專利名稱：被導(dǎo)靶的干擾素顯示強(qiáng)的細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性的制作方法
被導(dǎo)靶的干擾素顯示強(qiáng)的細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年9月21日提交的USSN60/994，717的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所述申請(qǐng) 通過引用全文并入本文。關(guān)于政府支持的聲明本發(fā)明是在國(guó)立衛(wèi)生學(xué)院提供的政府資助No. CA87990的支持下完成的。政府對(duì) 本發(fā)明擁有一定權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。發(fā)明提供了具有顯著抗癌活性的嵌合構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
盡管可以檢測(cè)到抗腫瘤相關(guān)抗原的自發(fā)免疫反應(yīng)(TAAs) (Hrouda et al. (1999) Semin. Oncol. 26 :455_471) (Disis et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15 :3363_3367)，但導(dǎo)致 疾病的惡性細(xì)胞不能引發(fā)免疫反應(yīng)，從而進(jìn)行排異。許多研究已表明有可能通過向腫瘤 細(xì)胞中引入諸如細(xì)胞因子的免疫刺激分子和協(xié)同刺激分子來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性 (Dranoff and Mulligan (1995) Adv. Immunol. 58 417-454 ；Hrouda et al. (1999) Semin. Oncol. 26 455-471 ；Hurford et al. (1995)Nat. Genet. 10 :430_435)；但高效的基因轉(zhuǎn)移 仍然具有挑戰(zhàn)性。此外，要根除殘存的癌癥細(xì)胞可能需要針對(duì)那些無法直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移 的大范圍內(nèi)分散的微轉(zhuǎn)移腫瘤沉積。先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)對(duì)于提供抗感染性病原菌和腫瘤的保護(hù)作 用都是必需的。先天性和獲得性免疫之間的交流通過細(xì)胞和細(xì)胞因子間的相互作用進(jìn) 行調(diào)節(jié)。先天免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以直接或間接地激活獲得性免 疫反應(yīng)中的細(xì)胞，并且在引發(fā)保護(hù)性抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用(Belardelli and Ferrantini (2002) Trends Immunol. 23 201-208)。激活先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵是檢測(cè)到導(dǎo)致 釋放促炎癥細(xì)胞因子(諸如IFN-α、TNF-α和IL_1)的細(xì)菌產(chǎn)物或“危險(xiǎn)”信號(hào)。IFN-α是具有強(qiáng)大抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的促炎癥細(xì)胞因子，并且是樹突狀細(xì) 胞(DCs)分化和活性的刺激劑(Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191 :1777_1788)。I 型 IFNs (IFN- α 和 IFN-β)對(duì)免疫反應(yīng)有多方面影響(Theofilopoulos et al. (2005)Annu. Rev. Immunol. 23 :307-336)。IFN-α 在 Thl 細(xì)胞的分化(Finkelman et al. (1991) J.Exp. Med. 174 1179-1188)和應(yīng)答特異抗原時(shí)CD8+T細(xì)胞的長(zhǎng)期存活(Tough et al. (1996) Science 272 1947-1950)中發(fā)揮作用。多項(xiàng)研究顯示IFNs 在動(dòng)物模型(Ferrantini et al. (1994) J. Immunol. 153 4604-4615)以及癌癥患者(14. Gutterman et al. (1980) Ann. Intern. Med. 93 399-406) 中也能夠發(fā)揮抗腫瘤效果。除了增強(qiáng)獲得性抗腫瘤免疫反應(yīng)，IFN-α還能夠提高腫瘤 抑制基因 P53 的表達(dá)(Takaoka et al. (2003) Nature 424 :516_523)、抑制血管發(fā)生 (Sidky and Borden(1987)Cancer Res. 47 :5155_5161)以及在腫瘤細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡 (Rodriguez-Villanueva and McDonnell (1995) Int. J. Cancer 61:110-11417)。雖然這些性能提示IFN-α應(yīng)當(dāng)是治療癌癥的有效治療劑，其較短的半衰期和系統(tǒng)毒性限制了它的 應(yīng)用。發(fā)明概述在多項(xiàng)實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即將干擾素附著到導(dǎo)靶部分(例如 能夠特異和/或優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞上的或者與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物的分子)上能夠顯著地提高干 擾素的治療效果，并且似乎能夠降低其系統(tǒng)毒性。相應(yīng)地，在多項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 了包含附著于導(dǎo)靶部分的干擾素的構(gòu)建體，以及這類構(gòu)建體在某些靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞) 的生長(zhǎng)或分化的特異和/或優(yōu)先抑制或者甚至殺傷中的用途。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著于 能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的導(dǎo)靶部分的干擾素(例如，干擾素_α、干擾素-β、干擾 素_ Y等)，當(dāng)所述構(gòu)建體與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被殺死或者其生長(zhǎng)或分化被抑 制。在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著于能夠結(jié)合細(xì)胞表 面標(biāo)記物或細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的導(dǎo)靶部分的干擾素，其中導(dǎo)靶部分不是通過(Gly4Ser)3(SEQ IDNO 31)接頭附著于干擾素的。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，干擾素是1型干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施 方案中，干擾素是2型干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，干擾素是干擾素α、干擾素-β或干 擾素-Y。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體。在某些實(shí)施方 案中，導(dǎo)靶部分與干擾素化學(xué)偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分通過肽接頭與干擾素連 接。在某些實(shí)施方案中，所述肽接頭長(zhǎng)度低于15、低于14、低于12、低于11、低于10、低于 9、低于8、低于7、低于6、低于5、低于4、低于3或低于2個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，接 頭長(zhǎng)度為15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，接頭 不是(Gly4Ser)3 (SEQ IDNO 31)。在某些實(shí)施方案中，接頭是抗蛋白質(zhì)水解或者基本上抗 蛋白質(zhì)水解的接頭。某些實(shí)施方案中，肽接頭是Gly4SeHSEQ ID NO :32)。在某些實(shí)施方 案中，接頭包含表2中的氨基酸序列或者由其組成。某些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是重組表達(dá) 的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，抗體特異結(jié)合選自EGFR、HER4、HER3、HER2/neu、MUC-I、 G250、間皮素(mesothelin)、gplOO、酪氨酸酶和MAGE的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶 部分是結(jié)合CD20的抗體。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是單鏈抗體，所述單鏈抗體包含來自 選自抗CD20(利妥昔單抗(Rituximab))、替伊莫單抗(Ibritumomabtiuxetan)、托西莫單抗 (tositumomab) > AME-133ν> Ocre 1 izumab > Ofatumumab > TRU-015 > IMMU-106 的CDRs 和/或可變區(qū)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是結(jié)合HER2的抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體 是C6抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體包含VH和VL CDRs或C6MH3-B1的VH和VL。在多項(xiàng) 實(shí)施方案中，抗體是 IgG(例如 IgGl、IgG3 等)、IgE、單鏈Fv(scFv)、FAB、(Fab，)2、(ScFv)2 等。某些實(shí)施方案中，抗體是選自 Rituxan、IF5、Bl、lH4、CD19、B4、B43、FVS191、hLL2、LL2、 RFB4、M195、HuM195、AT13/5、赫賽汀(HERCEPTIN) 、4D5、HuCC49、HUCC39 Δ CH2 Β72. 3、 12C10、IG5、H23、BM-2、BM-7、12H12、MAM-6和HMFG-I的抗體。某些實(shí)施方案中，抗體是能 夠結(jié)合EGF受體家族成員的抗體。某些實(shí)施方案中，抗體選自C6. 5、C6ML3-9、C6MH3-B1、 C6-B1D2、F5、HER3. A5、HER3. F4、HER3. HI、HER3. H3、HER3. E12、HER3. B12、EGFR. E12、EGFR. C10、EGFR. Bl 1、EGFR. E8、HER4. B4、HER4. G4、HER4. F4、HER4. A8、HER4. B6、HER4. D4、HER4. D7、HER4. D1UHER4. D12、HER4. E3、HER4. E7、HER4. F8 和 HER4. C7。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建 體包含附著了干擾素的抗HER2IgGl抗體。
發(fā)明還提供了藥物制劑。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，所述制劑包含的嵌合構(gòu)建體含有附 著于導(dǎo)靶部分的干擾素。某些實(shí)施方案中，嵌合構(gòu)建體包含以上(和/或下文)描述的構(gòu) 建體(例如抗CD20-干擾素和抗HER2-干擾素等)。在某些實(shí)施方案中，制劑是單位劑量的 制劑。在某些實(shí)施方案中，制劑配制成用于非胃腸道給藥。某些實(shí)施方案中，制劑配制成經(jīng) 由選自口服、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、直接腫瘤給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、透皮給藥以 及皮下儲(chǔ)庫(kù)式給藥的途徑進(jìn)行給藥。多項(xiàng)實(shí)施方案中提供了抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的方法。所述方法一般包括將 癌細(xì)胞與本文描述的嵌合構(gòu)建體進(jìn)行接觸。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞，和/或細(xì) 胞處于實(shí)體瘤中。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是B細(xì) 胞淋巴瘤。某些實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞是由選自B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸 癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系 統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、黑素瘤、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、腎癌、膽管癌、小 腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪瘤、睪丸癌以及惡性纖 維組織細(xì)胞瘤的癌癥產(chǎn)生的細(xì)胞。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，接觸包括將嵌合部分系統(tǒng)地給予哺 乳動(dòng)物。某些實(shí)施方案中，接觸包括將嵌合部分直接給予腫瘤部位。某些實(shí)施方案中，接觸 包括靜脈內(nèi)給予嵌合部分。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是人或非人哺乳動(dòng)物中的癌細(xì)胞。
某些實(shí)施方案中，提供了編碼本文描述的嵌合構(gòu)建體的核酸。在多項(xiàng)實(shí)施方案中， 核酸編碼的融合蛋白包含附著于抗EGFR家族成員抗體、抗HER2抗體、抗C6單鏈抗體或抗 CD20單鏈抗體的干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸所編碼的干擾素是I型干擾素。某些實(shí)施 方案中，干擾素是IFN-α或干擾素-β。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸編碼的抗體包含C6MH3-B1 的VH和VL CDRs。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸編碼將抗體附著到干擾素上的肽接頭(例如象 本文描述的)。某些實(shí)施方案中，核酸編碼抗CD20(利妥昔單抗)的CDRs和/或可變區(qū)。發(fā)明還提供了包含以上描述的編碼嵌合構(gòu)建體的核酸的細(xì)胞。某些實(shí)施方案中， 所述細(xì)胞表達(dá)嵌合構(gòu)建體。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，發(fā)明提供了本文描述的嵌合構(gòu)建體在制備用于抑制癌細(xì)胞生 長(zhǎng)和/或增殖的藥物中的用途。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排除利用了美國(guó)專利申請(qǐng)公開 2002/0193569A1中公開的抗體的構(gòu)建體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排 除引入了抗CD20抗體的構(gòu)建體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排除引入了 與任何以下靶分子結(jié)合的抗體的構(gòu)建體⑶19、⑶20、⑶22、⑶33、⑶38、EGF-R、HMl. 24、磷 脂酰絲氨酸抗原、HER-2、TAG-72和/或MUC-1。某些實(shí)施方案中，本文描述的構(gòu)建體可以用 于治療諸如多發(fā)性硬化癥、HCV介導(dǎo)的血管炎等的病變。定義術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換用于氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù) 語適用于其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的那些氨 基酸聚合物，也適用于天然的氨基酸聚合物。術(shù)語還包括將構(gòu)成多肽的氨基酸連接起來的 常規(guī)肽接頭的變體。優(yōu)選的“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”是α碳通過肽鍵連接的氨基酸鏈。 因此鏈的一端(氨基端)的末端氨基酸帶有游離的氨基，而鏈另一端(羰基端)的末端氨 基酸帶有游離羰基。術(shù)語“氨基端”(縮寫為N端)用于本文是指肽氨基末端的氨基酸上的游離α-氨基基團(tuán)或者肽內(nèi)其他位置上的氨基酸的α-氨基基團(tuán)(參與肽鍵時(shí)是亞氨基基 團(tuán))。類似地，術(shù)語"羰基端"是指肽的羰基端上的游離羰基基團(tuán)或者肽內(nèi)其他位置上的氨 基酸的羰基基團(tuán)。肽還包括基本上任何多聚氨基酸，包括但不限于肽模擬物，比如通過醚鍵 而不是酰胺鍵連接的氨基酸。“抗體”用于本文是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼的 一或多個(gè)多肽所構(gòu)成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒 定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈劃分為κ或λ。重鏈劃分為Y、μ、α、 δ或ε，它們又繼而分別定義了免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0 典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元已知包含四體。每個(gè)四體由兩對(duì)相同的多肽 鏈構(gòu)成，每對(duì)含有一個(gè)“輕鏈”(約25kD)和一個(gè)“重鏈”(約50-70kD)。每個(gè)鏈的N端界定 了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的有大約100到110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈和 可變重鏈(Vh)分別指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域?？贵w的存在方式包括完整的免疫球蛋白，或者是通過用多種肽酶消化或者重新表 達(dá)產(chǎn)生的許多已被很好定性的片段。因此，例如胰蛋白酶消化抗體鉸鏈區(qū)中的二硫鍵產(chǎn)生 F(ab)' 2，F(xiàn)ab 二聚體，其自身是通過二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈?？梢栽跍睾蜅l件下還原 F(ab)' 2，將鉸鏈區(qū)中的二硫鍵打開從而將(Fab' )2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab'單體。Fab'單 體基本上就是 Fab，和部分鉸鏈區(qū)(參見 Fundamental Immunology, W. Ε. Paul, ed.，Raven Press, N. Y. (1993)中對(duì)其他抗體片段的更詳細(xì)描述)。雖然多種抗體片段是根據(jù)完整抗體 的消化來定義的，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這類Fab'片段可以通過化學(xué)或者利用重組DNA方 法重新合成。因此，術(shù)語抗體用于本文還包括通過對(duì)完整抗體進(jìn)行修飾或者利用重組DNA 方法重新合成所產(chǎn)生的抗體片段包括，但不限于Fab’ 2、IgG, IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、納米 抗體、迷你抗體(imibodies)和二體(diabodies)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，優(yōu)選的抗體包括，但 不限于Fab’ 2、IgG, IgM、IgA、IgE和單鏈抗體，更優(yōu)選單鏈Fv (scFv)抗體，其中可變重鏈和 可變輕鏈被(直接或經(jīng)由肽接頭)連接在一起形成連續(xù)的多肽。某些實(shí)施方案中，用于構(gòu)建本發(fā)明的抗體和片段可以是雙特異性的。雙特異性抗 體或片段可以是多種構(gòu)型的。例如，雙特異性抗體可能類似于單個(gè)抗體(或抗體片段)，但 具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，可以通過化學(xué)技術(shù)(Kranz et al. (1981)Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，78 :5807)、“polydoma，，技術(shù)(參見例如 U. S. Pat. No. 4，474，893)或者重組DNA技術(shù)生產(chǎn)雙特異性抗體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性 抗體可以具有對(duì)至少兩種不同表位，其中至少一個(gè)是腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合特異性。在多項(xiàng) 實(shí)施方案中，抗體和片段還可以是異源抗體。異源抗體是連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)抗體，或 者抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)，每個(gè)抗體或片段具有不同的特異性?！翱乖Y(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部位”是指免疫球蛋白分子中參與抗原結(jié)合的部分。抗 原結(jié)合位點(diǎn)是由重鏈(H)和輕鏈(L)的N末端可變區(qū)(V)的氨基酸殘基形成的。重鏈和輕 鏈V區(qū)內(nèi)的三個(gè)高度分歧的片段稱為“高變區(qū)”，該區(qū)介于更保守的稱為“框架區(qū)”或“FRs” 的旁側(cè)片段之間。因此，術(shù)語“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高變區(qū)之間和高變區(qū)鄰近 的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個(gè)高變區(qū)和重鏈的三個(gè)高變區(qū)在三維空間中相對(duì) 對(duì)方形成抗原結(jié)合“表面”。這個(gè)表面介導(dǎo)靶抗原的識(shí)別和結(jié)合。每個(gè)重鏈和輕鏈的三個(gè)高 變區(qū)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDRs”，并通過例如Kabat et al. Sequences of proteins ofimmunological interest,4th ed. U. S. Dept. Health andHuman Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987)進(jìn)行表征。術(shù)語“干擾素”是指全長(zhǎng)干擾素，或者基本保持全長(zhǎng)野生型干擾素的生物活性(例 如保持全長(zhǎng)抗體至少80 %、優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選至少95 %、98 %或99 % )的干擾素片 段(截短的干擾素)或干擾素突變體。干擾素包括I型干擾素(例如，干擾素-α和干擾 素-β)和II型干擾素(例如，干擾素-Y)。所述干擾素(例如IFN-α)可以是來自幾乎 任何哺乳動(dòng)物物種。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，干擾素來自選自人、馬類、牛類、嚙齒動(dòng)物、豬類、 兔類、貓類、犬類、鼠、山羊、羊類、非人靈長(zhǎng)類等的物種。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，突變干擾素包 含一或多個(gè)氨基酸取代、插入和/或缺失。抗-HER2/neu抗體是特異或優(yōu)先結(jié)合HER2/neu受體的抗體。 術(shù)語“個(gè)體(subject) ”用于本文是指人或非人動(dòng)物，包括但不限于貓、狗、馬、豬、 牛、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。術(shù)語“C6抗體”用于本文是指由C6. 5衍生的抗體，其序列在例如美國(guó)專利 6，512，097和5，977，322，以及PCT公開WO 97/00271中明確提供。C6抗體優(yōu)選對(duì)HER2/neu 的結(jié)合親和力在大約1.6X10_8或以上。某些實(shí)施方案中，C6抗體來源于篩選噬菌體展示 文庫(kù)(對(duì)c-erbB-2/HER2/neu親和力)，所述文庫(kù)中已知的C6可變重鏈(Vh)與多個(gè)可變輕 鏈聯(lián)合表達(dá)，或者反過來，已知的C6可變輕鏈與多個(gè)可變重鏈聯(lián)合表達(dá)。C6抗體還包 括象例如美國(guó)專利6，512，097和5，977，322，以及PCT公開WO 97/00271中描述的，通過向 可變重鏈或可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rl、CDR2或⑶R3)中引入突變而產(chǎn)生的那些抗體。此 夕卜，C6抗體包括這些應(yīng)用于C6. 5及其衍生物的修飾方法的任意組合所產(chǎn)生的那些抗體?！翱?EGFR家族抗體”是指特異結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員的抗體(例如，結(jié) 合ErbB-I (又稱為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、ErbB_2 (在人中又稱為HER2，在嚙齒動(dòng)物中稱 為neu)、ErbB-3 (又稱為HER3)和/或ErbB_4 (又稱為HER4)的抗體)。示范性的抗-EGFR 家族抗體包括，但不限于諸如 C6. 5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3. A5、HER3. F4、 HER3. HUHER3. H3、HER3. E12、HER3. B12、EGFR. E12、EGFR. C10、EGFR. B1UEGFR. E8、HER4. B4、 HER4. G4、HER4. F4、HER4. A8、HER4. B6、HER4. D4、HER4. D7、HER4. Dl 1、HER4. D12、HER4. E3、 HER4. E7、HER4. F8以及HER4. C7等抗體(參見，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開US 2006/0099205A1 和US2004/0071696A1，這兩份文獻(xiàn)均通過弓I用并入本文)。單鏈Fv( “sFv”或“scFv”)多肽是共價(jià)連接的VH:八異二聚體，在某些實(shí)施方 案中可以由包含直接或者通過肽編碼接頭連在一起的Vh-和V^編碼序列的核酸表達(dá)產(chǎn) 生。Huston，et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA，85 :5879_5883 (1988)。有多種結(jié)構(gòu)能將天 然地聚集在一起但化學(xué)結(jié)構(gòu)各自獨(dú)立的輕鏈和重鏈多肽由抗體V區(qū)轉(zhuǎn)化為sFv分子，它們 能夠折疊成與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上類似的三維結(jié)構(gòu)。參見例如美國(guó)專利5，091，513、 5，132，405 和 4，956，778?！阿?0”是成熟B細(xì)胞表面上的非糖基化的磷酸蛋白(參見例如Cragget al. (2005) Curr. Dir. Autoimmun.，8 140-174) 該蛋白還可見于B細(xì)胞淋巴瘤、毛細(xì)胞白血 病、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、皮膚/黑素瘤癌癥干細(xì)胞等。短語“抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖”指降低癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和/或增殖速度。 某些實(shí)施方案中，這包括癌細(xì)胞的死亡(例如通過細(xì)胞凋亡)。某些實(shí)施方案中，該術(shù)語還指抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和/或增殖，和/或誘發(fā)腫瘤體積下降或者消除腫瘤。術(shù)語“癌癥標(biāo)記物”指這樣一些諸如蛋白、碳水化合物、糖蛋白等的生物分子，所述分子專門或者優(yōu)勢(shì)地或者有區(qū)別地在癌細(xì)胞上表達(dá)，和/或被發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞相關(guān)，因此 可以作為癌癥的優(yōu)選或特異的目標(biāo)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，優(yōu)勢(shì)表達(dá)可以是與生物體中其他 細(xì)胞相比的優(yōu)勢(shì)表達(dá)，或者是生物體中特定區(qū)域內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表達(dá)(例如，在特定器官或組織 中)。附圖簡(jiǎn)述圖IA-

圖10顯示了本文描述的多種構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列。圖IA顯示了 抗-HER2/neu IgG3 重鏈-IFN-α (SEQ ID NO 1)和抗 _HER2/neu IgG3 輕鏈的氨基酸序 列(SEQ ID NO :2)。單下劃線的是接頭，雙下劃線的是鼠IFN-α，無下劃線的是抗-HER2/ neu ；圖 IB α CD20 輕鏈，核酸(SEQ ID NO :3)，氨基酸序列(SEQ ID NO 4)；圖 IC α CD20-IgG3-muIFNa Gly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID NO :5)，氨基酸序列(SEQ ID NO 6)；圖 ID a CD20-IgG3-muIFNa α 螺旋接頭，核酸(SEQ ID NO :7)，氨基酸序列(SEQ ID NO 8)； 圖lE:aCD20-IgG3-huIFNaGly4Ser接頭，核酸(SEQ ID NO :9)，氨基酸序列(SEQID NO: 10)；圖 lF:aCD20-IgG3_huIFNa α 螺旋接頭，核酸(SEQ IDNO 11)，氨基酸序列(SEQ ID NO 12)；圖 IG a CD20-IgGl_muIFN a Gly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID NO :13)，氨基酸序列(SEQ ID NO 14)；圖 IH : a CD20-IgGl-muIFNa α 螺旋接頭，核酸(SEQ ID N0:15)，氨基酸序列 (SEQID NO 16)；圖 II : a CD20_IgGl_huIFNa Gly4Ser接頭，核酸(SEQ IDNO : 17)，氨基酸序 列(SEQ ID NO 18)；圖 IJ : a CD20-IgGl_huIFN α α 螺旋接頭，核酸(SEQ ID NO :19)，氨基 酸序列(SEQ ID NO 20)；圖 IK : a Her2/neu 輕鏈核酸(SEQ ID N0:21)，氨基酸序列(SEQ ID NO 22)；圖 IL : a Her2/neu-IgGl_muIFN a GlySer接頭，核酸序列(SEQ ID NO :23)，氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO 24)；圖 IM : a Her2/neu-IgGl_muIFN α α 螺旋接頭，核酸序列(SEQ ID N0:25)，氨基酸序列(SEQ ID NO 26)；圖 IN : a Her2/neu-IgGl_huIFN a GlySer 接頭，核酸 序歹丨J (SEQ ID N0:27)，氨基酸序列(SEQ ID NO 28)；圖 10 : a Her2/neu-IgGl_huIFN a a 螺旋接頭，核酸序列(SEQ ID N0:29)，氨基酸序列(SEQ ID NO :30)。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本圖中 顯示的構(gòu)建體帶有特定接頭，在某些實(shí)施方案中，可以用文中描述的其他接頭代替。圖2A、圖2B、圖2C和圖2D圖示了抗-HER2/neu IgG3_IFN_a的構(gòu)建和表征。圖2A: 抗-HER2/neu-IgG3-IFN-a的示意圖。實(shí)心區(qū)域代表抗_HER2/neu可變區(qū)?？招膮^(qū)域代表 人IgG3和κ恒定區(qū)。白色圓形區(qū)域代表鼠IFN-a。圖2B 純化的抗-HER2/neu_IgG3 (泳 道 1 禾口 4)、IgG3-IFN- a (泳道 2 和 5)和抗-HER2/neu-IgG3_IFN- a (泳道 3 和 6)在非還 原(泳道1-3)或還原(泳道4-6)條件下的SDS-PAGE。分子量標(biāo)記蛋白示于每個(gè)凝膠的 左側(cè)。圖 2C 抗-HER2/neu-IgG3 和抗-HER2/neu-IgG3-IFN-a 結(jié)合 HER2/neu。表達(dá)高 水平人HER2/neu的鼠結(jié)腸細(xì)胞系CT26/HER2與帶有或不帶有肝素的抗-HER2/neu-IgG3、 IgG3-IFN-a或抗-HER2/neu-IgG3_IFN-α反應(yīng)，然后與PE標(biāo)記的兔抗人IgG反應(yīng)。破折 號(hào)線代表不加入重組蛋白時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)。圖2D :IFN-a標(biāo)準(zhǔn)和不同IFN_a融合蛋白抗 VSV 的保護(hù)活性。制備 100 μ IlU IFN-α 標(biāo)準(zhǔn)、0. 21ng(IOpM)抗-HER2/neu-IgG3_IFN-a、 0. 21ng (IOpM) IgG3_IFN_a，或 0. 17ng (IOpM)抗-HER2/neu_IgG3 的稀釋液，并加給 L-929 細(xì)胞。溫育24小時(shí)后，加入4000PFU的VSV。48小時(shí)后，用結(jié)晶紫染料將活細(xì)胞染色，經(jīng)甲 醇溶解，用ELISA檢測(cè)儀于570nm檢測(cè)溶解的染料。
圖3A和圖3B顯示不同IFN- α融合蛋白和rIFN- α的體內(nèi)抗腫瘤活性。C3H/HeN 小鼠用1X 10338C13/HER2細(xì)胞s. c.(皮下)攻擊，在腫瘤攻擊后1、3和5天用2.5yg(圖 3A)或Iyg(圖3B)指定蛋白i. p.(靜脈)處置。測(cè)量每只小鼠的腫瘤體積。觀察小鼠，直 至s. c.腫瘤直徑達(dá)到15mm。圖4々和圖48顯示0^-0上融合IgG3提高了它的抗腫瘤活性并且提高了其 體內(nèi)半衰期。圖4A 小鼠在腫瘤攻擊后1和3天用9600U的rIFN-α或9600U(4y g)的 IgG3-IFN-a處置。跟蹤動(dòng)物的存活情況，并在s. c.腫瘤直徑達(dá)到15mm時(shí)處死。圖4B 將 三只一組的 C3H/HeN 小鼠 i. p.注射 66 μ Ci125I-標(biāo)記的 rIFN- a、IgG3_IFN- α 或抗-HER2/ neu-IgG3-IFN-a。在注射125I-標(biāo)記的蛋白后的不同間隔用小鼠全身放射性計(jì)數(shù)器測(cè)量殘 余放射性。結(jié)果代表三只小鼠的平均值。條帶，SD。圖5A、圖5B、圖5C和圖5D顯示IFN-a融合蛋白抑制了細(xì)胞增殖并體外誘發(fā) 38C13/HER2的細(xì)胞凋亡。IFN-α融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖。與不同劑量的不同融合蛋 白溫育48小時(shí)后，利用MTS檢測(cè)來測(cè)量活的38C13/HER2(圖5A)或38C13(圖5B)細(xì)胞。 這些試驗(yàn)一式三份進(jìn)行了三次；誤差條，測(cè)量值的SD。圖5C:IFN-a融合蛋白誘導(dǎo)38C13/ HER2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。簡(jiǎn)而言之，將1X 10638C13/HER2細(xì)胞與I nM指定蛋白溫育72h。然 后將細(xì)胞清洗，用Alexa Fluor 488、膜聯(lián)蛋白(annexin) V和PI染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分 析。角落處顯示了位于每個(gè)象限中的細(xì)胞的百分比。圖5D:IFN-a融合蛋白抑制了存活的 38C13/HER2細(xì)胞的增殖。簡(jiǎn)單來說，將1 X 10638C13/HER2細(xì)胞用2. 5 μ M CFSE標(biāo)記，并立 即固定(破折號(hào)線)，或者用PBS(細(xì)黑線)、或InM抗-HER2/neu IgG3 (細(xì)黑線、與PBS對(duì) 照重疊)、IgG3-IFN- α (粗黑線)或抗-HER2/neu-IgG3-IFN- α (黑色區(qū)域)處理48h。然 后將細(xì)胞清洗，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。通過選通活細(xì)胞群獲得圖譜。 圖6A、6B和6C顯示IFN- α融合蛋白在38C13/HER2細(xì)胞中誘導(dǎo)了 STATl活 化。簡(jiǎn)單來說，IX 10738C13/HER2 細(xì)胞用 1000U/ml 抗-HER2/neu-IgG3_IFN-α (圖 6Α)或 IgG3-IFN-a (圖6B)處理指定的時(shí)間。細(xì)胞裂解物經(jīng)SDS-PAGE分離，并利用多克隆兔抗磷 STATl通過Western印跡分析。為了證實(shí)蛋白樣品上樣量相同，用抗GAPDH的偶聯(lián)HRP的兔 多克隆抗體檢測(cè)印跡。圖6C 對(duì)每個(gè)指定時(shí)間點(diǎn)，用抗GAPDH的強(qiáng)度將抗磷STATl的強(qiáng)度 歸一化，得到的數(shù)值除以O(shè)時(shí)間點(diǎn)處的數(shù)值得到STATl的活化倍數(shù)。這些試驗(yàn)進(jìn)行了兩次； 誤差條，測(cè)量值的SD。*，出現(xiàn)兩組差異ρ < 0. 05的唯一點(diǎn)。圖7IFN-a融合蛋白抑制了已建立的腫瘤的生長(zhǎng)。將C3H/HeN小鼠s. c.注射 1X 10338C13/HER2細(xì)胞。12天后，連續(xù)三天用5 μ g指定蛋白將小鼠i. p.處理。測(cè)量每只 小鼠的腫瘤體積。當(dāng)s. c.腫瘤直徑達(dá)到15mm，將動(dòng)物處死。圖8顯示重組抗體與表達(dá)⑶20的人細(xì)胞發(fā)生結(jié)合。將Daudi細(xì)胞與重組IgG3或 利妥昔單抗溫育，隨后與生物素化的大鼠抗人IgG和PE-標(biāo)記的鏈霉親和素溫育，并通過流 式細(xì)胞術(shù)分析。A，僅與二抗溫育的細(xì)胞；B，與重組IgG3溫育的細(xì)胞；C，與利妥昔單抗溫育 的細(xì)胞。圖9顯示了抗體-IFN-a融合蛋白的重鏈的示意圖。特別是該圖顯示了 將(Gly4Ser)3(SEQ ID NO 31)縮短為 Gly4Ser (SEQ ID NO 32)接頭產(chǎn)生 了全長(zhǎng) a CD20-IgG3-mIFNa。圖10顯示了從蛋白A S印harose洗脫下來的級(jí)分的SDS-PAGE分析。表達(dá)帶有(Gly4Ser)3(SEQ ID NO 31)接頭的抗_CD-20-IgG3-IFNa的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清流過蛋白A S印harose，融合蛋白在洗脫前結(jié)合。A.蛋白未經(jīng)還原跑膠。泳道1，IgG3 ；泳道2_6，從蛋 白A S印harose洗脫下來的級(jí)分。B.蛋白在分析前被還原。泳道2，IgG3 ；泳道3_7，從蛋 白A Sepharose洗脫下來的級(jí)分。圖11顯示了通過在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白的SDS-PAGE分析。泳 道 1，帶有延長(zhǎng)的(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO :31)接頭的抗-CD20-IgG3_huIFN Ql;泳道 2，帶 有縮短的Gly4Ser(SEQ ID NO :32)接頭的抗_CD20_IgG3 huIFN…泳道3，帶有延長(zhǎng)的 (Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO 31)接頭的抗-CD20-IgG3-muIFN0t ；泳道4，帶有縮短的Gly4Ser (SEQ ID NO 32)接頭的抗-CD20-IgG3-muIFNOt ；泳道 5，抗 _CD20IgG3。圖12顯示了利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)與Daudi細(xì)胞結(jié)合的蛋白進(jìn)行的分析。 1 X IO6Daudi細(xì)胞用1μ g含有人IFN-α或Rituxan的融合蛋白染色。圖13顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)與38C13/⑶20結(jié)合的蛋白進(jìn)行的分析。
圖14.Daudi細(xì)胞與不同濃度的IFN-α、抗體或融合蛋白溫育72小時(shí)。利用 CellTiter 96 AQueous細(xì)胞增殖分析法評(píng)價(jià)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。圖15. Daudi細(xì)胞用IOpM指定蛋白處理72小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行 流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。圖16. 38C13/⑶20細(xì)胞用IOpM指定蛋白處理48小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色， 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。圖17.用各種濃度的不同蛋白處理后細(xì)胞增殖的抑制情況。38C13-⑶20細(xì)胞用各 種濃度的指定蛋白處理48小時(shí)。處理后，利用MTS分析法監(jiān)測(cè)增殖程度。圖18. 38C13/⑶20細(xì)胞用不同濃度的指定蛋白處理48小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI 染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。圖19. Daudi細(xì)胞與不同濃度的融合蛋白溫育72小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色， 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。圖20. Daudi細(xì)胞用各種濃度的融合蛋白處理72小時(shí)。加入MTS溶液定量細(xì)胞活 力。圖21. Daudi 細(xì)胞與 IpM 帶有 Gly4Ser 接頭(32) (Gly-Ser 接頭)的 抗-CD20-IgG3_hIFNa 或者 IpM 帶有 α 螺旋接頭(Alpha helix Linker)的 抗-⑶20-IgG3-hIFNa溫育72小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。圖22顯示了接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞，并在第1、2和3天用HBSS或者指定 量的抗-⑶20-IFN-a融合蛋白處理過的小鼠的存活情況。圖23顯示了接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞，并在第5、6和6天用10 μ g 抗-CD20-IgGl、抗-CD20-IgG3、利妥昔單抗或抗-CD20-IgG3_mIFNα處理過的小鼠的存活 情況。圖24.接種 5000 個(gè) 38C13-CD20 細(xì)胞，并在第 5、6 和 6 天用 10 μ g 抗-CD20_IgG3、 抗-CD20-IgG3+IFNa、抗-DNS-IgG3或抗-CD20-IgG3_mIFFN α處理過的小鼠的存活情況。圖25. 8只一組的小鼠在第0天注射5000個(gè)38C13-⑶20細(xì)胞。第8、9和10天， 它們用HBSS或100 μ g抗-⑶20-IgG3-mIFN α處理。持續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。
圖26. 8只一組的小鼠在第0天注射5000個(gè)38C13-⑶20細(xì)胞。第8、9和10天， 它們用HBSS或100 μ g抗-⑶20-IgG3-mIFN α處理。持續(xù)監(jiān)測(cè)存活情況。發(fā)明詳述干擾素α (IFN-α)是啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)的一種重要細(xì)胞因子，它還表現(xiàn)出廣 泛的抗腫瘤活性。但是干擾素(例如IFN-a)在臨床上作為抗癌藥物的應(yīng)用卻受到嚴(yán)重 影響其治療效果的較 短的半衰期所限制。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即通 過將干擾素附著于能夠特異/優(yōu)先結(jié)合靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)上或者與靶細(xì)胞相關(guān) 的標(biāo)記物的導(dǎo)靶部分可以提高干擾素的治療指數(shù)。這使得可以向靶位點(diǎn)遞送更高劑量 的干擾素，而系統(tǒng)并發(fā)癥更少。這一點(diǎn)在一個(gè)實(shí)施方案中通過由抗_HER2/neU IgG3和 IFN-α (抗-HER2/neu-IgG3-IFN-a)構(gòu)成的融合蛋白的構(gòu)建和使用，在另一個(gè)實(shí)施方案中 由抗-⑶20-IFN-a融合蛋白的構(gòu)建和使用予以展示。HER2/neu-IgG3-IFN-a構(gòu)建體的效力在用人HER2/neu轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠B-細(xì)胞淋巴瘤 38C13上進(jìn)行了測(cè)試?？?HER2/neu-IgG3-IFN-a融合蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制38C13/HER2 體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的效果，甚至在腫瘤攻擊后，僅給予1 μ g抗-HER2/neu IgG3_IFN_ α即導(dǎo)致 88%的長(zhǎng)期存活。不同尋常的是，抗_HER2/neu IgG3_IFN_a顯示出強(qiáng)大的抗已建立的38C13/HER2 腫瘤的活性，在88%處理小鼠中觀察到腫瘤完全消失。這樣巨大的抗腫瘤活性是由IFN-a 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的，通過抗-HER2/neu化63抗體將正^(1導(dǎo)靶到38C13/HER2腫瘤細(xì) 胞對(duì)增強(qiáng)這些效果是關(guān)鍵的。抗-⑶20-IgG3-IFN_a構(gòu)建體(參見實(shí)施例2)中觀察到了類似的結(jié)果。這些結(jié) 果表明干擾素(例如，IFN-α)附著(例如融合)于導(dǎo)靶部分(例如附著于腫瘤特異性抗 體)產(chǎn)生了可用于抑制靶細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖甚至將其殺死的有效治療劑。因此，例如 本文描述的示例性構(gòu)建體可以方便地用于臨床上治療B細(xì)胞淋巴瘤和其他癌癥。因此，某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的構(gòu)建體(例如嵌合部分)，所述構(gòu)建 體包含附著于導(dǎo)靶部分(例如附著于特異結(jié)合癌細(xì)胞上的癌癥特異標(biāo)記物的抗體)的干擾 素(例如IFN-a)。這類構(gòu)建體包括化學(xué)偶聯(lián)體和融合蛋白。還提供了編碼融合蛋白的核 酸，和轉(zhuǎn)染了所述核酸從而表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞。還提供了抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的方法， 以及用于治療各種癌癥的包含例如本文描述的嵌合部分的試劑盒。I.包含附著了干擾素的導(dǎo)靶部分的嵌合構(gòu)建體。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含附著了導(dǎo)靶部分的天然(野生型)或修飾的IFN(例如 IFN-α)的嵌合構(gòu)建體可以有效地用于抑制靶癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖，所述癌細(xì)胞表達(dá)導(dǎo) 靶部分所針對(duì)的標(biāo)記物或者與所述標(biāo)記物相關(guān)。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分與干擾素化學(xué) 偶聯(lián)，而在其他實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分與IFN-α表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)以融合蛋白產(chǎn)生時(shí)，導(dǎo) 靶部分(例如抗體)成分與IFN-a可以是直接融合或者借助肽接頭(例如，(Gly4Ser)3(SEQ ID NO 31)接頭、GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO 32)接頭、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO 33) 等)附著。A)導(dǎo)革巴部分(targetting moieties)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是這樣的分子，其與靶細(xì)胞所表達(dá)的(例如表達(dá)在 靶細(xì)胞表面的)標(biāo)記物或者和靶細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物特異地或優(yōu)先地結(jié)合。雖然靶細(xì)胞幾乎可以是任何細(xì)胞，某些優(yōu)選的細(xì)胞包括那些與特征在于細(xì)胞過度增殖的病態(tài)(即過度增殖病)相關(guān)的細(xì)胞。示范性的過度增殖病包括，但不限于銀屑病、中性白細(xì)胞增多癥、紅細(xì)胞 增多癥、血小板增多癥和癌癥。定性為癌癥的過度增殖病包括，但不限于實(shí)體瘤，諸如發(fā)生在乳腺、呼吸道、腦、生 殖器官、消化道、尿道、眼、肝臟、皮膚、頭頸、甲狀腺、甲狀旁腺的癌癥，以及它們的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn) 移。這類疾病還包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的實(shí)例包括，但不限于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸 潤(rùn)性小葉癌、乳腺導(dǎo)管原位癌和乳腺小葉原位癌。呼吸道癌癥的實(shí)例包括，但不限于肺小細(xì) 胞癌和非小細(xì)胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細(xì)胞瘤。腦癌的實(shí)例包括，但不限于腦干 和下丘腦角質(zhì)瘤、小腦和大腦星狀細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤，以及神經(jīng)外胚層和松果 體腫瘤。男性生殖器腫瘤包括，但不限于前列腺和睪丸癌。女性生殖器腫瘤包括，但不限于 子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、陰道和外陰癌，以及子宮瘤。消化道腫瘤包括，但不限于肛門、結(jié)腸、 結(jié)腸直腸、食管、膽囊、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺癌。尿道腫瘤包括，但不限于膀胱、陰 莖、腎、腎盂、輸尿管和尿道癌。眼癌包括，但不限于眼球內(nèi)黑素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。肝癌 的實(shí)例包括，但不限于肝細(xì)胞癌(有或沒有纖維板層變異的肝細(xì)胞瘤)、膽管癌(肝內(nèi)膽管 癌)和混合型肝細(xì)胞膽管細(xì)胞癌。皮膚癌包括，但不限于鱗狀細(xì)胞癌、卡波西(Kaposi' s) 肉瘤、惡性黑素瘤、默克(Merkel)細(xì)胞皮膚癌和非黑素瘤型皮膚癌。頭頸癌包括，但不限于 喉/下咽/鼻咽/ 口咽癌，和嘴唇和口腔癌。淋巴癌包括，但不限于AIDS相關(guān)的淋巴癌、非 霍奇金(Hodgkin' s)淋巴癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴癌、霍奇金氏病，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴癌。 肉瘤包括，但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白 血病包括，但不限于急性髓樣白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒 細(xì)胞白血病和毛細(xì)胞白血病。這些疾病在人類中已有成熟的研究，但它們也以類似的病原學(xué)存在于其他哺乳動(dòng) 物中，可以通過給予本發(fā)明的藥物組合物來治療。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合癌癥標(biāo)記物(例如，腫瘤相關(guān)抗原)的部 分。有大量癌癥標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些標(biāo)記物不需要是癌細(xì)胞特有的，但 在以下情況中也是有效的，即標(biāo)記物在癌細(xì)胞中的表達(dá)提高(相比正常的健康細(xì)胞)或者 周邊組織不存在可比水平的標(biāo)記物(特別是當(dāng)嵌合部分用于局部遞送)。示范性的癌癥標(biāo)記物包括，例如ND4單克隆抗體識(shí)別的腫瘤標(biāo)記物。該標(biāo)記物可 見于低分化的結(jié)腸直腸癌，以及胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(參見例如Tobi et al. (1998)Cancer Detection and Prevention, 22 (2) =147-152) 0其他重要的癌癥免疫療法目標(biāo)是膜結(jié)合補(bǔ) 體調(diào)控糖蛋白⑶46、⑶55和⑶59，這些蛋白已被發(fā)現(xiàn)體內(nèi)和體外在多數(shù)腫瘤細(xì)胞上都有 表達(dá)。人粘蛋白(例如MUC1)與在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的gplOO、酪氨酸酶和MAGE都是已知的腫 瘤標(biāo)記物。野生型WiIms'瘤基因WTl不僅在多數(shù)急性髓細(xì)胞、急性淋巴細(xì)胞和慢性髓細(xì)胞 白血病中，而且在包括肺癌的多種類型的實(shí)體瘤中高水平表達(dá)。急性淋巴細(xì)胞白血病已通過TAAs HLA-Dr、⑶1、⑶2、⑶5、⑶7、⑶19和⑶20表征。 急性髓細(xì)胞白血病已通過TAAs HLA-Dr、⑶7、⑶13、⑶14、⑶15、⑶33和⑶34表征。乳腺癌 已通過標(biāo)記物EGFR、HER2、MUCl和Tag-72表征。多種癌通過標(biāo)記物MUC1、TAG-72和CEA 進(jìn)行了表征。慢性淋巴細(xì)胞白血病已通過標(biāo)記物⑶3、⑶19、⑶20、⑶21、⑶25和HLA-DR進(jìn) 行了表征。毛細(xì)胞白血病通過標(biāo)記物⑶19、⑶20、⑶21、⑶25進(jìn)行了表征?；羝娼鸢Y已通過Leu-Ml標(biāo)記物進(jìn)行了表征。多種黑素瘤已通過HMB45標(biāo)記物進(jìn)行了表征。非霍奇金淋 巴瘤通過⑶20、⑶19和Ia標(biāo)記物進(jìn)行了表征。多種前列腺癌已通過PSMA和SElO標(biāo)記物 進(jìn)行了表征。此外，許多類型的腫瘤細(xì)胞展示罕見的抗原，這些抗原或者是對(duì)于該細(xì)胞類型和/ 或其環(huán)境不相宜的，或者正常情況下只在生物體發(fā)育過程中出現(xiàn)(例如胚胎抗原)。這類抗 原的實(shí)例包括鞘糖脂⑶2，這種雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂通常只在神經(jīng)元細(xì)胞的外表面膜上有 顯著水平的表達(dá)，其與免疫系統(tǒng)的接觸受到血腦屏障的限制。GD2在包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤、髓 母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、黑素瘤、肺小細(xì)胞癌、骨肉瘤和其他軟組織肉瘤的許多種腫瘤細(xì)胞 表面都有表達(dá)。因此GD2是免疫療法的一個(gè)方便的腫瘤特異性目。其他類型的腫瘤細(xì)胞展示一些是健康細(xì)胞表面罕見或者不存在的細(xì)胞表面受體，這些受體負(fù)責(zé)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和分裂。實(shí)例包括 (ErbB2). HER2/neu,這種組成性活化細(xì)胞表面受體在乳腺癌腫瘤細(xì)胞表面上異常高水平地 產(chǎn)生。其他有用的目標(biāo)包括，但不限于⑶20、⑶52、⑶33、表皮生長(zhǎng)因子受體等。表1中提供了合適的腫瘤標(biāo)記物的說明性而非限制性列表。這些以及其他癌癥標(biāo) 記物的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以購(gòu)買到或者利用例如噬菌體展示技術(shù)很容易地 制備。表1.說明性的癌癥標(biāo)記物和相關(guān)的參考文獻(xiàn)，為了便于確認(rèn)提及的腫瘤標(biāo)記物， 這些文獻(xiàn)全部通過引用并入本文。
以上任何標(biāo)記物都可以作為包含本發(fā)明的干擾素_導(dǎo)靶部分構(gòu)建體的導(dǎo)靶部分 的目標(biāo)。某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)記物包括，但不限于表皮生長(zhǎng)因子家族成員(例如HER2、 HER3、EGF、HER4)、CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、 CD33、CD34、CD38、5E10、CEA、HLA-DR、HM 1. 24、HMB 45、la、Leu-Ml、MUCl、PMSA、TAG-72、磷 脂酰絲氨酸抗原(phosphatidyl serine antigen)等。以上標(biāo)記物僅用于示范而非限制。其他腫瘤相關(guān)抗原對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已 知的。腫瘤標(biāo)記物是細(xì)胞表面受體的情況中，該受體的配體可以作為導(dǎo)靶部分。類似的， 這類配體的模擬物也可以作為導(dǎo)靶部分?？贵w。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分可以包含能夠特異或優(yōu)勢(shì)結(jié)合腫瘤標(biāo)記物的抗體、迷 你抗體或affybodies。能夠特異或優(yōu)勢(shì)結(jié)合腫瘤標(biāo)記物的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的。例如結(jié)合在人B細(xì)胞上表達(dá)的CD22抗原的抗體包括HD6、RFB4、UV22-2、Tol5、4KB128、 人源化抗 CD22 抗體(hLL2)(參見例如 Li et al. (1989)Cell. Immunol. Ill :85_99 ；Mason et al. (1987)Blood 69 836-40 ；Behr et al. (1999)Clin. Cancer Res. 5 :3304s-3314s ； Bonardiet al. (1993)Cancer Res. 53 :3015_3021)。針對(duì)CD33的抗體包括例如HuM195(參見例如Kossman et al. (1999)Clin. Cancer Res. 5 2748-2755)和 CMA_676(參見例如 Sievers et al.，(1999)Blood 93 :3678_3684)。針對(duì)CD38的抗體包括例如AT13/5(參見例如Ellis et al. (1995) J. Immunol. 155 :925_937)、HB7 等。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分包含抗HER2抗體。ergB 2基因(更常用的名稱是 Her-2/neu)是編碼跨膜受體的原癌基因。已經(jīng)開發(fā)的幾種抗Her-2/neu的抗體包括曲妥 珠單抗(trastuzumab)(例如，赫賽、;丁 .; Fornier et al. (1999) Oncology (Huntingt) 13 647-58)、TAB-250 (Rosenblum et al. (1999)Clin. Cancer Res.5 :865_874)、 BACH-250(Id. )、TAl(Maier et al. (1991) Cancer Res. 51 :5361_5369)和美國(guó)專利 5，772，997,5, 770，195 (mAb 4D5 ；ATCC CRL 10463)和 5，677，171 中描述的 mAbs。說明性的抗MUC-I抗體包括，但不限于Mc5(參見例如Peterson et al. (1997) Cancer Res.57 1103-1108 ；Ozzello et al. (1993)Breast Cancer Res. Treat.25 265-276)和 hCTMOl (參見例如 Van Hof et al. (1996) Cancer Res. 56 :5179_5185)。說明性的抗TAG-72抗體包括，但不限于CC49 (參見例如Pavlinkova etal. (1999) Clin. Cancer Res. 5 :2613_2619)、B72. 3 (參見例如 Divgi et al. (1994) Nucl. Med. Biol. 21 9-15)和美國(guó)專利5，976，531中公開的那些抗體。說明性的抗HMl. 24抗體 包括，但不限于小鼠單克隆抗HMl. 24IgG2a/K和人源化抗 HMl. 24^6/κ .抗體(參見例如，Ono et al. (1999)Mol. Immuno. 36 :387_395)。已經(jīng)開發(fā)了許多特異結(jié)合HER2的抗體，其中一些已用于臨床。它們包括例如曲 妥珠單抗(例如，赫賽、;丁 , Fornier et al. (1999)Oncology (Huntingt) 13 :647_658)、 TAB-250(Rosenblum et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5 :865_874)，BACH_250 (Id.)、TA1 (參 見例如Maier et al. (1991) Cancer Res. 51 :5361_5369)和美國(guó)專利 5，772，997、5，770，195 和5，677，171中描述的抗體。其他人抗HER2/neU抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這類抗體包括，但不限于 C6 抗體，比如 C6. 5、DPL5、G98A、C6MH3-B1、B1D2、C6VLB、C6VLD、C6VLE、C6VLF、C6MH3-D7、 C6MH3-D6、C6MH3-D5、C6MH3-D3、C6MH3-D2、C6MH3-D1、C6MH3-C4、C6MH3-C3、C6MH3-B9、 C6MH3-B5、C6MH3-B48、C6MH3-B47、C6MH3-B46、C6MH3-B43、C6MH3-B41、C6MH3-B39、 C6MH3-B34、C6MH3-B33、C6MH3-B31、C6MH3-B27、C6MH3-B25、C6MH3-B21、C6MH3-B20、 C6MH3-B2、C6MH3-B16、C6MH3-B15、C6MH3-B11、C6MH3-B1、C6MH3-A3、C6MH3-A2 和 C6ML3-9。 美國(guó)專利 6，512，097 和 5，977，322、PCT 公開 WO 97/00271、Schieret al. (1996) J Mol Biol 255 :28-43、Schier et al. (1996) J Mol Biol 263 :551_567 等中描述了這些和其他的抗 HER2/neu 抗體。更普遍來說，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體家族不同成員的抗體非常適合作為本發(fā)明的 構(gòu)建體的導(dǎo)靶部分。這類抗體包括，但不限于美國(guó)專利5，844，093和5，558，864，以及歐洲 專利706，799A中描述的抗EGF-R抗體。其他說明性抗EGFR家族抗體包括，但不限于諸如 C6. 5、C6ML3-9、C6MH3—B1、C6—B1D2、F5、HER3. A5、HER3. F4、HER3. HI、HER3. H3、HER3. E12、 HER3. B12、EGFR. E12、EGFR. C10、EGFR. B1UEGFR. E8、HER4. B4、HER4. G4、HER4. F4、HER4. A8、 HER4. B6、HER4. D4、HER4. D7、HER4. Dl 1、HER4. D12、HER4. E3、HER4. E7、HER4. F8 和 HER4. C7 等(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開US 2006/0099205A1和US 2004/0071696A1，這兩份文獻(xiàn)通 過引用并入本文)等抗體。正如美國(guó)專利6，512，097和5，977，322中所述，其他抗EGFR家族成員抗體可以通 過輕鏈和/或重鏈的重排，隨后進(jìn)行一或多輪的親和選擇而容易地制備得到。因此某些實(shí) 施方案中，本發(fā)明考慮了在VL和/或VH區(qū)中使用一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR，所述CDRs在以上 確定的抗體中和/或以上確定的出版物中進(jìn)行了描述。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分包含特異或優(yōu)勢(shì)結(jié)合CD20的抗體。抗CD20抗體是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于利妥昔單抗、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)， 和托西莫單抗、AME-133v(Applied MolecularEvolution)、Ocrelizumab (Roche)、 Ofatumumab(Genmab)、TRU-015 (Trubion)禾口 IMMU-106(Immunomedics)。本發(fā)明不必限于以上描述的抗體的用途，其他這類本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗體也 可以用于本文描述的組合物和方法。雖然以上討論涉及的是抗體，可以用親和體(affybodies)和/或迷你抗體代替抗體使用。迷你抗體(unibodies)。迷你抗體技術(shù)是能夠產(chǎn)生比某些小的抗體形式預(yù)期具有更長(zhǎng)的治療窗的穩(wěn)定的、 較小的抗體形式。某些實(shí)施方案中，通過刪除IgG4抗體的鉸鏈區(qū)制備迷你抗體。與全長(zhǎng) IgG4抗體不同的是該半分子片段非常穩(wěn)定，稱為迷你抗體。將IgG4分子一分為二僅留下 迷你抗體上能夠結(jié)合目標(biāo)分子的一個(gè)區(qū)域。PCT公開W02007/059782中詳細(xì)描述了制備 迷你抗體的方法，該文獻(xiàn)通過引用全文并入本文(還可以參見Kolfschoten et al. (2007) Science317 :1554_1557)。
親和體(affibodies)。親和體分子是基于有58個(gè)氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域的一類親和蛋白，所述蛋白 結(jié)構(gòu)域來源于鏈球菌蛋白A的一個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這個(gè)有三個(gè)螺旋束的結(jié)構(gòu)域已被用做 構(gòu)建組合噬粒文庫(kù)的支架，由此文庫(kù)可以利用噬菌體展示技術(shù)挑選針對(duì)所需分子的親和體 變體(參見例如 Nord et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15 -.112-111 ；Ronmark et al. (2002) Eur. J. Biochem.，269 :2647_2655.)。親和體的詳細(xì)情況和制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的(參見例如美國(guó)專利5，831，012，該文獻(xiàn)通過引用全文并入本文)?？梢砸庾R(shí)到，以上描述的抗體可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法提供為完整的 抗體(例如IgG)、抗體片段或者單鏈抗體。此外，雖然抗體可以來自基本上任何哺乳動(dòng)物物 種，為了減少免疫原性，最好使用來自與構(gòu)建體(例如抗HER2/neU-IFN-a嵌合分子)將要 用在的物種相同的物種的抗體。換句話說，在人中使用時(shí)，最好用人、人源化或者嵌合人抗 體。B) IFN- α和經(jīng)過修飾的IFN- α在多項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合部分包含連接了導(dǎo)靶部分(例如，抗HER2/neU 抗體)的干擾素(例如，IFN-α)。干擾素可以是全長(zhǎng)野生型干擾素(例如IFN-α ,IFN-β、 IFN-Y等)、干擾素片段(例如IFN-α片段)，和/或突變的干擾素。一般來說，干擾素片 段是優(yōu)選具有野生型干擾素的至少80 %，更優(yōu)選至少90 %或95 %，最優(yōu)選至少98 %、99 %、 100%，或者更高的內(nèi)源性活性的片段。鑒定這類修飾過的干擾素分子的手段對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)的。在一個(gè)說 明性過程中，制備了截短的和/或突變的IFN-α的文庫(kù)，并進(jìn)行了 IFN-α活性篩選。制備 多肽變體文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，可以利用例如易錯(cuò)PCR來產(chǎn)生突變 的和/或截短的IFN- α的文庫(kù)(參見例如美國(guó)專利6，365，408)。然后可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來篩選這樣得到的文庫(kù)成員。因 此，可以通過例如測(cè)量抗特定測(cè)試病毒的抗病毒活性來檢測(cè)IFN-α活性。檢測(cè)IFN-α活 性的試劑盒可以購(gòu)買到(參見例如，Neutekbio, Ireland的iLiteTMalphabeta試劑盒)。這些方法意在說明而非限制。利用本文提供的教導(dǎo)，可以容易地鑒定并生產(chǎn)其他 合適的修飾過的干擾素(例如，經(jīng)過修飾的IFN- α、IFN- β、IFN- Y等)。C.抗體(例如，抗HER2/neu)與IFN- α的附著。一般來說，導(dǎo)靶部分(例如，抗HER2/neu抗體和抗CD20抗體等)可以按照任何順 序連接在一起。因此，例如可以將抗體連接到干擾素的氨基或羧基端。只要附著不會(huì)影響 到抗體與靶標(biāo)記物(例如，HER2/neU受體)的結(jié)合，也可以將抗體連接到干擾素的內(nèi)部區(qū)域，或者反過來，可以將干擾素連接到抗體的內(nèi)部或者任一端?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何手段將抗體(例如，C6抗HER2/neu)與干擾素(例如IFN-α)附著。某些實(shí)施方案中，干擾素是直接或者通過接頭(間隔臂)與抗體 偶聯(lián)。但是，某些實(shí)施方案中優(yōu)選將嵌合部分重組表達(dá)為融合蛋白。i)導(dǎo)靶部分與干擾素的化學(xué)偶聯(lián)。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分(例如，諸如C6. 5、C6MH3-B1、G98A、ML3-9、H3B1、B1D2 等的抗HER2/neU抗體)與干擾素分子(例如IFN-α)化學(xué)偶聯(lián)。將分子化學(xué)地偶聯(lián)的手 段是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于偶聯(lián)兩個(gè)分子的程序根據(jù)試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)而不同。多肽一般含有各種功能基 團(tuán)(例如羧酸(COOH)或游離氨基(-NH2))可供與另一個(gè)肽上的或者連接這兩個(gè)分子的接 頭上的合適功能基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。替代的，可以將抗體和/或IFN-α衍生從而暴露或者附著上其他反應(yīng)性功能基 團(tuán)。衍生反應(yīng)可以包括附著上諸如Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois)銷售 的多種接頭中的任意一種。“接頭”用于本文一般是指用于將抗體與IFN-α連在一起的分子。在多項(xiàng)實(shí)施方 案中，接頭能夠與抗體和IFN-α均形成共價(jià)鍵。合適的接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包 括但不限于，直連或支鏈碳接頭、雜環(huán)碳接頭或者肽接頭。某些實(shí)施方案中，接頭可以與抗 體和/或IFN-α的氨基酸通過其側(cè)鏈基團(tuán)(例如通過與半胱氨酸的二硫鍵)連接。某些 優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭被連接到抗體和/或IFN-α末端氨基酸的α碳氨基和/或羧基基 團(tuán)上。可以使用雙功能接頭，即帶有一個(gè)能與抗體上的基團(tuán)反應(yīng)的功能基團(tuán)和另一個(gè)能 夠與IFN-α反應(yīng)的基團(tuán)，來形成所需的偶聯(lián)物。替代地，衍生反應(yīng)可以包括導(dǎo)靶部分的化 學(xué)處理。用于產(chǎn)生例如多肽(比如抗體或抗體片段)上的游離巰基的程序是已知的(參見 美國(guó)專利4，659，839)。用于將包括放射性核素金屬螯合劑、毒素和藥物的各種化合物附著于蛋白質(zhì) 的許多程序和接頭是已知的。參見例如，歐洲專利申請(qǐng)188，256 ；美國(guó)專禾Ij 4，671，958、 4，659，839,4, 414，148,4, 699，784,4, 680，338,4, 569，789 和 4，589，071 ；以及 Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47 :4071_4075。尤其是各種免疫毒素的制備是本領(lǐng)域 公知的，可以在例如 “MonoclonalAntibody-Toxin Conjugates :Aiming the Magic Bullet,，，Thorpe et al. , Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190(1982) ；Waldmann (1991) Science, 252 1657 ；美國(guó)專利 4，545，985 和 4，894，443等中找到。ii)融合蛋白的產(chǎn)生。某些實(shí)施方案中，利用重組DNA技術(shù)合成嵌合導(dǎo)靶部分-干擾素融合蛋白。通常， 這包括產(chǎn)生編碼所述融合蛋白的DNA序列，將DNA置于受到特定啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)盒中，在 宿主中表達(dá)蛋白，分離表達(dá)產(chǎn)生的蛋白，以及如果需要將蛋白復(fù)性。編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA可以通過任何合適的方法制備，包括例如合適的序 列的克隆和限制性消化，或者通過諸如Narang et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 :90_99的 磷酸三酯法；Brown et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 109-151 的磷酸二酯法；Beaucage etal. (1981) Tetra. Lett. ,22 1859-1862)的二乙基亞磷酸酰胺方法；美國(guó)專利4，458，066的
固體支持物方法等直接化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可以通過與互補(bǔ)序列雜交，或者將該單鏈作為模 板用DNA聚合酶通過聚合轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然DNA化學(xué)合成限 于大約100堿基的序列，通過較短序列的連接可以得到更長(zhǎng)的序列。替代地，可以克隆亞序列，并用合適的限制酶將適當(dāng)?shù)膩喰蛄星懈?。然后可以將?段連接產(chǎn)生所需的DNA序列。某些實(shí)施方案中，利用DNA擴(kuò)增方法，比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆編碼本發(fā)明 融 合蛋白的DNA。因此，例如利用含有例如NdeI限制位點(diǎn)的有義引物和含有HindIII限制 位點(diǎn)的反義引物PCR擴(kuò)增IFN-α的基因。這樣可以產(chǎn)生編碼成熟IFN-α序列并帶有末端 限制位點(diǎn)的核酸。帶有“互補(bǔ)”限制位點(diǎn)的抗體可以類似地克隆，然后連接到IFN-α上，和 /或連接到附著在IFN-α上的接頭上。核酸序列的連接和插入載體產(chǎn)生編碼與抗HER2/neU 抗體相連的IFN-α的載體。雖然可以將兩個(gè)分子直接連在一起，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可以通過由一或多個(gè) 氨基酸構(gòu)成的肽間隔臂將分子隔開。通常間隔臂除了將蛋白連接起來或者保持它們之間的 某個(gè)最小距離或其他空間關(guān)系之外，沒有具體的生物活性。但是，在某些實(shí)施方案中，可以 選擇間隔臂的組成氨基酸能夠影響分子的某些屬性，比如折疊、凈電荷或疏水性。但是，令人驚訝的是某些接頭不適合用于制備本發(fā)明的融合蛋白。因此，例如 (Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO 31)接頭不太適合用于制備抗⑶20-IFN-α構(gòu)建體。不受到具體理 論的限制，據(jù)信干擾素通過蛋白水解被從融合蛋白上去除。利用抗Fc和抗干擾素進(jìn)行的 Western印跡分析證實(shí)上面的條帶均為重鏈，但只有最大條帶含有干擾素。相應(yīng)地，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，希望使用抗蛋白水解的接頭。某些優(yōu)選接頭是 (Gly4Ser)3(SEQ ID NO 31)接頭以外的接頭。某些優(yōu)選接頭是長(zhǎng)度低于15個(gè)氨基酸的接 頭，或者是低于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個(gè)氨基酸的接頭。某些實(shí)施方案中， 接頭是最多約12或13或14個(gè)氨基酸長(zhǎng)的α螺旋接頭。某些非常適合用于本發(fā)明的構(gòu)建體的示范性蛋白水解抗性接頭如表2所示。表2.示范性的抗蛋白水解的接頭。
可以在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼融合蛋白的核酸序列，包括大腸桿菌、其他細(xì)菌 宿主、酵母和各種高等真核細(xì)胞，比如COS、CHO和HeLa細(xì)胞系和骨髓瘤細(xì)胞系。重組蛋白 基因通?？刹倏v地連接有適合各個(gè)宿主的表達(dá)調(diào)控序列。對(duì)于大腸桿菌，表達(dá)調(diào)控序列包括諸如T7、trp或λ啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及優(yōu)選轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。對(duì)于真核細(xì)胞，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子，優(yōu)選來源于免疫球蛋白基因、SV40、巨細(xì)胞病毒等的增強(qiáng)子，和 多聚腺苷酸化序列，還可以包括剪接供體和受體序列。本發(fā)明的質(zhì)?？梢酝ㄟ^公知技術(shù)轉(zhuǎn)移到所選的宿主細(xì)胞中，比如用于大腸桿菌的 氯化鈣轉(zhuǎn)化，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的磷酸鈣處理或電穿孔?？梢酝ㄟ^由質(zhì)粒所含基因(比如 amp、gpt、neo和hyg基因)賦予的抗生素抗性來挑選轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的細(xì)胞。表達(dá)后，重組融合蛋白可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)程序進(jìn)行純化，包括硫酸銨 沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等(參見，R. Scopes (1982) ProteinPurif ication， Springer-Verlag, N. Y. Deutscher (1990)Methods in EnzymologyVol. 182 :Guide to Protein Purification.，Academic Press, Inc. N. Y.等)。對(duì)于藥物用途，優(yōu)選至少約 90 到95%同質(zhì)性，最優(yōu)選98%到99%或以上同質(zhì)性的基本純的成分。一旦部分純化，或者達(dá) 到所需同質(zhì)性純化后，多肽可以用于治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，化學(xué)合成、生物表達(dá)或純化后，融合蛋白(例如抗 HER2/neu-IFN-α，抗⑶20-IFN-α等)具有的構(gòu)象可能與組成多肽的天然構(gòu)象非常不同。 這種情況下，可能需要將多肽變性和還原，然后使多肽重新折疊成優(yōu)選的構(gòu)象。蛋白的還 原和變性方法以及誘導(dǎo)重新折疊的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如，Debinski et al. (1993)J. Biol. Chem. ,268 14065-14070 ；Kreitman and Pastan (1993)Bioconjug. Chem. ,4 581-585 ；禾口 Buchner，et al. (1992)Anal. Biochem.，205 :263_270)。例如 Debinski et al.描述了內(nèi)含體蛋白在胍-DTE中的變性和還原。然后蛋白在含有氧化型谷 胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中重新折疊。某些實(shí)施方案中，可以利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)本文描述的嵌合構(gòu)建體。雖然有 許多細(xì)胞系可能可以使用，一種非常適合瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞系是293T。進(jìn)行293T瞬時(shí)表達(dá) 時(shí)，在第O天將25ml中9百萬個(gè)細(xì)胞接種到每個(gè)150mm組織培養(yǎng)板中。用無菌水制備Img/ ml PEI (聚乙烯亞胺)。為了表達(dá)完整抗體或抗體融合蛋白，每個(gè)板中用H和L各25 μ g (共 50 μ g)。每個(gè)150mm板的轉(zhuǎn)染使用5ml體積。將DNA與DMEM混合，然后加入PEI，混合物在 室溫下溫育10分鐘。每yg DNA使用1.75yg PEI。要進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，移出舊培養(yǎng)基，丟棄并 換上20ml新鮮培養(yǎng)基(Iscoves+5%小牛血清)。加入轉(zhuǎn)染混合物，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板。第2天， 將培養(yǎng)基換成30ml含有FBS (胎牛血清)的Iscoves培養(yǎng)基以便盡量減少存在的牛Ig 的量。第4、6和13天，通過移去培養(yǎng)基并用30ml含有FBS的新鮮Iscover代替來由細(xì) 胞收集上清。實(shí)施例1中闡述了抗HER2/neu-IFN-a融合蛋白的克隆和表達(dá)，而實(shí)施例2中顯 示了抗⑶20-IFN-a融合蛋白的克隆和表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到這些表達(dá)方法是說明性的而非限制性的。可以對(duì)本文 描述的融合蛋白進(jìn)行修飾而不會(huì)使它們的活性/效力消失。可以進(jìn)行某些修飾以便協(xié)助克 隆、表達(dá)或者將導(dǎo)靶分子弓丨入融合蛋白。這類修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如在氨 末端添加甲硫氨酸從而提供起始位點(diǎn)，或者在任意一端添加其他氨基酸從而產(chǎn)生便于使用 的限制位點(diǎn)或終止密碼子?？梢赃M(jìn)行其他修飾以提供血清半衰期和/或生物利用率。這類修飾包括，但不限 于引入D-氨基酸(特別是在接頭中)、使用非天然的氨基酸、融合蛋白的聚乙二醇化等。
D.其他多價(jià)導(dǎo)靶部分。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮到了利用多價(jià)，優(yōu)選三價(jià)、四價(jià)、五價(jià)或更高價(jià)導(dǎo)靶 部分(例如，抗HER2/neU抗體、抗CD20抗體等)將干擾素導(dǎo)靶到靶細(xì)胞。例如，多價(jià)抗HER2/neu部分可以通過多種方法中的任何一種來產(chǎn)生。例如，具有 三個(gè)、四個(gè)或更多反應(yīng)位點(diǎn)的接頭可以與抗HER2/neU抗體反應(yīng)以便形成三聚體或更大的 偶聯(lián)體。在某些實(shí)施方案中，可以利用噬菌體展示、酵母展示、細(xì)菌展示或其他展示系統(tǒng)來 表達(dá)和展示多拷貝(例如，至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)拷貝等)導(dǎo)靶(例如， 抗HER2/neU、抗CD20等)抗體，從而有效提供多價(jià)導(dǎo)靶部分。
II.組合使用。本發(fā)明的嵌合構(gòu)建體可以用于抑制靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)和/或增殖。在 多項(xiàng)實(shí)施方案中，可以使用嵌合部分來抑制疾病的發(fā)展、縮小腫瘤大小和/或穩(wěn)定病情的
衰退/緩解。尤其是在癌癥的治療中，本發(fā)明的組合物和方法還可以包括其他治療上和/ 或藥物學(xué)可接受的試劑。例如，所述組合物和方法可以包括其他治療癌癥的試劑。這 類試劑包括，但不限于烷化劑(例如，二氯甲基二乙酸(氮芥(Mustargen))、環(huán)磷酰 胺(Cytoxan, Neosar)、異環(huán)磷酰胺(Ifex)、苯丙氨酸氮芥、美法侖(melphalen)(愛 克蘭(Alkeran))、苯丁酸氮芥(chlorambucol)(瘤可寧(Leukeran))、尿嘧啶氮芥、 雌氮芥(estramustine) (Emcyt)、噻替派(thiot印a) (Thioplex)、白消安(busulfan) (Myerlan)、羅氮芥(Iomustine) (CeeNU)、卡氮芥(carmustine) (BiCNU, BCNU)、鏈脲霉 素(streptozocin) (Zanosar)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC-Dome)、順鉬(Platinol, Platinol AQ)、卡鉬(伯爾定 Paraplatin)、六甲蜜胺(altretamine) (Hexalen)等)；抗代 謝物(例如，甲氛蝶吟(Amethopterin、Folex、Mexate、Rheumatrex)、5_氣尿啼 (Adrucil、 Efudex、Fluoroplex)、氟脫氧尿苷(floxuridine)、5_ 氟脫氧尿苷(fluorodeoxyuridine) (FUDR)、卡培他濱(capecitabine)(希羅達(dá)(Xeloda))、氟達(dá)拉濱(fludarabine)(福達(dá) 華(Fludara))、阿糖胞苷(cytosine arabinoside) (Cytaribine、Cytosar, ARA-C)、6-巰 基嘌呤(Purinethol)、6_ 硫鳥嘌呤(Thioguanine)、吉西他濱(gemcitabine) (Gemzar)、 克拉屈濱(cladribine) (Leustatin)、脫氧考福霉素(deoxycoformycin)、噴司他丁 (pentostatin) (Nipent)等)；抗生素(例如多柔比星(doxorubicin)(亞德里亞霉素 (Adriamycin)、Rubex、Doxil、柔紅霉素月旨質(zhì)體制品)、正定霉素(daunorubicin)(道諾霉素 (Daunomycin), Cerubidine)、伊達(dá)比星(idarubicin) (Idamycin)、戊柔比星(valrubicin) (Valstar)、米托蒽醌(諾肖林(Novantrone))、更生霉素(dactinomycin)(放線菌素D、 Cosmegen)、光輝霉素(mithramycin)、普卡霉素(plicamycin) (Mithracin)、絲裂霉素 (mitomycin) C(突變霉素 Mutamycin)、博來霉素(Blenoxane)、丙卡巴餅(procarbazine) (Matulane)等)；有絲分裂抑制劑(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol)、多烯紫 杉酉享(docetaxel) (Taxotere)、硫酸長(zhǎng)春堿(vinblatine sulfate) (VeIban> Velsar、 VLB)、硫酸長(zhǎng)春新堿(vincristine sulfate) (Oncovin、Vincasar PFS、Vincrex)、硫酸 長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine sulfate) (Navelbine)等)；染色質(zhì)功能抑制劑(例如拓?fù)涮?康(topotecan) (Camptosar)、伊立替康(irinotecan) (Hycamtin)、依托泊昔(etoposide)(VP-16、VePesicU Toposar)、替尼泊苷(teniposide) (VM-26、Vumon)等)；激素和激 素抑制劑(例如，己烯雌酚(diethylstilbesterol) (Stilbesterol、Stilphostrol)、 雌二醇(estradiol)、雌激素、酉旨化雌激素(esterified estrogens) (Estratab、 Menest)、雌氮芥(estramustine) (Emcyt)、它莫西芬(tamoxifen) (Nolvadex)、托瑞米 芬(toremifene) (Fareston)、瑞寧得(anastrozole) (Arimidex)、來曲唑(Ietrozole) (Femara)、17_0Η_ 孕酮(progesterone)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate) (Megace)、戈舍瑞林(goserelin) (Zoladex)、亮腦利特(Ieuprolide) (Leupron)、睪丸酮(testosteraone)、甲基睪丸酮(methyltestosterone)、氟甲睪酮 (f luoxymesterone) (Android_F、Halotestin)、氟他米特(flutamide) (Eulexin)、比卡魯胺 (bicalutamide) (Casodex)、尼魯米特(nilutamide) (Nilandron)等)；合成抑制劑(例如， 氨魯米特(aminoglutethimide) (Cytadren)、酮康唑(ketoconazole) (Nizoral)等)；免疫 調(diào)節(jié)劑(例如，利妥昔單抗(Rituxan)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀)、deniIeukin diftitox (Ontak)、左旋咪唑(Ievamisole) (Ergamisol)、卡介苗 BCG(TheraCys，TICE BCG)、干擾素α -2a、α -2b (羅擾素(Roferon) -A, Intron A)、白介素-2、阿地白介素 (aldesleukin)(普留凈ProLeukin)等)以及其他試劑，比如1_天冬酰胺酶(Elspar、 Kidrolase)、培門冬酶(pegaspasgase)(Oncaspar)、輕基服(hydroxyurea)(Hydrea、 Doxia)、甲酰四氫葉酸(Ieucovorin) (Wellcovorin)、米托坦(mitotane) (Lysodren)、卟盼 姆(porfimer) (Photofrin) JH A (tretinoin) (Veasnoid)等。III.藥物組合物。為了實(shí)施本發(fā)明的方法，將一或多種本發(fā)明的活性試劑(嵌合部分)給予例如被 診斷為患有癌癥的個(gè)體。活性制劑可以以天然形式給予，或者如果需要的話，只要其鹽、 酯、胺、前藥、衍生物適合用于藥物(即在所述方法中是有效的)，可以給予鹽、酯、胺、前藥、 衍生物等形式?；钚灾苿┑柠}、酯、胺、前藥和其他衍生物可以利用有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的禾口例如 March(1992) Advanced Organic Chemistry ；Reactions, Mechanisms andStructure,4th Ed. N. Y. Wiley-Interscience 中描述的常規(guī)程序來制備。例如，酸加成鹽可以由游離堿，利用一般涉及到與適宜的酸進(jìn)行反應(yīng)的常規(guī)方法 來制備。通常，將藥物的堿形式溶解在諸如甲醇或乙醇的極性有機(jī)溶劑中，然后向其中加入 酸。將得到的鹽沉淀或者通過再加入極性較弱的溶劑使它從溶液中萃取出來。適合制備 酸加成鹽的酸包括有機(jī)酸(例如乙酸、丙酸、羥基乙酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀 酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲基磺酸、乙磺酸、P-甲苯磺 酸、水楊酸等)和無機(jī)酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)?？梢酝ㄟ^用合適的堿處 理將酸加成鹽轉(zhuǎn)化為游離堿。本文中特別優(yōu)選的活性試劑的酸加成鹽是利用諸如氯化酸或 溴化酸制備的鹵化鹽。發(fā)過來，本發(fā)明的活性試劑的堿性鹽制品是利用藥物可接受的堿，比 如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等以類似的方式制備的。特別優(yōu)選的堿 性鹽包括堿性金屬鹽，例如鈉鹽和銅鹽。酯類的制備一般包括藥物分子結(jié)構(gòu)中可能存在的羥基和/或羧基的功能化。酯通 常是游離醇基的酰基取代衍生物，即來源于通式RCOOH羧酸的部分，其中R是烷基，并且優(yōu) 選是低等烷基。如果 需要，可以通過利用常規(guī)氫解或水解過程將酯重新轉(zhuǎn)化為游離酸。酰胺和前藥也可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者相關(guān)文獻(xiàn)中描述過的技術(shù)制備。例如，可以利用合適的胺反應(yīng)物由酯制備酰胺，或者可以由無水或酸性氯化物通過與氨 或低等烷基胺反應(yīng)來制備。前藥的制備通常是通過共價(jià)附著上一個(gè)部分，得到直至被個(gè)體 的代謝系統(tǒng)修飾才具備治療活性的化合物。 本文中確認(rèn)的活性試劑可以用于胃腸外、外用、口腔、鼻(或者吸入)、直腸給藥， 或者通過諸如氣霧劑或跨膜的局部給藥，對(duì)本文描述的一或多種病態(tài)/指征(例如動(dòng)脈粥 樣硬化和/或其癥狀)進(jìn)行預(yù)防和/或治療性處置。根據(jù)給藥方法，可以以多種單位劑量 形式給予藥物組合物。合適的單位劑量形式包括，但不限于粉末、片劑、藥丸、膠囊、錠劑、栓 齊U、貼片、鼻腔噴霧、注射劑、植入式緩釋制劑、脂類復(fù)合體等。本發(fā)明的活性試劑通常與藥物可接受的載體(賦形劑)組合形成藥物組合物。藥 物可接受的載體含有一種或多種生理可接受的化合物，所述化合物可以例如穩(wěn)定藥物組合 物或者增加或減少活性試劑的吸收。生理可接受的化合物可以包括例如，諸如葡萄糖、蔗糖 或右旋糖的碳水化合物；諸如抗壞血酸或谷胱甘肽的抗氧化劑；螯合劑；低分子量蛋白；諸 如脂類的保護(hù)劑和攝取增強(qiáng)劑；減少活性試劑的清除或水解的組合物；或者賦形劑或其他 穩(wěn)定劑和/或緩沖液。其他生理可接受的化合物包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、分散劑，或者對(duì)防止微生物的生長(zhǎng) 或作用特別有用的防腐劑。各種防腐劑是已知的，包括例如酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人 員明白，藥物可接受載體，包括生理可接受化合物的選擇取決于例如活性試劑的給藥途徑 和活性試劑的具體生理_化學(xué)特性。賦形劑優(yōu)選是無菌的，并且通常不含不需要的物質(zhì)。這類組合物可以通過常規(guī)的 已知滅菌技術(shù)來滅菌。在治療應(yīng)用中，將本發(fā)明的組合物以能夠有效地防止和/或治愈或者至少部分防 止或遏制疾病和/或其并發(fā)癥的量給予患有例如癌癥或者有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)(例如在手術(shù)切除 原發(fā)腫瘤)的病人。足夠?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn)的量定義為“治療有效劑量”。這類用途的有效量取決 于疾病的嚴(yán)重程度和患者的整體健康情況。根據(jù)患者需要的并且能夠耐受的劑量和頻率， 可以將組合物單次或多次給藥。任何情況中，組合物都應(yīng)當(dāng)提供足夠量的發(fā)明所述制劑中 的活性試劑，以便有效治療(緩解一種或多種癥狀)患者?；钚詣┑臐舛瓤赡苡泻艽蟮牟煌?，主要根據(jù)所選的具體給藥方式和患者的需求， 基于液體體積、粘性和體重等來選擇。但是一般選擇的濃度能夠提供約0. 1或lrng/kg/天 到約50mg/kg/天，或者有時(shí)更高的劑量。典型的劑量在約3mg/kg/天到約3. 5mg/kg/天的 范圍內(nèi)，優(yōu)選約3. 5mg/kg/天到約7. 2mg/kg/天，更優(yōu)選約7. 2mg/kg/天到約11. Omg/kg/ 天，最優(yōu)選約11. Omg/kg/天到約15. Omg/kg/天的范圍內(nèi)。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量處于 約10mg/kg/天到約50mg/kg/天的范圍內(nèi)。某些實(shí)施方案中，劑量在約20mg到約50mg，每 天口服兩次。應(yīng)當(dāng)明白，這些劑量可以變動(dòng)，從而優(yōu)化具體個(gè)體或個(gè)體組的治療方案。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的活性試劑是(例如以片劑)口服的，或者是按照本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法注射的。其他優(yōu)選實(shí)施方案中，肽還可以利用常規(guī)的跨膜藥 物遞送系統(tǒng)，即跨膜“貼片”(通常其中的活性試劑含在層壓結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)作為藥物遞送裝 置固著到皮膚上)進(jìn)行遞送。在這類結(jié)構(gòu)中，藥物組合物一般含在位于上襯層下面的層或 “儲(chǔ)庫(kù)”中。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“儲(chǔ)庫(kù)”在該語境中是指最終可供遞送到皮膚表面的“活性成分” 的量。因此，例如“儲(chǔ)庫(kù)”可能包括貼片襯層上粘著劑中的活性成分，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種不同基質(zhì)制劑中任一種中的活性成分。貼片可以含有單個(gè)儲(chǔ)庫(kù)，或者可以含有多個(gè)儲(chǔ)庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫(kù)包含藥物可接受的接觸粘合材料構(gòu)成的聚合物基質(zhì)，其 將系統(tǒng)在藥物遞送過程中固著到皮膚上。合適的皮膚接觸粘合材料實(shí)例包括，但不限于聚 乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。替代地，含有藥物的儲(chǔ)庫(kù)和皮膚接觸粘 合以單獨(dú)和分開的層次存在，其中粘合劑位于儲(chǔ)庫(kù)之下，這種情況中，儲(chǔ)庫(kù)可以是上面描述 過的聚合物基質(zhì)，或者可以是液體或水凝膠儲(chǔ)庫(kù)，或者采取其他形式。這些板層中作為裝置 上表面的襯層，優(yōu)選是“貼片”中的主要結(jié)構(gòu)單元，為裝置提供大部分的柔性。選擇作為襯 層的材料優(yōu)選對(duì)活性試劑和其他存在的材料是基本通透的。某些實(shí)施方案中，可以通過使用緩釋蛋白“包裝”系統(tǒng)來維持提高的血清半衰 期。這類緩釋系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于蛋白質(zhì)和肽的 ProLease 生物可降解微球遞送系統(tǒng)(參見，例如Tracy (1998) Biotechnol. Prog. 14 108 ； Johnson et al. (1996),Nature Med. 2 795 ；Herbert et al. (1998),Pharmaceut. Res. 15, 357)是由生物可降解聚合微球構(gòu)成的干粉，其中所述微球含有在聚合物基質(zhì)中的活性試 齊U，該系統(tǒng)可以在有或沒有其他試劑的情況下復(fù)合成干制劑。ProLease 微球制造過程經(jīng)過特別設(shè)計(jì)，能夠在維持活性試劑的完整性的同時(shí)達(dá) 到高的封裝效率。所述過程包括(i)通過將藥物溶液與穩(wěn)定賦形劑噴霧凍干來大量制備凍 干的藥物顆粒，(ii)制備藥物聚合物懸浮液，然后超聲處理或均質(zhì)化來減小藥物顆粒的大 小，(iii)通過噴霧到液氮中產(chǎn)生冷凍的藥物聚合物微球，(iv)用乙醇萃取聚合物溶劑，以 及(ν)過濾和真空干燥產(chǎn)生最終的干粉產(chǎn)品。這樣得到的粉末含有固體形式的活性試劑， 活性試劑是均質(zhì)的，僵硬地分散在多孔聚合物顆粒中。該過程中最常用的聚合物_丙交酯 乙交酯共聚物(lactide-co-glycolide) (PLG)是生物相容的和生物可降解的。封裝(encapsulation)可以在低溫(例如_40°C )實(shí)現(xiàn)。在封裝過程中，蛋白質(zhì)在 沒有水的情況下保持固態(tài)，從而使得蛋白質(zhì)被水誘導(dǎo)的構(gòu)象變化最小化，防止那些包括水 作為反應(yīng)物的蛋白降解反應(yīng)，并且避免形成有機(jī)相-水相界面使蛋白在那里發(fā)生變性。優(yōu) 選的過程使用多數(shù)蛋白不能溶于其中的溶劑，從而達(dá)到高封裝效率(例如，高于95% )。另一個(gè)實(shí)施方案中，可以以“濃縮物”來提供溶液中的一或多種成分，例如在可即 時(shí)稀釋的存儲(chǔ)容器中(例如，預(yù)先量好的體積)，或者以可加入一定體積的水中的可溶性膠
囊 ο以上制劑和給藥方法意在說明而非限制。應(yīng)當(dāng)明白，利用本文提供的教導(dǎo)，可以容 易地設(shè)計(jì)其他合適的制劑和給藥模式。IV.試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療原發(fā)性癌癥和/或用在輔助療法 中的試劑盒。試劑盒一般包含含有本發(fā)明的嵌合部分(例如，抗HER2/neU-IFN-a、抗 CD20-IFN-Q等)的容器。嵌合部分可以存在于藥物可接受的賦形劑中。此外，試劑盒可以任選包含說明材料，公開如何使用嵌合部分(例如治療癌癥和/ 或作為聯(lián)合療法)的方法。說明材料任選還可以教導(dǎo)優(yōu)選劑量、計(jì)數(shù)器顯示等。試劑盒還可以包含其他成分以協(xié)助試劑盒所預(yù)期的具體應(yīng)用。因此，例如還包含 用于給傷口消毒、止痛、附著上敷料等的裝置。
雖然說明材料一般包含書寫或打印的材料，但并不局限于此。任何能夠存儲(chǔ)這類 說明并將它們傳達(dá)給終端使用者的媒介都是本發(fā)明考慮的。這類媒介包括，但不限于電子 存儲(chǔ)媒介(例如，磁盤、磁帶、盒式磁帶、芯片)、光學(xué)媒介(例如CD ROM)等。這類媒介可以 包含提供說明材料的網(wǎng)址。
實(shí)施例以下實(shí)施例僅供對(duì)發(fā)明進(jìn)行闡述，而非限制。 實(shí)施例1抗Her2/Neu IgG3和IFN-α融合蛋白顯示抗B細(xì)胞淋巴瘤的強(qiáng)細(xì)胞凋亡和抗腫 瘤活性在本項(xiàng)研究中，我們構(gòu)建了由帶有C6MH3-B1 (20)可變區(qū)的抗HER2/neu_IgG3和 IFN-α構(gòu)成的融合蛋白，并研究了它對(duì)表達(dá)人HER2/neu的鼠B細(xì)胞淋巴瘤38C13 (38C13/ HER2)的效果?？紤]到該B細(xì)胞淋巴瘤對(duì)IFN-α (21)的反應(yīng)性，我們選擇在這個(gè)模型中評(píng) 估IFN-α靶向腫瘤的能力。IFN-α與Ab的融合顯著提高了它的體內(nèi)半衰期。我們發(fā)現(xiàn) 抗HER2/neu-IgG3-IFN-a有效地抑制了小的和已建立的38C13/HER2腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，同 時(shí)在有效劑量沒有觀察到系統(tǒng)毒性的跡象?？笻ER2/neu-IgG3-IFN-a抑制了 38C13/HER2 細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)了其細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明IFN-a與腫瘤特異性Ab的融合產(chǎn)生了能 夠有效治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥劑。材料與方法細(xì)胞系和培養(yǎng)條件38C13是來源于C3H/HeN小鼠的高度惡性鼠B細(xì)胞淋巴瘤。表達(dá)人HER2/neu的 38C13(38C13/HER2)的構(gòu)建和表征已有描述(6)。38C13和38C13/HER2均培養(yǎng)在補(bǔ)充了 2mM L-谷氨酰胺、10U/ml盤尼西林、10微克/ml鏈霉素(GPS ；Sigma-Aldrich)和10%小牛血清 (Atlanta Biologicals)的 IMDM(Irvine Scientific)中。鼠骨髓瘤 P3X63Ag8. 653 (美國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心)及其表達(dá)抗HER2IgG3-IFN_a或IgG3_IFN_a的衍生物生長(zhǎng)在補(bǔ)充 了 10%小牛血清和GPS的IMDM中。L929成纖維細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)培養(yǎng)在 含有5%小牛血清和GPS的IMDM中。過表達(dá)人HER2/neu的鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系CT26/HER2 的構(gòu)建和表征已有描述(6)。CT26/HER2培養(yǎng)在含有5%小牛血清和GPS的IMDM中。質(zhì)粒構(gòu)建。將抗人HER2/neu scFv :C6MH3_B1的H和L鏈可變區(qū)分別插入人γ 3Η鏈(ρΑΗ4802) 和κ L鏈(pAG4622)表達(dá)載體(22)，并用于產(chǎn)生該特異性的嵌合IgG3。為了構(gòu)建抗人HER2/ neu-IgG3 (C6MH3-B1) -IFN- α融合蛋白，首先利用PCR給成熟小鼠IFN-α基因上游導(dǎo)入 BamHl限制酶位點(diǎn)，下游導(dǎo)入XbaI限制酶位點(diǎn)，其中IFN-α基因是用正向引物5' -CGC GGA TCC TGTGAC CTG CCT CAG ACT C_3 (SEQ ID NO 55)和反向引物 5' -GCT CTA GATCAT TTC TCT TCT CTC AGT CTT C_3 (SEQ ID NO 56)由 BALB/c 小鼠的基因組 DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增的。將 最終的PCR產(chǎn)物連接到TA載體中。得到的載體在測(cè)序后，用BamHl和Xb a I消化從而釋放 出插入載體PAH9612中的DNA片段，pAH9612含有IgG3恒定區(qū)，其中C6MH3-B1H鏈可變區(qū) 和GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO 57)肽接頭位于CH3末端。最后的PCR產(chǎn)物pAH9616含有 抗 HER2/neu-IgG3，之后是 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO 57)肽接頭和小鼠 IFN-a。
重組蛋白的生產(chǎn)和純化將編碼融合了 IFN- α的含有C6MH3-B1可變區(qū)的IgG3H鏈的質(zhì)粒，以960 μ Fd電 容和0. 2V的脈沖經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染到P3X63Ag8. 653細(xì)胞中，所述細(xì)胞或者表達(dá)含有C6MH3-B1 可變區(qū)(23)的L鏈，從而產(chǎn)生抗HER2/neu-IgG3-IFN-a ；或者表達(dá)非特異性的L鏈(4D5 ； Genentech) (6)，從而產(chǎn)生 IgG3_IFN_ a。挑選產(chǎn)生抗 HER2/neu (C6MH3-B1) _IgG3、抗 HER2/ neu(C6MH3-Bl)-IgG3-IFN-a或IgG3_IFN_a的轉(zhuǎn)染體，并按照以前的描述(6)進(jìn)行表征。 利用固定在S印harose 4B fast flow(Sigma-Aldrich)上的蛋白G從培養(yǎng)物上清中純化 抗 HER2/neu(C6MH3-Bl)-IgG3，利用固定在 S印harose 4B fast flow (Sigma-Aldrich)上 的蛋白A從培養(yǎng)物上清中純化抗HER2/neu(C6MH3-Bl)-IgG3-IFN-a和IgG3_IFN_a。將 SDS-PAGE分離的蛋白進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色來評(píng)價(jià)蛋白的純度和完整性。用國(guó)立衛(wèi)生院提供 的小鼠IFN-α的國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)來確定融合蛋白的IFN活性。rIFN_a從PBLBiomedical Laboratories —。IgG3-IFN-a融合蛋白的FPLC分析 為了確定融合蛋白在溶液中是以單體和/或聚合物存在的，將混合了作為內(nèi)部對(duì) 照的 400 μ g OVA 的 100 μ g IgG3-IFN" α 在 30 X 1. 5-cm Superose 6 柱上通過凝膠過濾進(jìn) 行分析，其中所述Superose 6柱子連接快速蛋白液相層析(FPLC)，分析使用PBS，以0. 5ml/ 分鐘流速進(jìn)行。在同一柱子上進(jìn)行IgA2m(主要以分子量350kDa的二體Ab存在)、由Miles IgG(分子量150kDa)和0VA(分子量45kDa)組成的混合物的凝膠過濾以提供分子量標(biāo)準(zhǔn)。HER2/neu結(jié)合活性的流式細(xì)胞術(shù)分析為了檢測(cè)各種抗HER2/neu融合蛋白與CT26/HER2細(xì)胞的反應(yīng)性，將IX IO6細(xì)胞 與IOpM融合蛋白在4°C溫育1小時(shí)。某些試驗(yàn)中，融合蛋白在與CT26/HER2細(xì)胞溫育前， 先與900U肝素于4°C溫育17小時(shí)。然后細(xì)胞與生物素化的1/100稀釋的大鼠抗人IgG(BD Biosciences)反應(yīng)。用1/1500稀釋的PE標(biāo)記鏈霉親和素(BD Biosciences)檢測(cè)結(jié)合的 生物素化Abs，通過流式細(xì)胞術(shù)用FACScan (BD Biosciences)分析細(xì)胞。IFN-α抗病毒活性對(duì)水泡性口炎病毒(VSV)感染敏感的L-929成纖維細(xì)胞系被用于定量IFN- α的 生物活性。將L-929細(xì)胞以4Χ IO4細(xì)胞/孔的密度接種在96孔組織培養(yǎng)板(Falcon ；BD Biosciences)中，于37°C在5% C02氣中溫育過夜。之后，加入不同IFN-α融合蛋白或標(biāo) 準(zhǔn) IFN-a (小鼠 IFN-a 的國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)；National Institutes of Health,Bethesda,MD) 的梯度稀釋液，培養(yǎng)板在37°C溫育24小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入四千PFU的VSV，于37°C 再溫育48小時(shí)。存活的貼壁細(xì)胞用50μ1結(jié)晶紫(溶于20%乙醇的0.05%溶液)染色10 分鐘。將培養(yǎng)板水洗，加入100 μ 1 100%甲醇將存留的染料溶解。用ELISA檢測(cè)儀在595nm 讀培養(yǎng)板。抗HER2/neu-IgG3-IFN_a抗增殖效果的檢測(cè)法簡(jiǎn)單來說，將38C13或38C13/HER2細(xì)胞以1. 25 X IO4細(xì)胞/孔的密度接種在96孔 組織培養(yǎng)板中，加入不同融合蛋白的梯度稀釋液。然后將培養(yǎng)板在5% C02氣中于37°C溫 育48小時(shí)。加入20 μ 1 MTS溶液(Promega)使培養(yǎng)板顯色，并用ELISA檢測(cè)儀在490nm進(jìn) 行分析。增殖抑制率(百分?jǐn)?shù))計(jì)算為IOOx [ (0D 試驗(yàn)-ODfie)/ (0D培養(yǎng)基—0D 空白)]xl00。
細(xì)胞凋亡的檢測(cè)法簡(jiǎn)單來說，將1 X IO6細(xì)胞用不同融合蛋白處理72小時(shí)。然后用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。使用 Vybrant Apoptosis Assay Kit 2 (Molecular Probes)，按照制造商建議的步驟 進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(PI)檢測(cè)。標(biāo)記CFSE的38C13/HER2腫瘤細(xì)胞的增殖簡(jiǎn)單來說，將1 X IO6 細(xì)胞與 2. 5 μ M CFSE (Molecular Probes)于 37°C溫育 10 分 鐘。然后細(xì)胞用InM不同融合蛋白處理48小時(shí)，使用CellTraceCFSE Cell Proliferation Kit (Molecular Probes)，按照制造商建議的步驟進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。小鼠使用從Taconic Farms得到的6_8周齡的雌性C3H/HeN小鼠。將動(dòng)物用帶有木刨 花床墊的高壓滅菌的聚碳酸酯籠子關(guān)在實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物可隨意取食和水。以12/12小時(shí)的晝 夜循環(huán)給予人工光照。實(shí)驗(yàn)室的溫度為20°C，每小時(shí)進(jìn)行10-15次換氣。半衰期將小鼠rIFN_a(PBL Biomedical Laboratories)、IgG3_IFN_ α 禾P 抗 HER2/ neu-IgG3-IFN-a用Iodo-Beads (Pierce)，按照制造商的試驗(yàn)方案用125I碘化為IOyCi/ μ go小鼠i.p.注射66yCi of 125I標(biāo)記的蛋白。在注射125I標(biāo)記的rIFN-a、IgG3_IFN_ a 或抗HER2/neu-IgG3-IFN-a后的不同間隔，用小鼠全身放射性計(jì)數(shù)器(Wm. B. Johnson and Associates)測(cè)量存留的放射性。腫瘤攻擊和Ab療法C3H/HeN小鼠經(jīng)s. c.接受1000 38C13/HER2腫瘤細(xì)胞。在腫瘤攻擊后的第1、3 和5天或者12、13和14天，通過i.p.注射給予治療。每隔一天對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)量，使用以 下公式估計(jì)腫瘤體積(立方毫米)[長(zhǎng)(mm) X寬(mm) X高(mm)]/2 (24)。觀察動(dòng)物直至 s. c.腫瘤的長(zhǎng)度達(dá)到15mm或者直至觀察到任何小鼠遭受折磨或似乎頻臨死亡。達(dá)到這些 條件的動(dòng)物按照研究所政策人道地處死。Western 印跡分析禾口 Ab簡(jiǎn)單來說，38C13/HER2細(xì)胞用不同融合蛋白處理指定的時(shí)間，用冰冷的PBS清 洗，在裂解緩沖液(0. 125% Nonidet P-40,0. 875% Brij 97、IOmMTris-HCl (pH 7.5)、2mM EDTA、0. 15M NaCl、0.4mM Na3V04、0. 4mM NaFUmM PMSF、2. 5 μ M 亮肽素(leup印tin)禾口 2. 5 μ M抑酶肽(aprotinin))中在冰上裂解10分鐘。細(xì)胞裂解物于4°C以10，OOOxg澄清10 分鐘。然后將蛋白樣品在樣品緩沖液中煮沸，隨后在8% SDS-PAGE膠上分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏 氟乙烯微孔膜(Millipore)。用溶于 150mM NaCl、50mM Tris-HCl (pH 7. 6 ；TBS)的 3% BSA 在室溫下封閉1小時(shí)后，印跡用指定的第一 Abs在4°C過夜檢測(cè)。然后印跡在室溫下用溶于 TBS的0. 05% Tween 20清洗3次，與合適的偶聯(lián)了 HRP的二抗溫育，并借助過氧化物酶催 化的ECL檢測(cè)系統(tǒng)(ECL5Pierce)檢測(cè)。多克隆兔抗磷酸化STATl購(gòu)買自Cell Signaling Technology。多克隆偶聯(lián)HRP的驢抗兔IgG購(gòu)買自Amersham Biosciences。多克隆兔抗 GAPDH 購(gòu)買自 Abeam。統(tǒng)計(jì)分析體外研究用雙尾Student’ s t檢驗(yàn)，動(dòng)物存活曲線用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Mantel-Cox)分 析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果抗HER2/neu-IgG3-IFN_a 的生產(chǎn)和表征帶有C6MH3-B1 (20)可變區(qū)的抗HER2/neu_IgG3的構(gòu)建和表達(dá)以前已有描述 (23)。成熟小鼠IFN-a的氨基末端被融合到抗HER2/neU-IgG3的羧基末端，之間被柔 性的[(Gly4) Ser] 3 (SEQ ID NO 31)接頭(圖2A)隔開。通過將C6MH3-B1L鏈代替為 4D5 (rhuMab HER2，赫賽?。籊enentech) L鏈構(gòu)建得到缺乏HER2/neu特異性的相同融合蛋 白IgG3-IFN-a。利用蛋白G從培養(yǎng) 物上清中純化得到的蛋白在非還原和還原性條件下通 過SDS-PAGE分析(圖2B)。在沒有還原劑的情況下，抗HER2/neu-IgG3 (圖2B，泳道1)以 170kDa 的分子量遷移，而抗 HER2/neu-IgG3-IFN- α (圖 2B，泳道 2)和 IgG3_IFN_ α (圖 2B， 泳道3)是210kDa，這是附著了兩個(gè)分子小鼠IFN-α的完整IgG3所預(yù)期的大小(圖2A)。 用還原劑處理后，在這些蛋白中可以看到以25kDa分子量遷移的L鏈(圖2B，泳道4_6)。 但是，抗HER2/neu-IgG3帶有分子量為60kDa的H鏈(圖2B，泳道4)，而IgG3_IFN_ α (圖 2Β，泳道5)和抗HER2/neu-IgG3-IFN- α (圖2B，泳道6)正如預(yù)期的，帶有分子量80kDa的 H鏈。泳道1下方的條帶(圖2B)是同樣會(huì)與蛋白G柱子結(jié)合的牛IgG;牛H和L鏈在泳道 4中也可看到(圖2B)，在泳道5和6中較淺(圖2B)。FPLC分析顯示IgG3_IFN_ α融合蛋 白在溶液中以單體存在(數(shù)據(jù)未顯示)?？笻ER2/neu-IgG3_IFN- α的Ag結(jié)合和抗病毒活性抗HER2/neu-IgG3 和抗 HER2/neu-IgG3_IFN- α 均能結(jié)合表達(dá)高水平人 HER2/neu 的CT26/HER2細(xì)胞，而IgG3_IFN_ α僅能微弱結(jié)合CT26/HER2 (圖2C)。多種細(xì)胞因子包括 IL-U IL-2、IL-6(25)和IFN-α (26)曾顯示與肝素有相互作用。為了確定IgG3_IFN_a 和CT26/HER2之間的弱相互作用是否由于肝素結(jié)合，在添加給CT26/HER2之前，將蛋白與 肝素一起溫育。肝素抑制IgG3-IFN-a結(jié)合到CT26/HER2細(xì)胞上，但是沒有抑制抗HER2/ neu-IgG3 和抗 HER2/neu-IgG3_IFN- α 的結(jié)合(圖 2C)。這些結(jié)果顯示抗HER2/neu-IgG3-IFN_a保留了它結(jié)合Ag的能力，IgG3_IFN_ α不 識(shí)別HER2/neu。對(duì)VSV感染敏感的L-929成纖維細(xì)胞系用于定量融合蛋白與IFN- α標(biāo)準(zhǔn) 相比的IFN-α生物活性。抗HER2/neu-IgG3-IFN_a和IgG3_IFN_a在L-929細(xì)胞中均表 現(xiàn)出 2400U/ μ g的抵抗VSV誘導(dǎo)型細(xì)胞毒性的IFN- α活性，而抗HER2/neu_IgG3未表現(xiàn) 抗病毒活性(圖2D)。融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性為了確定抗HER2/neu-IgG3-IFN- α的體內(nèi)抗腫瘤活性，同種小鼠s. c.接種 1 X 10338C13/HER2腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤攻擊后第1、3和5天通過i. p.給予不同劑量的蛋 白進(jìn)行處理(圖3A-圖3B)。用2.5yg IgG3-IFN-a處理過的小鼠顯示出腫瘤生長(zhǎng)的 某些消退，8只小鼠中的一只(13%)在50天后仍存活(圖3A)。但是，利用腫瘤特異性 Ab將IFN-a體內(nèi)導(dǎo)靶到腫瘤顯著地提高了它的抗腫瘤效果。所有用2.5yg(圖3A)抗 HER2/neu-IgG3-IFN- α處理過的小鼠在腫瘤攻擊后，50天沒有腫瘤(與PBS對(duì)照相比ρ =0.0048)，并且處理的小鼠均未顯示毒性。因此，與連接了非特異性Ab的IFN-α相比， IFN-α導(dǎo)靶到腫瘤細(xì)胞表面導(dǎo)致明顯的抗腫瘤活性(ρ = 0.007)。當(dāng)使用較低劑量時(shí)，被 定靶的抗HER2/neu-IgG3-IFN-a繼續(xù)表現(xiàn)出強(qiáng)的抗腫瘤活性。用Iyg(圖3B)抗HER2/ neu-IgG3-IFN-a處理過的8只小鼠中的7只(88% )在50天后仍然沒有腫瘤。形成強(qiáng)烈對(duì)比的是，IgG3-IFN-a處理過的小鼠在這個(gè)較低劑量表現(xiàn)出與用PBS處理的小鼠類似的 腫瘤生長(zhǎng)(P = O. 183)，8只小鼠中只有1只(13%)存活。當(dāng)處理增加到三個(gè)5yg劑量， 抗HER2/neu-IgG3-IFN-a和IgG3_IFN_a均能有效防止腫瘤生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)，明確地 反映了 38C13細(xì)胞對(duì)IFN-a處理敏感的事實(shí)(21，27，28)。用5 μ g抗HER2/neu_IgG3 Ab 處理過的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況與PBS對(duì)照相同，表明Ab自身沒有體內(nèi)抗腫瘤效果(數(shù)據(jù)未 顯示)。這些結(jié)果表明通過腫瘤特異性Ab將IFN-a導(dǎo)靶到腫瘤細(xì)胞可以顯著強(qiáng)化其效力， 這一點(diǎn)在給予低劑量時(shí)可以明顯地看出。重要的是，可以在沒有明顯毒性的情況下，達(dá)到該 抗腫瘤活性。融合了 Ab的IFN-a與游離IFN-α相比，抗腫瘤活性提高
正如上文所述，我們發(fā)現(xiàn)融合了非腫瘤特異性Ab的IFN- α展示出抗腫瘤活性。為 了將它與可溶性rIFN-a的抗腫瘤活性比較，給小鼠s. c接種1 X 10338C13/HER2腫瘤細(xì)胞， 并在腫瘤攻擊后第1和3天通過i. p.給予9600υ(4μ g)IgG3-IFN-a或9600U rIFN-a進(jìn) 行處理(圖4A)。所有用9600U的IgG3-IFN-a處理過的小鼠均顯示延遲的腫瘤生長(zhǎng)，75% 的小鼠在腫瘤攻擊后50天沒有腫瘤(ρ = 0. 027)。反之，用相同數(shù)量單位的rIFN-a處理 過的小鼠與PBS對(duì)照在它們的腫瘤生長(zhǎng)模式方面沒有顯著不同。IFN-a的體內(nèi)半衰期非常短(29)。在以前的研究中，Abs與細(xì)胞因子的融合 顯示能夠提高細(xì)胞因子的半衰期(6)。125I標(biāo)記的rIFN- a、IgG3_IFN_ α或抗HER2/ neu-IgG3-IFN- α的清除在C3H/HeN小鼠中進(jìn)行檢驗(yàn)。小鼠i. p.注射66 μ Ci的125I標(biāo)記的 蛋白，并用小鼠全身計(jì)數(shù)器測(cè)量殘存的放射性。rIFN-a被快速清除，到 2. 5小時(shí)時(shí)50% 已被除掉(4B)。相反，抗HER2/neu-IgG3-IFN-a和IgG3_IFN_a顯示出體內(nèi)半衰期 的顯著提高，清除50%所注射的放射性需要8小時(shí)。IFN-a融合蛋白的抗腫瘤效力可能得 益于這個(gè)提高的半衰期。因此，IFN-a上融合了 IgG3 Ab可以顯著提高IFN-α的體內(nèi)抗 腫瘤活性。但是，通過將IFN-a導(dǎo)靶至腫瘤可以進(jìn)一步提高該抗腫瘤活性，使它在較低劑 量也有效果。抗HER2/neu-IgG3-IFN_a體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖IFN-a具備多種活性，其中包括免疫應(yīng)答和抗腫瘤的直接細(xì)胞毒性。為了研 究使用抗HER2/neu-IgG3-IFN-a或IgG3_IFN_a時(shí)看到的抗腫瘤效果的潛在機(jī)制，用 1X 10338C13/HER2腫瘤細(xì)胞攻擊一直無腫瘤的8只小鼠(參見圖3A)。令人驚訝地，所有 小鼠和未處理小鼠一樣，快速發(fā)展出龐大的腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果暗示，在低腫瘤 負(fù)荷的試驗(yàn)條件下，IFN-α融合蛋白沒有啟動(dòng)保護(hù)性的獲得性免疫反應(yīng)，相反，其強(qiáng)大的抗 腫瘤活性是由先天性免疫系統(tǒng)或者作用于腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒效果介導(dǎo)的。為了確定IFN-a融合蛋白是否對(duì)腫瘤細(xì)胞是直接細(xì)胞毒性的，將38C13/HER2或 親代38C13腫瘤細(xì)胞與不同蛋白溫育48小時(shí)，利用MTS檢測(cè)法測(cè)量細(xì)胞增殖情況。用抗 HER2/neu-IgG3進(jìn)行的處理未能顯著抑制38C13/HER2或親代38C13腫瘤細(xì)胞的增殖(圖 5A 和圖 5B)。盡管抗 HER2/neu-IgG3-IFN-a 和 IgG3-IFN-a 均能抑制 38C13/HER2 腫瘤細(xì) 胞的增殖，抗HER2/neu-IgG3-IFN- α比IgG3_IFN_ α更有效，兩者的IP50值分別為10禾口 IOOpM(圖 5A)。相反，抗 HER2/neu-IgG3-IFN-a 和 IgG3_IFN_a 對(duì)親代 38C13 腫瘤細(xì)胞表 現(xiàn)出類似的抗增殖活性。這些結(jié)果提供證據(jù)表明IFN-a融合蛋白可以直接抑制B細(xì)胞淋 巴瘤38C13的增殖，IFN-a被導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞強(qiáng)化了這一效果。
抗HER2/neu-IgG3-IFN_a體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡IFN-α信號(hào)傳導(dǎo)可以在某些腫瘤細(xì)胞系中誘發(fā)細(xì)胞凋亡。為了確定我們觀察到的 抗增殖效應(yīng)是否歸因于細(xì)胞凋亡，利用膜聯(lián)蛋白V親和分析法(30)分析用不同蛋白處理過 的38C13/HER2細(xì)胞將腦磷脂從細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)層轉(zhuǎn)位到外片層的情況。利用PI將死細(xì)胞染色， 該染料破壞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞并與DNA結(jié)合。與PBS對(duì)照相比，用抗HER2/neu-Ig G3處理后，死 細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白V/PI明亮，2% )或早期凋亡細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白V明亮，3% )的數(shù)量沒有增 力口(圖5C)。相反，當(dāng)用IgG3-IFN-Ci處理細(xì)胞時(shí)，死細(xì)胞(21% )和早期凋亡細(xì)胞(6% ) 的數(shù)量有明顯增加。用抗HER2/neU-IgG3-IFN-a進(jìn)行的處理使得死細(xì)胞(33%)和早期凋 亡細(xì)胞(16%)的數(shù)量進(jìn)一步增加。這些結(jié)果表明，IFN-a可以在38C13/HER2腫瘤細(xì)胞中 誘發(fā)細(xì)胞凋亡，IFN-α被導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞可以顯著提高這一效果。除了誘發(fā)細(xì)胞凋亡，IFN-a可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(31)。為了確定抑制 增殖和細(xì)胞凋亡在被處理的腫瘤細(xì)胞中是否均有發(fā)生，將CFSE標(biāo)記的8C13/HER2細(xì)胞用不 同蛋白處理48小時(shí)，選通活細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)確定CFSE的水平?？笻ER2/neu-IgG3處 理過的細(xì)胞(圖5D，細(xì)線)與PBS處理過的細(xì)胞的CFSE信號(hào)重疊，比標(biāo)記CFSE后立即固 定的細(xì)胞的信號(hào)明顯低(圖5D，虛線)，表明抗HER2/neu-IgG3未能抑制38C13/HER2的增 殖。相反，IgG3-IFN-a明顯抑制存活的38C13/HER2細(xì)胞的增殖(圖5D，粗線)，通過HER2/ neu-IgG3-IFN-a將IFN-α導(dǎo)靶至38C13/HER2細(xì)胞強(qiáng)化了這一效果(圖5D，黑色區(qū)域)。 這些結(jié)果表明盡管抗HER2/neu-IgG3-IFN- α處理未能在48小時(shí)導(dǎo)致全部細(xì)胞死亡，存活 細(xì)胞的增殖能力降低。IFN-α融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中誘發(fā)了 STATl激活盡管結(jié)合IFN-a受體能夠啟動(dòng)多個(gè)STAT蛋白的激活，STATl在介導(dǎo)IFN-α依 賴性的信號(hào)傳導(dǎo)中起著專門的作用(32)。為了研究IFN-a融合蛋白能否在38C13/HER2 中啟動(dòng)IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)，將IFN-a導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞是否增強(qiáng)該效果，我們檢驗(yàn)了處理 后STATl的磷酸化。如圖6A-6C所示，抗HER2/neu-IgG3-IFN- α和IgG3_IFN- α均能在 38C13/HER2內(nèi)啟動(dòng)強(qiáng)STATl磷酸化，至10分鐘時(shí)，STATl磷酸化提高8倍。但是，抗HER2/ neu-IgG3-IFN-a誘發(fā)的STATl磷酸化持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，抗HER2/neu-IgG3_IFN-α處理過的 細(xì)胞在30、60和90分鐘時(shí)觀察到更高的STATl磷酸化。這些結(jié)果表明，IFN-a融合蛋白 能夠在38C13淋巴瘤細(xì)胞中誘發(fā)IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)，IFN-α被導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞強(qiáng)化了這一 效果?？笻ER2/neu-IgG3-IFN_a表現(xiàn)出抗已有腫瘤的強(qiáng)活性因?yàn)榭笻ER2/neu-IgG3-IFN_a表現(xiàn)出抗38C13/HER2腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒性， 我們考察了抗HER2/neu-IgG3-IFN-a能否有效抗已建立的38C13/HER2腫瘤。給同種小 鼠s. c.接種1X 10338C13/HER2腫瘤細(xì)胞，腫瘤攻擊后第12、13和14天用5yg(圖7) 指定蛋白進(jìn)行i. P.處理。第12天，腫瘤平均大小是100mm3，用PBS或IOyg抗HER2/ neU-IgG3進(jìn)行的處理未能抑制腫瘤生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)。用5yg IgG3-IFN-a進(jìn)行的處 理顯示抑制腫瘤生長(zhǎng)的某些效果；但是，所有小鼠都發(fā)展出大塊的腫瘤，在腫瘤攻擊32天 后，沒有小鼠存活。相反，用5yg抗HER2/neu-IgG3-IFN-a處理過的全部小鼠的腫瘤生 長(zhǎng)都得以延遲，8只小鼠中的3只腫瘤完全消退，腫瘤攻擊后50天仍沒有腫瘤(抗HER2/ neu-IgG3-IFN-a 相對(duì) PBS，ρ = 0. 0001 ；抗 HER2/neu-IgG3_IFN-α 相對(duì) IgG3_IFN_a，ρ =0. 063)。因此，IgG3-IFN- α 和抗 HER2/neu-IgG3_IFN- α 均顯示抗腫瘤活性，但抗 HER2/ neu-IgG3-IFN-a能夠更有效地延遲腫瘤生長(zhǎng)，只有抗HER2/neu-IgG3_IFN-α處理過的小 鼠中觀察到了腫瘤的完全緩解。當(dāng)處理劑量增加到10μ g融合蛋白時(shí)，幾乎所有用抗HER2/ neu-IgG3-IFN-a或IgG3-IFN-a處理過的小鼠都發(fā)生了腫瘤的完全消退，50天后仍然沒 有腫瘤。 用三個(gè)IOyg劑量的融合蛋白處理后仍然沒有腫瘤的小鼠在第50天再次用 1X 10338C13/HER2腫瘤細(xì)胞攻擊。全部小鼠保持沒有腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明， 當(dāng)用融合了 Ab的IFN-a處理較大的已建立腫瘤時(shí)，伴有免疫記憶的獲得性免疫反應(yīng)被啟 動(dòng)。討論盡管rIFN-a已顯示出抗B細(xì)胞淋巴瘤和多種骨髓瘤的活性，但效果不穩(wěn)定及其 系統(tǒng)毒性限制了它的應(yīng)用(33)。本研究顯示，將IFN-a與Ab融合提高了其抗腫瘤效力， 當(dāng)IFN-a通過腫瘤特異性Ab導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞時(shí)，該效力可以進(jìn)一步提高。這一抗腫瘤效 力未發(fā)現(xiàn)有任何明顯的毒性相伴。這些研究表明，IFN-a與腫瘤特異性Ab融合可產(chǎn)生治 療B細(xì)胞淋巴瘤的高效生物藥劑。為了驗(yàn)證利用Ab將IFN-α導(dǎo)向腫瘤部位能夠使效力提高的猜想，我們選擇了已 被詳細(xì)研究過的小鼠B細(xì)胞淋巴瘤，該淋巴瘤經(jīng)工程化能夠表達(dá)常見TAA :HER2/neU，其有 Abs可供使用?？笻ER2/neU-IgG3-IFN-a看來能比以前描述過的免疫治療劑更有效地治療 38C13B細(xì)胞淋巴瘤，雖然在本研究中通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)引入的外來Ag是目標(biāo)物。在腫瘤攻擊 1天后開始的三個(gè)1 μ g劑量抗HER2/neu-IgG3-IFN- α處理看來與腫瘤攻擊1天后開始的 IOyg抗Id IgGl-IL-2融合蛋白處理5天(34)同樣有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，抗HER2/ neu-IgG3-IFN-a能夠有效地抗已建立的腫瘤(圖7)，而抗IdIgGl-IL_2處理如果是在腫 瘤攻擊3或7天后開始，其抗腫瘤活性很低(34)。治愈已建立腫瘤的能力也表明Ab導(dǎo)靶的 IFN-α是比GM-CSF(35)、CTLA-4(36)或融合了 Id Ag的CD40配體(37)更強(qiáng)的治療劑，因 為這些疫苗都不能有效地抗已建立的腫瘤。因此，將IFN-a導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞可以是很有前 景的治療B細(xì)胞淋巴瘤的方法。利用腫瘤特異性Ab將IFN-α導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞提高了 IFN-α的抗腫瘤效力?？?HER2/neu-IgG3-IFN-a能夠比IgG3_IFN_a更有效地在38C13/HER2中抑制增殖和誘發(fā)細(xì) 胞凋亡(圖5A-圖5D)，用2. 5或1 μ g抗HER2/neu-IgG3-IFN- α進(jìn)行的處理比相同劑量的 IgG3-IFN-a能夠更有效地抑制體內(nèi)小腫瘤的生長(zhǎng)(圖3A和圖3B)。這些結(jié)果表明腫瘤特 異性Ab將IFN-α定向到腫瘤，從而提高了其治療指數(shù)，而系統(tǒng)毒性下降。不同尋常的是，IgG3-IFN-a表現(xiàn)出比rIFN-a更強(qiáng)的抗腫瘤活性(圖4A)。雖 然rIFN-a能夠有效治療多種腫瘤(38-40)，但需要用高劑量做長(zhǎng)時(shí)間治療才能看到抗腫 瘤活性，這部分是因?yàn)樵摷?xì)胞因子的半衰期非常短。在本研究中，我們展示了給IFN-a融 合上IgG3 Ab顯著提高了它的半衰期(圖4B)，融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性的提高可得益于 該延長(zhǎng)的半衰期(圖4A)。此夕卜，IgG3-IFN- α的Fc區(qū)可能幫助IFN- α導(dǎo)靶到B淋巴瘤細(xì) 胞上存在的Fc受體，從而提高了抗腫瘤活性。因此，IFN-α與IgG3 Ab的融合提供了改進(jìn) IFN-α的抗腫瘤效力的多方面優(yōu)勢(shì)。雖然IFN-a具備包括激活免疫反應(yīng)在內(nèi)的多種活性，但看來直接的細(xì)胞毒性在抗HER2/neu-IgG3-IFN-a的強(qiáng)抗腫瘤活性中起著重要作用。IFN-α融合蛋白均顯示針對(duì) 38C13/HER2的細(xì)胞凋亡和抗增殖活性，而導(dǎo)靶到腫瘤顯著提高了這些效果(圖5A-圖5D)。 雖然IFN-a融合蛋白能夠非常有效地治療小腫瘤(圖3A和圖3B)，存活的小鼠均未發(fā)展 出能夠保護(hù)它們免于第二次腫瘤攻擊的免疫反應(yīng)，這表明IFN-a融合蛋白的直接細(xì)胞毒 性非常有效地殺滅了腫瘤細(xì)胞，當(dāng)僅有小的腫瘤負(fù)荷時(shí)，獲得性免疫沒有發(fā)揮作用。因?yàn)?38C13是一個(gè)極度惡性的B淋巴瘤細(xì)胞系，僅注射200個(gè)細(xì)胞的小鼠在20天內(nèi)就會(huì)發(fā)展出 大塊的腫瘤(36)，IFN-α融合蛋白一定要非常有效地殺死多數(shù)接種的腫瘤細(xì)胞才能有長(zhǎng) 期存活者。包括下調(diào)NF-K B(41)、通過激活半胱天冬酶(CaSpaSe)-3誘發(fā)細(xì)胞凋亡(42) 以及上調(diào)TRAIL和TRAIL受體(43)的多種機(jī)制都曾被顯示參與IFN-α介導(dǎo)的抗腫瘤細(xì)胞 的細(xì)胞毒性，我們預(yù)計(jì)在Ab-IFN-α融合蛋白中看到的抗腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性也得益 于這些機(jī)制。與此一致的，用融合蛋白處理腫瘤細(xì)胞后，我們觀察到了 STATl的活化(圖 6A-6C)。雖然在接種腫瘤1天后開始對(duì)小鼠進(jìn)行處理的情況下，IFN-α融合蛋白未能啟動(dòng) 記憶性免疫反應(yīng)，當(dāng)小鼠在接種腫瘤后12天開始接受處理時(shí)，IFN-α融合蛋白啟動(dòng)的免疫 反應(yīng)能夠保護(hù)小鼠抗第二次腫瘤攻擊。因此，在有較大腫瘤負(fù)荷時(shí)，IFN-α融合蛋白會(huì)激 活保護(hù)性獲得性免疫。因?yàn)镮FN-α能夠借助刺激DC的分化和成 熟而激活獲得性免疫(9)， 有可能在有IFN-α的情況下，已建立的腫瘤提供了更多TAA用于DC活化。此外，在這個(gè)模 型中，外來的Ag-人HER2/neu可能通過提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性而促進(jìn)了抗腫瘤免疫力。⑶20作為B細(xì)胞表達(dá)的Ag在多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤中都有表達(dá)(44)，抗⑶20 (利妥 昔單抗，Genentech ；)是最成功的癌癥治療劑之一，其抗淋巴瘤的效力強(qiáng)而毒性很小(45)。 盡管抗HER2/neu IgG3_IFN_ α能夠非常有效地抗38C13/HER2，正常情況下HER2/neu不會(huì) 在淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此它可能在治療淋巴瘤方面只有有限的治療應(yīng)用，但應(yīng)當(dāng)能夠有 效地治療表達(dá)HER2/neu的癌癥。相反，IFN-α與抗⑶20的融合預(yù)計(jì)能夠產(chǎn)生有效抗淋巴 瘤的融合蛋白，通過在一種蛋白中結(jié)合了抗CD20的抗淋巴瘤活性和IFN-a的強(qiáng)免疫刺激 和細(xì)胞毒活性得到更高的抗腫瘤活性。此外，正如在B細(xì)胞淋巴瘤患者中觀察到的(46)， IFN-α處理后，IFN-α可進(jìn)一步上調(diào)⑶20的表達(dá)。目前，我們正在研究抗⑶20_IFN_ α融 合蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠模型中的效果。總之，我們構(gòu)建了新的融合蛋白并對(duì)其進(jìn)行了表征，所述融合蛋白中IFN-a連接 著識(shí)別TAA的抗體。我們的結(jié)果表明IFN-a與腫瘤特異性抗體的融合強(qiáng)烈地提高了 IFN-a 的抗腫瘤活性而未觀察到任何明顯的毒性。不尋常的是，Ab-IFN-α融合蛋白能夠有效地 抗已建立的腫瘤。因此，融合了腫瘤特異性抗體的IFN(例如，IFN-a)顯示出治療B細(xì)胞 淋巴瘤的前景。參考文獻(xiàn)1. 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產(chǎn)生⑶20的特異性重組抗體。擴(kuò)增抗CD20(利妥昔單抗)的可變區(qū)并將其克隆到用于產(chǎn)生帶有人κ輕鏈和Y3 重鏈的嵌合抗體的表達(dá)載體中。產(chǎn)生蛋白并利用流式細(xì)胞術(shù)和人B細(xì)胞系Daudi檢驗(yàn)其識(shí) 別⑶20的能力。如圖8所示，重組蛋白能夠和重組IgGl-利妥昔單抗一樣好地結(jié)合⑶20。制備連接著CD20特異性抗體的人干擾素的抗體融合蛋白a.融合蛋白的設(shè)計(jì)當(dāng)我們最初嘗試制備融合蛋白時(shí)，我們利用由(Gly4Ser) 3構(gòu)成的柔性甘氨酸_絲 氨酸接 頭(SEQ ID NO 31)將IFN-α與人IgG3基因的羧基端連在一起。圖9中圖示了重 鏈。驗(yàn)證融合蛋白載體帶有正確的核苷酸序列后，將它與嵌合抗CD20輕鏈一起轉(zhuǎn)染 至NSO細(xì)胞中。通過ELISA篩選產(chǎn)生IgG的轉(zhuǎn)染子。將給出最強(qiáng)信號(hào)的克隆擴(kuò)增，隨后的 亞克隆生長(zhǎng)在轉(zhuǎn)瓶中。然后將上清過蛋白AS^harose柱，洗脫結(jié)合的蛋白，并在未還原和 還原后通過SDS-PAGE分析(參見圖10)。盡管分離的蛋白組裝成了 H2L2分子，多數(shù)分離的 蛋白比預(yù)期的小。進(jìn)行還原后，多數(shù)重鏈比預(yù)期的小，與不含融合蛋白的Y3重鏈遷移到 相同的位置。干擾素看來被蛋白水解從融合蛋白中去除了。使用抗Fc和抗干擾素進(jìn)行的 Western印跡分析證實(shí)，兩個(gè)上方的條帶都是重鏈，但只有最大條帶含有干擾素。柔性接頭可能成為蛋白水解切割的目標(biāo)物。因此，我們將接頭縮短到只有一個(gè)拷 貝的Gly4SeHSEQ ID NO :32)。將這些載體和帶有延長(zhǎng)的接頭的載體與合適的輕鏈一起瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。細(xì)胞通過在35S-甲硫氨酸中生長(zhǎng)被同位素標(biāo)記，用蛋白A沉淀 免疫球蛋白，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖11)。帶有延長(zhǎng)的接頭的融合蛋白發(fā)生了明顯的切 害!]，而當(dāng)只有一個(gè)Gly4Ser (SEQ ID NO :32)構(gòu)成的接頭時(shí)，沒有發(fā)生切割。因此，制備融合 蛋白使用的接頭很重要，可影響到蛋白的穩(wěn)定性。b.融合蛋白對(duì)CD20的識(shí)別為了確定融合蛋白能否識(shí)別⑶20，將表達(dá)⑶20的人細(xì)胞系Daudi與Rituxan、抗 DNS/IgG3-hu-IFN-a 或抗 CD20/IgG3-hu_IFN-α —起溫育?？?CD20/IgG3-hu_IFN-α 比 Rituxan結(jié)合地好(圖12)?？笵NS/IgG3_hu_IFN-α融合蛋白也顯示出一定的結(jié)合，雖然 比任一種⑶20特異性蛋白都弱。我們提出假設(shè)認(rèn)為，抗DNS/IgG3-hu-IFN-a的結(jié)合以及 與Rituxan相比，抗CD20/IgG3-hu_IFN- α的結(jié)合提高是因?yàn)閔u_IFN_ α部分結(jié)合到Daudi 細(xì)胞上表達(dá)的IFN受體。Timmerman實(shí)驗(yàn)室制備了一種表達(dá)人⑶20的小鼠淋巴瘤38C13轉(zhuǎn)染體。Rituxan 和抗CD20/IgG3-mu-IFN-a都能結(jié)合該轉(zhuǎn)染體。抗DNS/IgG3-mu_IFN-α未顯示結(jié)合(圖 13)。c.融合蛋白的抗病毒活性為了評(píng)估hu-IFN-a融合蛋白的抗病毒活性，以2X IO5細(xì)胞/ml接種HeLa細(xì) 胞，并用融合蛋白或羅擾素(重組人干擾素2a)的兩倍梯度稀釋液處理24小時(shí)。然后用 4000pfu/100l·! 1的VSV (水泡性口炎病毒)感染細(xì)胞。72小時(shí)后，細(xì)胞用0. 1 %結(jié)晶紫染 色。為了確定抗病毒感染的保護(hù)作用，可以通過用0. 結(jié)晶紫染色，并用光點(diǎn)密度計(jì)測(cè)量 每孔染料的量來定量感染后存活下來的細(xì)胞，或者計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量。兩種分析法中，融合蛋白 都有顯著的IFN-a活性，但與羅擾素相比，活性下降了大約100倍。
融合蛋白對(duì)Daudi淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和殺滅使用兩種方法來評(píng)價(jià)融合蛋白對(duì)表達(dá)CD20的淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制/殺滅。應(yīng)當(dāng)提到的是這些試驗(yàn)中使用的是天然表達(dá)⑶20的人細(xì)胞系Daudi。第一種方法中，將Daudi 細(xì)胞與不同濃度的IFN-α、抗體或融合蛋白一起溫育72小時(shí)，利用CellTiter 96 Aqueous 細(xì)胞增殖檢測(cè)法評(píng)價(jià)生長(zhǎng)抑制情況(圖14)。盡管抗CD20/IgG3-hU-IFN-a在抗病毒分析 法中表現(xiàn)出較低的IFN-α活性，它和羅擾素顯示出類似的抑制淋巴瘤生長(zhǎng)的能力，這表明 對(duì)IFN-α的導(dǎo)靶增強(qiáng)了其細(xì)胞毒效果。與單獨(dú)的羅擾素相比，抗⑶20/IgG3+羅擾素未顯 示更高的活性。抗DNS/IgG3-hIFN- α、Rituxan和抗⑶20/IgG3只在最高使用濃度處表現(xiàn) 出某些生長(zhǎng)抑制。值得提到的是在這項(xiàng)檢測(cè)法中，融合蛋白比Rituxan更能防止細(xì)胞的生 長(zhǎng)。在第二種方法中，將Daudi細(xì)胞與不同濃度的IFN-α、抗體或融合蛋白溫育72小 時(shí)，然后用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。圖15顯示了使用IOpM 各種蛋白時(shí)得到的結(jié)果。處于細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白V+ΡΓ ；凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì) 胞是膜聯(lián)蛋白V+PI+。這些試驗(yàn)說明了這樣幾點(diǎn)。即使在最高測(cè)試濃度，Rituxan和抗⑶20/IgG3都 僅能誘發(fā)很少甚至不能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。正如預(yù)期，小鼠IFN-α抗人細(xì)胞系不如人重想 IFN-α (羅擾素)有效，不能導(dǎo)靶到腫瘤細(xì)胞的抗DNS/IgG3-mIFiiJ α與重組小鼠IFN-α 效果類似。但是，利用抗⑶20/IgG3-mIFNa將小鼠IFN-α導(dǎo)靶至腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致能夠有效地 誘發(fā)細(xì)胞死亡。抗CD20/IgG3_hIFNa比抗DNS/IgG3_hIF N α更有效，再次顯示了細(xì)胞導(dǎo) 靶在細(xì)胞殺傷中的作用。在該體外檢測(cè)法中，羅擾素和抗CD20/IgG3-hIFNa表現(xiàn)出類似的 活性，即使低至IpM也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，應(yīng)當(dāng)指出的是，在體內(nèi)⑶20/ IgG3-hIFNa會(huì)導(dǎo)靶至腫瘤部位并在此積累，而羅擾素表現(xiàn)的是全身的活性。融合蛋白對(duì)38C13-⑶20淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和殺滅正如上文簡(jiǎn)單提到的，John Timmerman博士的實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)表達(dá)人⑶20的 小鼠淋巴瘤38C13-⑶20，該細(xì)胞系可以在同種C3H/HeJ小鼠中生長(zhǎng)。這一細(xì)胞系使得有 可能檢驗(yàn)我們的融合蛋白的體內(nèi)效力。將38C13-CD20細(xì)胞與各種抗體和融合蛋白溫育48 小時(shí)。然后通過用膜聯(lián)蛋白V和PI將細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)來確定細(xì)胞殺傷和凋 亡。當(dāng)使用濃度為IOOpM的蛋白時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，重組mIFN-a和抗⑶20-IgG3_mIFN-a 都非常高效地導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中抗⑶20-IgG3-mIFN_a比重組mIFN-a略勝一籌。用 抗DNS-IgG3-mIFN-a或Rituxan處理38C13-⑶20細(xì)胞誘發(fā)了某些凋亡。用該濃度的抗 ⑶20/IgG3進(jìn)行的處理未影響細(xì)胞活力。當(dāng)處理濃度降低到10pM(圖16)，重組mIFN-a 和抗⑶20/IgG3-mIFN-a仍然有效地引起細(xì)胞凋亡，其中抗⑶20/IgG3_mIFN-α比重組 mIFN-a更有效。用抗DNS-IgG3_mIFN-α處理后，只觀察到少量的凋亡，這表明利用抗 ⑶20-IgG3-mIFN-a將IFN-a導(dǎo)靶產(chǎn)生了更有效的治療劑。在這個(gè)濃度，Rituxan僅引起 很少的凋亡，表明抗⑶20-IgG3/mIFN-a融合蛋白優(yōu)于未融合的抗⑶20抗體。用抗⑶20/ IgG3進(jìn)行的處理對(duì)細(xì)胞活力還是沒有影響。處理劑量為IpM時(shí)，只有抗⑶20-IgG3-mIFN- α 在38C13-⑶20中誘發(fā)了細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。劑量為0. IpM時(shí)，所有處理都不能誘發(fā) 凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。作為一種替代方法，用不同濃度的各種蛋白處理38C13-⑶20細(xì)胞并利用MTS檢測(cè)法監(jiān)測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制(圖17)?？耿?0/IgG3-mIFN-a能夠最有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，其 次是重組mIFN-α。在抗DNS/IgG3-mIF:Ni-a中觀察到了某些生長(zhǎng)抑制?？耿?0/IgG3 和Rituxan對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響很小。因此，這些檢測(cè)中得到的結(jié)果反映了(mirror)監(jiān)測(cè)細(xì)胞 凋亡時(shí)觀察到的結(jié)果。其他IgG-IFNa融合蛋白的制備和表征
a.抗 CD20-IgGl_mIFNa 和抗 CD20_IgGl_hIFN a將IFN-α與人IgG3骨架融合在一起制備初始的蛋白。Rituxan是一種IgGl。為 了確定免疫球蛋白骨架是否影響融合蛋白的性能，制備了 m-IFN-a和hu_IFN_ α與IgGl 融合的融合蛋白。它們具有預(yù)期的分子量。評(píng)估了抗CD20/IgGl_mIFNa誘發(fā)38C13-CD20細(xì)胞凋亡的能力(圖18)。研究顯 示該蛋白有效，甚至可能比IgG3融合蛋白更有效。評(píng)估了抗⑶20/IgGl-hIFNa誘發(fā)Daudi細(xì)胞凋亡的能力。研究顯示該蛋白與抗 CD20/IgG3-hIFNa 的活性類似(圖 19)。如圖20所示，對(duì)融合蛋白抑制Daudi細(xì)胞生長(zhǎng)的能力進(jìn)行了評(píng)估。IgGl與小鼠和 人IFNa的融合具有IgG3融合體抑制Daudi細(xì)胞生長(zhǎng)方面的能力。b.通過α螺旋接頭將IFN-α與IgG骨架連在一起的融合蛋白。制備融合蛋白，其中GlySer接頭被具有A (EAAAK)2A (SEQ ID NO :33)序列的接頭 代替。所述序列預(yù)期會(huì)折疊成α螺旋。通過在293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)制備蛋白，并通過SDS-PAGE進(jìn)行評(píng)價(jià)。蛋白發(fā)生了 組裝，分子量與預(yù)期相同。沒有觀察到接頭的切割?？笴D20-IgG3_hIFNa ( a -螺旋接頭)融合蛋白在與含有 Gly4Ser (SEQ IDNO 32) 接頭的融合蛋白相同濃度使用時(shí)，能夠有效地誘發(fā)Daudi細(xì)胞的凋亡(圖21)。腫瘤的體內(nèi)治療經(jīng)Timmerman實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)導(dǎo)從而表達(dá)人⑶20的38C13淋巴瘤被用于這項(xiàng)研究。 38C13是生長(zhǎng)在同種C3H/HeJ小鼠中的侵略性的淋巴瘤。轉(zhuǎn)導(dǎo)體38C13-⑶20表現(xiàn)出相同的 生長(zhǎng)特性。因此有可能在免疫力完全的動(dòng)物中考察融合蛋白介導(dǎo)的保護(hù)作用。a.早期腫瘤的治療在第0天，給小鼠(4只一組)皮下注射5000個(gè)38C13-⑶20細(xì)胞。在第1、2和3 天，用h印es緩沖的鹽溶液(HBSS)，或者0. 4 μ g、2 μ g或10 μ g抗CD20-m_IFN- α對(duì)小鼠靜 脈處理，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。至第2 )天，所有HBSS處理的動(dòng)物都有大的腫瘤，不得不被 處死。相反，用10 μ g融合蛋白處理的動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)；20天后在用0. 4 μ g融合 蛋白處理的4只小鼠中有3只開始腫瘤生長(zhǎng)，2 μg融合蛋白處理的小鼠中有1只開始腫瘤 生長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示，抗CD20/IFN-a融合蛋白能夠非常有效地抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)并提高 存活率(參見例如，圖22).b.抗⑶20-mIFNa融合蛋白比利妥昔單抗或抗⑶20/IgG3能更有效地治療中等大 小的腫瘤C3H/HeJ小鼠在第0天接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞。第5、6和7天，用 HBSS或10 μ g抗CD20-IgGl (在293T細(xì)胞中產(chǎn)生的)、抗CD20_IgG3、利妥昔單抗或抗 ⑶20-IgG3-mIFNa進(jìn)行處理。監(jiān)測(cè)它們的腫瘤生長(zhǎng)和存活情況(參見，例如23)。在防止中等大小的腫瘤的生長(zhǎng)方面，抗⑶20/IgG3-mIFNa比利妥昔單抗、抗⑶20/IgG3或抗 ⑶20/IgGl有效得多。融合蛋白的腫瘤導(dǎo)靶能力顯著地增強(qiáng)了其體內(nèi)效力。C3H/HeJ小鼠在第0天接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞。第5、6和7天，用10 μ g 抗⑶20-IgG3、10 μ g抗⑶20-IgG3+mIFN- α (選擇的劑量與融合蛋白摩爾數(shù)相同)、抗 DNS-IgG3-IFNa或抗CD20-IgG3_mIFN α進(jìn)行處理并跟蹤腫瘤生長(zhǎng)和存活情況(參見例如， 圖24)?？耿?0-IgG3-IFNa顯著地延遲了腫瘤生長(zhǎng)并提高了存活率，表明利用抗體結(jié)合位 點(diǎn)將IFNa導(dǎo)靶至腫瘤產(chǎn)生的治療劑，比不能導(dǎo)靶IFNa的融合蛋白(抗DNS-IgG3-IFNtt )或者比將抗⑶20和未共價(jià)關(guān)聯(lián)的IFNa —起注射(抗⑶20-IgG3+mIFN-q)更有效。融合蛋白處理能夠有效抗已建立的腫瘤
8只一組的C3H/HeJ小鼠接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞，并在第8、9和10天用 100 μ g抗⑶20-mIFNa或HBSS處理。監(jiān)測(cè)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況(參見圖25)和存活情況 (參見圖26)。接種了抗⑶20-mIFNa的小鼠顯示提高的存活率(圖26)。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明的目的，本領(lǐng)域技術(shù) 人員根據(jù)這些教導(dǎo)可以進(jìn)行各種改動(dòng)或變化而都符合本申請(qǐng)的精神和范圍，處于以下所附 權(quán)利要求的范圍內(nèi)。文中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過引用全文并入本文。
權(quán)利要求
嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著了能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的導(dǎo)靶部分的干擾素，當(dāng)所述構(gòu)建體與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，導(dǎo)致所述腫瘤細(xì)胞被殺死或者其生長(zhǎng)或增殖受到抑制。
2.嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著了能夠結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的 導(dǎo)靶部分的干擾素，其中所述導(dǎo)靶部分不是通過(Gly4Ser)3(SEQ ID NO 31)接頭附著于所 述干擾素的。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是1型干擾素。
4.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是2型干擾素。
5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素a。
6.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素β。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗 原的抗體。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分與所述干擾素是化學(xué)偶 聯(lián)的。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是借助肽接頭與干擾素 連在一起的。
10.如權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其中所述肽接頭長(zhǎng)度小于15個(gè)氨基酸。
11.如權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其中所述肽接頭不是(Gly4Ser)3t5
12.如權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其中所述肽接頭是Gly4Sert5
13.如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是重組表達(dá)的融合蛋白。
14.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體特異結(jié)合選自HER3、HER2/neu、MUC-I、 G250、間皮素、gplOO、酪氨酸酶和MAGE的標(biāo)記物。
15.如權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合CD20的抗體。
16.如權(quán)利要求15所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是單鏈抗體，其包含抗CD20(利妥 昔單抗)的可變區(qū)。
17.如權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合HER2的抗體。
18.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是C6抗體。
19.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL⑶Rs。
20.如權(quán)利要求17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL結(jié)構(gòu)域。
21.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是選自單鏈Fv(ScFv)、FAB、(Fab’)2、 (ScFv) 2和全長(zhǎng)IgG的抗體。
22.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是選自Rituxan、IF5、B1、1H4、 CD19、B4、B43、FVS191、hLL2、LL2、RFB4、M195、HuM195、AT13/5、赫賽汀、4D5、HuCC49、 HUCC39 Δ CH2B72. 3、12C10、IG5、Η23、ΒΜ-2、ΒΜ-7、12Η12、ΜΑΜ-6、HMFG-I 的抗體。
23.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是能夠結(jié)合EGF受體家族成員的抗體。
24.如權(quán)利要求23所述的構(gòu)建體，其中所述抗體選自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、 C6-B1D2、F5、HER3. Α5、HER3. F4、HER3. HI、HER3. H3、HER3. E12、HER3. B12、EGFR. E12、EGFR. CIO、EGFR. Bl 1、EGFR. E8、HER4. B4、HER4. G4、HER4. F4、HER4. A8、HER4. B6、HER4. D4、HER4. D7、HER4. D 11、HER4. D 12、HER4. E3、HER4. E7、HER4. F8 和 HER4. C7
25.藥物制劑，所述制劑在藥物可接受的賦形劑中包含如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述 的構(gòu)建體。
26.如權(quán)利要求25所述的藥物制劑，其中所述制劑是單位劑量制劑。
27.如權(quán)利要求25所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成腸胃外給藥的制劑。
28.如權(quán)利要求25所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成用于通過選自口服、靜脈 內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、直接腫瘤給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、透皮給藥和皮下儲(chǔ)庫(kù)給藥的 途徑進(jìn)行給藥的制劑。
29.抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的方法，其中所述方法包含將所述癌細(xì)胞與如權(quán)利要 求1-21中任一項(xiàng)所述的嵌合構(gòu)建體進(jìn)行接觸。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞在實(shí)體瘤中。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是B細(xì)胞淋巴瘤。
34.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是由選自B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、支氣管 癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、 外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、黑素瘤、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、腎 癌、膽管癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪瘤、睪丸 癌以及惡性纖維組織細(xì)胞瘤的癌癥產(chǎn)生的細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述接觸包括將所述嵌合部分系統(tǒng)地給予哺乳動(dòng)物。
36.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述接觸包括將所述嵌合部分直接給藥到腫瘤部位。
37.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述接觸包括靜脈內(nèi)給予所述嵌合部分。
38.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人體內(nèi)的癌細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物體內(nèi)的癌細(xì)胞。
40.編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含附著于C6單鏈抗體或抗CD20單鏈抗體的 干擾素。
41.如權(quán)利要求35所述的核酸，其中所述干擾素是I型干擾素。
42.如權(quán)利要求35所述的核酸，其中所述干擾素是IFN-α。
43.如權(quán)利要求40-37中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL CDRs。
44.如權(quán)利要求43所述的核酸，其中所述抗體通過肽接頭附著于所述IFN-α。
45.如權(quán)利要求38所述的核酸，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL結(jié)構(gòu)域。
46.如權(quán)利要求40-37中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述抗體包含抗CD20(利妥昔單抗) 的可變區(qū)。
47.如權(quán)利要求46所述的核酸，其中所述抗體通過15個(gè)氨基酸或更短的肽接頭附著于 所述IFN- α。
48.如權(quán)利要求46所述的核酸，其中所述抗體通過Gly4Ser肽接頭附著于所述IFN-α。
49.含有表達(dá)融合蛋白的核酸的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含如權(quán)利要求40-48中任一項(xiàng)所述的核酸。
50.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體在制備用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖的 藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了表現(xiàn)出明顯抗癌效力的新的嵌合部分。某些實(shí)施方案中，所述嵌合部分包含附著于干擾素的導(dǎo)靶部分。某些實(shí)施方案中，所述嵌合部分包含融合蛋白，其中特異結(jié)合癌癥標(biāo)記物的抗體與干擾素α(IFN-α)融合在一起。
文檔編號(hào)A61K38/21GK101868246SQ200880117225
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者旋采云, 謝里·L·默里森, 黃子軒 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)