專利名稱：編碼破傷風毒素重鏈羧基端結構域的序列作為藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼破傷風病毒素重鏈羧基端結構域的序列作為優(yōu)選治療肌萎縮側 索硬化癥(ALS)的藥物的用途，及由所述序列編碼的多肽用于治療上述疾病的用途。
背景技術：
肌萎縮側索硬化癥(路一蓋里格氏病)是一種進行性的、無法治愈的致命性疾病， 其發(fā)展為髓、延髓、運動皮質水平上的運動神經(jīng)元退化。在西班牙，該疾病具有2/100，000 的發(fā)病率，以及1/10，000的患病率，這意味著約有40，000的西班牙人將在他們一生中的某 段時間內罹患該病(來源西班牙肌萎縮側索硬化癥協(xié)會-ADELA-)盡管發(fā)現(xiàn)該病已有很長時間，但至今仍未找到確切的病因，雖然該病有基因型，也 知不表現(xiàn)出遺傳來源的病例。據(jù)預計，該病的常見形式中有10%的病例為遺傳來源，其中 15% 20%的病例為超氧化物歧化酶(S0D-1)突變，且甚至在該種疾病的偶發(fā)形式中觀察 到 了該酶的突變(Brown, R. H Jr. (1997). Arch. Neurol. 54 (10) 1246-1250)。在肌萎縮側索 硬化癥的一些患者的異常形式中發(fā)現(xiàn)編碼神經(jīng)絲重鏈的基因NFH發(fā)生突變。因此，對于此病的基因遺傳學研究引起了科學家們極大地興趣。近些年，該病動物模型的建立成為了其實驗治療研究中最相關的工具，其可幫助 我們了解與病因相關的一些問題，盡管我們仍對導致該病發(fā)生的原因并不十分了解。S0D-1 酶敲除的小鼠以及轉入人類S0D-1酶不同突變體的轉基因動物均不能再造與人類該疾病 相似的臨床模式。而與該病發(fā)病過程最為相近的動物是在93位存在幾個拷貝的突變的超 氧化物歧化酶的轉基因動物，其是由Jackson實驗室提供的所謂的S0DlG93A(Tu，P. H.，et al. (1996.) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (7) :3155_3160·)。盡管對其發(fā)病原因與發(fā)病機理進行了很多的研究，但截止目前仍未發(fā)現(xiàn)一套經(jīng)典 而有效的治療方法。人們正在基于利用谷氨酸拮抗劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及抗氧化劑這三個 方向上進行研究。但均尚未取得較好的治療效果。根據(jù)近幾年的研究，人們已經(jīng)了解神經(jīng)營養(yǎng)因子具有阻止運動神經(jīng)退化功效。基 因治療在動物模型中表現(xiàn)出的一些結果引起了人們巨大的興趣，使用腺病毒載體在動物體 內表達多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(OTNF、CNTF、NI-4、IGF-1)均取得了較為理想的結果。但由于其 會導致強烈的免疫應答，故注射腺病毒的方法只能被用于新生動物。因此，盡管應用腺病毒 載體治療的結果可喜，但仍然需要發(fā)開一種新的，能夠降低免疫反應載體來治療ALS。自1996年Schuelp博士首次臨床試驗至今，人們一直沒有獲得令人滿意的試驗結 果(http://WWW. wiley. co. uk/genetherapy)，究其原因可能在于試驗中所使用的神經(jīng)營 養(yǎng)因子(CNTF)本身的一些特性；和/或其缺乏深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。1999年Axel Kahn博士的研究小組在所用的動物模型中證明對于上述神經(jīng)營養(yǎng)因子而言，施用途徑對于 治療效果有著重要的影響(Haase et al. (1999) Ann. Neurol. 45 (3) 296-304)。而皮下施用 BDNF效果不佳可能便由于該種施用方式其特異性較差所致。此外，全身施用神經(jīng)營養(yǎng)因子在其作用于其它組織時會表現(xiàn)出一定的毒性。然而盡管使用神經(jīng)營養(yǎng)因子這種治療方法具有這一系列的缺點，但這種潛在的治療方法仍然由于其在臨床前階段所表現(xiàn)出的良好療效而得以繼續(xù)的研究。特別的，在Rochester Medical Center (明尼蘇達州)基于神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-I進行了最新的臨床試驗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人表示破傷風毒素重鏈(HcTeTx)無毒性的羧基端結構域(截至目 前為止，其只通過制備融合蛋白而作為各種神經(jīng)營養(yǎng)因子以及S0D-1酶的媒質而應用于 ALS的治療)本身能夠延長患病實驗動物的生存時間。因此，本發(fā)明的第一方面涉及包括分離的HcTeTx的編碼序列、其等位變體或其功 能片段的多核苷酸用于制備優(yōu)選治療ALS的藥物的用途。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中， HcTeTx的編碼序列含蓋HcTeTx的氨基末端的氨基酸V(纈氨酸)的編碼三聯(lián)體到編碼氨基 酸D(天冬氨酸)的三聯(lián)體，更優(yōu)選從氨基酸V (854)到D(1315)的序列，該序列的登錄號為 NCBI :P04958。在本發(fā)明此方面的更優(yōu)選實施方式中，HcTeTx的編碼序列為SEQ ID NO 1, 且HcTeTx片段為SEQ ID NO :5。在下文中，此多核苷酸會被稱為“本發(fā)明的多核苷酸”。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多核苷酸可經(jīng)突變(刪除、插入、顛倒、點突 變等)，其中所述突變不影響其作為藥物(尤其是治療ALS的藥物)的能力。可通過重復實 施例I或實施例II中任何一個來驗證本發(fā)明的經(jīng)突變的多核苷酸的治療作用的保持。貫 穿本說明書，這些經(jīng)突變的多核苷酸也應被看作是等位基因變體。在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多核苷酸還可包含啟動、終止、沉默序列，可輔 助其整合到染色體中的序列或任何類型的遺傳物質的有機結構等。本發(fā)明第二方面涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體用于制備藥物(優(yōu)選用于治 療ALS的藥物)的用途，其中所述載體選自(不限類型)質粒、噬菌體、粘粒、噬菌粒、酵母 人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、人類人工染色體(HAC)、病毒載體(如腺病毒、逆 轉錄病毒)、或任何其它類型的可使其在原核或真核細胞中自我復制的DNA或RNA。在下文 中，這種載體將被稱為“本發(fā)明的載體”。本發(fā)明第三方面涉及轉基因細胞用于制備藥物(優(yōu)選治療ALS的藥物)的用途， 其中所述細胞包含本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體。本發(fā)明第四方面涉及分離的多核苷酸用于制備治療ALS的藥物的用途，所述分離 的多核苷酸包含分離的HcTeTx的編碼序列、其等位突變體或其功能片段。在本發(fā)明的一 個優(yōu)選實施方式中，HcTeTx的序列包括登錄號為NCBI :P04958的序列的氨基酸V(854)到 D (1315)。在本發(fā)明此方面的更進一步優(yōu)選的實施方式中，HcTeTx的序列為SEQ ID NO :2， HcTeTx片段為SEQ ID NO :6。在下文中，此多核苷酸將被稱為“本發(fā)明的多核苷酸”。在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的多肽經(jīng)突變(氨基酸刪除、插入、顛倒、點取代 等)，即便所述突變并不影響其作為治療ALS的藥物的能力?？赏ㄟ^重現(xiàn)實施例1和2來驗 證本發(fā)明的經(jīng)突變多核苷酸療效的維持。為施用所述藥物或藥物化合物，將本發(fā)明的多核苷酸、載體、轉基因細胞或多肽 制成適于使用選定施用途徑施用的藥物形式。為此，所述藥物化合物應包括藥學可接 受的和制備選定施用藥物形式所需的媒質和賦形劑?？捎糜谥脖凰鏊幬锘衔锏馁x 形劑或媒質的信息及施用活性成分的藥物形式的信息通?？梢娪?Treatise of theGalenicPharmacy" (by C. Fauli i Trillo,1st Edition，1993，Luzan 5，SA deEdiciones) 這本書中。
所述藥物組合物應至少包括治療有效量的選自本發(fā)明的多核苷酸、載體、轉基因 細胞或多肽中的任一成分。本文所述的“治療有效量”指選定成分的計算為產(chǎn)生期望治療 效果的量，且一般尤其會根據(jù)多肽自身特征確定，及根據(jù)待獲得的治療效果、待治療個體的 特征，所述個體所患病的嚴重程度等確定。在下文中，這種藥物化合物將被稱為“本發(fā)明的 藥物化合物或藥物”。本發(fā)明的藥物化合物可通過任意適宜施用途徑施用，如經(jīng)口服、經(jīng)腸胃外、經(jīng)鼻 (粘膜)等，一般經(jīng)腸胃外施用，以通過肌內或皮下施用為宜。此外，所述藥物化合物可以 任何適于施用的提供形式提供，例如，以固體形式(片劑、膠囊、顆粒劑等)、液體(溶液、懸 液、乳液等)等，適于通過選定施用途徑施用。在一優(yōu)選實施方式中，將所述藥物化合物制 成適宜單位劑量的藥物形式。在一優(yōu)選實施方式中，所述藥物化合物可為通過以固體形式或優(yōu)選液體形式口 月艮，或者更優(yōu)選通過肌內途徑施用的藥物形式。通過口服途徑施用的藥物形式的示例包括 片劑、膠囊、顆粒、溶液、懸液等，且可包括常規(guī)賦形劑，如粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、 濕潤劑等，且可按照常規(guī)方法制備。在另一優(yōu)選實施方式中，所述藥物化合物還可適于以例 如溶液、懸液、冷凍干燥、無菌產(chǎn)品的形式，以適宜劑型經(jīng)腸胃外施用，在這種情況下，所述 藥物化合物會包括適宜賦形劑，例如緩沖液、表面活性劑等。在任何情況下，所述賦形劑要 根據(jù)所選藥物施用形式而選擇。藥物的各種藥物形式的施用及其制備的綜述可見于如上所 述的"Treatise of the Galenic Pharmacy"C. Fau 11 i Trillo, 10th Edition, 1993,Luzan 5, S. A. de Ediciones這本書中。此外，所述藥物化合物還可包括其它提供提高的效力且給 所述化合物提供提高的效力的多肽、多核苷酸、載體或細胞。^X本文中所用的“多核苷酸”指任何長度的核苷酸的多聚形式，且可為脫氧核糖核苷 酸或核糖核苷酸。此術語特指所述分子的一級結構。因此，此術語包括單鏈或雙鏈DNA及 單鏈或雙鏈RNA。本文通篇中的術語“分離的”在與HcTeTx或其編碼序列聯(lián)用時，不僅指它們見于 從人體分離的形式，還指它們不形成實現(xiàn)治療功能的融合蛋白或酶的一部分。本文通篇中的表述"HcTeTx的功能片段，其等位變體，或編碼它們的序列”指包括 保持作為藥物(更尤其用于治療ALS的藥物)的能力的HcTeTx的一部分，其等位變體、或 其編碼序列的肽或多核苷酸，其中所述治療能力的保持可通過重現(xiàn)實施例1 3來驗證。本文通篇中的術語“等位變體”指與破傷風毒素重鏈C-端結構域同源性很高，且 功能相當?shù)亩嚯?。而此處所述的肽與所述結構域“同源性很高”指所述肽的氨基酸序列與 所述結構域的氨基酸序列具有至少60 %、70 %、85 %，且更優(yōu)選至少95 %的同一性。所述結 構域的氨基酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO :2。本說明書中此術語還指能夠編碼與HcTeTx功能 相當?shù)耐葱院芨叩亩嚯牡亩嗪塑账?。在這種情況下，所述多核苷酸與HcTeTx的編碼序列 具有至少40%，50%，60%，70%，85%或95%的同源性，其核酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO :1。本文通篇中的表述“功能相當”指當通過重現(xiàn)實施例I或II來檢驗治療能力的保 持時，多肽或者多肽保持其作為藥物(更尤其用于治療ALS的藥物)的能力。
對于專家而言，本發(fā)明的材料、其他對象、優(yōu)勢以及特征部分見于說明書中，部分見于本發(fā)明的實踐中。以下實施例提供實施方式，且它們不應被理解為限制本發(fā)明。附圖簡述

圖1 用于檢測HcTeTx表達的PCR擴增。在肌內注射質粒pCMV-HcTeTx (η = 2，第 1道和第2道)及空質粒pCMV (η = 2，第3道和第4道)后10天，從肌肉提取RNA，并進行 反轉錄。通過PCR擴增所得cDNA的HcTeTx基因。第5道示陽性對照(質粒pCMV-HcTeTx)， 且第6道中裝載了反應的靶標。在M道發(fā)現(xiàn)IOObp大小的標記物。圖2 用編碼HcTeTx的裸DNA臺療對于患有ALS S0D1G93A病的小鼠模型中癥狀 發(fā)作的影響。與對照組(η = 10)相比，經(jīng)HcTeTx治療的組(η = 10)的癥狀發(fā)作被顯著推 遲。累計概率使用Kaplan-Meier生存時間分析(SPSS 13.0)進行計算。圖3 用編碼HcTeTx的裸DNA治療對于患ALS S0D1G93A病小鼠模型的生存時間 的影響。與對照組(η = 10)相比，經(jīng)HcTeTx治療的組(η = 10)的生存時間顯著增加。累 計概率使用Kaplan-Meier生存時間分析(SPSS 13. 0)進行計算。圖4 用編碼HcTeTx的裸DNA治療的影響。通過以14rpm的恒定速度翻轉至180 秒來測定運動活性。與對照組(η = 10)相比，在經(jīng)HcTeTx治療的組(η = 10)中觀察到更 高的運動活性。圖5 在S0D1-G93A小鼠中肌內注射編碼HcTeTx的裸DNA的影響。小鼠中的運動 力與功能通過使用吊線測試來測定。各組使用10只小鼠(η = 10)。圖6 在S0D1-G93A小鼠中肌內注射編碼HcTeTx的裸DNA的影響。測定經(jīng)HcTeTx 治療的轉基因小鼠重量。各組使用10只小鼠(η = 10)。圖7 在110日齡的有癥狀的S0D1G93A小鼠脊髓中涉及凋亡信號轉導通路的基因 表達的分析。表示Caspl、Casp3、Bax和Bcl2基因與對照(靶標)和經(jīng)HcTeTx治療的小鼠 (灰色)中信使RNA的平均表達水平。將之前的小鼠組與野生型小鼠(黑色)相比較(η = 5只小鼠/組)。圖8 在110日齡的有癥狀的S0D1G93A小鼠脊髓中涉及凋亡信號轉導通路的蛋白 的分析。通過蛋白印跡分析相比野生型小鼠(黑色)，經(jīng)HcTeTx治療的小鼠(灰線)和對 照小鼠(黑線)脊髓中使用的pro-CaSp3，活性Casp3，Bax和Bcl2蛋白的分析(η = 5只 小鼠/組)。圖9 :Akt和Erk 1/2蛋白的磷酸化的蛋白印跡分析。分析了每組5只老鼠的樣品。 IDV(強度密度值)。將蛋白印跡分析結果以相對野生型小鼠微管蛋白相應值的比顯示 Γ P < 0. 05，〃 P < 0. 01 ；誤差棒表示SEM)。圖中各柱代表之前章節(jié)中描述的相同組。圖10:在ALS S0D1G93A小鼠模型中腹膜內施用含破傷風毒素重鏈C-端結構域 (HcTeTx)的多肽對生存時間的影響。相比對照組(η = 3，實線)，經(jīng)HcTeTx治療的組(η = 3，連續(xù)系)的生存時間顯著增加。累計概率使用Kaplan-Meier生存時間分析(SPSS 13. 0) 進行計算。圖11 肌內注射HcTeTx來治療小鼠影響S0D1G93A轉基因小鼠脊髓中涉及鈣穩(wěn) 態(tài)的基因表達。測定了經(jīng)HcTeTx(灰色)或空質粒(白色)治療的轉基因小鼠中Ncsl與 Rrad基因的表達水平。將前組小鼠的信使RNA水平的變化與野生型小鼠(黑色)相比較 (*P < 0.05,**P < 0. 01 ；誤差棒顯示 SEM ；η = 5 只小鼠 / 組)。
實施方式以下發(fā)明人通過測試說明本發(fā)明，其證明HcTeTx及其編碼序列作為藥物(更優(yōu)選 為用于治療ALS的藥物)的效力。
實施例實施例1 通過肌內灃射棵DNA來施用HcTeTx減緩癥狀發(fā)作及延長S0D1G93A小 鼠的牛存時間過表達含不同突變的人過氧化物岐化酶-I(SOD-I)基因的轉基因動物的制備為 研究ALS疾病提供了動物模型。這些動物表現(xiàn)出臨床和病理學特征(如患ALS的特征)。 研究與表征最多的模型之一為轉基因小鼠S0D1G93A，其在S0D-1酶基因的93位發(fā)生了丙氨 酸取代甘氨酸氨基酸的突變。該模型動物已經(jīng)用多種治療化合物成功測試。但其尚未在人 類臨床試驗中產(chǎn)生有效的治療效果，其由不適當?shù)氖┯猛緩剿?，?或由治療分子到達 靶細胞的生物利用度有限所致。一些基因療法策略使用腺伴隨病毒(AAV)，可將其經(jīng)肌內注 射，以逆行方式轉運到運動神經(jīng)元。但 是，使用病毒載體的可能性仍然存在，其可導致經(jīng)治 療者額外損傷。使用裸DNA則是一種更為安全且適宜的向患者遞送特定基因治療的替代性 策略。材料與方法1.1.編碼 HcTeTx 的棵 DNA將編碼HcTeTx (破傷風毒素重鏈C-端結構域，462氨基酸的SEQID NO 2)的基因 克隆進真核細胞表達質粒pcDNA3. I(Invitrogen)中，位于巨細胞病毒(CMV)啟動子控制 下。該載體在化學感受態(tài)細菌大腸桿菌(DH5a)中產(chǎn)生，并使用Sigma-Aldrich maxiprep GenElute試劑盒進行純化。1.2.轉基因小鼠由Jackson實驗室(Bar Harbor, ME)得到過表達具有G93A突變的人SODl的轉基 因小鼠(B6SJL-TgN[S0Dl-G93A]lGur)。全部試驗均使用半合子突變體(突變體雄性與非 轉基因雌性交配)。按照Gurney等人所述，通過PCR擴增從尾部提取的DNA來鑒定轉基因 小鼠(Gurney et al. , 1994. Motor neuron degeneration in mice thatexpress a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166) : 1772-5)。這些動物飼養(yǎng)于 薩拉戈薩大學的Mixed ResearchUnit中。使它們自由飲水和進食。進行的所有實驗以及 對動物的照管均依照薩拉戈薩大學的標準和國際實驗動物使用指南。1. 3.裸DNA肌內注射及肌肉提取 將300 μ g pCMV-HcTeTx肌內注射到8周齡S0D1G93A轉基因小鼠的四頭肌 (50 μ g/每塊肌內的兩次注射)和三頭肌(50 μ g/每塊肌肉的單次注射)。對照組小鼠注 射等量空質粒。在肌內注射質粒10天后，提取經(jīng)接種的肌肉，其在液氮中預冷，隨后保存 于-70°C。1. 4.提取RNA、合成cDNA及PCR擴增將組織于液氮中冷凍，隨后在冷研缽中研成粉末。按照TRIzoI試劑(Invitrogen) 的方法提取肌肉總RNA。使用SuperScriptTM第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)試劑盒合成 cDNA，始于 Iyg RNA 到終體積 20 μ L。在含 150ηΜ 各引物、150 μ M dNTPs、2mM MgCl2UX緩沖液、0. 2U Taq聚合酶和稀釋10倍的cDNA合成反應的終體積20 μ L中進行用于擴增 HcTeTx的基因片段的PCR反應。全部PCR反應在GeneAmp 熱循環(huán)儀2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中進行。熱循環(huán)參數(shù)如下在94°C溫育3分鐘，以 940C 30秒、61°C 30秒、及72°C 30秒進行35個循環(huán)。HcTeTx基因擴增的存在通過用2%溴 化乙錠染色的瓊脂凝膠觀察。所用正向和反向引物分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。 擴增子大小為355bp。
1. 5.翻轉測試、柵格測試及存活測試用柵格測試測定肌強度和ALS癥狀的發(fā)作。從8周齡起，每周給動物進行一次該 測試。將各小鼠放在用作常規(guī)籠子的頂蓋的柵格上。隨后將柵格翻轉180°并與柔軟的表 面保持約60cm的距離，以避免任何損傷。記錄各小鼠掉落的等待時間。每只小鼠均使其抓 住倒置的柵格最久至180秒，進行三次實驗，并記錄最長的時間。翻轉測試用來評估運動的協(xié)調性、力量以及平衡性。實驗動物被置于儀器 (R0TA-R0D/RS,LE8200,LSI-LETICA ScientificInstruments)的翻轉桿上。以 14rpm 的恒 定轉速下，記錄動物能夠保持在上述桿上的時間。每只小鼠有三次機會，記錄動物能夠保持 不從桿上掉落的最長時間，隨機時間限制為180秒。當將小鼠置于仰臥位時其無法自行翻身，則認為是其生命終點。MM2. 1.肌肉中質粒表達的檢測起初確認了在轉基因小鼠S0D1G93A肌肉細胞中所構建的pCMV_HcTeTx表達編碼 基因的能力。由于這些小鼠并不存在內源性HcTeTx基因的表達，故可通過注射將該基因片 段的PCR擴增產(chǎn)物應用到肌肉中，以檢測所述分子的mRNA表達。如圖1所示，在注射空質粒 的對照組中未觀察到HcTeTx基因的表達。但PCR顯示，在接種同一編碼質粒的肌肉中存在 HcTeTx基因的擴增產(chǎn)物，表明該質粒成功到達了肌肉細胞，并發(fā)生所述基因的轉錄過程。2. 2. HcTeTx延緩癥狀出現(xiàn)，提高運動能力，及延長S0D1G93A轉基因小鼠的生存時
M用編碼HcTeTx的裸DNA肌內治療ALS模型小鼠(包含G93A突變和人SODl基因) 至癥狀發(fā)作延緩，運動活力提高，且病終點推遲。當小鼠第一次無法在柵格反轉試驗中保持 3分鐘時，記錄為癥狀出現(xiàn)的第一天。相比對照組，注射HcTeTx的動物組的癥狀出現(xiàn)顯著減 少約8天(圖2，表1)。如圖3和表1所示，在用HcTeTx治療的組的小鼠中檢測到最長生 存時間，達到平均136天，比對照組長16天。在第12周與第13周之間觀察到對照組翻轉 測試的活性顯著下降，而此缺陷直到第16周才在經(jīng)處理動物組中出現(xiàn)(圖4)
對照(η = 10) HcTeTxCn =10) P 值 癥狀出現(xiàn)(天)102. 4 + 2. 4110. 9 + 2. 00. 0295~
致死(天)120. 5 + 3. 9136. 0 + 3.0. 0093~
出現(xiàn)-致死的間隔(天) 87 257
表1 癥狀出現(xiàn)與生存時間數(shù)據(jù)統(tǒng)計表，包括對照組，HcTeTx治療組，以及P值(Log Rank，Mantel-Cox)自小鼠8周齡開始還使用“吊線”測試來評估治療效果(圖5)。在第14周時S0D1G93A小鼠表現(xiàn)出了虛弱的第一跡象，而使用HcTeTx治療的小鼠組在14 16周則表現(xiàn) 出變強。對照組小鼠也在14周齡開始伴隨疾病體重減輕。但用HcTeTx治療明顯逆轉體重 減輕，在第15周呈現(xiàn)最大體重(圖6)。實施例2 用編碼HcTeTx的棵DNA肌內灃射治療的S0D1G93A小鼠脊髓中凋亡的 抑制材料與方法1.1.編碼 HcTeTx 的棵 DNA將編碼HcTeTx的基因(破傷風毒素重鏈C-端結構域，SEQ IDNO 1)克隆進真核 細胞表達質粒pcDNA3. I(Invitrogen)中，位于巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下。該載體在 化學感受態(tài)大腸桿菌(DH5a)中產(chǎn)生，并使用Sigma-Aldrich maxiprep GenElute試劑盒 進行純化。1.2.轉基因小鼠由Jachson實驗室(Bar Harbor, ME)得到過表達具有G93A突變的人SODl的轉基 因小鼠(B6SJL-TgN[SOD 1G93A] IGur)。全部試驗均使用半合子突變體(雄性突變體與非轉 基因雌性交配)。按照Gurney等人所述，通過PCR擴增從尾部提取的DNA來鑒定轉基因小 鼠(Gurney et al. ,1994. Motor neuron degeneration in mice thatexpress a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264 (5166) : 1772—5)。這些動物飼養(yǎng)于薩拉 戈薩大學的Mixed ResearchUnit中，使它們自由飲水和進食。進行的所有實驗以及對動物 的照管均依照薩拉戈薩大學的標準和國際實驗動物使用指南。共使用12只動物野生型(η =5)，注射pcDNA3. 1的S0D1G93A小鼠(對照，η = 5)，以及用HcTeTx治療的S0D1G93A小 鼠(η = 5)。1. 3.裸DNA肌內注射及脊髓提取將300 μ g pCMV-HcTeTx肌內注射到8周齡S0D1G93A轉基因小鼠的四頭肌(每次 50 μ g/每塊肌內的兩次注射)和三頭肌(50 μ g/每塊肌肉的單次注射)。對照組小鼠注射
等量空質粒。肌內注射質粒110天后，提取脊髓，其在液氮中預冷，隨后保存于-70°C。將組織在 液氮中冷凍，隨后在冷研缽中研成粉末。一半樣品用于提取RNA，另一半用于提取蛋白。1. 4.從脊髓提取RNA及合成cDNA按照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen)的方法提取脊髓中的總 RNA，并 使用SuperScriptTM第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)試劑盒合成cDNA，始于2μ g RNA到終 體積20 μ L01. 5.實時 PCR在含lxTaqMan UniversalPCR Master Mix,NoAmpErase UNG(Applied Biosystems)UX所研究各基因的未標記的引物混合物和TaqMaU MGB (Applied Biosystems)探針、及1 μ L/稀釋10倍的cDNA反應的終體積10 μ L中進行實時PCR反應。使用3種內源性基因(18s rRNA、GAPDH和β-肌動蛋白)作為標準。用于擴增各所研究基 因的引物和探針的混合物索弓I如下半胱氨酸天東氨酸蛋白酶_3 (Mm00438023_ml)、半胱 氨酸天東氨酸蛋白酶-1 (Mm00438023_ml) ,NCS-I (Mm00490552_ml) ,Rrad(Mm00451053_ml)、 18s rRNA(Hs99999901)、GAPDH (4352932E)以及 β-激動蛋白(4352933Ε)。全部 PCR 反應 均在ABI Prism 7000序列檢測系統(tǒng)熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)中進行。熱循環(huán)參數(shù) 如下在95°C溫育10分鐘，以95°C 15秒和60°C 1分鐘進行40個循環(huán)。半胱氨酸天東氨 酸蛋白酶-3、半胱氨酸天東氨酸蛋白酶-1、NCS-1和Rrad的表達采用3種內源性基因的幾 何平均來進行標準化。1.6.從脊髓提取蛋白，及蛋白印跡分析 將野生型小鼠與經(jīng)HcTeTx治療的S0D1G93A小鼠的脊髓樣品于液氮中用具有些列 組成的提取緩沖液攪勻150mM NaCl、50mMTris-HCl pH = 7. 5、1%脫氧膽酸鹽、0. 1% SDS、 1% Triton X-IOOUmMNaOVaUmM PMSF、10 μ g/mL 亮抑蛋白酶肽和抑肽酶以及 1 μ g/mL 胃 酶抑素。在4°C以3000g離心10分鐘。用BCA(9643Sigma)法定量各樣品上清的蛋白濃 度，將25 μ g蛋白裝載到10 %的丙烯酰胺凝膠中。將PVDF膜用于轉膜過程，所述PVDF膜 用含 5%脫脂乳的 TTBS 溶液(20mM Tris 堿、0. 15M NaCl，pH = 7. 5,0. 1% Tween)封閉一 小時。隨后將它們與第一抗體于4°C溫育過夜(anti-p-Akt(SC-7985R，Santa Cruz))。將 GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)用于標準化用Akt (anti-GAPDH(sc-25778，Santa Cruz))獲 得的培養(yǎng)基。在與第一抗體溫育后，用TTBS洗滌膜，并將它們于室溫下與第二抗體溫育一 小時。最后使用化學發(fā)光(Western Blotting Luminol Reagent, sc—2048 Santa Cruz) 顯色。掃描膜，并用AlphaEase FC軟件(BonsaiTechnologies)進行分析。統(tǒng)計學分析用 ANOVA檢驗與紐曼-科伊爾斯檢驗來進行。MM本研究中，顯示了將HcTeTx應用于存在運動神經(jīng)元退化的S0D1G93A ALS病模型 小鼠的結果。圖7中顯示了這些發(fā)病期小鼠脊髓的轉錄研究。比較了涉及野生型小鼠和 S0D1G93A小鼠發(fā)病后期(110日齡)脊髓中凋亡的半胱氨酸天東氨酸蛋白酶_1、半胱氨酸 天東氨酸蛋白酶-3、Bax以及Bcl2基因的轉錄調控。結果顯示，相比野生型，S0D1G93A對 照小鼠中半胱氨酸天東氨酸蛋白酶-1 (P < 0. 05)、半胱氨酸天東氨酸蛋白酶_3 (P < 0. 05) 和Bcl2(P<0.01)基因被顯著誘導，但Bax基因(P > 0. 05)的表達譜則無顯著差異(圖 7)。在接收HcTeTx治療的小鼠組中，野生型中保持了半胱氨酸天東氨酸蛋白酶-1和半胱 氨酸天東氨酸蛋白酶-3的表達水平，且僅在與未治療小鼠相比時發(fā)現(xiàn)顯著差異(分別為P <0.05和P <0.01)。但這些轉基因小鼠脊髓中的Bax和Bcl2基因未受hct治療影響(P > 0. 05)(圖 7)。為了評估HcTeTx對于復原可誘導S0D1G93A小鼠脊髓中的細胞死亡的凋亡的機理 的作用，進行了蛋白研究。數(shù)據(jù)顯示，相比對照組，經(jīng)HcTeTx治療的小鼠的半胱氨酸天東 氨酸蛋白酶_3(P<0. 05)基因的活化明顯降低，達到近似于野生型小鼠的水平，而轉基因 動物中半胱氨酸天東氨酸蛋白酶_3前體蛋白的水平則未受影響。與表達分析所得到的結 果相反，在蛋白印跡試驗中觀察到，Bax與Bcl2蛋白的量比在用HcTeTx治療的小鼠中更低 (圖 8)。HcTeTx 的一種作用方式為磷酸化 Akt (Gil et al.，2003. Biochem J. 373 613-620)，所述Akt為一種受多種生長因子激活的激酶蛋白，所述生長因子涉及阻斷由磷 脂酰肌醇3-激酶介導的通路。Densiometric定量表明，相比空載體對照，經(jīng)HcTeTx治療的 動物具有兩倍多的在Ser473上磷酸化的Akt水平(根據(jù)使用磷特異性抗體的蛋白印跡分 析測得)(P < 0. 05)(圖9)。通過使用抗微管蛋白的抗體進行檢測來確定蛋白的等摩爾裝 載。之前已在培養(yǎng)的皮質神經(jīng)元中公開了由HcTeTx的ERK1/2磷酸化(Gil et al. ,2003. Biochem J. 373 :613_620)。為確認HcTeTx參與MAP激酶通路，對經(jīng)治療和未經(jīng)治療的110 日齡S0D1G93A小鼠的脊髓提取物進行蛋白印跡分析。結果表明，相比經(jīng)HcTeTx治療組，對 照組中ERK1/2的激活增加(圖9)，但表達水平與野生型小鼠相近。t施徹丨3 目復臘內灃身寸施用句,含破傷風毒素重 車(HcTeTx)C-端結構域的多At后 S0DlG93Alt型小鼠在肌萎縮側丨索硬化中的存活時間 曾力口材料與方法1.1.句,含破傷風毒素重鏈(HcTeTx) C-端結構域的多flt的提取所用多肽(稱為HcTeTx)對應于破傷風毒素重鏈C-端結構域，且包含SEQ ID NO 2的451個氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，可按照Gil等人所述的方法獲得(Gil et al. ,2003. Biochem. J. 373,613-620)。1.2.轉基因小鼠由Jachson實驗室(Bar Harbor, ME)得到過表達具有G93A突變的人SODl的轉基 因小鼠(B6SJL-TgN[SOD 1G93A] IGur)。全部試驗均使用半合子突變體(雄性突變體與非轉 基因雌性交配)。按照Gurney等人所述，通過PCR擴增從尾部提取的DNA來鑒定轉基因小 鼠(Gurney et al. ,1994. Science, 264 (5166) :1772_5)。這些動物飼養(yǎng)于薩拉戈薩大學的 Mixed Research Unit中，使它們自由飲水和進食。進行的所有實驗以及對動物的照管均依 照薩拉戈薩大學的標準和國際實驗動物使用指南。1.3.給動物腹膜內注射多肽給12周齡的S0D1G93A小鼠腹膜內注射250 μ 1濃度0. 5 μ M的包含破傷風毒素 C-端結構域(HcTeTx)的多肽。每周重復一次注射直到小鼠死亡。1. 4.測量動物的生存時間當將小鼠置于仰臥位時其無法自行翻身，則認為是其生命終點。MM1. 1. HcTeTx延長S0D1G93A轉基因小鼠的生存時間如圖10和表2所示，在經(jīng)HcTeTx治療組的小鼠中檢測到最長生存時間，其達到了 平均135天，比對照組長了 9天。 表2 顯示對照組及經(jīng)HcTeTx治療組的生存時間數(shù)據(jù)以及P值。實施例4 施用HcTeTx導致與S0D1G93A小鼠脊髓中的鈣相關基因表達變化有相伴肌萎縮側索硬化癥(ALS)的異常細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的證據(jù)。已知神經(jīng)元 蛋白NCSl以鈣依賴方式調節(jié)神經(jīng)分泌(McFerran et al.，1998. J. Biol. Chem. 273 22768-22772)，并與涉及神經(jīng)信號轉導的鈣/鈣調蛋白依賴酶的調控相關聯(lián)(Schaad et al.，1996. PNAS. 93 :9253_9258)。在經(jīng) HcTeTx 治療 50 天后檢測了 SOD1G93A 小鼠脊髓中 NCSl的表達情況。在RT-PCR實驗中，相比同齡的野生型小鼠，在遲發(fā)癥狀的轉在基因小鼠 中NCSl基因的表達被抑制(P <0.05)。此外，肌內接受HcTeTx治療的小鼠具有更高水平 的NCSl (P < 0. 05)，且接近野生型小鼠的水平。使用同樣的樣品，分析了有關Ras且與糖尿 病基因(Rrad)相關 的基因的信使RNA水平。在本實施例中，相比同齡野生型小鼠，對照轉 基因小鼠的Rrad水平升高了近兩倍。但與對照相比，用HcTeTx治療顯著降低SOD1G93A小 鼠的Rrad表達(P<0. 05)，達到近似于從野生型小鼠中得到的值(圖11)。
權利要求
分離的多核苷酸用于制備藥物的用途，所述分離的多核苷酸包含破傷風毒素重亞基(HcTeTx)羧基-端結構域的編碼序列、其等位變體或它們的功能片段。
2.前述權利要求中任一項的用途，其中所述HcTeTx由SEQIDN0 1編碼。
3.權利要求1的用途，其中所述破傷風毒素重亞基羧基_端結構域的編碼序列的片段 具有 SEQ ID NO :6。
4.包含前述權利要求的任一多核苷酸的載體用于制備藥物的用途。
5.包含權利要求1 3的任一多核苷酸的轉基因細胞用于制備藥物的用途。
6.前述權利要求中任一項的用途，其中所述藥物用于治療肌萎縮側索硬化癥(ALS)。
7.分離的多肽用于制備治療ALS的藥物的用途，所述分離的多核苷酸包含破傷風毒素 重亞基(HcTeTx)羧基-端結構域、其等位變體或它們的功能片段。
8.前一項權利要求的用途，其中HcTeTx具有SEQID NO :2。
9.權利要求6的用途，其中HcTeTx的功能片段具有SEQID NO :5。
10.前述權利要求中任一項的用途，其中所述藥物被設計為經(jīng)口、經(jīng)腸胃外、經(jīng)肌內或 經(jīng)鼻途徑施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用破傷風毒素重鏈羧基端編碼序列以及由其編碼的多肽作為藥物，以更好的治療肌萎縮性脊髓則索硬化癥(ALS)。
文檔編號A61K38/08GK101873865SQ200880117397
公開日2010年10月27日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權日2007年10月5日
發(fā)明者A·C·卡爾沃羅尤, J·阿古勒拉埃韋拉, M·J·姆諾茲岡扎爾沃, M·P·扎拉高扎菲爾南德茲, M·莫雷諾伊高爾, R·奧斯塔斯品佐拉斯 申請人:薩拉戈薩大學;巴塞羅納自治大學