專利名稱：可成像的哮喘嚙齒動物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哮喘嚙齒動物模型。更具體地說，其涉及一種哮喘嚙齒動物模 型，其具有熒光標記的細胞，這些細胞的移行(trafficking)在哮喘性反應(yīng)(asthmatic response)被誘導(dǎo)后可被監(jiān)測。還提供了利用所述嚙齒動物模型來確定調(diào)節(jié)哮喘性反應(yīng)的 候選藥物的有效性的方法。
背景技術(shù)：
哮喘是一種以Th2驅(qū)動的氣道內(nèi)炎癥為特征的免疫疾病。支氣管周圍空間的炎 癥，伴有氣道粘液產(chǎn)生的增加和氣道高反應(yīng)性，是哮喘的主要特征。鼠哮喘模型已經(jīng)被廣泛用于研究哮喘反應(yīng)(asthmatic response)之后的多種不 同事件。卵清蛋白(OVA)刺激模型為加深我們對這種疾病背后的病理遺傳機制和鑒定新 治療靶標提供了許多機會(Kumar et al.，Curr Drug Targets2008 ；9 =485-94.) 沒有單 一的“經(jīng)典”模型，因為就小鼠株系、致敏方法、刺激的途徑和持續(xù)時間、以及評估宿主應(yīng)答 的手段等方面的選擇而言都存在很多可選的方案。Kumar等人對“經(jīng)典”的小鼠哮喘OVA 刺激模型進行了綜述，基于小鼠株系、途徑、刺激的劑量和持續(xù)時間、以及致敏方法等的選 擇總結(jié)了一系列小鼠哮喘OVA刺激模型。近來已經(jīng)開發(fā)了多種由臨床上重要的變態(tài)反應(yīng) 原導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)和變應(yīng)性哮喘的小鼠模型(Fuchs&Braun，Curr Drug Targets 2008 ；9 495-502.)。已經(jīng)證明，肺變應(yīng)性疾病的抗原誘導(dǎo)小鼠模型可為肺中炎癥途徑的基因剖析提供 尤其豐富的信息。Kimg等人開發(fā)了一種在小鼠中誘導(dǎo)嚴重肺嗜酸粒細胞增多的方法，還 研究了血液和骨髓中的嗜酸粒細胞的數(shù)量和對皮質(zhì)類固醇治療的應(yīng)答(Kimg et al. , Int Arch Allergy Immunol. 1994 ；105 =83-90.)。用明礬沉淀的OVA使動物致敏，并在12天后， 當(dāng)血清中IgE水平顯著提升時，用氣溶膠化的OVA刺激動物。刺激后4到8小時，骨髓和外 周血中的嗜酸粒細胞的數(shù)目稍有增加，但是在肺組織和支氣管肺泡灌洗(BAL)液中僅觀察 到少數(shù)嗜酸粒細胞。刺激后24小時，骨髓中的嗜酸粒細胞顯著減少，而肺中血管周圍及支 氣管周圍區(qū)域中的嗜酸粒細胞數(shù)達到峰值。刺激后48小時，在BAL液中發(fā)現(xiàn)了最高數(shù)目的 嗜酸粒細胞，占該區(qū)室中所有細胞的> 80%。肺組織和BAL液中的高嗜酸粒細胞水平持續(xù) 了 2-3天，隨之而來的是更輕微但持久的嗜酸粒細胞增多，再持續(xù)10天。未致敏的動物的 BAL液、肺、血液或骨髓中的嗜酸粒細胞數(shù)目未顯示顯著變化。組織病理學(xué)評估還顯示氣道 的上皮細胞損傷、內(nèi)腔中粘液過多、和粘膜下層水腫。Pauwels等人開發(fā)了一種變應(yīng)性氣道炎癥體內(nèi)模型，其特征在于針對吸入抗原 的IgE抗體的存在，支氣管周浸潤伴有嗜酸粒細胞數(shù)增多，以及氣道對非抗原性支氣管收縮刺激物的應(yīng)答性增加(Pauwels et al.，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997 ；156 S78-S81.)。C57Black 6(C57Bl/6)小鼠在第O天通過腹膜內(nèi)注射10 μ g OVA (吸附在Img 明礬上)主動致敏，并從第14天到21天每天在30分鐘時間內(nèi)暴露于氣溶膠化OVA。在第 22天，可以證明存在氣道炎癥，其特征是存在支氣管周和細支氣管周混合細胞浸潤物，其主 要由單核細胞和嗜酸粒細胞組成。這反映為從這些動物中回收的BAL液中嗜酸粒細胞數(shù)的 增加。此外，這種炎癥應(yīng)答伴隨著氣道對卡巴膽堿(carbachol)的應(yīng)答性的增加。在經(jīng)過 致敏和暴露的動物的血清中可發(fā)現(xiàn)卵清蛋白特異性IgE抗體。有人開發(fā)了一種抗原誘導(dǎo)性氣道高反應(yīng)性和炎癥的體內(nèi)鼠模型來研究免疫調(diào) 節(jié)的改變對氣道高反應(yīng)性起重要作用的可能性(Gavett et al. , Am JRespir Cell Mol Biol. 1994 ；10 :587-93.)，這種可能性被很多描述性的人體數(shù)據(jù)所提示。A/J小鼠在用綿羊 紅細胞腹膜內(nèi)致敏和氣管內(nèi)刺激后，產(chǎn)生了氣道高反應(yīng)性，肺炎癥細胞數(shù)也顯著增加。值得 注意的是，嗜酸性粒細胞是炎性浸潤物的重要(prominent)成分。利用抗CD4單克隆抗體 GKl. 5體內(nèi)耗竭⑶4+細胞，考察了這些現(xiàn)象在病理學(xué)上和功能上對⑶4+T淋巴細胞的依賴 性。當(dāng)在抗原刺激之前施用時，GKl. 5完全阻止了氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細胞的浸潤。該 模型提供了氣道高反應(yīng)性對CD4+T淋巴細胞的依賴性的首個直接證明，且結(jié) 果與嗜酸粒細 胞可能是這種應(yīng)答的效應(yīng)物是一致的。美國專利申請11/568，896(公開號US 2008-0172751)提供了一種通過OVA和雙 鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的COPD和Thl哮喘的小鼠模型。BALB/c小鼠(Jackson Lab, USA)通 過鼻內(nèi)單獨或共同給予合成的dsRNA聚肌苷酸-聚胞苷酸(ployinosinic-polycytidylic acid) (PolylC，Sigma, USA)和OVA 4次來致敏。10天后，小鼠通過鼻內(nèi)給予OVA刺激來誘 導(dǎo)哮喘。所得的小鼠命名為Thl哮喘小鼠。陰性對照小鼠僅給予磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。美國專利6，215，040描述了一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其肺上皮中組成性表達IL_5，導(dǎo) 致支氣管周嗜酸粒細胞顯著積累，并發(fā)生引人注目的病理學(xué)改變，包括支氣管相關(guān)淋巴 樣組織(BALT)的擴展、杯形細胞增生、上皮細胞肥大和病灶膠原沉積(focal collagen deposits) 0令人驚訝的是，這些改變并沒有伴隨著明顯的氣道內(nèi)腔嗜酸粒細胞浸潤。由此 可見，單獨的IL-5肺特異性表達(即沒有抗原誘導(dǎo)的肺部炎癥)就能夠誘導(dǎo)許多與變應(yīng)性 呼吸道疾病相關(guān)的病理學(xué)改變。此外，這些小鼠響應(yīng)于醋甲膽堿(methacholine)刺激顯示 出AHR。因此，AHR可以在沒有大量嗜酸粒細胞浸潤氣道內(nèi)腔的情況下發(fā)生。有人開發(fā)了兩種新的變應(yīng)性哮喘模型，其中小鼠接受相同的變應(yīng)原致敏，但分別 急劇(acutely)或緩慢(chronically)地暴露于變應(yīng)原，后者用來更近似地模擬人類中的 情況(Fernandez-Rodriguez et al. , Int Immunopharmaco 1. 2008 ；8 :756_63·)。對于急 劇型模型，在同一天以O(shè)VA吸入方式刺激經(jīng)OVA致敏的小鼠兩次，對于緩慢型模型在6周時 間內(nèi)刺激18次。最后一次刺激后馬上監(jiān)測在清醒、無拘束狀態(tài)下的小鼠的肺功能，持續(xù)最 多達12h。刺激后24h，測定針對吸入的醋甲膽堿的氣道應(yīng)答性和血清抗體水平。在第2或 24h測定支氣管肺泡炎癥細胞募集情況。急劇和緩慢處理的小鼠具有相似的早發(fā)和遲發(fā)哮 喘反應(yīng)，分別在第2h和第7-8h達到高峰。相比于幼稚(naive)小鼠，IgE和IgG抗體水平 上升；相比于幼稚和鹽水刺激的小鼠，嗜酸粒細胞浸潤上升。在兩種模型中刺激發(fā)生24小 時后都觀察到針對醋甲膽堿的氣道高反應(yīng)性。急劇型模型具有更高的嗜酸粒細胞水平，而 緩慢型模型對更低的醋甲膽堿劑量顯示反應(yīng)性，且總IgE水平和卵清蛋白特異性IgG抗體水平更高。這兩種新的變應(yīng)性哮喘鼠模型都與人哮喘具有很高的相似性，二者對于哮喘的 潛在機理的研究和現(xiàn)有的及新的治療劑的評價都具有獨到的優(yōu)勢。已經(jīng)證明鼠哮喘模型對研究變應(yīng)性炎癥及其背后的免疫應(yīng)答的基本機理是非常 有用的。許多研究揭示，CD4+2型T輔助細胞(Th2)和嗜酸粒細胞在哮喘中起關(guān)鍵作用。 ⑶4+Th2細胞——人們認為它們在所有哮喘患者的氣道中都存在——分泌關(guān)鍵性的細胞因 子，如IL-4和IL-13，以及IL-5和IL-9。常規(guī)的⑶4+T細胞 在肺中識別外源抗原并啟動變 應(yīng)性炎癥，而且在哮喘小鼠模型中，⑶4+細胞的消除可取消(abrogate)AHR的發(fā)生。對哮 喘性炎癥的發(fā)病同樣關(guān)鍵的是所謂Th2細胞因子，尤其是白細胞介素(IL)-5和IL-13(參 見例如 Nakajima et al.，Am. Rev. Respir. Dis. 1992 ； 146 :374_377 ；WiIls-Karp et al.， Science 1998;183:195-201.)。雖然Th2驅(qū)動的免疫應(yīng)答在哮喘的發(fā)生中是極為重要的，但Th2應(yīng)答本身不足以 誘發(fā)哮喘。通過進一步了解調(diào)節(jié)細胞在哮喘中扮演的角色，可能可以鑒定出新的治療靶標。 在大多數(shù)臨床研究中，人們已經(jīng)確認肺嗜酸粒細胞是炎癥性浸潤的一個突出特征，而炎癥 性浸潤往往與疾病的嚴重性相關(guān)。最近，嗜酸性粒細胞與哮喘發(fā)病的關(guān)系越來越引起人們 的興趣(ffeller,P. F. ,Curr. Opin. Immunol. 1994 ；6 :85_90.)。一系列 CD4+T 細胞，包括 Th3 細胞、TR細胞、⑶4+CD25+細胞和NKT細胞，在這種疾病的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Akbari等人 利用天然殺傷細胞(NKT)缺陷小鼠證明，在沒有Va 14iNKT細胞存在時，變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道 高反應(yīng)性(AHR)——哮喘的主要特征之一——不會發(fā)生(Akbari et al.，Nat. Med. 2003 ；9 582-588.)。因此，肺Va 14iNKT細胞關(guān)鍵性地調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生和針對名義(nominal)外源 抗原的Th2偏向性呼吸道免疫。Miyahara等人提出，效應(yīng)物⑶8+T細胞在AHR和氣道炎癥 中起重要作用，該作用可能與它們的Tc2型細胞因子生產(chǎn)以及它們遷移到肺中的本領(lǐng)有關(guān) (Miyahara et al.，Nat. Med. 2004 ；10 :865_869·)。Wyss 等人描述了一種在 BALB/c 小鼠中 產(chǎn)生的卵清蛋白誘導(dǎo)的腺苷高反應(yīng)性模型，其中他們確定了小鼠中腺苷誘導(dǎo)的高反應(yīng)性是 依賴于肥大細胞的(Wysset al.，Br J Pharmacol. 2005 ；145 :845_852·)。雖然現(xiàn)有技術(shù)中描述了多種哮喘動物模型，但是關(guān)于抗原特異性Th細胞向患哮 喘的肺中的遷移和動力學(xué)的信息寥寥無幾。這部分地是由于難以監(jiān)測患哮喘的肺中的細胞 移行，尤其是在體內(nèi)。一種常用的手段是確定支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的總細胞計數(shù)和 差異細胞計數(shù)。然而，短期高水平刺激模型中嗜酸粒細胞的數(shù)目和百分比的增加并不反映 患者中的情況。評估組織切片中的炎癥應(yīng)答是更可靠的，但耗費時間。因此，本領(lǐng)域中急切 需要一種容許人們?nèi)菀椎伢w內(nèi)監(jiān)測患哮喘的肺中的細胞移行的動物模型。熒光蛋白多年來被用作熒光標記。最初被分離的蛋白發(fā)綠色波長的光，后被稱為 綠色熒光蛋白(GFP)。由于這一點，綠色熒光蛋白成為了泛指此類熒光蛋白的通稱，盡管還 有不同顏色的蛋白，包括紅色熒光蛋白(RFP)、藍色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP) 等等被制備出來。這些蛋白的性質(zhì)在例如美國專利6，232，523,6, 235，967,6, 235，968和 6，251，384中有討論。這些專利描述了利用具有不同顏色的熒光蛋白來監(jiān)測轉(zhuǎn)基因嚙齒動 物(它們是便利的腫瘤模型)中的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。有人描述了一種腫瘤-宿主相互作用雙色熒光成像模型，該模型基于表達RFP的 腫瘤在GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中的生長，容許人們對腫瘤_基質(zhì)相互作用(包括腫瘤血管生成和 腫瘤中淋巴細胞的浸潤)加以雙色可視化(dual-colorvisualization)。作為宿主，使用在雞β-肌動蛋白啟動子和巨細胞病毒增強子控制下表達GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠(Okabe et al., FEBS Lett 1997 ；407 315 319)。來自該轉(zhuǎn)基因品系的所有組織在藍色激發(fā)光下發(fā)綠色 熒光。用pLNCX2-DsRed-2-RFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達RFP的B16F0 (B16F0-RFP)小鼠黑素瘤細胞。 B16F0-RFP腫瘤和表達GFP的宿主細胞可以同時被清楚地成像。高分辨率的雙色圖像容許 人們將腫瘤細胞核宿主組織解析到單細胞水平。表達GFP的宿主細胞包括成纖維細胞、腫 瘤浸潤性淋巴細胞、樹突細胞、血管和毛細血管等，可以很容易地與表達RFP的腫瘤細胞區(qū) 分開。這種雙色熒光成像系統(tǒng)可以幫助人們進行旨在了解腫瘤生長和腫瘤血管形成過程中 的腫瘤-宿主相互作用的研究。該雙色嵌合系統(tǒng)還為人們提供了一種有力的工具來分析和 分離與腫瘤相互作用的腫瘤浸潤性淋巴細胞和其他宿主基質(zhì)細胞，用于治療和診斷/分析 目的。上面的參考文獻通過引用并入本文。最近，Yang等人針對表達GFP的腫 瘤和轉(zhuǎn)移灶進行了整體光學(xué)成像(Yang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (U S A) 2000 ；97 :1206_11)。Yang 等人實時成像了在活小鼠中 生長和轉(zhuǎn)移中的發(fā)熒光腫瘤。整體光學(xué)成像系統(tǒng)是體外非介入性的。它為人們提供了前所 未有的針對完整動物體內(nèi)惡性腫瘤生長和擴散的連續(xù)可視監(jiān)測。Yang等人建立了新的穩(wěn)定 表達極高水平的維多利亞水母(Aequorea victoria) GFP的人類和嚙齒動物腫瘤，并把它們 移植到合適的動物中。B16F0-GFP小鼠黑素瘤細胞被注射到6周齡C57BL/6和裸小鼠的尾 靜脈或門靜脈中。整體光學(xué)成像顯示在腦、肝和骨中有B16F0-GFP的轉(zhuǎn)移灶，它們被用來對 上述每個器官中腫瘤的生長進行實時定量測量。通過手術(shù)將AC3488-GFP人類結(jié)腸癌同位 植入到裸小鼠中。整體光學(xué)成像實時顯示了原發(fā)結(jié)腸癌的生長及其在肝臟和骨骼中的轉(zhuǎn)移 灶。成像使用透射式落射熒光顯微鏡或盒式熒光儀(fluorescence light box)和熱電冷 卻式彩色電荷耦合器件照相機。轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的可成像深度取決于它們的大小。60微米 直徑的腫瘤可以在0. 5mm的深度被檢測到，而1，800微米的腫瘤可以在2. 2mm的深度可視 化。這種針對生長中腫瘤的簡單、非介入式、高度選擇性的成像方法(強GFP熒光使這成為 可能)，使人們能夠?qū)δ[瘤生長和轉(zhuǎn)移形成進行詳細的成像。這將有助于人們研究腫瘤生長 的調(diào)節(jié)因素，包括潛在化療劑的抑制作用。上文所述的全身外部熒光光學(xué)成像技術(shù)在美國 專利6，649，159中公開。本發(fā)明的公開本發(fā)明涉及一種哮喘嚙齒動物模型，其具有熒光標記的細胞，在哮喘反應(yīng)被誘導(dǎo) 后這些細胞的移行可以被監(jiān)測。該模型是這樣的嚙齒動物，其已被供與變應(yīng)原致敏的、熒光 標記的淋巴細胞，它們在誘導(dǎo)針對所述變應(yīng)原的哮喘反應(yīng)后可以被檢測到。在另一個方面 中，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測所述嚙齒動物哮喘模型中細胞移行的方法。在另一個方面中，本發(fā) 明涉及利用所述嚙齒動物模型篩選抗哮喘藥的方法，所述方法尋找可特異性抑制負責(zé)哮喘 反應(yīng)的熒光細胞的移行的藥物。附圖簡要說明

圖1. OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘中GFP+⑶4+T細胞向肺中浸潤的雙色可視化。圖2. OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘中RFP+⑶4+T細胞向肺中浸潤的雙色可視化。圖3. OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘中⑶8+T細胞向肺中的浸潤的可視化。圖4.肺中CD4+T細胞積累的時間過程和地塞米松(Dexamethasone)對其的抑制。圖5.肺中CD4+T細胞積累的時間過程和地塞米松(Dexamethasone)對其的抑制的熒光成像。圖6. OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘中0T2_Th2向肺中積累的可視化。圖7.變應(yīng)原刺激后炎癥灶(inflammatory foci)和GFP+Th2 細胞灶(GFP+Th2 cell foci)的誘導(dǎo)的組織學(xué)和免疫組化分析。實施本發(fā)明的樽式可用于本發(fā)明中的工具在上文通過提述并入的出版物、美國專利和專利申請中有 記載。整體成像(whole body imaging)、可用于本發(fā)明的熒光蛋白的性質(zhì)、以及標記整個動 物的方法在這些文件中都有描述。為了避免混淆，將使用簡單的術(shù)語“熒光蛋白”;一般來說，該術(shù)語應(yīng)理解為指多種 生物(如海腎(Renilla)和水母(Aequorea))產(chǎn)生的熒光蛋白，以及這些天然熒光蛋白的 可發(fā)出各種可見色的熒光的修飾形式，所述可見色如紅、黃和深藍色，分別由紅色熒光蛋白 (RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)或深藍色熒光蛋白(CFP)展現(xiàn)。一般來說，術(shù)語“熒光蛋白”與 “GFP” “或RFP”可互換使用。本發(fā)明提供一種哮喘嚙齒動物模型，其中所述嚙齒動物已被供予經(jīng)變應(yīng)原致敏和 熒光標記的淋巴細胞，這些細胞在誘導(dǎo)了針對所述變應(yīng)原的哮喘反應(yīng)之后可以被檢測到。在一個具體的實施方案中，熒光標記的淋巴細胞可以是T淋巴細胞。在另一個具 體的實施方案中，熒光標記的淋巴細胞可以是CD4+T淋巴細胞。在另一個具體的實施方案 中，熒光標記的淋巴細胞可以是Th2細胞。上述文獻中描述的任何用于誘導(dǎo)哮喘反應(yīng)的規(guī)程都可以在本模型中使用。所述 嚙齒動物可以是，例如，小鼠或大鼠。合適的小鼠株系可以為BALB/c，C57BL/6, B6D2F1/J, A/J，CBA/J等等。用于刺激和致敏的變應(yīng)原可以為OVA、OVA肽、綿羊紅細胞、dsRNA、蟑螂 (rBla g2)、房舍塵螨(housedust mite) (rDer f 1)，房舍塵螨類提取物、橄欖花粉(天然和 重組 Ole el)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)提取物、梯牧草(Timothy grass)花粉 (rPhl p5)、樺樹花粉(rBet vl)、黑麥草(rye grass)花粉(Lol pi)、橄欖花粉提取物、鏈 格孢菌(Alternaria alternate)提取物、草本枝孢(Cladosporium herbarum)孢子、屋塵 螨(Dermatophagoides pteronyssinus)提取物、熱凝固的雞蛋清等等，或者它們的任何組 合。刺激的途徑可為吸入或氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射等等。在一個具體的實施方案中，熒光標記的細胞來自于遍在地(ubiquitously)表達 或者在一部分細胞中表達熒光蛋白的供體小鼠。供體小鼠可以先進行致敏，再收集熒光標 記的細胞用于導(dǎo)入受體小鼠中。致敏可以用上面列出的任何變應(yīng)原或者它們的組合來進 行，可以用或者不用(多種)佐劑。所用的佐劑可以是明礬、HDMziCFA1UFA2JT3等等，或它 們的任何組合。致敏的途徑可以為腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下注射等等。在另一個具體實施方案中，熒光標記的細胞來自兩只表達兩種不同的熒光蛋白的 供體動物。一只供體接受致敏，另一只供體不作致敏，用作對照。將兩個不同標記的細胞群 導(dǎo)入同一受體動物中，并且可以通過如上所述的雙色熒光成像來同時監(jiān)測它們的移行。本發(fā)明還提供一種確定候選抗哮喘藥物的有效性的方法，該方法將物質(zhì)施用給所 述哮喘嚙齒動物模型，然后監(jiān)測對細胞移行的抑制效果。候選物質(zhì)的施用可以在對動物的 誘導(dǎo)哮喘反應(yīng)的刺激之前、之后或者與之同時進行。可以利用雙色熒光成像來監(jiān)測候選物 質(zhì)對經(jīng)致敏的及對照的細胞群體的效應(yīng)以過濾掉假陽性。
可以監(jiān)測已被切除的組織切片中、離體的活組織中、或活動物體內(nèi)的細胞移行。為 了體內(nèi)監(jiān)測活動物，可以進行內(nèi)鏡檢查或全身熒光成像，下面部分中將詳細描述。本發(fā)明的各方面中用到的標記物是熒光蛋白。這一類群中的基礎(chǔ)蛋白——GFP的 天然編碼基因已從生物發(fā)光水母維多利亞水母(Aequorea victoria)中被克隆出來(Morin et al. ,J. Cell Physiol. 1972 ；77 313 318)。該基因的獲得使得人們使用GFP作為基因表 達的標志物成為可能。原始的GFP本身是一個283個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為27kD。它 發(fā)熒光不需要任何來自其天然來源的其他蛋白，也不需要只在其天然來源中有的底物或輔 因子(Prasheret al.，Gene 1992 ；111 229 233 ；Yang et al. , Nature Biotechnol. 1996 ； 14 12521256 ；Cody et al. ,Biochemistry 1993 ；32 1212 1218.)。人們已發(fā)現(xiàn)原始GFP基 因的突變體可用于提高表達和改變激發(fā)和熒光，從而得到多種顏色(包括紅色和藍色)的 “GFP”。GFP S65T(其中第65位的絲氨酸被替換為蘇氨酸)在本發(fā)明的方法中特別有用，其 在 490nm有單個激發(fā)峰(Heim et al. ,Nature 1995 ；373 663 664 ；美國專利 5，625，048.)。 Delagrade et al. , Biotechnology 1995；13 151 154 ；Cormack et al. , Gene 1996 ； 173 33 38 JPCramer et al. ,NatureBiotechnol. 1996 ； 14 315 319 也描述了其他突變體。美 國專利5，625，048中也公開了更多突變體。通過合適的修飾，可以改變GFP發(fā)射的光譜。 因此，雖然本發(fā)明中多使用術(shù)語“GFP”，但該定義所包括的蛋白不一定呈綠色。GFP的許多 形式呈現(xiàn)綠色之外的顏色，這些也包括在定義“GFP”之內(nèi)，并且可用于本發(fā)明的方法和材料 中。此外應(yīng)當(dāng)注意，落入定義“GFP”范圍內(nèi)的綠色熒光蛋白已經(jīng)從其他生物，如海腎(sea pansy)，即海洋腔腸(Renillareniformis)中分離出來。任何合適的和便利的GFP，包括天 然和突變的形式，都可以用來修飾本發(fā)明可用的感染原。本發(fā)明的方法利用熒光標記的細胞，優(yōu)選具有足夠的熒光強度，使得無需任何介 入性技術(shù)即可見到受試者中的熒光。整體成像是優(yōu)選的，因為它可能允許實時觀察，但也可 以使用例如內(nèi)鏡檢查技術(shù)，或者，如果期望的話，可以切出組織或器官進行直接觀察或免疫 組化觀察。雖然可以使用內(nèi)鏡檢查或者切出單獨組織，但通過熒光成像使完整動物中的細胞 遷移可視化是特別方便的。這容許人們在潛在抗哮喘藥和抗哮喘程序的評估中連續(xù)地實時 觀察和監(jiān)測細胞移行，特別是在模型系統(tǒng)中。因此，與未被施以候選藥物或程序的對照相 比，在被施以候選藥物或程序的試驗動物中直接觀察到細胞移行的抑制，則表明候選藥物 或程序的功效及其作為治療手段的潛力。對于正接受哮喘治療的受試者而言，有了熒光成 像，治療程序的設(shè)計者們就有可能隨時知曉修改程序或不修改該程序的適當(dāng)性。熒光成像(參見Yang, Μ.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002 ；99 38243829)。初 步低分辨率成像使用裝有50W汞燈電源的LZ12型Leica熒光立體顯微鏡。為了同時顯 現(xiàn)GFP和RFP熒光，通過D425/60帶通濾光片和470DCXR分色鏡產(chǎn)生激發(fā)。通過長通濾光 片 GG475 (Chroma Technology, Brattleboro, VT)收集發(fā)射的熒光。在燈箱(light box) (Lightools Research, Encinitas, CA)中進 亍宏觀成像(macroimaging)。 GFP 禾口 RFP 腫瘤的熒光激發(fā)都在燈箱中利用狹縫纖維透鏡(slit fiber optics)通過干涉濾光片 (440+/-20nm)產(chǎn)生。通過520nm長通濾光片觀察熒光。用Hamamatsu C5810 3芯片冷色 CCR照相機(Hamamatsu Photonics Systems,Bridgewater,NJ)捕捉來自顯微鏡的圖像。用 Spectra Physics 3941-M1BB 型雙光子激光器、Photon Technologylntl. GL-3300 型氮氣激光器和Photon Technology Intl. GL-302型染料激光器進行基于激光的成像。處理圖像 的對比度禾口亮度，利用 Image Pro Plus 4· 0 軟件(Media Cybernetics, Silver Springs, Maryland)加以分析。在IBM PC上直接捕捉1024x724像素的高分辨率圖像，或者通過視頻 輸出到SLV-R1000型高分辨率Sony VCR(Sony Corp.，Tokyo Japan)上來連續(xù)捕捉這些圖像。多光子共聚焦顯微術(shù)(multiphoton confocal microscopy) (Wang et al·, Cancer Res. 2002 ；62 6278 6288).還使用了 雙光子激光器(Spectra-Physics3941_MlBB 型)， 其與960nm—對于GFP熒光而言的最優(yōu)波長一的Radiance2000多光子系統(tǒng)(Bio-Rad， Hercules, CA)聯(lián)用。使用Bio-Rad的Lasersharp2000軟件收集圖像。將激發(fā)限制于僅 針對接受觀察的光學(xué)區(qū)域。在非焦平面內(nèi)960nm波長處將沒有熒光團的激發(fā)。Millenia， Tsunami Ti 藍寶石激光器一其是Spectra Physics 3941-M1BB型雙光子激光器的一個附 件一具有長波長透鏡(超過1，OOOnm)用于RFP多光子成像。用Image Pro Plus 4. 0軟件 處理圖像。τ^ β^Ι (Spectral resolution).(Spectral imaging), ^zfe
像素中均含有高分辨率光譜的圖像，以便從GFP標記的細胞中“分離”(unmix)出RFP信號。 對常規(guī)GFP-小鼠成像系統(tǒng)(長通發(fā)射濾光片)進行改造，將通常的彩色照相機替換成冷卻 型單色照相機(Roper Scientific CCDthermo-cooled digital camera)和置于常規(guī)宏鏡 頭之前的液晶可調(diào)濾光片(CRI，Inc.，ffoburn, MA)。典型地，從500到650nm每IOnm拍攝 一系列圖像，在存儲器中自動組裝成光譜“堆?！?stack)。利用預(yù)先定義的GFP或RFP和 自發(fā)熒光光譜，可以利用一種基于線性組合化學(xué)計量學(xué)的算法將圖像解析為不同的圖像， 其中該算法可產(chǎn)生僅包含自發(fā)熒光信號或僅包含GFP或RFP信號的圖像(現(xiàn)在它們在基本 上黑色的背景下是可見的)。利用光譜自發(fā)熒光差減，信噪比得到改善，從而靈敏度得以提 高。通過使用波長選擇性成像技術(shù)和分析方法來對深處器官如肺上的細胞移行進行成像， 可以進一步加強GFP或RFP標記細胞所提供的優(yōu)勢(它們使得非介入式的、高度選擇性的 成像成為可能)(個人通信，Richard Levenson, CRI，Inc.，ffoburn, ΜΑ)。成像深度①印讓of imaging).本申請的一個目的是內(nèi)部器官上的單個細胞或微 觀細胞集落(microscopic colonies of cells)的體夕卜可視化(externalvisualization)。 具有如此能力(power)的成像需要減少激發(fā)和發(fā)射光的散射。為了更深地透入活體動物， 將會使用多光子和單光子激光器。還將與多光子激光器結(jié)合使用共聚焦顯微術(shù)。激發(fā)光的 相對高的波長，約470nm(GFP雙光子為960nm，RFP雙光子為大約1，220nm)，不會破壞組織。 多光子共聚焦系統(tǒng)將會高度限制照射區(qū)域，進一步保護宿主組織。皮瓣也可大大減少散射， 我們已經(jīng)證明它們使得體外單細胞成像成為可能。使用長波長Ds-Red-2-RFP也可減少散 射。給出下面的實施例，它們用來說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。A.方法小鼠.C57BL/6購自 Charles River Laboratories。 C57BL/6_Tg(CAG-EGFP) C14-Y01-FM1310sb (GFP Tg，C57BL/6 背景)小鼠，其在全身表達一種增強的 GFP ((Okabe et al.，F(xiàn)EBS Lett. 1997 ；407 :313_319)，由 Okabe 博士 (Osaka University, Japan)提供。OVA 特異性TCRa β轉(zhuǎn)基因(0Τ2 Tg)小鼠保持在無特定病原體的環(huán)境下。所有動物照管均按照千葉大學(xué)(ChibaUniversity)和Anticancer，Inc的規(guī)章進行。體外Th2細胞分化培養(yǎng)。針對通過細胞分選純化的GFP χ 0Τ2 Tg⑶44ffiOT4+T 細胞(2xl05個)，用抗原性O(shè)VA肽((Loh 15，1 μ M)和經(jīng)照射(3000rad)的C57BL/6抗原 呈遞細胞(IxlO6個)在外源IL-4的存在下進行刺激，如前人所述(Hasegawa et al.，J Immunol. 2006 ；176 :2546_2554)。OVA-致敏、細胞轉(zhuǎn)移和OVA吸入。在第0天和第7天，用含250 μ g OVA (雞卵清蛋 白，Sigma產(chǎn))的4mg氫氧化鋁凝膠(明礬)免疫GFP或RFP Tg小鼠。在14天，使用⑶4+T 細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec)通過磁性負選擇分離來自O(shè)VA致敏的GFP或RFP Tg小 鼠的脾⑶4+T細胞，獲得> 98%的純度。將這些細胞(2xl07個細胞)或OVA特異性Th2細 胞(5xl06個細胞)轉(zhuǎn)移到8周齡C57BL/6受體小鼠的尾靜脈內(nèi)。一天或兩天后，利用超聲 霧化器(NE-U07，Omron Co. Japan)，使受體小鼠吸入氣溶膠化的含OVA的鹽水(10mg/ml)30 分鐘。肺組織學(xué)和免疫組化.在OVA吸入后的標示時間通過CO2窒息處死小鼠，向肺中注 入10% (ν/ν)溶于PBS的福爾馬林或4% (ν/ν)多聚甲醛，用于固定。將肺組織切片、用Η&Ε 試劑染色，在x50或x200的光學(xué)顯微鏡下檢查病理學(xué)改變。將肺標本包埋在Tissue-Tek OCT化合物中，在液氮中冷凍，用冷凍切片機切成6 μ m厚的切片。先后用0.6%過氧化氫和 Biotin-Blocking System試劑(DAKOCytomation)分別封閉內(nèi)源過氧化物酶活性和非特異 性蛋白結(jié)合。將切片與10μ g/ml的倉鼠抗GFP單抗(Serotec)4°C溫育過夜，然后用TBST洗 滌。結(jié)合的Ab通過先后與生物素化的兔抗倉鼠IgG和鏈親合素-HRP溫育，然后與3，3- 二 氨基聯(lián)苯胺(DAKOCytomation)溫育，來加以檢測。然后用水洗滌載玻片并用蘇木精復(fù)染。肺中細胞移行的可視化.在OVA吸入后的不同時間通過CO2窒息處死小鼠。移出 肺，利用0V100 Olympus Whole Mouse Imaging System(全小鼠成像系統(tǒng))監(jiān)測肺表面上 的GFP+和RFP+細胞。用于體內(nèi)動畫(in vivo movie)的激光掃描顯微術(shù).小鼠麻醉后切開氣管。利用 顯微手術(shù)暴露肺。夾住一根右氣管以阻止通氣造成的運動。對左肺人工通氣以保持存活。 利用激光掃描顯微鏡IVioo (Olympus Corp.)監(jiān)測被夾住的右肺。所用的是488-nm氬激光。 為了生成體內(nèi)動畫，以5秒為間隔記錄圖像，持續(xù)40min。規(guī)定多于50%的2D區(qū)域被GFP+ 細胞占據(jù)的區(qū)域為焦點區(qū)域。肺中的運動細胞(motive cells)規(guī)定為遷移或伸長超過直 徑的50%的細胞。統(tǒng)計分析.實驗數(shù)據(jù)表示為平均值及標準偏差。兩個組間的顯著性通過雙尾 (two-tailed) Student t 檢驗來確定。B.結(jié)果實施例1在第O天和第7天用OVA-明礬對GFP Tg小鼠致敏。來自O(shè)VA致敏的GFP Tg和小鼠及未致敏的RFP Tg小鼠的脾⑶4+T細胞經(jīng)純化后， 在第14天注射到正常C57BL/6小鼠中。在第15天，通過氣道施用使受體小鼠暴露于氣溶膠 化OVA變應(yīng)原。在第16天，通過0VA100顯微鏡檢(圖la)對肺表面上的GFP+和RFP+⑶4+T 細胞進行監(jiān)測。注射后隨即有大量的被轉(zhuǎn)移細胞聚集在肺毛細血管中(圖lb)。檢測到了類似數(shù)目的GFP+和RFP+細胞。細胞轉(zhuǎn)移后一天，肺中沒有顯著數(shù)目的GFP+RFP+細胞殘留。然而， OVA吸入后24小時，來自O(shè)VA致敏小鼠的GFP+RFP+T細胞數(shù)顯著增加，其中的一些形成外觀 像⑶4+T細胞團(cluster)的灶(foci)。另一方面，來自未致敏小鼠的RFP+⑶4+T細胞數(shù)沒 有增加(圖lb，c)。這些結(jié)果表明，OVA吸入后⑶4+T細胞向肺中的遷移依賴于OVA初次刺 激的(priming with OVA)。如果用RFP標記經(jīng)致敏的⑶4+T細胞，只有它們在OVA吸入后會積累在肺中，而未 經(jīng)致敏的GFP+CD4+T細胞則不會(圖2a，b)。這些結(jié)果表明積累的差異是不依賴于熒光蛋 白的。當(dāng)將來自用OVA致敏的GFP+Tg小鼠的脾⑶8+T細胞純化后注射到受體小鼠中時， 它們在OVA吸入后也在肺中積累(圖3)。實施例2考察了 OVA吸入后肺中⑶4+T細胞積累的時間過程。將來自O(shè)VA致敏的GFP Tg小鼠的脾⑶4+T細胞注射到受體C57BL/6小鼠中，如實 施例1所述使受體小鼠暴露于變應(yīng)原刺激。在OVA吸入后24小時(圖4a和5a)和72小 時(圖4b和5b)通過0V100顯微鏡檢監(jiān)測肺表面上的GFP+CD4+T細胞。在OVA吸入12小 時時首次檢測到GFP+CD4+T細胞向肺中的遷移，在OVA吸入后第18至36小時時檢測到最大 數(shù)目的CD4+T細胞。雖然嗜酸粒細胞浸潤是變應(yīng)性氣道炎癥的特征，但這里的結(jié)果顯示，變 應(yīng)原刺激后肺中CD4+T細胞的積累發(fā)生在嗜酸粒細胞浸潤之前，并且持續(xù)到變應(yīng)原刺激后 的至少72小時。這種可成像模型被證明對于監(jiān)測炎癥淋巴細胞在患哮喘的肺中的遷移是有用的。 為了測試這種模型對于確定抗變應(yīng)藥有效性的用處，對受體小鼠施用地塞米松，一種強效 的減輕變應(yīng)反應(yīng)的藥物，然后進行變應(yīng)原刺激。在OVA刺激之前1小時向受體小鼠腹膜內(nèi)注射三個不同劑量(0. 4、1和4mg/kg體 重)的地塞米松。OVA吸入后24小時，通過0V100顯微鏡檢監(jiān)測GFP+⑶4+T細胞。與對照 相比，CD4+T細胞向肺中的浸潤以劑量依賴的方式發(fā)生了顯著減少(圖4c和5c)。這些結(jié) 果提示，地塞米松可抑制變應(yīng)原暴露后肺中CD4+T細胞的積累。進行進一步的實驗來測試地塞米松抗變應(yīng)效果的時間范圍。在OVA吸入前1小時 或后1天腹膜內(nèi)注射地塞米松(4mg/kg)，并在OVA吸入后48小時監(jiān)測GFP+⑶4+T細胞。在 兩種情況下GFP+CD4+T細胞的浸潤數(shù)均顯著減少(圖4d和5d)。這些結(jié)果顯示，地塞米松 即使在氣道炎癥之后施用也可抑制CD4+T細胞浸潤。接下來，我們通過IV100顯微鏡檢監(jiān)測了 OVA吸入后肺中GFP+⑶4+T細胞前形態(tài)學(xué) 改變。肺中自發(fā)熒光的內(nèi)皮細胞和GFP+CD4+T細胞均被可視化(圖5e)。在經(jīng)過刺激的肺 中的⑶4+T細胞的平均直徑顯著大于對照(圖4e和5e)。這些結(jié)果表明，浸潤的⑶4+T細 胞是活化的。實施例3為了考察患哮喘的肺中抗原性Th2細胞的動力學(xué)，從來自GFP Tg χ 0T2Tg小鼠的 幼稚CD4+T細胞體外誘導(dǎo)了 OVA特異性的Th2細胞。首先，我們確認了在一次變應(yīng)原刺激后肺中GFP+OVA-特異性Th2細胞的積累。相 比于來自用OVA初次刺激的小鼠的⑶4+T細胞，OVA吸入后肺中GFP+0T2-Th2細胞積累的效率更高(圖6)。含有0T2-Th2細胞的灶數(shù)比含有OVA初次刺激的CD4+T細胞的灶數(shù)多得多 (數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果顯示，體外誘導(dǎo)的0T2-Th2細胞在抗原吸入后在肺中積累的效率更高。接下來，我們進行了 OVA吸入后0T2_Th2細胞積累的時間過程分析。OVA吸入后6 小時，0T2-Th2細胞形成了小的灶。OVA吸入后12小時，灶的數(shù)目和大小有所增加。在非灶 區(qū)域中的GFP+細胞數(shù)也有增加，但直到OVA吸入12小時后增加才明顯。OVA吸入后18小 時灶數(shù)進一步增加，且OVA吸入后12到18小時之間非灶區(qū)域中的GFP+細胞數(shù)顯著增加。 OVA吸入后18小時及之后，各灶的邊緣變得模糊，各灶開始匯合。接下來，我們考察了抗原暴露后肺中0T2_Th2細胞浸潤的動力學(xué)。在OVA吸入前的穩(wěn)定階段中，在肺中沒有觀察到灶，且肺中的0T2_Th2細胞只有 10%是活動的(表1)。通過激光掃描顯微鏡IV100捕捉的體內(nèi)動畫顯示，循環(huán)中的0T2-Th2 細胞數(shù)為14.7士1.5個細胞/讓730!^11(表1)。在肺中積累的循環(huán)中細胞數(shù)為7.0士 1.5 個細胞/mm2/30min，而離開肺的循環(huán)中細胞數(shù)為7. 0士 1. 0個細胞/mm2/30min (表1)。這些 結(jié)果表明，變應(yīng)原特異性的效應(yīng)T細胞在體內(nèi)循環(huán)并且反復(fù)地進入肺，在肺中積累，和離開 肺。進入肺和離開肺的細胞的數(shù)目是相等的，肺中效應(yīng)T細胞數(shù)被保持恒定。在OVA吸入6小時后，發(fā)現(xiàn)了小的灶。與穩(wěn)定階段相比，體內(nèi)動畫顯示循環(huán)中的 0T2-Th2細胞增加到了 33. 3 士 3. 1個細胞/mm2/30min，而積累中的細胞增加到了 14. 7 士 1. 5 個細胞/mm2/30min (表1)。運動細胞的百分比從10 %增加到了 30. 5 %。另一方面，從肺 中離開的0T2-Th2細胞仍然與穩(wěn)定階段一樣。這些觀察結(jié)果表明，到OVA吸入后6小時時， 0T2-Th2細胞在變應(yīng)原誘導(dǎo)下向肺中的遷移和在肺中的積累是上調(diào)的。OVA吸入12小時后，體內(nèi)動畫顯示，出現(xiàn)了更大的灶，且循環(huán)進入肺中的0T2_Th2 細胞進一步增加到44. 7 士4. 5個細胞/mm2/30min (表1)。肺中0T2_Th2細胞的積累進一步 增加到24. 3士2. 5個細胞/mm2/30min，但離開肺的0T2_Th2細胞與穩(wěn)定階段相比沒有顯著 變化(表1)。在肺中積累的0T2-Th2細胞中90%是運動的。這些結(jié)果表明，在OVA吸入后 12小時，0T2-Th2細胞在變應(yīng)原誘導(dǎo)下向肺中的遷移和在肺中的積累是高度上調(diào)的。在OVA吸入后6_12h肺中積累的早期，遷移中的0T2_Th2細胞主要形成灶。肺中 積累中的0T2-Th2細胞的高度運動性提示它們大多數(shù)是活化的。OVA吸入后21小時，體內(nèi)動畫顯示，與OVA吸入后12小時相比，非灶區(qū)域中 0T2-Th2 細胞數(shù)目顯著增加(868. 7士296. 5 對 226. 0士25. 1 個細胞 /mm2/30min)。與 OVA 吸入后12小時相比，進入肺中的循環(huán)的0T2-Th2細胞顯著減少，從44. 7士4. 5減少到 2. 7士0. 6個細胞/mm2/30min(表1)。肺中0T2_Th2細胞的積累和0T2_Th2細胞從肺的離 開在OVA吸入后21小時也顯著減少。超過95%的積累中的細胞是運動的。這些結(jié)果表明， 到OVA吸入后21小時時，0T2-Th2細胞在變應(yīng)原誘導(dǎo)下向肺中的遷移和在肺中的積累是下 調(diào)的。在OVA吸入后12-21小時間的積累后期階段，0T2_Th2細胞除了在灶區(qū)域之外，在 肺的整個區(qū)域都有積累。表1 0T2_Th2細胞在肺的非灶區(qū)域中的積累
12 實施例4最早的動物模型研究提示變應(yīng)性疾病的Th2范式產(chǎn)生Th2細胞因子的Th2細胞 的活化增加，導(dǎo)致嗜酸粒細胞的募集和活化。嗜酸粒細胞在變應(yīng)原刺激后2或3天時浸潤 到肺中，在肺的細支氣管周和血管周區(qū)域形成炎癥灶。我們提出了這樣的假說上述實驗中 觀察到的OVA吸入后Th2細胞的灶區(qū)域可能與嗜酸粒細胞的灶區(qū)域一致(coincide with those ofeosinophils).為了驗證該假說，我們通過變應(yīng)原刺激后肺的免疫組化進行了考 察。將GFP+0T2_Th2細胞靜脈注射轉(zhuǎn)移到C57BL/6小鼠中。兩天后，通過OVA吸入使 受體小鼠暴露于變應(yīng)原刺激。通過H&E染色觀察了嗜酸粒細胞的浸潤和灶形成(圖7a)。 利用抗GFP抗體進行免疫組化檢出了浸潤的0T2-Th2細胞(圖7b)。OVA吸入后24小時， GFP+0T2-Th2細胞浸潤到肺中并形成灶，但嗜酸粒細胞沒有浸潤(圖7)。OVA吸入后48小 時，觀察到炎癥細胞向肺中浸潤，且炎癥細胞與GFP+0T2-Th2細胞的灶區(qū)域是一致的。OVA 吸入后72小時嗜酸粒細胞的浸潤和灶形成仍保持。這些結(jié)果表明在變應(yīng)原暴露后0T2-Th2 細胞早于嗜酸粒細胞浸潤到肺中，并且可能調(diào)節(jié)炎癥灶的形成。
權(quán)利要求
一種用于哮喘的實驗嚙齒動物模型，其中所述嚙齒動物已被供予經(jīng)變應(yīng)原致敏的、熒光標記的淋巴細胞，所述淋巴細胞在誘導(dǎo)了針對所述變應(yīng)原的哮喘反應(yīng)后可以被檢出。
2.權(quán)利要求1的模型，其中所述熒光標記的淋巴細胞是從被針對所述變應(yīng)原致敏的供 體動物收集的。
3.權(quán)利要求1的模型，其中所述熒光標記的淋巴細胞是在體外用所述變應(yīng)原致敏過的 Th2細胞。
4.權(quán)利要求2的模型，其中所述變應(yīng)原選自O(shè)VA、OVA肽、綿羊紅細胞、dsRNA、蟑螂(rBla g2)、房舍塵螨(rDer Π)，房舍塵螨提取物、橄欖花粉(天然和重組Ole el)、煙曲霉提取 物、梯牧草花粉(rPhl p5)、樺樹花粉(rBet vl)、黑麥草花粉(Lol pi)、橄欖花粉提取物、鏈 格孢菌提取物、草本枝孢孢子、屋塵螨提取物、熱凝固的雞蛋清等，或它們的任何組合。
5.權(quán)利要求3的模型，其中所述變應(yīng)原選自0VA、0VA肽、綿羊紅細胞、dsRNA、蟑螂(rBla g2)、房舍塵螨(rDer Π)，房舍塵螨提取物、橄欖花粉(天然和重組Ole el)、煙曲霉提取 物、梯牧草花粉(rPhl p5)、樺樹花粉(rBet vl)、黑麥草花粉(Lol pi)、橄欖花粉提取物、鏈 格孢菌提取物、草本枝孢孢子、屋塵螨提取物、熱凝固的雞蛋清等，或它們的任何組合。
6.權(quán)利要求2的模型，其中所述變應(yīng)原是通過腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、或皮下注射施用的。
7.權(quán)利要求2的模型，其中所述熒光是由于編碼熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因所導(dǎo)致的。
8.權(quán)利要求1的模型，其中所述淋巴細胞是T淋巴細胞。
9.權(quán)利要求8的模型，其中所述淋巴細胞是CD4+T細胞。
10.權(quán)利要求8的模型，其中所述淋巴細胞是Th2細胞。
11.權(quán)利要求8的模型，其中所述淋巴細胞是不同細胞類型的混合物。
12.—種監(jiān)測哮喘反應(yīng)的方法，所述方法包括a)向權(quán)利要求1-11中任一項的嚙齒動物模型施用所述變應(yīng)原；和b)檢測所述嚙齒動物的肺中所述熒光標記的淋巴細胞的存在、不存在或量。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述施用是通過吸入、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下注射 進行的。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述熒光標記的淋巴細胞是通過整體光學(xué)成像檢測的。
15.一種確定候選抗哮喘物質(zhì)的有效性的方法，所述方法包括a)向權(quán)利要求1-11中任一項的嚙齒動物模型施用變應(yīng)原和候選抗哮喘物質(zhì)；b)檢測所述嚙齒動物模型的肺中淋巴細胞的量；和c)比較b)中測定的量與未施用該物質(zhì)的對照嚙齒動物模型中的量，其中b)中模型中的量相比于對照模型的減少表明所述物質(zhì)的抗哮喘效果。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用是通過吸入、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下注射 進行的。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述熒光標記的淋巴細胞是通過整體光學(xué)成像檢測的。
全文摘要
本文描述了一種可成像的哮喘嚙齒動物模型。本發(fā)明提供了一種哮喘嚙齒動物模型，其中嚙齒動物被供予熒光標記的淋巴細胞，此淋巴細胞被針對某種變應(yīng)原致敏，且在該變應(yīng)原誘導(dǎo)了哮喘反應(yīng)后可以被監(jiān)測。提供了監(jiān)測所述哮喘嚙齒動物模型中熒光標記的細胞的移行的方法。還提供了使用所述嚙齒動物哮喘模型測定調(diào)節(jié)哮喘反應(yīng)的候選藥物的有效性的方法。
文檔編號A61K39/395GK101883587SQ200880118742
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日
發(fā)明者中山俊憲, 楊萌, 長谷川明洋 申請人:抗癌公司