jīng)干細胞、胚胎干細胞或涉及神經(jīng)修復(fù)或擴大的其他細胞和組織。神經(jīng)干細胞/神經(jīng)祖細胞已在本領(lǐng)域中描述，并且它們在多種治療方案中的用途也被廣泛討論。例如，美國專利號6，638，501，Bjornson等；U. S. 6，541，255， Snyder 等；U. S. 6，498，018，Carpenter ；美國專利申請 20020012903，Goldman 等；Palmer 等(2001)Nature 411(6833) :42-3 ;Palmer 等(1997)MoI Cell Neurosci. 8 (6) :389-404; Svendsen 等(1997)Exp. Neurol. 148(1) :135-46 和 Shihabuddin(1999)MoI Med Today 5(11) :474-80 ；以及其他，每份文獻通過參考明確并入本文。神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞能夠參與正常發(fā)育的多個方面，包括沿充分確立的遷移
29通路遷移至散布的CNS區(qū)域，應(yīng)答微環(huán)境信號而分化成為多種發(fā)育或區(qū)域合適的細胞類型，和非破裂、非致瘤散開于宿主祖細胞及其后代中。人NSC能夠在這些散布的位置中體內(nèi)表達外來轉(zhuǎn)基因。同樣，這些細胞可用于治療多種病癥，包括對脊髓、腦和外周神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷性損傷；治療退化性障礙，包括阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森?。话ㄖ匕Y抑郁在內(nèi)的情感障礙；中風等等。通過突觸發(fā)生增強劑增強神經(jīng)元的功能性聯(lián)結(jié)，提供改善的臨床結(jié)果。施用本發(fā)明的突觸發(fā)生抑制物時，突觸發(fā)生的減少可包括相對于缺乏這類處理的對照而言可測量的減少，例如至少10%的減少、至少20%的減少、至少50%的減少或更多。 在一些實施方案中，突觸數(shù)量可被抑制至少約10%、20%、30%、40%、50%或60%之任何。 在一些實施方案中，突觸在神經(jīng)肌肉接點處。在一些實施方案中，突觸包含興奮性突觸或者由其組成。在一些實施方案中，突觸是VGlut2陽性興奮性突觸。在一些實施方案中，突觸是VGlutl陽性興奮性突觸。本發(fā)明減少突觸發(fā)生的方法的目的病癥在于疼痛、癲癇、焦慮癥、成癮癥的治療， 和幫助再生的神經(jīng)元的軸突生長。這類病癥得益于血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑的施用，所述血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑降低或抑制突觸的發(fā)育?？梢允褂帽疚乃龅娜魏无卓箘?，例如特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白(例如血小板反應(yīng)蛋白的EGF-樣結(jié)構(gòu)域)的抗體或其片段；和結(jié)合鈣通道α 2 δ亞基的分子(例如鈣通道的α 2 δ亞基，如α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4)， 例如特異性結(jié)合α2δ的VWFA結(jié)構(gòu)域的抗體，加巴噴丁及其類似物，尤其包括通過本文所述篩選方法鑒定的類似物。癲癇是是一種周期性發(fā)作的、陣發(fā)的大腦功能障礙，其特征是由大腦神經(jīng)元過度放電引起的改變的意識、運動活性、感覺現(xiàn)象或不適行為的突然、短暫的發(fā)作。表現(xiàn)取決于癲癇發(fā)作的類型，其可以被歸類為部分或全身性的。在部分癲癇發(fā)作中，過量的神經(jīng)元放電包含在大腦皮層的一個區(qū)域內(nèi)。在全身性癲癇發(fā)作中，放電雙側(cè)和擴散性地涉及整個皮層。 有時半球一個部分的局部損傷活化兩側(cè)整個大腦，從而在局部征兆顯示之前快速地產(chǎn)生全身性的強直-痙攣發(fā)作。大部分癲癇患者在癲癇發(fā)作之間變成神經(jīng)學正常，盡管抗驚厥藥的過度使用能夠使警覺性遲鈍。進行性精神衰退通常與引起癲癇發(fā)作的神經(jīng)學疾病有關(guān)。左顳葉癲癇伴隨著文字記憶異常；右顳葉癲癇有時引起視覺空間記憶異常。沒有明顯腦損害時前景最好。如果外周神經(jīng)部分受損，則其功能在切斷的纖維再生之前修復(fù)。外周神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓和腦均顯示萌發(fā)(sprouting)和回路重塑。損傷后，最初不與損害相關(guān)的區(qū)域顯示突觸密度改變，并隨后在一段長時間中恢復(fù)對照水平。盡管這些區(qū)域中不存在退化的末端，但是發(fā)生突觸改變。因此，對CNS的較大創(chuàng)傷后可發(fā)生顯著的跨神經(jīng)元改變，表明反應(yīng)性突觸發(fā)生可調(diào)節(jié)具有或不具有原發(fā)性損害的區(qū)域中復(fù)合回路的功能完整性。成熟腦中發(fā)生損傷時，在受損系統(tǒng)的周圍環(huán)境中必須完成生長過程。必須清除舊的系統(tǒng)，并使其與新突觸的生長開始和形成協(xié)調(diào)。不需要這類重塑時，期望抑制廣泛重塑和生長的能力。在這類病癥下， 可以在突觸形成前將根據(jù)本發(fā)明的突觸發(fā)生抑制物施用足以允許神經(jīng)元生長的一段時間。突觸發(fā)生涉及酒精中毒和藥物成癮癥潛在的神經(jīng)基礎(chǔ)。神經(jīng)生理學研究鑒定了涉及藥物濫用和依賴性的特異性腦區(qū)域和分子機制。藥物誘導(dǎo)的持久行為如致敏、耐受或復(fù)發(fā)遠遠超出了任何先前報道的分子機制。已結(jié)合可卡因誘導(dǎo)的行為致敏發(fā)現(xiàn)了突觸重接的超微結(jié)構(gòu)證據(jù)。這類突觸重塑代表了成癮癥持久性的潛在的可能性神經(jīng)底物。針對酒精中毒和藥物成癮癥的位點特異性藥物治療學和行為治療程序可隨后靶向這些回路。在這類病癥下，根據(jù)本發(fā)明的突觸發(fā)生抑制物可以被施用一段時間，所述時間足以抑制與成癮癥相關(guān)的突觸形成。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還提供了在CNS損傷后調(diào)控軸突和/或樹突生長和促進功能的手段。軸突和/或樹突生長的誘導(dǎo)會促進損傷后的功能改善。軸突/樹突生長增加的量可包括相對于缺乏這類處理的對照而言可測量的增加，例如至少10%的增加、至少20%的增加、至少50%的增加或更多。在一些實施方案中，軸突和/或樹突生長可提高至少約10%、 20 %、30 %、40 %、50 %或60 %之任何。在一些實施方案中，軸突和/或樹突生長為軸突生長。在一些實施方案中，軸突和/或樹突生長為樹突生長。施用本發(fā)明的軸突和/或樹突生長抑制物時，軸突和/或樹突生長的減少可包括相對于缺乏這類處理的對照而言可測量的減少，例如至少10%的減少、至少20%的減少、至少50%的減少或更多。在一些實施方案中，軸突和/或樹突生長可被抑制至少約10%、20%、30%、40%、50%或60%之任何。在一些實施方案中，被抑制的軸突和/或樹突生長是軸突生長。在一些實施方案中，被抑制的軸突和/或樹突生長是樹突生長。在本文所述任何方法的一些實施方案中，個體可由于脊髓損傷而遭受軸突和/或樹突退化。在一些實施方案中，個體由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或多發(fā)性硬化而遭受軸突和/或樹突退化。在一些實施方案中，個體遭受黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。在一些實施方案中，個體由由于選自以下的精神病障礙而遭受軸突和/或樹突退化急性應(yīng)激障礙、廣場恐怖癥、分離型遺忘癥、神經(jīng)性厭食癥、雙相型障礙、身體變形性精神障礙、簡短精神病性障礙、神經(jīng)性暴食癥、轉(zhuǎn)換性障礙、環(huán)性氣質(zhì)障礙、 妄想癥、人格解體癥、人格分裂癥(DID)、性交疼痛、心境惡劣障礙、男性勃起障礙、廣泛性焦慮癥、陽痿、疼痛障礙、焦慮癥、恐怖癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、分裂情感性障礙、分裂樣精神病、 共有精神病性精神障礙和神經(jīng)藥物濫用。本文所述拮抗劑也可以用于治療或預(yù)防特征為鈣流入過量的障礙。本發(fā)明提供了包括對個體施用有效量下述試劑的方法，所述試劑阻斷血小板反應(yīng)蛋白和選自α2δ 1、 α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣亞基之間的相互作用。在一些實施方案中，所述試劑(例如抗體)特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白。在一些實施方案中，所述障礙是肌肉痙攣、偏頭痛、中風或帕金森病。基因遞送調(diào)控突觸發(fā)生的一種途徑涉及基因療法。在這類方法中，編碼本文所述激動劑或拮抗劑(例如包含至少一個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的肽、RNAi序列或抗體)的序列被引入中樞神經(jīng)細胞中并表達，成為對靶細胞提供激動劑或拮抗劑活性的手段。為了遺傳修飾被BBB保護的神經(jīng)元，使用兩種一般類型的途徑。在一種類型的途徑中，細胞在體外被遺傳改變，然后移植進CNS中某些，通常在BBB內(nèi)的區(qū)域中。在另一種類型的途徑中，遺傳“載體”被直接注射進CNS中的一個或多個區(qū)域，以遺傳改變正常時由BBB保護的細胞。 應(yīng)當注意，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”和“轉(zhuǎn)化”在本文中可互換使用。兩種術(shù)語均表示以引起要表達的外來基因形成相應(yīng)多肽的方式，將外來基因(也稱作“外源”基因)引入一個或多個預(yù)先存在的細胞中的過程。
一種優(yōu)選的途徑的目的是通過遺傳改造CNS內(nèi)的細胞，向CNS中引入期望的多肽來源。這通過將遺傳載體直接注射進CNS中，從而將外來基因“原位”(即在整個遺傳轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化步驟中，在患者腦或脊髓中，神經(jīng)元保持位于它們正常的位置中)引入CNS神經(jīng)元中來實現(xiàn)。有用的載體包括利用病毒的脂質(zhì)外膜或表面殼(也稱作殼體)的病毒載體。這些載體仿效并使用病毒的下述天然能力(i)與某些類型細胞上一種或多種具體的表面蛋白質(zhì)結(jié)合，然后(ii)將病毒的DNA或RNA注射進所述細胞中。藉此，病毒載體能夠?qū)⒔?jīng)遺傳改造的DNA或RNA鏈通過靶細胞的外膜遞送進細胞質(zhì)中。已報道了使用來自于單純皰疹病毒(例如歐洲專利453242, Breakfield等1996)、腺病毒(La Salle等1993)和腺伴隨病毒(Kaplitt等1997)的這類載體將基因轉(zhuǎn)移進入CNS神經(jīng)元中。非病毒載體通常含有期望的基因表達必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，并且可包含復(fù)制起點、可選擇標記等等，如本領(lǐng)域所已知的。然后通過向基因表達構(gòu)建體中添加選定的試劑來創(chuàng)建非病毒遺傳載體，所述試劑能夠幫助基因構(gòu)建體進入靶細胞。若干常用的試劑包括陽離子脂質(zhì)，帶正電的分子如多聚賴氨酸或聚乙烯亞胺，和/或與靶細胞表面上表達的受體結(jié)合的配體。就這一討論的目的而言，Curiel (1997)描述的DNA-腺病毒綴合物被認為是非病毒載體，因為對基因表達構(gòu)建體添加了腺病毒殼體蛋白，以幫助基因表達構(gòu)建體有效進入靶細胞。在陽離子基因載體中，DNA鏈帶負電，細胞表面也帶負電。因此，帶正電的試劑能夠幫助將它們拉到一起，并有助于DNA進入靶細胞。帶正電的轉(zhuǎn)染試劑的例子包括多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺(PEI)和多種陽離子脂質(zhì)。使用陽離子試劑制備遺傳載體的基本規(guī)程是相似的。以適當?shù)谋壤蚝蠨NA(帶負電)的水性溶液中添加陽離子試劑(多聚賴氨酸、 PEI或陽離子脂質(zhì)制備物)的溶液。帶正電和帶負電的組分會彼此吸引、結(jié)合、凝縮并形成分子復(fù)合物。如果以適當?shù)谋壤苽?，則得到的復(fù)合物會帶有一些正電荷，所述正電荷會幫助結(jié)合并進入帶有負電荷的靶細胞表面中。使用脂質(zhì)體將外來基因遞送進感覺神經(jīng)元中描述于多篇文章中，例如Sahenk等1993。PEI、多聚賴氨酸和其他陽離子試劑的使用描述于文章例如Li等2000和Nabel等1997中。將DNA引入靶細胞中的一種替代性策略是使DNA與通常進入細胞的分子結(jié)合。該途徑在美國專利No. 5，166，320 (Wu等1992)中在肝細胞中證明。該途徑的一個優(yōu)點是可以通過使DNA與靶細胞類型所選擇性吸收的分子結(jié)合，而將DNA遞送靶向至所述具體的細胞類型。已知有限量的分子在神經(jīng)元中經(jīng)歷受體介導(dǎo)的胞吞作用。結(jié)合神經(jīng)元受體并引發(fā)胞吞作用、導(dǎo)致它們進入神經(jīng)元中的已知試劑包括(i)破傷風毒素的無毒片段C(例如Knight 等1999) ； (ii)來自植物的多種凝集素，例如大麥凝集素(Horowitz等1999)和小麥胚凝集素(Yoshihara等1999)；和(iii)某些神經(jīng)營養(yǎng)因子(例如Barde等1991)。這些胞吞作用劑中至少一些在神經(jīng)元中經(jīng)歷“逆行”的軸突轉(zhuǎn)運。在本文上下文中，術(shù)語“逆行”表示這些分子通過細胞進程從神經(jīng)元的極端(或“末端”)沿軸突或樹突被活性轉(zhuǎn)運至細胞主體并進入，其中核位于所述細胞主體中。這一移動方向稱作“逆行”，因為其移動方向與細胞內(nèi)大部分代謝物(包括細胞體內(nèi)合成的蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)合成的神經(jīng)遞質(zhì)等)正常的向外 (“順行”)移動相反。施用方法和劑量
同樣，可以通過多種途徑實現(xiàn)化合物(包括本文所述的激動劑和拮抗劑)的施用， 包括口、頰、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、鼻、鼻內(nèi)、局部、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下(subcutaneous，SUbdermaDJIRJg (例如局部、注射(例如結(jié)膜下、subtenon、玻璃體內(nèi)等)或植入)或鞘內(nèi)施用?；钚詣┰谑┯煤罂梢允侨硇缘?，或者通過使用區(qū)域施用、 壁內(nèi)施用、或使用植入物而是局部的，所述植入物發(fā)揮將活性劑量保持在植入位點的作用。本發(fā)明的組合物可以使用任意醫(yī)學適用的規(guī)程來施用，例如血管內(nèi)(靜脈內(nèi)、 動脈內(nèi)、囊內(nèi))施用、注射進腦脊液中、腔內(nèi)注射或直接注射進腦中。鞘內(nèi)施用可以根據(jù)已知技術(shù)通過使用奧馬耶貯器進行(F. Balis等，AmJ. Pediatr. Hematol. Oncol. 11,74, 76(1989))。穿過血腦屏障(BBB)的一種藥物遞送策略需要通過滲透手段(如甘露醇或白細胞三烯)，或者通過使用血管作用物質(zhì)(如緩激肽)生物化學地破壞BBB。使用BBB打開靶特異性試劑的可能也是一種選擇。通過血管內(nèi)注射施用組合物時，BBB破壞劑可以與本發(fā)明的治療組合物共同施用。穿過BBB的其他策略可需要使用內(nèi)源轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，包括運載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運蛋白例如葡萄糖和氨基酸運載體，受體介導(dǎo)的胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白的胞轉(zhuǎn)作用，和活性流出轉(zhuǎn)運蛋白例如P-糖蛋白?；钚赞D(zhuǎn)運蛋白組件也可以與本發(fā)明使用的治療化合物或成像化合物綴合，以便于轉(zhuǎn)運穿過血管的上皮壁。或者，BBB之后的藥物遞送通過治療或成像試劑直接到顱的鞘內(nèi)遞送進行，如通過奧馬耶貯器進行。在腦中局部施用治療劑時，施用本發(fā)明的治療組合物的一種方法是通過任何合適的技術(shù)，例如通過直接注射(需要時借助于注射器的腦功能區(qū)定位)或者通過將奧馬耶貯器的尖端置入用于施用的腔中或囊中，來沉積進位點或者接近位點處?；蛘?，可以將對流增強的遞送導(dǎo)管直接植入位點中、植入天然或手術(shù)創(chuàng)建的囊中，或植入正常的腦實質(zhì)中。這類對流增強的藥物組合物遞送設(shè)備大幅改進了組合物在腦實質(zhì)各處的擴散。這些遞送設(shè)備的植入的導(dǎo)管利用高流量微量輸注(流速在約0. 5到15. 0μ 1/分鐘的范圍內(nèi))，而不是擴散流，將治療性組合物遞送至腦和/或腫瘤實質(zhì)。這類設(shè)備描述于美國專利No. 5，720，720中， 其通過參考完全并入本文。在本文所述治療方法和施用方法的一些實施方案中，所述方法包括施用有效量的試劑來促進突觸形成。在本文所述的治療方法和施用方法的一些實施方案中，所述方法包括施用有效量的試劑來抑制突觸形成。在本文所述的治療方法和施用方法的一些實施方案中，所述方法包括施用有效量的試劑來促進軸突和/或生長。在本文所述治療方法和施用方法的一些實施方案中，所述方法包括施用有效量的試劑來抑制軸突和/或樹突生長。在一些實施方案中，所述試劑是拮抗劑。在一些實施方案中，所述試劑是激動劑。在本文所述的治療方法和施用方法的一些實施方案中，所述方法包括施用一種或多種本文所述的調(diào)節(jié)劑(例如兩種調(diào)節(jié)劑(例如拮抗劑和激動劑))。在一些實施方案中， 所述方法包括(a)施用有效量的第一試劑來促進軸突和/或樹突生長，和(b)施用有效量的第二試劑來促進突觸形成。在一些實施方案中，第一試劑是血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道Ci2 δ亞基的拮抗劑。在一些實施方案中，第二試劑是血小板反應(yīng)蛋白激動劑。在一些實施方案中，第一試劑和第二試劑先后施用。在一些實施方案中，第一試劑和第二試劑單獨施用。在一些實施方案中，第一試劑在第二試劑之前任意少于約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 天時施用。在一些實施方案中，第二試劑在第一試劑后任意少于約1、3、6、9、12、18、Μ小時時施用。本文所述的治療方法和施用方法，其包括本發(fā)明的激動劑和/或拮抗劑，以調(diào)控突觸形成和/或軸突生長同時最小化任何副作用的劑量施用。注意，對體內(nèi)應(yīng)用而言應(yīng)當在醫(yī)師的執(zhí)導(dǎo)下獲得和使用組合物。治療性配制物的劑量可廣泛變化，這取決于疾病性質(zhì)、 施用頻率、施用方式、宿主對試劑的清除率等等。可以施用藥物組合物用于預(yù)防性和/或治療性處理?？梢栽诩毎囵B(yǎng)物和/或試驗動物中根據(jù)標準藥物規(guī)程測定活性成分的毒性和治療效力，包括例如測定LD5tl(對50% 群致死的劑量)和ED5tl(在50%群中治療有效的劑量)。毒效應(yīng)和治療效應(yīng)之間的劑量比是治療指數(shù)，其可以表述為LD5(i/ED5(i。優(yōu)選顯示大治療指數(shù)的化合物。從細胞培養(yǎng)物和/或動物獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的一系列劑量?；钚猿煞值膭┝客ǔＡ杏诰哂械投拘缘难h(huán)濃度范圍內(nèi)，包括ED5tlt5劑量可在該范圍內(nèi)變化，取決于使用的劑型和使用的施用途徑。要給予具體患者的本文所述治療性組合物的有效量會取決于多種因素，其中若干種在患者與患者之間不同。試劑的劑量會取決于治療、施用途徑、治療法的性質(zhì)、患者對治療法的敏感度等等。利用LD5tl動物數(shù)據(jù)和其他信息，根據(jù)施用途徑，臨床醫(yī)師能夠確定針對個體的最大安全劑量。利用常用技術(shù)，有能力的臨床醫(yī)師應(yīng)當能夠在常規(guī)臨床試驗進程中優(yōu)化具體治療性組合物的劑量。組合物可以在一系列多于一次的施用中施用給受試者。對治療性組合物而言，規(guī)律的周期性施用有時會是需要的，或者可以是期望的。治療方案可根據(jù)試劑而變化，例如一些試劑可以在每天或每半天的基礎(chǔ)上使用延長的時間段，而更具選擇性的試劑可以按照更確定的時間進程施用，例如每天、每半天、每半周、每周等等使用一天、兩天、三天或更多天，一周或多周，一個月或多個月等等。可藥用組合物和配制物可以通過與適當?shù)目伤幱眠\載體或稀釋劑組合，將治療性試劑例如激動劑或拮抗劑摻入多種用于治療性施用的配制物中，或者可以配制進固體、半固體、液體或氣體形式的制劑中，例如片劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、 微球和氣霧劑。藥物組合物可根據(jù)期望的配制物而包含可藥用的、無毒的稀釋劑運載體，其被定義為通常用于配制用于動物或人施用的藥物組合物的載劑。選擇稀釋劑使其不影響組合的生物活性。這類稀釋劑的例子是蒸餾水、緩沖的水、生理鹽水、PBS、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。另外，藥物組合物或配制物可包含其他運載體、佐劑或無毒的，非治療性，非免疫原性的穩(wěn)定劑、賦形劑等等。組合物也可包含具有額外的物質(zhì)以接近生理條件， 例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑、潤濕劑和洗滌劑。組合物也可包含多種穩(wěn)定劑中的任意，例如抗氧化劑。當藥物組合物包含多肽時， 多肽可以與多種公知的化合物復(fù)合，所述化合物增強多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，或以其他方式增強其藥理學特性(例如提高多肽的半衰期、降低其毒性、增強其溶解度或吸收)。這類修飾或復(fù)合劑的實例包括硫酸鹽、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽。組合物的多肽也可以與增強其體內(nèi)屬性的分子復(fù)合。這類分子包括例如糖類、多胺、氨基酸、其他肽、離子(例如鈉、鉀、 鈣、鎂、錳)和脂質(zhì)。關(guān)于適用于多種類型施用的配制物的進一步指導(dǎo)可參閱 Remington' sPharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版，(1985)。藥物遞送方法的簡短綜述參閱Langer, Science 249 :1527-1533(1990)。對經(jīng)口施用而言，可以以固體劑型或者液體劑型施用活性成分，所述固體劑型例如膠囊劑、片劑和粉末劑，所述液體劑型例如酏劑、糖漿劑和懸浮劑。可以將活性組分與無活性的成分和粉末化的運載體一起包封在明膠膠囊中，所述無活性成分和粉末化的運載體例如為葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂。為了提供期望的色彩、口味、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散或其他已知的期望的特征，可以添加的額外的無活性成分的例子是氧化鐵紅、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦和可食用的白墨水。可使用相似的稀釋劑來制造壓縮片劑。片劑和膠囊均可以被制造成持續(xù)釋放的產(chǎn)物，從而在數(shù)小時的周期內(nèi)提供連續(xù)的藥物釋放。壓縮片劑可以是糖衣片或薄膜片，從而掩蔽任何令人不快的口味，并保護片劑不與大氣接觸，或者包有用于在胃腸道中選擇性崩解的腸溶衣。用于經(jīng)口施用的液體劑型可含有著色劑和調(diào)味劑來提高患者接受性。適用于腸胃外施用的配制物包括水性和非水性的、等滲無菌注射溶液，以及水性和非水性的無菌懸浮液，所述非水性的、等滲無菌注射溶液可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得配制物與預(yù)期受體的血等滲的溶質(zhì)，所述無菌懸浮液可含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于配制藥物組合物的組分優(yōu)選地具有高純度，并且基本不含可能有害的污染物 (例如至少為國家食品(NF)級別，通常至少為分析級別，更通常至少為藥物級別)。另外， 意圖體內(nèi)使用的組合物通常是無菌的。對于給定的化合物必須在使用前合成的程度而言， 得到的產(chǎn)物通常基本不含合成或純化過程期間可能存在的任何可能的毒性劑，尤其是任何內(nèi)毒素。用于胃腸外施用的組合物也是無菌、基本等滲和在GMP條件下制造的?？梢詾榱嗽谀X中的保留和穩(wěn)定化而優(yōu)化配制物。將試劑施用進顱區(qū)室中時，期望試劑保留在顱區(qū)室中，并且不擴散或以其他方式穿過血腦屏障。穩(wěn)定化技術(shù)包括交聯(lián)，聚合，或與基團例如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、中性蛋白質(zhì)運載體等等連接，從而實現(xiàn)分子量的增加。提高保留的其他策略包括將試劑包埋在生物可降解或生物可蝕解的植入物中。通過轉(zhuǎn)運通過聚合物基質(zhì)的速率和植入物的生物降解，控制治療活性劑的釋放速率。藥物通過聚合物屏障的轉(zhuǎn)運也會受到以下的影響化合物溶解度、聚合物親水性、聚合物交聯(lián)程度、聚合物在吸收水后膨脹從而使得聚合物屏障對藥物更加通透、植入物的幾何形狀等等。 植入物的維度與選擇作為植入位點的區(qū)域的大小和形狀相當。植入物可以是顆粒、片、貼片、板、纖維、微囊等等，并且可具有與選擇的插入位點相當?shù)娜魏未笮』蛐螤睢Ｖ踩胛锟梢允钦w的，即活性劑通過聚合物基質(zhì)均勻地分布，或者是包封的，其中活性劑包封在聚合物基質(zhì)中。要使用的聚合物組合物的選擇可根據(jù)施用位點、期望的治療時間、患者耐受、要治療的疾病性質(zhì)等等而變化。聚合物的特征應(yīng)包括植入位點處的生物可降解性、與目的試劑的相容性、易于包封、在生理環(huán)境中的半衰期?？梢允褂玫纳锟山到獾木酆衔锝M合物可以是有機酯或醚，其降解時產(chǎn)生生理學可接收的降解產(chǎn)物，包括單體?？梢允褂盟狒Ⅴ０?、原酸酯等等自身或者與其他單體組合使用。聚合物可以是縮合聚合物。聚合物可以是交聯(lián)的或非交聯(lián)的。尤其感興趣的是羥基脂肪族羧酸的聚合物(均聚物或共聚物)，和多糖。感興趣的聚酯包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、聚己酸內(nèi)酯的共聚物及其組合。通過使用L-乳酸鹽/酯或D-乳酸鹽 /酯得到了緩慢生物降解的聚合物，而外消旋物則大幅增強降解。尤其感興趣的是乙醇酸 (glycolic acid)和乳酸的共聚物，其中通過乙醇酸與乳酸的比例控制生物降解速率。最快速降解的共聚物具有幾乎等量的乙醇酸和乳酸，其中任一均聚物都更加抗降解。乙醇酸與乳酸的比例也會影響植入物的脆性，其中對更大的幾何形狀而言期望更柔軟的植入物。 感興趣的多糖是藻酸鈣和功能化的纖維素，尤其是羧甲基纖維素酯，其特征是不溶于水、約 5kD到500kD的分子量等等。本發(fā)明的植入物中也可以使用生物可降解的水凝膠。水凝膠通常是共聚物材料，其特征是能夠吸漲液體。可以使用的示范性生物可降解的水凝膠描述于 Heller in :Hydrogels in Medicineand Pharmacy, N. A. Peppes 編著，第 III 卷，CRC Press, Boca Raton, FIa.，1987，第 137-149 頁中。制品和試布丨念本發(fā)明提供了包含組合物、配制物和單位劑量的制品，其裝在用于在本文所述治療方法和施用方法中使用的合適包裝中。本文所述組合物的合適包裝是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如罐(例如密封罐)、管(例如密封管)、安瓿、瓶、壇、柔性包裝(例如密封的Mylar 或塑料袋)等等中。這些制品可進一步滅菌和/或密封。本發(fā)明還提供了藥物包或試劑盒，其包含一種或多種裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成分的容器?？膳c這類容器一起提供形式為政府機構(gòu)提出的管理藥物或生物學制品制造、使用或銷售的通知書，所述通知書反映了機構(gòu)批準制造、使用或銷售以用于人施用。本發(fā)明試劑盒中提供的說明書通常是標簽或包裝插入頁(例如包含在試劑盒中的紙片)上書寫的說明書，但是也可以接受機器可讀的說明書(例如磁性儲存盤或光學儲存盤所攜帶的說明書)。涉及納米顆粒組合物使用的說明書通常包括關(guān)于針對預(yù)期治療的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。試劑盒還可包含選擇合適個體或治療的描述。本發(fā)明還提供了下述試劑盒，其包含本文所述組合物(或單一劑型和/或制品)， 并可進一步包含對所述組合物使用方法(例如本文中進一步描述的用途)的說明。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含上文所述包裝。在其他實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含上文所述包裝和包含緩沖液的第二包裝。其還可包含從商業(yè)和使用者角度看來期望的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和帶有進行本文所述任何方法的說明的包裝插入頁。篩選方法在本發(fā)明的一些方面中，本發(fā)明提供了針對增強突觸發(fā)生的活性篩選候選試劑的方法，所述方法包括a)測量候選試劑與α 2 δ多肽(例如α 2 δ 1多肽)或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α 2 δ多肽(例如α 2 δ 1多肽) 或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成， 其中與無候選試劑時突觸形成相比，存在候選試劑時增加的突觸形成表明所述候選試劑具有增強突觸發(fā)生的活性。本發(fā)明還涉及針對抑制突觸發(fā)生的活性篩選候選試劑的方法，所述方法包括a)測量候選試劑與α 2 δ多肽(例如α 2 δ 1多肽)或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α 2 δ多肽(例如α 2 δ 1多肽)或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑和血小板反應(yīng)蛋白激動劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成，其中與無候選試劑時突觸形成相比，存在候選試劑時減少的突觸形成表明所述候選試劑具有抑制突觸發(fā)生的活性。針對調(diào)控突觸發(fā)生的能力篩選候選試劑，所述試劑可包括候選血小板反應(yīng)蛋白衍生物、變體、片段、模擬物、激動劑和拮抗劑、和/或GABA類似物和模擬物?？梢葬槍︹}通道亞基α 2 δ (例如亞基α 2 δ 1)和/或包含至少一個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽篩選目的試劑。這類化合物篩選可以使用體外模型進行，使用表達多肽的細胞(包括經(jīng)遺傳改變的細胞)進行，或使用動物或使用純化的蛋白質(zhì)進行?？墒褂枚喾N測定法用于這一目的。在一個實施方案中，最初針對與鈣通道亞基Q2S (例如鈣通道亞基α2δ1)的接合，或針對與血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的相互作用，測試被預(yù)測為突觸發(fā)生拮抗劑或激動劑的化合物。然后可針對在生物模型(例如下文所述的體外培養(yǎng)物體系)、動物模型等等中的功能活性，進一步測試所述化合物。例如，可以通過已知的藥理學、通過結(jié)構(gòu)分析、使用基于計算機的建模通過合理的藥物設(shè)計、通過接合測定等等鑒定候選試劑?？梢允褂枚喾N體外模型確定化合物是否以結(jié)合或者以其他方式影響血小板反應(yīng)蛋白的活性。使用這樣的候選化合物在允許突觸發(fā)生的環(huán)境中接觸神經(jīng)元?？梢葬槍υ鰪姷耐挥|發(fā)生，在體外模型中進一步測試這樣的化合物。如下量化突觸發(fā)生對培養(yǎng)物中的神經(jīng)元施用候選試劑，并測定不存在或存在試劑時突觸的存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，神經(jīng)元是原代培養(yǎng)物，例如RGC的原代培養(yǎng)物。通過常規(guī)方法如連續(xù)免疫淘洗獲得純化的RGC群。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，所述培養(yǎng)基通常應(yīng)包含適當?shù)纳L因子，例如CNTF ；BDNF等等。作為陽性對照，可以向某些孔中添加可溶的血小板反應(yīng)蛋白，例如TSP1、TSP2等等。將神經(jīng)細胞(例如RGC)培養(yǎng)一段時間， 所述時間足以允許有活力的向外生長過程，然后將其用候選試劑培養(yǎng)約1天到1周的一段時間，允許突觸形成。為了量化突觸，將培養(yǎng)物固定、封閉和洗滌，然后如本領(lǐng)域所已知的用特異性突觸蛋白質(zhì)例如突觸結(jié)合蛋白等染色，并用適當?shù)脑噭╋@影?？梢杂蔑@微鏡進行染色的分析。在一個實施方案中，用照相機和圖像捕獲軟件調(diào)節(jié)熒光發(fā)射的數(shù)碼圖像，以去除未使用的像素值范圍，并調(diào)節(jié)使用的像素值以利用整個像素值范圍。然后歸并相應(yīng)的通道圖像產(chǎn)生有色(RGB)圖像，所述圖像含有兩個單通道圖像作為個體色彩通道?？梢允褂脻L動球背景相減算法從每個圖像通道中去除低頻背景，來鑒定共定位的斑塊。針對圖像中所有突觸結(jié)合蛋白、PSD-95和共定位的斑塊，記錄數(shù)量、平均面積、平均最小和最大像素強度和平均像素強度并保存在硬盤中用于分析。在一些實施方案中，候選試劑包括大量化學品類別，盡管其通常為有機分子，優(yōu)選地為分子量大于50并小于約2，500道爾頓的小有機化合物。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性相互作用(尤其是氫鍵)必需的官能團，并通常包含至少一個胺、糖基、羥基或羧基，優(yōu)選地至少兩個功能化學基團。候選試劑通常包含環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或多聚芳香族結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)被一個或多個上述官能團取代。候選試劑還可以是生物分子，包括肽、糖、 脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。通常以不同的試劑濃度并列運行多種測定混合物，以獲得對多種濃度的不同應(yīng)答。通常這些濃度之一發(fā)揮陰性對照的作用，即處于零濃度或低于檢測水平。候選試劑得自多種來源，包括合成或天然化合物文庫。例如，可以獲得隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子的大量手段，包括表達隨機化的寡核苷酸和寡肽?；蛘?，可以獲得或容易地生產(chǎn)細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，天然或合成生產(chǎn)的文庫和化合物容易通過常規(guī)化學、物理和生物化學手段被修飾，并可用于生產(chǎn)組合文庫。可對已知的藥理學試劑進行直接或隨機的化學修飾，例如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等等，以生產(chǎn)結(jié)構(gòu)類似物。測試試劑可得自文庫，例如天然產(chǎn)物文庫或組合文庫。也可以通過合理的設(shè)計制備候選化合物的文庫(一般參閱Cho等，Pac. Symp. Biocompat. 305-16，1998 ；Sun 等，J. Comput. Aided MoI. Des. 12 :597-604,1998)；每份文獻通過參考整體并入本文)。例如，可以通過合成組合化學文庫來制備磷酸酶抑制物的文庫(一般參閱 DeWitt 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 :6909_13，1993 ；國際專利公開 WO 94/08051 ；Baum, Chem. & Eng. News 72 :20-25,1994 ；Burbaum 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 :6027-31,1995 ；Baldwin 等，J. Am. Chem. Soc. 117 :5588-89,1995 ；Nestler 等，J. Org. Chem. 59 :4723-24,1994 ；Borehardt 等，J. Am. Chem. Soc. 116 :373-74,1994 ；Ohlmeyer 等， Proc. Nat. Acad. Sci. USA90 10922-26，所有文獻通過參考整體并入本文)?！敖M合文庫”是化合物的集合，其中組成所述集合的化合物由一種或多種類型的亞單位(subimit)組成。制備組合文庫的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括以下方法美國專利號5，958，792 ；5, 807，683 ；6, 004，617 ；6, 077，954 ；其通過參考并入本文。亞單位可選自天然或非天然的組件。組合文庫的化合物以一種或多種方式，在于數(shù)量、順序、對組成組合物的一種或多種亞單位進行的一種或多種的類型修飾方面而有所不同。或者，組合文庫可表示“核心分子”的集合，所述核心分子由于它們含有的R基團的數(shù)量、類型或位置和/或組成核心分子的分子的身份而有所不同?；衔锏募弦韵到y(tǒng)的方式產(chǎn)生。系統(tǒng)產(chǎn)生以上文公開的一種或多種方式彼此區(qū)分的化合物集合的任何方法是組合文庫。組合文庫可以在來自一種或多種固相結(jié)合樹脂起始材料的固體支持物上合成。文庫可含有五種( 或更多、優(yōu)選地十種(10)或更多彼此不同的有機分子。每種不同的分子以可檢測的量存在。使得每種不同分子的存在可以測定的實際量可由于使用的實際規(guī)程而變化，并可隨著分離、檢測和分析技術(shù)的發(fā)展而改變。當所述分子以基本相等的摩爾量存在時，可以檢測出100皮摩爾或更多的量。優(yōu)選的文庫包含基本等摩爾量的每種期望的反應(yīng)產(chǎn)物，并且不包含相對大量或小量的任何給定分子，從而這類分子的存在在任何測定中處于支配地位或者完全被抑制。通常通過在固相支持物(例如微珠)上衍生化起始化合物來制備組合文庫。通常， 固體支持物與可商業(yè)獲得的樹脂例如Rink或Merrifield Resin結(jié)合。與初始化合物結(jié)合后，取代基與初始化合物結(jié)合。取代基被加成在初始化合物，并且可通過提供包含取代基的反應(yīng)物的混合物來改變。合適的取代基的例子包括但不限于烴取代基，例如脂肪族、脂環(huán)族取代基，芳香族、脂肪族和脂環(huán)族取代的芳香族核等等，以及環(huán)狀取代基；取代的烴取代基， 即含有非烴基團的取代基，所述非烴基團不改變主要的烴取代基(例如為鹵素(特別是氯和氟)、烷氧基、巰基、烷基巰基、硝基、亞硝基、亞砜基等等)；和雜取代基，即在具有主要為烴基的特征同時，含有除碳原子以外其他原子的取代基。合適的雜原子包括例如硫、氧、氮和例如吡啶基、呋喃基、硫代苯基、咪唑基等等的這類取代基。在基于烴的取代基中，雜原子 (通常不多于一個)可代替每個碳原子存在?；蛘呋跓N的取代基中不存在這類基團或雜原子，并且因此取代基可以純?yōu)闊N?？蛇M一步測試初始通過任何篩選方法鑒定的化合物，以驗證表觀活性。這類方法的基本格式涉及對用作入模型的動物施用在初始篩選中鑒定的前導(dǎo)化合物，然后測定對突觸發(fā)生的影響。驗證研究中使用的動物模型通常是哺乳動物。合適的動物的特定例子包括但不限于靈長類、小鼠和大鼠。
實施例公開以下的實施例，從而為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員提供如何制造和使用本發(fā)明的完全公開和描述，并且不旨在限制本發(fā)明涉及的范圍。進行了確保使用的數(shù)字(例如量、溫度、濃度等)精確性的努力，但是應(yīng)當允許一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，部分是按重量計的部分，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度；壓強處于或接近大氣壓。實施例1星形膠質(zhì)細胞分泌的可溶信號可觀地提高了培養(yǎng)物中CNS神經(jīng)元之間的突觸數(shù)量，所述信號在本文中被鑒定為血小板反應(yīng)蛋白(TSP)，其對星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基的突觸促進活性而言是必要且充分的組分。TSP誘導(dǎo)超微結(jié)構(gòu)正常的突觸，所述突觸是突觸前活性但突觸后無活性的。TSP在發(fā)育中的腦各處的星形膠質(zhì)細胞和突觸中體內(nèi)濃縮，并且 TSPl及其直系同源物TSP2均有缺陷的小鼠具有顯著的突觸數(shù)量減少。TSP是約500kD的大寡聚體細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，其通過結(jié)合大量膜受體、其他細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和細胞因子而介導(dǎo)細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用。存在五種TSP，各自由單獨的基因編碼。盡管若干TSP在腦中表達，但是這些TSP的功能是未知的。TSPl和TSP2 是密切相關(guān)的三聚體蛋白質(zhì)，其共享相同的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的集合。TSP4(其為五聚體并具有與TSPl和TSP2不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu))存在于成年神經(jīng)系統(tǒng)中，在那里局限于一些CNS 突觸以及神經(jīng)肌肉接頭。所有5種TSP同種型由于共享共有的EGF樣結(jié)構(gòu)域而具有強突觸誘導(dǎo)活性。我們使用該結(jié)構(gòu)域確定，TSP通過與一種廣泛表達的跨膜神經(jīng)元細胞表面分子一韓通道亞基 α 2 δ 1的新相互作用來誘導(dǎo)突觸形成，所述亞基先前未與突觸形成聯(lián)系起來。用作抗癲癇藥和抗神經(jīng)性疼痛劑的加巴噴丁先前顯示與該受體結(jié)合，但是其作用機制長久以來是未知的。我們顯示加巴噴丁在培養(yǎng)物中能夠特異性抑制血小板反應(yīng)蛋白或其結(jié)構(gòu)域的突觸形成活性。該作用對血小板反應(yīng)蛋白是特異性的，因為加巴噴丁不抑制另一星形膠質(zhì)細胞分泌的突觸發(fā)生蛋白Hevin誘導(dǎo)的突觸形成。如圖IA中所示，所有TSP均為細胞外聚合物、多結(jié)構(gòu)域的鈣結(jié)合糖蛋白，其作用于細胞表面和細胞外機制環(huán)境中。血小板反應(yīng)蛋白基因家族被分為兩個亞類。亞類A血小板反應(yīng)蛋白包括TSPl和2，其為三聚體并具有更大的N端結(jié)構(gòu)域(黑色卵形)，并且其具有三個額外的備解素樣重復(fù)(矩形)。亞類B的TSP是五聚體并且缺乏備解素樣重復(fù)。之前顯示亞類A TSPl和2是突觸發(fā)生的(Christopherson等，Cell，2005)。本文中顯示，五聚體亞類B血小板反應(yīng)蛋白也是突觸發(fā)生的。針對突觸前突觸結(jié)合蛋白和突觸后PSD-95共定位的RGC免疫染色顯示，無星形膠質(zhì)細胞時有很少共定位的突觸斑(B)，但是存在星形膠質(zhì)細胞飼喂層時有許多(圖1C)。使用來自下述C0S7細胞的條件培養(yǎng)基的RGC培養(yǎng)物形成許多突觸，其被觀察為共定位的突觸前斑和突觸后斑，所述C0S7細胞用TSP3過表達載體(圖1D)或用經(jīng)純化的 TSP4(圖1E)或TSP5(圖1F)轉(zhuǎn)染。星形膠質(zhì)細胞和TSP對突觸斑影響的量化限制于圖IG中。與單獨的RGC(對照)相比，星形膠質(zhì)細胞和TSP1、TSP4或TSP5均顯著地提高共定位的突觸斑/細胞的數(shù)量。如圖IH中所示，與用來自空載體轉(zhuǎn)染的C0S7細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的RGC(對照)相比，用來自TSP3過表達載體轉(zhuǎn)染的C0S7細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)RGC 顯著地提高了共定位的突觸斑/細胞的數(shù)量Γρ < 0. 05，η = 20，誤差棒標明SEM值)。圖2A中展示了血小板反應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。TSPl和2由肝素結(jié)合N端結(jié)構(gòu)域(C)、與前膠原具有同源性的連接子(PC)、三個TSP-型-1(備解素)重復(fù)、三個EGF-樣 (TSP-型-2)重復(fù)、七個TSP型-3(鈣結(jié)合)重復(fù)，和細胞結(jié)合羧基端結(jié)構(gòu)域(C)組成。圖2B中展示了 TSPl (B)和TSP2 (C)結(jié)構(gòu)域?qū)GC體外形成的突觸數(shù)量影響的量化。與單獨培養(yǎng)的RGC相比，星形膠質(zhì)細胞和純化的TSPl (三聚體-8nM)顯著提高了 RGC 形成的突觸數(shù)量。有趣的是，含有EGF-樣重復(fù)(藍色)的TSPl截短構(gòu)建體(單體-20nM) 也能夠顯著提高突觸數(shù)量。如圖2C中所示，與單獨培養(yǎng)的RGC相比，含有TSP2的EGF-樣重復(fù)的，類似純化的重組TSP2結(jié)構(gòu)域(單體-20nM)顯著提高RGC形成的突觸數(shù)量。有趣的是，僅含有第三個 EGF-樣結(jié)構(gòu)域以及TSP2的C-末端的構(gòu)建體也是突觸發(fā)生的。然而，單獨的第三個EGF-樣重復(fù)(藍色)不顯著提高突觸數(shù)量。(圖2D、E)。針對TSP的EGF樣重復(fù)的抗體能夠阻斷它們的突觸發(fā)生作用。與單獨培養(yǎng)的RGC相比，用星形膠質(zhì)細胞或用重組的TSPl (圖2D) 或TSP2(圖2E)截短構(gòu)建體培養(yǎng)的RGC形成多得多的突觸，所述截短構(gòu)建體含有第三個備解素重復(fù)以及三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域(在下文中稱作EGF-樣結(jié)構(gòu)域)。有趣的是，與TSP的第三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體A4. 1 (Neomarkers) 阻斷TSPl以及TSP2突觸發(fā)生構(gòu)建體的突觸發(fā)生作用。與TSP的第二個EGF-樣重復(fù)結(jié)合的另一單克隆抗體C6. 7 (Neomarkers)不影響TSPl構(gòu)建體的突觸發(fā)生功能，但是能夠阻斷突觸發(fā)生的TSP2結(jié)構(gòu)域。這些數(shù)據(jù)顯示，TSP的突觸發(fā)生作用通過TSP的EGF-樣重復(fù)介導(dǎo)，最可能通過定位在第三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域的相互作用介導(dǎo)。Γρ < 0. 05,η = 20，誤差棒標明SEM值)。圖3A顯示，針對突觸前突觸結(jié)合蛋白和突觸后PSD-95共定位的RGC免疫染色展示了單獨培養(yǎng)時有很少共定位的突觸斑，但是存在純化的TSPl或重組的TSP2EGF-樣結(jié)構(gòu)域時有許多。如圖;3B中所示，結(jié)合鈣通道亞基α2δ的加巴噴丁(GBP，32yM)阻斷了 TSPl或 TSP2EGF-樣結(jié)構(gòu)域的突觸發(fā)生作用。圖3C，加巴噴丁對TSP誘導(dǎo)的突觸形成影響的量化。 對TSPl或TSP2 EGF-樣結(jié)構(gòu)域添加加巴噴丁(32 μ M)將RGC形成的突觸數(shù)量降低至背景水平。圖3D，加巴噴丁阻斷星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基(ACM)的突觸發(fā)生作用。與單獨培養(yǎng)的 RGC相比，存在大鼠或小鼠ACM時培養(yǎng)的RGC形成5-10倍更多的突觸數(shù)。加巴噴丁(32 μ Μ) 的添加減小了大鼠和小鼠ACM的突觸發(fā)生作用。圖3Ε。加巴噴丁阻斷新突觸的形成，但是不降解已經(jīng)形成的突觸或由另一突觸發(fā)生蛋白質(zhì)Hevin形成的突觸。用純化的重組TSP2 EGF-樣結(jié)構(gòu)域QOnM)或Hevin(30ηΜ) 將3DIV RGC體外處理9天。與單獨培養(yǎng)的RGC相比，EGF-樣結(jié)構(gòu)域和Hevin均顯著提高形成的突觸數(shù)量。與(C)類似，和EGF-樣結(jié)構(gòu)域一起添加加巴噴丁(GBP)縮小其突觸發(fā)生作用。然而，在第6天向用EGF-樣結(jié)構(gòu)域處理過的RGC中再添加3天加巴噴丁未減少突觸數(shù)量，表明加巴噴丁不降解已經(jīng)形成的突觸，而是阻斷新突觸的形成。向Hevin中添加加巴噴丁未影響Hevin的突觸發(fā)生功能，這與其添加的時間無關(guān)，所述Hevin是能夠誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)性突觸形成的另一種由星形膠質(zhì)細胞分泌的蛋白質(zhì)。Γρ < 0. 05,η = 20，誤差棒標明SEM值)。TffeRGC的純化和培養(yǎng)。如先前所述(Barres等，(1988)Neuron 9，791)，通過從P5 Sprague-Dawley IE (Simonsen Labs, Gilroy, CA)中連續(xù)免疫淘洗(immunopanning) 至大于99. 5%的純度來純化RGC。在25孔板(Falcon)中的玻璃(Assistant)或Aclar 22C (Allied Signal)蓋玻片上每孔培養(yǎng)約30，000個RGC細胞，所述蓋玻片先用多聚-D-賴氨酸(10 μ g/ml)再用層粘連蛋白O μ g/ml)涂覆。在600 μ 1從Bottenstein and Sato (1979)改良的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)RGC，所述培養(yǎng)基含有Neurobasal (Gibco)、牛血清白蛋白、硒、腐胺、3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸、運鐵蛋白、孕酮、丙酮酸鹽/酯(lmM)、谷氨酰胺(2mM)、CNTF (10ng/ml)、BDNF(50ng/ml)、胰島素(5 μ g/ml)和毛喉素(10μΜ)ο 重組的人 BDNF 禾口 CNTF 由 Regeneron Pharmaceuticals f康ft提供。純化的人血小板TSPl來自Sigma或者Haematologic Technologies, 二者具有相似的結(jié)果。重組的TSP2純化自下述無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基是表達小鼠TSP2的桿狀病毒感染的昆蟲細胞的條件培養(yǎng)基。因為純化的TSPl可容易獲得，所以除非另有說明，我們使用它作為我們實驗中的TSP來源，除非另有說明，所述TSP以5μ g/ml的濃度使用。將 RCG培養(yǎng)4天以允許有活力的向外生長的過程，然后再用TSP培養(yǎng)6天。所有其他試劑得自 Sigma。星形膠質(zhì)細胞和ACM 的制備。如 McCarthy，J. de Vellis, J. Cell Biol. 85, 890(1980)所述制備皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)。簡言之，將出生后1-2天的皮質(zhì)用木瓜蛋白酶消化并在組織培養(yǎng)瓶(Falcon)中接種在不允許神經(jīng)元存活的培養(yǎng)基中(Dulbecco改良的fegle培養(yǎng)基，胎牛血清(10%)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml)、谷氨酰胺QmM)和丙酮酸鈉(ImM))。4天后從單細胞層上搖動除下不粘附的細胞，并將細胞再孵育2-4天以允許再填滿單細胞層。將培養(yǎng)基更換為含AraC(IOyM)的新鮮培養(yǎng)基并孵育48小時。胰蛋白酶消化星形膠質(zhì)細胞，并接種在M孔插入物(insert，F(xiàn)alcon, 1. O μ m)或IOcm組織培養(yǎng)皿中。為了制備ACMJf IOcm平皿中匯合的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物在PBS中洗滌3次并補充IOmL RGC培養(yǎng)基(不含CNTF、BDNF或毛喉素)。除非另有說明，在條件化4_6天后收獲 ACM，濾過0.2 μ m注射器濾器，并通過5KD分子量截留離心濃縮器(Millipore)濃縮10倍。 除非另有說明，以5X的最終濃度使用AOL將RCG培養(yǎng)4天，以允許有活力的向外生長過程，然后用ACM或星形膠質(zhì)細胞飼喂層再培養(yǎng)6天。突觸測定。為了量化突觸，將培養(yǎng)物在4%低聚甲醛(PFA)中固定7分鐘，在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌3次并在IOOyL封閉緩沖液(50%抗體緩沖液(0.5%牛血清白蛋
5% Triton X_100、30mM NaP04、750mMNaCl、5%正常山羊血清和0. 4% NaN3，pH 7.4)、 50%山羊血清(NGS)、0. 1% Triton-Χ)中封閉30分鐘。封閉后將蓋玻片在PBS中洗滌3次， 并向每個蓋玻片上添加100 μ L—級抗體溶液，所述溶液由1 500稀釋于抗體緩沖液中的兔抗突觸結(jié)合蛋白(胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，Synaptic Systems)和小鼠抗-PSD-95 (6G6-1C9克隆， Affinity Bio Reagents)組成。將蓋玻片在4°C孵育過夜，在PBS中洗滌3次，并用IOOyL 第二抗體溶液孵育，所述溶液含有1 1000稀釋于抗體緩沖液中的Alexa-594綴合的山羊抗兔和Alexa-488綴合的山羊抗小鼠(Molecular Probes) 0在室溫下孵育2小時后，將蓋玻片在PBS中洗滌五次，并在含DAPI的Vectashield包埋介質(zhì)(VectorLaboratories Inc) 中包埋于載玻片(VWR Scientific)上。對突觸前活性測定而言，通過用對應(yīng)于突觸結(jié)合蛋白N-端腔部分的肽進行免疫，產(chǎn)生兔突觸結(jié)合蛋白抗血清。將該血清以1 500添加至活培養(yǎng)物中并孵育6小時。然后將細胞在DPSB中洗滌3次，如上文固定并染色，不同之處在于省略來自一級抗體溶液的突觸結(jié)合蛋白抗體。使用Nikon Diaphot and Eclipse epi熒光顯微鏡(Nikon)對包埋的蓋玻片成像。使用DAPI熒光，通過肉眼鑒定并隨機選擇健康細胞，其細胞直徑至少是它們最接近的鄰居的2倍。使用冷卻單色CCD照相機和SPOT圖像捕獲軟件(Diagnostic Instruments, he)，在594nm和488nm處針對每個選擇的細胞記錄熒光發(fā)射的8-比特數(shù)字圖像。調(diào)節(jié)每個單通道圖像，以去除像素值范圍的未使用的部分，并適當?shù)卣{(diào)節(jié)使用的像素值，以利用整個像素值范圍。然后歸并相應(yīng)的通道圖像產(chǎn)生有色(RGB)圖像，所述圖像含有兩個單通道圖像作為個體色彩通道。這些操作通過定做軟件包SpotRemover ( 2001 Barry Wark)自動進行。使用定做撰寫的插件鑒定共定位的斑塊。斑塊計數(shù)算法的整個文件可得自〃 Puncta Analyzer"插件的源代碼。簡言之，使用滾動球背景相減算法(the rolling ball background subtraction algorithm)從每個圖像通道中去除低頻背景。通過為圖像設(shè)定閾值使得僅保留高于閾值的合理突觸斑，將單通道圖像中的板塊“掩蔽”。然后使用 ImageJ的〃 Particle Analyzer"插件鑒定和表征每個通道內(nèi)的斑塊。如果兩個圓的中心集中在斑塊中心并且面積等于斑塊面積、距離比兩個圓的半徑中較大的更小，則不同色彩通道中的斑塊被定義為共定位。針對圖像中所有突觸結(jié)合蛋白、PSD-95和共定位的斑塊， 記錄數(shù)量、平均面積、平均最小和最大像素強度和平均像素強度并保存在硬盤中用于之后的分析。免疫組織化學。將腦切片在37°C干燥30分鐘，之后應(yīng)用封閉緩沖液。將載玻片在 PBS中洗滌3次，每次5分鐘。將使用的第一抗體稀釋進如下的抗體緩沖液中TSP1(P10，小鼠單克隆的，Immunotech，l 200或Ab 8，Neomarkers，兔，1 200)、突觸結(jié)合蛋白(兔多克隆的，Synaptic Systems, 1 500)、埃茲蛋白(單克隆的 3C12，Neomarkers，1 200)、 SV2 (雜交瘤上清，Developmental Studies Hybridoma Bank, 1 30)、Bassoon (Stressgen, 1 400)、PSD-95 (單克隆的 6G6-1C9，Affinity Bioreagents, 1 250)，并在 4°C孵育過夜，之后在PBS中洗滌3次。以1 1000添加第二 Alexa-綴合的抗體(Molecular Probes), 室溫下2小時。將玻片在PBS中洗滌3次并包埋于含DAPI的Vectashield中。突觸數(shù)量的共聚焦分析。在Leica SPS SP2 AOBS共聚焦顯微鏡上收集免疫染色的腦的圖像。將光學切片直線平分(line-averaged)并以0.觀μ M的間隔收集。對每個切片個別地調(diào)節(jié)增益、閾值和黑色水平，以覆蓋相同的像素值范圍，或者針對WT切片設(shè)定并對所有切片保持恒定。在兩種情況下對WT或KO動物中的相對突觸數(shù)獲得了等同的結(jié)果。 如下針對突觸數(shù)量化20個光學切片的堆疊(stacks)投射一系列5個(這是光學切割大部分突觸斑完整性的憑經(jīng)驗確定的數(shù)字)光學切片并對每個透射體積中的突觸數(shù)量計數(shù)。 使用ImageJ斑塊分析儀程序自動計數(shù)突觸，并通過手動計數(shù)證實計數(shù)的準確度。對P8WT 和KO而言N = 6個半球，對P21 WT和KO而言N = 10個半球。每個半球平均獲得3個堆疊，得到針對P8腦突觸斑分析的總計18個堆疊(72個光學切片)，和針對P21腦突觸斑分析的總計30個堆疊(120個光學切片)。實施例2-鈣通道亞基α 2 δ 1是涉及突觸形成的神經(jīng)元TSP受體為了確定α2δ 1是否在TSP-誘導(dǎo)的體外突觸形成中起作用，我們在RGC中過表達 α2δ1并測定TSP-誘導(dǎo)的突觸形成是否受到影響。與單獨用GFP轉(zhuǎn)染的RGC相比，過表達 α 2 δ 1的RGC應(yīng)答SD2時形成兩倍的突觸(圖4Α)，表明α 2 δ 1過表達增強TSP-誘導(dǎo)的突觸形成。單獨的α2 S 1過表達不足以在缺失TSP時誘導(dǎo)突觸形成，表明TSP-Ci2 δ 1相互作用是啟始突觸形成必需的。為了進一步確定TSP誘導(dǎo)的突觸形成是否需要α 2 δ 1，使用小干擾RNA(siRNA) 敲減途徑。對大鼠α2 δ 1特異性的siRNA集合體顯著地降低轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中的大鼠 α 2 δ 1表達(圖4Β)。用針對大鼠α 2 δ 1的該siRNA集合體或用siRNA對照集合體轉(zhuǎn)染 RGC0 α2δ 1的敲減有利地抑制星形膠質(zhì)細胞或TSP誘導(dǎo)的體外突觸形成(圖4C、4D和未顯示的數(shù)據(jù))，而非靶向的對照siRNA集合體(si對照)或針對大鼠整聯(lián)蛋白β 1蛋白質(zhì)的靶向siRNA集合體均不影響突觸形成(圖4C、4D)，所述整聯(lián)蛋白β 1蛋白質(zhì)是RGC突觸中存在的另一 TSP受體。這些結(jié)果證明α2 δ 1是TSP和星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的體外突觸形成所必需的。因為在α2δ1過表達和敲減實驗中僅計數(shù)了表達GFP細胞上的突觸，所以這些結(jié)果還表明α2 δ 1作用于突觸后側(cè)，并且是細胞接收突觸的能力所必需的。實施例3- α 2 δ 1-促進的突觸形成不取決于鈣通道功能或數(shù)量為了查明α 2 δ 1是否通過其調(diào)控鈣通道生物物理特性的能力促進突觸形成，測試了 Sl亞基是否仍然能夠增強TSP-誘導(dǎo)的突觸形成。為此，在RGC中過表達δ 1并分析其對SD2-誘導(dǎo)的突觸形成的影響。δ 1亞基的過表達未模擬全長α 2 δ 1的作用。相反，δ 1 亞基發(fā)揮顯性負構(gòu)建體的作用并導(dǎo)致SD2-誘導(dǎo)的突觸形成的抑制(圖4Ε)。類似地，δ 亞基表達還阻斷了星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明α 2 δ 1不通過調(diào)控鈣通道的生物物理特性來介導(dǎo)其對突觸形成的影響。另外，α2δ 1對TSP-誘導(dǎo)的突觸形成的增強需要存在受體的α 2亞基，所述亞基含有VWF-A結(jié)構(gòu)域。另外，δ亞基的顯性負作用提示通過TSP-Ci2相互作用傳遞突觸誘導(dǎo)信號需要δ亞基。進行進一步的研究來確定α 2 δ 1在突觸形成中的作用是否與其通過增加表面鈣通道數(shù)量來提高鈣通量的能力相關(guān)。之前我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞提高RGC細胞表面上的鈣通道總數(shù)(Ullian等，Science 291 =657-661, 2001) 0該提高是小量的，并且與突觸形成同時而不是在其之前發(fā)生，使其不可能是突觸形成的原因。為了直接測試突觸形成是否需要電壓門控鈣通道(VGCC)功能，向RGC培養(yǎng)基中添加L-型鈣通道阻斷劑尼莫地平和硝苯吡啶，以確定這是否降低SD2-誘導(dǎo)的突觸形成(圖5A)。盡管這些藥物的存在對RGC的存活有不利影響，但是阻斷L-型通道功能對TSP-誘導(dǎo)的突觸形成沒有影響，所述阻斷占RGC中鈣通量的大部分(Ullian等，Science291 :657-661,2001)并且主要是突觸后的。類似地， 突觸前N和P/Q型通道的阻斷劑(芋螺毒素GVIA、芋螺毒素MVIIA、美洲蜘蛛毒素IVA和芋螺毒素MVIIC)未阻斷TSP-誘導(dǎo)的突觸形成(數(shù)據(jù)未顯示)。最后，進行研究來確定是否RGC中增強的突觸后L-型鈣通道表達會以與過表達 α2δ 1相似的方式增強突觸形成。為此，在RGC中過表達L-型鈣通道α IC和β亞基，并分析它們對星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成的影響。在存在或不存在星形膠質(zhì)細胞時α 1和 β亞基的過表達對突觸形成沒有正面或負面的影響(圖5Β)。這些結(jié)果提示，鈣通道功能或者鈣通道數(shù)量的提高均不是TSP-誘導(dǎo)的突觸形成的驅(qū)動力，然而，對導(dǎo)致TSP-誘導(dǎo)的突觸形成起始的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件而言，α 2 δ I-VGCC相互作用可仍然是重要的。這些觀察一起提供了進一步證明α 2 S I-TSP相互作用可通過α 2 δ 1的尚且未知的功能誘導(dǎo)突觸形成。實施例4-在神經(jīng)元中過表達α 2 δ 1增強體內(nèi)突觸形成Ci2 δ 1敲除是早期胚胎致死的；因此，難以測試α2δ 1對體內(nèi)突觸形成的影響。作為一種替代性途徑，在特異性過表達α 2 δ 1的小鼠中檢查突觸數(shù)，所述過表達處于Thyl啟動子的控制下(Li等，Pain 125 =20-34,2006)。由于脊柱興奮性過度并且在CNS各處具有提高的α2 δ 1蛋白質(zhì)水平，所以這些轉(zhuǎn)基因小鼠對機械和熱刺激是高度敏感的。我們研究了這些小鼠是否在皮層中具有更高水平的興奮性突觸。用針對突觸后密度蛋白質(zhì)95(PSD95) 和突觸前囊泡谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1或2(分別為VGlutl和VGlut2)的抗體，對來自21天齡(P21)轉(zhuǎn)基因和野生型同窩小鼠的徑向腦切片進行共免疫染色。量化共定位的突觸前斑和突觸后斑的數(shù)量，以確定這些小鼠皮層中的突觸密度。與同窩野生型對照相比，過表達 α2δ1的轉(zhuǎn)基因小鼠在皮層中具有顯著更多的VGlut2陽性興奮性突觸數(shù)量(圖6A和B)。 另一方面，對轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠而言，VGlutl陽性興奮性突觸的數(shù)量相似(圖6C和D)。 α 2 δ 1過表達特異性提高VGlu5陽性突觸的觀察結(jié)果是有趣的。一種可能的解釋是在這些小鼠中，α2δ1轉(zhuǎn)基因在確立VGlut2陽性突觸的神經(jīng)元中特異性地過表達?？偠灾^表達α 2 S 1的小鼠中VGlut2/PSD95突觸數(shù)量的提高顯示α 2 δ 1在促進腦中興奮性突觸形成中起作用。實施例5-α 2 δ 1的強親和力配體——加巴噴丁有力地抑制TSP和星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成Ci2 δ 1是加巴噴丁的高親和力受體。為了確定加巴噴丁(GBP)是否影響TSP或星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成，在存在或不存在GBP (32 μ Μ)時用SD2或ACM培養(yǎng)RGC。GBP 有力地抑制TSP和星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成(圖7A-C)。GBP對RGC無毒(RGC存活率在對照培養(yǎng)基中為62. 0士 2. 1%，與之相比含GBP的培養(yǎng)基中為66. 5士4. )。類似地， GBP未影響神經(jīng)突向外生長(數(shù)據(jù)未顯示)。進行研究確定GBP是否能夠溶解已經(jīng)形成的突觸。用SD2將RGC培養(yǎng)5天以允許突觸形成，然后添加GBP再培養(yǎng)1天。盡管在整個6天培養(yǎng)周期中一直存在時GBP完全抑制SD2誘導(dǎo)的突觸形成，但是僅在最后M小時向SD2添加GMP時突觸形成未受影響(圖7Β)。因此，GBP有力地阻斷了 TSP和星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的新突觸形成，但是不溶解已經(jīng)形成的突觸。有趣的是在高濃度下使用時GABA也阻斷TSP誘導(dǎo)的突觸形成(圖8)，所述GABA是以低得多的親和力結(jié)合α 2 δ 1的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(IC50 =650 μ Μ, (Suman-Chauhan 等，Eur. J. of Pharmacol. 244 :293-301,1993)。 為了確定GBP是否類似地阻斷體內(nèi)突觸形成，在出生后第一周用GBP或者鹽水注射新生小鼠，所述時間與腦中突觸形成的起始重疊(見實驗步驟)。進行分析確定注射GBP 的小鼠皮層中是否具有減少的谷氨酸能興奮性突觸。在這一年齡時，皮層中的P7谷氨酸能突觸主要是 VGlut2 陽性的(Miyazaki 等，The Eur. J. of Neuroscience, 17 :2563-2572, 2003)。因此，用針對VGlut2和PSD95的抗體進行來自(P7)注射鹽水或GBP的小鼠徑向腦切片的共免疫染色，并量化共定位的突觸前斑和突觸后斑的數(shù)量，以確定這些小鼠皮層中的突觸密度。與注射鹽水的對照小鼠相比，注射GBP的小鼠的大腦皮層中興奮性突觸密度存在顯著的降低(圖7D)。這一差異主要歸因于注射GBP的一半動物中突觸數(shù)量的顯著降低。在應(yīng)答GBP的這一半小鼠中，VGlut2/PSD95突觸密度可觀地降低至少于注射鹽水的小鼠中數(shù)值的10%，盡管對神經(jīng)元的數(shù)量無明顯影響。GBP注射通過減少斑塊的數(shù)量、大小和共定位(圖7E)來影響VGlut2以及PSD95斑塊，這與其對體外突觸斑的影響相似(圖7A)。 注射GBP組的另一半具有與注射鹽水的對照相似的突觸密度。有趣的是GBP的體內(nèi)作用是 “全或無”而不是突觸數(shù)量的逐漸降低，并且僅50%的小鼠應(yīng)答GBP注射。這可能歸因于要有效阻斷突觸形成必需的GBP的關(guān)鍵性閾值濃度，所述濃度可能僅在一些小鼠中達到。然而在三個重復(fù)的實驗中，我們僅觀察到一半小鼠被GBP影響，即便我們將總劑量，且頻率從每天一次提高到一天三次也是如此(見下文和實驗步驟)，并且即使使用近親交配的小鼠株系也是如此。然而，這些發(fā)現(xiàn)顯示GBP是體外以及體內(nèi)新突觸形成的有力抑制物。實施例6-TSP-誘導(dǎo)的突觸形成的抑制干擾新生小鼠中損傷誘導(dǎo)的桶狀皮層可塑性理解腦如何重塑其神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)主要是神經(jīng)生物學目標，因為這些過程是學習、記憶和從損傷中恢復(fù)的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的突觸形成涉及發(fā)育期間重塑的神經(jīng)回路嗎？為了探究這一問題，使用充分確立的發(fā)育可塑性范例——“桶狀皮層可塑性”實驗。支配小鼠吻部主要腮須的神經(jīng)反射至腦作為地形圖式排列的“軀體皮層定位”圖譜，其中傳入軸突和靶細胞形成有序的模塊，所述模塊概括了腮須墊上觀察到的結(jié)構(gòu)組成(Erzurumlu 等，The Anatomical Record 沘8 121-134，2006)。首先，三叉神經(jīng)的神經(jīng)元支配mystacial 觸須(腮須)并將完全轉(zhuǎn)換的反射傳遞至腦的對側(cè)。然后這些反射在腦干(barrelettes) 處形成突觸，隨后其傳導(dǎo)物反射并在丘腦(barreloids)處形成突觸。最后，丘腦-皮層軸突反射至初級軀體感覺皮層，在那里形成具有突觸后層IV顆粒細胞的“桶”狀軀體皮層定位圖譜(圖9A)。為了測試TSP-誘導(dǎo)的突觸形成是否涉及經(jīng)歷依賴型可塑性的機制，我們利用桶狀皮層的能力展示應(yīng)答外周腮須操作時其回路的結(jié)構(gòu)改變。如果在出生后發(fā)育的關(guān)鍵時期(小鼠出生后最初3天)中使吻部一排腮須的傳入神經(jīng)受阻，則皮層中對應(yīng)于受損的一排腮須的桶收縮并融合在一起，同時鄰近桶中的細胞侵入來自受損腮須的反射空出的領(lǐng)地中(Van der Loos and ffoolsey, Science 179:395-546,1973)?？梢酝ㄟ^在出生后第 7天(P7)分析桶狀皮層使這些改變可見(圖9A)。從PO開始直到P7，每天用GBP或等體積鹽水注射兩組新生小鼠。在Pl天，手術(shù)去除來自每只小鼠一側(cè)吻部上C-排的五處腮須并燒灼。然后在P7天處死小鼠，并分析它們對應(yīng)于未受損的“對照”半球以及受損半球的桶狀結(jié)構(gòu)。注射鹽水和GBP的小鼠均在對照側(cè)形成典型的桶(圖9B上部兩張左圖)。然而在受損側(cè)，所有注射鹽水的小鼠展示了典型的桶狀皮層可塑性模式，其中對應(yīng)于燒灼腮須的C排桶融合，并且鄰近的B和D排桶擴大從而支配空出的區(qū)域。50%注射GBP的小鼠展示非典型的可塑性應(yīng)答(圖9B，右圖)。在這些小鼠中，除C排以外，A和B排也失去形狀并且融合，即使吻部分析顯示這些小鼠中這些排腮須的毛囊仍然存在并且未受破壞(圖9B和9C，表型集請參閱圖10)。因為GBP有力地阻斷TSP和星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的突觸發(fā)生，所以這些發(fā)現(xiàn)表明，星形膠質(zhì)細胞分泌的TSP誘導(dǎo)損傷后桶恢復(fù)所需的突觸形成。阻斷TSP-誘導(dǎo)的突觸形成可導(dǎo)致“停止并連接”信號的缺失，因此軸突會繼續(xù)尋找適當?shù)陌袠耍@導(dǎo)致桶不能夠再形成。 為了更直接地測試TSP的作用，檢查了 TSP1/2雙重敲除(KO)小鼠中的桶狀皮層可塑性。三分之一分析的TSP1/2K0小鼠顯示非常類似的、異常的桶狀皮層可塑性表型(圖9B，底部右
45圖)，所述模式在任何野生型小鼠中從未觀察過。這些發(fā)現(xiàn)提供了下述證據(jù)GBP在桶狀皮層可塑性中的主要作用可能通過其對星形膠質(zhì)細胞衍生的TSP-誘導(dǎo)的突觸形成的抑制進行，并且TSP-誘導(dǎo)的突觸形成參與小鼠中的桶狀皮層可塑性。有趣的是，在未受損的對照側(cè)中桶的正常確立中，注射GBP的小鼠或TSP1/2K0小鼠均沒有問題，表明TSP特異性地在該系統(tǒng)損傷后的突觸重塑-可塑性中起作用。實施例7-鈣通道亞基a2 δ 1與TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域相互作用先前發(fā)現(xiàn)TSP的許多結(jié)構(gòu)域與特定的細胞表面受體(尤其是整聯(lián)蛋白)相互作用，然而直到最近也沒有已知的TSP的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的受體。最近，發(fā)現(xiàn)TSP4的EGF-樣結(jié)構(gòu)域與整聯(lián)蛋白α M的VWF-A結(jié)構(gòu)域結(jié)合(Pluskota等，Blood，106 :3970-3978，2005)。因為若干其他的整聯(lián)蛋白α和β亞基含有VWF-A樣結(jié)構(gòu)域(Whittaker和Hynes，MoI. Bio. of the Celll3 :3369-3387, 2002)，所以我們研究了整聯(lián)蛋白α M或其他含有VWF-A結(jié)構(gòu)域的整聯(lián)蛋白是否由RGC表達并且涉及TSP誘導(dǎo)的突觸形成。含有VWF-A結(jié)構(gòu)域并且由RGC 表達的整聯(lián)蛋白對于TSP的突觸發(fā)生活性均不是關(guān)鍵性的(數(shù)據(jù)未顯示)。含有VWF-A結(jié)構(gòu)域的另一類神經(jīng)元原生質(zhì)膜分子是鈣通道亞基Ci2 δ家族。迄今為止克隆了哺乳動物中的四種Q2S亞基(Klugbauer等，J. ofBioenergetics and Biomembranes 35 =639-647, 2003)。RGC的基因表達譜顯示L-型鈣通道亞基α 2 δ 1的高水平表達，這通過RT-PCR和Western印跡驗證(數(shù)據(jù)未顯示，圖11A)。因此我們接著研究了 α2δ1是否與TSP相互作用。我們使用特異性多克隆抗體從來自出生后5天的大鼠大腦皮層裂解物中免疫沉淀TSP 1、2和4，并使用Ci2 δ 1特異性單克隆抗體對免疫沉淀的蛋白質(zhì)進行Western印跡分析。在使用三種TSP抗體中每一種進行的免疫沉淀中檢測到α 2 δ 1 (圖 11Β)，提供了 α 2 δ 1和TSP之間體內(nèi)相互作用的證據(jù)。為了確定TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域和α 2 δ 1之間是否有直接和特異性的結(jié)合相互作用，我們共表達了單獨FLAG-標記的α2δ1(圖IlC第1道)與SD2 (第2道)或與無關(guān)的分泌型對照蛋白質(zhì)，所述對照蛋白質(zhì)被亞克隆進與SD2相同的載體中并具有相同的C-端 myc和6-組氨酸標簽(對照-myc-his，圖IlC第3道)。當我們通過使用與抗FLAG-標簽抗體綴合的微珠使α 2 δ I-FLAG免疫沉淀時，我們發(fā)現(xiàn)SD2與α 2 δ I-FLAG共免疫沉淀，但是對照-myc-his蛋白質(zhì)則不(圖11C，分別為第5和第6道)。這些數(shù)據(jù)顯示α 2 δ 1與TSP 的突觸發(fā)生的EGF-樣結(jié)構(gòu)域特異性相互作用。為了提供α2δ 1和SD2之間相互作用的進一步證據(jù)，我們在ΗΕΚ293細胞中共表達 α 2 δ 1和SD2，同時使用與抗-myc抗體綴合的微珠從洗滌劑增溶的HEK293細胞膜制劑中免疫沉淀SD2。α 2 δ 1與SD2共免疫沉淀進一步顯示α 2 δ 1與TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域直接相互作用(圖11D，第7道)。為了確定SD2_a2 δ 1相互作用是否需要其他鈣通道亞基，和鈣通道α 1亞基是否與SD2相互作用，我們在存在或不存在α 2 δ 1時共表達SD2與L-型鈣通道α IC和β亞基(第1、2和4道)。即便存在α2δ 1時α 1亞基也不與SD2相互作用 (圖11D，第5、6和8道)，并且也表達α 亞基時與SD2共免疫沉淀的α2δ1量下降(圖 3D，第8道，上圖)。因此，TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域與Ci2 δ 1特異性相互作用，但是不與L-型鈣通道的α 亞基相互作用。Ci2 δ 1-SD2相互作用強烈地依賴于用于膜制備和免疫沉淀的緩沖液中鎂離子的存在(實驗步驟)?？偠灾@些數(shù)據(jù)顯示α 2 δ 1和TSP通過TSP的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域相互作用，并且這一相互作用不依賴于其他L-型鈣通道亞基的存在。
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實施例8-TSP2突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體SD2的制備和測試制造被設(shè)計為編碼分泌型單體TSP2片段的哺乳動物表達構(gòu)建體，所述片段包含 TSP2的第三個備解素樣重復(fù)和三個EGF-樣重復(fù)(圖12A)。通過利用C-端6-組氨酸標簽 (His-tag)，將該重組蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)染的HEK293細胞培養(yǎng)基中純化至同質(zhì)(圖12B)。該帶有標簽并且純化的TSP2片段(命名為SD2，既突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域2)是強突觸發(fā)生的(圖12C、 D)。這些突觸模擬全長TSPl誘導(dǎo)的突觸，因為它們是突觸前活性但突觸后沉默的(數(shù)據(jù)未顯示)。在10-20nM范圍內(nèi)SD2活性最高(圖12D)。在更高的濃度下其活性降低，表明由于高配體濃度導(dǎo)致的受體抑制或脫敏。實施例2-8的實驗步驟RGC和星形膠質(zhì)細胞的純化和培養(yǎng)通過連續(xù)免疫淘洗將RGC從P5 Sprague-Dawley大鼠(Charles Rivers)中純化至大于99. 5%的純度，并如先前所述在層粘連蛋白涂敷的蓋玻片上含BDNF、CNTF和毛喉素的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Christopherson 等，Celll20 :421-433,2005 ；Meyer-Franke 等， Neuron 15 :805_819，1995 ;Ullian 等，Science 291:657-661,2001)。如 Christopherson 等，Cell 120 :421-433,2005中所述制備皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞插入物和ACM。將RGC培養(yǎng)3_4 天以允許有活力的向外生長過程，然后與星形膠質(zhì)細胞插入物、ACM或TSP —起再培養(yǎng)6天。重組蛋白質(zhì)和DNA構(gòu)建體純化的人血小板TSPl 得自 Haematologic ^Technologies。如 Chen 等，J. Biol. Chem. 275 :26538-26544,2000 ；Lawler 等，J. Biol. Chem. 270 :2809-2814,1995 中所述， 表達和純化重組的TSP4和TSP5。pcDNA3哺乳動物表達載體中的小鼠TSP3cDNA是來自 V. DixiWQabar 等，J. Biol. Chem. 269 1262-1269，1994)的饋贈。在 Cos 7 細胞中過表達 TSP3，并使用Cos7細胞條件培養(yǎng)基作為TSP3的來源。在相同的實驗中，用來自空pcDNA3 載體轉(zhuǎn)染的Cos7細胞的條件培養(yǎng)基處理對照條件。如先前(Mosher等，Methods in Cell Bio. 69 ；69-81,2002 ；Miao 等，Cancer Research61 :7830-7839,2001 ；Saumet 等，Blood 106 :658-667,2005)中所述表達和純化一組TSPl和2截短構(gòu)建體。α2 δ 1的過表達載體是來自D. Lipscombe (Brown University)的慷慨饋贈，δ 1 表達載體是來自K. Campbell (Univ. of Iowa)的慷慨饋贈并且描述于(Gurnett等，J. Biol. Chem. 272 :18508-18512,1997)中。表達鈣通道亞基α IC和β的載體描述于(Dolmetsch 等，Science 294 :333-339,2001)中。將TSP2的突觸發(fā)生結(jié)構(gòu)域(SD2)克隆進pAPtag5載體(GenHunter)中Sfil和 Xhol位點之間。SD2由HEK293細胞表達，所述細胞使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 按照制造商說明轉(zhuǎn)染。然后按照制造商說明，使用Ni-NTA樹脂Oiiagen)，通過Ni-螯合載體從條件培養(yǎng)基中純化分泌的重組蛋白質(zhì)。對RGC的突觸測定為了進行RGC培養(yǎng)物的突觸量化，將細胞用4%低聚甲醛(PFA)固定7分鐘，在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌三次，并在含50%正常山羊血清和0. 1% Triton X-100的100 μ 1 封閉緩沖液中封閉30分鐘。封閉后將蓋玻片在PBS中洗滌三次，向每個蓋玻片上添加 100 μ L—級抗體溶液，所述溶液由兔抗-突觸結(jié)合蛋白(1 750，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，Synaptic Systems)和小鼠抗-PSD-95 (1 750，6G6-1C9 克隆，Affinity Bio Reagents)組成。將蓋玻片在4°C孵育過夜，在PBS中洗滌三次，并用100 μ 1 1 1000稀釋于抗體緩沖液中的Alexa-594綴合的山羊抗兔和Alexa-488綴合的山羊抗小鼠(Invitrogen)孵育。孵育 2小時后，將蓋玻片在PBS中洗滌3-4次，并在含DAPI的Vectashield包埋介質(zhì)(Vector Laboratories Inc)中包埋于載玻片(VWR Scientific)上。常規(guī)進行僅有第二抗體的對照，并且揭示了無顯著的背景染色。使用Nikon Eclipse E800熒光顯微鏡(Nikon)對包埋的蓋玻片成像。使用DAPI 熒光，通過肉眼鑒定并隨機選擇健康細胞，其細胞直徑至少是它們最接近的鄰居的2倍。 使用單色CCD照相機和SPOT圖像捕獲軟件(Diagnostic Instruments, Inc)，在594nm和 488nm處針對每個選擇的細胞記錄熒光發(fā)射的8-比特數(shù)字圖像。通過使用NIH圖像加工軟件包 ImageJ (見 www. rsb. info. nih. gov. laneproxy. Stanford, edu/ij/)的定做撰寫的插件(Barry Wark,根據(jù) GPL 被許可，見 www. gnu. org/copyleft/gpl. html)，針對共定位的斑塊分析合并的圖像。該分析產(chǎn)生與通過肉眼計數(shù)并證實多次獲得的數(shù)量相似的計數(shù)。先前顯示共定位的斑塊對應(yīng)于突觸數(shù)量的真實提高，所述突觸數(shù)量通過電子顯微鏡計數(shù)并通過電生理學分析(Christopherson 等，Cell 120 :421-433,2005 ；Ullian 等，Science291 657-661，2001)。RGC 轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)試劑轉(zhuǎn)染 6DIV RGC。簡言之，取出來自細胞的300 μ 1條件培養(yǎng)基，并保存在37°C下10% C02培養(yǎng)箱中另一組織培養(yǎng)平板中。然后用 200 μ 1新鮮培養(yǎng)基飼喂細胞。將1 μ g DNA或2 μ 1 20 μ M SiRNA集合體與100 μ 1 OptiMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen)和 2μ ILipofectamine 2000 試劑(Invitogen)混合。將混合物在室溫下孵育20分鐘，并添加至細胞。3小時后用溫熱的PBS將細胞洗滌兩次，并飼喂200 μ 1 新鮮的RGC生長培養(yǎng)基和300 μ 1保存的條件培養(yǎng)基。對質(zhì)粒構(gòu)建體而言，在轉(zhuǎn)染后1天開始SD2或星形膠質(zhì)細胞插入物處理，對siRNA集合體而言在轉(zhuǎn)染后2天進行。通過用每種條件共轉(zhuǎn)染的GFP標記轉(zhuǎn)染的細胞。典型的轉(zhuǎn)染效率范圍在10%和15%之間。如前文所述在SD2或星形膠質(zhì)細胞處理后6天針對突觸染色細胞。在這一情況下通過使用與Alexa 680綴合的第二山羊抗小鼠抗體，檢測PSD95。轉(zhuǎn)染細胞的圖像在三個通道中獲取(GFP為 488nm，突觸結(jié)合蛋白為594nm，PSD95為680歷)。使用上文所述方法對GFP陽性細胞上的突觸數(shù)量進行量化。免疫沉淀和Wfestern印跡使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)按照供應(yīng)商的說明，通過2到3天的瞬時轉(zhuǎn)染在HEK293細胞中表達SD2、α 2 δ 1 (無標簽或有FLAG-標簽)和L-型鈣通道α IC和
β亞基。如下制備ΗΕΚ293細胞質(zhì)膜用于共免疫沉淀。將細胞用PBS洗滌3次并從組織培養(yǎng)平板上刮下。將細胞沉淀并重懸于含蛋白酶抑制物(完全無EDTA，Roche)的冰冷的低滲緩沖液(IOmM Tris pH 7. 4，ImM CaCl2和ImM MgCl2)中，并在冰上孵育15分鐘使細胞膨脹。 然后通過在玻璃-對-玻璃勻漿器(glass-on-glass douncer)上勻漿(5次)使細胞破裂。 通過在300g離心5分鐘去除核和未破壞的細胞。將除核上清(post-nuclearsupernatant) 在20，OOOg下離心20分鐘，使膜沉淀。將膜重懸于含蛋白酶抑制物(完全無EDTA，Roche)和0. 5 % Surfact-AmpsNP-40 (Pierce)的溶解緩沖液(25mM Tris pH 7. 2、150mMNaCl、250mM蔗糖、ImM CaClJP ImM MgCl2)中，并在4°C孵育10分鐘以允許溶解。通過離心00，OOOg 10分鐘)去除不溶碎片。 用抗-myc抗體綴合的瓊脂糖珠(用于免疫沉淀SD2 (Upstate))或用抗-FLAG抗體M2綴合的微珠(用于免疫沉淀帶FLAG-標簽的α 2 δ 1 (Sigma-Aldrich))將上清孵育4小時或在 4°C下過夜同時旋轉(zhuǎn)。結(jié)合完成后，用溶解緩沖液將微珠洗滌4-5次。通過添加非還原性 SDS-PAGE緩沖液Pierce)并在37°C下孵育5分鐘洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后將洗脫液轉(zhuǎn)移至清潔的管中，并添加巰基乙醇。將樣品于37 °C變性30分鐘，并上樣在SDS-PAGE 凝膠(4-15%，BioRad)上。SDS-PAGE電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并針對靶蛋白質(zhì)進行印跡。如下進行TSP免疫沉淀。切下五只P5大鼠皮層，并如上文所述制備和溶解膜。將可溶級分用A/G蛋白微珠孵育，所述A/G蛋白微珠預(yù)先與TSP1、2或4多克隆抗體過夜結(jié)合(TSP 抗體描述于(Lawler 等，J. Biol. Chem. 270 :2809-2814,1995 ；Tooney 等，Matrix Biol. 17 :131-143,1998)中)。將微珠洗滌4_5次，如上文所述洗脫蛋白質(zhì)并用于SDS-PAGE 分析。通過使用單克隆抗體(Sigma，l 1000)在Wfestern印跡中檢測鈣通道亞基 α 2 δ 1。SD2和帶有myc標簽的對照蛋白質(zhì)均含有C端6_His標簽，并且通過使用單克隆抗-五-組氨酸抗體toiagen，l 1000)在Wfestern印跡中識別了它們。用兔多克隆抗體(ChemiCOn，l 1000)檢測鈣通道亞基α 1C。使用辣根過氧化物酶綴合的抗-小鼠或抗-兔(1 5000)作為第二抗體(JacksonLabs)，并用來自Amersham的ECL試劑盒進行檢測。 對小鼠腦切片的突觸測定將腦浸入4%低聚甲醛(PFA)中，在4°C固定過夜，并在30%蔗糖中冷凍保護。 對突觸染色而言，將組織包埋在PBS中20%蔗糖OCT的2 1混合物中，并冷凍切片 (12 μ m)。將切片在37°C下干燥，在PBS中洗滌三次，并用PBS中20%正常山羊血清(NGS， Invitrogen)封閉1小時。如下將一級抗體在含0. 3% triton和10% NGS的PBS中稀釋 將 PSD95(Zymed，兔，1 500)和 VGlutl 和 VGlut2 (Chemicon，荷蘭豬，1 2500)在 4°C孵育過夜。以相同緩沖液中1 200添加第二 Alexa綴合的抗體(山羊抗荷蘭豬Alexa488 和山羊抗兔Alexa 594，Invitrogen)，暗中室溫下放置2小時。將載玻片包埋在含DAPI的 Vectashield中并使用kiss LSM 510共聚焦激光掃描顯微鏡成像。用突觸前標記和突觸后標記染色每只動物的三個獨立的徑向腦切片，并在皮層上進行5 μ m共聚焦掃描(光學切片寬度0. 38 μ m，各14個光學切片)。為了確保要掃描的皮層區(qū)域的一致性，在每個切片中挑選外皮層區(qū)域，包括齒狀回背側(cè)皮層的突觸層。掃描參數(shù)總是針對野生型(或注射鹽水的)腦切片設(shè)定，并對轉(zhuǎn)基因(或注射GBP的)動物使用相同的成像參數(shù)。使用ImageJ-斑塊分析儀選項分析以Ιμπι間隔合并的單個光學切片圖像， 以計算共定位的突觸前斑和突觸后斑的數(shù)量(每個腦切片5個光學切片，每個腦總計15個圖像)。針對每種條件計算每個成像區(qū)域的平均突觸密度。小鼠使用FVB 背景上的 TSP 1/2 雙敲除小鼠(n = 12) (Agah 等，Matrix Biol. 22 539-47,2004)。具有 FVB 背景的野生型小鼠購自 Charles RiverLaboratories。來自 P21、α 2 δ 1過表達的轉(zhuǎn)基因動物及其同窩野生型對照的腦(n = 8)由Li和同事提供，并描述于 (Li 等，Pain 125 :20-34,2006)中。鹽水和加巴噴丁注射在三個獨立的實驗中，對兩窩野生型小鼠(n = 3x12, FVB背景)每日腹膜內(nèi)注射單劑400mg/kg的GBP(Sigma-Aldrich)或匹配體積的鹽水溶液(PBQ。在一個實驗中，每天用200mg/kg GBP將小鼠注射三次(n = 6)，并且對照接受相同體積的鹽水溶液(n = 6)。 在注射前即刻對幼獸稱重以確定施用的劑量，并且監(jiān)測它們的體重增加和一般健康，這些在注射GBP和鹽水的小鼠之間顯示無差異。分析桶狀皮層可塑性期間對樣品進行盲實驗。腮須損傷所有腮須損傷從Pl小鼠的右側(cè)腮須墊上切除中心一排(C排)腮須毛囊。將新生小鼠左側(cè)固定在解剖鏡下，并用手術(shù)刀在要去除的一排腮須兩側(cè)切開兩個平行的切口。用鑷子將切口之間的皮膚拉回。用鑷子在切口處個別地去除毛囊。然后使用有彈性的腐蝕性涂藥器(Tech-Med)用硝酸銀燒灼損傷位點。然后允許小鼠在它們的籠中恢復(fù)。桶狀皮層免疫化學在Ρ7天處死小鼠，將腦切開并在4%低聚甲醛中浸泡固定12到M小時。將腦在 PBS中30%蔗糖中冷凍保護，直至它們沉入溶液底部04- 小時)。然后將腦沿中線切成兩半，在Leica SM2000R冷凍切片機上對每個半球桶狀皮層沿徑向切下40_μ m_厚的切片，并置于PBS中。在自由漂浮的切片上進行桶狀皮層染色。首先在室溫下將切片在PBS 中10% NGS和0. 25% Triton-X-IOO的封閉溶液中放置45分鐘。然后在室溫下用封閉溶液中1 400的抗-5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運蛋白兔多克隆抗體(Calbiochem)將切片孵育1 個小時，然后在4°C下過夜。在PBS中洗滌3次后，在室溫下用封閉溶液中1 1000的山羊抗-兔Alexa 594第二抗體(Invitrogen)將組織切片孵育90分鐘，以允許第一抗體的熒光檢測。在PBS中洗滌3次后，在載玻片(VWR)上將切片按照其被切割的順序固定，并用 Vectashield 包埋介質(zhì)(Vector Laboratories)包埋。使用 Nikon Eclipse E800 熒光顯微鏡使切片顯影，并使用 SPOT 照相機(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)數(shù)碼獲得圖像。桶狀皮層恢復(fù)為了重組桶狀皮層的完整圖譜，在Wiotoshop (Adobe Systems)中恢復(fù)來自系列切片的5-HTT染色的圖像。選擇一個切片作為基礎(chǔ)圖像，向上層疊來自相鄰切片的數(shù)據(jù)，通常所述一個切片的大部分桶狀皮層已經(jīng)在平面中。首先小心地對齊每個添加的切片從而與先前的切片匹配，然后用層掩蔽物(layer mask)僅顯示添加的切片中更明亮地標記的桶狀區(qū)域部分。重復(fù)該過程直至整個主要的桶狀皮層可見。然后小心地匹配層之間的對比度和亮度水平，獲得對跨越整個恢復(fù)的桶狀區(qū)域的信號水平的更準確的描繪。腮須墊染色將整個吻部區(qū)域在4%低聚甲醛中浸泡固定，然后在PBS中30%的蔗糖中冷凍保護過夜。沿中線將吻部切成兩半，并修剪成僅含有腮須墊。然后將腮須墊弄平并埋入2 1 30%蔗糖0. C. T中。使用Leica CM3050低溫保持器切下50 μ m的切片并收集在陽性有涂層的玻片(Sigma)上。將切片在37°C干燥30到90分鐘，然后用PBS洗滌一次并用Mayer' s Hematoxylin(Lillie' s Modification) (Dako)染色30秒。將玻片在去離子蒸溜水中沖洗，并蓋上帶有Faramount水性包埋介質(zhì)(Dako)的蓋玻片。用Nikon EclipSeE800顯微鏡進行亮視野顯微術(shù)，使用SPOT照相機(Diagnostic Instruments)數(shù)碼獲得圖像。實施例9-鞘內(nèi)推注活性抗-TSP4抗體或TSP4反義寡脫氧核苷酸逆轉(zhuǎn)脊神經(jīng)受損大鼠中的異常性疼痛為了測試TSP4蛋白質(zhì)是否能夠誘導(dǎo)行為超敏感性和加巴噴丁是否能夠阻斷該誘導(dǎo)，進行了以下實驗。在第O天注射溶于鹽水中的活性或熱失活的TSP4蛋白質(zhì)，并如實驗步驟中所述每天進行行為超敏感性測試。在TSPM45ug/大鼠)推注后三天注射加巴噴丁或鹽水，之后1小時和然后每天進行行為測試。如圖13A中所示，向首次實驗的大鼠L5/6 脊髓區(qū)段中鞘內(nèi)推注活性TSP4以劑量依賴型方式引起它們對von Frey細絲(機械)刺激的爪退縮閾值的逐漸降低，而失活的TSP4蛋白質(zhì)則不(圖13A)。行為超敏感性具有注射后兩天的開始時間，在注射后2-4天達到峰值，并在TSP4后持續(xù)超過一周。TSP4誘導(dǎo)的行為超敏感性是可逆的，并且逆轉(zhuǎn)時間為峰效應(yīng)時間后約5天。加巴噴丁(lmg/大鼠，推注鞘內(nèi)注射)的鞘內(nèi)注射阻斷了 TSP4誘導(dǎo)的行為超敏感性，鹽水則不。加巴噴丁作用持續(xù)超過一天。因為加巴噴丁與鈣通道α2δ1亞基結(jié)合，所以這些數(shù)據(jù)支持TSP4-誘導(dǎo)的異常性疼痛可能通過與鈣通道α2 δ 1亞基的相互作用介導(dǎo)。加巴噴丁作用的緩慢逆轉(zhuǎn)提示慢性而不是急性的藥物作用機制。為了確定TSP4是否在介導(dǎo)在脊髓水平上進展的神經(jīng)性疼痛中起作用，檢查了鞘內(nèi)TSP4抗血清在逆轉(zhuǎn)脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中確立的異常性疼痛中的作用。在損傷后2周向左側(cè)L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中施用鞘內(nèi)推注的活性TSP4抗體(雞多克隆，來自Dr. Frank Zaucke, University ofCologne，Cologne，德國)，所述時間受損傷的大鼠已完全發(fā)育出異常性疼痛。推注TSP4抗體以劑量依賴型方式逆轉(zhuǎn)了損傷側(cè)確立的異常性疼痛(圖13B-C)。 注射熱失活(煮沸)的抗-TSP4抗體未顯示異常性疼痛逆轉(zhuǎn)的任何作用(圖13B-C)?；钚钥寡?80ug/大鼠，推注鞘內(nèi)注射)在異常性疼痛逆轉(zhuǎn)中的作用具有4小時的開始時間， 和超過10小時的持續(xù)時間(圖13B)。類似的活性TSP4抗體處理未改變未受損側(cè)(對側(cè)) 中對相同刺激的基線行為閾值。這些數(shù)據(jù)表明增加的TSP4蛋白質(zhì)可在外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的脊柱水平異常性疼痛中起關(guān)鍵作用，并且在脊柱水平上阻斷其功能，這在疼痛管理中可具有治療性價值。為了確定相似的抗-TSP4處理是否能夠防止損傷誘導(dǎo)的異常性疼痛的發(fā)生，預(yù)先用TSP抗血清(雞多克隆，SOug/大鼠)每日鞘內(nèi)注射處理脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠。處理在神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)之前開始。如圖13D中所示，預(yù)先鞘內(nèi)TSP4抗血清處理未改變未損傷(右)側(cè)中的基線閾值，但是與用鞘內(nèi)注射鹽水處理的受損大鼠相比，阻止了脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠損傷(左)側(cè)中異常性疼痛的發(fā)生。TSP4抗體的作用在最后一次注射后持續(xù)超過2天。這些數(shù)據(jù)表明損傷誘導(dǎo)的TSP4蛋白質(zhì)可在脊柱水平上異常性疼痛的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，并且 TSP4功能的阻斷可在神經(jīng)性疼痛預(yù)防中具有治療性益處。為了確定TSP4反義寡脫氧核苷酸是否能夠阻斷損傷誘導(dǎo)的觸覺異常性疼痛，在損傷后5周將與TSP4mRNA的兩個不同區(qū)域互補的兩種TSP4反義寡脫氧核苷酸(#1和#2) 鞘內(nèi)注射進脊神經(jīng)結(jié)扎的大鼠中，此時受損的大鼠已在損傷側(cè)建立了異常性疼痛。如圖13E 中所示，在4天中每天鞘內(nèi)注射TSP4反義#1 (50ug/天)對異常性疼痛逆轉(zhuǎn)具有一些作用， 但是使用反義(不是錯配的#2)的相似處理引起損傷側(cè)(同側(cè))中建立的異常性疼痛完全逆轉(zhuǎn)至與非損傷側(cè)(對側(cè))中觀察到的相似的水平。反義作用具有3天的發(fā)生時間，在處理4天后的這一天達到峰值，并且在最后一次注射后持續(xù)3天。反義或錯配寡脫氧核苷酸均不改變未損傷側(cè)的行為閾值。這些數(shù)據(jù)表明，用反義寡脫氧核苷酸阻斷損傷誘導(dǎo)的TSP4 表達可代表阻斷脊柱TSP4在疼痛過程中作用的另一途徑。實施例9的實驗步驟手術(shù)和行為測試使雄性 Harlan Sprague Dawley 大鼠(100_150g，Harlan Industrieslndianapolis, IN)圈養(yǎng)在獨立的籠中，暴露于12/12h晝/夜循環(huán)中，并允許其自由獲取食物和水。用DRG和脊神經(jīng)開端之間左側(cè)L5/6脊神經(jīng)的緊密結(jié)扎在異氟烷 (isofluorane)麻醉的動物中誘導(dǎo)外周神經(jīng)損傷(Kim andChung, Pain 50 50:355-363， 1992)。為了實現(xiàn)觸覺疼痛異常，使用 Dixon (Dixon, Ann. Rev. Pharma. & iToxico. 20 441-462,1980)的上-下(up-down)方法，如先前(Chaplan 等，J. Neuros. Methods 53: 55-63，1994)所述用 vonFrey 細絲(Moelting，Wood Dale, IL, USA)測定爪退縮閾值(PffT)。 簡言之，允許動物在帶有線網(wǎng)底部的透明塑料隔間中適應(yīng)30分鐘。首先以引起細絲彎曲的壓力對左側(cè)爪足底表面應(yīng)用2g有標度的細絲。如果在5秒后未檢測到爪抬起，則使用具有遞增重量的下一個細絲。如果觀察到爪抬起，則使用下一個更弱的細絲。從第一次應(yīng)答改變或者達到五次應(yīng)答(指定0. 25g的分值)之前的一次開始，使用該范例進行總計六次測量。如先前所述(Luo等，J. Neurosci. 21 1868-75，2001)計算50%應(yīng)答閾值。鞘內(nèi)反義寡脫氧核苷酸設(shè)計針對靶基因翻譯起始區(qū)的反義寡脫氧核苷酸#1，其顯示有效降低其他靶基因的表達(Wahlestedt 等，Nature 363 :260-263,1993 Ji 等，PNAS91 12540-12543，1994 ； Hua 等，J. Neurochem. 70 :688-698,1998 ；Li 等，J. Neurosci. 24 :8494-8499, 2004)。也設(shè)計基于大鼠TSP4mRNA序列的寡脫氧核苷酸#2，并用于在實時PCR實驗(TaqMan Gene Expression Assay ID RnO 14934317，Applied Biosystems)中生產(chǎn)引物,其對 TSP4 mRNA 是特異性的。使用以隨機順序含有相同數(shù)量核苷酸的錯配寡脫氧核苷酸(不與TSP4 mRNA 的任何具體區(qū)域互補)作為對照。因為單堿基錯配會將親和力降低約500倍(Freier， 1992)，所以錯配寡脫氧核苷酸應(yīng)當對TSP4 mRNA具有非常低的親和力。下文展示了大鼠 TSP4基因這些區(qū)域和反義與錯配寡脫氧核苷酸的核酸序列對應(yīng)于翻譯起始區(qū)的大鼠TSP4 cDNA序列(起始密碼子加有下劃線)5' CRtatRAccATGAttAcRCC 3' (SEQ ID NO :1 ;Genbank 登錄號 # :X89963)寡脫氧核苷酸反義#1:5' GGCGTAATCATGGTCATACG 3‘ (SEQ ID NO 2)錯配#1:5' CGGAGTCATGATCGTAATCG 3 ‘ (SEQ ID NO 3)對應(yīng)于實時PCR引物區(qū)域的大鼠TSP4 cDNA序列5' GGAAGATAGCAACAATGATGG 3‘ (SEQ ID NO :4 ;Genbank 登錄號 # :X89963)寡核苷酸反義#2:5' CCATCATTGTTGCTATCTTCC 3‘ (SEQ ID NO 5)錯配#2:5' ACCATCGTTGTTACTTTCTCC 3 ‘ (SEQ ID NO 6)大鼠基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST搜索結(jié)果表明，這些反義和錯配序列不與其他大鼠基因的任何序列互補。顯示帶有硫代磷酸酯修飾的寡脫氧核苷酸具有提高的穿過脂質(zhì)雙分子層的潛能，并且減少核切割(Crooke，等，Ann. Rev. Wiarmacology. & Toxicology，1996)。使用寡脫氧核苷酸兩端僅三個核苷酸上有限的硫代磷酸酯修飾，并且這一修飾方法不引起體內(nèi)炎性副作用(Li等，J. Neurosci. 24 =8494-8499,2004)。研究中使用的所有反義寡脫氧核苷酸均商業(yè)合成(Genelink，he.，NY)，用乙醇沉淀滅菌，并在使用前溶于無菌鹽水中。藥物制備和鞘內(nèi)注射使用前將加巴噴丁、純化的TSP蛋白質(zhì)和抗體溶于并稀釋于無菌鹽水中，并使用與30G針頭連接的微量注射器以IOmL的總體積直接注射進異氟烷麻醉的大鼠的L5/6脊柱區(qū)中。統(tǒng)計學進行不成對的學生t檢驗，并且雙尾ρ值< 0. 05指示其顯著性。本說明書中引用的所有出版物和專利申請通過參考并入本文，就好像每個出版物或?qū)＠暾埍幻鞔_和個別地指出通過參考并入一樣。任何出版物的引用是針對提交日期之前的公開內(nèi)容，并且不應(yīng)被解釋為承認本發(fā)明沒有資格作為在先的發(fā)明而比這類出版物日
期更早。應(yīng)當理解本發(fā)明不限于所述具體的方法、流程、細胞系、動物物種或?qū)?、和試劑，因為它們可以變化。還應(yīng)當理解本文使用的命名法僅為了描述具體實施方案的目的，并且不意圖限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由附帶的權(quán)利要求限制。除非另有清楚的說明，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。
權(quán)利要求
1.在個體中促進突觸發(fā)生的方法，其包括對需要突觸發(fā)生的個體施用有效劑量的包含至少一個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述多肽不是血小板反應(yīng)蛋白，并且其中個體中的突觸形成增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域是來自于長度約35到約65個氨基酸的血小板反應(yīng)蛋白同種型的多肽，其至少包含6個半胱氨酸氨基酸，其中主要的結(jié)構(gòu)是雙鏈β -片層，之后為從環(huán)到C-端短雙鏈片層。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域與人TSPl的氨基酸 551-586,588-636 或 650-689，人 TSP2 的氨基酸 553_588、590_6；35 或 652-691，人 TSP3 的氨基酸 316-368,370-412 或 418-455，人 TSP4 的氨基酸 290-324,326-377,379-418 或 424-461，或人軟骨寡聚體基質(zhì)的氨基酸87-U6、127-179、180-222或225-267具有至少 95%的序列同一性。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽包含至少兩個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述多肽包含至少三個血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述多肽缺乏除EGF-樣結(jié)構(gòu)域之外的血小板反應(yīng)蛋白序列。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述個體由于衰老而遭受突觸減少。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述個體由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、多發(fā)性硬化或青光眼而遭受突觸減少。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述個體罹患黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述個體由于選自抑郁、精神分裂癥、孤獨癥和攻擊的精神障礙而遭受突觸減少。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述突觸形成位于神經(jīng)肌肉接合處。
12.在個體中治療或預(yù)防疼痛的方法，其包括對個體施用有效量的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑，所述拮抗劑抑制血小板反應(yīng)蛋白的突觸發(fā)生活性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述試劑結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白，并阻斷血小板反應(yīng)蛋白與一種或多種選自α2δ1、α2δ2、α2δ3和α2δ4的鈣通道亞基之間的相互作用。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的抗體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的第三EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述血小板反應(yīng)蛋白是TSP1、TSP2、TSP3、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白的來自支架的結(jié)合蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是特異性抑制血小板反應(yīng)蛋白表達的siRNA、反義RNA或微小RNA。
20.權(quán)利要求19的方法，其中TSP1、TSP2、TSP4或軟骨寡聚體基質(zhì)的表達被抑制。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ1的細胞外部分的多肽。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽包含人α2 δ 1的約253到約430位氨基酸(VWFA 結(jié)構(gòu)域)。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ2的細胞外部分的多肽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述多肽包含人α2 δ 2的約291到約469位氨基酸(VWFA 結(jié)構(gòu)域)。
25.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ3的細胞外部分的多肽。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述多肽包含人α2 δ 3的約256到約438位氨基酸(VWFA 結(jié)構(gòu)域)。
27.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是包含鈣通道亞基α2δ4的細胞外部分的多肽。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述多肽包含人α2 δ 4的約291到約473位氨基酸(VWFA 結(jié)構(gòu)域)。
29.權(quán)利要求21、23、25和27中任一項的方法，其中所述多肽是免疫黏附素。
30.權(quán)利要求12的方法，其中所述疼痛是軀體疼痛、神經(jīng)性疼痛、內(nèi)臟疼痛、癌癥疼痛、 突發(fā)性癌癥疼痛、炎性疼痛、手術(shù)后疼痛、骨疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、偏頭痛或幻覺疼痛。
31.權(quán)利要求12的方法，其中所述疼痛是異常性疼痛或痛覺過敏。
32.在個體中治療或預(yù)防疼痛的方法，其包括對個體施用有效量的下述抗體，所述抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域，并且阻斷血小板反應(yīng)蛋白和所述鈣通道亞基之間的相互作用。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述疼痛是軀體疼痛、神經(jīng)性疼痛、內(nèi)臟疼痛、癌癥疼痛、 突發(fā)性癌癥疼痛、炎性疼痛、手術(shù)后疼痛、骨疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、偏頭痛或幻覺疼痛。
34.在個體中治療癲癇的方法，其包括對個體施用有效量的下述抗體，所述抗體特異性結(jié)合選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3和α 2 δ 4的鈣通道亞基的VWFA結(jié)構(gòu)域，并且阻斷血小板反應(yīng)蛋白和所述鈣通道亞基之間的相互作用。
35.在個體中促進軸突生長的方法，其包括對需要的個體施用有效量的血小板反應(yīng)蛋白拮抗劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述個體罹患脊髓損傷。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述個體由于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS或多發(fā)性硬化而遭受軸突或樹突退化。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述個體罹患黃斑變性、聽力喪失、糖尿病性神經(jīng)病或化學療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述個體由于選自抑郁、精神分裂癥、孤獨癥和攻擊的精神障礙而遭受軸突或樹突退化。
40.在個體中治療特征為鈣流入過量的障礙的方法，其包括對個體施用有效量的下述試劑，所述試劑特異性結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白，并阻斷血小板反應(yīng)蛋白和選自α 2 δ 1、α 2 δ 2、α 2 δ 3禾Π α 2 δ 4的鈣亞基之間的相互作用。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述障礙選自肌肉痙攣、偏頭痛、中風和帕金森病。
42.針對增強突觸發(fā)生的活性篩選候選試劑的方法，所述方法包括a)測量候選試劑與α2δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α2δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成，其中與無候選試劑時突觸形成相比，存在候選試劑時增加的突觸形成表明所述候選試劑具有增加突觸發(fā)生的活性。
43.針對抑制突觸發(fā)生的活性篩選候選藥物的方法，所述方法包括a)測量候選試劑與α2 δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合；b)如果步驟a)中候選試劑結(jié)合α2δ多肽或血小板反應(yīng)蛋白EGF-樣結(jié)構(gòu)域，則定量存在候選試劑和血小板反應(yīng)蛋白激動劑時神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中突觸的形成，其中與無候選試劑時突觸形成相比，存在候選試劑時減少的突觸形成表明所述候選試劑具有抑制突觸發(fā)生的活性。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于調(diào)控突觸發(fā)生，以及軸突和/或樹突生長的方法和組合物。該方法包括使用調(diào)控血小板反應(yīng)蛋白和/或鈣通道的α2δ亞基的試劑。
文檔編號A61K38/00GK102316888SQ200880112779
公開日2012年1月11日 申請日期2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日
發(fā)明者B·A·巴勒斯, C·厄羅格魯 申請人:利蘭斯坦福青年大學托管委員會