專利名稱：肝素結合表皮生長因子樣生長因子抗原結合蛋白的制作方法
肝素結合表皮生長因子樣生長因子抗原結合蛋白背景人表皮生長因子受體(HER)家族包括稱為HERl (或erbBl)、HER2(或erbB2)、 HER3 (或erbB3)和HER4 (或erbB4)的4種不同的受體酷氨酸激酶。HERl通常也稱為表皮 生長因子受體(EGFR)。除了 HER3以外，這些受體都具有磷酸受體(phospho-acc印tor)靶 特異性內在蛋白酪氨酸激酶活性。HER家族的成員在大多數(shù)表皮細胞以及在許多不同的腫 瘤細胞類型中表達。例如，HER家族的受體在上皮來源以及間充質來源的腫瘤細胞中表達。 此外，HER受體酪氨酸激酶參與細胞增殖和血管生成，這與疾病例如癌癥相關。例如，EGFR 頻繁在乳腺癌、肝癌、腎癌、白血病、支氣管癌、胰腺癌和胃腸癌例如結腸癌、直腸癌或胃癌 中過表達或被異常激活。高水平的EGF受體還與不良預后和對治療的應答相關(Wright等 人，1992,Br. J. Cancer 65 :118_121)。因此，中斷來往于這些激酶之間的信號轉導可具有抗 增殖作用，從而對許多癌癥和腫瘤細胞類型具有治療作用。受體酪氨酸激酶的酶促活性可通過過表達和/或通過配體介導的二聚化來刺激 (Heldin, 1995, Cell 80 :213_223)。受體同二聚體和異二聚體的激活導致受體上的酪氨酸 殘基的磷酸化，這反過來磷酸化其他分子(包括細胞內蛋白質)的酪氨酸殘基。(Ullrich 等人，1990，Cell 61:203-212)。之后細胞內信號轉導途徑例如牽涉絲裂原活化蛋白激酶 (MAP 激酶)(Dhillon 等人，2007，Oncogene 26 =3279-3290)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3 激 酶)的信號轉導途徑被激活。已顯示此類途徑的激活增加細胞增殖和抑制細胞凋亡，還已 顯示小分子抑制劑或單克隆抗體對由HER家族成員介導的信號轉導的抑制抑制了細胞增 殖和促進了細胞凋亡(Prenzel 等人，2001，Endocr. Relat. Cancer 8 :11_31)。肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)是22kDa的0_糖基化蛋白質 (Higahiyama 等人，1992，J Biol Chem 267:6205-6212)。HB-EGF 以其成熟形式結合并 且激活 EGF 受體和 HER4(Elenius 等人，1997，EMBO 16:1268-1278)。HB-EGF 是 G 蛋白 偶聯(lián)受體(GPCR)誘導的細胞增殖(通過稱為三重膜傳遞信號轉導(triple-membrane passingsignaling, TMPS)的過程)的至關重要的介體(Prenzel 等人，1999，Nature 402 884-888，綜述于 Fischer 等人 2003，Biochem. Soc. Trans. 31 1203-1208 中)。已顯 示HB-EGF促進細胞增殖以及血管生成(Zushi等人，1997，Int J Cancer 73:917-923; Abramovitcn 等人，1998，F(xiàn)EBS letters 425:441-447)。還顯示 HB-EGF 在許多癌癥中起著 至關重要的作用，即，其與卵巢腫瘤的侵襲性行為相關。(Tanaka等人，2005，Clin. Cancer Re s. 11 =4783-4792) 0此外，HB-EGF是卵巢癌細胞系異種移植物腫瘤形成所必需的。 HB-EGF (野生型或分泌形式)的過表達加速了 SK0V3和RMG-I細胞中的腫瘤形成。然而，使 用siRNA對內源HB-EGF的抑制消除或延遲了 SK0V3和RMG-I細胞的腫瘤形成。Miyamoto， 2004，Cancer Res. 64 :5720。如由上述證據(jù)所表明的，HB-EGF表達或活性的抑制可抑制腫 瘤形成。類似地，HB-EGF在一些癌癥包括人膀胱癌中是不良預后的標志物(Thogersen等 人，2001，Cancer Res. 61 =6227-6233) 0體外研究表明經(jīng)工程改造表達HB-EGF (野生型，可 溶性的或不可切割的)的人EJ膀胱細胞展示生長的增加、不依賴錨定的生長和VEGF的產
15生以及增強的遷移。當將此類表達HB-EGF的EJ膀胱細胞移植入裸小鼠時，在腫瘤中觀察 到增加的腫瘤形成、血管的大小和密度。(Ongusaha，2004Cancer Res. 64 =5283-5290) 概述本文中提供了結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白。此類抗原結合蛋白中的一些 包含A) —個或多個由下列組成的輕鏈互補決定區(qū)(CDRL) :(i)選自SEQ ID NO :189_217的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ IDNO :218_233 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL 3 ； 或(iv)包含一個或多個不超過4個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii) 的CDRL。備選地，HB-EGF抗原結合蛋白可包含B) —個或多個由下列組成的重鏈互補決定區(qū) (CDRH)⑴選自 SEQ ID NO :275_299 的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (iii)選自SEQ ID NO :332_372的⑶RH 3 ；或(iv)包含一個或多個不超過4個氨基酸的氨 基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH。在一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白可包含1、2或更多個上述輕鏈⑶RL和 1、2或更多個上述重鏈⑶RH。在一個方面中，分離的抗原結合蛋白包含⑶RH1、⑶RH2、⑶RH 3、⑶RL1、⑶RL2和⑶RL 3。在另一個方面，A)的分離的抗原結合蛋白(同上)選自來自 SEQ IDNO 189-217 的 CDRLl ；來自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；來自 SEQ IDNO :234_274 的CDRL 3 ；和包含一個或多個不超過2個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的上述(i)、 (ii)或(ii)的CDRL。此外B)的所述重鏈CDRH(同上)選自來自SEQ ID NO =275-299的 CDRHl ；來自 SEQ IDNO :300_331 的 CDRH2 ；來自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 和包含一個或 多個不超過2個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的上述的CDRH。此外，分離的抗原結合蛋 白可包含一個或多個A)的輕鏈⑶RL (同上)；和一個或多個B)的重鏈⑶RH(同上)。在另一個實施方案中，抗原結合蛋白包含選自下列的⑶RL:來自SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；來自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；來自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3。 抗原結合蛋白還可包含選自下列的⑶RH 來自SEQ ID NO 275-299的⑶RHl ；來自SEQ ID NO 300-331的CDRH2 ；來自SEQ ID NO :332_372的CDRH 3。備選地，分離的抗原結合蛋白 可包含一個或多個A)中所列的輕鏈⑶RL (同上)，和一個或多個B)的重鏈⑶RH(同上)。 特別地，分離的抗原結合蛋白可包含SEQ ID NO 189-217的CDRLl、SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 和 SEQID NO 234-274 的 CDRL3 和 / 或 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl、SEQ IDNO 300-331 的 CDRH2 和 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3。在一個方面中，分離的抗原結合蛋白包含與選自SEQ ID NO :94_141的氨基酸序列 具有至少80%、90%或100%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)(\)。在另一個方面，分離的抗原 結合蛋白包含與選自SEQ IDNO 142-186的氨基酸序列具有至少80 %、90 %或100 %的序列 同一性的重鏈可變區(qū)(Vh)。在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白特異性識別至少HB-EGF的包含IHGE 的表位和/或EGF樣結構域。此外，本文中還提供了與如上所述的結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白競爭結 合的分離的抗原結合蛋白。本文中還提供了分離的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白結合HB-EGF并且包含 A) 一個或多個選自下列的輕鏈CDR (CDRL) (i)與SEQID NO 189-217具有至少80%或至 少90%的序列同一性的CDRLl ； (ii)與SEQ ID NO :218_233具有至少80%或至少90%的
16序列同一性的CDRL2 ；和(iii)與SEQ ID NO :234_274具有至少80%或至少90%的序列同 一性的⑶RL 3。備選地，結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白包含B) —個或多個選自下列 的重鏈CDR(CDRH) :(i)與SEQ ID NO :275_299具有至少80%或至少90%的序列同一性的 CDRHl ； (ii)與SEQ ID NO 300-331具有至少80%或至少90%的序列同一性的CDRH2 ；和 (iii)與SEQ ID NO :332_372具有至少80%或至少90%的序列同一性的CDRH 3。分離的 抗原結合蛋白還可包含C) 一個或多個A)的輕鏈⑶RL和一個或多個B)的重鏈⑶RH。
在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白結合HB-EGF并且包含A)選自下列的 輕鏈互補決定區(qū)(CDRL)⑴選自SEQ ID NO =234-274的CDRL3 ;(ii)在氨基酸序列上與 ⑴的CDRL3相異于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRL3 ；和(iii)選自 下列的⑶RL3氨基酸序列X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO: 1046)，其中
X1是I或M，
X2是々、6或S，
&是1或T，
X4是H或Q，
X5 是 F、L 或 W，
X6 是 C、1、!1、1^或1\
X7是S或T ；
QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID NO: 1047)，其中
X1是I或S，
X2是F或Y，
X3 是 F、I、S 或 Y，
X4 是 A、S 或 T，
X5是P或S ；
X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO: 1048)，其中
X1是！^或Q，
X2是K、N或Q，
X3是々、H、S或Y，
X4 是 H、N 或 Y，
X6 是 A、F、I、Τ、V 或 Y，
X7是P或無氨基酸，
X8 是 F、L 或 P ；
QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID NO: 1049)，其中
X1是!1或Q，
X2是C或Y，
X3 是 D、I、N、S 或 Y，
父4是？、I或L，
父5是々、3或T ；
17
QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO: 1050)，其中X1 是 H 或 Y，X2 是 G 或 N，X3 是 N 或 S，X4 是 S 或 W，X5是P或無氨基酸，X6 是 R 或 W，X7 是 S 或 T ；或X1QYX2X3X4X5X6X 7F(SEQ ID NO: 1051)，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 F 或 Y，X3 是 G、I 或 S，X4 是 F、I 或 T，乂5是] 、？、3或1\X6 是 F、L、R 或 W,X7 是 S 或 T。分離的抗原結合蛋白還包含B)選自下列的重鏈互補決定區(qū)(⑶RH) :(i)選自SEQ ID NO 332-372的⑶RH3 ； (ii)在氨基酸序列上與(i)的⑶RH3相異于不超過2個氨基酸 的氨基酸添加、缺失或置換的CDRH3 ；和iii)選自下列的CDRH3氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQID NO 1065)，其中X1是E 或 S，X2是0、G或無氨基酸，X3是D、N或無氨基酸，X4是G或無氨基酸，X5是G或無氨基酸，X6是W、Y或無氨基酸，X7 是 I、N 或 Y，X8 是 A 或 Y，X9 是 G、V 或 Y，父10是八、？或GX11 是 F、L 或 M，X12 是 V 或 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID N0:1066)，其中X1是G或無氨基酸、X2 是 K、L 或 Y，X3 是 A、G 或 S，X4 是 S、V 或 Y，X5 是 A 或 G，X6是G或無氨基酸，
X7是T或無氨基酸，X8是S或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，X10 是 W 或 Y，X11 是 G、S 或 Y，X12 是 F 或 Y，X13是G或無氨基酸，X14是M或無氨基酸，X15 是 V 或 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 1067)，其中
X1是D、G、L、S或無氨基酸，X2是6、H、W、Y或無氨基酸，X3是A、F、W、Y或無氨基酸，X4是D、G、Q、T或無氨基酸，X5是G、I、Q、S或無氨基酸，X6是A、D、N、Q、S或無氨基酸，X7是6、Y或無氨基酸，X8是0、Y或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，X1。是 A、E、N 或 Y，X11 是 G、P、Τ、V 或 Y，父12是？或I，父13是0或 Q，X14 是 C、H、V或 Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO: 1068)，其中X1是E、D或無氨基酸，X2是6、R或無氨基酸，X3是I、V、Y或無氨基酸，X4 是 A、G、L 或 N，父5是々、6、￥或 W，X6 是 A、N、R 或 T，X7是6、N、P或無氨基酸，X8是6、T或無氨基酸，X9是A或無氨基酸，Xltl是D、E或無氨基酸，X11是S、Y或無氨基酸，X12是6、Y或無氨基酸，X13是N、Y或無氨基酸，X14是Y或無氨基酸，
X15是0、Y或無氨基酸，X16是々、G或無氨基酸，X17 ^ F ^ M,父18是1、乂或Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEQ ID NO ；1069)，其中X1 是八、0、6、3 或 T，父2是43、6、1^、11 、￥或無氨基酸，父3是4、6、1^、11 、1\￥或無氨基酸，父4是0、6、1 、5、￥、￥或無氨基酸，X5是六、6、I、S、V、Y或無氨基酸，X6是F、G、L、R、V或無氨基酸，&是1^、1\￥或無氨基酸，X8是Y或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，Xltl是D或無氨基酸，X11是S或無氨基酸，X12是S或無氨基酸，X13是G或無氨基酸，乂14是0、1^、11、5、￥ 或無氨基酸，X15 是 H、I、P、V、W 或無氨基酸，乂16是？、6、1^、1 、5、￥ 或無氨基酸，X17 是0、F、V、W、Y 或無氨基酸，X18 是 C、F、L、P、S 或 Y，X19 是0、F、G 或 Y，父2。是八、(、6、卩、1 、￥或￥，X21 是？、1^、11、3 或無氨基酸，X22是々、D或無氨基酸，&3是I、L、V、Y或無氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO: 1070)，其中父是]^或 V，X2是S或無氨基酸，X3是F或無氨基酸，X4是V或無氨基酸，父5是？或1X6是V或Y;或RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID N0:1071)，其中X1 是G、H、L、N 或 R，X2是E、T 或 W，父3是1^、111或￥，
X4 是 D 或 E。在另一個方面，分離的抗原結合蛋白還可包含A)選自下列的⑶RL:(i)選自SEQ ID NO 189-217的⑶RLl ； (ii)在氨基酸序列上與(i)的⑶RHl相異于不超過2個氨基酸 的氨基酸添加、缺失或置換的CDRLl ；或(iii)選自下列的CDRLl氨基酸序列x1ssqslx2x3sdgx4tylx5(seq id n0:1035)，其中父是仄或R，X^L 或 V，父3是!1或 Y，父4是1(或n，父5是13或Y;RASQX11SX2YLN(SEQ ID N0:1036)，其中父1是尺、3或1\父2是1 或S;RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO: 1037)，其中父1是0、6、3或1\父2是八、1 或S，X3 是 H、I、N、R、S 或 T，X4 是 D、W 或 Y，父5是八、6或n;QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID N0:1038)，其中父1是3或1\x^d 或n，&是3 或Y;RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID N0:1039)，其中父1是3或1\X2 是 I 或 S，X3 是 R 或 S，X4是S、N或無氨基酸，X5是Y或無氨基酸；或kssqx1x2lx3x4snnknylx5(seq id no: 1040)，其中X1是N 或 S，父2是1或乂，X3 是 D 或 Y，X4 是 N、R 或 S，XjA或V;(iv)選自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (ν)在氨基酸序列上與(iv)的 CDRL2 相 異于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRL2 ；或(vi)選自下列的CDRL2氨 基酸序列X1X2SNX3X4S(SEQ ID N0:1041)，其中
X1是E 或K、X2 ^ I ^ V,父3是1 或W，X4 是D 或F;X1X2SX3LQS(SEQ ID N0:1042)，其中父1是八或T，X2 是 A、E 或 V，X3 是 S 或 T ；X1ASX2LQS(SEQ ID N0:1043)，其中X1 是 A 或 V，X2 是 S 或 T ；DASX1LET(SEQ ID NO: 1044)，其中X1 是 I 或 N ；GASSRAT(SEQ ID NO 223)；或WASX1RES(SEQ ID NO: 1045)，其中父丨是八或T。分離的抗原結合蛋白還可包含B)選自下列的CDRH (i)選自SEQID NO =275-299 的CDRHl;(ii)在氨基酸序列上與(i)的CDRHl相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、 缺失或置換的⑶RHl ； (iii)選自下列的⑶RHl氨基酸序列GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 1052)，其中
父工是？或L，
X2 是E、G 或 S，
X3 是 H、L 或 Y，
父4是6、3或Y，
X5是I或M，
X6是H或S ；
GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO: 1053)，其中
X1是R或S ；
GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID N0:1054)，其中
X1是1 或S，
X2是H或Y，
X3是D或G ；
GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID N0:1055)，其中
父工是？或T，
X2是々、1 或S，
&是々或S，
X4是N或S ；
GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO: 1056)，其中
父工是0或G，
父2是卩、1或乂，X3是R、S或無氨基酸，X4是6、Y或無氨基酸，&是0、6、3或無氨基酸，x6 是 a、s 或 y，x7 是 a 或 y，x8 是 n 或 s ；gfslsnarmgvs (seq id no 279)；或gfslxjggvgvg(seq id no: 1057)，其中x1 是 s 或 n ；(iv)選自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (ν)在氨基酸序列上與(iv)的 CDRH2 相 異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRH2 ；或(vi)選自下列的CDRH2氨 基酸序列x1x2x3x4x5x6gx7tx8x9xltlqkx11x12 (seq id no: 1058)，其中X1 是 S 或 W，父2是？或I，X3 是 D、N 或 S，x4 是 a 或 p，x5是e、n 或 s，X6 是 D、N 或 S，X7 是 E、G 或 N，x8 是 i 或 n，x9 是 c、h 或 y，x1。是 a 或 t，x11 是 f 或 l，X12 是 D 或 G ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no:io59)，其中X1 是 D 或 G，x2 是 a、i 或 t ；X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(SEQ ID NO: 1060)，其中x1 是 f 或 v，x2 是 s 或 w，父3是0、3或 y，x4 是 i、n 或 t，X5 是 K 或 Q，X6 是 N、R 或 Y，x7 是 a、t 或 v，X8 是 K 或 R ；x1isx2sx3x4x5xeyyadsvkg(seq id n0:1061)，其中
X1 是 A、H 或 Y，父2是6、1 或S，父3是6或 S，X4 是 G、R 或 S，X5 是 S、T 或 Y，X6 是 I 或 T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO: 1062)，其中X1是E、R 或 Y，X2 是 I 或 T，X3 是 H、N 或 Y，X4 是 C、H、S、T 或 Y，X5 是 S 或 R，X6 是 G 或 S，X7 是 G、K、S 或 T，X8 是 T 或 W，X9 是 N 或 Y，Xltl是N或無氨基酸，X11是D或無氨基酸，X12 是 A 或 N，X13 是 P 或 V,X14 是 L 或 V ；X1Ifsndeksystslks(seq id no:io63)，其中父工是！!或Li;或LIYffNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID N0:1064)，其中X1 是 D 或 V，父2是0或E、X3 是 K 或 R。在另一個實施方案中，上述分離的抗原結合蛋白包含第一氨基酸序列和第二氨基 酸序列，這兩個序列彼此共價連接。第一氨基酸序列還包含SEQ ID NO: 234-274的⑶RL 3、 SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，以及第二氨基酸序列包含 所述 SEQ IDNO 332-372 的 CDRH3，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 和 SEQ ID NO :275_299 的 CDRHl。在一個方面，分離的抗原結合蛋白可以是單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人 抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段?？贵w片段可以是Fab片段、 Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、雙價抗體(diabody)或單鏈抗體分子。在一個實施方 案中，本發(fā)明的分離的抗原結合蛋白是人抗體。在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白 是單克隆抗體。本文中描述的分離的抗原結合蛋白，可以是下列類型的任一種IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4類型。在一個實施方案中，抗原結合蛋白是I gG2或I gG4類型。此外，可將抗原結合蛋白偶聯(lián)至標記基團。此類標記基團可以是例如放射性同位素、放射性核素、熒光基團、 酶基團、化學發(fā)光基團、生物素基團或預先確定的多肽基團。在另一個實施方案中，將分離的抗原結合蛋白偶聯(lián)至效應子基團例如放射性同位 素、放射性核素、毒素、治療性基團或化學治療基團。化學治療基團可以是例如卡奇霉素、 auristatin-PE、格爾德霉素、美登納新或其衍生物。在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白與本文中所述和請求保護的抗原結合 蛋白競爭對人HB-EGF的結合。該競爭性抗原結合蛋白可以是例如單克隆抗體、多克隆抗 體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。抗體片段可以 是例如Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、雙價抗體或單鏈抗體分子。在一個 實施方案中，分離的結合蛋白是人抗體。在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白是單克 隆抗體。在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4類型。在 一個實施方案中，抗原結合蛋白是IgG2或IgG4類型。在另一個實施方案中，可將本文中描 述的抗原結合蛋白偶聯(lián)至標記基團。標記基團的實例是放射性同位素、放射性核素、熒光基 團、酶基團、化學發(fā)光基團、生物素基團或預先確定的多肽基團。在另一個實施方案中，將分 離的抗原結合蛋白偶聯(lián)至效應子基團例如，放射性同位素、放射性核素、毒素、治療性基團 或化學治療基團。治療性基團或化學治療基團的實例包括例如卡奇霉素、auristatin-PE, 格爾德霉素、美登納新或其衍生物。在一個方面中，提供了至少部分地減少HB-EGF介導的信號轉導的分離的抗原結
合蛋白ο本文中還提供了編碼之前所描述的分離的抗原結合蛋白的核酸分子，其中核酸分 子與控制序列有效連接。在一個方面中，提供了包含上述核酸分子的載體。在另一個方面， 提供了包含上述核酸分子和/或載體的宿主細胞。在一個實施方案中，提供了用于制備抗原結合蛋白的方法，其包括從分泌所述抗 原結合蛋白的宿主細胞制備所述抗原結合蛋白的步驟。在另一個實施方案中，提供了包含至少一種上述的本發(fā)明的抗原結合蛋白以及可 藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物可包含另外 的活性劑例如抗腫瘤劑?？鼓[瘤劑可以是例如抗腫瘤抗體?？鼓[瘤抗體的實例可以是例如 抗受體酪氨酸激酶或EGFR的抗體。在一個方面中，藥物組合物用于過度增殖性疾病的診斷、預防或治療。在另外的方 面，過度增殖性疾病與HB-EGF表達相關。在另一個方面，過度增殖性疾病與被擾亂的(例 如病理性增強的)生長因子受體激活相關或與其相伴，其中所述病理性增強的生長因子受 體激活與G蛋白和/或G蛋白偶聯(lián)受體的活性的病理性增加相關或由其引起。在一個實施方案中，藥物組合物包含至少一種抗原結合蛋白和可藥用的載體、稀 釋劑和/或佐劑，所述藥物組合物用于診斷、預防或治療癌癥例如乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、 前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲狀腺 癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質瘤、黑素瘤、其他表達或過表達HB-EGF的癌癥以及腫瘤轉移的形成。在另一個實施方案中，本文中所描述的抗原結合蛋白用于制造藥物組合物，所述 藥物組合物用于診斷、預防或治療過度增殖性疾病。在另外的實施方案中，過度增殖性疾病 與HB-EGF表達相關。
—個實施方案描述了用于診斷與HB-EGF的表達相關的病況的方法，該方法包括 將樣品與本文中所描述的分離的抗原結合蛋白接觸，和確定HB-EGF在所述樣品中的存在 的步驟。在另外的實施方案中，病況是與HB-EGF表達相關的過度增殖性疾病。另一個方面描述了用于預防或治療患者中與HB-EGF的表達相關的病況的方法， 其包括對有此需要的患者施用有效量的本文中所描述的抗原結合蛋白。在另外的方面，病 況是與HB-EGF表達相關的過度增殖性疾病。在另外的方面，患者是哺乳動物患者。在一個實施方案中，提供了包含如上所述的抗原結合蛋白、核酸分子或載體的試 劑盒。在另外的實施方案中，試劑盒包含至少一種另外的活性劑，其中另外的活性劑是抗腫 瘤劑。本發(fā)明的這些和其他方面將在本文中進行更詳細地描述。本發(fā)明的每一個方面可 包括本發(fā)明的不同實施方案。因此預期包括一個元素或元素的組合的本發(fā)明的每一個實施 方案可包括在本發(fā)明的每一個方面中。本發(fā)明的其他特征、目的和有利方面在隨后的發(fā)明 詳述中是顯然的。附圖概述

圖1A-1P描述了抗原結合蛋白的不同輕鏈可變區(qū)。⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)標示于 框中。圖2A-20描述了抗原結合蛋白的不同重鏈可變區(qū)。⑶R1、⑶R2和⑶R 3區(qū)標示于 框中。圖3A-3K描述了抗原結合蛋白的不同輕鏈的氨基酸序列。圖4A-40描述了抗原結合蛋白的不同重鏈的氨基酸序列。圖5A描述了抗原結合蛋白的示例性輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。圖5B描述了抗原結合蛋白的示例性重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。圖6A-6F描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同CDR區(qū)的氨基酸序列。圖7A-7E描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同CDR區(qū)的氨基酸序列。圖8A-8H描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的氨基酸序列。圖9A-9F描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的氨基酸序列。圖IOA和IOB描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變序列的氨基酸序列的比對。⑶R1、 CDR2和CDR3區(qū)示于框中。圖IlA和IlB描述了抗原結合蛋白的重鏈可變序列的氨基酸序列的比對。⑶R1、 CDR2和CDR3區(qū)示于框中。圖12A描述了顯示抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的親緣關系(relatedness)的進化 樹。圖12B描述了顯示抗原結合蛋白的輕鏈CDRL3區(qū)的親緣關系的進化樹。圖12C描述了顯示抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的親緣關系的進化樹。圖13A-13V描述了抗原結合蛋白的不同輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。圖14A-14C描述了抗原結合蛋白的不同重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。圖15A-15M描述了抗原結合蛋白的不同輕鏈的核苷酸序列。圖16A-16L描述了抗原結合蛋白的不同重鏈的核苷酸序列。圖17A描述了抗原結合蛋白的輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。
圖17B描述了抗原結合蛋白的重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。圖18A-18F描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同⑶R區(qū)的核苷酸序列。圖19A-19G描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同⑶R區(qū)的核苷酸序列。圖20A-20K描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的核苷酸序列。圖21A-21K描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的核苷酸序列。圖22A圖解說明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG2抗體制劑抑制HB-EGF誘導的 表皮生長因子受體(EGFR)的酪氨酸磷酸化所達到的程度。提供了抗體U2-1至U2-68的制 劑的結果。如所說明的，單克隆抗體制劑U2-18、U2-24、U2-19和U2-42強烈地抑制EGFR的 酪氨酸磷酸化。圖22B圖解說明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG4抗體制劑抑制HB-EGF誘導的 表皮生長因子受體(EGFR)的酪氨酸磷酸化所達到的程度。提供了抗體U2-2至U2-66的制 劑的結果。如所說明的，單克隆抗體制劑U2-39、U2-34、U2-45和U2-6強烈地抑制EGFR的
酪氨酸磷酸化。圖23舉例說明抗體抑制C0S-7細胞中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA) 誘導的EGFR的酪氨酸磷酸化。LPA是激活TMPS途徑，從而導致HB-EGF的釋放(進而導致 EGFR的酪氨酸磷酸化)的GPCR配體。用指定的抗體預處理且用LPA刺激C0S-7細胞，然后 制備細胞裂解物，且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解物蛋白質。在制備印跡后，使用抗磷 酸酪氨酸抗體檢測磷酸化的EGFR。作為對照，如下圖中所示，使用WB抗EGFR抗體檢測總 EGFR0如所說明的，抗HB-EGF抗體制劑U2-24、U2-19和U2-42強烈抑制LPA誘導的EGFR 磷酸化。圖24圖解說明本文中提供的不同抗體對HB-EGF-誘導的EGF受體的酪氨酸磷酸 化的劑量依賴性抑制。在刺激SCC9鱗癌細胞之前將不同濃度的候選U2-39、U2-42和U2-45 抗體制劑與HB-EGF —起預溫育，然后檢測EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如所顯示的，抗體 U2-42和U2-39獲得多達111%的抑制。對于抗體測定的IC50值分別為0. 167nM(U2_39)、 lnM(U2-42)和 2nM(U2_45)。圖25圖解說明抗HB-EGF抗體制劑對MDA-MB231細胞中經(jīng)由TMPS的凝血酶誘導的 EGFR磷酸化的劑量依賴性抑制。在凝血酶存在的情況下將MDA-MB231細胞與候選U2-42、 U2-39和U2-45抗體制劑一起溫育，然后使用實施例6中描述的方法檢測EGFR的酪氨酸磷 酸化的量。如所顯示的，抗體U2-42和U2-39獲得100%的抑制。圖26舉例說明抗HB-EGF抗體制劑對PPC-1細胞中經(jīng)由TMPS的LPA誘導的EGFR 的酪氨酸磷酸化的劑量依賴性抑制。將PPC-I細胞與候選U2-42、U2-39和U2-45抗體制劑 一起溫育，然后使用實施例4中描述的方法檢測LPA刺激后EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如 所顯示的，抗體U2-42、U2-39和U2-45獲得100%的抑制。圖27舉例說明抗HB-EGF抗體制劑對鞘氨醇磷酸誘導的MDA-MB231乳腺癌細 胞的遷移的抑制達到100%。使用膠原I-包被的transwell(BD FalcomSym孔)就細胞 遷移的抑制檢測候選抗HB-EGF抗體制劑U2-42、U2-39和U2-45。如所顯示的，抗HB-EGF抗 體制劑U2-42抑制鞘氨醇-1-磷酸誘導的MDA-MB231細胞遷移大約70%，而U2-39和U2-45 抗HB-EGF抗體制劑抑制MDA-MB231細胞遷移大約100%。因此，本文中提供的抗HB-EGF抗 體強烈抑制MDA-MB231細胞遷移。
圖28圖解說明HB-EGF誘導的MCF-7乳腺癌細胞的遷移被3種抗HB-EGF抗體制 劑(U2-42、U2-39和U2-45單克隆抗體制劑)抑制。圖29舉例說明抗HB-EGF抗體制劑對HB-EGF誘導的HER4的酪氨酸磷酸化的劑量 依賴性抑制。在刺激和檢測HER4的酪氨酸磷酸化之前將U2-42. 1或U2-39. 1抗HB-EGF抗 體制劑與HB-EGF —起溫育。如所顯示的，觀察到對HER4的酪氨酸磷酸化的100%的抑制。 注意，示于χ軸的抗體的量對數(shù)減少。圖30A顯示單克隆抗體制劑與來自食蟹猴(cynomolgus monkey)的HB-EGF交叉 反應，如使用用表達食蟹猴HB-EGF的DNA載體轉染的HEK-293細胞通過流式細胞術(FACS) 所估量的。如所顯示的，對于用空載體對照轉染的HEK-293對照細胞觀察到極低的X-平均 值(1-2)。相反地，當用編碼食蟹猴HB-EGF的表達盒轉染HEK-293細胞時，觀察到250或更 高的X-平均值。圖30B顯示單克隆抗體U2-45制劑與來自小鼠的HB-EGF交叉反應，如使用用表達 小鼠HB-EGF的DNA載體轉染的HEK-293細胞通過流式細胞術(FACS)所估量的。當用編碼 小鼠HB-EGF的表達盒轉染HEK-293細胞時，觀察到33. 7的X-平均值。圖30C顯示HB-EGF抗體與雙調蛋白(amphiregulin)的交叉反應性的程度。圖31顯示HB-EGF在人血管內皮細胞(HUVEC)上表達，如通過FACS分析所檢測的。圖32A-32B顯示HB-EGF刺激HUVEC細胞增殖，而抗HB-EGF抗體制劑抑制基礎增殖 大約8%至14%。HB-EGF刺激HUVEC細胞增殖大約38% (圖32A)。然而，在加入抗HB-EGF 抗體制劑U2-42、U2-39或U2-45后，基礎細胞增殖被抑制大約8%至14% (圖32B)。圖 33A-33L 舉例說明抗 HB-EGF 抗體加速 HUVEC 管退化(tuberegression)。HUVEC 管形成是內皮細胞血管生成的模式系統(tǒng)。圖33A-33C提供了在不使用抗HB-EGF抗體的情況 下進行的對照測定。如所顯示的，HUVEC細胞連接形成許多環(huán)形結構或“管”。圖33D-33F舉 例說明加入抗HB-EGF U2-39抗體制劑對管形成的作用。圖33G-33I舉例說明加入抗HB-EGF U2-42抗體制劑對管形成的作用。圖33J-33L舉例說明加入抗HB-EGF U2-45抗體制劑對管 形成的作用。如所顯示的，當存在U2-42、U2-39和U2-45抗HB-EGF抗體制劑時，可看到較 少的HUVEC管，并且網(wǎng)絡減少。圖33M圖解說明在加入本文中提供的抗HB-EGF抗體制劑后HUVEC管形成的定量 評估，其支持HB-EGF抗體抑制血管生成的用途。針對U2-42、U2-39或U2-45抗HB-EGF抗 體制劑，將每顯微鏡視野的管或封閉的細胞結構的數(shù)目作圖。如所顯示的，當抗HB-EGF抗 體不存在時可看到大約10個HUVEC管，而當加入U2-39抗HB-EGF抗體制劑時，每顯微鏡視 野只觀察到大約4個HUVEC管。在U2-42抗HB-EGF抗體制劑存在的情況下，只觀察到大約 1個HUVEC管。當U2-45抗HB-EGF抗體制劑存在時，只觀察到6個HUVEC管。圖34A舉例說明抗HB-EGF抗體抑制HB-EGF刺激的0VCAR-8卵巢癌細胞的集落形 成。如所顯示的，HB-EGF刺激0VCAR-8細胞形成比在HB-EGF不存在的情況下培養(yǎng)的對照 0VCAR-8細胞顯著更大的平均集落大小。然而，當在HB-EGF存在的情況下將0VCAR-8細胞 與抗HB-EGFU2-39抗體一起培養(yǎng)時，平均集落大小減小至在無HB-EGF處理的情況下對于對 照細胞觀察到的基礎大小。圖34B舉例說明抗HB-EGF抗體抑制HB-EGF刺激的BM1604前列腺癌細胞在軟瓊 脂中的集落形成。如所顯示的，HB-EGF刺激BM1604細胞形成比在HB-EGF不存在的情況下培養(yǎng)的對照BM1604細胞更大數(shù)目的集落/孔。然而，當在HB-EGF存在的情況下將BM1604 細胞與抗HB-EGF U2-39抗體一起培養(yǎng)時，平均集落大小減小至與在無HB-EGF處理的情況 下對于對照細胞所觀察到的大小相似的大小?？笻B-EGFU2-45和U2-42抗體部分地抑制集 落形成，然而在該測定中，U2-39抗HB-EGF抗體完全抑制集落形成。圖34C舉例說明抗HB-EGF抗體抑制HB-EGF刺激的NCI-H226肺癌細胞的集落形 成。如所顯示的，HB-EGF刺激NCI-H226細胞形成比在HB-EGF不存在的情況下培養(yǎng)的對照 NCI-H226細胞顯著更大的平均集落大小。然而，當在HB-EGF存在的情況下將NCI-H226細 胞與抗HB-EGF U2-39抗體一起培養(yǎng)時，平均集落大小減小至在無HB-EGF處理的情況下對 于對照細胞所觀察到的基礎大小。圖34D舉例說明抗HB-EGF抗體抑制Sk0V-3HB-EGF克隆71細胞(來源于用HB-EGF 表達載體轉染以引起HB-EGF的組成型過表達的SkOV-3卵巢癌細胞)的基礎集落形成。 如所顯示的，對照Sk0V-3HB-EGF克隆71細胞形成大量的集落。然而，當將Sk0V_3HB_EGF cl. 71細胞與抗HB-EGF U2-42或U2-39抗體一起培養(yǎng)時，集落的數(shù)目急劇減少。圖34E舉例說明抗HB-EGF抗體抑制Sk0V-3HB-EGF克隆74細胞(來源于用HB-EGF 表達載體轉染以引起HB-EGF的組成型過表達的SkOV-3卵巢癌細胞)的基礎集落形成。如 所顯示的，對照Sk0V-3HB-EGF克隆74細胞形成大量的集落。然而，當將Sk0V_3HB_EGF克 隆74細胞與抗HB-EGF U2-39抗體一起培養(yǎng)時，集落的數(shù)目急劇減少。圖34F舉例說明抗HB-EGF抗體抑制培養(yǎng)在軟瓊脂中的BxPC3胰腺腺癌細胞的基 礎集落形成。如所顯示的，對照BxPC3細胞形成大量的集落。然而，當在HB-EGF存在的情 況下將BxPC 3細胞與抗HB-EGF U2-42或U2-39抗體一起培養(yǎng)時，集落的數(shù)目急劇減少。圖35舉例說明抗HB-EGF抗體抑制培養(yǎng)在軟瓊脂中的過表達HB-EGF的 EF0-27HB-EGF克隆58卵巢癌細胞的基礎集落形成。如所顯示的，對照細胞形成大量集落。 然而，當將EF0-27HB-EGF cl. 58細胞與抗HB-EGF U2_42、U2_39或U2-45抗體一起培養(yǎng)時， 集落的數(shù)目急劇減少。此外，抗HB-EGF抗體與抗EGFR抗體愛必妥(Erbitux)的聯(lián)合治療 完全抑制集落形成。圖36顯示抗HB-EGF抗體抑制HB-EGF誘導的體內管生成?？贵wU2-42、U2-39和 U2-45可以以劑量依賴性的方式阻斷小鼠基質膠塞測定(matrigel plug assay)中的血管 個生(Angiogenicnetwork formation)。圖37舉例說明抗體U2-42和U 2-39在小鼠異種移植物模型中對已建立的BxPC3 腫瘤的生長的抑制。圖38A-38C舉例說明抗體U2-42、U2-39和U2-45在小鼠異種移植物模型中對已 建立的EF0-27 HB-EGF克隆58腫瘤的生長的抑制(圖38A)。如圖38B中所示，顯示抗體 U2-42和U2-39對異種移植物腫瘤生長的抑制的功效是劑量依賴性的。此外，與抗EGFR抗 體愛必妥的聯(lián)合治療導致腫瘤生長的完全消失，從而顯示抗HB-EGF抗體作為聯(lián)合療法的 試劑的有效協(xié)同活性(圖38C)。圖39A-39B舉例說明人抗HB-EGF抗體用于通過免疫組織化學(圖39A)和通過 ELISA(圖39B)檢測人組織中的HB-EGF的用途。圖40A舉例說明顯示HB-EGF誘導的CLS354上皮鱗癌細胞(口)的遷移的抑制的 ^lJJtIlJ^ (scratch assay)。
圖40B舉例說明顯示HB-EGF誘導的Detroit 562上皮癌細胞(咽)的遷移的抑
(transmigration assay)。圖41舉例說明顯示VEGF刺激的內皮細胞出芽(sprouting)的抑制的基于球狀體 的(spheroid-based)細胞血管生成測定。圖42舉例說明顯示體內腫瘤的CD31染色的抑制的人腫瘤異種移植物樣品的免疫 組織化學(IHC)分析。圖43舉例說明顯示U2-39與順鉬和阿瓦斯丁的聯(lián)合治療的體內卵巢腫瘤異種移 植物模型。發(fā)明詳述本文中使用的章節(jié)標題僅用于組織目的而不被解釋為限定所述的主題內容。除非在本文中另外定義，否則結合本申請使用的科學和技術術語將具有本領域技 術人員通常理解的意義。此外，除非根據(jù)上下文需要，否則單數(shù)術語包括復數(shù)并且復數(shù)術語 包括單數(shù)。通常，本文中描述的結合細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳 學和蛋白質與核酸化學及雜交使用的命名法以及細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、 微生物學、遺傳學和蛋白質與核酸化學及雜交的技術是本領域內熟知和常用的。除非另 外指出，否則本申請的方法和技術通常按照本領域內熟知的和在整個本說明書中引用和 論述的各種一般和更專業(yè)的參考文獻中描述的常規(guī)方法來進行。參見，例如，Sambrook 等 人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 第 3 版·，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)禾口 Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates(1992),以及 Harlow 禾口 Lane Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)，其通過引用合并入本文。如本領域中通常實現(xiàn)的或如本文中所描述 的，按照廠商說明書進行酶促反應和純化技術。本文中描述的結合分析化學、合成有機化學 和醫(yī)學與藥物化學使用的術語以及分析化學、合成有機化學和醫(yī)學與藥物化學的實驗室方 法和技術是本領域內熟知和常用的?？墒褂脴藴始夹g進行化學合成、化學分析、藥物制備、 配制和遞送以及患者的處理。應當理解本發(fā)明不限于本文中描述的特定方法、方案和試劑等，因為其可發(fā)生變 化。本文中使用的術語只用于描述特定實施方案的目的，并且無意限定只由權利要求界定 的公開的范圍。與在操作實施例中不同，或除非另外指出，否則本文中使用的表示成分或反應條 件的數(shù)量的所有數(shù)值在所有情況下應當理解為由術語“大約”進行修飾。術語“大約”，當與 百分比結合使用時，可以表示士 1%。A. 一般概述本文中提供了結合HB-EGF，特別是人HB-EGF(hHB-EGF)蛋白的抗原結合蛋白。提 供的抗原結合蛋白是如本文所述的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)被包埋和/或連接入其中 的多肽。在一些抗原結合蛋白中，⑶R被包埋入“構架”區(qū)中，所述構架區(qū)確定⑶R的方位以 使獲得正確的CDR的抗原結合性質。通常，提供的抗原結合蛋白可干擾、阻斷、減少或調節(jié) HB-EGF與其相關受體(包括EGF-R和HER4)之間的相互作用。
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本文中描述的某些抗原結合蛋白是抗體或來源于抗體。在某些實施方案中，抗 原結合蛋白的多肽結構基于抗體，包括但不限于單克隆抗體、雙特異性抗體、微小抗體 (minibody)、結構域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化 抗體、人抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為“抗體綴合物”)和分別地其片段。在下文中 進一步描述各種結構。已顯示本文中提供的抗原結合蛋白結合HB-EGF特別地人HB-EGF的幾個表位。如 實施例中所顯示的，HB-EGF結合其相關受體的能力減小或被抑制。因此，本文中提供的抗 原結合蛋白能夠抑制HB-EGF的活性。特別地，結合此類表位的抗原結合蛋白可具有一個或 多個下列活性抑制，特別地，EGF-R和HER4的自磷酸化、EGF-R和HER4信號轉導途徑的誘 導、EGF-R和HER4誘導的細胞生長以及在HB-EGF結合后由EGF-R和HER4誘導的其他生理 效應。本文中公開的抗原結合蛋白具有多種用途。一些抗原結合蛋白例如可用于HB-EGF 特別地hHB-EGF的特異性結合測定、親和純化和可用于篩選測定以鑒定這樣的受體。此外， 公開的抗原結合蛋白還可用于疾病例如增殖性病癥的診斷和/或治療。此類疾病包括但不 限于各種類型的癌癥。B.肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)HB-EGF由各種腫瘤細胞產生，并且用作自分泌腫瘤生長因子。Davis-Fleischer ^A, 1998, Front Biosci. 3 288-299 ；Iwamoto&Mekada, 2000, Cytokine Growth Factor Rev. 11 :335-344。HB-EGF對于可增加HB-EGF的生物學活性的肝素具有強親和力。HB-EGF 產生為跨膜蛋白，其被金屬蛋白酶蛋白水解切割，產生生長因子的成熟可溶形式。HB-EGF最早以可溶、分泌的形式在培養(yǎng)的人巨噬細胞的上清液中得到鑒定。在人 細胞上，前體proHB-EGF用作白喉毒素受體。不同細胞類型，包括上皮細胞、角質形成細胞、 單核細胞、系膜細胞(mesangialcell)、淋巴樣細胞和骨骼肌細胞產生HB-EGF。其為上皮細 胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和各種人癌細胞的有效絲裂原和趨化因子。HB-EGF的跨膜形式由許多細胞類型合成為208個氨基酸的跨膜前體 (tm-HB-EGF)，其含有EGF結構域、發(fā)夾結合結構域、跨膜結構域和細胞質結構域。細胞外 結構域可通過金屬蛋白酶的作用作為12至22-kDa的HB-EGF的可溶性形式(sol-HB-EGF) 釋放，這受不同的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或腫瘤促進劑例如十四酰佛波乙酸酯(TPA)的調 控。通常，顯著量的跨膜HB-EGF前體在細胞表面上保持未切割狀態(tài)。tm-HB-EGF和sol-HB-EGF都具有生物學活性。sol-和tm-HB-EGF的生物學功能 都由EGF受體(EGFR;HER1)和ErbB4(HER4)介導。這些受體的這些類型的激活據(jù)信作為配 體誘導的受體同二聚化或異二聚化的結果而發(fā)生?；罨?，EGF受體顯示增加細胞生長、增 加細胞運動性、抑制細胞凋亡和增加細胞轉化。在刺激G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)后，可反式激活EGFR依賴性信號轉導途徑。通過 與GPCR相互作用產生的異三聚體G蛋白的配體激活導致誘導跨膜金屬蛋白酶的細胞外活 性的細胞內信號。激活GPCR途徑的配體包括LPA(溶血磷脂酸)、凝血酶、卡巴膽堿、鈴蟾 肽(bombesin)和內皮素。此類激活導致跨膜生長因子前體的細胞外加工和成熟因子的釋 放，所述成熟因子直接或通過蛋白聚糖基質與EGFR的胞外結構域相互作用，并且通過酪 氨酸磷酸化激活它。參見，Prenzel等人，1999，Nature 402 :884_888。因此，HB-EGF是GPCR借以激活膜結合金屬蛋白酶的三重膜傳遞信號(TMPS)機制的成分，所述金屬蛋白酶 切割proHB-EGF，從而釋放可溶性生長因子，該可溶性生長因子隨后激活EGF受體。EGFR 的反式激活與不同疾病狀態(tài)例如心肌肥厚(綜述于ShahBH，Catt KJ. Trends Pharmacol Sci. 2003May ；24 (5) :239_244 中)、血管重塑(綜述于 Eguchi 等人，2003，Biochem Soc Trans. 2003Dec ；31 (Pt 6) 1198-202 中)和癌癥(綜述于 Fischer 等人，2003 中，同上)相 關。HB-EGF蛋白的序列和編碼此類蛋白的核酸的序列對于本領域技術人員來說是 可獲得的。例如，這樣的HB-EGF序列可見于由NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫(參見，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)。HB-EGF 序列 的一個實例是NCBI登錄號NM 001945和NP_001936(gi =4503413)下的氨基酸序列。下文 中提供該序列以方便參考(SEQ ID N0 1072)MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEAD LDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCH GLSLPVEN RLYTYDHTTILAVVAVVLSSVCLLVIVGLLMFRYHRRG GYDVENEEKVKLGMTNSH。注意，上文中所示的HB-EGF序列(SEQ ID NO :1072)具有19個氨基酸的信號肽 (MKLLPSVVLK LFLAAVLSA, SEQ ID NO 1073)。可溶性細胞外結構域由上述HB-EGF序列的氨基酸1_149組成。HB-EGF可溶性細 胞外結構域的該序列在下文中提供為SEQ ID N0 1074MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEADL DLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRD PCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHG LSLP。在切割后，產生由氨基酸63-149 (87個氨基酸)組成的成熟HB-EGF。成熟HB-EGF 的該序列在下文中提供為SEQ ID NO 1075 DLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPS CICHPGYHGERCHGLSLF。HB-EGF與表皮生長因子受體(EGFR)相互作用并且激活其。EGFR是由細胞外配體 結合結構域、跨膜區(qū)和具有酪氨酸激酶活性的細胞內結構域組成的170kDa跨膜糖蛋白。生 長因子與EGFR的結合導致配體-受體復合物的內化，受體和其他蛋白質底物的自磷酸化， 從而最終導致DNA合成和細胞分裂。外部配體結合結構域不僅受HB-EGF刺激，而且還受 EGF, TGF α和雙調蛋白(AR)刺激。EGFR的過表達通常伴隨EGF樣生長因子的共表達，這表明控制生長的自分泌途徑 在腫瘤的進展中可能起主要作用?，F(xiàn)在普遍認為這是腫瘤借以逃脫正常生理控制的機制。C. HB-EGF受體抗原結合蛋白提供了許多用于調控HB-EGF的活性的選擇性結合試劑。此類試劑包括，例 如，包含抗原結合結構域的抗原結合蛋白(例如，單鏈抗體、結構域抗體、免疫粘附素 (inmmunoadhesion)和具有抗原結合區(qū)的多肽)并且特異性結合HB-EGF多肽，特別地人 HB-EGF。一些試劑例如可用于抑制HB-EGF與其受體的結合，從而可用于抑制、干擾或調節(jié) 與HB-EGF介導的信號轉導相關的一個或多個活性?！愕?，提供的抗原結合蛋白通常包含1個或多個本文中描述的⑶R(例如，1，2，3，4，5或6個)。在一些情況下，抗原結合蛋白包含(a)多肽結構和(b) —個或多個插入和 /或連接至多肽結構的⑶R。多肽結構可采用許多不同的形式。例如，其可以是，或包含天 然發(fā)生的抗體的構架或其片段或變體，或可以是完全天然合成的。不同多肽結構的實例在 下文中進一步描述。在某些實施方案中，抗原結合蛋白的多肽結構是抗體或來源于抗體，包括但不限 于單克隆抗體、雙特異性抗體、微小抗體、結構域抗體、合成的抗體(在本文中有時稱為“抗 體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(有時稱為“抗體綴合物”)和其各自的部 分或片段。在一些情況下，抗原結合蛋白是抗體的免疫學片段(例如，F(xiàn)ab、Fab'、F(ab' )2 或scFv)。在本文中進一步描述和定義各種結構。本文中提供的某些抗原結合蛋白特異性結合人HB-EGF。在特定的實施方案中，抗 原結合蛋白特異性結合具有SEQ ID NO: 1072的氨基酸序列的人HB-EGF蛋白。在其中抗原結合蛋白用于治療應用的實施方案中，抗原結合蛋白可抑制、干擾或 調節(jié)HB-EGF的一個或多個生物學活性。在該情況下，當過量的抗體使與其受體結合的人 HB-EGF的量減少(或反之亦然)至少大約20%、40%、60%、80%、85%或更多(例如通過 在體外競爭結合測定中測量結合)時，抗原結合蛋白特異性結合和/或顯著抑制人HB-EGF 與其受體的結合。HB-EGF具有許多不同的生物學效應，其可在許多不同的測定中在不同的 細胞類型中進行測量；本文中提供了此類測定的實例。1.天然發(fā)生的抗體結構提供的一些抗原結合蛋白具有通常與天然發(fā)生的抗體相關的結構。這些抗體的 結構單位通常包含一個或多個各自由兩個相同的多肽鏈偶聯(lián)體組成的四聚體，雖然一些哺 乳動物物種也產生只具有單個重鏈的抗體。在經(jīng)典的抗體中，各個對或偶聯(lián)體包含一個全 長“輕”鏈(在某些實施方案中，大約25kDa)和一個全長“重”鏈(在某些實施方案中，大 約50-70kDa)。各個單獨的免疫球蛋白鏈由幾個“免疫球蛋白結構域”組成，其各自由大約 90至110個氨基酸組成并且表達特征折疊模式。這些結構域是組成抗體多肽的基本單位。 各鏈的氨基末端部分通常包括負責抗原識別的可變結構域。羧基末端部分在進化上比鏈的 另一個末端更保守并且稱為“恒定區(qū)”或“C區(qū)”。人輕鏈通常分類為K和λ輕鏈，并且這 些鏈的每一個包含一個可變結構域和一個恒定結構域。重鏈通常分類為μ、δ、Υ、α或 ε鏈，這些鏈分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾種亞型，包 括但不限于IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM亞型包括IgMl和IgM2。IgA亞型包括IgAl和 IgA2。在人中，IgA和IgD同種型包含4條重鏈和4條輕鏈；IgG和IgE同種型包含2條重 鏈和2條輕鏈；IgM同種型包含5條重鏈和5條輕鏈。重鏈C區(qū)通常包含一個或多個可負 責效應子功能的結構域。重鏈恒定區(qū)結構域的數(shù)目將取決于同種型。例如IgG重鏈包含稱 *CH1、CH2*CH3的3個C區(qū)結構域。提供的抗體可具有任何這些同種型和亞型。在某些 實施方案中，HB-EGF抗體是IgGl、IgG2或IgG4亞型的抗體。在全長輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的“ J”區(qū)連 接，重鏈還包含大約10或更多個氨基酸的“D”區(qū)。參見，例如，F(xiàn)undamental Immunology, 第2版，Ch. 7 (Paul，W.，ed.) 1989，New York Raven Press (以其全文通過引用合并入本文， 用于所有目的)。各輕鏈/重鏈對的可變區(qū)通常形成抗原結合部位。示例性HB-EGF單克隆抗體的κ輕鏈恒定結構域的一個實例具有氨基酸序列
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RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 187)。示例性HB-EGF單克隆抗體的IgG2重鏈恒定結構域的一個實例具有氨基酸序列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI EKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 188)。免疫球蛋白鏈的可變區(qū)通常展示相同的總體結構，包含通過3個高變區(qū)(更通 常地稱為“互補決定區(qū)”或CDR)連接的相對保守的構架區(qū)(FR)。來自各個上述重鏈/輕 鏈對的兩條鏈的CDR通常通過構架區(qū)聯(lián)配(align)，從而形成特異性結合靶蛋白(例如， HB-EGF)上的特定表位的結構。從N末端至C末端，天然發(fā)生的輕鏈和重鏈可變區(qū)都通常遵 從此類元件的下列順序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已設計編號系統(tǒng)用于給占 據(jù)每一個此類結構域中的位點的氨基酸賦予編號。在Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1987 禾口 1991，NIH Bethesda, MD)或 Chothia&Lesk，1987，J. Mol. Biol. 196 901-917 ；Chothia 等人，1989，Nature 342 :878_883 中定義了該編號系統(tǒng)。本文中提供的各種輕鏈和重鏈可變區(qū)分別描述于圖1A-1P和圖2A-20。可分別將 這些可變區(qū)中的每一個連接至上述重鏈和輕鏈恒定區(qū)以形成完整的抗體重鏈和輕鏈。此 外，可將每一個如此產生的重鏈和輕鏈序列組合以形成完整的抗體結構。提供的一些抗體的全長輕鏈和重鏈的特定實例和它們相應的氨基酸序列分別概 述于圖3A-3K和圖4A-40中。再次地，可將圖3A-3K中所列的每一個示例性輕鏈(UL-1, Ul_2，Ul_3等)與圖 4A-40中顯示的任一示例性重鏈組合以形成抗體。此類組合的實例包括Uf 1與 -1至 -58 的任一個組合;Ul-2與Uh-I至Uh-58的任一個組合；或隊-3與Uh-I至UH_58的任一個組合 等。在一些情況下，抗體包括分別來自圖3A-3K和圖4A-40的至少一條輕鏈和一條重鏈。在 其他情況下，抗體包含兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈。例如，抗體或免疫功能片段可包 含兩條Ul-I輕鏈和兩條Uh-I重鏈，或兩Ul-2輕鏈和兩條Uh-2重鏈，或兩條UL_3輕鏈和兩 條Uh-3重鏈以及分別如圖3A-3K和圖4A-40中所列的成對輕鏈與成對重鏈的其他相似組
口 O提供的其他抗體是通過組合分別在圖3A-3K和圖4A-40中顯示的重鏈和輕鏈形成 的抗體的變體，其包括各自與這些鏈的氨基酸序列具有至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%,97%或99%的同一性的輕鏈和/或重鏈。在一些情況下，此類抗體包含至少一條輕鏈 和一條重鏈，然而在其他情況下，變體形式包含兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈。2.抗體的可變結構域還提供了包含抗體輕鏈可變區(qū)和/或抗體重鏈可變區(qū)以及此類輕鏈和重鏈可變 區(qū)的免疫功能性片段、衍生物、突變蛋白和變體的抗原結合蛋白，所述輕鏈可變區(qū)選自 U-VlI、U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U_VL7、U-VL8、U-VL9、U-Vl 10、U-VlI 1、U-Vl 12、U-VlI 3、 U-Vl14、U-VlI5, U-Vl16、U-VlI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、 U-Vl25、U-Vl26、U-Vl27、U_Vl28、U_Vl29、U_Vl30、U_Vl31、U_Vl32、U_Vl33、U_Vl34、U_Vl35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、U_VL42、U_VL43、U_VL44、U_VL45、U_VL46、 U-Vl47、U-Vl48、U-Vl49、U_Vl50、U_Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、U_Vl58、 U-Vl59 ,U-Vl60 ,U-Vl6 1,U-VL62,U-VL64 和 U_VL65，所述重鏈可變區(qū)選自U-VH1、U-VH2、U_VH3、 U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、U-VHI5, U-VH16、U-VHI7, U-VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、U_VH26、 U-Vh27、U-Vh28、U-Vh29、U_Vh30、U_Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、U_Vh36、U_Vh37、 U-Vh38、U-Vh39、U-Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U-VH46、U_VH47、U_VH48、 U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U-VH 56、U_VH57 和 U_VH58，分別如 圖1A-1P和圖2A-20中所示。不同輕鏈和重鏈可變區(qū)的序列比對分別提供于圖IOA和IOB以及圖IlA和IlB中。該類型的抗原結合蛋白通常可以用式“VHx/\y”來標示，其中“X”相應于重鏈可變 區(qū)的數(shù)目，“y”相應于輕鏈可變區(qū)的數(shù)目(通常，χ和y各自為1或2)?？蓪D1A-1P中所列的每一個輕鏈可變區(qū)與圖2A-20中所列的任一個重鏈可變區(qū) 組合以形成抗原結合蛋白。此類組合的實例包括U-VlI與U-VHI、U-VH2、U_VH3、U_VH4、U_VH5、 U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U_VH12、U-VHI3, U_VH14、U_VH15、U_VH16、U-VHI7, U-Vh18、U-Vh19、U-Vh20、U_Vh21、U_Vh22、U_Vh23、U_Vh24、U_Vh25、U_Vh26、U_Vh27、U_Vh28、 U-Vh29、U-Vh30、U-Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、U_Vh36、U_Vh37、U_Vh38、U_Vh39、 U-VH40、U-VH41、U-VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、U_VH47、U_VH48、U_VH49、U_VH50、 U-Vh51、U-Vh52、U-Vh53、U-Vh54、U-Vh55、U-Vh56、U-Vh57 或 U-Vh58 中的任一個組合或 U_Vl2 與 U-VHI、U-VH2、U-VH3、U_VH4、U_VH5、U_VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VH 10、U-VHI 1、U-VH 12、U-VHI 3、 U-VH14、U-VHI5, U-VH16、U-VHI7、U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、 U-Vh25、U-Vh26、U-Vh27、U_Vh28、U_Vh29、U_Vh30、U_Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、 U-VH36、U-VH37、U-VH38、U_VH39、U_VH40、U_VH41、U_VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、 U-Vh47、U-Vh48、U-Vh49、U_Vh50、U_Vh51、U_Vh52、U_Vh53、U_Vh54、U_Vh55、U_Vh56、U_Vh57 或 U-Vh58中的任一個組合等。在一些情況下，抗原結合蛋白包括分別來自圖1A-1P和圖2A-20中所列的那些的 至少一個重鏈可變區(qū)和/或一個輕鏈可變區(qū)。在一些情況下，抗原結合蛋白包含分別來自 圖1A-1P和圖2A-20中所列的那些的至少兩個不同的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。這樣 的抗原結合蛋白的實例包含(a) —個U-VJ和(b)U-VJ、U-VJ、U-VJ、U-Vj、U-八6、U-VJ、 U-Vl8,U-Vl9,U-VlIO,U-Vl1UU-Vl12,U-Vl13,U-Vl14,U-Vl15,U-Vl16,U-Vl17,U-Vl18,U-Vl19, U-VL20、U-VL21、U-VL22、U_VL23、U_VL24、U_VL25、U_VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、 U-VL31、U-VL32、U-VL33、U_VL34、U_VL35、U_VL36、U_VL37、U_VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、 U-VL42、U-VL43、U-VL44、U_VL45、U_VL46、U_VL47、U_VL48、U_VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、 U-Vl54、U-Vl55、U-Vl56、U-Vl57、U-Vl58、U-Vl59、U-Vl60、U-Vl61、U-Vl62、U-Vl64 和 U_VL65 中 的一個。再次地，這樣的抗原結合蛋白的另一個實例包含(a) —個U-VJ和(b)U-\l、U-\3、 U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U_VL8、U_VL9、U-VlIO, U-VLI 1、U-VlI2, U-VlI3, U_VL14、U-VLI5, U-VL16、U-VLI7, U-VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、U_VL25、U_VL26、 U-VL27、U-VL28、U-VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、U_VL35、U_VL36、U_VL37、 U-Vl38、U-Vl39、U-Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、U_Vl46、U_Vl47、U_Vl48、U-Vl49、U-Vl50、U-Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、U_Vl58、U_Vl59、U_Vl60、 U-\61、U-\62、U-\64和U-&65中的一個。再次地，這樣的抗原結合蛋白的另一個實例包含 (a) 一個 U-Vl3 和(b)U-VLl、U-VL2、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VLll、 U-VLI2, U-VlI3, U_VL14、U-VlI5, U_VL16、U-VlI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、 U-VL23、U-VL24、U-VL25、U_VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、 U-VL34、U-VL35、U-VL36、U_VL37、U_VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、U-V42、U_VL43、U_VL44、 U-VL45、U-VL46、U-VL47、U_VL48、U_VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、U_VL54、U_VL55、U_VL56、 U-VL57, U-VL58, U-VL59, U_VL60、U_VL61、U_VL62、U-VL64 和 U_VL65 中的一個等。再次地，這樣的抗原結合蛋白的另一個實例包含(a) —個U-VhI和(b)U_VH2、 U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、 U-VhI5, U-Vh16、U-VhI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、 U-VH26、U-VH27、U-VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、 U-VH37、U-VH38、U-VH39、U_VH40、U_VH41、U_VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、U_VH47、 U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U_VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U_VH56、U_VH57 和 U_VH58 中 的一個。另一個實例包含(a) —個 U-Vh2 和(b)U-VHl、U-Vh3、U_Vh4、U_Vh5、U_Vh6、U_Vh7、 U-Vh8、U-Vh9、U-Vh10、U-Vh11、U-Vh12、U-Vh13、U-Vh14、U-Vh15、U-Vh16、U-Vh17、U-Vh18、U-Vh19、 U-VH20、U-VH21、U-VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、U_VH26、U_VH27、U_VH28、U_VH29、U_VH30、 U-VH31、U-VH32、U-VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、U_VH37、U_VH38、U_VH39、U_VH40、U_VH41、 U-Vh42、U-Vh43、U-Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、U_Vh48、U_Vh49、U_Vh50、U_Vh51、U_Vh52、 U-Vh53、U-Vh54、U-Vh55、U-Vh56、U-Vh57 和 U-Vh58 中的一個。再次地，另一個實例包含(a) — 個 U-Vh3 和(b) U-VhI、U-Vh2、U-Vh4、U-Vh5、U-Vh6、U-Vh7、U-Vh8、U-Vh9、U-Vh10、U-Vh1 1、U-Vh12、 U-VHI3, U-VH14、U-VHI5, U_VH16、U-VHI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、 U-VH24、U-VH25、U-VH26、U_VH27、U_VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、 U-Vh35、U-Vh36、U-Vh37、U_Vh38、U_Vh39、U_Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、 U-VH46、U-VH47、U-VH48、U_VH49、U_VH50、U_VH51、U_VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U_VH56、 U-VH57和U-VH58中的一個等?？蓪⒅劓溈勺儏^(qū)的不同組合與輕鏈可變區(qū)的任何不同組合相組合。在其他情況下，抗原結合蛋白包含兩個相同的輕鏈可變區(qū)和/或兩個相同的重鏈 可變區(qū)。例如，抗原結合蛋白可以是抗體或免疫功能片段，其包括成對輕鏈可變區(qū)和成對重 鏈可變區(qū)(分別如圖1A-1P和圖2A-20中所列)的組合中的兩個輕鏈可變區(qū)和兩個重鏈可 變區(qū)。提供的一些抗原結合蛋白包含輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含與選自 U-VLI、U-VL2、U-VL3、U_VL4、U_VL5、U_VL6、U_VL7、U_VL8、U_VL9、U-VL 10、U-VLI 1、U-VL 12、U-VLI 3、 U-VL14、U-VLI5, U-VL16、U-VLI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、 U-V L25、U-VL26、U-VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、U_VL35、 U-Vl36、U-Vl37、U-Vl38、U_Vl39、U_Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、U_Vl46、 U-VL47、U-VL48、U-VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、U_VL54、U_VL55、U_VL56、U_VL57、U_VL58、 U-Vl59, U-八60、U-VL6U U-八62、U-八64或U-八65的輕鏈可變結構域的序列相異只在于1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中每一個這樣的序列差異獨立地是一個氨基酸的缺失、插入或置換。一些抗原結合蛋白中的輕鏈可變區(qū)包 含與 U-VLI、U-VL2、U-VL3、U_VL4、U_VL5、U_VL6、U_VL7、U_VL8、U_VL9、U-VLIO, U-VLI 1、U_VL12、 U-VLI3, U-VL14、U-VLI5, U_VL16、U-VLI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、 U-VL24、U-VL25、U-VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、 U-Vl35、U-Vl36、U-Vl37、U_Vl38、U_Vl39、U_Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、 U-Vl46、U-Vl47、U-Vl48、U_Vl49、U_Vl50、U_Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、 U-VL58, U-八59、U-VL60, U-八61、U-八62、U-VL64或U_\65的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的氨基酸序列。某些抗體包含重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與選自U-VHI、U_VH2、 U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、 U-VhI5, U-Vh1 6、U-VhI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、 U-VH26、U-VH27、U-VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、 U-Vh37、U-Vh38、U-Vh39、U_Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、 U-Vh48、U-Vh49、U-Vh50、U_Vh51、U_Vh52、U_Vh53、U_Vh54、U_Vh55、U_Vh56、U_Vh57 或 U_VH58 的重鏈可變結構域的序列相異只在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基 酸殘基的氨基酸序列，其中每一個這樣的序列差異獨立地是一個氨基酸的缺失、插入或 置換。一些抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)包含與U-VH1、U-Vh2、U-Vh3、U-Vh4、U_Vh5、U_Vh6、 U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VHIO、U-VHI 1、U_VH12、U_VH13、U_VH14、U_VH15、U_VH16、U_VH17、U_VH18、 U-Vh19、U-Vh20、U-Vh21、U_Vh22、U_Vh23、U_Vh24、U_Vh25、U_Vh26、U_Vh27、U_Vh28、U_Vh29、 U-VH30、U-VH31、U-VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、U_VH37、U_VH38、U_VH39、U_VH40、 U-Vh41、U-Vh42、U-Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、U_Vh48、U_Vh49、U_Vh50、U_Vh51、 U-VH52、U-VH53、U-VH54、U_VH55、U_VH56、U_VH57 或 U_VH58 的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的氨基酸序列。其他抗原結合蛋白例如抗體或免疫功能片段包括如剛才所描述的變異輕鏈和變 異重鏈的變異形式。3. CDR本文中公開的抗原結合蛋白是其中移植、插入和/或連接了一個或多個CDR的多 肽?？乖Y合蛋白可具有1、2、3、4、5或6個⑶R。因此抗原結合蛋白可具有例如一個輕鏈 CDRl (“CDRL1，，)和 / 或一個輕鏈 CDR2 (“CDRL2，，)和 / 或一個輕鏈 CDR3 (“CDRL3，，)和 / 或一 個重鏈 CDRl (“CDRH1”)和 / 或一個重鏈 CDR2 (“CDRH2”)和 / 或一個重鏈 CDR3 (“CDRH3”)。 一些抗原結合蛋白包含⑶RL3和⑶RH3。圖6A-6F和圖7A-7E中鑒定了特定的⑶R?？墒褂糜?Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第 5 片反，US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991中描述的系統(tǒng)鑒定給定的抗體的互補決定區(qū)(CDR)和構架區(qū)(FR)(圖8A-8H和圖 9A-9F中分別給出了輕鏈和重鏈FR氨基酸序列的實例)。本文中公開的某些抗體包含一個 或多個與圖6A-6F(⑶RL)和圖7A-7E (⑶RH)中所示的一個或多個⑶R的氨基酸序列同一或 與其具有充分序列同一性的氨基酸序列。已描述了天然發(fā)生的抗體中的⑶R的結構和性質，同上。簡而言之，在一般的抗體 中，CDR被包埋在重鏈和輕鏈可變區(qū)的構架區(qū)中，在其中它們構成了負責抗原結合和識別的區(qū)域?？勺儏^(qū)在構架區(qū)(被Kabat等人，1991 (同上)稱為構架區(qū)1_4，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4 ； 也參見Chothia和Lesk，1987，同上)內包含至少3個重鏈或輕鏈CDR，參見，同上(Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N. I. H.，Bethesda, MD ；也參見 Chothia 和 Lesk, 1987，J. Mol. Biol. 196 :901_917 ；Chothia 等人，1989, Nature 342 :877_883)。然而，本文中提供的CDR不僅可用于界定常規(guī)抗體結構 的抗原結合結構域，而且還可包埋在許多其他多肽結構中，如本文中所描述的。
在一個方面中，提供的CDR是(a)選自下列的CDRL :(i)選自SEQ IDNO 189-217的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ； 和(iv)包含一個或多個不超過5、4、3、2或1個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、 (ii)禾口 (iii)的 CDRL ； (B)選自下列的 CDRH ⑴選自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ； (ii) 選自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；禾口 (iv)包含 一個或多個不超過5、4、3、2或1個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii) 的 CDRLH。在另一個方面，提供了與圖6A-6F和圖7A-7E中所列的⑶R序列具有至少80%、 85 %、90 %或95 %的序列同一性的⑶R的變異形式。在另一個方面，本文中公開的⑶R包含來源于相關單克隆抗體的組的共有序列。 如本文中所描述的，“共有序列”是指具有在許多序列之間共同的保守氨基酸和在給定的 氨基酸序列中變化的可變氨基酸的氨基酸序列。提供的CDR共有序列包括相應于CDRL1、 CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2 和 CDRH3 中的每一個的 CDR。使用標準系統(tǒng)發(fā)生分析法(phylogenic analysis approach)確定相應于抗 HB-EGF抗體的U-Vl和U-Vh的CDR的共有序列。在該方法中，首先將相應于U-Vl或U-Vh的 完整可變結構域的氨基酸序列轉換成FASTA格式以方便處理比較比對和推斷系統(tǒng)發(fā)生?；?于該比較，分別將各輕鏈和重鏈可變區(qū)分成系統(tǒng)發(fā)生相關的組，即，將輕鏈可變區(qū)分成6個 組，A、B、C、D、E和F(參見，圖12A和12B)，將重鏈可變區(qū)分成7個組，A、B、C、D、E、F和G(參 見，圖12C)。然后，在這些組的每一個組中，將CDRLl、CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2、CDRH3區(qū) 域的每一個的比較用于確定共有集合(consensus collection)。A組輕鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 X1Ssqslx2X3SDGX4TYlX5 (seq id no 1035)的 cdrl1，其中X1 是 K 或 R，x2 是 l 或 v，X3 是 H 或 Y，X4 是 K 或 N，X5 是 N、S 或 Y。b.通式為 X1X2SNX3X4S(SEQ ID NO 1041)的 CDRL2，其中X1是E 或K，X2 是 I 或 V，X3 是 R 或 W，X4 是 D 或 F。c.通式為 X1QX2X3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO 1046)的 CDRL3，其中
X1 是 I 或 M，X2 是 A、G 或 S，X3 是 I 或 T，X4 是 H 或 Q，X5 是 F、L 或 W，X6 是 C、I、H、L 或 T，X7 是 S 或 T。B組輕鏈⑶R包括下列共有集合a 通式為 RASQX11SX2YLN(SEQ ID NO 1036)的 CDRLl，其中X1 是 R、S 或 T，父2是1 或S。b.通式為 X1X2SX3LQS (SEQ ID NO: 1042)的 CDRL2，其中父！是六或T，X2 是 A、E 或 V，X3 是 S 或 T。c.通式為 QQX1X2X3X4X5IT (SEQ ID NO 1047)的 CDRL3，其中X1 是 I 或 S，X2 是 F 或 Y，X3 是 F、I、S 或 Y，X4 是 A、S 或 T。X5 是 P 或 S.C組輕鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 RAsQX1IX2X3X4LX5 (seq ID NO 1037)的 CDRL1，其中父1是0、6、3或1\父2是六、1 或S，X3 是 H、I、N、R、S 或 T，X4 是 D、W 或 Y，X5 是 A、G 或 N。b.通式為 X1AsX2LQsGEQ ID NO 1043)的CDRL2，其中X1 是 A 或 V，父2是3或丁。c.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8T (SEQ ID NO: 1048)的 CDRL3，其中X1 是 L 或 Q，X2 是 K、N 或 Q，X3 是 A、H、S 或 Y，X4 是 H、N 或 Y，乂5是13或1\X6 是 A，F(xiàn)，I，T，V 或 Y，X7是P或無氨基酸，
X8 是 F、L 或 P。
D組輕鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 QasqdiX1X2X3LMseq id no :io38)的 cdrli，其中X1 是 S 或 T，X2 是 D 或 N，X3 是 S 或 Y。b.通式為 DasxiLEI^sEQ ID no 1044)的 CDRL2，其中X1 是 I 或 N。c.通式為 QX1X2DX3LPX4X5 (SEQ ID NO: 1049)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 C 或 Y，X3 是 D、I、N、S 或 Y，X4 是 F、I 或 L，乂5是六、3或11。E組輕鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 RasqX1VX2X3X4X5UUseq ID no :1039)的 CDRL1，其中父1是3或1\X2 是 I 或 S，X3 是 R 或 S，X4是S、N或無氨基酸，X5是Y或無氨基酸。b.通式為 GASSRAT (SEQ ID NO 223)的 CDRL2c.通式為 QQX1X2X3X4PX5X6XTiSEQ ID NO 1050)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Y，X2 是 G 或 N，X3是N 或 S，X4 是 S 或 W，x5是p或無氨基酸，X6 是 R 或 W，父7是3或丁。F組輕鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 KssqxiX2Lx3X4SnnKnYLX5 (SEQ ID NO :1040)的 CDRL1，其中X1是N 或 S，父2是1或乂，X3 是 D 或 Y，X4 是 N、R 或 S，父5是六或v。b.通式為 WASX1RES (SEQ ID NO 1045)的 CDRL2，其中父是八或T。
c.通式為 X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO 1051)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 F 或 Y，父3是6、1或 S，X4 是 F、I 或 T，父5是] 、卩、3或1\X6 是 F、L、R 或 W，父7是3或丁。A組重鏈⑶R括下列共有集合a.通式為 GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO 1052)的 CDRH1，其中X1 是 F 或 L，X2是E、G 或 S，X3 是 H、L 或 Y，X4 是 G、S 或 Y，
X5 是 I 或 M，X6 是 H 或 S。b.通式為 X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9XltlQKX11X12 (SEQ ID NO: 1058)的 CDRH2，其中X1 是 S 或 W，父2是？或I，X3 是 D、N 或 S，X4 是 A、P，X5 是 Ε、N 或 S，X6 是 D、N 或 S，X7是E、G 或 N，X8 是 I 或 N，X9 是 C、H 或 Y，父10是八或1\X11 是 F 或 L，X12 是 D 或 G。c.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQ ID NO: 1065)的 CDRH3，其中X1是E 或 S，X2是0、G或無氨基酸，X3是0、N或無氨基酸，X4是G或無氨基酸，X5是G或無氨基酸，X6是W、Y或無氨基酸，X7 是 I、N 或 Y，父8是六或Y，X9 是 G、V 或 Y，
X10 是 A、F 或 G，X11 是 F、L 或 M，X12 是 V 或 Y。
集合a.通式為 GyxiFTSyWIG(SEQ ID NO 1053)的 CDRH1，其中父丨是！ 或s。b.通式為 IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(SEQ ID NO 1059)的 CDRH2，其中x1 是 d 或 g，父2是八、1或丁。c.通式為 QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO 1066)的 CDRH3，其中x1是g或無氨基酸，x2 是 k、l 或 y，x3 是 a、g 或 s，X4 是 S、V 或 Y，x5 是 a 或 g，x6是g或無氨基酸，x7是t或無氨基酸，x8是s或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，x1。是 w 或 y，X11 是 G、S 或 Y，X12 是 F 或 y，x13是g或無氨基酸，x14是m或無氨基酸，x15 是 v 或 y。c組重鏈⑶r包括下列共有集合a.通式為 GFTFX1SX2X3MiKSEQ ID NO 1054)的 CDRH1，其中x1 是 r 或 s，父2是!1或 y，x3 是 d 或 g。b.通式為 X1Ix2X3DgSX4X5X6YX7DSVX8G (SEQ ID NO: 1060)的 CDRH2，其中X1 是 F 或 v，x2 是 s 或 w，X3 是 D、S 或 Y，x4是i、n或t，x5 是 k 或 q，x6 是 N、r 或 y，X7 是 A、T 或 V，父8是1(或R。
c.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14 (SEQ ID NO 1067)的 CDRH3，其中父丨是〕^^或無氨基酸，X2是6、H、W、Y或無氨基酸，X3是八、F、W、Y或無氨基酸， X4是D、G、Q、T或無氨基酸，X5是G、I、Q、S或無氨基酸，X6是A、D、N、Q、S或無氨基酸，X7是6、Y或無氨基酸，X8是0、Y或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，X1。是 A、E、N 或 Y，X11 是 G、P、Τ、V 或 Y，父12是？或I，父13是0或 Q，X14 是 C、H、V 或 Y。D組重鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 Gfx1Fsx2Yx3MxJseq id no :io55)的 cdrhi，其中父丨是卩或T，X2 是 A、R 或 S，X3 是 A 或 S，X4 是 N 或 S。b.通式為 X1Isx2Sx3X4X5X6YyADSVKG(SEQ ID NO 1061)的 CDRH2，其中X1 是 A、H 或 Y，父2是6、1 或S，X3 是 G 或 S，父4是6、1 或S，X5 是 S、T 或 Y，X6 是 I 或 T。c.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18 (SEQ ID NO: 1068)的 CDRH3， 其中X1是E、D或無氨基酸，X2是6、R或無氨基酸，X3是I、V、Y或無氨基酸，X4 是 A、G、L 或 N，X5 是 A、G、V 或 W，X6 是 A、N、R 或 T，X7是6、N、P或無氨基酸，父8是6、1\無氨基酸，X9是A或無氨基酸，
Xltl是D、E或無氨基酸，X11是S、Y或無氨基酸，X12是6、Y或無氨基酸，X13是N、Y或無氨基酸， X14是Y或無氨基酸，X15是0、Y或無氨基酸，X16是六、G或無氨基酸，X17 是 F 或 M，X18 是 I、V 或 Y。E組重鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8 (SEQ ID NO: 1056)的 CDRHl，其中父！是0或G，X2 是 F、I 或 V，X3是R、S或無氨基酸，X4是6、Y或無氨基酸，&是0、6、3或無氨基酸，X6 是 A、S 或 Y，X7 是 A 或 Y，X8是N 或 S。b.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS (SEQ ID NO 1062)的 CDRH2，其中X1是E、R 或 Y，父2是1或T，X3 是 H、N 或 Y，X4 是 C、H、S、T 或 Y，X5 是 S 或 R，X6 是 G 或 S，X7 是 G、K、S 或 T，X8 是 T 或 W，X9 是 N 或 Y，Xltl是N或無氨基酸，X11是D或無氨基酸，X12 是 A 或 N，X13 是 P 或 V,X14 是 L 或 V。c.通式為 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEQ ID NO: 1069) 的CDRH3，其中X1 是八、0、6、3 或 T，父2是八』、6、1^、11 、￥或無氨基酸，父3是八、6、1^、11 、1\￥或無氨基酸，
父4是0、6、1 、5、￥、￥或無氨基酸，X5是八、6、I、S、V、Y或無氨基酸，X6是F、G、L、R、V或無氨基酸，X7是L、T、Y或無氨基酸，
X8是Y或無氨基酸，X9是Y或無氨基酸，X10是D或無氨基酸，X11是S或無氨基酸，X12是S或無氨基酸，X13是G或無氨基酸，父14是0、1^、皿、5、￥或無氨基酸，X15 是 H、I、P、V、W 或無氨基酸，父16是？、6、1^、1 、5、￥或無氨基酸，X17 是0、F、V、W、Y 或無氨基酸，X18 是 C、F、L、P、S 或 Y，X19 是0、F、G 或 Y，父2。是八、(、6、卩、1 、￥或￥，X21是？、1^、1、3或無氨基酸，X22是A、D或無氨基酸，X23是I、L、V、Y或無氨基酸。F組重鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 GFSLSNARMGVS(SEQ ID NO 279)的 CDRHlb.通式為 X1Ifsndeksystslks(seq id no :io63)的 cdrh2，其中父丨是！!或L。c.通式為 X1YssGWX2X3YGX4X5DX6(seq ID no 1070)的 CDRH3，其中X1 是 M 或 V，X2是S或無氨基酸，X3是F或無氨基酸，X4是V或無氨基酸，X5 是 F 或 M，X6是V或Y。G組重鏈⑶R包括下列共有集合a.通式為 GFSLXJGGVGVG(SEQ ID NO 1057)的 CDRH1，其中x1 是 s 或 n。b.通式為 LiywnxiX2KrySPSLX3S (SEQ id no :1064)的 cdrh2，其中父:是0或 V，父2是0或E，父3是1(或R。c.通式為 RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID NO 1071)的 CDRH3，其中
X1 是G、H、L、N 或 R，X2 是 Ε、T 或 W，
父3是1^、111或￥，X4 是 D 或 Ε。 在另一個方法中，共有序列可通過在相應于U-Vl或U-Vh的相同序列內保持⑶R連 續(xù)來確定。簡而言之，在該方法中，將相應于或U-Vh的完整可變結構域的氨基酸序列 轉換成FASTA格式以方便處理比較比對和推斷系統(tǒng)發(fā)生。然后，將這些序列的構架區(qū)用人 工接頭序列替換，從而在不導入任何氨基酸位點權重偏向(weighting bias)(由于巧合的 事件(coincident event)(例如，偶然地共有共同的種系構架遺傳物(heritage)的不相關 抗體)引起)，同時仍然在相應于U-Vl或U-Vh的相同序列內保持CDR連續(xù)的情況下進行單 獨的CDR檢查。然后使用應用標準ClutalW-Iike算法的程序(參見，Thompson等人，1994， Nucleic Acids Res. 22 :4673_4680)，將該格式的U-Vl或U-Vh序列經(jīng)歷序列相似性比對查 詢。該程序同樣地使用UPGMA (使用算術平均數(shù)的非加權成組配對法)或Neighbor-Joining 法(參見，Saitou 和 Nei，1987，Molecular Biology and Evolution 4:406-425)基于序列 相似性比對產生系統(tǒng)發(fā)育圖(系統(tǒng)發(fā)生樹圖解)，從而通過分支長度比較和分組來構建和 圖解說明序列組的相似性和差異。對于確定單獨的組內的共有序列集合，兩種方法產生相 似的結果。在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一個⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3 (所述⑶RL具 有上述共有序列中的一個)。在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一個⑶RH1、⑶RH2或 CDRH3(所述CDRH具有上述共有序列中的一個)。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少兩 個根據(jù)上述共有序列的CDRLJP /或至少兩個根據(jù)上述共有序列的CDRH。在一個方面中， CDRL和/或CDRH來源于不同的組。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少兩個來自相同 組A、B、C、D、E或F的CDRL和/或至少兩個來自相同組A、B、C、D、E、F或G的CDRH。在其 他方面，抗原結合蛋白包含來自相同的上述組A、B、C、D、E或F的所有3個⑶RLl，⑶RL2 和CDRL 3序列，和/或來自相同的上述組A、B、C、D、E、F或G的所有3個CDRHl、CDRH2和 CDRH3序列。D.示例性抗原結合蛋白根據(jù)一個方面，提供了結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白，其包含(A)選自下列 的一個或多個輕鏈互補決定區(qū)(CDRL) :(i)選自SEQ IDNO =189-217的CDRLl ； (i i)選自 SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ；禾口 (iv)包含一個 或多個不超過5、4、3、2或1個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的 CDRL ； (B)選自下列的一個或多個重鏈互補決定區(qū)(CDRH)⑴選自SEQ ID NO =275-299的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ； 和(iv)包含一個或多個不超過5、4、3、2或1個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、 (ii)或(iii)的CDRH ；或(C) 一個或多個(A)的輕鏈CDRL ；和(D) 一個或多個(B)的重鏈 CDRH0在另一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白可包含㈧選自下列的CDRL :(i)選自 SEQ ID NO 189-217 的CDRLl ； (i )選自 SEQ ID NO :218_233 的CDRL2 ；和(iii)選自 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL3 ； (B)選自下列的 CDRH (i)選自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ；禾口 (iii)選自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；或(C) 一 個或多個(A)的輕鏈CDRLjP (D) —個或多個(B)的重鏈CDRL。在一個實施方案中，分離 的抗原結合蛋白可包含(A)SEQ IDNO 189-217 的 CDRLl，SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2，禾口 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL 3，和(B)SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2，和 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3。在另一個實施方案中，抗原結合蛋白包含與選自SEQ ID NO :94_141的氨基酸序列 具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性的可變輕鏈(Vj和/或與選自SEQ ID NO 142-186的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性的可變重鏈(Vh)。在 另外的實施方案中，八選自SEQ ID NO :94-141和/或乂11選自SEQ ID NO: 142-186。在另一方面，還提供了特異性結合含有至少一個包含IHGE的表位和/或HB-EGF 的EGF樣表位的表位的分離的抗原結合蛋白。
在另外的方面，提供了結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包 含(A)選自下列的輕鏈互補決定區(qū)(CDRL) :(i)選自SEQ ID NO 234-274的CDRL3，(ii) 在氨基酸序列上與(i)的CDRL3相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的 CDRL3 ； (iii)選自下列的 CDRL3 氨基酸序列=X1QX2X3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO 1046)，其中 X1 選 自I禾口 M，X2選自A、G禾口 S，X3選自I禾口 T，X4選自H禾口 Q、X5選自F、L禾口 W，X6選自C、I、H、 L 和 T，X7 選自 S 和 T !QQX1X2X3X4X5II^SEQ ID NO 1047)，其中 X1 選自 I 和 S，X2 選自 F 禾口 Y， X3 選自 F、I、S 和 Y，X4 選自 A、S 和 T，X5 選自 P 和 S ；X1X2X3X4X5X6X7X8T (SEQ ID NO 1048)，其 中X1選自L禾口 Q，X2選自K、N禾口 Q，X3選自A、H、S禾口 Y，X4選自H、N禾口 Y，X5選自N、S禾口 T， 乂6選自六、？、1、1\￥和丫，乂7選自 P 和無氨基酸，X8 選自 F、L 和 P ^X1X2DX3LPX4X5 (SEQ ID NO 1049)，其中X1選自H和Q，X2選自C和Y，X3選自D、I、N、S和Y，X4選自F、I和L，X5選自A、 S 和 T ；QQX1X2X3X4PX5X6X7 (SEQ ID NO 1050)，其中 X1 選自 H和 Y，X2 選自 G 和 N，X3 選自 N和 S， X4選自S和W，X5選自P和無氨基酸，X6選自R和W，X7選自S和T ；和X1QYX2X3X4X5X6X7F (SEQ IDNO 1051)，其中X1選自H禾口 Q，X2選自F禾口 Y，X3選自G、I禾口 S，X4選自F、I禾口 T，X5選 自M、P、S和T，X6選自F、L、R和W，X7選自S和T ；和/或⑶選自下列的重鏈互補決定區(qū) (CDRH)⑴選自SEQ IDNO 332-372的CDRH3，(ii)在氨基酸序列上與⑴的CDRH3相異 在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRH3;和(iii)選自下列的CDRH3氨 基酸序列=X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQ ID NO 1065)，其中 X1 選自 E 和 S，X2 選自 D、G 禾口 無氨基酸，X3選自D、N和無氨基酸，X4選自G和無氨基酸，X5選自G和無氨基酸，X6選自W、 Y和無氨基酸，X7選自I、N和Y，X8選自A和Y，X9選自G、V和Y，Xltl選自A、F和G，X11選 自 F、L 禾口 M，X12 選自 V 禾口 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15 (SEQ ID NO 1066)，其中 X1 選自G和無氨基酸，X2選自K、L和Y，X3選自A、G和S，X4選自S、V和Y，X5選自A和G，X6 選自G和無氨基酸，X7選自T和無氨基酸，X8選自S和無氨基酸，X9選自Y和無氨基酸，Xw 選自W和Y、X11選自G、S和Y、X12選自F和Y、X13選自G和無氨基酸，X14選自M和無氨基 酸，X15 選自 V 禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO 1067)，其中 X1 選自 D、G、L、S 和無氨基酸，X2選自G、H、W、Y和無氨基酸，X3選自A、F、W、Y和無氨基酸，X4選自D、G、Q、T 和無氨基酸，X5選自6、1、0、3和無氨基酸，&選自A、D，X8選自D、Y和無氨基酸，X9選自Y 和無氨基酸，X10選自A、E、N和Y，X11選自G、P、Τ、V和Y，X12是se，X14選自C、H、V和Y ；X1 X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17DX18 (SEQ IDNO 1068)，其中 X1 選自 E、D 和無氨基酸，X2選自G、R和無氨基酸，X3選自I、V、Y和無氨基酸，X4選自八、6、1^和隊&選自六、6、￥和1， X6選自A、N、R和T，X7選自G、N、P和無氨基酸，X8選自G、T和無氨基酸，X9選自A和無氨 基酸，Xltl選自D、E和無氨基酸，X11選自S、Y和無氨基酸，X12選自G、Y和無氨基酸，X13選自 N、Y和無氨基酸，X14選自Y和無氨基酸，X15選自D、Y和無氨基酸，X16選自A、G和無氨基酸， X17 選自 F 禾口 M, X18 選自 I、V 禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X 20X21X22X23 (SEQ ID NO 1069)，其中X1選自A、D、G、S和T，X2選自A、E、G、L、N、R、Y和無氨基酸，X3選自A、 G、L、N、R、T、Y和無氨基酸，X4選自D、G、R、S、V、Y和無氨基酸，X5選自A、G、I、S、V、Y和無 氨基酸，X6選自F、G、L、R、V和無氨基酸，X7選自L、T、Y和無氨基酸，X8選自Y和無氨基酸， X9選自Y和無氨基酸，Xltl選自D和無氨基酸，X11選自S和無氨基酸，X12選自S和無氨基 酸，X13選自G和無氨基酸，X14選自D、L、M、S、Y和無氨基酸，X15選自H、I、P、V、W和無氨基 酸，X16選自F、G、L、R、S、Y和無氨基酸，X17選自D、F、V、W、Y和無氨基酸，X18選自C、F、L、 P、S和Y，X19選自D、F、G和Y，X20選自A、C、G、P、R、V和Y，X21選自F、L、M、S和無氨基酸， X22 選自 A、D 和無氨基酸，X23 選自 I、L、V、Y 和無氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO 1070)，其中X1選自M和V，X2選自S和無氨基酸，X3選自F和無氨基酸，X4選自V和無氨基 酸，X5 選自 F禾口 M、X6 選自 V 禾口 Y ；禾口 RX1X2X3PFX4Y(SEQID NO 1071)，其中 X1 選自 G、H、L、N 禾口 R，X2選自Ε、T禾口 W，X3選自L、N、T禾口 V，X4選自D禾口 E。
在一個實施方案中，分離的抗原結合蛋白還包含㈧選自下列的⑶RL:(i)選 自SEQ ID NO :189-217的⑶RLl ;(ii)在氨基酸序列上與(i)的⑶RLl相異在于不超 過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRLl ;(iii)選自下列的CDRLl氨基酸序列 X1Ssqslx2X3SDGX4TYLX5 (SEQ ID NO :1035)，其中 X1 選自 K 和 R，X2 選自 L 和 V，X3 選自 H 禾口 Y，X4 選自 K 禾口 N，X5 選自 N、S 和 Y ;RASQXJSX2YLN(SEQ ID NO 1036)，其中 X1 選自 R、S 禾口 T，X2 選自 R禾口 S ；RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO 1037)，其中 X1 選自 D、G、S 和 T，X2 選自 A、 R 禾口 S，X3 選自 H、I、N、R、S 和 T，X4 選自 D、W 禾口 Y，X5 選自 A、G 禾口 N ；QASQDIX1X2X3LN (SEQ ID NO 1038)，其中 X1 選自 S 和 T，X2 選自 D 和 N，X3 選自 S 和 Y ；RASQX1VX2X3X4X5LA (SEQ ID NO 1039)，其中X1選自S和T，X2選自I和S，X3選自R和S，X4選自S、N和無氨基酸，X5選自Y 和無氨基酸；和 Kssqx1X2Lx3X4SnnKnyLX5(seq id no 1040)，其中 X1 選自 ν和 s，X2 選自 ι 禾口 V,x3選自 D 和 Υ，Χ4 選自 N、R和 S，X5 選自 A和 V ；或(iv)選自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (ν)在氨基酸序列上與(iv)的CDRL2相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置 換的CDRH2 ；或(vi)選自下列的CDRL2氨基酸序列=X1X2SNX3X4S (SEQ ID NO 1041)，其中 X1 選自 E 禾口 K，X2 選自 I 禾口 V，X3 選自 R 禾口 W，X4 選自 D 禾口 F ；X1X2SX3LQS (SEQ ID NO 1042)， 其中 X1 選自 A 禾口 T，X2 選自 A、E 禾口 V，X3 選自 S 禾口 T ；X1ASX2LQS(SEQ ID NO 1043)，其中 X1 選自 A 禾口 V，X2 選自 S 禾口 T ；DASX1LET (SEQ ID NO 1044)，其中 X1 選自 I 和 N ；GASSRAT (SEQ IDNO 223)；和 WASX1RES(SEQ ID NO :1045)，其中 X1 選自 A 和 T ；或 B)選自下列的 CDRH ⑴選自SEQ ID NO =275-299的CDRHl ； (ii)在氨基酸序列上與⑴的CDRHl相異在于不 超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRHl ;(iii)選自下列的CDRHl氨基酸序列 GYTX1TX2X3X4X5X6 (SEQ ID NO 1052)，其中 X1 選自 F 和 L，X2 選自 E、G 和 S，X3 選自 H、L 禾口 Y， X4 選自 G、S 禾口 Y，X5 選自 I 禾口 M，X6 選自 H 禾口 S ；GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO 1053)，其中 X1 選 自 R 禾口 S ；GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID NO 1054)，其中 X1 選自 R 和 S，X2 選自 H 和 Y，X3 選自 D 和 G ； GFX1FSX2YX3MX4 (SEQ ID NO 1055)，其中 X1 選自 P 和 T，X2 選自 A、R 禾口 S，X3 選自 A 禾口 S，X4選自 N 禾口 S ；GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO 1056)，其中 X1 選自 D 禾口 G，X2 選自 F、I 禾口 V， X3選自R、S和無氨基酸，X4選自G、Y和無氨基酸，X5選自D、G、S和無氨基酸，X6選自A、S 禾口 Y, X7 選自 A 禾口 Y，X8 選自 N 禾口 S ；GFSLSNARMGVS (SEQ ID NO 279)；禾口 GFSLXJGGVGVG (SEQ ID NO 1057)，其中 X1 選自 S 和 N ;(iv)選自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ； (ν)在氨基酸序 列上與(iv)的CDRH2相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或置換的CDRH2 ；和 (vi)選自下列的 CDRH2 氨基酸序列=X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9XltlQKX11X12 (SEQ ID NO: 1058)，其中 X1選自S禾口 W，X2選自F禾口 I，X3選自D、N禾口 S，X4選自A禾口 P，X5選自E、N禾口 S、X6選自D、 N和S，X7選自E、G和N，X8選自I和N，X9選自C、H和Y，Xltl選自A和T，X11選自F和L，X12 選自 D禾口 G ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no 1059)，其中 x1 選自 D和g，x2選自 a、i 和 τ ； X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G (SEQ ID NO 1060)，其中 X1 選自 F 和 V，X2 選自 S 和 W，X3 選自 D、 S禾口 Y，X4選自I、N禾口 T，X5選自K禾口 Q，X6選自N、R禾口 Y，X7選自A、T禾口 V，X8選自K禾口 R ； X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO 1061)，其中 X1 選自 Α、Η*Υ，Χ2 § G、R*S，X3itg G 和 S，X4 選自 G、R 禾口 S，X5 選自 S、T 和 Y，X6 選自 I 和 T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS (SEQ ID NO 1062)，其中 X1 選自 E、R 禾口 Y，X2 選自 I 禾口 T，X3 選自 H、N 禾口 Y，X4 選自 C、H、S、 T和Y，X5選自S和R，X6選自G和S，X7選自G、K、S和T，X8選自T和W，X9選自N和Y，X10 選自N和無氨基酸，X11選自D和無氨基酸，X12選自A和N，X13選自P和V，X14選自L和V ； X1Ifsndeksystslks(seq id no :io63)，其中X1 選自 η和li ；和Liywnx1X2KrySPSLX3S(seqid NO 1064)，其中X1選自D禾口 V，X2選自D禾口 E，X3選自K禾口 R。
在一些實施方案中，⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3序列中的至少2個或所有3個來源于共 有序列的相同的組A、B、C、D、E或F，和/或⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3序列中的至少2個或所 有3個來源于相同的組A、B、C、D、E、F或G。在其他情況下，將來自不同共有序列組的⑶R 混合和搭配。在另一個實施方案中，上文中描述的分離的抗原結合蛋白包含第一氨基酸序列和 第二氨基酸序列，兩者的序列彼此共價連接。在另外的實施方案中，分離的抗原結合蛋白的 第一氨基酸序列包括 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL3、SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO :189-217的⑶RL1。在另一方面，分離的抗原結合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3, SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 和 SEQ IDNO 275-299 的 CDRHl。在一個方面，本文中提供的分離的抗原結合蛋白可以是單克隆抗體、多克隆抗體、 重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在另一個實施方案中，本文中提供的分離的抗原結合蛋白的抗體片段可以是Fab 片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、雙價抗體或單鏈抗體分子。在另外的實施方案中，本文中提供的分離的抗原結合蛋白是人抗體并且可以是 IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4 類型。在另一個方面，可將本文中提供的分離的抗原結合蛋白偶聯(lián)至標記基團，例如放 射性同位素、放射性核素、熒光基團、酶基團、化學發(fā)光基團、生物素基團或預先確定的多肽 基團，或效應子基團例如放射性同位素、放射性核素、毒素、治療性基團或化學治療基團。治 療性基團或化學治療基團的實例是卡奇霉素、auristatin-PE、格爾德霉素、美登納新或其 衍生物。在另一個方面，本發(fā)明包括與任何上述抗原結合蛋白競爭的抗原結合蛋白。
如將由本領域技術人員認識到的，對于具有多于一個的來自所描述的序列的CDR 的任何抗原結合蛋白，可使用獨立地選自所描述的序列的CDR的任何組合。因此，可產生具 有1、2、3、4、5或6個獨立地選擇的⑶R的抗原結合蛋白。然而，如將由本領域技術人員所 認識到的，特定實施方案通常使用非重復的CDR的組合，例如，抗原結合蛋白通常不由兩個 ⑶RH2區(qū)域制備，等。在下文中更詳細地論述提供的一些抗原結合蛋白。1.抗原結合蛋白和結合表位 當認為抗原結合蛋白結合多肽例如HB-EGF的特定殘基中的表位時，例如，所指的 意思是抗原結合蛋白特異性結合由特定殘基組成的多肽(例如，HB-EGF的特定區(qū)段)。這 樣的抗原結合蛋白通常并非與HB-EGF中的每一個殘基接觸。HB-EGF的細胞外結構域或 HB-EGF內的每一個單個氨基酸置換或缺失并不一定顯著影響結合親和力?？乖Y合蛋白 的表位特異性可以用多種方法來測定。例如，一個方法包括檢測橫跨抗原的序列的并且以 少量氨基酸(例如，3個氨基酸)增量相異的大約15個氨基酸的重疊肽的集合。將肽固定 在微量滴定板的孔內。可通過生物素化肽的一個末端來實現(xiàn)固定。任選地，為了比較目的， 可在氨基端和羧基端生物素化相同肽的不同樣品，然后將其固定在分開的孔中。這用于鑒 定末端特異性抗原結合蛋白。任選地，可通過在特定的目的氨基酸上終止來包括另外的肽。 該方法可用于鑒定抗HB-EGF的內部片段的末端特異性抗原結合蛋白。就與每一個不同的 肽的特異性結合篩選抗原結合蛋白或免疫功能片段。表位定義為抗原結合蛋白對其顯示特 異性結合的所有的肽共有的氨基酸的區(qū)段。關于界定表位的特定方法的詳細內容示于實施 例23中。如實施例23中所顯示的，本文中提供的抗原結合蛋白能夠結合HB-EGF的至少一 個含有IHGE的表位和/或EGF樣結構域。2.競爭性抗原結合蛋白在另一個方面，提供了抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白與例舉的抗體或功能性 片段中的一個競爭對上述表位的結合(以特異性結合HB-EGF)。這樣的抗原結合蛋白還可 結合與本文中示例的抗原結合蛋白之一相同的表位或交疊表位。預期與示例的抗原結合蛋 白競爭或結合與其相同的表位的抗原結合蛋白和片段顯示相似的功能特性。示例的抗原結 合蛋白和片段包括上文中描述的那些，包括具有圖1、2、3、4、6和7中包括的重鏈和輕鏈、可 變區(qū)結構城和⑶R的那些。3.人抗體和抗體的人源化在一個實施方案中，HB-EGF抗原結合蛋白是人抗體或人源化的抗體。人抗體避免 了與具有鼠或大鼠可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體相關的許多問題。此類鼠或大鼠來源的蛋白 的存在可導致抗體的快速清除或可導致患者產生抗抗體的免疫應答。為了避免使用鼠或大 鼠來源的抗體，已通過將功能性人抗體基因座導入嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物(從 而使嚙齒類動物、其他哺乳動物或動物產生完全人抗體)來產生完全人抗體。用于產生完全人抗體的一個方法是使用小鼠的XenoMouse 品系，其經(jīng)工程改 造包含多達但小于IOOOkb大小的人重鏈基因座和K輕鏈基因座的種系配置的片段。參見， 例如 Mendez 等人，1997，NatureGenetics 15 146-156，以及 Green 和 Jakobovits，1998， J. Exp. Med. 188 :483_495。XenoMoU.Se 品系可從 Abgenix，Inc. (Fremont, CA)獲得。
小鼠的XenoMoUSe ,品系的產生論述和詳細描述于1990年I月12日提交的美國專利申請系列07/466，008、1990年11月8日提交的07/610，515、1992年7月24日提交 的 07/919，297、1992 年 7 月 30 日提交的 07/922，649、1993 年 3 月 15 日提交的 08/031，801、 1993年8月27日提交的08/112，848、1994年4月28日提交的08/234，145、1995年1月 20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430，938、1995年6月5日提交的 08/464，584、1995 年 6 月 5 日提交的 08/464，582、1995 年 6 月 5 日提交的 08/463，191、1995 年6月5日提交的08/462，837、1995年6月5日提交的08/486，853、1995年6月5日提交 的 08/486，857、1995 年 6 月 5 日提交的 08/486，859、1995 年 6 月 5 日提交的 08/462，513、 1996 年 10 月 2 日提交的 08/724，752、1996 年 12 月 3 日提交的 08/759，620、2001 年 11 月30日提交的美國公開案2003/0093820和美國專利6，162，963,6, 150，584,6, 114，598、 6，075，181 和 5，939，598 以及日本專利 3068180Β2.3068506Β2 和 3068507Β2 中。也參見， 1996年6月12日公開的歐洲專利EP 0463151Β1、1994年2月3日公開的國際專利申請案 WO 94/02602、1996年10月31日公開的國際專利申請案W096/34096、1998年6月11日公 開的WO 98/24893、2000年12月21日公開的WO 00/76310。每一個上述專利、申請和參考 文獻的公開內容以其全文通過引用合并入本文。在備選方法中，其他的包括GenPharm International, Inc.已利用“微小基因 座(minilocus)”方法。在微小基因座方法中，通過包含來自Ig基因座的片段(單獨的基 因)來模擬外源Ig基因座。因此，將一個或多個Vh基因，一個或多個Dh基因，一個或多個 Jh基因，μ恒定區(qū)以及通常第二恒定區(qū)(優(yōu)選Y恒定區(qū))構建入用于插入動物的構建體。 該方法描述于屬于Surani等人的美國專利5，545，807和各自屬于Lonberg和Kay的美 國專利 5，545，806,5, 625，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016,5, 770，429,5, 789，650、 5，814，318,5, 877，397,5, 874，299 和 6，255，458、屬于 Krimpenfort 和 Berns 的美國專利 5，591，669 和 6，023，010、屬于 Berns 等人的美國專利 5，612，205,5, 721，367 和 5，789，215 以及屬于Choi和Dunn的美國專利5，643，763，以及1990年8月29日提交的GenPharm國 際美國專利申請系列案07/574，748、1990年8月31日提交的07/575，962、1991年12月 17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853，408、1992年6月23日提交的 07/904，068、1992 年 12 月 16 日提交的 07/990，860、1993 年 4 月 26 日提交的 08/053，131、 1993 年 7 月 22 日提交的 08/096，762,1993 年 11 月 18 日提交的 08/155，301,1993 年 12 月3日提交的08/161，739、1993年12月10日提交的08/165，699、1994年3月9日提交的 08/209, 741中，其公開內容通過引用合并入本文。也參見，歐洲專利0546073Β1、國際專利 申請 WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、W094/00569、 WO 94/25585,WO 96/14436,WO 97/13852 和 WO 98/24884 以及美國專利 5，981，175，其公開 內容以其全文通過引用合并入本文。Kirin也已顯示從其中通過微細胞融合已導入了大的染色體片段或完整染色體的 小鼠產生人抗體。參見，歐洲專利申請773288和843961，其公開內容通過引用合并入本 文。此外，已產生KM 小鼠，其是Kirin' s Tc小鼠與Medarex' s微小基因座(Humab)小 鼠雜交育種的結果。這些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH轉染色體(transchromosome)和 Genpharm 小鼠的 κ 鏈轉基因(Ishida 等人，2002，Cloning StemCells 4:91-102)。還可通過體外方法產生人抗體。合適的實例包括但不限于噬菌體展示(CAT，Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion(之前為 Proliferon), Affimed)，核糖體展示(CAT)、酵母展示等。Ε.抗體的制備通過使用本文中描述的XenoMouse 技術制備本文中描述的抗體。此類小鼠能 夠產生人免疫球蛋白分子和抗體并且基本上不產生鼠免疫球蛋白分子和抗體。用于產生人 抗體的技術公開于本文中公開的專利、申請和參考文獻中。在一些實施方案中，如1996年 12月3日提交的美國專利申請系列08/759，620和1998年6月11日公開的國際專利申請 WO 98/24893和2000年12月21日公開的WO 00/76310 (其公開內容通過引用合并入本文) 中所公開的，進行小鼠和人抗體的轉基因產生。也參見Mendez等人，1997，Nature Genetics 15 :146-156，其公開內容通過引用合并入本文。
通過使用此類技術，已產生了抗許多抗原的全長人單克隆抗體。通常，用目的抗原 (例如HB-EGF)免疫小鼠的XenoMouse ,品系，從高度免疫的小鼠回收淋巴細胞(例如B 細胞)，然后將回收的淋巴細胞與骨髓型細胞系融合以制備永生化的雜交瘤細胞系。篩選 和選擇此類雜交瘤細胞系以鑒定產生特異于目的抗原的抗體的雜交瘤細胞系。還可就抗 HB-EGF片段的免疫反應性篩選上清液，以進一步繪制結合HB-EGF上的功能目的結構域的 不同抗體的圖譜。還可篩選與EGFR或其家族成員的其他配體、其他相關人趨化因子結合的 和抗HB-EGF的大鼠、小鼠和非人靈長類動物例如食蟹猴直系同源物的抗體，最后以確定物 種交叉反應性。本文中提供了用于產生多種雜交瘤細胞系(其產生特異于HB-EGF的抗體) 的方法。此外，本文中提供了由此類細胞系產生的抗體的特征，包括此類抗體的重鏈和輕鏈 的核苷酸和氨基酸序列分析。備選地，可直接測定B細胞，而無需融合至骨髓瘤細胞以產生雜交瘤。例如，可從 高度免疫的XenoMouse 小鼠分離B細胞，讓其增殖并且分化成抗體分泌型漿細胞。然 后通過ELISA就抗HB-EGF免疫原的反應性篩選來自細胞上清液的抗體。還可就抗HB-EGF 片段的免疫反應性篩選上清液以進一步繪制結合HB-EGF上的功能目的結構域的不同抗體 的圖譜。還可篩選與EGF受體或其家族成員的其他配體、其他相關人趨化因子結合的和抗 HB-EGF的大鼠、小鼠和非人靈長類動物例如食蟹猴直系同源物的抗體，最后以確定物種交 叉反應性?？衫酶鞣N方法永生化來自包含目的抗體的孔的B細胞，所述方法包括融合以 從單獨的孔或從混合的孔產生雜交瘤，或用EBV感染或用已知的永生化基因轉染，然后涂 板在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中。備選地，然后使用HB-EGF特異性溶血空斑測定(hemolytic plaque assay) (Babcook 等人，1996，Proc. Natl. Acad. Sci USA 93 :7843_48)分離分泌具有期望的 特異性的抗體的單個漿細胞。被靶向以裂解的細胞優(yōu)選是包被有HB-EGF抗原的綿羊紅細 胞(SRBC)。如上所述，存在許多抗體的同種型，包括但不限于下列人IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4。應理解，產生的抗體最初不需要具有這樣的同種型，相反地，當產生時，抗體可具有任 何同種型，以及應理解可通過使用本領域內熟知的常規(guī)分子生物學技術，利用合適的表達 載體中的分子克隆的V區(qū)基因或克隆的恒定區(qū)基因或cDNA，然后使用本領城內已知的技術 在宿主細胞中表達抗體，來對抗體進行同種型轉換。通常，由融合的雜交瘤產生的抗體是具有完全人κ鏈的人IgG2重鏈或人IgG4重鏈?？贵w還可以是其他人同種型，包括IgGl或IgG3。抗體具有高親和力，通常具有大約10_6 至大約10_12M或更低的KD，當通過固相和液相技術測量時。具有至少10_9M的Kd的抗體優(yōu) 選用于抑制HB-EGF的活性。具有至少ΙΟ,Μ的Kd的抗體也優(yōu)選用于抑制HB-EGF的活性。 具有至少IiT11M的Kd的抗體也優(yōu)選用于抑制HB-EGF的活性。
如將意識到的，可在除了雜交瘤細胞系以外的細胞系中表達抗HB-EGF抗體。可使 用編碼特定抗體的序列轉染合適的哺乳動物宿主細胞。在用于轉染和隨后表達抗體的合適 的載體的構建過程中，可將抗體從一種同種型類別轉換成另一種同種型，例如可通過本領 域內已知的技術將IgG4抗體類別轉換成IgG2?？赏ㄟ^用于將多核苷酸導入宿主細胞的任 何已知的方法(包括例如將多核苷酸包裝入病毒中(或病毒載體中)，然后用病毒(或載 體)轉導宿主細胞)或通過本領域內已知的轉染方法(如美國專利4，399，216,4, 912，040、 4，740，461和4，959，455 (所述專利通過引用合并入本文)所例舉的)進行轉染。所使用 的轉化方法取決于待轉化的宿主。用于將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法在本領域 內是熟知的，包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿 孔、多核苷酸在脂質體中的封裝和DNA至細胞核內的直接顯微注射。可作為用于表達的宿主獲得的哺乳動物細胞系在本領域內是熟知的并且包括許 多可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細胞系，包括但不限于中國倉鼠卵 巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如， Hep G2)、人上皮腎293細胞和許多其他細胞系。通過確定具有高表達水平且產生大量的抗 HB-EGF抗體的細胞系來選擇特別優(yōu)選的細胞系。備選地，可從經(jīng)基因工程改造以產生完全人抗體的動物或從在噬菌體、酵母、核糖 體或大腸桿菌(E.coli)中制備的抗體展示文庫制備此類抗體。參見，例如，Clackson等 人，1991，Nature 352 :624_628，Marks 等人，1991，J. Mol. Biol. 222 :581_597，F(xiàn)eldhaus 和 Siegel, 2004, J. Immunol. Methods. 290 :69_80，Groves禾口Osbourn，2005，Expert Opin Biol Ther. 5 125—135 以及 Jostock 禾口 Dubel，2005，Comb Chem High Throughput Screen. 8 127-133。另一方面涉及編碼HB-EGF抗原結合蛋白例如抗體的分離的核酸分子。在本文的 上下文中，術語“分離的核酸分子”，如本文中所使用的，根據(jù)其來源，意指基因組、cDNA或合 成來源的多核苷酸或其一些組合，“分離的核酸分子”(1)不與在其中天然發(fā)現(xiàn)“分離的多 核苷酸”的所有或部分多核苷酸結合，(2)與其在天然狀態(tài)下不與之連接的多核苷酸有效連 接，或(3)不作為更大的序列的部分天然發(fā)生。此外，術語“核酸分子”，如本文中所提及的， 意指長度為至少10個堿基的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型的核苷酸的修 飾形式例如具有修飾的或取代的糖基的核苷酸等)的多聚體形式。術語還包括DNA的單鏈 和雙鏈形式。在下文中更詳細地描述編碼抗原結合蛋白或其部分的示例性核酸。在一個實施方案中，將核酸分子有效連接至控制序列。術語“控制序列”，如本文中 使用的，是指實現(xiàn)與它們連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。取決于宿 主生物，此類控制序列的性質不同。在原核生物中，此類控制序列通常包括啟動子、核糖體 結合位點和轉錄終止序列。在真核生物中，一般地，此類控制序列包括啟動子和轉錄終止序 列。術語“控制序列”意欲包括(在最低程度上)其存在是表達和加工所必需的所有組件， 并且還可包括其存在是有利的另外的組件，例如，前導序列和融合伴侶序列。此外，術語“有效連接的”，如本文中所使用的，是指處于允許它們以期望的方式發(fā)揮功能的關系中的所述 組件的位置。此外，如本文中所提供的，與編碼序列有效連接的表達控制序列以在與表達控 制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達的方式連接。另外的方面是包含編碼本文中提供的HB-EGF抗原結合蛋白的核酸分子的載體。 可將核酸分子與控制序列有效連接。此外，載體可額外地包含復制起始區(qū)或選擇標記基因。 可使用的載體的實例是例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。 F.基于基本抗體結構的抗原結合蛋白如上所述，已知基本抗體結構單位包含四聚體。各四聚體由兩個相同的多肽鏈對 組成，各對具有一個“輕鏈”(大約25kDa)和一個“重鏈”(大約50-70kDa)。各鏈的氨基末 端部分包括大約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)(主要負責抗原識別)。各鏈的羧基 末端部分界定了負責二聚化效應子功能、循環(huán)半衰期和其他功能的恒定區(qū)。人輕鏈分類為 K和λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、Υ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、 IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連 接，對于重鏈還包括大約10或更多個氨基酸的“D”區(qū)。通常參見Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編輯，第2版.Raven Press, N. Y. (1989))(以其全文通過引用合并入本文， 用于所有目的)。各輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成了抗體的抗原結合位點。因此，完整的IgG抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中外，兩 個結合位點是相同的。鏈的可變區(qū)都展示相同的一般結構通過3個高變區(qū)(也稱為互補決定區(qū)或CDR) 連接相對保守的構架區(qū)(FR)。來自各個對的兩個可變區(qū)的CDR通過構架區(qū)聯(lián)配，從而使 得能夠與抗原上的特定表位結合。輕鏈和重鏈的可變區(qū)從N末端至C末端都包含結構域 FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸至各結構域的分配遵從KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(Nationallnstitutes of Health, Bethesda, Md. (1987 和 1991))，或 Chothia&Lesk，1897，J. Mol. Biol. 196 :901_917 ；Chothia 等人， 1989，Nature 342 :878_883 的定義。因此，本文中提供的抗體可包括至少一個具有式 FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3-⑶R3-FR4的可變區(qū)多肽鏈，其中FRl是第一人構架區(qū)，⑶Rl是第 一互補決定區(qū)，F(xiàn)R2是第二人構架區(qū)，⑶R2是第二互補決定區(qū)，F(xiàn)R3是第三人構架區(qū)，⑶R3 是第三互補決定區(qū)，以及FR4是第四人構架區(qū)。CDR3通常是抗體可變區(qū)的最多樣的區(qū)域。在一些實施方案中，F(xiàn)Rl區(qū)包括但不限于氨基酸序列SEQ IDNO :373_393和/或 453-469的任一個；CDRl區(qū)包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO 189-217和/或275-299 的任一個；FR2區(qū)包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO :394_414和/或470-481的任一個； CDR2區(qū)包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO 218-233和/或300-331的任一個；FR3區(qū)包 括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO =415-440和/或482-511的任一個；CDR3區(qū)包括但不限 于氨基酸序列SEQ ID NO 234-274和/或332-372的任一個；以及FR4區(qū)包括但不限于氨 基酸序列SEQ IDNO :441-452和/或512-517的任一個。因此，在一些實施方案中，本文中 提供的人抗體具有一個或多個本文中提供的氨基酸序列。應理解，本文中提供的抗體的氨基酸序列不限于20種常規(guī)氨基酸(參見， Immunology-Α Synthesis(第 2 片反，E.S. Golub 禾口 D. R. Gren, Eds.，Sinauer Associates，Sunderland,Mass. (1991))，其通過引用合并入本文)。例如，氨基酸可包括20種常規(guī)氨基 酸的立體異構體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α _，α - 二取代的氨基酸、N-烷 基氨基酸、乳酸和其他非常規(guī)氨基酸。也可以是提供的抗體的合適的組分的非常規(guī)氨基酸 的實例包括4_羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、 O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、σ -N-甲基 精氨酸和其他類似的氨基酸和亞氨基酸，例如4-羥脯氨酸。此外，預期包括SEQ ID NO :1_517和1035-1071中顯示的氨基酸序列中的小變異， 只要氨基酸序列中的變異保持SEQ ID NO 1-517和1035-1071中所示的序列的至少75%， 更優(yōu)選至少80%、90%、95%和最優(yōu)選99%即可。SEQ ID NO :1_517和1035-1071中顯示 的氨基酸序列中的優(yōu)選變異，即，至少一個氨基酸的缺失、插入和/或置換，在功能結構域 的邊界附近發(fā)生?？赏ㄟ^將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或私人擁有的序列數(shù)據(jù)庫 相比較來鑒定結構和功能結構域?？墒褂糜嬎?機化的比較方法來鑒定在已知結構和/或功 能的其他抗體中發(fā)生的預測的蛋白質構象結構域或序列基序。鑒定折疊入已知的三維結構 的蛋白質序列的方法是已知的。參見，例如，Bowie等人，1991，Science253 164 ；Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed. ,W.H.Freeman and Company,New York(1984)) ；Introduction to Protein Structure(C. Branden禾口 J. Tooze,eds. ,Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；和 Thornton 等人，1991，Nature 354 :105，其全都通 過引用合并入本文。因此，本領域技術人員可識別可用于界定結構和功能結構域的序列基 序和結構構象。SEQ ID NO 1-517和1035-1071中所示的氨基酸序列中的特別優(yōu)選的變異是導致 減少的對蛋白質水解或氧化的易感性、改變糖基化模式或改變結合親和力或賦予或改變抗 體的其他物理化學或功能特性的變異。特別地，涉及保守氨基酸置換。保守置換是在其側 鏈相關的氨基酸的家族內發(fā)生的置換。優(yōu)選的氨基酸家族如下酸性家族=天冬氨酸、谷氨 酸；堿性家族=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；非極性家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和不帶電荷的極性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是脂肪族-羥基家族=絲氨酸和蘇 氨酸；含有酰胺的家族=天冬酰胺和谷氨酸胺；脂肪族家族=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸；和芳香族家族=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可合理地預期，用異亮氨酸或纈 氨酸對亮氨酸的分離的置換、用谷氨酸對天冬氨酸的分離的置換、用絲氨酸對蘇氨酸的分 離的置換或用結構上相關的氨基酸對氨基酸的相似置換將對所得抗體的結合或性質不具 有重大影響，特別是如果置換不涉及構架部位內的氨基酸。然而，還包括所有其他可能的氨 基酸置換。氨基酸變化是否導致功能性抗體，即，結合HB-EGF并且減小、中和或或顯著抑制 HB-EGF的功能的抗體，可通過在ELISA或FACS中就與HB-EGF的結合測定所得抗體的特異 性活性或通過體外或體內功能測定來容易地進行確定。可通過影響，例如減少或抑制HB-EGF與其受體例如EGFR或HER4的結合來引起 HB-EGF介導的信號轉導的減少、中和或顯著抑制。術語“抗體”或“抗HB-EGF抗體”，如本文中所使用的，意指單克隆抗體、多克隆 抗體、重組抗體、人源化抗體(Jones等人，1986，Nature 321 :522_525 ；Riechmann等人， 1988，Nature 332 :323_329 ；禾口 Presta, 1992，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596)、嵌合抗體(Morrison 等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α. 81 :6851_6855)、從至少兩個抗體形 成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或其抗體片段。術語“抗體片段”包括上述抗體的 任何部分，優(yōu)選至少一個它們的抗原結合或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab片段、Fab' 片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、雙價抗體(Hollinger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90 :6444-6448)、單鏈抗體分子(Pluckthun in :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg 和 Moore，EDS，Springer Verlag, N. Y. (1994)，269-315)和其 他片段，只要它們展示期望的結合HB-EGF的能力。此外，術語“抗體”或“抗HB-EGF抗體”，如本文中所使用的，可包括包含抗體或 天然發(fā)生的抗體變體的經(jīng)工程改造的亞結構域的抗體樣分子。此類抗體樣分子可以是 單鏈結構域抗體例如來源于天然來源例如駱駝(Muyldermans等人，2001，Reviews in MolecularBiotechnology 74，277-302)的或通過來自人、駱駝或其他物種的文庫的體外展 示(Holt 等人·，2003，Trends Biotechnol. 21 484-90)產生的只有 VH 或只有 VL 的結構 域 。"Fv片段”是包含完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非 共價結合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。在該構型中各可變 結構域的3個⑶R相互作用以在二聚體的表面上界定抗原結合位點。6個⑶R共同賦 予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或只包含特異于抗原的3個CDR的一 半的Fv)也具有識別和結合抗原的能力，盡管通常以比完整結合位點更低的親和力。“Fab 片段”還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(C0I)?！癋ab片段”與“Fab'片 段”相異在于在重鏈ChI結構域的羧基末端上添加少數(shù)幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的 一個或多個半胱氨酸?！癋(ab' )2片段”最初產生為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的一對 "Fab'片段”。制備此類抗體片段的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解，對于本領域技 術人員來說是已知的。本文中提供的抗體可引起(fix)補體依賴性細胞毒性(CDC)或激活抗體依賴性細 胞毒性(ADCC)，特別是IgGl抗體、通過分子生物學從人或哺乳動物來源的IgG2或IgG4或 另一個同種型類別轉換的IgGl變體或從產生人IgGl的小鼠從新產生的IgGl變體。還可 使用其他方法。有時可將本文中提供的抗體偶聯(lián)至標記基團或效應子基團，例如毒素、化學 治療劑、報告分子或顯象劑。G.其他類型的HB-EGF結合蛋白在另一個方面，本文中提供的HB-EGF抗原結合蛋白是具有抗體樣結合活性(即結 合 HB-EGF)的支架蛋白(scaffold protein)。在本發(fā)明的背景中，術語“支架蛋白”，如本文中所使用的，意指其折疊對修飾例如 多個插入、缺失或置換具有高度耐受性的多肽構架。該固有的構象穩(wěn)定性使得能夠在蛋白 質的確定區(qū)域內進行定向隨機化和劇烈變化。因此，其獲得了某些新的特性，然而，其總體 結構完整性和原始物理化學行為仍然得到保持。該從新采用的特性主要但非唯一地包括對 預先確定的靶分子的結合特異性。目前，正在使用許多支架蛋白，其模擬常規(guī)抗體的結合原理至不同程度(Hey等 人，2005，Trends in Biotechnol. 23 :514_22)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的支架蛋白的實例可細 分為不同類型?？贵w相關支架，其被定義為抗體的衍生物，所述抗體的衍生物在大小上天然更小并且在結構上更簡單或已以這樣的方式進行了工程改造。該類型包括例如所謂的 納米抗體(Nanobody)(綜述于 Hey 等人，Trends in Biotechnol. 2005 ；23 (10) ；514-522)、 結構域抗體(Holt等人，2003，Trends inBiotechnol. 21 :484_489)或鯊魚抗原反應性 蛋白(shark antigenreactive proteins)(Holt 等人.Trends in Biotechnol. 2003 ； 21 ；484-489)。第二種類型的支架蛋白是耐受單個環(huán)肽的插入或隨機化的剛性蛋白折疊 如 Kunitz-型結構域(Dennis 等人，1995 J. Biol. Cell. 270 :25411_25417)、人轉鐵蛋白 (Ali 等人，1999 J. Biol. Cell. 274 24066-24074)或半胱氨酸結(cystein-knot)結構基 序(Christmann等人，1999，Protein Eng. 12 797-806)。共有與抗體類似的在剛性保守構 架上具有多個高變環(huán)的原理的代表性蛋白是人CTLA-4 (Hufton等人，2000FEBS Lett. 475 225-231)、人纖連蛋白 III 型結構域(Koide 等人，1998 J. Mol. Biol. 284 :1141_1151)、C 型凝集素樣結構域或脂質運載蛋白(Skerra，2001，J. Biotechnol. 74 :257-275)。具有通 過部分或完全位于蛋白質的剛性二級結構內的氨基酸殘基產生的結合特異性的支架是例 如錨蛋白重復蛋白(Binz，2003，J. Mol. Biol. 332 :489_503)、蛋白A的Z結構域(Nord等 人，1995，Protein Eng. 8 601-608)或 Y-晶體蛋白(crystalline) (Fiedler 和 Rudolph， 2001，國際專利申請WO 01/04144)。支架蛋白和肽以及其應用綜述于Hey等人，2005， Trends in Biotechnol. 23 514-522 ；Binz ^A, 2005, Nature Biotechnol. 23 1257-1268 和 Holliger 等人，2005，Nature Biotechnol. 23 :11261136。
支架蛋白工程改造可被當作是將親和功能移植至或整合入多肽構架(其折疊對 修飾具有高度耐受性)的結構構架。親和功能根據(jù)本發(fā)明意指蛋白質結合親合力。支架在 結構上可與賦予結合特異性的氨基酸序列分離。通常，可通過合理的或最通常地，組合蛋 白質工程技術獲得適合用于開發(fā)此類人工親和試劑的蛋白質，例如，使用本領域內已知的 技術(Skerra, 2000，J. Mol. Recog. Jul—Aug ；13 (4) 167—87 ；Binz 禾口 Pliickthun，2005，Aug ； 16(4) 459-69)針對抗原例如HB-EGF(純化的蛋白質或在細胞表面上展示的蛋白質)在體 外展示的人工支架文庫中淘選結合劑。此外，具有抗體樣結合活性的支架蛋白可來源于包 含支架結構域的受體多肽，例如前述蛋白之一，所述受體多肽可移植供體多肽的結合結構 域以將供體多肽的結合特異性賦予含有支架結構域的受體多肽。所述插入的結合結構域可 以是例如抗體特別地HB-EGF抗體的一個或多個互補決定區(qū)(⑶R)。優(yōu)選⑶R是⑶R3。可 通過本領域技術人員已知的各種方法(包括例如，多肽合成、編碼氨基酸的核酸合成)以及 通過本領域技術人員熟知的各種形式的重組方法進行插入。H. HB-EGF抗原結合蛋白綴合物在另一個實施方案中，將本文中提供的HB-EGF抗原結合蛋白例如抗體偶聯(lián)至標 記基團。這樣的標記的抗原結合蛋白特別適合用于診斷應用。如本文中所使用的，術語 “標記基團”是指可檢測的標志物，例如放射性標記的氨基酸或可通過經(jīng)標記的抗生物素蛋 白(例如，與可通過光學法或比色法檢測的熒光標志物或酶促活性結合的鏈霉抗生物素蛋 白)檢測的生物素基部分。用于標記多肽和糖蛋白例如抗體的各種方法在本領域內是已知 的并且可被使用。合適的標記基團的實例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素 (例如，禮噸？^？義^？^“化’嚴仏焚光基團(例如，F(xiàn)ITC、羅丹明、稀土元素磷光 體)、酶基團(例如，辣根過氧化物酶、β _半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學發(fā)光基 團、生物素基團或由第二報告分子識別的預先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二抗的結合位點、金屬結合結構域、表位標簽)。在某些方面，可能期望通過各種長度的間隔 臂連接標記基團以減小潛在的空間位阻。備選地，可將本文中提供的HB-EGF抗原結合蛋白，例如抗體偶聯(lián)至效應子基團。 這樣的效應子修飾的抗原結合蛋白特別適合于治療性應用。如本文中使用的，術語“效應 子基團”是指細胞毒性基團例如放射性同位素或放射性核素、毒素、治療性基團或本領域內 已知的其他效應子基團。合適的效應子基團的實例是放射性同位素或放射性核素(例如， 3H、14C、15N、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、卡奇霉素、多拉司他汀類似物例如auristatin和化 學治療劑例如格爾德霉素和美登納新衍生物，包括DMl。在某些方面，可期望通過各種長度 的間隔臂連接效應子基團以減小潛在的空間位阻。同樣如本文中所描述的，本文中提供的許多高度有用的HB-EGF抗原結合蛋白，例 如抗體制劑，識別HB-EGF的EGF樣結構域內的表位，其包括蛋白質的殘基106-149，例如具 有下列序列PCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGY HGERCHGLSLP(SEQ ID NO: 1076)。在 一些實施方案中，被本文中提供的抗原結合蛋白識別的表皮生長因子表位包括氨基酸 序列 IHGE。因此，提供了結合和識別HB-EGF的含有IHGE的表位和/或EGF樣結構域(例如SEQ ID NO 1076)的抗體制劑?？笻B-EGF抗原結合蛋白可用于檢測患者樣品中的HB-EGF，從而可用作本文中描 述的疾病狀態(tài)的診斷劑。此外，基于它們顯著抑制HB-EGF和/或EGF受體活性的能力(如 在下文的實施例中所顯示的)，HB-EGF抗原結合蛋白在治療由HB-EGF表達和/或HB-EGF 活性引起的癥狀和病況中具有治療效果。在特定的實施方案中，本文中的抗原結合蛋白和 方法涉及由HB-EGF相關疾病、HER4-相關疾病或EGF受體相關疾病狀態(tài)例如癌癥病況引起 的癥狀的治療。另外的實施方案包括使用本文中描述的抗原結合蛋白和方法治療不期望的 血管生成、腫瘤疾病例如黑素瘤、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質瘤、肝細胞(肝)癌、甲狀腺腫瘤、 胃(胃部)癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、膠質母細胞瘤、子宮內膜癌、腎癌、 結腸癌和胰腺癌。I.編碼HB-EGF抗原結合蛋白的核酸還提供了編碼本文中描述的抗原結合蛋白或其部分的核酸，包括編碼抗體的一條 或兩條鏈或其片段、衍生物、突變蛋白或變體的核酸、編碼重鏈可變區(qū)或只編碼CDR的多核 苷酸、足以用作雜交探針的多核苷酸、用于鑒定、分析、突變或擴增編碼多肽的多核苷酸的 PCR引物或測序引物、用于抑制多核苷酸的表達的反義核酸和前述的互補序列。核酸可以 是任何長度。它們的長度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、 175、200、250、300、350、400、450、500、750、1，000,1, 500,3, 000,5, 000 或更多個核苷酸，和 /或它們可包含一個或多個額外的序列，例如，調控序列和/或可以作為更大的核酸例如 載體的一部分。核酸可以是單鏈的或雙鏈的并且可包含RNA和/或DNA核苷酸，以及其人 工變體(例如，肽核酸)。圖15A-15V描述了抗原結合蛋白的不同輕鏈的核苷酸序列。圖 16A-16C描述了抗原結合蛋白的不同重鏈的核苷酸序列。圖13A-13M描述了抗原結合蛋白 的不同輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。圖14A-14L描述了抗原結合蛋白的不同重鏈可變區(qū)的核 苷酸序列。圖18A-18F描述了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同CDR區(qū)的核苷酸序列。圖 19A-19G描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同CDR區(qū)的核苷酸序列。圖20A-20K描述 了抗原結合蛋白的輕鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的核苷酸序列。圖21A-21K描述了抗原結合蛋白的重鏈可變區(qū)的不同F(xiàn)R區(qū)的核苷酸序列。圖17A描述了抗原結合蛋白的輕鏈恒定區(qū)的 核苷酸序列。最后，圖17B描述了抗原結合蛋白的重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列?？蓮囊延肏B-EGF或其免疫原性片段免疫的小鼠的B細胞分離編碼某些抗原結合 蛋白或其部分(例如，全長抗體、重鏈或輕鏈可變結構域或⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、 ⑶RL2或⑶RL3)的核酸。可通過常規(guī)方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)分離核酸。噬菌體展 示是可籍以制備其他抗原結合蛋白和抗體的衍生物的已知技術的另一個實例。在一個方法 中，在任何合適的重組表達系統(tǒng)中表達作為目的抗原結合蛋白的組件的多肽，并允許所表 達的多肽組裝以形成抗原結合蛋白分子?！獋€方面還提供了在特定的雜交條件下與其他核酸(例如，包含圖13至21中 所述的核苷酸序列的核酸)雜交的核酸。用于雜交核酸的方法在本領域內是熟知的。參 見，例如，Current Protocols in Mo lecularBiology, John Wiley&Sons, N. Y. (1989), 6. 3. 1-6. 3. 6。如本文中所定義的，中度嚴格雜交條件使用含有5x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、 0.5% SDSU.OmM EDTA(pH 8.0)的預清洗溶液，大約50%甲酰胺、6xSSC的雜交緩沖液和 550C的雜交溫度(或其他相似雜交溶液，例如含有大約50%甲酰胺的溶液和42°C的雜交溫 度)，和60°C下于0. 5x SSC、0. SDS中的清洗條件。嚴格雜交條件在45°C下于6x SSC中 雜交，然后在68°C下于0. Ix SSC，0.2% SDS中進行一次或多次清洗。此外，本領域技術人 員可操控雜交和/或清洗條件以提高或降低雜交的嚴格性，以使包含彼此至少65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一的核苷酸序列的核酸通常保持彼此雜交。影響雜交條件的選擇的基本參數(shù)和用于設計合適的條件的指導方針示于例如 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis(2001，MolecularCloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N· Y·，同上禾口 Current Protocols inMolecular Biology, 1995，Ausubel 等人，eds.，John Wiley&Sons, Inc.，sections 2. 10 和6. 3-6. 4)中，并且它們可由本領域技術人員基于例如核酸的長度和/或堿基組成容易地 確定?？赏ㄟ^突變將變化導入核酸，從而導致其編碼的多肽(例如，抗體或抗體衍生物) 的氨基酸序列發(fā)生變化?？墒褂帽绢I域內已知的任何技術導入突變。在一個實施方案中， 使用例如定點誘變方案改變一個或多個特定的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，使用例 如隨機誘變方案改變一個或多個隨機選擇的殘基。無論如何進行突變，都可表達突變的多 肽，并且可就期望的性質篩選突變的多肽?？蓪⑼蛔儗牒怂岫伙@著改變其編碼的多肽的生物學活性。例如，可產生導致 非必需氨基酸殘基上的氨基酸置換的核苷酸置換。備選地，可向核酸中導入一個或多個選 擇性改變核酸編碼的多肽的生物學活性的突變。例如，突變可定量或定性改變生物學活性。 定量改變的實例包括增加、減少或消除活性。定性改變的實例包括改變抗體的抗原特異性。另一個方面提供了適合用作檢測核酸序列的引物或雜交探針的核酸分子。核酸分 子可只包含編碼全長多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探針或引物的片段或編碼多 肽的活性部分(例如，HB-EGF結合部分)的片段?；诤怂嵝蛄械奶结樋捎糜跈z測核酸或相似的核酸，例如編碼多肽的轉錄物。探 針可包含標記基團，例如放射性核素、熒光化合物、酶或酶輔因子(co-factor)。此類探針可 用于鑒定表達多肽的細胞。
另一個方面提供了包含編碼多肽或其部分(例如，包含一個或多個⑶R或一個或 多個可變區(qū)結構域的片段)的核酸的載體。載體的實例包括但不限于質粒、病毒載體、非附 加型(non-印isomal)哺乳動物載體和表達載體，例如重組表達載體。重組表達載體可以以 適合于核酸在宿主細胞中表達的形式包含核酸。重組表達載體包含一個或多個與待表達的 核酸序列有效連接的調控序列(其基于用于表達的宿主細胞進行選擇)。調控序列包括在 多種類型的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成型表達的調控序列(例如，SV40早期基因增 強子、Rous肉瘤病毒啟動子和巨細胞病毒啟動子)、只在某些宿主細胞中指導核苷酸序列 的表達的調控序列(例如，組織特異性調控序列，參見，Voss等人，1986 Trends Biochem. Sci. 11 :287，Maniatis等人，1987，Science 236 1237，以其全文 通過引用合并入本文)，以 及響應特定處理或條件而指導核苷酸序列的誘導型表達的調控序列(例如，哺乳動物細胞 中的金屬硫蛋白啟動子以及原核和真核系統(tǒng)中的tet-響應和/或鏈霉素響應啟動子(參 見，同前)。本領域技術人員將理解，表達載體的設計可取決于這樣的因素如待轉化的宿主 細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等。可將表達載體導入宿主細胞，從而產生蛋白質或 肽，包括由本文中所述的核酸編碼的融合蛋白或肽。另一個方面提供了已向其中導入了重組表達載體的宿主細胞。宿主細胞可以是任 何原核細胞(例如，大腸桿菌)或真核細胞(例如，酵母、昆蟲或哺乳動物細胞(例如，CHO 細胞))。可通過常規(guī)轉化或轉染技術將載體DNA導入原核或真核細胞。對于哺乳動物的 穩(wěn)定轉染，已知，取決于所使用的表達載體和轉染技術，只有小部分細胞可將外源DNA整合 入它們的基因組。為了鑒定和選擇此類整合體，通常將編碼選擇標記(例如，賦予對抗生素 的抗性)的基因連同目的基因一起導入宿主細胞。優(yōu)選的選擇標記包括賦予對藥物例如 G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的選擇標記。特別地，可通過藥物選擇鑒定用導入的核酸穩(wěn) 定轉染的細胞(例如，已整合了選擇標記基因的細胞將存活，而其他細胞將死亡)。J. HB-EGF抗原結合蛋白用于診斷和治療目的的用途1.適應癥(Indication)本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可用于檢測或治療許多疾病和病癥，包括牽 涉過度細胞增殖、不期望的細胞遷移和/或異常的血管生成的疾病。例如，此類HB-EGF抗原 結合蛋白可抑制癌細胞中HB-EGF誘導的EGFR和/或HER4的酪氨酸磷酸化(圖22-29)。這 樣的抑制可中斷驅動細胞增殖和遷移以及血管生成的信號轉導事件的級聯(lián)。此外，HB-EGF 抗原結合蛋白可干擾EGFR的反式激活。此外，此類抗原結合蛋白抑制基礎HUVEC細胞增殖 (圖32B)、內皮細胞管形成(圖33)和體內基質膠塞測定中HB-EGF誘導的血管形成(圖 36)。這些結果表明本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白在體外和體內抑制血管生成。此外， 此類抗原結合蛋白還抑制不依賴于錨定的細胞生長(圖34和圖35)以及小鼠中異種移植 物腫瘤的生長(圖37和圖38)。HB-EGF抗原結合蛋白還顯著抑制MCF-7和MDA-MB231癌 細胞的遷移(參見，圖27和27)。因此，本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白攻擊腫瘤和其 他癌性病況的發(fā)展中的幾個步驟，包括控制細胞增殖的信號轉導事件、血管生成和與轉移 癌的擴散和發(fā)展相關的細胞遷移。這樣的多方面干預對于控制和抑制癌癥籍以發(fā)展的過程 大有益處。此外，可治療處于任何進展期的癌癥(例如，早期癌癥、轉移癌和復發(fā)性癌癥)。除了 HB-EGF抗原結合蛋白在檢測和治療處于不同進展期的癌癥中的用途外，此 類抗原結合蛋白還可用于檢測許多不同類型的癌癥。例如，HB-EGF以非常低的水平在正常乳腺和胰腺組織中表達。然而，HB-EGF在大約55%的胰腺癌細胞和大約70%的乳腺癌細 胞中以高水平表達。此外，如實施例中所描述的，在不同的癌細胞系中檢測到HB-EGF表達， 這表明本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可用于檢測多種癌癥類型。例如，可通過所請求保護的抗原結合蛋白檢測或治療的癌癥包括實體哺乳動物腫 瘤以及血液惡性腫瘤。實體哺乳動物腫瘤包括兒童中的癌癥，例如生殖細胞腫瘤、軟組織肉 瘤、原發(fā)性腦腫瘤、神經(jīng)母細胞瘤、腎母細胞瘤和癌、特別是鱗癌(squamous carcinoma)和 上皮癌。實體哺乳動物腫瘤還可包括成人癌癥，例如未知來源的腫瘤，成人中的原發(fā)性腦 癌，腦下垂體、嘴唇、口腔、鼻咽、喉、上頌竇、篩竇、唾液腺、甲狀腺(包括甲狀旁腺和類癌)、 食道、胃、胰腺、小腸、結腸、直腸、肛管、肝臟、膽囊、肝外膽管(extra hepati c bile duct)、 Vater壺腹(ampulla of vater)的腫瘤，類癌，胃-腸-肝系統(tǒng)的內分泌腫瘤，嗜鉻細胞瘤 和副神經(jīng)節(jié)瘤，腎上腺、肺、胸膜、縱隔、胸腺，骨及軟組織的腫瘤，嘴唇、眼險、外耳、臉的其 他未指明的部分、頭皮和頸、軀干、上肢和肩、下肢和臀、陰戶、陰莖、陰囊的皮膚腫瘤，乳腺 腫瘤，陰戶、陰道、子宮頸、子宮體、卵巢、輸卵管的婦科腫瘤，妊娠和滋養(yǎng)層腫瘤，陰莖、前列 腺、睪丸、腎、腎盂和輸尿管、膀胱、尿道，眼瞼、結膜、葡萄膜、視網(wǎng)膜、眼眶和淚腺的眼科腫 瘤。血液惡性腫瘤包括兒童的腫瘤，例如，白血病和淋巴瘤、急性和慢性白血病(AML、ANLL、 ALL,CML,MDS)、何杰金氏病、B細胞、T細胞、大細胞、濾泡、淋巴細胞和皮膚來源的惰性/低 級、侵襲性/高級淋巴瘤、漿細胞腫瘤和與AIDS相關的癌癥。此外，本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白還可用于檢測或治療癌性病況或腫瘤 性病癥，其包括例如腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、血管纖維瘤、非典型增殖性粘液性 腫瘤(mucinous neoplasia)、勃勒納腫瘤(Brenner tumor)、類癌、海綿狀血管瘤、富細胞型 平滑肌瘤、絨毛膜血管瘤、先天性中胚層腎瘤、粘液性囊腺瘤、漿液性囊腺瘤、皮樣瘤、硬纖 維瘤、纖維腺瘤、纖維瘤、纖維卵泡膜細胞瘤、濾泡腺瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、巨細胞瘤、顆粒細胞瘤、 粒層細胞瘤、血管瘤、導管內乳頭狀瘤、胰島細胞瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、黃體瘤、腦膜瘤、胎 塊(mole)、髓脂瘤、粘液瘤、神經(jīng)纖維瘤、痣、骨軟骨瘤、嗜鉻細胞瘤、息肉、神經(jīng)鞘瘤、漿液性 囊腺瘤、卵巢甲狀腺腫、滑膜軟骨瘤病(synovial chrondromatosis)、良性胸腺瘤?？捎帽疚闹忻枋龅腍B-EGF蛋白進行檢測或治療的癌癥類型的另外的實例可見于 例如美國癌癥學會(www. cancer, org)或 Wilson 等人(1991)Harrison' s Principles of Internal Medicine,第 12 版，McGraw-Hill, Inc0因此，本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可用于治療和/或預防癌癥、癌性病況、 腫瘤生長、癌細胞的轉移、血管生成過程和/或腫瘤性病癥。因此，此類抗原結合蛋白提供 了治療或預防受試者中的癌癥的方法，該方法包括對受試者施用有效量的組合物，所述組 合物包含本文中描述的人和/或單克隆HB-EGF抗原結合蛋白制劑中的一種或其組合。高比例的實體瘤疾病通常表征為由生長因子(S卩，VEGF)和其他因子(S卩，HB-EGF) 介導的腫瘤血管生成、腫瘤組織中(異常)血管的過度生長。通過HB-EGF特異性抗原結合 蛋白靶向HB-EGF可阻止新血管的形成，從而限制現(xiàn)有腫瘤的擴展和新腫瘤的發(fā)生(即，轉 移)。HB-EGF除了作為促有絲分裂和促侵入(pro-invasive)配體外，幾個研究已證實 其可作為癌癥中血管生成過程的重要調節(jié)劑。如實施例中所舉例說明的，顯示了 HB-EGF在 體內血管生成的調控中的功能。因此，本文中描述的抗原結合蛋白可用于治療與血管生成相關或由其引起的疾病，例如癌性或非癌性疾病。例如本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可干擾平滑肌細胞(SMC)與內皮細胞之 間的通訊(血管生成例如腫瘤血管生成中血管的發(fā)育和功能性中的基本過程)。 此外，此類抗原結合蛋白可以至少部分地抑制HB-EGF誘導的VEGF的表達和從SMC 的釋放(所述VEGF隨后用作強效的內皮絲裂原)。類似地，VEGF增加內皮細胞中的HB-EGF 產量，這從而構成了由這兩個重要配體組成的促血管生成反饋回路(該回路可通過施用本 文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白來中斷)。最近，除了 VEGF外，還鑒定了另外的至關重要 的促血管生成組分例如促血管生成素(angiopoetin) 1和2(Ang_l&2)和它們的受體TIE-2 以及有效的平滑肌細胞GPCR刺激物血管緊張素II (ATII)。有趣地，HB-EGF是內皮細胞中 ATII誘導的EGFR反式激活以及VEGF和Ang_2的下游上調的至關重要的介體。在體內，ATII 以HB-EGF依賴性方式誘導血管生成并且增強VEGF的血管生成活性。這些發(fā)現(xiàn)支持，平行 于VEGF，HB-EGF能夠通過Ang2激活另外的血管生成途徑。因此，可通過施用有效量的本文 中描述的HB-EGF抗原結合蛋白來治療哺乳動物中的異常血管生成或癌癥。除了其作為癌癥中血管生成過程的重要調節(jié)劑的作用外，具有激活的血管生成途 徑和需要側枝血流的各種非癌適應癥是HB-EGF抗原結合蛋白治療的推定疾病。慢性炎性疾病(例如，腎炎、C0PD、炎性腸病)，包括免疫系統(tǒng)介導的“炎性反 應”(例如，移植物抗宿主病、移植排斥、再狹窄)、代謝疾病(例如，糖尿病)或慢性缺氧性 病況，通常以過度血管形成和/或新血管形成(例如，慢性潰瘍)為特征。所述HB-EGF抗 原結合蛋白可以至少部分地抑制血管生成的必需過程一由HB-EGF(由炎性細胞產生或被 缺氧上調)誘導的內皮細胞對血管平滑肌細胞的招募一從而代表用于過度/病理性血管 形成的介入治療的吸引人的途徑。在肥胖受試者中，來源于積累的脂肪的增加的水平的HB-EGF(其促成肥胖癥中血 管疾病的更高發(fā)病率)可用本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白來中和。使用HB-EGF抗原 結合蛋白的治療性干預從而可在中斷脂肪血管軸(adipovascular axis)中直接用作抗脂 肪細胞因子。在成纖維細胞中，HB-EGF通過激活表皮生長因子受體而顯著下調彈性蛋白mRNA。 該效應在肺纖維化的發(fā)展中提供了干預的途徑。此外，HB-EGF是參與炎性疾病的發(fā)病機制的角質形成細胞的絲裂原。此外，HB-EGF 的表達和與EGFR的共定位可在銀屑病的早期發(fā)病機制中起重要作用，這在皮膚炎性疾病 的治療中和特別地在銀屑病的早期治療中(使用請求保護的抗原結合蛋白)打開了潛在的 治療窗口。使用所述抗原結合蛋白靶向HB-EGF還可導致用于患增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變 (PVR)的患者的治療選擇，因為PVR的發(fā)展伴隨PVR視網(wǎng)膜中HB-EGF的顯著上調。此外，纖 維增生組織中的HB-EGF表達和其對神經(jīng)膠質細胞增殖、趨化性和VEGF分泌的刺激作用表 明HB-EGF可能是PVR期間介導神經(jīng)膠質細胞應答的因子。這些原理還可用于其他血管生 成依賴性眼病例如年齡相關和非年齡相關黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、rubeotic青光 目艮、間質性角膜炎、早產兒視網(wǎng)膜病變和角膜移植失敗(corneal graft failure)。由于GPCR的血管收縮和生長促進能力，已將GPCR例如腎上腺受體和血管緊張素 受體與高血壓的發(fā)病機制聯(lián)系在一起。因為HB-EGF是此類途徑的至關重要的介體，因此中和性抗原結合蛋白適用于高血壓病癥例如心肌肥厚和充血性心力衰竭、腎衰竭或中風中的 靶向干預。 在具有內膜增厚的冠狀動脈的粥樣硬化斑塊中檢測到HB-EGF(平滑肌細胞(SMC) 的強效絲裂原和化學引誘物)，其由SMC和巨噬細胞產生。進一步顯示殘粒脂蛋白(Remnant lipoprotein)(其為動脈粥樣硬化的已知致病因子)通過HB-EGF介導的EGFR反式激活誘 導SMC增殖。因此，本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白代表通過阻斷至關重要的平滑肌細 胞功能靶向動脈粥樣硬化的具有選擇性且有效的試劑。此外，以平滑肌細胞的增殖為特征 的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention)后的再狹窄可能也通 過HB-EGF功能的特異性中和而被阻止。因此，本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可用于治療多種疾病，包括非惡性增殖 性疾病例如異常血管生成、平滑肌瘤(子宮纖維化)、良性平滑肌細胞腫瘤、腎小球硬化(系 膜細胞的過度增殖)、平滑肌細胞增生、動脈粥樣硬化(血管平滑肌細胞的過度增殖)、紅 變、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性失明、黃斑變性、風濕性關節(jié)炎、心 肌肥厚、銀屑病等。在另外的方面，此類HB-EGF抗原結合蛋白可用于治療與擾亂的例如，病理性增強 的生長因子受體激活相關的或與其相伴的病癥。在另一個方面，該增強的生長因子受體激活可與G蛋白和/或G蛋白偶聯(lián)受體的 活性的病理性增加相關或由其引起。應當指出，與擾亂的例如病理性增強的生長因子受體 激活相關或與其相伴的以及可能與G蛋白和/或G蛋白偶聯(lián)受體的活性的病理性增加相關 或由其引起的病癥可以與特征在于增強的生長因子受體激活活性的其他病癥區(qū)分開，因為 發(fā)生了經(jīng)由G蛋白偶聯(lián)受體的生長因子受體的反式激活。2.診斷方法本文中描述的HB-EGF抗原結合分子可用于檢測測試樣品中的癌細胞的方法中， 其包括將測試樣品與抗原結合分子接觸和檢測抗體是否結合樣品中的表達pr oHB-EGF或 HB-EGF分子的細胞。結合發(fā)生的程度可通過使用對照樣品來估量。測試和對照樣品可以例 如是血液、血清、腹水、胸腔積液、腦脊髓液、組織、細胞、尿液、淋巴、唾液、乳汁或其他樣品。 這樣的對照樣品可以是非癌性的體液或組織或細胞類型的樣品。在一些實施方案中，對照 樣品是獲自與測試樣品相同的受試者的非癌性樣品?！笆茉囌摺被颉盎颊摺笔侵感枰委熁?檢測病況、病癥或疾病的哺乳動物，優(yōu)選人。抗體與測試樣品的組分的結合可通過檢測結合至或可選擇性結合至本文中描述 的抗原結合蛋白的報告分子、顯象劑或標記來檢測。此類HB-EGF抗原結合蛋白可具有一個 或多個報告分子、標記或顯象劑。報告分子定義為可使用測定法檢測的任何部分。已被綴 合至抗體的報告分子的非限定性實例包括酶、放射性標記、半抗原、熒光標記、磷光分子、化 學發(fā)光分子、生色團、發(fā)光分子、光親和分子、有色顆?；蚺潴w例如生物素。報告分子可提供 可檢測的信號。例如，可檢測的信號可以是熒光、磷光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、電化學、顏色 變化或酶的信號。本文中提供的抗HB-EGF抗體可用作捕獲抗體，其用于生長因子的基于 ELISA的檢測或組織樣品的免疫組織化學分析，如圖39中所示。在一些實施方案中，將報告分子共價連接至本文中描述的抗原結合蛋白。在其他 實施方案中，可將報告分子選擇性地結合至本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白。報告分子與所述抗原結合蛋白的此類選擇性結合可通過具有共價連接的標記的二抗來進行，其中二 抗選擇性結合本文中描述的HB-EGB抗原結合蛋白。3.治療方法藥物制劑、施用的途徑癌癥的治療或治療癌癥意欲包括至少一種通常與疾病相關的癥狀的緩和或減輕。 治療還包括一種以上的相關癥狀的緩和或減輕。治療可治愈癌癥，例如，其可基本上消除癌 細胞和/或停止癌性腫瘤的生長。備選地，治療可減緩癌癥的進展。 可使用本領域技術人員可獲得的方法來評估抗多種癌癥或癌細胞的抗癌活性。抗 癌活性，例如，可通過測定本文中描述的抗原結合蛋白的制劑的LDltltl或ED5tl來測定，所述抗 原結合蛋白的制劑阻止癌癥的生長。在一個實施方案中，抗癌活性是當使用標準劑量應答 方法測量時殺死50%或100%的癌細胞的抗體的量。本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白可單獨施用，或與抗體、化學治療藥物或放射 療法聯(lián)合施用。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一療法施用或與另一種藥物組合物 (優(yōu)選包含另一種抗腫瘤劑，特別是順鉬或阿瓦斯丁)聯(lián)合施用。例如，可將所述HB-EGF抗 原結合蛋白與抗腫瘤抗體(例如，嵌合、人源化或人抗腫瘤抗體)，與特異性結合VEGF以進 一步抑制腫瘤血管生成的抗體或與特異性結合受體酪氨酸激酶例如HER2、HER4或EGFR并 從而進一步抑制腫瘤細胞增殖的抗體共施用。在圖38中，對于測試的兩個治療性抗HB-EGF 抗體，可顯示抗EGFR抗體和抗HB-EGF抗體的協(xié)同作用。此外，可將本文中描述的HB-EGF 抗原結合蛋白與其他抗腫瘤劑共施用?？膳c本文中提供的抗體共施用的抗腫瘤劑的特定 實例包括，例如，吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、貝伐單抗(bevacisumab)、西妥 昔單抗、伊馬替尼、曲妥珠單抗、阿侖珠單抗、利妥昔單抗、厄洛替尼、硼替佐米等?？梢种瓢?癥或腫瘤細胞增殖的任何其他抗癌劑或藥物也可用于本文描述和請求保護的組合物中。例 如，請求保護的組合物可包括化學治療劑例如卡培他濱、柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素D、 多柔比星、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氯 乙亞硝脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、普卡霉素、潑尼 松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、 苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿 糖胞苷(CA)、5_氮雜胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-hydroxyperoxycyclophosphor-amide 、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5_氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、 長春堿、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、順鉬、阿瓦斯丁和己烯雌酚(DES)。通常參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, H 15 片反，1987， pp. 1206-1228, Berkow ^A, eds. , Rahway, N. J0當與所述HB-EGF抗原結合蛋白一起使用時，此類化學治療劑可分別地 (例如，5-FU和抗體)、相繼地(例如，5-FU和抗體，一段時間后，MTX和抗體)或與一種或 多種其他此類化學治療劑聯(lián)合(例如，5-FU、MTX和抗體，或5-FU、放射治療和抗體)使用。還提供了評估使用具有本文中公開的氨基酸序列的抗體治療癌癥的治療有效劑 量的方法，該方法包括測定HB-EGF抗原結合蛋白制劑在體內或體外的LDiqq或ED5Q。這樣的 方法允許計算抑制癌細胞生長或轉移大約10 %至100 %，或大約20 %至100 %，或大約25 % 至100 %，或大約30 %至100 %，或大約40 %至100 %，或大約50 %至100 %的每體積所需的 抗原結合蛋白的近似量。在一些實施方案中，觀察到低于100%的癌細胞生長或轉移的抑 制。例如，癌細胞生長和/或轉移被抑制大約90%、80%、70%、60%或50%?？梢岳缤ㄟ^對本領域可獲得的SCID或nu/nu小鼠(其中已導入了腫瘤細胞)施用抗原結合蛋白制 劑和/或通過標準方法，使用培養(yǎng)的癌細胞(參見，圖38B)來測定百分比抑制。在實施例 中描述了幾種方法。還包括的是本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白的無菌藥物制劑，其可用作用于 疾病包括例如癌癥和/或異常血管生成的療法。這樣的制劑可抑制HB-EGF與其受體例如 EGFR或與HER4的結合，從而有效地治療其中例如血清、細胞或組織HB-EGF異常升高或其中 其受體例如，EGFR或HER4，異?；钴S的病理狀況。如本文中所舉例說明的，HB-EGF抗原結 合蛋白具有足夠的親和力來有效地中和HB-EGF以及調節(jié)與HB-EGF受體相關的信號轉導事 件。本文中描述的HB-EGF抗原結合蛋白優(yōu)選是人源化抗原結合蛋白。此類人源化抗 原結合蛋白的施用減小了負面作用的可能性。此外，此類抗原結合蛋白例如在體內是穩(wěn)定 的，因為它們被識別為正常人產物，從而使免 疫系統(tǒng)應答的風險降至最低。此外，此類抗原 結合蛋白不易被蛋白水解破壞，從而提高了它們的循環(huán)半衰期。因此，本文中描述的HB-EGF 制劑具有優(yōu)良的體內半衰期，從而使得人中的施用相對不頻繁。這樣的延長的作用持續(xù)時 間可允許進行較不頻繁的和更方便的給藥方案(通過可選的胃腸外途徑例如皮下或肌內 注射)。可以例如通過在抗體的冷凍干燥和重構之前或之后通過無菌濾膜過濾來產生無 菌制劑。通常將本文中描述的抗原結合蛋白以凍干的形式貯存或貯存在溶液中。通常將治 療性抗體組合物置于具有無菌存取口的容器(例如，靜脈內注射溶液袋或具有允許抽取制 劑的適配器(adapter)例如可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)內?？砂凑找阎姆椒ㄊ┯肏B-EGF抗原結合蛋白，例如，通過靜脈內、皮下、真皮內、 腹膜內、大腦內、肌內、眼內、動脈內、鞘內、膀胱內、海綿體內途徑進行的注射或輸注、吸入、 損傷內途徑或通過持續(xù)釋放系統(tǒng)(如下文中指出的)。在一些實施方案中，通過輸注或通過 團注連續(xù)施用本文中描述的抗原結合蛋白?？蓪⒈疚闹忻枋龅腍B-EGF抗原結合蛋白與可藥用載體一起制備于混合物中。可 以優(yōu)選以液體或粉末氣霧劑(冷凍干燥的)的形式靜脈內或經(jīng)鼻或肺施用該治療性組合 物。還可如所期望地胃腸外或皮下施用組合物。當全身性施用時，治療性組合物應當是無 菌的、無熱源的并且在胃腸外可接受的溶液(對此要考慮的是生理上可接受的PH值、等滲 性和穩(wěn)定性)中。這些條件對于本領域技術人員來說是已知的。簡而言之，通過將具有期 望的純度的化合物與生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備用于貯存或施用的 本文中描述的化合物的劑量制劑。這樣的材料在使用的劑量和濃度上對受者是無毒的，并 且其包括緩沖劑例如TRIS HC1、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、和其他有機酸鹽；抗氧化劑例如 抗壞血酸；低分子量(少于大約10個殘基)肽例如聚精氨酸、蛋白質例如血清白蛋白、明膠 或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidinone)；氨基酸例如 甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括纖維素或其衍生物、 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ；糖醇例如甘露醇或山梨醇；抗衡離子例如鈉離子 和/或非離子型表面活性劑例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。可按照 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版， Lippincott Williams&ffilkens Publishers (2003))中所描述的常規(guī)藥學實踐配制用于注射的無菌組合物。例如，可期望將活性化合物溶解或懸浮于媒介物例如水或天然產生的植 物油如芝麻油、花生油或棉籽油或合成的脂肪媒介物如油酸乙酯等?？砂凑湛山邮艿乃帉W 實踐包含緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等。持續(xù)釋放制劑的合適的實例包括含有多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質， 該基質以成形的制品、膜或微膠囊的形式存在。持續(xù)釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠 (例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(如Langer等人，1981，J. Biomed Mater. Res. 15 167-277 和 Langer，1982，Chem. Tech. 12 :98_105 所描述的)，或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美 國專利3，773，919、EP 58，481)、L_谷氨酸與γ乙基_L_谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人， 1983，Biopolymers 22 :547_556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)、可 降解的乳 酸_乙醇酸共聚物例如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林 組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133，988)。雖然聚合物例如乙烯_醋酸乙烯酯和乳酸_乙醇酸使分子能夠釋放100多天，但 某些水凝膠釋放蛋白質較短的時間。當封裝的蛋白質在體內長時間保持時，它們可變性或 聚集(由于在37°C下暴露于潮濕)，從而導致生物學活性的喪失和免疫原性的可能變化。取 決于牽涉的機制，設計用于蛋白質穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是經(jīng)由二硫互 換的分子間S-S鍵形成，則可通過修飾巰基殘基，從酸性溶液冷凍干燥，控制含濕量，使用 合適的添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定化。持續(xù)釋放組合物還包括懸浮于合適的制劑中的能夠在懸浮液中保持結晶的抗原 結合蛋白的晶體制劑。此類制劑，當皮下或腹膜內注射時，可產生持續(xù)釋放效果。其他組 合物還包括脂質體捕獲的抗體。通過本身已知的方法制備含有此類抗體的脂質體美國專 利 DE3, 218，121 ；Epstein 等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 :3688_3692 ；Hwang 等 人，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030-4034 ；EP 52，322 ；EP 36，676 ；EP 88，046 ；EP 143，949 ；142，641 ；日本專利申請 83-118008 ；美國專利 4，485，045 和 4，544，545 ；以及 EP 102，324。用于給定的患者的抗原結合蛋白制劑的劑量可由主治醫(yī)師通過考慮已知修飾藥 物的作用的各種因素(包括疾病的嚴重度和類型、體重、性別、飲食、施用的時間和途徑、其 他用藥和其他相關臨床因素)來確定。治療有效劑量可通過體外或體內方法來確定。待治療性使用的本文中描述的抗原結合蛋白的有效量將取決于例如治療目的、施 用途徑和患者的狀況。因此，優(yōu)選，治療學家滴定劑量和根據(jù)需要改變施用途徑以獲得最佳 治療效果。典型的日劑量可在大約0.001mg/kg至多達100mg/kg或更大的范圍內，這取決 于上述因素。通常，臨床醫(yī)師將施用治療性抗原結合蛋白直至達到獲得期望的效果的劑量。 該治療的進程可通過本文中描述的常規(guī)測定容易地監(jiān)控。應理解，根據(jù)本文中的組合物和方法的治療實體(therapeuticentity)可與合 適的載體、賦形劑和其他試劑(其摻入制劑中以提供提高的轉移、遞送、耐受性等)一起 施用。此類制劑包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質、含有脂質(陽離子或陰 離子的)的載體(例如Lipofectin )、DNA綴合物、無水吸收糊劑(anhydrousabsorption paste)、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(emulsionscarbowax)(各種分子量的聚乙二 醇)、半固體凝膠和含有碳蠟的半固體混合物。上述混合物的任一種可適用于包括本文中 描述的HB-EGF抗原結合蛋白的治療和療法，只要制劑中的活性成分不被制劑滅活并且制劑對于施用途徑在生理上是相容的和可耐受的。也參見BaldrickP. 〃 Pharmaceutical excipient development :the need forpreclinical guidance, " 2000, Regul. Toxicol. Pharmacol. 32 210~218 ；Wang, " Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals, " 2000, Int. J. Pharm. 203 1-60 ；Charman WN " Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emergingconcepts, " J. Pharm. Sci. 89 :967_978 ;Powell 等人，1998, " Compendium of excipients for parenteral formulations, “ PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52 :238_311 以及其中關于與藥物化學家熟 知的制劑、賦形劑和載體相關的另外的信息的引文。下列實施例，包括進行的實驗和獲得的結果僅僅用于舉例說明目的，而不被解釋 為對本文中的教導的限定。
實施例 K.實施例1 免疫原的產生從pcDNA3-VSV-HB-EGF表達構建體(Prenzel等人，1999，同上)擴增含有EGF樣 結構域(氨基酸1-149)的HB-EGF，然后將其克隆入在羧基末端提供符合讀框的6His標 簽的表達載體(pcDNA 3. lmyc-his, InVitrogen)。在HEK293細胞中表達該具有C末端 myc (HIS) 6標簽的HB-EGF免疫原，在Ni-NTA瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia)和肝素瓊 脂糖凝膠(Sigma)上通過兩步純化法對其進行純化。免疫原的HB-EGF部分具有下列序列(SEQ ID N0:1077)。1MKLLPSVVLK LFLAAVLSAL VTGESLERLR RGLAAGTSNP41DPPTVSTDQL LPLGGGRDRK VRDLQEADLD LLRVTLSSKP81QALATPNKEE HGKRKKKGKG LGKKRDPCLR KYKDFCIHGE121CKYVKELRAP SCICHPGYHG ERCHGLSLPB.實施例2 Aenomouse小鼠的免疫和觀察到的滴度通過連續(xù)地免疫XenoMoUSe 小鼠(XenoMouse品系XMG2(產生人IgG2)禾口 XM3C-1 (產生人 IgG4)，Abgenix, Inc. Fremont, CA)產生抗 HB-EGF 的單克隆抗體。1.免疫經(jīng)足墊進行所有注射以免疫XenoMouse動物。各注射的總體積為50 μ 1/小鼠， 25 μ 1/足墊。對于組群1 (10只XMG2小鼠)和組群2 (10只XM3C-1)，初次免疫為每只小鼠使用與 TITERMAX GOLD (Sigma，Oakville，ON)以 1 1 (ν/ν)混合的 IOyg HB-EGF 蛋白。用與 無熱原的 D-PBS 中的 100 μ g 鋁膠(alumgel) (Sigma, Oakville, ON)以 1 1 (ν/ν)混合的 IOyg HB-EGF蛋白進行隨后的4次增強。第5次增強由與TITERMAX GOLD 以1 1 (ν/ ν)混合的10 μ gHB-EGF蛋白組成。第6和第7次注射由與100 μ g鋁膠以1 1 (ν/ν)混合 的10 μ g HB-EGF蛋白組成。最終的加強用無熱原的DPBS中的10 μ gHB-EGF蛋白(不含佐 劑)來進行。對于該方案，在第0、4、8、14、18、21、25和28天免疫乂6110]\101186小鼠，在第32 天進行融合。在第4次增強后16天，第6次增強后23天通過眼眶后放血(Retro-Orbital Bleed)法進行兩次放血。2.通過滴定選擇用于收獲的動物
通過ELISA測定來自免疫的XenoMouse小鼠的血清中抗HB-EGF抗體的滴度。簡 而言之，在4°C下在抗原包被緩沖液(0. IM碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6NaHC03(MW 84)8. 4g/L)中
HB-EGF 蛋白(2 μ g/ml)過夜包被至 Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板(Corning，Acton，MA)上。第二天，使用Biotek洗板機用清洗緩沖液(lx PBS中的 0. 05% Tween 20)清洗板一次。然后用200 μ 1/孔的封閉緩沖液(lx PBS中的0. 5% BSA, 0. 1% Tween 20,0. 01%的硫柳汞)封閉板，并且在室溫下溫育1小時。在1小時的封閉后， 使用Biotek洗板機用清洗緩沖液清洗板一次。在0. 5% BSA/PBS緩沖液中以1 3的稀釋 度(從1 100的初始稀釋度開始)以一式兩份滴定來自HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小 鼠的或首次用于實驗的XenoMouse小鼠動物的血清。最后的孔留作空白對照。將這些板在 室溫下溫育2小時，然后使用Biotek洗板機用清洗緩沖液清洗板3次。以1 2000的終濃 度將山羊抗人IgG Fc-特異性辣根過氧化物酶(CALTAG，產品編號，H10507)綴合的抗體加 入封閉緩沖液中，并在室溫下溫育1小時。使用Biotek洗板機用清洗緩沖液清洗板3次。在 清洗后，通過加入TMB顯色底物(BioFx BSTP-0100-01)并進行10-20分鐘或直至陰性對照 孔開始顯色來對板進行顯色。然后通過加入終止液(650nM用于TMB (BioFxBSTP-0100-01) 的終止試劑，用IOOml水/瓶進行重構)來終止ELISA。根據(jù)650nm處的光密度來測定各 XenoMouse動物的具體滴度，并將其示于下面的表1中。滴度值是具有2倍于背景的OD讀 數(shù)的血清的最大稀釋度的倒數(shù)。因此，數(shù)值越高，對HB-EGF的體液免疫應答越大。表 1
組 1，fp, XMG2, 10 只小鼠,_ 組 2，fp, XM3C-1, 10 只小鼠，_
4次注射后I 6次注射后4次注射后1 6次注射后
小鼠ID 對HB-EGF的反應性小鼠ID 對HB-EGF的M性_
P4721 3，800__59，000P2664 35_ 2’ 300_
P4722 6,500__68, 000P2666 20__750 _
P4723 2，500__43’ 000P2669 30__850_
P4724 2,400__22，000P26610 75__1,900_
P4725 2,400__71,000P2892 60550_
P4726 45058，000P2894 60__1,400_
P4727 1,600__20, 000P2895 95_ 2, 600_
P4728 2，700__61，000P2896 45__2,500_
P4729 80061,000P3672 50__2，000_
P4721Q 5,700__78, 000P3678 60__1,800
_NC__<100<100NC<100__<100_
PCI <100<100PC35丨 20C.實施例3 雜交瘤的產生和結合劑的初步篩選殺死免疫的小鼠，收集淋巴節(jié)，將來自各組群的淋巴節(jié)混合在一起。通過在DMEM 中研磨以從組織釋放細胞來分離淋巴細胞，將細胞懸浮于DMEM中。計數(shù)細胞，將0. 9mlDMEM(每1億個淋巴細胞)加入至細胞沉淀以輕輕但完全地重懸浮細胞。使用100 μ 1⑶90+ 磁珠(每1億個細胞)，通過在4°C下將細胞與磁珠一起溫育15分鐘來標記細胞。將包含 多至IO8個陽性細胞(或多至2xl09個總細胞)的磁性標記的細胞懸浮液裝載到LS+柱上， 然后用DMEM洗滌柱子。收集總流出物作為CD90-陰性級分(預期大多數(shù)此類細胞為B細 胞)。通過將來自上述方法的清洗的富集的B細胞與購自ATCC，cat. #CRL 1580的沒有 分泌作用的骨髓瘤 P3X63Ag 8. 653 細胞(Kearney 等人，1979，J. Immunol. 123 1548-1550) 以1 1的比例混合來進行融合。以800g輕輕地離心細胞混合物。在完全除去上清液后， 用2-4ml的鏈霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat. #53702 ；0. 5mg/ml于PBS中)處理細胞沉淀 不超過2分鐘。然后，加入3-5ml FBS來終止酶活性，使用電細胞融合液ECFS (0. 3M蔗糖， Sigma, Cat#S7903,0. ImM 醋酸鎂，Sigma, Cat#M2545,0. ImM 醋酸鈣，Sigma, Cat#C4705)將 懸浮液調整至40ml的總體積。在離心后除去上清液，將細胞重懸浮于40ml ECFS中。重復 該清洗步驟，再次將細胞重懸浮于ECFS至2xl06個細胞/ml的濃度。使用融合發(fā)生器(fusion generator) (ECM2001 型，Genetronic，Inc.，San Diego, CA)進行電細胞融合。使用的融合杯(fusionchamber)大小為2. 0ml，使用下列儀器設置 Alignment條件電壓50V，時間50秒；膜破裂于電壓3000V，時間30微秒；融合后保 持時間3秒。在電細胞融合后，在無菌條件下小心地從融合杯中取出細胞懸浮液，將其轉移至 裝有相同體積的雜交瘤培養(yǎng)基(DMEM(JRHBiosciences)、15% FBS(Hyclone)、補充有L-谷 氨酰胺、青霉素/鏈霉素、OPI (草酰乙酸鹽、丙酮酸鹽、牛胰島素)(全都來自Sigma)和 IL-6 (Boehringer Mannheim))的無菌試管內。在37°C下將細胞溫育15至30分鐘，然后 以400g離心5分鐘。輕輕地將細胞重懸浮于小體積的雜交瘤選擇培養(yǎng)基(補充有0. 5x HA (Sigma, cat. #A9666)的雜交瘤培養(yǎng)基)，然后基于5xl06個B細胞(總共)/96孔板和 200 μ L/孔的終涂板，用更多的雜交瘤選擇培養(yǎng)基適當?shù)恼{整體積。將細胞輕輕地混合，然 后轉移入96孔板中，讓其生長。在第7或10天，除去一半的培養(yǎng)基，用雜交瘤選擇培養(yǎng)基 再飼養(yǎng)細胞。在14天的培養(yǎng)后，通過ELISA就HB-EGF特異性單克隆抗體篩選來自組群#1和 組群#2的雜交瘤上清液。在初步篩選中，用50 μ 1/孔的包被緩沖液(0. IM碳酸鹽緩沖 液，ρΗ 9.6，NaHCO3 8. 4g/L)中的 HB-EGF 蛋白(2 μ g/ml)包被 ELISA 板(Fi sher，產品編 號12-565-136)，然后在4°C下溫育過夜。溫育后，用清洗緩沖液(0. 05% Tween 20于PBS 中)清洗板一次。加入200 μ 1/孔的封閉緩沖液(lx PBS中的0. 5% BSA, 0. 1% Tween 20， 0.01%硫柳汞)，然后將板在室溫下溫育1小時。溫育后，用清洗緩沖液清洗板1次。加入 雜交瘤上清液以及陽性和陰性對照的等分(50 μ 1/孔)，然后將板在室溫下溫育2小時。整 個過程中使用的陽性對照是相關HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小鼠的血清，陰性對照是 KLH免疫的相關品系的XenoMouse小鼠的血清。在溫育后，用清洗緩沖液清洗板3次。加入 100 μ 1/孔的檢測抗體山羊抗hulgGFc-HRP (Caltag Inc.，產品編號H10507，使用的濃度為 1 2000的稀釋度)，然后將板在室溫下溫育1小時。溫育后，用清洗緩沖液清洗板3次， 并加入100 μ 1/孔的TMB (BioFX Lab.產品編號TMSK-0100-01)。然后讓板顯色大約10分 鐘(直至陰性對照孔剛開始顯色)。然后加入50 μ 1/孔的終止液(TMB終止液(BioFX Lab.
69產品編號STPR-0100-01)，在ELISA板讀數(shù)器上在450nm的波長處讀取板。除去來自陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)孔(基于初次篩選)的舊培養(yǎng)上清液，將HB-EGF陽 性雜交瘤細胞重懸浮于新鮮雜交瘤培養(yǎng)基中，然后轉移至24孔板。培養(yǎng)2天后，這些上清液 準備用于二次確認篩選。在二次確認篩選中，通過ELISA(如上所述)，用兩組檢測抗體山 羊抗hulgGFc-HRP (Caltag Inc.，產品編號H10507，使用的濃度為1 2000的稀釋度)(用 于人Y鏈檢測)和山羊抗hlgK -HRP(SouthernBiotechnology，產品編號2060-05)(用于 人κ輕鏈檢測)篩選第一次篩選中的陽性，以證明抗體制劑是HB-EGF特異性的并且在其 組成上是完全人的。兩組ELISA方法與上文中描述的相同，除了分別使用兩種不同的檢測 抗體外。與二次確認篩選平行地，進行相反ELISA篩選(counter ELISAscreen)以排除與 myc (his) 6標簽反應的抗體。ELISA方法與上文中描述的相同，除了用無關myc (his) 6標簽 蛋白(ML-myc(his)6蛋白)包被而非用HB-EGF myc (his) 6蛋白包被外。在二次確認和相反ELISA篩選后，從組群1和2鑒定了 49個完全人IgG/ κ HB-EGF 特異性單克隆抗體。D.實施例4 功能測定中抗體的放大(Scale-Up)和檢測本實施例描述了產生對于HB-EGF具有親和力的抗HB-EGF抗體的雜交瘤細胞系的鑒定。1.結合至表達HB-EGF的細胞系的雜交瘤產生的抗HB-EGF抗體的FACS檢測通過FACS分析確定細胞系上的HB-EGF表達。為了進行該分析，用PBS中的IOmM EDTA收獲2xl05個選擇的表達HB-EGF的細胞，將其重懸浮于FACS緩沖液(PBS，3% FCS, 0.4%疊氮化物)中，然后接種至96孔圓底板上。在以IOOOrpm離心3分鐘以除去上清液 后，將細胞重懸浮于雜交瘤來源的抗HB-EGF抗體稀釋液(100 μ 1/孔)中，并在4°C下溫 育45分鐘。用FACS緩沖液清洗細胞2次，并用以1 100稀釋于FACS緩沖液中的二抗 (ΙΟΟμΙ/孔)驢抗人PE(Jackson)重懸浮細胞。在4°C下將細胞懸浮液于黑暗中溫育30 分鐘，用FACS緩沖液清洗2次，然后進行分析(FACS，Beckman Coulter)。這些測定的結果提供于下面的表2和3中，其提供了各FACS測定的熒光平均值。 如表3和4中所舉例說明的，在不表達HB-EGF的CHO對照細胞中基本上檢測不到HB-EGF 的表達。然而，當HB-EGF在CHO細胞中重組過表達時，幾種單克隆抗體制劑展示了顯著的 對表達HB-EGF的細胞的結合。對MDA-MB231、SCC-9和C0S-7細胞的結合在一定程度上是 可變的，但結合一種表達HB-EGF的細胞類型的抗體制劑通常結合另一種細胞類型。如表2 中所示，幾種抗體制劑，包括例如U2-24、U2-5、U2-19、U2-21、U2-15和U2-42抗體制劑展示 了對表達HB-EGF的CHO細胞的強結合。類似地，抗體制劑U2-39、U2-26、U2-44、U2-45和 U2-48也展示了良好的對表達HB-EGF的CHO細胞的結合。表2抗HB-EGF抗體上清液的FACS分析(組群1)CHO對照細胞對表達HB-EGF的 CHO細胞內源表達HB-EGF的細胞系抗體CHO-K1CHO-HB-EGFMDA-MB231SCC-9COS-7KLH0.20.30.40.20.4U2-180.31543.11.21.6U2-680.22381.70.61.1U2-240.236020.66.7U2-140.31322.80.81.1U2-10.2641.80.73.1U2-320.2761.71.21.8U2-400.21372.11.31.1U2-50.33716.91.72.2U2-80.31483.71.41.4U2-130.21360.4(2.6)0.50.8U2-170.21701.60.61-4U2-190.43475.51.86.1U2-380.3303.90.91.4U2-210.23443.93.42.1U2-150.237030.60.9U2-160.21971.50.40.9U2-300.32733,513.4U2440.35.60.80.25.2U2-421.22773.30.56.7U2-360.91121.60.34.9U2-220.32211J0.24.9U2-560.2380.50.21.8Neg0.20.20.3Pos (山羊 aHB)0.2803表3抗HB-EGF抗體上清液的FACS分析(組群2)
7權利要求
結合HB EGF的分離的抗原結合蛋白，其包含A)一個或多個選自下列的輕鏈互補決定區(qū)(CDRL)(i)選自SEQ ID NO189 217的CDRL1；(ii)選自SEQ ID NO218 233的CDRL2；(iii)選自SEQ ID NO234 274的CDRL3；和(iv)包含一個或多個不超過4個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRL；或B)一個或多個選自下列的重鏈互補決定區(qū)(CDRH)(i)選自SEQ ID NO275 299的CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO300 331的CDRH2；(iii)選自SEQ ID NO332 372的CDRH 3；和(iv)包含一個或多個不超過4個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH。
2.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其包含一個或多個A)的輕鏈CDRL，和一個或多 個B)的重鏈CDRH。
3.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其包含至少2個A)的CDRL和至少2個B)的 CDRH0
4.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其包含所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。
5.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其中 所述A)的CDRL選自⑴選自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；(ii)選自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；(iii)選自SEQ ID NO :234_274 的 CDRL 3 ；禾口(iv)包含一個或多個不超過2個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或 (iii)的 CDRL ；所述B)的CDRH選自(i)選自SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；(ii)選自SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ；(iii)選自SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；和(iv)包含一個或多個不超過2個氨基酸的氨基酸置換、缺失或插入的(i)、(ii)或 (iii)的 CDRH ；或C)一個或多個A)的輕鏈⑶RL和一個或多個B)的重鏈⑶RH。
6.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含A)選自下列的CDRL⑴選自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；(ii)選自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；禾口(iii)選自SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ；B)選自下列的CDRH:(i)選自SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；(ii)選自SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ；禾口(iii)選自SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ； 或C) 一個或多個A)的輕鏈⑶RL和一個或多個B)的重鏈⑶RH。
7.權利要求6的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含A)SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2，和 SEQ ID NO :234_274 的CDRL3，和/或B)SEQ ID NO :275-299 的 CDRH1，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2，和 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3。
8.權利要求1的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含與選自SEQID NO 94-141的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)(VJ和/或與選自SEQ ID NO 142-186的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)(Vh)。
9.權利要求8的分離的抗原結合蛋白，其中八與選自SEQID NO :94-141的氨基酸序 列具有至少90%的序列同一性，和/或Vh與選自SEQ IDNO 142-186的氨基酸序列具有至 少90%的序列同一性。
10.權利要求8的分離的抗原結合蛋白，其中Vl選自SEQID NO :94_141，和/或Vh選 自 SEQ ID NO 142-186。
11.特異性識別至少HB-EGF的含有IHGE的表位和/或EGF樣結構域的分離的抗原結 合蛋白ο
12.與權利要求1的抗原結合蛋白競爭結合的分離的抗原結合蛋白。
13.結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含A)一個或多個選自下列的輕鏈CDR (CDRL)⑴與SEQ ID NO 189-217具有至少80%的序列同一性的CDRLl ；(ii)與SEQID NO :218_233具有至少80%的序列同一性的CDRL2 ；禾口(iii)與SEQID NO :234_274具有至少80%的序列同一性的CDRL3 ；B)一個或多個選自下列的重鏈⑶R (⑶RH)⑴與SEQ ID NO 275-299具有至少80%的序列同一性的CDRHl ；(ii)與SEQID NO 300-331具有至少80%的序列同一性的CDRH2 ；禾口(iii)與SEQID NO :332_372具有至少80%的序列同一性的CDRH 3 ；或C)一個或多個A)的輕鏈⑶RL和一個或多個B)的重鏈⑶RH。
14.權利要求13的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含A)一個或多個選自下列的⑶RL ⑴與SEQ ID NO 189-217具有至少90%的序列同一性的CDRLl ；(ii)與SEQID NO :218_233具有至少90%的序列同一性的CDRL2 ；禾口(iii)與SEQID NO :234_274具有至少90%的序列同一性的CDRL3 ；B)一個或多個選自下列的⑶RH ⑴與SEQ ID NO 275-299具有至少90%的序列同一性的CDRHl ； (ii)與SEQ ID NO 300-331具有至少90%的序列同一性的CDRH2 ；禾口(iii)與SEQ ID NO :332_372具有至少90%的序列同一性的CDRH3 ；或 C) 一個或多個A)的輕鏈⑶RL和一個或多個B)的重鏈⑶RH。
15.結合HB-EGF的分離的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包含 A)選自下列的輕鏈互補決定區(qū)(⑶RL) ⑴選自 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL 3 ；( )在氨基酸序列上與(i)的⑶RL3相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RL3 ；和(iii)選自下列的⑶RL3氨基酸序列X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO: 1046)，其中X1選自I和M，X2選自A、G和S，X3選自I和T，X4選自H和Q、X5選自F、L和W，7X6 選自 C、I、H、L 和 T，X7選自S和T ；QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID N0:1047)，其中X1選自I和S，X2選自F和Y，X3選自F、I、S和Y，X4 選自 A、S*T，X5選自P和S ；X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO: 1048)，其中X1選自L和Q，X2選自K、N和Q，X3選自A、H、S和Y，X4選自H、N和Y，X5 選自 N、S*T，X6 選自 A、F、I、Τ、V 和 Y，X7選自P和無氨基酸，X8選自F、L和P ；QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID Ν0:1049)，其中X1選自H和Q，X2選自C和Y，X3 選自 D、I、N、S 和 Y，X4選自F、I和L，X5選自A、S和T ；QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO: 1050)，其中 X1選自H和Y，X2選自G和N， X3選自N和S， X4選自S和W， X5選自P和無氨基酸， X6選自R和W， X7選自S和T ；和X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO: 1051)，其中X1選自H和Q，X2選自F和Y，X3選自G、I和S，X4選自F、I和T，X5選自M、P、S和T，X6選自F、L、R和W，X7選自S和T ；和/或B)選自下列的重鏈互補決定區(qū)(⑶RH)⑴選自 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3,( )在氨基酸序列上與(i)的⑶RH3相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RH3 ；和(ii i)選自下列的CDRH3氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12 (SEQ ID NO: 1065)，其中X1選自E和S，X2選自D、G和無氨基酸，X3選自D、N和無氨基酸，X4選自G和無氨基酸，X5選自G和無氨基酸，X6選自W、Y和無氨基酸，X7選自I、N和Y，X8選自A和Y，X9選自G、V和Y，X10 it 自 A、F 禾口 G，X11 選自 F、L*M，X12選自V禾口 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO: 1066)，其中X1選自G和無氨基酸，X2選自K、L和Y，X3選自A、G和S，X4選自S、V和Y，X5選自A和G，X6選自G和無氨基酸， X7選自T和無氨基酸， X8選自S和無氨基酸， X9選自Y和無氨基酸， X10 選 S W 和 Y， X11選自G、s和Y， X12選自F和Y， Xw選自G和無氨基酸， X14選自M和無氨基酸， X15選自V禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14(SEQ ID NO: 1067)，其中X1選自D、G、L、S和無氨基酸，X2選自G、H、W、Y和無氨基酸，X3選自A、F、W、Y和無氨基酸，X4選自D、G、Q、T和無氨基酸，X5選自G、I、Q、S和無氨基酸，X6選自A、D、N、Q、S和無氨基酸，X7選自G、Y和無氨基酸，X8選自D、Y和無氨基酸，X9選自Y和無氨基酸，X1。選自 A、E、N 和 Y，X11 選自 G、P、T、V 和 Y，X12選自F禾口 I，X13選自D和Q，X14 選自 C、H、V 禾口 Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO 1068)，其中X1選自E、D和無氨基酸，X2選自G、R和無氨基酸，X3選自I、V、Y和無氨基酸，X4 選自 A、G、L 禾口 N，X5選自A、G、V和W，X6 選自 Α、Ν、《Τ，X7選自G、N、P和無氨基酸，X8選自G、T和無氨基酸，X9選自A和無氨基酸，Xltl選自D、E和無氨基酸，X11選自S、Y和無氨基酸，X12選自G、Y和無氨基酸，Xw選自N、Y和無氨基酸，X14選自Y和無氨基酸，X15選自D、Y和無氨基酸， X16選自A、G和無氨基酸， X17選自F禾口 M， X18選自I、V和Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEC) ID NO 1069)，其中X1 選自 A、D、G、SiPT，X2選自A、Ε、G、L、N、R、Y和無氨基酸，X3選自A、G、L、N、R、T、Y和無氨基酸，X4選自D、G、R、S、V、Y和無氨基酸，X5選自A、G、I、S、V、Y和無氨基酸，X6選自F、G、L、R、V和無氨基酸，X7選自L、T、Y和無氨基酸，X8選自Y和無氨基酸，X9選自Y和無氨基酸，Xltl選自D和無氨基酸，X11選自S和無氨基酸，X12選自S和無氨基酸，X13選自G和無氨基酸，X14選自D、L、M、S、Y和無氨基酸，X15選自H、I、P、V、W和無氨基酸，X16選自F、G、L、R、S、Y和無氨基酸，X17選自D、F、V、W、Y和無氨基酸，X18 選自 C、F、L、P、S 和 Y，X19 選自 D、F、G 和 Y，乂2。選自六、(、6、卩、1 、￥和 Y，X21選自F、L、M、S和無氨基酸，X22選自A、D和無氨基酸，X23選自I、L、V、Y和無氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO: 1070)，其中X1選自M和V，X2選自S和無氨基酸，X3選自F和無氨基酸，X4選自V和無氨基酸，X5選自F和M，X6選自V和Y;和RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID N0:1071)，其中 X1 選自 G、H、L、N 禾口 R， X2選自E、T和W， X3 選自 L、N、TiPV，X4選自D禾口 E。
16.權利要求15的分離的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白還包含 A)選自下列的CDRL ⑴選自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；( )在氨基酸序列上與(i)的CDRLl相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RLl ；(iii)選自下列的⑶RLl氨基酸序列 X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(SEQ ID NO:IO35)，其中 X1選自K和R，X2選自L和V， X3選自H和Y， X4選自K和N， X5選自N、S和Y ；RASQX11SX2YLN(SEQ ID N0:1036)，其中 X1 選自 R、SiPT， X2選自R和S ；RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID N0:1037)，其中X1 選自 D、G、SiPT，X2選自A、R禾口 S，X3 選自 H、I、N、R、S 禾口 T，X4選自D、W和Y，X5選自A、G和N ；QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID N0:1038)，其中 X1選自S和T， X2選自D和N， X3選自S和Y ；RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID NO: 1039)，其中X1選自S和T，X2選自I和S，X3選自R和S，X4選自S、N和無氨基酸，X5選自Y和無氨基酸；和KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(SEQ ID NO:IO4O)，其中X1選自N和S，X2選自I和V，X3選自D和Y，X4選自N、R和S，X5選自A和V ；(iv)選自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；8(ν)在氨基酸序列上與(iv)的CDRL2相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RL2 ；和(vi)選自下列的CDRL2氨基酸序列 X1X2SNX3X4S(SEQ ID N0:1041)，其中 X1選自E和K， X2選自I和V， X3選自R和W， X4選自D和F ；X1X2SX3LQS(SEQ ID N0:1042)，其中 X1選自A和T， X2選自A、E禾口 V， X3選自S和T ； X1ASX2LQS(SEQ ID NO: 1043)，其中 X1選自A和V， X2選自S和T ；DASX1LET(SEQ ID NO : 1044)，其中 X1選自I和N ；GASSRAT(SEQ ID NO 223)；禾口WASX1RES(SEQ ID N0:1045)，其中X1選自A和T ；或B)選自下列的CDRH :(i)選自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；( )在氨基酸序列上與(i)的CDRHl相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RHl ；(iii)選自下列的⑶RHl氨基酸序列 GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 1052)，其中 X1選自F和L， X2選自E、G禾口 S， X3選自H、L禾口 Y， X4選自G、S和Y， X5選自I和M， X6選自H和S ；GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO: 1053)，其中 X1選自R和S ；GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID N0:1054)，其中 X1選自R和S， X2選自H和Y， X3選自D和G ；GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID NO: 1055)，其中x1選自p和τ， x2選自a、r禾口 s， x3選自a和s， x4選自n和s ；gx1sx2sx3x4x5x6x7wx8(seq id no: 1056)，其中x1選自d和g， x2選自f、i和v，x3選自r、s和無氨基酸，X4選自G、Y和無氨基酸，x5選自d、g、s和無氨基酸，x6選自a、s和y，x7選自a和y，x8選自n和s ；gfslsnarmgvs(seq id no 279)；禾口 gfslxjggvgvg(seq id no: 1057)，其中 x1選自s和n ；(iv)選自 seq id no :300-331 的 cdrh2 ；(ν)在氨基酸序列上與(iv)的CDRH2相異在于不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置換的⑶RH2 ；和(vi)選自下列的CDRH2氨基酸序列x1x2x3x4x5x6gx7tx8x9x10qkx11x12 (seq id n0:1058)，其中x1選自s和w，x2選自f和i，x3選自d、n禾口 s，x4選自a和p，x5選自e、n和s，x6選自d、n和s，x7選自e、g禾口 n，x8選自i和n，x9選自c、h和y，x10選自a和t，X11 選自 FfPL,x12選自d禾口 g ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no:io59)，其中 x1選自d和g， x2選自a、i和t ；x1ix2x3dgsx4x5x6yx7dsvx8g(seq id no: 1060)，其中 x1選自f和v， x2選自s和w，X3選自D、S禾口 Y， X4 選自 I、N*T， X5選自K和Q， X6選自N、R和Y， X7選自A、T禾口 V， X8選自K和R ；X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID N0:1061)，其中X1選自A、H禾口 Y，X2選自G、R禾口 S，X3選自G和S，X4選自G、R和S，X5選自S、T和 Y，X6選自I和T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO: 1062)，其中X1選自E、R禾口 Y，X2選自I和T，X3選自H、N禾口 Y，X4 選自 C、H、S、T 和 Y，X5選自S和R，X6選自G和S，X7 選自 G、K、SiPT，X8選自T和W，X9選自N和Y，Xltl選自N和無氨基酸，X11選自D和無氨基酸，X12選自A和N，X13選自P禾口 V，X14選自L禾口 V ；X1Ifsndeksystslks(seq id no:io63)，其中 X1選自H和LI ；和LIYffNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID N0:1064)，其中 X1選自D和V， X2選自D和E， X3選自K禾口 R。
17.權利要求16的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含所述第一氨基酸 序列和所述第二氨基酸序列。
18.權利要求17的分離的抗原結合蛋白，其中所述第一氨基酸序列共價連接至所述第二氨基酸序列。
19.權利要求17的分離的抗原結合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含所述SEQIDNO 234-274 的 CDRL 3,SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，以及 所述第二氨基酸序列包含所述SEQ ID NO 332-372的CDRH3，SEQ ID NO 300-331的CDRH2 和 SEQ IDNO 275-299 的 CDRHl。
20.權利要求1-19的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是單克 隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體，或其抗體片 段。
21.權利要求20的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗體片段是Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、雙價抗體或單鏈抗體分子。
22.權利要求20的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是人抗體。
23.權利要求20的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是單克隆抗體。
24.權利要求1-19的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是IgGl、 IgG2、IgG3 或 IgG4 類型。
25.權利要求24的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是IgG2或IgG4類型。
26.權利要求1-19的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白偶聯(lián)至標 記基團。
27.權利要求26的分離的抗原結合蛋白，其中所述標記基團是放射性同位素、放射性 核素、熒光基團、酶基團、化學發(fā)光基團、生物素基團或預先確定的多肽基團。
28.權利要求1-19的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白偶聯(lián)至效應子基團。
29.權利要求28的分離的抗原結合蛋白，其中所述效應子基團是放射性同位素、放射 性核素、毒素、治療性基團或化學治療基團。
30.權利要求29的分離的抗原結合蛋白，其中所述治療性基團或化學治療基團是卡奇 霉素、auristatin-PE、格爾德霉素、美登納新或其衍生物。
31.與權利要求1-19的一項的抗原結合蛋白競爭對人HB-EGF的結合的分離的抗原結 合蛋白ο
32.權利要求31的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是單克隆抗體、多克 隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體，或其抗體片段。
33.權利要求32的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗體片段是Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、雙價抗體或單鏈抗體分子。
34.權利要求32的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是人抗體。
35.權利要求32的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是單克隆抗體。
36.權利要求31的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是IgGI、 IgG2、IgG3 或 IgG4 類型。
37.權利要求36的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是IgG2或IgG4類型。
38.權利要求31的任一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白偶聯(lián)至標記 基團。
39.權利要求38的分離的抗原結合蛋白，其中所述標記基團是放射性同位素、放射性 核素、熒光基團、酶基團、化學發(fā)光基團、生物素基團或預先確定的多肽基團。
40.權利要求31的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白偶聯(lián)至效應子基團。
41.權利要求40的分離的抗原結合蛋白，其中所述效應子基團是放射性同位素、放射 性核素、毒素、治療性基團或化學治療基團。
42.權利要求41的分離的抗原結合蛋白，其中所述治療性基團或化學治療基團是卡奇 霉素、auristatin-PE、格爾德霉素、美登納新或其衍生物。
43.權利要求1-19的一項的分離的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白至少部分地 減少HB-EGF介導的信號轉導。
44.編碼權利要求1-19的任一項的抗原結合蛋白的核酸分子。
45.權利要求44的核酸分子，其中所述核酸分子與控制序列有效連接。
46.包含權利要求44的核酸分子的載體。
47.包含權利要求45的核酸分子的載體。
48.包含權利要求45的核酸分子的宿主細胞。
49.包含權利要求46或47的一項的載體的宿主細胞。
50.制備權利要求1-19的任一項的抗原結合蛋白的方法，其包括從分泌所述抗原結合 蛋白的宿主細胞制備所述抗原結合蛋白的步驟。
51.包含至少一種權利要求1-19的任一項的抗原結合蛋白以及可藥用的載體、稀釋劑 和/或佐劑的藥物組合物。
52.權利要求51的藥物組合物，其還包含另外的活性劑。
53.權利要求52的藥物組合物，其中所述至少一種另外的活性劑是抗腫瘤劑。
54.權利要求53的藥物組合物，其中所述抗腫瘤劑是抗腫瘤抗體。
55.權利要求54的藥物組合物，其中所述抗腫瘤抗體是抗受體酪氨酸激酶的抗體。
56.權利要求53的藥物組合物，其中所述抗腫瘤抗體抗EGFR。
57.權利要求51的藥物組合物，其用于過度增殖性疾病的診斷、預防或治療。
58.權利要求57的藥物組合物，其中所述過度增殖性疾病與HB-EGF表達相關。
59.權利要求57的藥物組合物，其中所述過度增殖性疾病與被擾亂的例如病理性增強 的生長因子受體激活相關或與其相伴。
60.權利要求59的藥物組合物，其中所述病理性增強的生長因子受體激活與G蛋白和 /或G蛋白偶聯(lián)受體的活性的病理性增加相關或由其引起。
61.權利要求51的藥物組合物，其用于癌癥的診斷、預防或治療。
62.權利要求61的藥物組合物，其中所述癌癥選自乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、 卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、 神經(jīng)膠質瘤、黑素瘤、癌，特別是上皮或鱗癌、其他表達或過表達HB-EGF的癌癥以及腫瘤轉 移的形成。
63.至少一種權利要求1-19的抗原結合蛋白用于制造藥物組合物的用途，所述藥物組 合物用于診斷、預防或治療過度增殖性疾病。
64.權利要求63的用途，其中所述過度增殖性疾病是如權利要求58中所定義的過度增殖性疾病。
65.用于診斷與HB-EGF的表達相關的病況的方法，其包括將樣品與權利要求1-19的抗 原結合蛋白接觸，和確定HB-EGF在所述樣品中的存在。
66.權利要求65的方法，其中所述病況是如權利要求58中所定義的過度增殖性疾病。
67.用于預防或治療患者中的與HB-EGF的表達相關的病況的方法，其包括對有此需要 的患者施用有效量的至少一種權利要求1-19的抗原結合蛋白。
68.權利要求62的方法，其中所述病況是如權利要求57-60的任一項中所定義的過度 增殖性疾病。
69.權利要求57的方法，其中所述患者是哺乳動物患者。
70.包含權利要求1-19的抗原結合蛋白、權利要求44或45的核酸分子或權利要求46 或47的載體的試劑盒。
71.權利要求70的試劑盒，其包含至少一種另外的活性劑。
72.權利要求71的試劑盒，其中所述另外的活性劑是抗腫瘤劑。
73.權利要求53的藥物組合物，其中所述抗腫瘤劑是順鉬或阿瓦斯丁。
74.權利要求51-62的任一項的藥物組合物，其將作為單一療法施用或與優(yōu)選包含抗 腫瘤劑例如順鉬或阿瓦斯丁的另外的藥物組合物聯(lián)合施用。
全文摘要
本文中提供了抗原結合蛋白，例如人和/或單克隆抗體，其具有對肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)的親和力并且中和該生長因子的生物學功能。
文檔編號A61K33/24GK101970485SQ200880117400
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權日2007年9月26日
發(fā)明者E·伯吉斯, E·茨維克-瓦拉施, M·羅特, N·普倫策爾, O·富爾德, T·海特曼 申請人:U3制藥有限公司;安進公司