專利名稱：調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(lrp6)的分子和方法
調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)的分子和方法
背景技術(shù)：
Wnt基因家族編碼一大類涉及Intl/Wntl原癌基因和果蠅屬無翅基因(“Wg”) (果蠅屬的Wntl相應(yīng)物)的分泌蛋白質(zhì)(Cadigan等人(1997)Genes& Development 11 3286-3305)。Wnt表達(dá)于多種組織和器官且為許多發(fā)育過程所需，這些過程包括果蠅屬 中的分節(jié)；秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中的內(nèi)胚層發(fā)育；哺乳動物的肢極性建立、神經(jīng) 脊分化、腎形態(tài)發(fā)生、性別決定和腦發(fā)育(Parr等人(1994)Curr. Opinion Genetics & Devel. 4 :523_528)。在胚胎發(fā)生過程和成熟生物體中，Wnt途徑都是動物發(fā)育的主要調(diào)節(jié) 物(Eastman 等人(1999) Curr Opin Cell Biol 11 :233_240 ；Peifer 等人(2000) Science 287 1606-1609)。Wnt信號通過七跨膜結(jié)構(gòu)域受體的Frizzled家族(“Fz”)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Bhanot等人 (1996)Nature 382:225-230)。Frizzled細(xì)胞表面受體(Fzd)在典型和非典型Wnt信號 傳導(dǎo)中都發(fā)揮主要作用。在典型途徑中，緊隨Wnt蛋白質(zhì)激活Fzd和LRP5/6 (低密度脂 蛋白受體相關(guān)蛋白5和6)，產(chǎn)生阻止“ β -聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體”對β _聯(lián)蛋白進(jìn)行磷酸 化和降解的信號，允許穩(wěn)定的聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)位并積累在細(xì)胞核內(nèi)，從而使Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 (Perrimon(1994)Cell 76 781-784) (Miller, J. R. (2001)Genome Biology ；3(1) :1_15)。 對非典型Wnt信號傳導(dǎo)途徑知之較少已提出了至少兩條非典型Wnt信號傳導(dǎo)途徑，包括平 面細(xì)胞極性(PCP)途徑、Wnt/Ca++途徑和會聚伸展途徑。糖原合酶激酶3 (GSK3，在果蠅屬中稱為shaggy)、腫瘤抑制基因產(chǎn)物APC (腺瘤結(jié) 腸息肉)(Gumbiner (1997) Curr. Biol. 7 :R443_436)和支架蛋白Axin都是Wnt途徑的負(fù)調(diào) 節(jié)物，并一起形成“β-聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體”。在無Wnt配體時，這些蛋白質(zhì)形成復(fù)合體并促 進(jìn)β-聯(lián)蛋白的磷酸化和降解，而Wnt信號傳導(dǎo)鈍化該復(fù)合體并阻止β-聯(lián)蛋白降解。結(jié)果 穩(wěn)定的聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，在此結(jié)合TCF(T細(xì)胞因子)轉(zhuǎn)錄因子(也稱為淋巴樣細(xì) 胞增強(qiáng)子結(jié)合因子-I(LEFl))，并作為TCF/LEF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的輔激活物(Bienz等人(2000) Cell 103 :311-320 ;Polakis 等人(2000)Genes Dev 14:1837-1851)。Wnt信號傳導(dǎo)通過典型和非典型機(jī)制發(fā)生。在典型途徑中，緊隨Wnt蛋白質(zhì)激活 Fzd和LRP5/6，穩(wěn)定的聯(lián)蛋白在細(xì)胞核中積累并導(dǎo)致TCF靶基因的激活(如上所述)。 (Miller, J. R. (2001)Genome Biology ；3(1) :1_15)。對非典型Wnt 信號傳導(dǎo)途徑知之較少: 已提出了至少兩種非典型Wnt信號傳導(dǎo)途徑，包括平面細(xì)胞極性(PCP)途徑和Wnt/Ca++途 徑。通過β -聯(lián)蛋白的穩(wěn)定化，異常高的Wnt途徑激活在許多結(jié)腸直腸癌的腫瘤發(fā)生 中起關(guān)鍵作用。據(jù)估計，80%的結(jié)腸直腸癌(CRC)在腫瘤抑制APC中具有失活突變，其允許 不間斷的Wnt信號傳導(dǎo)。此外，越來越多證據(jù)表明，Wnt途徑的激活可涉及黑素瘤、乳腺癌、 肝癌、肺癌和胃癌。在Wnt、正常發(fā)育和癌癥之間存在公認(rèn)已久的聯(lián)系，c-Myc原癌基因被確 認(rèn)為Wnt信號傳導(dǎo)的靶基因，從而更進(jìn)一步確立了這種聯(lián)系(He等人(1998)SCienCe281 1509-3512)。此外，與Wnt信號傳導(dǎo)的病理性的高或低水平相關(guān)的其他病癥包括但不限于骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、多囊腎病、糖尿病、精神分裂癥、血管病、心臟病、非致癌的增生性疾病和 神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病。Wnt信號傳導(dǎo)的異常上調(diào)與癌癥、骨關(guān)節(jié)炎和多囊腎病相 關(guān)，而Wnt信號傳導(dǎo)的異常下調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、肥胖癥、糖尿病、纖維化疾病和神經(jīng)元變性 疾病相關(guān)。目前開發(fā)Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)病癥(如結(jié)腸直腸癌)的療法的范例是依賴靶向于 β-聯(lián)蛋白或β-聯(lián)蛋白下游的Wnt途徑組分。然而，最近的研究表明，Wnt受體Frizzled 和LRP5/6介導(dǎo)的自分泌Wnt信號傳導(dǎo)可以在調(diào)節(jié)腫瘤生長和存活中起關(guān)鍵作用。存在對 下述藥物和方法的需要，所述藥物和方法通過沿著其他關(guān)鍵結(jié)合點調(diào)節(jié)Wnt途徑的激活來 抑制或增強(qiáng)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，從而治療、診斷、預(yù)防和/或改善Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)病癥。發(fā)明概述本發(fā)明涉及LRP6的表位、LRP6結(jié)合分子和使用這些分子的方法。LRP6結(jié)合分子 與LRP6相互作用，從而能夠調(diào)節(jié)LRP6的功能。LRP6激動或拮抗結(jié)合分子可分別用來促進(jìn) 或抑制Wnt途徑信號傳導(dǎo)；因此LRP6激動或拮抗結(jié)合分子可分別用來例如診斷、改善其癥 狀、防御和治療與Wnt途徑信號傳導(dǎo)的異常低水平或異常高水平相關(guān)的Wnt信號傳導(dǎo)病癥。 與Wnt信號傳導(dǎo)的異常上調(diào)相關(guān)的病癥的非限制性實例是癌癥(例如乳腺癌、肺癌和結(jié)腸 癌)。與Wnt信號傳導(dǎo)的異常下調(diào)相關(guān)的病癥的非限制性實例是特征為低骨礦物質(zhì)密度 (BMD)的骨相關(guān)病癥(例如骨質(zhì)疏松癥)。在多個方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)(例如抑制或促進(jìn))LRP6的一種或多種生物學(xué)功 能的LRP6結(jié)合分子。例如，LRP6結(jié)合分子可調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的磷酸化和隨后的降解。作 為另一個實例，LRP6結(jié)合分子可干擾LRP6結(jié)合Wnt途徑所有成員的能力，所述成員例如 DKKl (dickkopf 1)、DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性 Fzd 相關(guān)蛋白)1-4、 Wise (USAG1的小鼠版本)或Wnt配體本身。LRP6結(jié)合分子包括，例如結(jié)合LRP6的抗體(例如在LRP6的特定結(jié)構(gòu)域或表位內(nèi)， 如結(jié)合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋槳，或結(jié)合至任意螺旋槳內(nèi)的特異結(jié)構(gòu)域(例如 EGF重復(fù)、YffTD樣基序或其他))，和包含這類抗體的抗原結(jié)合部分的多肽。LRP6結(jié)合分子 還包括其中結(jié)合部分不是源自抗體的分子，例如源自具有免疫球蛋白樣折疊的多肽的LRP6 結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分通過隨機(jī)化、選擇和親和力成熟而改造為結(jié)合LRP6。因此，在一方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如特異地結(jié)合)至LRP6的抗體的抗 原結(jié)合部分的LRP6結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合至人LRP6螺旋槳1 (SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :1的殘基20-326)內(nèi)的表位，該表位在以下之一內(nèi)或與之重疊(a) SEQ ID NO :1的氨基酸286-324 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO 3)) ； (b) SEQ ID NO :1 的氨基酸66-69 (即在以下 序列內(nèi)或與之重疊的表位YWSD) ； (c)SEQ ID NO 1的氨基酸110-113 (即在以下序列內(nèi)或 與之重疊的表位YWTD) ； (d) SEQ IDNO 1的氨基酸153-156 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊 的表位YWTD) ； (e) SEQ ID NO=I的氨基酸197-200 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位 YWAD)；和(f)SEQ ID NO 1的氨基酸238-241 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位=YffTD)。在另一方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如特異地結(jié)合)至LRP6的抗體的抗原結(jié)合 部分的LRP6結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合至人LRP6螺旋槳1(SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 1的殘基20-326)內(nèi)的表位，該表位在以下之一內(nèi)或與之重疊(a) SEQ ID NO 1的氨基酸 20-65 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 70-109 ； (c) SEQ ID NO :1 的氨基酸 114-152 ； (d) SEQ ID NO 1 的氨基酸 157-196 ；禾口 (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 201-237 ；禾口 (f) SEQ ID NO 1 的 氨基酸242-326。因此，在一方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如特異地結(jié)合)至LRP6的抗體的抗原結(jié) 合部分的LRP6結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合至人LRP6螺旋槳3 (SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :1的殘基631-932)內(nèi)的表位，該表位在以下之一內(nèi)或與之重疊(a) SEQ ID N0:1的氨 基酸889-929 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO 5)) ； (b) SEQ ID NO :1的氨基酸677-680 (即在以下序列內(nèi)或與之重 疊的表位YWTD) ； (c)SEQ ID NO :1的氨基酸720-723 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位 YWAD) ； (d) SEQ IDNO :1的氨基酸763-766 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位YWTE) ； (e) SEQ ID NO :1的氨基酸806-809(即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位YWTD)；和(f) SEQ ID NO 1的氨基酸846-849 (即在以下序列內(nèi)或與之重疊的表位YWTD)。在另一方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如特異地結(jié)合)至LRP6的抗體的抗原結(jié)合 部分的LRP6結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合部分結(jié)合至人LRP6螺旋槳3 (SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :1的殘基631-932)內(nèi)的表位，該表位在以下之一內(nèi)或與之重疊(a) SEQ ID N0:1的氨 基酸 631-676 ； (b) SEQ IDNO 1 的氨基酸 681-719 ； (c) SEQ ID NO 1 的氨基酸 724-762 ； (d) SEQ IDNO 1 的氨基酸 767-805 ；禾口 (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 810-845 ；禾口 (f) SEQ IDNO 1 的氨基酸850-932。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子(例如抗-LRP6拮抗抗體)以這樣的方式結(jié)合 至人LRP6內(nèi)的表位(例如結(jié)合至人LRP6螺旋槳1、螺旋槳3、或結(jié)合至其組件結(jié)構(gòu)域或基 序)以阻止某些Wnt配體類似地結(jié)合。作為非限制性實例，拮抗Wnt信號傳導(dǎo)途徑的LRP6 結(jié)合分子阻止Wntl或Wnt3a配體結(jié)合LRP6。例如，Wnt3或Wnt3a特異的信號傳導(dǎo)活性可 最有效地被Wnt3a特異的LRP6拮抗結(jié)合分子抑制。作為另一個非限制性實例，Wntl、Wnt2、 Wnt6,ffnt7a,ffnt7b和WntlO特異的信號傳導(dǎo)活性可最有效地被Wntl特異的LRP拮抗結(jié)合 分子抑制。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子(例如抗-LRP6拮抗抗體)能夠結(jié)合至一個以 上的LRP6螺旋槳(例如同時地結(jié)合至螺旋槳1、螺旋槳3、或結(jié)合至其組件結(jié)構(gòu)域或基序)。 在一些情況下，所述同時結(jié)合的LRP6結(jié)合分子能夠阻止某些Wnt配體類似地結(jié)合LRP6。作 為非限制性實例，所述同時結(jié)合的LRP6結(jié)合分子能夠阻止Wntl或Wnt3a配體結(jié)合LRP6。 作為非限制性實例，所述同時結(jié)合的LRP6結(jié)合分子能夠抑制Wnt3和Wnt3a特異的信號傳 導(dǎo)活性。作為另一個非限制性實例，所述同時結(jié)合的LRP6結(jié)合分子能夠抑制Wntl、Wnt2、 Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO特異的信號傳導(dǎo)活性。在多個實施方案中，結(jié)合至人LRP6的螺旋槳1、螺旋槳3、或其組件結(jié)構(gòu)域或基序 內(nèi)的表位的LRP6結(jié)合分子(例如抗-LRP6激動或拮抗抗體)與非人類靈長動物(例如食 蟹猴或獼猴)的LRP6蛋白質(zhì)(或其部分)交叉反應(yīng)。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子 與嚙齒動物物種的LRP6(例如鼠LRP6、大鼠LRP6)交叉反應(yīng)。在多個實施方案中，LRP6結(jié) 合分子與人LRP5交叉反應(yīng)。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子(例如抗-LRP6拮抗抗體)能夠結(jié)合至并調(diào)節(jié) (例如抑制)磷酸化的LRP6 (磷酸-LRP6)。
在多個實施方案中，抗原結(jié)合部分結(jié)合至線性表位。在多個實施方案中，抗原結(jié)合部分結(jié)合至非線性表位。在一個實例中，抗原結(jié)合 部分結(jié)合至非線性表位，該表位包含或由以下每種線性表位的至少一個部分組成(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸 286-324 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 66-69 ； (c) SEQ ID NO 1 的氨基酸 110-113 ； (d)SEQ ID NO 1 的氨基酸 153-156 ； (e) SEQ ID NO 1 的氨基酸 197-200 ；禾口 (f) SEQ ID NO :1的氨基酸238-241。在另一個實例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合至非線性表位，該 表位包含或由以下兩個或三個線性表位的至少一個部分組成(a)SEQ IDNO=I的氨基酸 889-929 ； (b) SEQ ID NO 1 的氨基酸 677-680 ； (c) SEQ IDNO 1 的氨基酸 720-723 ； (d) SEQ ID NO 1 的氨基酸 763-766 ； (e) SEQ IDNO 1 的氨基酸 806-809 ；和(f) SEQ ID NO 1 的氨基 酸846-849。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、 0. 25nM或0. InM的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至LRP6。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、 0. 25nM或0. InM的Kd結(jié)合至非人類靈長動物(例如食蟹猴或黑猩猩)的LRP6，。在多個實施方案中，抗原結(jié)合部分以等于或小于1ηΜ、0. 5nM、0. 25nM或0. InM的Kd 結(jié)合至小鼠LRP6?？贵w可以是嵌合(例如人源化)抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗原結(jié)合部分是人抗體的抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分可以是單克隆抗體或多克隆抗體的抗原結(jié)合部分。LRP6結(jié)合分子包括例如抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或Fv片段。LRP6結(jié) 合分子還包括例如完全抗體，例如二價IgG抗體。在一些實施方案中，能夠拮抗LRP6的Fab 或其他單價抗體片段可以轉(zhuǎn)化為能夠激動LRP6的二價完全抗體，例如二價IgG抗體。在其他實施方案中，將LRP6結(jié)合分子與藥物綴合或偶聯(lián)來增加所述結(jié)合分子。 在一些情況下，將LRP6結(jié)合分子與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合蛋白質(zhì)綴合。在一些實施 方案中，將LRP6結(jié)合分子聚乙二醇化(例如用美國專利US 5,840, 526, US 5,874, 541, US 6，005，079、和 US 6，765，087 ( “Hamers 專利”)、和包含 PCT 公開物 W097/49805 的專 利族中任意一篇描述的專有技術(shù))。在一些實施方案中，LRP6結(jié)合分子是聚乙二醇化的 Fab片段?？捎脕碇苽銵RP6結(jié)合分子的所述綴合物的技術(shù)的非限制性實例可見于包含 以下一項或多項的專利族美國專利號US 5，840，526、US 5，874，541、US6, 005，079和US 6，765，087 ( "Hamers 專利”)；PCT 公開物 W097/49805 ；歐洲專利 EP1517921B1 ；美國專利 6，267，974 ；美國公開物 US2003-0175921。
0031 ] 在一個實施方案中，LRP6結(jié)合分子是人抗體。在一個實施方案中，LRP6結(jié)合分子包含單鏈Fv。在一個實施方案中，LRP6結(jié)合分子包含雙價抗體(例如單鏈雙價抗體或具有兩條 多肽鏈的雙價抗體)。在一些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合部分產(chǎn)生自以下同種型之一的抗體IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合部分產(chǎn)生自IgA或IgE同種型的 抗體。LRP6結(jié)合分子(例如結(jié)合至LRP6胞外域的第一或第三螺旋槳內(nèi)的表位、或結(jié)合至所述螺旋槳內(nèi)的特異結(jié)構(gòu)域(例如EGF重復(fù)或YWTD樣基序)的LRP6結(jié)合分子)可以顯 示大量生物學(xué)活性中的一種或多種。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合分子抑制LRP6結(jié)合至 多個 Wnt 信號傳導(dǎo)途徑成員(例如 DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、 sFRP(可溶性Fzd相關(guān)蛋白)1-4、Wise或Wnt配體本身)。例如，相對于對照(例如相對 于無LRP6結(jié)合分子時的結(jié)合)，LRP結(jié)合分子抑制LRP6結(jié)合至Wnt信號傳導(dǎo)途徑成員至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在一個實施方案中，LRP6結(jié)合分子與Wnt信號傳導(dǎo)途徑成員(例如 DKK1 (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1 (USAG1)、sFRP (可溶性 Fzd 相關(guān)蛋白)1 -4、Wise 或Wnt配體本身)競爭結(jié)合LRP6，從而調(diào)節(jié)Wnt途徑信號傳導(dǎo)的生物學(xué)活性和結(jié)果。作為 非限制性實例，拮抗LRP6結(jié)合分子可通過與Wnt信號傳導(dǎo)途徑成員競爭結(jié)合LRP6來抑制、 減弱或阻止Wnt途徑激活和信號傳導(dǎo)。作為另一個非限制性實例，Wntl特異的拮抗LRP6結(jié) 合分子可阻止通過Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO中任意一種的Wnt途徑激活和 信號傳導(dǎo)。作為另一個實例，拮抗LRP6結(jié)合分子(例如在LRP6的第一螺旋槳內(nèi)結(jié)合的結(jié) 合分子)可抑制、減弱或阻止通過Wise或Wnt配體的Wnt途徑激活和信號傳導(dǎo)。作為另一 個實例，拮抗LRP6結(jié)合分子(例如在LRP6的第三螺旋槳內(nèi)結(jié)合的結(jié)合分子)可抑制、減弱 或阻止通過例如DKKl和Wnt配體(如Wnt3和Wnt3a)的Wnt途徑激活和信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，LRP6結(jié)合分子能夠激活、增強(qiáng)或保全Wnt信號傳導(dǎo)途徑，或使 細(xì)胞對Wnt信號傳導(dǎo)敏感。作為非限制性實例，激動LRP6結(jié)合分子能夠結(jié)合至LRP6 (例如 結(jié)合至第三螺旋槳)并引起聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體的溶解，從而使聯(lián)蛋白穩(wěn)定，轉(zhuǎn)運至 細(xì)胞核并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。在一些實施方案中，激動LRP6結(jié)合分子能夠通過寡聚化LRP6來激活、增強(qiáng)或保全 Wnt信號傳導(dǎo)途徑，或使細(xì)胞對Wnt信號傳導(dǎo)敏感。已知可通過使LRP6寡聚化形成(例如 Fzd-LRP6異寡聚體)的藥物來取消對Wnt配體的需要，所述藥物包括本發(fā)明的LRP6結(jié)合分 子。(Cong 等人(2004)Development 131 (20) :5103)。在一些實施方案中，所述 LRP6 結(jié)合 分子是如本文所述的二價IgG抗體。在一些實施方案中，LRP6結(jié)合分子通過調(diào)節(jié)LRP6以直接或間接方式正常地調(diào)節(jié) 下游生物學(xué)活性(例如調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白磷酸化和降解)。例如，相對于對照(例如相對于無 拮抗LRP6結(jié)合分子時的活性)，拮抗LRP6結(jié)合分子允許β -聯(lián)蛋白磷酸化和降解的程度高 至少 5%、10%、15%、25%或 50%。在一個實施方案中，通過阻止通過Wntl、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和WntlO中任 意一種的Wnt途徑激活和信號傳導(dǎo)，Wntl特異的拮抗LRP6結(jié)合分子允許β _聯(lián)蛋白磷酸化 和降解的程度相對于對照高至少5%、10%、15%、25%或50%。在另一個實施方案中，通過 阻止通過Wnt3或Wnt3a的Wnt途徑激活和信號傳導(dǎo)，Wnt3a特異的拮抗LRP6結(jié)合分子允許 β -聯(lián)蛋白磷酸化和降解的程度相對于對照高至少5%、10%、15%、25%或50%。在另一 個實施方案中，通過阻止Wise結(jié)合至LRP6，Wntl特異的拮抗LRP6結(jié)合分子允許β -聯(lián)蛋 白磷酸化和降解的程度相對于對照高至少5 %、10 %、15 %、25 %或50 %。在另一個實施方 案中，通過阻止DKKl、Wnt配體(如Wnt3和Wnt3a)等結(jié)合至LRP6，Wnt3a特異的拮抗LRP6 結(jié)合分子允許β _聯(lián)蛋白磷酸化和降解的程度相對于對照高至少5 %、10 %、15 %、25 %或 50%。
相反地，例如，相對于對照(例如相對于無激動LRP6結(jié)合分子時的活性)，激動 LRP6結(jié)合分子穩(wěn)定β -聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)水平的程度高至少5%、10%、15%、25%或50%。本發(fā)明還涉及非抗體的LRP6結(jié)合分子。非抗體LRP6結(jié)合分子包含LRP6結(jié)合結(jié) 構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有源自非抗體多肽的免疫球蛋白樣(Ig樣)折疊的氨基酸序列，所述非 抗體多肽例如以下之一腱糖蛋白、N-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ICAM、纖連蛋白、肌聯(lián)蛋白、 GCSF受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓鞘質(zhì)膜粘附分子Ρ0、CD8、CD4、 ⑶2、I類MHC、T-細(xì)胞抗原受體、⑶1、C2和VCAM-I的I_set結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì) C的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)H的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白 的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、促紅細(xì)胞生成 素受體、催乳素受體、干擾素_ Y受體、β “半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β “葡糖醛酸糖 苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物岐化酶、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠 色熒光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。一般而言，相對于免疫球蛋白樣折疊的氨基酸序列，改變 LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以使LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異地結(jié)合至LRP6 (即，其中免疫球蛋 白樣折疊不能特異地結(jié)合至LRP6)。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與纖連蛋白、細(xì)胞因子受體或 鈣粘蛋白的免疫球蛋白樣折疊的氨基酸序列至少60 %相同(例如至少65 %、75 %、80 %、 85%或90%相同)。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與以下之一的免疫球蛋白樣 折疊的氨基酸序列至少60%、65%、75%、80 %、85%或90%相同腱糖蛋白、N-鈣粘蛋白、 E-鈣粘蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白、GCSF受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓 鞘質(zhì)膜粘附分子PO、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T-細(xì)胞抗原受體、CDl、C2和VCAM-I的I-set結(jié) 構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)C的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)H的I-set 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生 長激素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、干擾素_ Y受體、β “半乳糖苷酶/葡糖醛 酸糖苷酶、β -葡糖醛酸糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物岐化酶、組織因 子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠色熒光蛋白、GroEL或竹芋蛋白。在多個實施方案中，LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域以等于或小于InM(例如0. 5nM、0. InM)的Kd 結(jié)合至LRP6。在一些實施方案中，Ig樣折疊是纖連蛋白的Ig樣折疊，例如III型纖連蛋白的Ig 樣折疊(例如纖連蛋白III的組件10的Ig樣折疊)。本發(fā)明還提供對應(yīng)于LRP6抗原性表位的肽。在一個方面，本發(fā)明涉及由與以下氨 基酸序列之一至少90%相同的氨基酸序列組成的肽LRP6的第一螺旋槳(SEQ ID NO 2)； NATNPCGIDN GGCSHLCLMSPVKPFYQCAC PTGVKLLENG KTCK (SEQ ID NO 3) ；LRP6 的第三螺旋槳 (SEQ ID NO 4)；或 GW NECASSNGHC SHLCLAVPVGGFVCGCPAHY SLNADNRTC(SEQ ID NO :5)。在另一個方面，本發(fā)明提供對動物施用該組合物時導(dǎo)致特異地結(jié)合至LRP6的 抗體的組合物。該組合物包含例如以下肽之一LRP6的第一螺旋槳(SEQ ID NO 2)； NATNPCGIDN GGCSHLCLMS PVKPFYQCACPTGVKLLENG KTCK(SEQ ID NO 3) ；LRP6 的第三螺旋槳 (SEQ IDNO 4)；或GW NECASSNGHC SHLCLAVPVG GFVCGCPAHYSLNADNRTC(SEQ ID NO 5)；具有 少于5個氨基酸改變的肽；或它們的片段(例如包含5、6、7、8、9、10、11或12個氨基酸的片段)?？梢孕揎椩撾膩硖岣呖乖?，例如通過偶聯(lián)至載體蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含本文所述LRP6結(jié)合分子的藥物組合物。所述組合物包含例如 LRP6結(jié)合分子和可藥用的載體。本發(fā)明還涉及使用本文所述LRP6結(jié)合分子的方法。在一方面，本發(fā)明涉及抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法。該方法包括將腫瘤細(xì)胞與拮抗 LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗體的抗原結(jié)合部分的LRP6結(jié)合分子)接 觸，從而穩(wěn)定β -聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體，引起β -聯(lián)蛋白磷酸化和降解，阻止腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Wnt 途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個方面，本發(fā)明涉及在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法。該方法包括將腫瘤細(xì) 胞或宿主細(xì)胞環(huán)境與拮抗LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗體的抗原結(jié)合 部分的LRP6結(jié)合分子)接觸，從而穩(wěn)定β-聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體，引起β-聯(lián)蛋白磷酸化和 降解，阻止腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Wnt途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個方面，本發(fā)明涉及侵蝕癌性腫瘤基質(zhì)支持的方法。該方法包括將腫瘤細(xì) 胞與拮抗LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗體的抗原結(jié)合部分的LRP6結(jié) 合分子)接觸，從而殺傷腫瘤所依賴的血管(血管發(fā)生或其他方式)和/或其他結(jié)構(gòu)組分。在上述情況下，可分別以對抑制腫瘤細(xì)胞生長或在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡有效的量 施用拮抗LRP6結(jié)合分子。相對于施用組合物前的所述比例，個體的癌細(xì)胞與健康細(xì)胞的比 例可降低至少10% (例如癌細(xì)胞與健康細(xì)胞的比例降低至少25%、30%、50%、60%、75% 或100%)。在一些實施方案中，個體還接受化療劑的治療。在一個方面，本發(fā)明的LRP6激動或拮抗結(jié)合分子可用來例如診斷、改善其癥狀、 防御和治療本文所定義的骨相關(guān)病癥。在一個方面，本發(fā)明涉及提高個體骨礦物質(zhì)密度的方法。該方法包括以對提高骨 礦物質(zhì)密度有效的量對個體施用激動LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗體 的抗原結(jié)合部分的LRP6結(jié)合分子)。在一些實施方案中，所述激動LRP6結(jié)合分子干擾LRP6 和Sclerostin間的結(jié)合事件，并能夠激活、增強(qiáng)或保全Wnt信號傳導(dǎo)途徑，或使細(xì)胞對Wnt 信號傳導(dǎo)敏感。Sclerostin是由SOST基因編碼的蛋白質(zhì)，是涉及骨相關(guān)病癥的Wnt信號傳 導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物(Wnt信號傳導(dǎo)對正常生理條件下的骨形成是很重要的)。作為非限制性實例，激動LRP6結(jié)合分子能夠結(jié)合至LRP6 (例如結(jié)合至LRP6的第 三螺旋槳)并引起β-聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體的溶解，從而使β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定，轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核并 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，從而以此過程提高骨礦物質(zhì)密度。作為其他非限制性實例，激動LRP6結(jié)合 分子能夠結(jié)合至LRP6的第三螺旋槳之外的區(qū)域。在這些情況下，所述LRP6激動抗體能夠 寡聚化LRP6，以激活、增強(qiáng)或保全Wnt信號傳導(dǎo)或使細(xì)胞對Wnt信號傳導(dǎo)敏感。在另一個方面，本發(fā)明涉及降低個體骨礦物質(zhì)密度的方法。該方法包括以對降低 骨礦物質(zhì)密度有效的量對個體施用拮抗LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗 體的抗原結(jié)合部分的LRP6結(jié)合分子)。在一些實施方案中，所述拮抗LRP6結(jié)合分子模擬 Sclerostin的作用，從而能夠以類似的方式負(fù)調(diào)節(jié)Wnt途徑。在一些實施方案中，拮抗LRP6結(jié)合分子是Wntl特異的，并結(jié)合至LRP6的第一螺 旋槳。在一些其他實施方案中，拮抗LRP6結(jié)合分子是Wntl特異的，結(jié)合至LRP6的第一螺 旋槳并阻止配體Wntl、Wnt6和/或Wnt7與LRP6相互作用和啟動Wnt途徑。
在其他方面，本發(fā)明涉及改善或預(yù)防代謝綜合征和/或冠狀動脈病癥狀的方法。 該方法包括以對改善或預(yù)防代謝綜合征和/或冠狀動脈病癥狀有效的量對個體施用激動 LRP6結(jié)合分子(例如包含特異地結(jié)合至LRP6的抗體的抗原結(jié)合部分的LRP6結(jié)合分子)。 在一些實施方案中，所述激動LRP6分子能夠激活、增強(qiáng)或保全Wnt信號傳導(dǎo)途徑，或使細(xì)胞 對Wnt信號傳導(dǎo)敏感。作為非限制性實例，所述激動LRP6結(jié)合分子能夠結(jié)合至LRP6 (例如 結(jié)合至LRP6的第三螺旋槳)，誘導(dǎo)LRP6的寡聚化，引起β -聯(lián)蛋白破壞復(fù)合體的溶解，從而 使聯(lián)蛋白穩(wěn)定，轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，從而以此過程改善或預(yù)防代謝綜合征 和/或冠狀動脈病的癥狀。在一些實施方案中，在靜脈內(nèi)施用組合物。本發(fā)明的一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)在以下所附的圖和描述中給出?？蓮拿枋龊?圖以及權(quán)利要求書中明白本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點。附圖簡述本專利或申請文件包含至少一幅彩圖。收到請求和支付必要的費用后，辦公室將 提供本專利或?qū)＠暾埞_的帶有彩圖的拷貝。

圖1是鑒定優(yōu)先抑制Wntl誘導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)的抗-LRP6拮抗Fab的圖示。圖2是鑒定優(yōu)先抑制Wnt3A誘導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)的抗-LRP6拮抗Fab的圖示。圖3是鑒定抗-LRP6激動Fab的圖示。圖4顯示產(chǎn)生LRP6平截突變體進(jìn)行LRP6結(jié)構(gòu)域作圖的位置。圖4B以每幅圖對 應(yīng)于不同突變體顯示平截突變體的FACS分析。上一排從左至右涉及LRP6全長、LRP6缺失 I和LRP6缺失II。下一排從左至右涉及LRP6缺失III、LRP缺失I和II、和LRP6缺失I 和III。用抗-Flag抗體染色細(xì)胞。圖4C顯示以每幅圖對應(yīng)于不同突變體顯示平截突變體 的 FACS 分析。排列與圖 4B 中相同，用 Fab005、Fab021、FabO 10, Fab004、Fab002、Fab026、 Fab025和對照(抗-溶酶體Fab)染色細(xì)胞。圖5是大量Fab轉(zhuǎn)化為IgG時活性變化的圖示。圖5A顯示由Wntl誘導(dǎo)，圖5B顯 示由Wnt3A誘導(dǎo)。圖6是抗-LRP6結(jié)合分子抑制磷酸化的LRP6 (磷酸-LRP6)的能力的圖示。圖6A 顯示PA-I (卵巢畸胎瘤)細(xì)胞中的磷酸-LRP6抑制，圖6B顯示NCI-H929 (多發(fā)性骨髓瘤) 細(xì)胞中的磷酸-LRP6抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了結(jié)合至LRP6(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6)的分子(“LRP6結(jié)合 分子”)，尤其是結(jié)合至人LRP6并調(diào)節(jié)其功能的人抗體和其部分。本文還提供LRP6的表位 和結(jié)合這些表位的藥物。人LRP6(hLRP6)的全長序列見于 Genbank 檢索號 GI 148727288、 gb |NP_002327，其在表I中顯示為SEQ ID NO :1。編碼hLRP6的mRNA序列見于檢索號GI 148727287,ΝΜ_002336ο表1 人LRP6氨基酸序列1 MGAVLRSLLA CSFCVLLRAA PLLLYANRRD LRLVDATNGK ENATIVVGGL EDAMVDFVF61 SHGLIYffSDV SEEAIKRTEF NKTESVQNVV VSGLLSPDGL ACDWLGEKLY WTDSETNRIE121 VSNLDGSLRK VLFffQELDQP RAIALDPSSG FMYffTDffGEV PKIERAGMDG SSRFIIINSE
181IYffPNGLTLDYEEQKLYffADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYffT
241DffSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMS
301PVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIR
361HAIAIDYDPVEGYIYffTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDffVARNLYffT
421DTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYffTDffGEIPKIERAALDGSD
481RVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYffGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTL
541LGDYVYffTDffQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCS
601HLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTG
661VKEASALDFDVTDNRIYffTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDffLGKNLY
721WADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVffKDLDSPRALALDPAEGFMYffTEffGGKPKIDRAAMDG
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1561NYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS (SEQ I
(SEQ ID NO 1)
人LRP6蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 1)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域定位如下信號肽可見于SEQ ID
N0:1的氨基酸殘基1-19 ；四個YWTD(酪氨酸、色氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸)-型β-螺旋槳 結(jié)構(gòu)域(其每一個形成六瓣式β-螺旋槳結(jié)構(gòu)(Springer (1998) J. Mol. Biol. ；283 837 ； Jeon 等人(2001)Nat. Struct. Biol. 22 1172))可見于 SEQ ID NO :1 的氨基酸 20-326、 SEQ ID NO 1 的氨基酸 327-630、SEQ ID NO 1 的氨基酸 631-932、SEQ ID NO 1 的氨基酸 933-1246。人 HRP6 在 N42、N81、N281、N433、N486、N692、N859、N865、N926 和 N1039 處 N-糖 基化。 小鼠LRP6的氨基酸序列具有GenBank檢索號GI 148727327、NP_032540。果蠅屬 的Arrow序列見于檢索號GI :24653390、NP_524737，非洲爪蟾屬(Xenopus)的LRP6序列見 于檢索號GI :10280605、AAG15429。人LRP6是通過其與LRP5的同源性而鑒定的，LRP5最初 是通過其與LDLR(低密度脂蛋白受體)的同源性而分離的。ArrOW/LRP5/LRP6是分別具有 1678、1615和1613個氨基酸殘基的I型單跨膜蛋白質(zhì)。LRP5和LRP6在胞外域和胞內(nèi)域中 分別具有73%和64%的同一性，而Arrow同等地與LRP5和LRP6相關(guān)(40%相同)。事實 上，在培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞中，LRP6在Wg信號傳導(dǎo)過程中替換ArroW(SchWeizer等人(2003)BMCCell Biol. 4，4)，組成性活化的Arrow在哺乳動物細(xì)胞和非洲爪蟾胚胎中激活Wnt/ β -聯(lián) 蛋白信號傳導(dǎo)(Tamai 等人(2004)Nature 407 :530)。^JL如本文所用，術(shù)語“Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)病癥”指與異常Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病和 病癥，其包括但不限于癌癥，例如結(jié)腸直腸癌(CRC)、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌；其 他非致癌的增生性疾病，如增生性皮膚病(例如牛皮癬、皮炎)；骨質(zhì)疏松癥；骨關(guān)節(jié)炎；纖 維化病癥；精神分裂癥；血管病；心臟?。划惓５念^發(fā)生長或生發(fā)困難；創(chuàng)傷愈合；再生性 需要(肝、肺、肢)；和神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨海默病。Wnt信號傳導(dǎo)的異常上調(diào)與癌癥、骨 關(guān)節(jié)炎和多囊腎病相關(guān)，而Wnt信號傳導(dǎo)的異常下調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、肥胖癥、糖尿病和神經(jīng) 元變性疾病相關(guān)。如本文所用，“Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)癌癥”包括但不限于結(jié)腸直腸癌(CRC)、黑素瘤、 乳腺癌、肝癌、肺癌和胃癌。如本文所用，術(shù)語“Wnt相關(guān)癌癥”還包含惡性髓母細(xì)胞瘤和其 他原發(fā)性CNS惡性神經(jīng)外胚層瘤、橫紋肌肉瘤、肺癌、腸源腫瘤(包括但不限于食道、胃、胰 腺和膽管系統(tǒng)的癌癥)；前列腺癌和膀胱癌；結(jié)腸癌；白血病和其他血液癌癥(例如慢性淋 巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性骨髓 性白血病(CML)和骨髓增生異常綜合征(MDS))；和淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金 淋巴瘤)。如本文所用，“調(diào)節(jié)”指直接或間接地控制或影響的能力，作為非限制性實例，可以 選擇地表示抑制或刺激、激動或拮抗、妨礙或促進(jìn)以及加強(qiáng)或減弱。如本文所用，“拮抗”指抑制或阻止例如信號傳導(dǎo)途徑(如Wnt)的能力。作為實 例，通過例如干擾LRP6結(jié)合Wnt途徑成員(例如DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、SOSTU SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性Fzd相關(guān)蛋白)l-4、Wise或Wnt配體)的能力，本發(fā)明的拮抗 LRP6結(jié)合分子可以阻止經(jīng)由Wnt信號傳導(dǎo)途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)β -聯(lián)蛋白的磷酸化 和降解。如本文所用，“激動”指引起、促進(jìn)、增強(qiáng)或幫助例如信號傳導(dǎo)途徑(如Wnt)的能 力。作為實例，通過例如促進(jìn)LRP6結(jié)合Wnt途徑成員(例如DKKl (dickkopfl)、DKK2、DKK4、 SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性Fzd相關(guān)蛋白)l_4、Wise或Wnt配體)的能力，本發(fā)明 的激動LRP6結(jié)合分子可以促進(jìn)或增強(qiáng)經(jīng)由Wnt信號傳導(dǎo)途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻止β _聯(lián) 蛋白的磷酸化和降解(從而允許β-聯(lián)蛋白到達(dá)細(xì)胞核并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)。如本文所用，“骨相關(guān)病癥”包含其中骨礦物質(zhì)密度(BMD)相對于健康個體異常和 /或病理性地偏高的病癥，和其中骨礦物質(zhì)密度(BMD)相對于健康個體異常和/或病理性地 偏低的病癥。表征為高BMD的病癥包括但不限于硬化性狹窄病、Van Buchem病、骨質(zhì)增生 病癥和過度生長綜合征(SGBS)。表征為低BMD和/或骨脆性的病癥包括但不限于原發(fā)性和 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨軟化癥、骨質(zhì)疏松癥_假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征(OPPG)、成骨 不全(01)、無血管性壞死(骨壞死)、骨折和植入物愈合(牙植入物和髖植入物)和由其他 病癥引起的骨丟失(例如與HIV感染、癌癥或關(guān)節(jié)炎相關(guān)的)。其他“骨相關(guān)病癥”包括但 不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨折、關(guān)節(jié)炎和溶骨性病變的形成和/或存在。如本文所用，“纖維化病癥”指人類中的任何纖維化病癥，其特征為過度的成纖維 細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞增殖和結(jié)締組織基質(zhì)(包括膠原、纖連蛋白和糖胺聚糖(GAG))的產(chǎn)生。所述病癥包括但不限于皮膚瘢痕形成；進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病(PSS)；肝硬化；特發(fā)性和 藥理性誘發(fā)的肺纖維化；慢性移植物抗宿主??；硬皮病(局部的和系統(tǒng)性的)；佩羅尼??； 做膀胱鏡后的尿道狹窄；手術(shù)后的內(nèi)部粘連；特發(fā)性和藥理性誘發(fā)的腹膜后纖維化；和骨 髓纖維化。如本文所用，“纖維化病癥”還包括但不限于肺纖維化病癥(例如輻射誘發(fā)的纖維 化以及與哮喘、COPD和結(jié)節(jié)病相關(guān)的纖維化)；肝纖維化病癥(例如酒精性、丙肝相關(guān)性和 原發(fā)性膽汁性纖維化，以及非酒精性脂肪變性、硬化性膽管炎和源自血吸蟲病的纖維化)； 腎纖維化病癥(例如糖尿病腎病、狼瘡性腎小球硬化癥、奧爾波特綜合征和慢性腎移植排 斥)；心血管纖維化病癥(例如心肌梗塞后瘢痕形成、心臟肥大、動脈再狹窄和動脈粥樣硬 化)；皮膚纖維化病癥(例如肥厚性瘢痕形成、灼傷瘢痕形成和腎源性纖維化皮膚病)；眼 纖維化病癥(例如玻璃體視網(wǎng)膜病變和眼球后纖維化)。本發(fā)明的LRP6結(jié)合分子的“治療有效劑量”可導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重度的降低(例 如與異常高的Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)的病癥癥狀的降低(例如腫瘤細(xì)胞數(shù)目、生長速率或惡性 程度的降低)，或與異常低的Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)的病癥癥狀的降低(例如LDL和甘油三酯水 平的增加))、無疾病癥狀時期的頻率和持續(xù)時間的增加、或預(yù)防由于遭受疾病而使功能缺 損或失能。術(shù)語“個體”旨在包括患有或遭受與異常的Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病、病癥或病狀 的生物體，例如真核生物。個體的實例包括哺乳動物，例如人、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、 小鼠、兔、大鼠和轉(zhuǎn)基因非人動物。在某些實施方案中，個體是人，例如患有、具有罹患風(fēng)險 的或可能能夠患上癌癥(例如結(jié)腸癌)和其他增生性疾病、骨質(zhì)疏松和精神分裂癥、和本文 所述的其他疾病或病狀(例如Wnt信號傳導(dǎo)相關(guān)病癥)的人。如本文所用，術(shù)語“抗體”指完整抗體或其抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或 單鏈(即輕鏈或重鏈)。完整抗體是包含通過二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L) 鏈的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由 CHU CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為和輕鏈恒定區(qū) 組成。輕鏈恒定區(qū)由Q—個結(jié)構(gòu)域組成。V1^nt區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)(稱為互補(bǔ)決 定區(qū)(CDR))，其與更保守的區(qū)域(稱為框架區(qū)(FR))互相間隔。每條V1^Pt由三個CDR 和四個FR組成，它們從氨基端至羧基端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免 疫球蛋白結(jié)合至宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體 系統(tǒng)的第一成分(Clq)。如本文所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”指完整抗體的一個或多個片段，其保持 了特異結(jié)合至給定抗原(例如hLRP6)的能力。抗體的抗原結(jié)合功能可以通過完整抗體的 片段執(zhí)行。包含于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”的結(jié)合片段的實例包含F(xiàn)ab片段，其是由八、 Vh, (^和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；F(ab)2片段，其是包含通過鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩個 Fab片段(一般一個來自重鏈，一個來自輕鏈)的二價片段；由V1^P CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd 片段；由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等人 1989 Nature 341 :544_546)，其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域\和Vh由獨立的基因編碼，但可用重組方法，通過人工肽連接體將它們連接，使它們能被制備為單蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對形成單價分 子(稱為單鏈 Fv(scFv)；參見如 Bird 等人 1988 Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 =5879-5883)。這類單鏈抗體包含抗體的一個或多個“抗原結(jié) 合部分”。這些片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并以與完整抗體相同的方式， 篩選這些片段的效用。還可將抗原結(jié)合部分摻入單結(jié)構(gòu)域抗體、大抗體(maxibodies)、微抗體 (minibodies)、細(xì)胞內(nèi)抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v_NAR和雙-scFv中(參見如 Hollinger 和 Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗體的抗原結(jié)合部 分可以移植到基于多肽(如III型纖連蛋白(Fn3))的框架中(參見美國專利號6，703，199， 其描述了纖連蛋白多肽單價抗體)。抗原結(jié)合部分可以摻入包含一對串聯(lián)Fv片段(Vh-CHI-Vh-CHI)的單鏈分子中， 其與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等人1995 Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 ；和美國專利號 5，641，870)。如本文所用，術(shù)語“駱駝抗體”指完整抗體蛋白質(zhì)的一個或多個片段，所述 完整抗體蛋白質(zhì)獲得自駱駝和單峰駱駝(雙峰駝(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)科的成員，包括新大陸的成員例如美洲駝羊(Llama)種(美洲駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)和小羊駝(Lama vicugna))。可以通過基因工程獲得被鑒 定為Vhh的小的、單可變結(jié)構(gòu)域的駱駝抗體區(qū)域，以產(chǎn)生對靶標(biāo)具有高度親和力的小蛋白 質(zhì)，得到低分子量的來自抗體的被稱為“駱駝納米抗體(mmobody)”的蛋白質(zhì)。見美國專 利號 5，759，808 ；還見 Stijlemans 等人 2004 J. Biol. Chem. 279 :1256_1261 ；Dumoulin 等 人2003 Nature 424 :783_788 ；Pleschberger等人2003 Bioconjugate Chem. 14 440-448 ； Cortez-Retamozo 等人 2002 Int. J. Cancer 89 :456_62 ；禾口 Lauwereys.等人 1998 EMBO J. 17 :3512-3520。如本文所用，“分離的LRP6結(jié)合分子”指基本不含對LRP6以外的抗原具有抗原特 異性的分子的結(jié)合分子(例如分離的特異結(jié)合hLRP6的抗體基本不合特異結(jié)合hLRP6以外 抗原的抗體)。然而，分離的特異結(jié)合hLRP6的結(jié)合分子可以對其他抗原具有交叉反應(yīng)性， 例如來自其他物種的LRP6分子。若基本不含細(xì)胞物質(zhì)，則結(jié)合分子是“純化的”。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體組合物”指單分子組合物的抗體分子的制劑。單克 隆抗體組合物針對具體表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力。如本文所用，術(shù)語“人抗體”旨在包含具有其中框架區(qū)和CDR區(qū)均源自人源序列的 可變區(qū)的抗體。此外，若抗體包含恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自該人序列，例如人種系序列、或人 種系序列的突變版本。本發(fā)明的人抗體可以包含不是由人序列編碼的氨基酸殘基(例如通 過在體外隨機(jī)或位點專一誘變或通過在體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文所用， 術(shù)語“人抗體”并不旨在包含其中源自其他哺乳動物物種的種系(如小鼠)的CDR序列已 被移植至人框架序列中的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中框架區(qū)和CDR區(qū) 均源自人序列的可變區(qū)。在一個實施方案中，通過雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體，該雜交瘤包含 與永生化細(xì)胞融合的獲自轉(zhuǎn)基因非人類動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠，其具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因 和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)的B細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語“重組人抗體”包含通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的任何 人抗體，例如分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如小鼠)或從其制 備的雜交瘤的抗體；分離自經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞的抗體，例如分離自轉(zhuǎn)染瘤；分 離自重組的組合人抗體文庫的抗體；通過包括剪接人免疫球蛋白基因的全部或部分序列至 另一 DNA序列的任何其他方法而制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這類重組人抗體具有可 變區(qū)，其中框架區(qū)和CDR區(qū)源自人種系的免疫球蛋白序列。然而，在某些實施方案中，這類 重組人抗體可進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘 變)，從而使重組抗體Vh和\區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，雖然其源自和涉及人種系的 Vh和\序列，但可以不是天然存在于人中的人抗體種系的所有成分中。如本文所用，“同種型”指重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM、IgE、IgG(如 IgGl 或 IgG4))。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中與術(shù)語“特異結(jié)合至抗 原的抗體”可互換使用。如本文所用，“特異結(jié)合至LRP6”的LRP6結(jié)合分子(例如抗體或其抗原結(jié)合部分) 是指以1 X IO-7M或更小的Kd結(jié)合至LRP6的LRP6結(jié)合分子。“與抗原交叉反應(yīng)”的LRP6結(jié) 合分子(例如抗體)是指以1 X IiT6M或更小的Kd結(jié)合該抗原的LRP6結(jié)合分子。與給定抗 原“不發(fā)生交叉反應(yīng)”的LRP6結(jié)合分子(例如抗體)是指這樣的LRP6結(jié)合分子，其不能以 可檢測的水平結(jié)合至給定抗原，或者以IX IiT5M或更大的Kd結(jié)合給定抗原。在某些實施方 案中，在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定中，這類不與抗原交叉反應(yīng)的結(jié)合分子針對這些蛋白質(zhì)具有基本不 可檢測的結(jié)合。如本文所用，當(dāng)提到IgG抗體時，術(shù)語“高親和力”指抗體對靶抗原具有ICT9M或更 小的KD。若核苷酸序列被改變?yōu)槭褂蒙a(chǎn)細(xì)胞或生物中優(yōu)選的密碼子來編碼氨基酸序列， 則所述核苷酸序列稱作“優(yōu)化的”，所述生產(chǎn)細(xì)胞或生物一般是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞如 畢赤酵母(Pichia)、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞。優(yōu)化的 核苷酸序列被改造為編碼與最初的原始核苷酸序列(也稱作“親本”序列)所編碼的氨基 酸序列相同或幾乎相同的氨基酸序列。在以下部分中更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個方面。本領(lǐng)域已知用來評價分子結(jié)合至多個物種的LRP6和LRP6特定表位的能力的標(biāo)準(zhǔn) 測定，包括例如ELSA和蛋白質(zhì)印記。可使用肽表位競爭測定來測定LRP6結(jié)合分子是否結(jié) 合至LRP6的特異表位。例如，在肽的飽和濃度下，將LRP6結(jié)合分子與對應(yīng)于LRP6目的表 位的肽孵育。例如通過Biaeore 分析，對預(yù)孵育的LRP6結(jié)合分子與固定化的LRP6的結(jié)合 進(jìn)行測試。與肽的預(yù)孵育對LRP6結(jié)合的抑制表明LRP6結(jié)合分子結(jié)合至該肽表位(參見如 美國專利公開物20070072797)。還可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定來評價結(jié)結(jié)合動力學(xué)，例 如通過Biaeore 分析或通過FACS分析表觀結(jié)合。下文更詳細(xì)地描述了評估LRP6結(jié)合分 子對LRP6功能特性的影響的測定法。因此，如根據(jù)本領(lǐng)域已知的和本文所述的方法測定，“抑制” 一種或多種這些LRP6 功能特性(例如生化、細(xì)胞、生理或其他生物學(xué)活性等)的LRP6結(jié)合分子應(yīng)理解為，相對于 無結(jié)合分子時所觀察到的(例如在具有不相關(guān)的特異性的對照分子存在時)，在具體的功能特性中產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低。抑制LRP6活性的LRP6結(jié)合分子造成所測量參數(shù)降低 至少5%這樣的統(tǒng)計學(xué)顯著的降低。在某些實施方案中，與對照相比，拮抗抗體或其他LRP6 結(jié)合分子可以在所選擇的功能特性中產(chǎn)生至少10%、20%、30%或50%的降低。在一些實施方案中，通過測量Wnt信號傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平 (例如 Wnt、Wi se、DKK1、DKK2、DKK4、SOST1、SOSD1 (USAG1)、sFRP (可溶性 Fzd 相關(guān)蛋白)1 -4、 Axin或聯(lián)蛋白)來測定LRP6抑制。在其他實施方案中，生物學(xué)、生理學(xué)和/或形態(tài)學(xué) 變化表明LRP6結(jié)合分子抑制LRP6，例如抑制腫瘤細(xì)胞的生長或在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡；或 降低骨礦物質(zhì)密度。相反，激動或促進(jìn)LRP6活性的LRP6結(jié)合分子造成所測量參數(shù)增加至少5%這樣的 統(tǒng)計學(xué)顯著的增加。在某些實施方案中，與對照相比，激動抗體或其他LRP6結(jié)合分子可以 在所選擇的功能特性中產(chǎn)生至少10%、20%、30%或50%的增加。在一些實施方案中，通過測量Wnt信號傳導(dǎo)途徑下游mRNA信使或蛋白質(zhì)的表達(dá)或 穩(wěn)定性水平(例如Axin, Axin2、β -聯(lián)蛋白、VEGF、cMyc、細(xì)胞周期蛋白DU SNAIL)來測定 LRP6抑制。在其他實施方案中，生物學(xué)、生理學(xué)和/或形態(tài)學(xué)變化表明LRP6結(jié)合分子抑制 Wnt信號傳導(dǎo)，例如低于正常的骨礦物質(zhì)密度或胰島素分泌。本文所述抗-LRP6抗體包含人單克隆抗體。在一些實施方案中，將結(jié)合至LRP6的 抗體的抗原結(jié)合部分(例如Vh和\鏈)被“混合和搭配”，產(chǎn)生其他抗-LRP6的結(jié)合分子。 可以使用前述結(jié)合測定法(例如FACS、ELISA)測試這類“混合和搭配”的抗體的結(jié)合。當(dāng) 選擇Vh與特定\序列混合和搭配時，通常選擇在結(jié)構(gòu)上與其在與\配對中所代替的Vh相 似的VH。類似地，一般用結(jié)構(gòu)上類似的全長重鏈序列代替來自具體全長重鏈/全長輕鏈配 對的全長重鏈序列。類似地，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上類似的\序列代替來自具體配對的\序 列。類似地，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上類似的全長輕鏈序列代替來自具體全長重鏈/全長輕鏈配對的 全長輕鏈序列。在本文中，鑒定結(jié)構(gòu)相似性是本領(lǐng)域公知的方法。在其他方面，本發(fā)明提供包含一個或多個LRP6結(jié)合抗體的重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2 和⑶R3(以各種組合)的抗體?？紤]到這些抗體中的每一個都能夠結(jié)合至LRP6，且抗原 結(jié)合特異性主要由⑶Rl、2和3區(qū)域提供，所以可以將Vh⑶Rl、2和3序列與Vl⑶Rl、2和 3 “混合和搭配”(即來自不同抗體的CDR可以混合和搭配)。可以使用本文所述的結(jié)合測 定法(例如ELISA)來測試這類“混合和搭配”的抗體的LRP6結(jié)合。當(dāng)混合和搭配Vh⑶R 序列時，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上類似的CDR序列代替來自具體Vh序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序 列。類似地，當(dāng)混合和搭配\⑶R序列時，應(yīng)當(dāng)用結(jié)構(gòu)上類似的⑶R序列代替來自具體八 序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。在本文中，鑒定結(jié)構(gòu)相似性是本領(lǐng)域公知的方法。如本文所用，人抗體包含重鏈或輕鏈可變區(qū)或全長重鏈或輕鏈，若抗體的可變區(qū) 或全長鏈獲得自用人種系的免疫球蛋白基因作為序列來源的體系，則所述重鏈或輕鏈可變 區(qū)或全長重鏈或輕鏈?zhǔn)蔷唧w種系序列的“產(chǎn)物”或者“源自，，或“產(chǎn)生自，，具體的種系序列。 在一個這樣的體系中，人抗體產(chǎn)生于帶有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中。用目的抗原 (例如本文所述的hLRP6表位)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。或者，提供展示于噬菌體上的人免疫球 蛋白基因文庫并用目的抗原(例如本文所述的hLRP6或hLRP6表位)篩選文庫來鑒定人抗 體。
作為人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或者“源自，，或“產(chǎn)生自，，人種系免疫球蛋白 序列的人抗體可以如下鑒定將人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列比 較，并選擇在序列上與人抗體序列最接近(即最大的同一性百分?jǐn)?shù))的人種系免疫球蛋白 序列。作為具體人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或者“源自，，或“產(chǎn)生自，，具體人種系免疫 球蛋白序列的人抗體可以包含與該種系編碼的序列相比不同的氨基酸，這歸因于例如天然 存在的體細(xì)胞突變或人工位點定向突變。然而，選擇的人抗體通常具有與人種系免疫球蛋 白基因編碼的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，并包含與其他物種的種系免疫球蛋 白氨基酸序列(例如鼠種系序列)比較時人抗體被鑒定為屬于人的氨基酸殘基。在某些情 況下，人抗體在氨基酸序列上可與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少60%、70%、 80%、90%，或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。為了兩條序列的最佳比對，要考慮需要引入的缺口數(shù)和每個缺口的長度，兩條 序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是序列共享的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，同一性％=相同位置 數(shù)/總位置數(shù)χ 100)。使用PAM120權(quán)重殘數(shù)表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分，用 E.Meyers 和 W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci.，4 11-17)的算法來確定序列的比較和 兩條序列間同一性百分?jǐn)?shù)的測定，所述算法已被引入ALIGN程序(2. 0版)。通常，產(chǎn)生自具體人種系序列的人抗體的￥11或\將顯示與人種系免疫球蛋白基因 編碼的氨基酸序列不超過10個氨基酸的差異。在某些情況下，人抗體的Vh或\可顯示與 種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的 差異。駱駝抗體已經(jīng)針對大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和對人類個體的抗原性，表征了從駱駝和單峰駱駝 (雙峰駝和Calelus dromaderius)科的成員獲得的抗體蛋白質(zhì)，所述成員包括新大陸的成 員，例如美洲駝羊物種(美洲駝、大羊駝和小羊駝)。在該科哺乳動物中天然存在的某些IgG 抗體缺乏輕鏈，因此在結(jié)構(gòu)上與其他動物抗體的兩條重鏈和兩條輕鏈的典型四鏈的四級結(jié) 構(gòu)不同。參見WO 94/04678。可以通過遺傳工程獲得被鑒定為Vhh的小的、單可變結(jié)構(gòu)域的駱駝抗體區(qū)，以 產(chǎn)生對靶標(biāo)具有高親和力的小蛋白質(zhì)，得到低分子量的、產(chǎn)生自抗體的、稱作“駱駝納 米抗體”的蛋白質(zhì)。見美國專利號5，759，808 ；還見Stijlemans等人2004 J.Biol. Chem. 279 1256-1261 ；Dumoulin 等人 2003Nature 424 783~788 ；Pleschberger 等人 2003 Bioconjugate Chem. 14 440-448 ；Cortez-Retamozo 等人 2002 Int. J. Cancer 89 :456_62 ； 和Lauwereys等人1998 EMBO J. 17 :3512_3520。經(jīng)改造的駱駝抗體和抗體片段文庫可從 商業(yè)上獲自例如Ablynx，Ghent，比利時。與非人來源的其他抗體一樣，可以通過重組方法 改變駱駝抗體的氨基酸序列，獲得更類似于人序列的序列，即可以將納米抗體“人源化”。因 此，可以進(jìn)一步降低駱駝抗體對人的天然低抗原性。駱駝納米抗體具有約為人IgG分子十分之一的分子量，且蛋白質(zhì)僅具有幾納米的 物理直徑。小尺寸的一個結(jié)果是駱駝納米抗體能結(jié)合對更大的抗體蛋白質(zhì)在功能上不可見 的抗原位點的能力，即駱駝納米抗體適合用作檢測使用經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)時以其他方式隱藏 的抗原的試劑，且適合用作可能的治療劑。因此，小尺寸的另一個結(jié)果是駱駝納米抗體由于 結(jié)合至靶蛋白的溝或窄裂口中的特異位點而能夠抑制，并因此可發(fā)揮與經(jīng)典抗體相比更類似于經(jīng)典低分子量藥物功能的能力。低分子量和致密尺寸進(jìn)一步導(dǎo)致駱駝納米抗體的極端耐熱、對極端pH和蛋白水 解消化穩(wěn)定且免疫原性弱。另一結(jié)果是駱駝納米抗體易于從循環(huán)系統(tǒng)移動進(jìn)入組織甚至穿 過血腦屏障，并且能夠治療影響神經(jīng)組織的病癥。納米抗體可進(jìn)一步促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運穿過血 腦屏障。見2004年8月19日公開的美國專利公開號20040161738。這些特征與在人中的 低抗原性結(jié)合，表明巨大的治療潛能。另外，這些分子可在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中充分表 達(dá)。因此，本發(fā)明的一種特征是對LRP6具有高親和力的駱駝抗體或駱駝納米抗體。在 本文的某些實施方案中，駱駝抗體或納米抗體天然產(chǎn)生于駱駝科動物中，即，使用本文針對 其他抗體所述的技術(shù)，在用LRP6或其肽片段免疫后由駱駝產(chǎn)生?；蛘?，改造抗-LRP6駱駝 納米抗體，即以本文所述的LRP6或LRP6表位為靶標(biāo)而使用淘選方法，從展示恰當(dāng)突變的駱 駝納米抗體蛋白質(zhì)的噬菌體文庫中選擇產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^遺傳工程進(jìn)一步定制改造的納米抗 體，將在受體個體中的半衰期從45分鐘增加至兩周。雙價抗體雙價抗體是二價的、雙特異性的分子，其中V1^Pt結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，通 過連接體連接，該連接體很短因而不允許同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域間配對。Vh和\結(jié)構(gòu)域 與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如Holliger等人1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Pol jak等人 1994 Structure 2 :1121_1123)?？?以通過在同一細(xì)胞中表達(dá)具有結(jié)構(gòu)VHA-\B和Vhb-Vla 構(gòu)型)或Vu-Vhb和νω-νΗΑ(\-νΗ 構(gòu)型)的兩條多肽鏈而產(chǎn)生雙價抗體。其中大部分可以以可溶形式在細(xì)菌中表達(dá)。通過用約15個氨基酸殘基的連接體將形成雙價抗體的兩條多肽鏈連接，產(chǎn)生 單鏈雙價抗體(scDb)(見 Holliger 禾口 Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4) 128-30 ;Wu 等人 1996 Immunotechnology, 2 (1) :21_36)?？梢砸钥扇艿幕钚詥?體形式在細(xì)菌中表達(dá) scDb(見 Holliger 和 Winter, 1997Cancer Immunol. Immunother.， 45(34) 128-30 ；Wu 等人 1996 Immunotechnology, 2(1) 21-36 ；Pluckthun 禾Π Pack, 1997Immunotechnology, 3 (2) 83-105 ；Ridgway ^A 1996 Protein Eng. ,9(7) :617_21)。雙價抗體可以與Fc融合，產(chǎn)生“雙-雙價抗體”(見Lu等人2004 J. Biol. Chem.， 279(4) :2856-65)。經(jīng)改造和經(jīng)修飾的抗體可以使用具有一個或多個Vh和/或\序列的抗體作為起始材料來改造經(jīng)修飾的 抗體，從而制備本發(fā)明的抗體，所述經(jīng)修飾的抗體可具有相對于起始抗體改變的特性?？梢?通過修飾一個或兩個可變區(qū)(即V1^n/或內(nèi)，例如一個或多個CDR區(qū)內(nèi)和/或一個或 多個框架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基，來改造抗體。此外或備選地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘 基來改造抗體，例如改變抗體的效應(yīng)物功能?？梢赃M(jìn)行的一種可變區(qū)改造是⑶R移植?？贵w主要通過位于六個重鏈和輕鏈⑶R 中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列在各抗體 之間的差異更大。因為CDR序列負(fù)責(zé)大部分抗體-抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表 達(dá)載體來表達(dá)模擬特定天然存在的抗體的特性的重組抗體，所述表達(dá)載體包含來自特定 天然存在的抗體的CDR序列，所述CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的框架序歹丨J (參見例如 Riechmann 等人 1998 Nature 332 :323_327 Jones 等人 1986 Nature 321 -.522-525 ； Queen 等人 1989 Proc. Natl. Acad,見美國 86 10029-10033 ；美國專利號 5，225，539 和美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。框架序列可獲得自包含種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或出版的參考文獻(xiàn)。 例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可見于“Vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可在 因特網(wǎng)上 www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase 處獲得)中，以及 Kabat 等人 1991 Sequences of Proteins of Immunologicallnterest，第 5 版，美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson 等人 1992 J. Mol. Biol. 227 :776_798 ；和 Cox 等人 1994 Eur. J. Immunol. 24 :827_836 ；其中每篇參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此明確引用作為參考?？梢詫h⑶Rl、2和3序列和\⑶Rl、2和3序列移植至框架區(qū)，所述框架區(qū)具 有與在框架序列所源自的種系免疫球蛋白基因中的框架區(qū)相同的序列，或者可以將CDR 序列移植至與種系序列相比包含一個或多個突變的框架區(qū)。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下 框架區(qū)內(nèi)的殘基突變對維持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見例如美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370)。也可以將CDR移植入免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的多肽框架區(qū)中。適當(dāng)?shù)闹Ъ苄纬蓸?gòu) 象穩(wěn)定的框架，所述框架展示移植的殘基，以使它們形成定位的表面并結(jié)合目的靶標(biāo)(例 如LRP6)。例如，可以將⑶R移植至支架上，其中框架區(qū)基于纖連蛋白、錨蛋白、脂質(zhì)運載蛋 白、新制癌菌素、細(xì)胞色素b、CPl鋅指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z結(jié)構(gòu)域或淀粉酶抑肽(參 見例如 Nygren 禾口 Uhlen，1997 Current Opinion in Structural Biology，7，463—469)。另一種類型的可變區(qū)修飾是使Vh和/或Vl⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區(qū)中的氨基 酸殘基突變，從而改進(jìn)目的抗體的一個或多個結(jié)合特性(例如親和力)，這稱作“親和力成 熟”?？蛇M(jìn)行位點定向誘變或PCR介導(dǎo)的誘變以引入突變，并且可如本文所述在體外或體內(nèi) 測定中評估對抗體結(jié)合或其他目的功能特性的影響。可以引入保守修飾。突變可以是氨基 酸取代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區(qū)中不超過一個、兩個、三個、四個或五個的殘基。本發(fā)明的經(jīng)改造的抗體包含對其中Vh和/或\內(nèi)的框架殘基進(jìn)行了修飾例如以 改進(jìn)抗體特性的抗體。通常進(jìn)行這類框架修飾來降低抗體的免疫原性。例如，一種途徑是 將一個或多個框架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的種系序列。更具體而言，經(jīng)歷過體細(xì)胞突變的 抗體可包含與產(chǎn)生抗體的種系序列不同的框架殘基。可以通過比較抗體框架序列與產(chǎn)生抗 體的種系序列來鑒定這類殘基。為了將框架區(qū)序列回復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過例如位點 定向誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列。這類“回復(fù)突變的”抗 體也涵蓋在本發(fā)明中?？蚣苄揎椀牧硪环N類型涉及框架區(qū)內(nèi)或甚至一個或多個CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個 殘基的突變，以去除T細(xì)胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。該途徑也稱作“去免疫 化”，并且在Carr等人的美國專利公開號20030153043中進(jìn)一步詳細(xì)描述。除了在框架或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外或備選地，可以將本發(fā)明的抗體改造為在 Fc區(qū)內(nèi)包含修飾，通常來改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fc 受體結(jié)合和/或抗原依賴性的細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體可以進(jìn)行化學(xué)修飾(例如可 將一個或多個化學(xué)部分連接至抗體)，或修飾改變其糖基化，進(jìn)而改變抗體的一種或多種功 能特性。
在一個實施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)以改變鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)量，例 如增加或減少。此方法進(jìn)一步描述于Bodmer等人的美國專利號5，677，425中。改變CHl鉸 鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)，從而例如幫助輕鏈和重鏈的組裝，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，突變抗體的Fc鉸鏈區(qū)以降低抗體的生物半衰期。更明確 地，將一個或多個氨基酸突變引入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)中，使抗體相對于 天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SpA)結(jié)合而言具有受損的SpA結(jié)合。此方法在 Ward等人的美國專利號6，165，745中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一個實施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。多種途徑是可能的。例 如，美國專利號6，277，375描述了提高其體內(nèi)半衰期的IgG中的以下突變T252L、T254S、 T256F。備選地，為了提高生物半衰期，可以在CHl或CL區(qū)內(nèi)將抗體改變?yōu)榘a(bǔ)救受體結(jié) 合表位，所述補(bǔ)救受體結(jié)合表位取自IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)，如Presta等人的 美國專利號5，869，046和6，121，022中所述。還在其他實施方案中，通過用不同的氨基酸殘基代替至少一個氨基酸殘基來改變 Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)物功能。例如，可以用不同的氨基酸殘基代替一個或多個氨基酸， 使抗體針對效應(yīng)物配體具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。與之親和力 改變的效應(yīng)物配體可以是例如Fc受體或補(bǔ)體的Cl成分。此途徑在Winter等人的美國專 利號5，624，821和5，648，260中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一個實施方案中，可以用不同的氨基酸殘基代替一個或多個選自氨基酸殘基 的氨基酸，使抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。此 途徑在Idusogie等人的美國專利號6，194，551中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一個實施方案中，改變一個或多個氨基酸殘基，從而改變抗體結(jié)合補(bǔ)體的能 力。此途徑在Bodmer等人的WO 94/29351中進(jìn)一步描述。還在另一個實施方案中，通過修飾一個或多個氨基酸來修飾Fc區(qū)，以提高抗體 介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力，和/或提高抗體對Fc γ受體的親和力。此途 徑在Presta的WO 00/42072中進(jìn)一步描述。此外，已對人IgGl上針對Fc γ RI、Fc γ RII、 Fc γ RIII和FcRn的結(jié)合位點進(jìn)行了作圖，并描述了具有改進(jìn)的結(jié)合的變體(見Shields， R.L.等人 2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604)。還在另一個實施方案中，改變了抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體 (即抗體缺乏糖基化)?？梢愿淖兲腔瘉砝缣岣呖贵w對抗原的親和力?？梢酝ㄟ^例如改 變抗體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點來實現(xiàn)這類糖類修飾。例如，可以進(jìn)行導(dǎo)致一個或 多個可變區(qū)框架糖基化位點消除的一個或多個氨基酸取代，從而消除該位點上的糖基化。 這種無糖基化可提高抗體對抗原的親和力。該途徑在Co等人的美國專利號5，714，350和 6，350，861中進(jìn)一步詳細(xì)描述。此外或備選地，可以產(chǎn)生具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有減少的巖藻糖 殘基含量的低巖藻糖基化抗體，或具有增加的二等分GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。這類改變的糖基 化模式已顯示提高抗體的ADCC能力?？梢酝ㄟ^例如在具有改變的糖基化機(jī)制的宿主細(xì)胞 中表達(dá)抗體來實現(xiàn)這類糖修飾。具有改變的糖基化機(jī)制的細(xì)胞是本領(lǐng)域中已描述過的，并 且可以用作在其中表達(dá)本發(fā)明重組抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。 例如，Hang等人的EP 1，176，195描述了下述細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有功能性斷裂的編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FUT8基因，使得在該細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示低巖藻糖基化。Presta的 PCT公開號WO 03/035835描述了變體CHO細(xì)胞系Lecl3細(xì)胞，其具有降低的將巖藻糖連接 至連接Asn (297)的糖類的能力，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖基化(還 β Shields, R. L.等人 2002 J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana 等人的 WO 99/54342 描述了改造為表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β (1，4)-Ν乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶 III(GnTIII))的細(xì)胞系，使得在經(jīng)改造的細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示增加的二等分GlcNac 結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致抗體的提高的ADCC活性(也見Umana等人1999 Nat. Biotech. 17 176-180)。本發(fā)明關(guān)注的本文中抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？梢允箍贵w聚乙二醇化， 以例如提高抗體的生物(例如血清)半衰期。為了將抗體聚乙二醇化，通常將抗體或其片 段與聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物，在一個或多個PEG部分成為與抗體 或抗體片段結(jié)合的條件下反應(yīng)?？梢酝ㄟ^與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合 物)的?；磻?yīng)或烷化反應(yīng)進(jìn)行聚乙二醇化。如本文所用，術(shù)語“聚乙二醇”旨在包含用于 衍生化其他蛋白質(zhì)的任意形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚 乙二醇_馬來酰亞胺。在某些實施方案中，進(jìn)行聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。聚 乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的，并可應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。見例如Nishimura等 人的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等人的 EP 0 401 384。此外，通過引入非天然氨基酸，可以在本發(fā)明的LRP6結(jié)合多肽的任何部分中實 現(xiàn)聚乙二醇化?？梢酝ㄟ^ Deiters 等人 J Am Chem Soc 125 :11782_11783，2003 ;Wang 和 Schultz, Science 301 :964_967，2003 ；Wang 等人 Science 292 498-500, 2001 ；Zhang 等人 Science 303 :371_373，2004或美國專利號7，083，970中所述的技術(shù)引入某些非天然氨基 酸。簡言之，這些表達(dá)體系中的一些涉及位點定向誘變，從而將無義密碼子例如琥珀TAG引 入編碼本發(fā)明多肽的開放讀碼框中。然后將這類表達(dá)載體引入宿主中，所述宿主能夠利用 對所引入的無義密碼子特異且?guī)в羞x擇的非天然氨基酸的tRNA。對將部件與本發(fā)明多肽綴 合的目的而言，有益的具體非天然氨基酸包含具有乙炔和疊氮基側(cè)鏈的氨基酸。然后可以 將包含這些新氨基酸的多肽在蛋白質(zhì)中這些選定位點上聚乙二醇化。改造抗體的方法如上文所討論，可以使用抗-LRP6抗體，通過修飾全長重鏈和/或輕鏈序列、Vh和 /或\序列或與之連接的恒定區(qū)，來產(chǎn)生新的抗-LRP6抗體。例如，可以將抗體的一個或多 個⑶R區(qū)與已知的框架區(qū)和/或其他⑶R重組組合，產(chǎn)生新的、重組改造的抗-LRP6抗體。 其他修飾類型包含前一部分中所述的修飾。改造方法的起始材料是一條或多條Vh和/或 八序列，或其一個或多個⑶R區(qū)。為了產(chǎn)生經(jīng)改造的抗體，不必實際地制備(即作為蛋白質(zhì) 表達(dá))具有一個或多個V1^n/或\序列或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。相反，將序列中包 含的信息用作起始材料，產(chǎn)生源自最初序列的“第二代”序列，然后制備“第二代”序列并表 達(dá)為蛋白質(zhì)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)改變的抗體序列。改變的抗體序列所編碼 的抗體是保留了其所源自的抗LRP6抗體的一種、一些或所有功能特性的抗體，所述功能特 性包括但不限于特異地結(jié)合至LRP6、干擾LRP6結(jié)合Wnt途徑成員(例如DKKl (dickkopfl)、 DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP (可溶性 Fzd 相關(guān)蛋白)1_4、Wise 或 Wnt 配體)的 能力和調(diào)節(jié)聯(lián)蛋白磷酸化和降解。可以使用本領(lǐng)域中可獲得的和/或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)測定法(例如ELISA)來評價改變的抗體的功能特性。在本發(fā)明的改造抗體的方法的某些實施方案中，可以沿著抗-LRP6抗體編碼序列 的整體或部分，隨機(jī)地或選擇性地引入突變，并可如本文所述，針對結(jié)合活性和/或其他功 能特性(例如特異地結(jié)合至LRP6、干擾LRP6結(jié)合Wnt途徑成員(例如DKKl (dickkopfl)、 DKK2、DKK4、SOSTl、SOSDl (USAGl)、sFRP(可溶性 Fzd 相關(guān)蛋白)l_4、Wise 或 Wnt 配體)的 能力和調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白磷酸化和降解)篩選所得到的經(jīng)修飾的抗-LRP6抗體。在本領(lǐng)域中 已描述了突變方法。例如，Short的PCT公開WO 02/092780描述了使用飽和誘變、合成連 接組裝或其組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。備選地，Lazar等人的WO 03/074679描述了 使用計算篩選方法優(yōu)化抗體的物理化學(xué)特性的方法。非抗體的LRP6結(jié)合分子本發(fā)明還提供顯示抗體的功能特性，但其框架和抗原結(jié)合部分產(chǎn)生自其他多肽 (例如抗體基因編碼的多肽或通過抗體基因體內(nèi)重組產(chǎn)生的多肽以外的多肽)的LRP6結(jié)合 分子。通過定向進(jìn)化方法產(chǎn)生這些結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如LRP6結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。 見美國專利號7，115，396。具有與抗體可變結(jié)構(gòu)域的折疊類似的總體折疊(“免疫球蛋白 樣”折疊)的分子是適當(dāng)?shù)闹Ъ艿鞍踪|(zhì)。適合用于衍生抗原結(jié)合分子的支架蛋白質(zhì)包括纖 連蛋白或纖連蛋白二聚體、腱糖蛋白、N-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白、GCSF-受 體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓鞘質(zhì)膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I類 MHC,T-細(xì)胞抗原受體、⑶1、C2和VCAM-I的I_set結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)C的I_set 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)H的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白的I-set 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、 催乳素受體、干擾素_ Y受體、β "半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β "葡糖醛酸糖苷酶、轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物岐化酶、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠色熒光蛋 白、GroEL和竹芋蛋白。非抗體結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如免疫球蛋白樣折疊)可以具有小于IOkD 或大于7. 5kD的分子量(例如7. 5-10kD之間的分子量)。用來產(chǎn)生抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白 質(zhì)是天然存在的哺乳動物蛋白質(zhì)(例如人蛋白質(zhì))，并且與其所源自的蛋白質(zhì)的免疫球蛋 白樣折疊相比，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至多50% (例如至多34%、25%、20%或15%)的突變 氨基酸。具有免疫球蛋白樣折疊的結(jié)構(gòu)域一般包括50-150個氨基酸(例如40-60個氨基 酸)。為了產(chǎn)生非抗體結(jié)合分子，建立克隆文庫，其中形成抗原結(jié)合表面的支架蛋白質(zhì) 區(qū)(例如在位置和結(jié)構(gòu)上與抗體可變結(jié)構(gòu)域CDR的免疫球蛋白折疊相似的區(qū)域)中的序列 被隨機(jī)化。針對與目的抗原(例如hLRP6)的特異性結(jié)合和其他功能(例如LRP6生物活性 的抑制)來測試文庫克隆。選擇的克隆可以用作進(jìn)一步隨機(jī)化和選擇的基礎(chǔ)，產(chǎn)生對抗原 具有更高親和力的衍生物。選擇方案的一個實例描述于美國專利號6，207，446中。例如使用纖連蛋白III(kiFM)的第十模塊作為支架，產(chǎn)生高親和力結(jié)合分子。針 對1QFN3的殘基23-29、52-55和78-87處的三個⑶R樣環(huán)中的每一個構(gòu)建文庫。為了構(gòu)建 每個文庫，通過寡核苷酸合成，將與每個⑶R樣區(qū)域重疊的DNA區(qū)段編碼序列隨機(jī)化。用 于產(chǎn)生可選擇的kiFM文庫的技術(shù)描述于美國專利號6，818，418和7，115，396 ；Roberts和 Szostak, 1997Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 12297 ；美國專利號 6，261，804 ；美國專利號6，258，558 ；和 Szostak 等人 W098/31700。非抗體結(jié)合分子可以作為二聚體或多聚體產(chǎn)生，以提高對靶抗原的親合力。例如， 將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)為與抗體恒定區(qū)(Fe)的融合物，其形成Fc-Fc 二聚體。參見例如美 國專利號7, 115，396。編碼本發(fā)明抗體的核酸分子本發(fā)明的另一個方面涉及編碼本發(fā)明的LRP6結(jié)合分子的核酸分子。核酸可存 在于完整細(xì)胞中、細(xì)胞裂解液中，或者可以是部分純化或基本上純形式的核酸。當(dāng)通過標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)從其他細(xì)胞成分或其他污染物(例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))中純化出時，核酸 是“分離的”或“基本上純的”，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包含堿/SDS處理、CsCl區(qū)帶離心、柱層析、瓊 脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他方法。見F. Ausubel等編輯，1987 Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發(fā)明 的核酸可以是例如DNA或RNA，且可以包含或不包含內(nèi)含子序列。在一個實施方案中，核酸 是cDNA分子。核酸可以存在于載體例如噬菌體展示載體中，或存在于重組質(zhì)粒載體中。可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得本發(fā)明的核酸。對于雜交瘤(例如從帶有人免疫 球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤，如下文進(jìn)一步描述)表達(dá)的抗體，可以通過標(biāo)準(zhǔn) 的PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)，獲得編碼雜交瘤產(chǎn)生的抗體輕鏈和重鏈的cDNA。對于從免疫 球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術(shù))獲得的抗體，可以從文庫成員的多個噬菌體 克隆中回收編碼抗體的核酸。一旦獲得編碼Vh和\區(qū)段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這 些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這 些操作中，將編碼\或Vh的DNA片段有效連接至另一 DNA分子，或有效連接至編碼另一蛋 白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的片段。如本文所使用，術(shù)語“有效連接”是指兩條DNA片 段以功能性方式接合，例如使得兩條DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合讀框，或者使得 蛋白質(zhì)在期望的啟動子控制下表達(dá)。可以通過將編碼Vh的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2和CH3)的另一 DNA分子有 效連接，將分離的編碼Vh區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列為本領(lǐng) 域已知(見例如Kabat等人 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，NIH Publication No. 91-3242)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增 獲得包含這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或IgD恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，編碼Vh的DNA可以有效連接至僅編碼重鏈CHl恒 定區(qū)的另一 DNA分子?？梢酝ㄟ^將編碼Vl的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA分子有效連接，將分 離的編碼\區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的 序列為本領(lǐng)域己知(見例如 Kabat 等人 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，NIH Publication No. 91-3242)，并且可以通過 標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得包含這些區(qū)域的DNA片段。輕鏈恒定區(qū)可以是κ和λ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和\的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基 酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段有效連接，使得％和\序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白 質(zhì)，其中Vl和Vh區(qū)通過柔性連接體連接(見例如Bird等人1988 Science 242 =423-426 ；Huston等人 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ；McCafferty 等人 1990 Nature 348 552-554)。單克降抗體的產(chǎn)牛可以通過多種技術(shù)來產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，所述技術(shù)包含常規(guī)的單克隆抗體方 法，例如Kohler和Milstein (1975 Nature, 256 495)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)，或者使用文 庫展示方法，例如噬菌體展示。用于制備雜交瘤的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是良好建立的方法。 免疫方案和分離用于融合的經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合伙伴(例如鼠骨 髓瘤細(xì)胞)和融合流程也是已知的?？梢愿鶕?jù)按上述制備的鼠單克隆抗體的序列，制備本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗 體?？蓮哪康氖箅s交瘤獲得編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA，并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù) 將其改造為包含非鼠(例如人)的免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本 領(lǐng)域已知的方法(見例如Cabilly等的美國專利號4，816，567)，將鼠可變區(qū)連接至人恒定 區(qū)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入人的框架中。參見 例如美國專利號 5，225，539 和美國專利號 5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 和 6，180，370。在某個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？梢允褂脦в腥嗣庖呦到y(tǒng)部 分而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生這類針對LRP6的人單克隆抗 體。這些轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠，并且在 本文中集體稱作“人Ig小鼠”的小鼠。HuMAb mouse (Medarex, Inc.)包含人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)以 及使內(nèi)源性μ和κ鏈基因座失活的定向突變，所述微基因座編碼未重排的人重鏈(μ和 Y)和κ輕鏈免疫球蛋白序列(見例如Lonberg等人1994 Nature 368(6474) :856_859)。 因此，小鼠顯示降低的小鼠IgM或κ表達(dá)，并且在免疫應(yīng)答中，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基 因經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆(Lonberg，N.等，1994，見 上文；綜述于 Lonberg, N. , 1994 Handbook of Experimental Pharmacologyl 13 :49_101 ； Lonberg, N.禾口 Huszar, D.,1995 Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 ； 禾口 Harding, F.禾口 Lonberg, N.，1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764 :536_546)。HuMAb 小鼠的制備和應(yīng)用，以及這類 小鼠帶有的基因組修飾進(jìn)一步描述于Taylor，L.等人1992 Nucleic Acids Research20 6287-6295 ；Chen, J.等人 1993 International Immunology 5 647-656 ；Tuaillon 等 人 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 3720-3724 ；Choi 等人 1993 Nature Genetics 4 117-123 ；Chen, J.等人 1993 EMBO J. 12 :821_830 ；Tuaillon 等人 1994 J. Immunol. 152 2912-2920 ；Taylor,L.等人 1994International Immunology 579-591 ；和 Fishwild，D.等 人1996 NatureBiotechnology 14 :845_851，所述所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此明確地整體引 入作為參考。還參見美國專利號 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 789，650、 5，877，397、5，661，016、5，814，318、5，874，299 和 5，770，429，均屬于 Lonberg 和 Kay ； Surani 等的美國專利號 5，545，807 ；PCT
發(fā)明者F·從, S·M·蘭瓦拉, S·古特, S·埃滕伯格 申請人:諾瓦提斯公司