專利名稱：用于藥物用途的新型neurturin綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾人neurturin以提高其血清半衰期和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。尤 其，本發(fā)明涉及新型neurturin綴合物，其包含共價(jià)連接至多元醇部分，優(yōu)選聚乙二醇的 neurturin或其生物活性片段。本發(fā)明還涉及具有提高的生物利用度的藥物組合物，其包含 作為活性劑的新型neurturin綴合物以用于糖尿病和神經(jīng)退行性疾病的治療、處理、預(yù)防 和/或診斷。
背景技術(shù)：
胰腺β細(xì)胞分泌胰島素以應(yīng)答升高的血糖水平。與其他激素相比，胰島素在 能量代謝的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。胰島素導(dǎo)致了糖原和甘油三酯的貯存及蛋白質(zhì)的合成。 胰島素刺激葡萄糖進(jìn)入到肌肉和脂肪細(xì)胞。在患有I型糖尿病或LADA(成年陰性自身 ^iiSiilli^^l (latentautoimmue diabetes in adults), Pozzilli & Di Mario, 2001, DiabetesCare. 8 1460-1467)的患者中， 由于自身免疫攻擊，β-細(xì)胞被破壞。由剩余的胰 島細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素量太少導(dǎo)致了血糖水平的升高(高血糖癥)。在II型糖尿病患者中肝 臟和肌肉細(xì)胞失去了應(yīng)答正常的血液胰島素水平的能力(胰島素抵抗)。高血糖水平(也 和高血脂水平)依次導(dǎo)致了 β-細(xì)胞功能的損傷和β-細(xì)胞死亡的增加。有趣的是，在II 型糖尿病患者中β-細(xì)胞再生過程(如新生和復(fù)制)似乎沒有彌補(bǔ)β-細(xì)胞量的損失，從 而導(dǎo)致總β-細(xì)胞量隨著時(shí)間減少。最終，在II型糖尿病患者中外源胰島素的應(yīng)用為必需 的以用于血糖水平的充分控制。在I型糖尿病患者中，當(dāng)β-細(xì)胞被自身免疫攻擊破壞時(shí)，已設(shè)計(jì)了調(diào)節(jié)免疫系 統(tǒng)的治療并能停止或顯著降低胰島的破壞(Raz et al. ,2001, Lancet 358 1749-1753 ； Chatenoud et al. ,2003,Nat RevImmunol. 3 123-132 ；Homann et al. ,Immunity. 2002,3 403-415)。然而，由于人β細(xì)胞再生相對緩慢，如果所述治療與可刺激β細(xì)胞再生的治療 相結(jié)合，可更成功進(jìn)行所述治療。因?yàn)楝F(xiàn)今的普通抗糖尿病藥物無法足夠好的控制血糖水平以完全預(yù)防高血糖水 平和低血糖水平的發(fā)生，糖尿病成為非常致殘的疾病。血糖水平的頻繁升高是有毒性的且 可導(dǎo)致長期并發(fā)癥，例如腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及外周血管疾病。β細(xì)胞的大量損失 也導(dǎo)致了由胰腺α細(xì)胞分泌的胰高血糖素的下調(diào)，其有助于危險(xiǎn)的低血糖發(fā)病期的風(fēng)險(xiǎn) 增加。還有大量的相關(guān)病情，如肥胖、高血壓、心臟病和高血脂，因此糖尿病患者處于很大的 危險(xiǎn)中。除了患者的生活質(zhì)量受到損害，糖尿病的治療和長期并發(fā)癥導(dǎo)致了呈不斷上升趨 勢的醫(yī)療保健系統(tǒng)的巨大財(cái)政負(fù)擔(dān)。因此，在本領(lǐng)域中對于I型糖尿病和LADA的治療，并 且對于晚期II型糖尿病的治療有鑒定誘導(dǎo)胰腺胰島素產(chǎn)生細(xì)胞再生的因子的強(qiáng)烈需 要。一旦胰腺功能受損，所述因子可恢復(fù)正常的胰腺內(nèi)分泌功能或甚至可預(yù)防I型糖尿病、 LADA或II型糖尿病的出現(xiàn)或進(jìn)展。Neurturin為在胚胎胰腺中表達(dá)的分泌蛋白。已顯示重組的Neurturin可刺激小鼠胚胎干細(xì)胞分化成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞。此外，胰腺neurturin水平升高的轉(zhuǎn)基因小鼠具有 實(shí)質(zhì)性增加的胰腺β -細(xì)胞量?；谶@些發(fā)現(xiàn)，已提出將neurturin用于糖尿病之類的胰 腺疾病的治療(見例如WO 03/99318和WO 2005/051415，其公開內(nèi)容以引用的形式并入本 文)。Neurturin為由膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、Neurturin, Artemin和 Pers印hin組成的⑶NF配體家族(GFL)的一員。成熟的neurturin為102個(gè)氨基酸單體組 成的大小為23. 6kDa的同型二聚體。每個(gè)單體含有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵以形成一個(gè)胱氨酸結(jié)。 另外一個(gè)二硫鍵連接所述單體。以前已提出將Neurturin用于神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病和 亨廷頓氏癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、脊髓損傷或聽覺障礙)的治療(W0 97/08196，WO 99/06064 ； Akerud et al. J Neurochem. 1999 ；73(1) 70-78 ；Koeberle & Ball Neuroscience. 2002 ； 110(3) 555-567 ；Bilak et al. Mol Cell Neurosci. 1999 ； 13(5) 326-336 ；Perez-Navarro etal. Neuroscience. 2000 ；98 (1) 89~96 ；Rosenblad et al,Eur J Neurosci. 1999; 11 (5) 1554-1566，其公開內(nèi)容以引用的形式并入本文)。然而，發(fā)現(xiàn)neurturin和相關(guān)的⑶NF因子通過對流增強(qiáng)遞送(CED)進(jìn)入大鼠腦 中，其分布容積被限制(Hamilton et al.，ExpNeurol. 2001 ；168(1) :155_161)。通常必需 通過注射施用蛋白。注射后大部分蛋白質(zhì)從體內(nèi)快速清除，從而迫使了頻繁的注射。在我們 自己的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中皮下和靜脈注射neurturin后其生物利用度低。只 有大約10%皮下注射的neurturin進(jìn)入循環(huán)。因此，在患者中難以達(dá)到對治療有用的血液 蛋白質(zhì)水平。因此，有強(qiáng)烈的必要來研制有增強(qiáng)的可利用性的neurturin變異體并研發(fā)與之相 關(guān)的方法來延長在體內(nèi)的蛋白療法的循環(huán)半衰期(生物利用度)從而不需要頻繁的注射作 為活性劑的neurturin以滿足患者的“用戶友好”蛋白療法的需要。因此，本發(fā)明的根本問題是提供提高其生物利用度的新的neurturin變異體和制 劑。通過提供權(quán)利要求中所述的實(shí)施方式解決所述問題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及新型的neurturin綴合物，其包含共價(jià)連接到人neurturin蛋白產(chǎn)物 的多元醇部分。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種 neurturin蛋白產(chǎn)物和/或其生物活性片段作為活性成分，及藥物可接受的載體、稀釋劑和 /或佐劑。在一進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及對有需要的受試者施用藥物組合物的方 法，所述藥物組合物包含藥物活性量的綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種經(jīng)修飾的 neurturin蛋白產(chǎn)物或其生物活性片段作為活性成分，及藥物可接受的載體、稀釋劑和/或 佐劑。本發(fā)明還提供對有需要的受試者施用 藥物組合物的方法，所述組合物包含藥物活 性量的綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物或其生物活 性片段作為活性成分、及低分子量物質(zhì)、及藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
本發(fā)明的組合物適于預(yù)防或治療胰腺疾病或神經(jīng)退行性疾病，尤其胰腺自身免疫性疾病，例如I型糖尿病或LADA及II型糖尿病之類的自身免疫性糖尿病。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包含共價(jià)連接的多元醇部分(如聚乙二醇(PEG))的neurturin綴合 物，及包含所述neurturin綴合物，及其變異體、衍生物或生物活性片段的藥物組合物。除非提供了特殊的定義，本文所使用的相關(guān)術(shù)語及實(shí)驗(yàn)室方案、技術(shù)和方法已被 其所述領(lǐng)域所熟知。標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)符號和縮寫可與所述符號所代表的全名互換使用。標(biāo)準(zhǔn)的 技術(shù)可用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制劑、組合物、遞送和患者的治療。標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)可用于 DNA重組法、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)等。例如可使用試劑盒根據(jù)產(chǎn)品說明進(jìn)行如本領(lǐng)域通 常所實(shí)現(xiàn)或如本文所述的反應(yīng)或純化技術(shù)。通?？梢罁?jù)本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)方法和如各種 經(jīng)本說明書引用和討論的一般或更具體的參考文獻(xiàn)所述進(jìn)行上述技術(shù)和方案。所述術(shù)語“類似物”指結(jié)構(gòu)上與neurturin類似且具有相似功能的多肽。本文所用術(shù)語“生物活性的”或“生物活性”指所述neurturin產(chǎn)物誘導(dǎo)和/或刺 激祖細(xì)胞(例如干細(xì)胞)分化成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，及和/或促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞(例如體內(nèi) 或體外的β細(xì)胞)的保護(hù)、生存或再生。使用WO 93/06116和美國專利申請No. 08/535，681 所述的或本文實(shí)施例所述的公開的用于測定GDNF活性的標(biāo)準(zhǔn)體外測定可輕易確定本文所 公開的經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物的生物活性。本文所用的neurturin的“片段”指neurturin的一部分，其通過包括但不限于 neurturin的酶消化和化學(xué)裂解(例如CNBr)及所述多肽的物理剪切的任何方法生成。 Neurturin的片段也可通過例如重組DNA技術(shù)和氨基酸合成生成。當(dāng)所述片段或前體顯示出相同的neurturin生物活性時(shí)，本發(fā)明所用的 neurturin的“活性片段”或“生物活性片段”指單獨(dú)或與連接到其上的相關(guān)分子或殘基(例 如糖或磷酸鹽殘基，或所述多肽分子的聚集體)結(jié)合的所述neurturin多肽鏈的任何片段 或前體。所述術(shù)語“生物活性片段”也指neurturin產(chǎn)物的片段，其誘導(dǎo)和/或刺激祖細(xì)胞 (例如干細(xì)胞)分化成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，及和/或促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞(例如體內(nèi)或體外的 β細(xì)胞)的保護(hù)、生存或再生。使用WO 93/06116和美國專利申請No. 08/535，681所述的 或本文實(shí)施例所述的公開的用于測定GDNF活性的標(biāo)準(zhǔn)體外測定可輕易確定本文所公開的 經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物片段的生物活性。本文所用術(shù)語“同源物”指來自共同祖先蛋白序列的后代的涉及neurturin的多 肽。術(shù)語“同源”適用于通過遺傳復(fù)制事件而分離的蛋白質(zhì)間的關(guān)系。所述術(shù)語“低分子量物質(zhì)”指平均分子量在IOODa 12000Da之間，優(yōu)選在 200Da 8000Da之間，最優(yōu)選在約500Da 7000Da之間的物質(zhì)。所述低分子量物質(zhì)可為陰離子聚合物，其可為天然或合成的且其含有多種陰離子 基團(tuán)(如羧酸和/或硫酸基團(tuán))。例如，所述陰離子聚合物可選自低分子量硫酸化糖、硫酸化 環(huán)糊精或硫酸化合成聚合物(如丙烯酸聚合物、芳香族聚合物和/或多元醇)。更具體的說， 所述陰離子聚合物選自低分子量肝素或肝素衍生物、類肝素硫酸鹽、硫酸軟骨素、葡聚糖硫 酸鹽、經(jīng)化學(xué)修飾的肝素衍生寡糖(list from Wang et al. (2002)，supra)、類肝素寡糖、葡 聚糖硫酸鹽、硫酸化低分子糖胺聚糖、糊精-2-硫酸鹽、纖維素硫酸鹽和萘磺酸聚合物(例 如PR02000)、PAVAS (丙烯酸與乙烯醇硫酸的共聚物)、磺化聚合物PAMPS [聚(2-丙烯醛基-氨基-2-甲基-1-丙磺酸](Mw約為7000 12000)、硫酸軟骨素、硫酸化環(huán)糊精、昆布 ^WiMM (Alban, S. in Carbohydrates in DrugDesign (Ed. Ζ. J. ffitczak, K. A. Nieforth) Dekker,New York，1997，pp209)、聚甘油硫酸鹽(Turk, H.，Haag，R.，Alban，S. Bioconjugate Chem. 2004，15，162 ；)、戊聚糖聚硫酸鹽(PPS)及它們的衍生物(如乳糖修飾的戊聚糖硫酸 鹽、分餾PPS/低分子量PPS，墨角藻聚糖或衍生物或它們的組合)。低分子量肝素(LMWH)類似物(例如依諾肝素、達(dá)肝素或法安明)是適宜聚合物 的優(yōu)選例。其可通過肝素的分餾和/或限制性酶消化或化學(xué)消化獲得，且其具有優(yōu)選的約 3000 約7000道爾頓的平均分子量(Weitz 1997 supra)。本文所用術(shù)語“經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物”指包含共價(jià)連接的多元醇部分的 經(jīng)化學(xué)修飾的neurturin蛋白綴合物及由細(xì)胞表達(dá)的綴合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本文公開方法的或通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備經(jīng)化 學(xué)修飾的neurturin綴合物。本發(fā)明的neurturin綴合物的所述多元醇部分可為具有直鏈或支鏈的任何水溶 性單或雙功能聚(亞烷基氧化物)。通常，所述多元醇為聚(亞烷基乙二醇)，如聚(乙 二醇)(PEG)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到可適當(dāng)?shù)氖褂闷渌亩嘣?，如?丙二 醇)及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物?？赏ㄟ^綴合neurturin到水溶性聚合物來制備其他 neurturin綴合物。所述聚合物的非限制性名單包括 其他的聚環(huán)氧乙烷均聚物，如聚丙二 醇、聚氧乙烯化的多元醇、它們的共聚物和它們的嵌段共聚物?？墒褂糜行У姆强乖圆牧?(如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等)作為基 于聚環(huán)氧乙烷的聚合物的替代物。所述蛋白綴合物也可在本領(lǐng)域熟知的原核或真核細(xì)胞中表達(dá)。所述術(shù)語“neurturin綴合物”指包含共價(jià)連接到neurturin氨基酸的多元醇部分 (如聚乙二醇)的neurturin蛋白產(chǎn)物。所述氨基酸在N-末端氨基酸或其他的任何氨基酸 處可為位點(diǎn)特異性的。PEG綴合物可包含共價(jià)連接到所述neurturin蛋白產(chǎn)物的任何適合 位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)PEG分子。本文互換使用的術(shù)語“neurturin蛋白產(chǎn)物”、“neurturin產(chǎn)物”、“neurturin蛋 白”或“neurturin”指與可導(dǎo)致有公布的GenBank登錄號NP 004549 (SEQ ID N0:1，圖3) 的氨基酸序列的neurturin前體裂解的生物活性人neurturin產(chǎn)物或人neurturin前體本 身有超過70 %的、優(yōu)選超過80 %、更優(yōu)選超過90 %和最優(yōu)選超過95 %的同一性的蛋白或 肽、其變異體或衍生物。所述小鼠和人蛋白之間的同一性為約91%，且希望優(yōu)選的哺乳動(dòng) 物neurturin蛋白有相似的高同一性?？梢罁?jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(例如，通過使用BLAST算法)確 定neurturin產(chǎn)物與人neurturin蛋白或前體間的同一性百分比。當(dāng)在長度為100個(gè)氨基 酸中引入四個(gè)空位以協(xié)助所述比對，優(yōu)選在比較的序列中以相同氨基酸殘基排列的較小的 兩個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基百分比來計(jì)算同一性百分比。所用術(shù)語“直系同源物”指通過特化從共同的祖先基因進(jìn)化而來的不同物種中的 多肽。直系同源物在進(jìn)化的過程中保留相同的功能。所述術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”指PEG本身和其衍生物。通常以甲氧 基-PEG-OH(m-PEG)使用所述聚合物PEG，其中一個(gè)末端為相對惰性的甲氧基基團(tuán)，而另一 個(gè)末端為經(jīng)化學(xué)修飾的羥基基團(tuán)。支鏈的PEG也常用。分支臂(m)的數(shù)可在3 100或更多的范圍內(nèi)。羥基基團(tuán)還經(jīng)過化學(xué)修飾。如PCT專利申請W096/21469所述的另一個(gè)分支 形式具有經(jīng)化學(xué)修飾的單個(gè)末端。還有另一個(gè)分支形式具有沿著PEG骨架而非在PEG鏈末 端的反應(yīng)基團(tuán)(如羧基)。除了所述的PEG形式，也可用骨架中的薄弱連接或可降解連接 制備所述聚合物。例如，在通過引用整體并入本文的美國專利申請Ser. No. 06/026，716中 Harris已說明可用經(jīng)水解的聚合物骨架中的酯連接制備PEG。所述水解可導(dǎo)致聚合物裂解 成低分子量片段。所述環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物在化學(xué)上與PEG密切相關(guān)，且在它的 許多應(yīng)用中可使用其代替PEG。所述術(shù)語“PEG化”包含聚乙二醇分子共價(jià)附著到可為蛋白的基質(zhì)上。蛋白的PEG 化廣為本領(lǐng)域所知且已由例如Veronese，F(xiàn). Μ.，Biomaterials 22 (2001)405-417進(jìn)行了綜 述?？墒褂貌煌墓倌軋F(tuán)和不同分子量的聚乙二醇、線性和分支PEG及不同的連接基團(tuán)連 接 PEG (也見 Francis，G.E.，et al. , Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18 ；Delgado,C.，et al.， Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249—304)。
可在水溶液中用如例如，在WO 00/44785中所述的PEG化試劑，優(yōu)選使用分子量在 5 40kDa之間的NHS激活的線性或分支PEG分子進(jìn)行PEG化。也可依據(jù)Lu，Y. et al.， Reactive Polymers 22 (1994) 221-229 在固相中進(jìn)行 PEG 化。依 M Felix, Α. Μ. , et al. , ACS Symp. Ser 680 (Poly (ethyleneglycol)) (1997) 218-238可在N-末端氨基酸處進(jìn)行選擇性PEG化。在固相合成期間通過偶聯(lián)N-PEG 化氨基酸衍生物到所述肽鏈的N-末端氨基酸可完成選擇性N-末端PEG化。在固相合成期 間通過偶聯(lián)N-PEG化氨基酸衍生物到所述增長鏈可完成側(cè)鏈的PEG化?？稍谌缟纤龅墓?相合成中或通過將活化的PEG試劑使用于氨基脫保護(hù)肽的液相合成來組合處理N-末端PEG 化和側(cè)鏈PEG化。適合的PEG衍生物為具有優(yōu)選的平均分子量為約5 約40kDa，更優(yōu)選為約20 約40kDa，和最優(yōu)選為約30kDa的活化的PEG分子。所述PEG衍生物可為線性或分支的PEG?；罨腜EG衍生物為本領(lǐng)域已知及在例如Morpurgo, M.，et al.，J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368中所述的PEG-乙烯砜。直鏈和支鏈PEG類型適合于PEG化片段的制 備?；钚訮EG試劑的例子為碘-乙酰-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜。(m優(yōu)選從約 450到約900的整數(shù)，且R為線性或分支的、具有1 6個(gè)碳原子的低級烷基，例如甲基、乙 基、異丙基等，其中優(yōu)選甲基。本文所用術(shù)語“PEG”或“PEG部分”旨在包括但不限于線性和分支的PEG、甲氧基 PEG、水解或酶解的PEG、懸掛式PEG (pendant PEG)、樹枝狀PEG、PEG和一個(gè)或多個(gè)多元醇的 共聚物、及PEG和PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))的共聚物。所述術(shù)語“PEG化的neurturin”或“通過“PEG化”修飾的neurturin”或“包含聚 乙二醇部分的neurturin綴合物”指通過共價(jià)連接PEG部分形成所述PEG化蛋白的方法制 備的neurturin蛋白產(chǎn)物。所述術(shù)語“藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑”指一種或多種藥物和生理可接 受的化合物(例如賦形劑和輔助物)，其輔助將活性成分加工成可用于藥物的制劑?？稍?Remington's Pharmaceutical (Maack Publishing Co. ,Easton,Pa.)白勺MfilK巾胃
的情況。所述術(shù)語“未修飾的對照neurturin蛋白產(chǎn)物”指與相關(guān)的經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物來源相同的、作為對照使用的neurturin蛋白產(chǎn)物。本文所用術(shù)語“變異體”指相對于天然多肽，如下文進(jìn)一步所述的含有一個(gè)或多個(gè) 取代、添加、刪除和/或插入的多核苷酸變異體。所述術(shù)語“變異體”也包含異種來源的同 源多肽。通常而言，neurturin變異體保留完全的、或其絕大比例的、或至少一部分的生物 活性(例如，可使用如下所述的具體測定確定)。本文所用術(shù)語“變異體”也包含本領(lǐng)域熟 知的、提供功能等效分子的neurturin，其可通過取代、添加或刪除改變蛋白序列來修飾。后 者包括改變的序列，其中通過在序列內(nèi)的殘基取代功能等效的氨基酸殘基導(dǎo)致了生物學(xué)沉 默的交換。通過在編碼多肽的DNA中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓蛲ㄟ^所需多肽的體外化學(xué)合成制備neurturin變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可使用刪除、插入和取代獲得顯示 neurturin生物活性的蛋白產(chǎn)物變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知一個(gè)或多個(gè)選定氨基酸殘基的所述刪除、插入或突變的誘變 技術(shù)(例如，美國專利No. 4518584，其公開內(nèi)容以引用的形式并入本文)。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在成熟的人neurturin中的氨基酸47 69之間，優(yōu)選 51 65之間(如圖3所示的氨基酸141 164之間，優(yōu)選147 160之間)的區(qū)域引入氨 基酸的變化。所述氨基酸變化包含所述區(qū)域中至少一個(gè)精氨酸殘基的刪除或取代，例如精 氨酸殘基51、52、54、56、57、58、60、61和/或65。優(yōu)選精氨酸被中性或酸性氨基酸取代，例 如甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。特別優(yōu)選被谷氨酸取代，例如R51E、R52E、 R54E、R56E、R57E、R58E、R60E、R61E和R65E或包含至少2個(gè)所述取代的neurturin變異體。另外和/或還可用賴氨酸取代例如上文指定區(qū)域中的氨基酸殘基，尤其是精氨酸 殘基以便于偶聯(lián)多元醇部分。因?yàn)樵诔墒斓娜薾eurturin中沒有賴氨酸，所述改變允許用 多元醇部分進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾。特別優(yōu)選在上文指定區(qū)域中被賴氨酸取代，例如R51K、 R52K、R54K、R56K、R57K、R58K、R60K、R61K 和 R65K 或包含至少 2 個(gè)所述取代的 neurturin 變異體。Neurturin取代變異體具有移除人或小鼠neurturin氨基酸序列的至少一個(gè)氨基 酸殘基及在其位點(diǎn)中插入的不同殘基。所述取代變異體包括等位基因變異體，其特征在于 是，可導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸變化的種群中自然發(fā)生的核苷酸序列變化。出人意料的是，本發(fā)明研究者發(fā)現(xiàn)，與包含無綴合neurturin的藥物組合物相比， 所公開的藥物組合物具有其活性成分_所述綴合的neurturin和/或其生物活性片段的提 高的生物利用度。本發(fā)明證明，neurturin蛋白綴合多元醇(如PEG)顯著提高neurturin 產(chǎn)物的血清半衰期和生物利用度。如果采用皮下注射，neurturin產(chǎn)物的生物利用度的提 高可反過來降低注射位點(diǎn)處所述制劑的積累或加工，且以這種方式提高局部的耐受性。本發(fā)明提供了用與未修飾的對照neurturin相比低許多的劑量對患者使用本發(fā) 明的neurturin綴合物的方法以具有治療效果。這與“用戶友好蛋白療法”的需要相符，且 也可導(dǎo)致生產(chǎn)活性劑和/或藥物組合物的較低成本。與未修飾的neurturin相比，本發(fā)明的neurturin綴合物在水溶液中也有更高的 溶解性，這可導(dǎo)致活性劑配制的簡化。作為進(jìn)一步的優(yōu)勢，綴合多元醇(如PEG)到neurturin可降低對于neurturin的 免疫原性，及因此形成的中和抗體或抗活性劑的過敏反應(yīng)。
優(yōu)選，本發(fā)明的neurturin蛋白產(chǎn)物為人neurturin或其生物活性片段。優(yōu)選經(jīng) 重組技術(shù)制備neurturin蛋白產(chǎn)物，因?yàn)樗龇椒苓_(dá)到高純度蛋白的高產(chǎn)量且不限于在 細(xì)菌、植物、哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的產(chǎn)品。重組neurturin蛋白產(chǎn)物包括蛋白的糖基化形式和非糖基化形式。一般而言，重 組技術(shù)包括分離編碼neurturin蛋白產(chǎn)物的基因、在合適的載體和/或細(xì)胞類型中克隆所 述基因、根據(jù)需要修飾所述基因以編碼所需的變異體，并表達(dá)所述基因以制備neurturin 蛋白產(chǎn)物。另外，編碼所需neurturin產(chǎn)物的核苷酸序列可為化學(xué)合成的。希望可使用由 遺傳密碼變性或等位基因的變異或改變所致的在密碼子使用上不同的核苷酸序列表達(dá) neurturin產(chǎn)物，以便于用選定細(xì)胞制備所述蛋白產(chǎn)物。Kotzbauer et al. , Nature 384 :467_470 描述了小鼠 neurturin 蛋白的 cDNA 禾口 氨基酸序列及人neurturin蛋白的cDNA和氨基酸序列，在本文中以SEQ ID NO 1識別?？赏ㄟ^各種方法分離或制備依據(jù)本發(fā)明的neurturin產(chǎn)物。在專利申請TO 97/08196中描述了用于制備neurturin產(chǎn)物的例示方法，其以引用的形式并入本文。在 此也描述了用于neurturin蛋白表達(dá)的各種載體、宿主細(xì)胞和培養(yǎng)物生長條件及合成 neurturin蛋白產(chǎn)物變異體的方法。在專利No. EP 0 423 980公開了適于在大腸桿菌中表 達(dá)neurturin蛋白的其他載體，其公開內(nèi)容以引用的形式并入本文。蛋白neurturin的生物活性形式為二硫鍵連接的二聚體，其可通過純化的 neurturin的分子量確定。在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)后提取的物質(zhì)實(shí)質(zhì)上無生物活性，并以單體的 形式存在。重折疊是必需的以制備有生物活性的二硫鍵連接的二聚體。用于細(xì)菌系統(tǒng)中表 達(dá)的neurturin的重折疊和成熟的適當(dāng)方法與在W0 93/06116中所述的基本相似。用于測 定neurturin活性的標(biāo)準(zhǔn)體外測定與在W0 93/06116和美國專利申請No. 08/535, 681中所 述的測定GDNF活性的測定也基本相似，且其以引用的形式并入本文。將惰性、無毒、高降解性的聚合物-聚乙二醇(PEG)(也稱作聚氧化乙烯(PE0))共 價(jià)連接到neurturin在生物技術(shù)和醫(yī)藥上有重要的應(yīng)用。Neurturin的PEG化導(dǎo)致了導(dǎo)致 持久的持續(xù)時(shí)間的改良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，提高了安全性(例如較低的毒性、免疫原性和 抗原性)、提高療效、降低用藥次數(shù)、提高藥物溶解度和穩(wěn)定性、降低蛋白分解作用、及便于 控制藥物釋放。本發(fā)明涉及經(jīng)?；蛲榛B接連接到至少一個(gè)聚乙二醇分子的neurturin蛋白 產(chǎn)物(例如原核表達(dá)neurturin的衍生物)或其變異體的使用，及連接到一個(gè)或多個(gè)的聚 乙二醇分子的neurturin或其變異體的使用?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何PEG化反應(yīng)進(jìn)行 PEG 化。見，例如 Focus on Growth Factors, 3 (2) :4_10，1992 ;EP 0 154 316，其公開內(nèi)容 以引用的形式并入本文；EP 0 401 384;和本文引用的與PEG化相關(guān)的其他刊物。與不含有PEG化的neurturin的藥物組合物相比，本發(fā)明的藥物組合物在哺乳動(dòng) 物中(例如在人中)具有提高的活性成分的生物利用度(見圖2)。所述PEG化的neurturin 優(yōu)選以在活性成分的生物利用度上提供至少2倍的，優(yōu)選至少5倍的并更優(yōu)選至少10倍的 提高的量存在?？赏ㄟ^本申請的實(shí)施例所示確定生物利用度的提高。更具體而言，將含有指定量 或劑量的活性成分的組合物與含有相同劑量但未PEG化的活性成分的藥物組合物進(jìn)行比較。在皮下施用給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠)后可從血漿濃度確定兩種組合物的生物利用度。 優(yōu)選，經(jīng)至少120分鐘，優(yōu)選240分鐘且最優(yōu)選24小時(shí)的時(shí)間段后測量所述血漿濃度(見 圖2)?？墒贡景l(fā)明的藥物組合物適應(yīng)于通過任何有效途徑的施用，例如通過口腔、鼻腔、直腸、肺、局部、透皮或腸外途徑的施用。因此，所述組合物可為固體或液體組合物，例如片 齊 、膠囊、粉末、乳膏、凝膠劑、軟膏、溶液、乳液、懸浮液、冷凍干燥物等。但優(yōu)選通過注射或 輸液施用所述組合物，更優(yōu)選通過注射，例如通過皮下或靜脈注射。所述藥物組合物優(yōu)選水 溶液。除所述活性成分和可選擇的低分子量物質(zhì)(如陰離子聚合物)之外，所述藥物組 合物可包含藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑，例如緩沖液、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、填充 齊U、崩解劑、增稠劑等。所述藥物組合物包含治療有效量或劑量的活性成分。所述治療有效劑量依賴于活 性成分的類型、待治療疾病的類型和種類及施用的類型。對于含有neurturin作為活性成 分的腸外組合物來說，所述治療有效劑量優(yōu)選在約0. OOlmg/天 500mg/天的范圍內(nèi)，更優(yōu) 選從約0. 05mg/天 約IOOmg/天，最優(yōu)選從約0. Olmg/天 約5mg/天。優(yōu)選將所述組合物施用給哺乳動(dòng)物，尤其是人。因此，所述組合物適合于人用和獸 用藥品。所述組合物尤其適合于神經(jīng)退行性疾病或胰腺疾病的預(yù)防和/或治療，尤其是胰 腺自身免疫性疾病(如I型糖尿病和LADA、或II型糖尿病)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法，優(yōu)選腸內(nèi)或腸外或局部直接給胰腺 施用本文所述的neurturin綴合物?？梢罁?jù)體重、體表面積或器官大小的因素計(jì)算具體的 劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行確定涉及上述各組合物的用于治療的適當(dāng)劑量所需的計(jì)算 的進(jìn)一步優(yōu)化，且其在常規(guī)進(jìn)行的任務(wù)的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^將建立的確定所利用劑量的測定 與適當(dāng)?shù)膭┝宽憫?yīng)性數(shù)據(jù)結(jié)合使用來確定適當(dāng)?shù)膭┝?。將由主治醫(yī)師考慮改變藥物作用的 各種因素(例如患者的年齡、健康狀況、體重、性別和飲食，任意感染的嚴(yán)重性，施用時(shí)間及 其他臨床因素)確定涉及用于治療上述適應(yīng)癥的方法的最終給藥方案。隨著研究的進(jìn)行， 與治療各種疾病的適當(dāng)劑量水平有關(guān)的進(jìn)一步信息將出現(xiàn)。預(yù)見本文所述的neurturin綴合物的連續(xù)施用或持續(xù)給藥對特定的治療而言是 有優(yōu)勢的。雖然經(jīng)機(jī)械手段(例如用輸液泵)可完成連續(xù)的施用，希望也可實(shí)施其他連續(xù) 或幾乎連續(xù)施用的方式。例如，化學(xué)衍生或包裹導(dǎo)致了蛋白的緩釋形式，其具有以基于確定 的給藥方案的預(yù)計(jì)量持續(xù)存在的效果。因此，neurturin蛋白產(chǎn)物包括衍生的或以另外方 式制備的蛋白以完成所述連續(xù)施用。在一進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，可將neurturin綴合物直接遞送給祖細(xì)胞(例如 干細(xì)胞)以在體外或在體內(nèi)刺激胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的分化。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可優(yōu)選 以0. lng/ml 500ng/ml之間，更優(yōu)選lng/ml 100ng/ml之間，甚至更優(yōu)選20 80ng/ml 之間且最優(yōu)選50ng/ml的濃度添加neurturin綴合物?？梢詥为?dú)治療或與其他藥物制劑的聯(lián)合治療使用本文所公開的neurturin綴合 物。例如，可與適合用于治療或預(yù)防胰腺疾病和/或肥胖癥和/或代謝綜合征的其他藥物 制劑一起，尤其可與適合用于刺激和/或誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化為胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的其他藥物制 劑一起施用。另外，可與具有免疫抑制活性的藥物制劑一起使用，例如，在W02005/51415中公布的抗體、多肽和/或肽或非肽低分子量物質(zhì)。與野生型人neurturin相比，本發(fā)明的另一實(shí)施方式為包含至少一個(gè)氨基酸 (例如1、2、3或4個(gè)氨基酸)變化的人neurturin變異體。如上詳述，相對于天然的人 neurturin,人neurturin變異體可包含一個(gè)或多個(gè)取代、添加、刪除和/或插入?？扇缟纤?述制備neurturin變異體。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在成熟的人neurturin的氨基酸47 69之間，優(yōu)選51 65之間(如圖3所示的氨基酸141 164之間，優(yōu)選147 160之間)的區(qū)域出現(xiàn)氨基酸 的變化。所述氨基酸變化包含所述區(qū)域中至少一個(gè)精氨酸殘基的刪除或取代，例如精氨酸 殘基51、52、54、56、57、58、60、61和/或65。優(yōu)選精氨酸被中性或酸性氨基酸取代，例如甘 氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。特 別優(yōu)選被谷氨酸取代，例如R51E、R52E、R54E、 R56E、R57E、R58E、R60E、R61E和R65E或包含至少2個(gè)所述取代的neurturin變異體。也優(yōu)選人neurturin的變異體，其中另外和/或還可用賴氨酸取代上文指定區(qū)域 中的氨基酸殘基，尤其是精氨酸殘基，從而便于所述neurturin變異體位點(diǎn)特異性綴合到 多元醇基團(tuán)。特別優(yōu)選在上文指定區(qū)域中被賴氨酸取代，例如R51K、R52K、R54K、R56K、R57K、 R58K、R60K、R61K和R65K或包含至少2個(gè)所述取代的neurturin變異體。本發(fā)明的Neurturin取代變異體移除人neurturin氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸 殘基，及在其位點(diǎn)中插入的不同殘基。所述取代變異體包括等位基因變異體，其特征在于 是，可導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸變化的種群中自然發(fā)生的核苷酸序列變化。本發(fā)明進(jìn)一步提供了對有需要的受試者施用藥物組合物的方法，其中所述組合物 包含藥物活性量或劑量的綴合至少一個(gè)多元醇(如PEG)的至少一種neurturin蛋白產(chǎn)物 或所述綴合的neurturin的生物活性片段作為活性成分，及藥物可接受的載體、稀釋劑和/ 或佐劑。本發(fā)明甚至進(jìn)一步提供了對有需要的受試者施用藥物組合物的方法，其中所述組 合物包含藥物活性量或劑量的至少一種經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物或其生物活性片段 作為活性成分，及低分子量物質(zhì)，及藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。附圖簡述下列附圖和實(shí)施例說明本發(fā)明且其為如下述要求保護(hù)的本發(fā)明的非限制性實(shí)施 方式?；谙铝?br>

的因素本發(fā)明的許多其他方面和優(yōu)勢對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯 而易見的。圖1 細(xì)胞培養(yǎng)物中的PEG化的neurturin的生物活性所述報(bào)告細(xì)胞系經(jīng)受了遞增濃度的neurturin或用PEG綴合的neurturin (PEG 化的neurturin)。針對所測試制劑的最終濃度(在x軸上以ng/ml表示，圖1A和1B) 標(biāo)繪所得的報(bào)告基因活性(在y軸上以相對光單位(RLU)表示)。使用兩組單獨(dú)制備的 未修飾的neurturin作為實(shí)驗(yàn)對照(PeproTech ；Lot0805112和Lot0106112),并將它們 的相對活性與三種 PEG 化綴合物(單-mPEG-NHS-neurturin、單-mPEG-CHO-neurturin 和單-CES0310-neurturin)相比較。給定的值為至少3個(gè)孔的平均值士S. D。所述不 同測試計(jì)算出的 EC5Q 為Neurturin (Lot0805112,未修飾的蛋白)EC5(1 = 2. 2ng/ml， neurturin(Lot0106112,未修飾的蛋白):EC50 = 1. 2ng/ml,單-CES0310-neurturin EC50 = 12ng/ml (圖 1A)，及 neurturin(Lot0106112,未修飾的蛋白):EC50 = 3. 8ng/ml,單-mPEG-NHS-neurturin :EC5(I = 9. 7ng/ml,和單-mPEG-CHO-neurturin :EC5(I = 7. 4ng/ ml (圖 IB)。B 2 丨、鼠,Φ打·輸代編褲(PK)賺圖 2A 和 2B 示在給小鼠施用 0. 050mg/kg Bff (圖 2A)或 0. 50mg/kgBff(圖 2B)的 neurturin或PEG化的neurturin后在不同時(shí)間點(diǎn)以ng/ml表示的neurturin血漿濃度。 通過neurturin ELISA測定確定所得的血漿水平。時(shí)間點(diǎn)O顯示用ELISA測定的小鼠血清 中neurturin的平均背景信號。由從未處理小鼠的12份血清(圖2A)或11份血清(圖 2B)單獨(dú)測量的值計(jì)算背景值。其他的示值為從三個(gè)動(dòng)物測量的血清水平的平均值士S. D。 圖2A示源于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)(單-NHS-neurturin_Exp. 1和-_Εχρ· 2)的neurturin綴合 物單-NHS-neurturin的PK數(shù)據(jù)。圖2B示源自另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其中用0. 50mg/kg Bff 單-NHS-neurturin處理小鼠。就覆蓋全部所測時(shí)間點(diǎn)的曲線下面積(AUC)分析而言，設(shè)置所述基準(zhǔn)為 0. 6ng/ml (在時(shí)間點(diǎn)0處的平均背景值)Neurturin未修飾的蛋白18. 8ng * min/ ml,單-mPEG-NHS_neurturin_Expl :409ng * min/ml,單-mPEG-NHS_neurturin_Exp2 918ng ★ min/ml, -CES0310-neurturin =EC50 = 142ng ★ min/ml {U 2k), R neurturin 未修飾的蛋白:324ng * min/ml,單-mPEG-NHS-neurturin :1157ng * min/ml,禾口
-mPEG-CHO-neurturin :845ng ★ min/ml( 2B)。就neurturin血清水平的曲線下面積(AUC)分析(圖2A和2B)而言，設(shè)置所述基 準(zhǔn)為0. 6ng/ml neurturin，其對應(yīng)在未處理小鼠血清中確定的平均背景水平。圖 3由美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布了人neurturin前體的蛋白序列(登 錄號NP_004549)。用粗體標(biāo)出了對應(yīng)于生物及藥物活性形式的成熟蛋白的序列。Ml圖4A 人neurturin禾口突變的neurturin變異體的表達(dá)。對濃縮的表達(dá)neurturin 和neurturin變異體的HEK-293細(xì)胞的上清液進(jìn)行Native-PAGE/Western_blot (依據(jù)成熟 人neu rturin的序列進(jìn)行位置的編號，R 精氨酸，E 谷氨酸)。圖4B Neurturin ELISA 使用由大腸桿菌表達(dá)的人重組neurturin的代表性的標(biāo) 準(zhǔn)曲線。圖5 =Neurturin的生物活性的定量圖5A細(xì)胞的neurturin生物活性測定由大腸桿菌中遞增濃度的外源性人重組 neurturin組合遞增血清濃度刺激的酪氨酸羥化酶報(bào)告基因活性。圖5B Neurturin變異體的生物活性(n. d.未檢測)圖6 不同脊椎動(dòng)物物種的neurturin序列的比對示成熟人neurturin的氨基酸47 69 (依據(jù)成熟人neurturin肽的序列進(jìn)行位 置的編號，genbank登錄號NP_004549，成熟肽氨基酸96 197)。不同于neurturin的氨 基酸變異以粗體和下劃線標(biāo)出(GenBank登錄號在括號內(nèi))。圖 7 :neurturin 表達(dá)構(gòu)建體的 DNA 序列Kr-G3-H6-G3-Xa_rhneurturin (wt)將Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin(wt)克隆進(jìn)pMA載體。將限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和 所得的編碼區(qū)的氨基酸序列與正義鏈和反義鏈的DNA序列一起顯示。
圖 8 抗 neurturin 抗體 ELISA抗neurturin抗體ELISA 左側(cè)使用抗neurturin IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線，右側(cè)使用抗 neurturin IgG/I# 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)注意討論了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面的所有優(yōu)選的實(shí)施方式也涉及所有其他 的方面。說明了本發(fā)明的多用途，但其不限于下列實(shí)施例。 實(shí)施例實(shí)施例 1 :neurturin 的 PEG 化通過稱為PEG化的方法將聚乙二醇基團(tuán)(PEG)綴合到neurturin上。所述技術(shù) 廣泛用于治療蛋白的修飾且對任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言所述方案是熟悉的。在本發(fā)明 中，通過連接單個(gè)PEG分子到同型二聚體兩個(gè)亞基中的一個(gè)的N-末端氨基酸上來制備單 PEG化的neurturin綴合物。制備了兩個(gè)不同的單PEG化的neurturin綴合物，其在所連接 PEG的大小和結(jié)構(gòu)及綴合所述PEG到所述蛋白的制備方法上不同。使用約5kDa的線性PEG 試劑(mPEG-succinimidylsuccinat ；NOF, Japan)制備本文以“單-mPEG-NHS-neurturin” 公開的綴合物。所謂“NHS法”為可溶性蛋白PEG化的最常用方法。另外，使用5kDa的線 性聚乙二醇丁醛(Nektar，082M0H01)以生成以“單-mPEG-CHO-neurturin”公開的綴合 物。在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，NHS酯或NHS醛與蛋白和肽的游離氨基基團(tuán)有效地反應(yīng)。在 以“單-CES0310-neurturin”公開的另一個(gè)綴合物中，使用現(xiàn)有技術(shù)已知的PEG化方法 將neurturin同型二聚體的一條鏈上的N-末端氨基酸綴合到約5kDa的有六分支臂的 PEG 上(見，例如但不限于 DE 2005 100 04157. 0、EP 1 631 545 A2 ；W0 04/108634 ；W0 07/025763 ；CA2528667)。Neurturin不含有賴氨酸殘基，因此希望上述的PEG化反應(yīng)主要 導(dǎo)致了經(jīng)neurturin同型二聚體的N-末端氨基酸的反應(yīng)氨基基團(tuán)的N-末端PEG化。使用 本領(lǐng)域任何技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)方法確認(rèn)PEG化產(chǎn)品的質(zhì)量(大小和純度)。實(shí)施例2 :PEG化的neurturin綴合物或其變異體的生物活性使用基于細(xì)胞的報(bào)告物測定評估了所述neurturin綴合物的生物活性。確定 neurturin綴合物或其PEG化綴合物能多強(qiáng)地激活在表面表達(dá)neurturin受體的細(xì)胞系中 的報(bào)告基因構(gòu)建體。在測定中發(fā)現(xiàn)相對于未修飾的neurturin，兩種PEG化的neurturin綴 合物的活性降低了 3 10倍(圖1A和1B)。用neurturin報(bào)告基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在細(xì)胞表面表達(dá)neurturin受體的人成神 經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系TGW(JCRB0618)。所述報(bào)告基因構(gòu)建體包含熒光素酶基因，其在其他的調(diào)控 元件之間且受重復(fù)的血清應(yīng)答元件(SRE)的轉(zhuǎn)錄控制。在所述細(xì)胞中，應(yīng)答MAPK通路的激 活(例如通過neurturin結(jié)合到其表面受體)以刺激熒光素酶的表達(dá)。在96孔板中進(jìn)行 所述測定。通過添加熒光素底物到孔中，并在分析讀數(shù)器上(Molecular Devices)以發(fā)光 模式運(yùn)行以進(jìn)行讀取來測量熒光素酶活性。實(shí)施例3 :PEG化的neurturin綴合物或其變異體的提高的生物利用度利用在小鼠中的PK研究評估PEG化的neurturin綴合物的相對生物利用度(圖 2A和2B)。在所述實(shí)驗(yàn)中，皮下注射所述蛋白到小鼠的頸部區(qū)域。隨后，在遞送所述蛋白后 在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)使用特定的neurturin ELISA測定確定neurturin的血清濃度(圖2A和2B)。如使用未經(jīng)neurturin處理的小鼠的血清進(jìn)行檢測(O值點(diǎn))，在小鼠血清存在下所述 neurturin ELISA測定的靈敏性為相對的高背景信號所限。在進(jìn)行0. 050mg/kg體重(BW) 的未修飾的neurturin的注射后，在任何時(shí)間點(diǎn)都未發(fā)現(xiàn)neurturin血清水平顯著超過所 述背景水平。相反，當(dāng)使用相同量的PEG化的neurturin時(shí)，無關(guān)PEG修飾的種類，都可檢 測到注射蛋白血清水平的顯著提高(圖2A)。當(dāng)將未修飾的neurturin的注射量提高10倍 (0. 5mg/kg Bff)時(shí)可在時(shí)間點(diǎn)60、90、120和180分鐘時(shí)在血清中明顯檢測出所述蛋白(圖 2B)。使用T檢驗(yàn)及計(jì)算的ρ值<0.05確認(rèn)觀察的顯著性。另外，以0.5mg/kg BW劑量給 定的PEG化的neurturin衍生物的血清水平比未修飾的蛋白高幾倍(圖2A和2B)。相對于未修飾的neurturin，本文所示的neurturin綴合物始終體現(xiàn)出較高的血 清水平。總之，neurturin的PEG化顯著提高了neurturin的生物利用度。實(shí)施例4 :Neurturin變異體通過基于PCR的定點(diǎn)誘變用酸件的谷氨酸殘基取代位于neurturin的堿性插入?yún)^(qū) (patch)內(nèi)(成熟蛋白的氨基酸51 65)的堿性精氨酸殘基。簡言之，通過基于PCR的誘 變并使用不匹配的引物引入所需突變R51E、R52E、R54E、R56E、R57E、R58E、R60E、R61E、R63E 或R65E (依據(jù)成熟neurturin肽的序列進(jìn)行位置的編號，GenBank登錄號NP_004549，成熟 肽氨基酸96 197，在圖3中也顯示所述序列，R 精氨酸，E:谷氨酸)以修飾具有額外的 N-末端真核分泌信號肽的成熟人neurturin的編碼序列。純化所得質(zhì)粒，并通過測序檢查編碼序列的正確性。經(jīng)側(cè)翼的HindIII和XhoI克 隆位點(diǎn)將所述編碼序列克隆進(jìn)PCDNA3. 1+質(zhì)粒(Invitrogen Cat. No. V790 20)以用于真 核表達(dá)。在每一個(gè)175cm2組織培養(yǎng)皿上的用25ml培養(yǎng)基培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所述載體及作為轉(zhuǎn)染對照的空對照載體和GFP表達(dá)載體以用于真核表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后48小 時(shí)進(jìn)行每一個(gè)培養(yǎng)基的收集，并通過使用超濾柱濃縮培養(yǎng)基上清液至約0. 4ml。使用用于檢測的neurturin 特異性抗體通過native-PAGE/Western_blot首次 控制了 wt人neurturin和突變的變異體的表達(dá)(見圖4)。使用在大腸桿菌中表達(dá)的人重 組neurturin作為對照。圖4A示人野生型neurturin (wt)及除R63E外的所有經(jīng)修飾的neurturin變異體 以相似量表達(dá)。與wt neurturin相似，所述neurturin變異體的表觀質(zhì)量在20 25kDa 之間的范圍內(nèi)。通過neurturin特異性ELISA確定表達(dá)的neurturin的產(chǎn)量。簡言之，在微孔上 包被兔抗neurturin抗體以用于從含有neurturin的濃縮培養(yǎng)基上清捕獲neurturin。在 洗滌后，使用綴合生物素的羊抗neurturin抗體，再使用綴合過氧化物酶的鏈霉親和素，通 過發(fā)光讀出器定量捕獲的neurturin。使用在大腸桿菌中表達(dá)的人重組neurturin建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線(見圖4B)。此外，用特定的細(xì)胞測定定量表達(dá)的neurturin變異體的生物活性。所述測 定原理基于 Tanaka et al.，2002，2003 的實(shí)驗(yàn)(Tanaka M, Xiao H, Kiuchi K. Heparin facilitates glial cell line-derivedneurotrophic factor signal transduction. Neuroreport. 2002 0ct28 ；13 (15) 1913-6 ；Tanaka Μ, Xiao H, Hirata Y, Kiuchi K. A rapidassay for glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturinbasedon transfection of cells with tyrosine hydroxylasepromoter luciferase construct. Brain Res Brain Res Protoc. 2003May ； 11 (2) :119_22.)，顯示 了通過 neurturin在人TGW成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)對酪氨酸羥化酶(TH)報(bào)告基因構(gòu)建 體進(jìn)行的誘導(dǎo)。簡言之，用含有neurturin的樣品處理過表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)報(bào)告基 因構(gòu)建體的TGW細(xì)胞導(dǎo)致了由neurturin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK通路的誘導(dǎo)。所述報(bào)告基因構(gòu)建 體包含受重復(fù)的血清應(yīng)答元件(SRE)控制的熒光素酶基因。熒光素酶的表達(dá)依賴于MAPK 通路的激活。在96孔板中進(jìn)行所述測定。通過熒光素的添加并用發(fā)光讀出器分析來測量 neurturin介導(dǎo)的熒光素酶的表達(dá)。顯示使用在大腸桿菌中表達(dá)的人重組neurturin作為標(biāo)準(zhǔn)并與遞增的血清濃度 組合定量neurturin的生物活性的代表性實(shí)驗(yàn)示于圖5A。圖5B示野生型重組人neurturin及除R63E外的所有neurturin變異體以相似量 表達(dá)，導(dǎo)致了 1. 2 1. 7g/l之間的所述蛋白濃度，且與具有0. 32 0. 89ng/ml之間的EC5(1 的野生型重組人neurturin相比，所有表達(dá)的變異體在體外顯示了相似的生物活性(見圖 5B)。用于比較的大腸桿菌中的人重組neurturin顯示了可能由樣品中一部分未正確折疊 的neurturin的導(dǎo)致的EC50為2. 20ng/ml的較弱的效力(見圖5B)。因此，圖5顯示了在neurturin “踵”(heel)區(qū)的修飾(例如將帶負(fù)電荷的酸性氨 基酸引入到堿性插入?yún)^(qū)中)通常不損害neurturin的生物活性。出人意料的是現(xiàn)有技術(shù)顯 示在“踵”(heel)區(qū)的從堿性氨基酸到酸性氨基酸的修飾干擾neurturin的生物活性(見 如上所述的與其他的GFL的序列和結(jié)構(gòu)比較)。表達(dá)neurturin變異體R63E的失敗顯示在所述位置從精氨酸到谷氨酸的變化是 不容許的。然而，不導(dǎo)致氨基酸電荷完全改變的其他修飾是功能性的。已知的neurturin 同源物的序列比較顯示R63E變異體存在于鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)、短尾猊 (Monodelphisdomestica)禾口原雞(Gallus gallus)的人 neurturin 同源物中。在位置 52、 57,58和61處的精氨酸殘基的天然變異體也存在于不同的neurturin同源物中(見圖6)。研究者用賴氨酸取代在“踵”(heel)區(qū)的堿性精氨酸以建立具有提高的生物利用 度的生物活性neurturin變異體。因?yàn)榫彼岷唾嚢彼嵩诮Y(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，預(yù)計(jì)所述交換 僅最小限度的影響neurturin分子的結(jié)構(gòu)。所述改變能經(jīng)所示蛋白的區(qū)域中的賴氨酸側(cè)鏈 的伯胺進(jìn)行neurturin的位點(diǎn)特異性的定向PEG化以容許氨基酸實(shí)質(zhì)上改變，因此其對生 物活性不重要。因?yàn)樵诔墒斓奶烊蝗薾eurturin序列中不存在賴氨酸，所述反應(yīng)為高特異 性的。通過優(yōu)化反應(yīng)條件(例如PH、溫度和反應(yīng)時(shí)間)使活化的PEG與其他胺的反應(yīng)最小 化。通過在“踵” (heel)區(qū)的堿性插入?yún)^(qū)內(nèi)安排PEG修飾達(dá)到了兩個(gè)目的(i)在最小化對 蛋白活性的影響的同時(shí)，可獲得蛋白PEG化的益處(經(jīng)降低的腎清除、降低的免疫原性、提 高的蛋白穩(wěn)定性而提高的生物利用度)。(ii)預(yù)計(jì)所述區(qū)域的PEG化可通過防止與帶有負(fù) 電荷的細(xì)胞表面蛋白聚糖的相互作用來保護(hù)堿性插入?yún)^(qū)，也預(yù)計(jì)其可提高蛋白的生物利用 度。在第一步中，可通過基于PCR的定點(diǎn)誘變修飾成熟人neurturin的編碼序列，優(yōu)化 了所述序列的人密碼子的使用(具有用于真核分泌的額外的N-末端信號肽)和額外的純 化標(biāo)簽(具有用因子Xa裂解所述純化標(biāo)簽的額外位點(diǎn)的六個(gè)重復(fù)的組氨酸殘基)。在此， 將在精氨酸殘基51、52、54、56、57、58、60、61、63或65處的密碼子與賴氨酸殘基的密碼子互換。在本發(fā)明所得的稱為Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin的表達(dá)構(gòu)建體包括下列特 征 Kr 小鼠的含有kringle的跨膜蛋白2的DNA序列、氨基酸1 26、以人密碼子 使用(氨基酸序列MGTPHLQGFLLLFPLLLRLHGASAGS ;SEQ ID NO 2)優(yōu)化的用于細(xì)胞質(zhì)分泌 的信號肽(GenBank登錄號NP_082692)。
G3 以人密碼子使用(氨基酸序列GGG ；SEQ ID NO 3)優(yōu)化的甘氨酸間隔區(qū)的 DNA序列。
H6 以人密碼子使用(氨基酸序列HHHHHH ；SEQ ID NO 4)優(yōu)化的用于純化目 的的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的DNA序列?！a:以人密碼子使用(氨基酸序列IEGR;SEQ ID NO 5)優(yōu)化的因子Xa蛋白酶 識別位點(diǎn)的DNA序列。因子Xa蛋白酶切割精氨酸后的C-末端。
rhneurturin 以人密碼子使用(氨基酸序列ARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYAS DETVLFRYCAGACEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV SEQ ID NO :6)優(yōu)化的成熟的重組人neurturin的DNA序列。在各自的neurturin變異體 表達(dá)構(gòu)建體中通過賴氨酸密碼子AAG取代在位置51、52、54、56、57、58、60、61、63或65處的
單個(gè)精氨酸密碼子。在圖7 中示克隆進(jìn) pMA 載體的 Kr-G3-H6-G3-Xa-rhneurturin(wt)的完整 DNA 序 列；SEQ ID NO :7。實(shí)施例5 :neurturin變異體的PEG化將所得構(gòu)建體克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pcDNA3. 1+中，將其轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞以用 于如上所述經(jīng)修飾的neurturin變異體的表達(dá)。通過引入純化標(biāo)簽的方法由超濾和由親和層析純化表達(dá)的neurturin變異體。通過如上所述的native-PAGE/Western-blot和neurturin活性測定檢查所得的 neurturin變異體制劑的結(jié)構(gòu)、純度和生物活性。將以足夠產(chǎn)量表達(dá)和以可接受的純度純化的生物活性neurturin變異體用于用 不同的單分散PEG的共價(jià)修飾。所述PEG優(yōu)選2. 5 30kDa的大小，為線性或分支的，且用 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯激活。N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯自發(fā)地與伯胺發(fā)生反應(yīng)提 供了蛋白的有效PEG化。其他的PEG衍生物例如但不限于不同大小的分子、非單分散分子， 或具有不同的分支樣式的分子，且也可使用綴合化學(xué)。在反應(yīng)后，在引入的蛋白酶位點(diǎn)通過因子Xa裂解純化標(biāo)簽，并通過大小排除和/ 或親和層析純化PEG-neurturin變異體。本領(lǐng)域熟知大量其他的純化標(biāo)簽和蛋白酶位點(diǎn)/重組蛋白酶組合，并可替換所述 His標(biāo)簽和/或因子Xa位點(diǎn)/因子Xa裂解點(diǎn)。另外，可從無純化標(biāo)簽的真核表達(dá)系統(tǒng)的上清 或者過表達(dá)細(xì)菌的上清或裂解物通過色譜法純化含有引入的PEG化位點(diǎn)的所述neurturin 蛋白。通過如上所述的SDS-PAGE/Western-blot、native-PAGE/Western-blot 和 neurturin活性測定檢查所得的neurturin變異體制劑的結(jié)構(gòu)、純度和生物活性。在皮下施用50iimol/kg s. c給小鼠或大鼠后，體內(nèi)測定了在體外顯示足夠生物活性的純化的PEG-neurturin變異體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)。在施用后的基準(zhǔn)處及0. 25、 0. 5、1、1. 5、2、3、4、6 和 8 小時(shí)處通過 neurturin ELISA 確定血漿 neurturin 濃度。通過6天的、每天一次皮下施用50iimol/kg給neo STZ大鼠，測試了相比wt neurturin顯示提高的生物利用度的選定PEG-neurturin變異體的體內(nèi)效力。與媒質(zhì)對 照和wt neurturin組相比，每天測定血糖并在6天的處理后測定胰腺胰島素含量以測定
細(xì)胞功能。實(shí)施例6 :PEG化的neurturin的免疫原件潛力人重組wt neurturin具有免疫原性潛能，其通過在施用給成年小鼠超過2周后抗 neurturin抗體的出現(xiàn)證明。用特定的測定檢測抗neurturin抗體。簡言之，在微平板上 包被重組人neurturin以捕獲血清抗體。在洗滌后，使用綴合生物素的山羊抗IgG抗體或 山羊抗IgG/IgM抗體，再使用綴合過氧化物酶的鏈霉親和素通過發(fā)光讀出器定量捕獲的抗 neurturin抗體。使用在血清中稀釋的抗neurturin IgG和抗neurturin IgM以建立標(biāo)準(zhǔn) 曲線(見圖8)。因藥理活性蛋白的PEG化降低了它們的免疫原性潛力，通過28天的、每天一 次皮下施用50 u mol/kg給成年小鼠，測試了具有提高的生物利用度和持續(xù)效力的選定 PEG-neurturin變異體的免疫原性潛力。與媒質(zhì)對照和wt neurturin組相比，每周通過抗 neurturin抗體ELISA確定抗neurturin抗體的出現(xiàn)。
權(quán)利要求
Neurturin綴合物，其包含共價(jià)連接到neurturin蛋白產(chǎn)物或其生物活性片段的多元醇部分。
2.權(quán)利要求1的neurturin綴合物，其包含由SEQID. NO 1所示的氨基酸序列編碼的 多肽、或其同源物、直系同源物、變異體、類似物、衍生物、生物活性片段或生物活性突變體。
3.權(quán)利要求1或2的neurturin綴合物，其中所述多元醇部分為聚乙二醇部分。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其中所述多元醇部分為單鏈多元醇 部分。
5.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其中所述多元醇部分為支鏈多元醇 部分。
6.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其中所述多元醇部分為聚烷撐二醇 部分。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其具有同于或高于天然人neurturin 的體內(nèi)neurturin活性。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其與neurturin相比，具有至少一個(gè)氨基酸的變化。
9.權(quán)利要求8的neurturin綴合物，其中所述氨基酸變化在成熟人neurturin的氨基 酸47 69之間，優(yōu)選在51 65之間。
10.權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其中精氨酸殘基51、52、54、56、57、 58、60、61或65中的至少一個(gè)被刪除或取代。
11.權(quán)利要求10的neurturin綴合物，其中至少一個(gè)精氨酸殘基被中性或酸性氨基酸 殘基，例如谷氨酸取代。
12.權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)的neurturin綴合物，其中引入了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
13.藥物組合物，其包含 綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種neurturin蛋白產(chǎn)物和/或其生物活性片段 作為活性成分，及 藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述neurturin蛋白產(chǎn)物為人neurturin蛋白產(chǎn)物或 其生物活性片段。
15.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的組合物，其中所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物經(jīng)單 PEG化，其包含單個(gè)聚乙二醇分子鏈。
16.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的組合物，其中所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物經(jīng)寡 或多PEG化，其包含2、3、4或多個(gè)聚乙二醇分子鏈。
17.權(quán)利要求13 16中任一項(xiàng)的組合物，其中所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物包含 至少一個(gè)線性聚乙二醇分子鏈。
18.權(quán)利要求13 16中任一項(xiàng)的組合物，其中所述經(jīng)修飾的neurtur in蛋白產(chǎn)物包含 至少一個(gè)分支的聚乙二醇分子鏈。
19.權(quán)利要求13 18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇分子具有IOODa IOOOODa的、優(yōu)選200Da 8000Da的且最優(yōu)選IOOODa 7000Da的平均分子量。
20.權(quán)利要求13 19中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇分子被連接到所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物的N-末端氨基酸。
21.權(quán)利要求13 20中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇分子經(jīng)酰基或烷基連接被 連接到所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求13 21中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇分子由OH-、OCH3-或 OEt-基團(tuán)終止。
23.權(quán)利要求13 22中任一項(xiàng)的組合物，與含有未修飾的對照neurturin蛋白產(chǎn)物的 組合物相比，其具有提高的活性成分的生物利用度。
24.權(quán)利要求13 23中任一項(xiàng)的組合物，其中所述經(jīng)修飾的neurturin蛋白以在活 性成分的生物利用度上提供至少2倍的，優(yōu)選至少5倍的并更優(yōu)選至少10倍的提高的量存在。
25.權(quán)利要求13 24中任一項(xiàng)的組合物，其用于注射或輸液。
26.權(quán)利要求25的組合物，其用于皮下或靜脈注射。
27.權(quán)利要求13 26中任一項(xiàng)的組合物，其用于胰腺疾病或神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防或 治療。
28.權(quán)利要求27的組合物，其用于I型糖尿病、LADA和II型糖尿病的預(yù)防或治療。
29.權(quán)利要求13 28中任一項(xiàng)的組合物，其用于施用給哺乳動(dòng)物，尤其是人。
30.人neurturin的變異體，其與野生型人neurturin相比，包含至少一個(gè)，例如1、2、3 或4個(gè)氨基酸變化。
31.權(quán)利要求30的人neurturin變異體，其中所述氨基酸變化如權(quán)利要求9 12所定義。
32.對有需要的受試者施用藥物組合物的方法，所述藥物組合物包含藥物活性量的 綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物或與其生物活性片段作為活性成分，及 藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
33.對有需要的受試者施用藥物組合物的方法，所述藥物組合物包含藥物活性量的 綴合至少一個(gè)聚乙二醇分子的至少一種經(jīng)修飾的neurturin蛋白產(chǎn)物或其生物活性片段作為活性成分，及 低分子量物質(zhì)，及 藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及綴合到多元醇的neurturin蛋白產(chǎn)物且涉及具有提高的生物利用度的藥物組合物，其包含作為活性成分的neurturin綴合物，優(yōu)選PEG化的neurturin綴合物或其變異體。
文檔編號A61P25/00GK101848735SQ200880114325
公開日2010年9月29日 申請日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日
發(fā)明者F·哈德, M·奧斯滕, M·施奈德, M·格澤, R·穆斯曼, T·西格蒙德 申請人:德弗爾奧亨股份公司