專(zhuān)利名稱(chēng)：：供藥學(xué)應(yīng)用的蛋白酶變體的制作方法供藥學(xué)應(yīng)用的蛋白酶變體涉及序列表本申請(qǐng)含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。通過(guò)提述而將計(jì)算機(jī)可讀形式并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種蛋白酶，其與SEQIDNO1的氨基酸1_188具有至少90%的同一性，而且其與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含選自下列取代的至少一個(gè)取代A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L,D；T68A,R,S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；禾口T166A。SEQIDNO1的蛋白酶是來(lái)自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsissp.)的野生型蛋白酶。本發(fā)明還涉及這些蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)的藥學(xué)用途。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的其它例子是治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全(pancreaticexocrineinsufficiency,PEI)、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
背景技術(shù)：
：已知數(shù)種處于胰酶補(bǔ)充物形式的商品化藥物，用于治療胰腺外分泌機(jī)能不全。這些產(chǎn)品的活性成分是消化酶(主要為淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶)，它們?cè)谡Ｇ闆r下在胰腺中生成，并分泌至小腸上部(十二指腸)。此類(lèi)藥物中所使用的酶衍生自?；蜇i胰。WO2005/115445描述了供藥學(xué)應(yīng)用的SEQIDNO:1的蛋白酶及相關(guān)蛋白酶用于例如治療PEI的用途。WO2006/136159描繪了供藥學(xué)應(yīng)用的SEQIDNO:2的脂肪酶及相關(guān)脂肪酶用于例如治療PEI的用途。WO2006/136161描繪了供藥學(xué)應(yīng)用的SEQIDNO:3、4和5的淀粉酶及相關(guān)淀粉酶用于例如治療PEI的用途。源自擬諾卡氏菌屬菌種的蛋白酶(SEQIDNO:1)，及其制備物和其各種工業(yè)應(yīng)用記載于WO88/03947和WO01/58276。相關(guān)蛋白酶記載于W02004/111220、W02004/111222、WO2004/111223、WO2004/111221、W02005/035747、WO2004/111219、WO2005/123911和JP2003284571-A(GENESEQP:ADF43564)。本發(fā)明提供了具有改良性能的新型蛋白酶，例如具有改善的體內(nèi)表觀蛋白質(zhì)消化率、改善的PH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種蛋白酶，其與SEQIDNO1的氨基酸1_188具有至少90%的同一性，而且其與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下列取代的取代A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L,D；T68A,R,S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；禾口T166A。此外，本發(fā)明涉及用作藥物的此類(lèi)蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及此類(lèi)蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。本發(fā)明還涉及此類(lèi)蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)，用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含此類(lèi)蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)連同至少一種藥學(xué)可接受輔助性材料。最后，本發(fā)明涉及用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通過(guò)施用治療有效量的此類(lèi)蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶組合)來(lái)進(jìn)行。發(fā)明詳述塵術(shù)語(yǔ)“^S”在本文中定義為具有蛋白酶活性的多肽。蛋白酶指水解肽鍵的酶。它包括任何屬于EC3.4酶組(包括其13種亞類(lèi)之每一種，這些酶在下文中稱(chēng)為“屬于EC3.4.-·-組”)的酶。EC編號(hào)指來(lái)自NC-IUBMB，AcademicPress,SanDiego,California(包括分別于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；及Eur.J.Biochem.1999，264,610-650中出版的增補(bǔ)1_5)的酶命名法1992。命名進(jìn)行定期補(bǔ)充和更新；參見(jiàn)例如萬(wàn)維網(wǎng)于http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶選自由源自擬諾卡氏菌屬菌種菌株的蛋白酶組成的組。以參數(shù)“同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間的相關(guān)性(relatedness)。出于本發(fā)明的目的，使用來(lái)自EMBOSS包(http//emboss,org)第2.8.0版的Needle程序來(lái)比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列。Needle程序執(zhí)行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中所描述的全局比對(duì)算法。所使用的取代矩陣是BL0SUM62，缺口開(kāi)放罰分是10，而缺口延伸罰分是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列(“發(fā)明序列”；例如SEQIDNO6的氨基酸1_188)與不同氨基酸序列(“外來(lái)序列”；例如SEQIDNO1的氨基酸1-188)之間的同一性程度計(jì)算為兩個(gè)序列的此比對(duì)中的精確匹配數(shù)目除以“發(fā)明序列”的長(zhǎng)度或“外來(lái)序列”的長(zhǎng)度中的最短者。結(jié)果以百分比同一性表示。在“發(fā)明序列”和“外來(lái)序列”在重疊的同一位置中具有相同氨基酸殘基(在下文的比對(duì)例子中，這以“I”表示)時(shí)發(fā)生精確匹配。序列長(zhǎng)度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO6的長(zhǎng)度是188)。在下文純假設(shè)的比對(duì)例子中，重疊是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在該例子中，缺口以“-”標(biāo)示。假設(shè)的比對(duì)例子序列1:ACMSHTWGER_NL_]IIII序列2=HGffGEDANLAMNPS因而，序列1比序列2的同一性的百分比是6/12=0.5，對(duì)應(yīng)于50%。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如下測(cè)定多肽的氨基酸序列與或?qū)鏢EQIDNO=I的氨基酸1-188的同一性百分比，即i)使用Needle程序及BL0SUM62取代矩陣、缺口開(kāi)放罰分10和缺口延伸罰分0.5來(lái)比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列；ii)計(jì)算比對(duì)中精確匹配的數(shù)目；iii)用精確匹配的數(shù)目除以?xún)蓚€(gè)氨基酸序列的最短長(zhǎng)度，并iv)將iii)的除法結(jié)果轉(zhuǎn)化成百分比。以類(lèi)似的方式計(jì)算比，或者與本發(fā)明的其它序列如SEQIDNO:2的氨基酸1-269的同一性百分比。在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO1的氨基酸1_188具有至少90%、至少91%或至少92%；至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度。在本發(fā)明中，采用氨基酸殘基位置的特定編號(hào)方式。編號(hào)系統(tǒng)源自于使用Needle程序及BL0SUM62取代矩陣、缺口開(kāi)放罰分10和缺口延伸罰分0.5(如上文所描述的)與另一個(gè)蛋白酶的氨基酸序列比對(duì)的在SEQIDNO:1中所公開(kāi)的蛋白酶氨基酸序列。對(duì)于與SEQIDNO:1相比的氨基酸取代，使用下列命名法初始氨基酸(在SEQIDN0:1中)、位置(在比對(duì)中)、取代氨基酸(在另一個(gè)蛋白酶中)。因而，用在例如SEQIDNO6中的天冬氨酸⑶對(duì)SEQIDNO1中的谷氨酸(E)的第125位(通過(guò)參照SEQIDNO1)取代稱(chēng)為“E125D”。多處突變由加號(hào)(“+，，)分開(kāi)，例如“T44K+S99P”表示分別用賴(lài)氨酸⑷替換蘇氨酸(T)，和用脯氨酸⑵替換絲氨酸⑶的第44位和第99位突變(如例如在SEQIDNO:8中)。此外，表述如G12D，N，H意味著第12位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)或組氨酸(H)交換。在SEQIDNO=I的第12位中甘氨酸取代為任何其它氨基酸稱(chēng)作“G12”。在SEQIDNO=I的第38位中精氨酸取代為任何其它氨基酸稱(chēng)作“R38”。在SEQIDNO1的第47位中天冬酰胺取代為任何其它氨基酸稱(chēng)作“N47”。在SEQIDNO1的第125位中谷氨酸取代為任何其它氨基酸稱(chēng)作“E125”。在SEQIDNO1的第165位中精氨酸取代為任何其它氨基酸稱(chēng)作“R165”。在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶是酸穩(wěn)定性的，這意味著在對(duì)應(yīng)于A28tl=1.0的稀釋液中，且于37°C在如下緩沖液中溫育2小時(shí)后純的蛋白酶的蛋白酶活性是參照活性的至少40%(或至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少97%)，如使用WO01/58276的實(shí)施例2C中所描述的測(cè)定法(底物Suc_AAPF-pNA，pH9.0，25°C)所測(cè)量的，所述緩沖液為IOOmM琥珀酸、IOOmMHEPESUOOmMCHESUOOmMCABSUmMCaCl2、150mMKC1、0.01%TritonX-100,pH3.5。術(shù)語(yǔ)參照活性指相同蛋白酶以純的形式在對(duì)應(yīng)于A28tl=1.0的稀釋液中于5°C在如下緩沖液中溫育2小時(shí)后的蛋白酶活性，其中所述活性如上文所描述的那樣測(cè)定，所述緩沖液為100mM琥珀酸、IOOmMHEPESUOOmMCHESUOOmMCABS、ImMCaCl2、150mMKCl、0.01%TritonX-100，pH9.0。術(shù)語(yǔ)A280=1.0意味著相對(duì)于緩沖液空白在Icm路徑長(zhǎng)度比色皿中在280nm處產(chǎn)生1.0吸光度的所述純蛋白酶的此類(lèi)濃度(稀釋度)。術(shù)語(yǔ)純的蛋白酶指A28Q/A26Q比率高于或等于1.70(參見(jiàn)W001/58276的實(shí)施例2E)，并且通過(guò)掃描經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠測(cè)量為條帶中至少95%的其掃描強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于所述蛋白酶(參見(jiàn)WO01/58276的實(shí)施例2A)的樣品。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白酶與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO:1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下列取代的取代的蛋白酶=AlT；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L,D；T68A,R,S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下列取代的取代的蛋白酶G12D，N,H；R38T；N47H,T，S；E125D和R165S,H,G,T。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)取代G12D，N,H；特別是G12D的蛋白酶。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)取代Ν47Η，Τ,S；特別是Ν47Η的蛋白酶。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)取代R165S，H，G，T；特別是m65H的蛋白酶。與SEQIDNO:1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下列取代或取代組合的取代的蛋白酶G12D；和(N47H+G48D)。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下組取代組合的取代的蛋白酶(T41A+T68R+V88A)；(G12N+T22A+N23D+N47T+R165H)；和(R14I+R38T+T151I)。與SEQIDNO:1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)選自下列取代或取代組合的取代的蛋白酶R38T、(T44K+S99P)、S69T、(S69T+E125D)、E125D和R165S。與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90%的同一性，而且與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含至少一個(gè)下列取代或取代組合的蛋白酶R38T；T44K和S99P；S69T；S69T和E125D；E125D；和R165S。如下蛋白酶，其與SEQIDNO1的氨基酸1_188相比包含至少一個(gè)下列取代A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L,D；T68A,R,S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；禾口T166A；并且此外其選自下組(a)包含，優(yōu)選具有與SEQIDNO=I的氨基酸1-188具有至少90%同一性的氨基酸序列的蛋白酶；(b)由如下多核苷酸編碼的蛋白酶，所述多核苷酸在非常低的(優(yōu)選低的、中等的、中-高的、高的，或者最優(yōu)選非常高的)嚴(yán)格條件下與如下雜交(i)SEQIDNO1的編碼序列(W02005/035747的SEQIDNO1的核苷酸900-1463，在此通過(guò)提述而并入本文)，或者(ii)(i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(c)SEQIDNO=I的成熟多肽中還包含一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入(優(yōu)選保守性質(zhì)的取代、缺失和/或插入)的變體。非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為于42°C在5XSSPE、0.3%SDS,200微克/ml剪切且變性的鮭精DNA和對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%甲酰胺、對(duì)于中等和中-高嚴(yán)格性為35%甲酰胺或者對(duì)于高和極高嚴(yán)格性為50%甲酰胺中遵循標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行最佳12至24小時(shí)的預(yù)雜交和雜交。使用2XSSC,0.2%SDS，優(yōu)選于45°C(非常低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選于50°C(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選于55°C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選于60°C(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選于65°C(高嚴(yán)格性)，且最優(yōu)選于70°C(非常高的嚴(yán)格性)將載體材料最終清洗三次，每次15分鐘。保守性質(zhì)的氨基酸變化沒(méi)有顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性，而且包括小的缺失，通常為1至約30個(gè)氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸殘基；多至約20-25個(gè)殘基的小的接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一種功能來(lái)促進(jìn)純化的小的延伸，如多組氨酸束(tract)、抗原性表位或結(jié)合域。優(yōu)選地，變體中改變的總數(shù)是18、17或16。更優(yōu)選地，改變的總數(shù)是15，甚至更優(yōu)選14，甚至更優(yōu)選13，甚至更優(yōu)選12，甚至更優(yōu)選11，甚至更優(yōu)選10，甚至更優(yōu)選9，甚至更優(yōu)選8，甚至更優(yōu)選7，甚至更優(yōu)選6，甚至更優(yōu)選5，甚至更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，甚至更優(yōu)選2，且最優(yōu)選1個(gè)氨基酸。通過(guò)改組編碼一種或多種同源親本蛋白酶的一種或多種多核苷酸所生成的變體，其中所述變體包含與親本蛋白酶中選自下組的一個(gè)或多個(gè)位置對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的改變第38位、第44位、第69位、第99位、第125位和第165位，其中所述改變獨(dú)立地對(duì)應(yīng)于對(duì)占據(jù)該位置的氨基酸的取代，且其中所述變體具有蛋白酶活性。術(shù)語(yǔ)“親本”蛋白酶指對(duì)其進(jìn)行修飾，例如取代、插入、缺失和/或截短以生成本發(fā)明的酶變體的蛋白酶。此術(shù)語(yǔ)還指與變體比較和比對(duì)的多肽。親本可以是天然存在(野生型)多肽，或者它可以甚至是通過(guò)任何合適的手段制備的其變體。例如，親本蛋白質(zhì)可以是在氨基酸序列方面已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾或改變的天然存在多肽的變體。親本還可以是由占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種以上備選形式之任一種編碼的多肽的等位變體。術(shù)語(yǔ)“改組”指兩種以上同源核苷酸序列間的核苷酸序列重組，導(dǎo)致重組核苷酸序列(即已經(jīng)進(jìn)行過(guò)改組循環(huán)的核苷酸序列)與起始核苷酸序列相比具有許多改變了的核苷酸。優(yōu)選地，在如本文中和權(quán)利要求書(shū)中所列的本發(fā)明的組合、用途、組合物和方法中使用根據(jù)各個(gè)上文的例子和其它例子的蛋白酶和蛋白酶變體。體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率、pH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性。本發(fā)明的蛋白酶和蛋白酶變體展現(xiàn)出改良的性能，例如改善的體內(nèi)表觀蛋白質(zhì)消化率、改善/改變的PH-比率(pH5.6/pH8)和/或降低的毒性?？梢栽诨加姓T導(dǎo)性PEI的雌性GSttingen迷你豬(Ellegaard)中測(cè)定體內(nèi)表觀蛋白質(zhì)消化率。每天喂養(yǎng)豬兩餐，其含有21.3%蛋白質(zhì)、51.9%淀粉、2.6%脂肪，其優(yōu)選如實(shí)施例4中所描述的那樣組成。豬容許自由獲取水，并且優(yōu)選地，按照1212h光-暗周期圈養(yǎng)在籠中。首先給豬喂養(yǎng)與1升水、0.625gCr2O3(標(biāo)志物)混合的單一250g測(cè)試餐，在喂養(yǎng)前立即向其中混合不同量的SEQIDNO1的參照蛋白酶(0mg、20mg、50mg和120mg酶蛋白/餐)。對(duì)于該試驗(yàn)，本發(fā)明的蛋白酶的劑量為20mg、50mg和120mg/餐。在回腸中第一次出現(xiàn)膳食標(biāo)志物(綠色食糜)后，在冰上收集回腸食糜達(dá)總共8小時(shí)，并于-20°C貯存，之后進(jìn)行分析。在分開(kāi)的測(cè)定之間容許至少一天的沖洗(washout)。將冷凍的回腸食糜樣品冷凍干燥，磨碎，并分析干物質(zhì)(DM)和粗制蛋白質(zhì)。冷凍干燥，接著于103°C溫育8小時(shí)后按重量評(píng)估DM。以氮(N)乘以因數(shù)6.25計(jì)算粗制蛋白質(zhì)。通過(guò)燃燒，優(yōu)選用Dumas燃燒方法，更優(yōu)選使用“VarioMAXCNS”元素分析儀來(lái)測(cè)定氮含量。將Cr2O3氧化成鉻酸鹽，并經(jīng)由365nm處的消光來(lái)計(jì)算鉻含量。根據(jù)實(shí)施例4中所顯示的公式來(lái)計(jì)算表觀盲腸前蛋白質(zhì)消化率，其中Cr2O3和蛋白質(zhì)表示為g/100g干物質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶，優(yōu)選地，消化率(如表觀盲腸前蛋白質(zhì)消化率)與參照蛋白酶的消化率相比在劑量20、50和120mg酶蛋白/餐的至少一種中得到改善。優(yōu)選地，改善是至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%。更優(yōu)選地，改善是至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%或至少20%。甚至更優(yōu)選地，改善是至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%或至少26%。此外，可以從個(gè)體回歸曲線(xiàn)(表觀盲腸前蛋白質(zhì)消化率對(duì)酶劑量)外推分別實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)所需要的蛋白酶量(mg)。分別通過(guò)用實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)所需要的參照蛋白酶量(mg)除以實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(%CNA)所需要的變體蛋白酶量(mg)來(lái)計(jì)算改善因數(shù)50和60(IF50和IF60)。如此，對(duì)于參照蛋白酶，IF50和IF60都是1.00。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶，優(yōu)選地，IF50和/或IF60值是至少1.05、至少1.10、至少1.15、至少1.20、至少1.25、至少1.30、至少1.35、至少1.40、至少1.45或至少1.50。關(guān)于更多細(xì)節(jié)，參見(jiàn)實(shí)施例4。用酪蛋白作為底物，更具體地，用標(biāo)記有合適的紅色熒光染料的酪蛋白衍生物測(cè)SpH-比率，所述合適的紅色熒光染料優(yōu)選是pH不靈敏的(例如在pH5.6-8.0的范圍中)。熒光增強(qiáng)與蛋白酶活性成比例。優(yōu)選的PH8.0測(cè)定緩沖液是IOOmMTris/堿，并且可以通過(guò)混合25ml0.2M琥珀酸與37.5ml0.2MNa0H來(lái)制備優(yōu)選的pH5.6測(cè)定緩沖液。于合適的溫度(例如室溫，例如22°C)進(jìn)行溫育達(dá)合適的時(shí)間期限(例如60分鐘)，優(yōu)選的熒光染料是B0DIPYTR-X，在該情況中可以使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素濾器(激發(fā)=590nm，發(fā)射=635nm)來(lái)測(cè)定所得的熒光肽。對(duì)本發(fā)明的蛋白酶和SEQIDN0:1的參照蛋白酶測(cè)定pH5.6活性與PH8.0活性的比率，并計(jì)算相對(duì)于參照蛋白酶的比率的本發(fā)明蛋白酶的比率。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白酶具有1以上，優(yōu)選至少1.05，至少1.10，至少1.15，至少1.20，或至少1.25的相對(duì)于參照蛋白酶比率的所述比率。關(guān)于更多詳情，參見(jiàn)實(shí)施例3。毒性可以作為對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系如HT-29細(xì)胞(例如DSMZ號(hào)ACC299)的體外毒性來(lái)測(cè)定。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS(例如來(lái)自Sigma，產(chǎn)品目錄編號(hào)F-6178)的McCoy氏5A培養(yǎng)基(例如來(lái)自Cambrex)中優(yōu)選以4·104個(gè)細(xì)胞/孔/200μ1的密度在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。使細(xì)胞適應(yīng)各孔24小時(shí)后，在補(bǔ)充有0.5g/lProbumin(Millipore)U%胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒補(bǔ)充物(例如來(lái)自Invitrogen)和青霉素和鏈霉素(例如來(lái)自Invitrogen)的無(wú)血清培養(yǎng)基(例如DMEM:F12，Invitrogen)中以2倍稀釋一式三份以9種不同濃度(w/vol酶蛋白)添加蛋白酶，并再溫育24小時(shí)。通過(guò)細(xì)胞的代謝能力來(lái)測(cè)量成活力，其通過(guò)使用AlamarBlue(例如來(lái)自Invitrogen)測(cè)量來(lái)進(jìn)行。最大代謝活性(100%)以對(duì)照(沒(méi)有添加蛋白酶)的代謝活性來(lái)測(cè)定。對(duì)于要測(cè)試的給定蛋白酶，其毒性比率計(jì)算為對(duì)這種蛋白酶獲得50%的最大代謝活性時(shí)的濃度除以對(duì)參照蛋白酶(SEQIDNO1)獲得50%的最大代謝活性時(shí)的濃度。對(duì)于本發(fā)明的蛋白酶，毒性比率優(yōu)選是至少1.1，優(yōu)選至少1.2，優(yōu)選至少1.3，優(yōu)選至少1.4，優(yōu)選至少1.5，優(yōu)選至少1.6，優(yōu)選至少1.7，優(yōu)選至少1.8，優(yōu)選至少1.9，最優(yōu)選至少2.0。在實(shí)施例6中解釋毒性比率。已經(jīng)對(duì)體內(nèi)和體外毒性結(jié)果發(fā)現(xiàn)良好的關(guān)聯(lián)。在更進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，任選地，可以使用另外的蛋白酶，例如哺乳動(dòng)物蛋白酶，例如處于來(lái)自豬的胰提取物形式，或者微生物蛋白酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌書(shū)(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)或根霉屬(Rhizopus)ο具體地，蛋白酶可以源自曲霉屬，如米曲霉(Aspergillusoryzae)或蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)的菌株,特另ll是商業(yè)上可從AmanoPharmaceuticals,Japan得到的產(chǎn)品Prozyme6TM(中性、堿性蛋白酶EC3.4.21.63)?；虻目私岛鸵胪蛔兛梢允褂糜糜诳寺』蚝鸵胪蛔?隨機(jī)的和/或定點(diǎn)的)的標(biāo)準(zhǔn)方法，以獲得酶和酶變體如本發(fā)明的蛋白酶變體?？梢允褂迷O(shè)計(jì)成包含限制位點(diǎn)的引物來(lái)擴(kuò)增感興趣的基因(例如WO2005/035747的SEQIDNO:1，其是編碼本文中的SEQIDNO:1的基因)。關(guān)于合適技術(shù)的進(jìn)一步描述，參考Sambrook等(1989)，Molecularcloning=Alaboratorymanual,ColdSpringHarborlab.,ColdSpringHarbor,NY；Ausubel,F.M.等(編)"CurrentprotocolsinMolecularBiology".JohnffileyandSons,1995；Harwood,C.R.禾口Cutting，S.M.(編)"MolecularBiologicalMethodsforBacillus，，·JohnWileyandSons，1990，及WO96/34946。出于克隆目的使用相關(guān)限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化感興趣的基因和上文的質(zhì)粒后，可以在牽涉連接酶的連接方法中連接感興趣的基因和質(zhì)粒。連接酶反應(yīng)后，可以使用連接混合物來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，如Ausubel，F(xiàn).Μ.等中所述?？梢栽谝后w培養(yǎng)基中或在固體瓊脂板上繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，可以自經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞挽救質(zhì)粒，并用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(B.subtilis)細(xì)胞?？梢赞D(zhuǎn)化合適的感受態(tài)芽孢桿菌細(xì)胞如MB1510，其為168-衍生物(例如可從BGSC以登錄號(hào)lA1168trpC2得到)，如WO03/095658中所述。可以使用用于文庫(kù)構(gòu)建的大腸桿菌質(zhì)粒攜帶的整合盒進(jìn)行芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化。方法詳細(xì)記載于WO03/095658?；蛘撸梢允褂皿w外擴(kuò)增的PCR-SOE產(chǎn)物(Melnikov和Youngman,NucleicAcidResearch27,1056)。質(zhì)粒載體可以含有下列元件i)信號(hào)肽編碼區(qū)(例如獲自芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)的基因和枯草芽孢桿菌prsA)，接著有SEQIDN0:1的擬諾卡氏菌屬菌種蛋白酶的前域(pro-domain)(W02005/035747的SEQIDNO:1的殘基405-899)和成熟的蛋白酶變體基因。此序列之前可以為且可操作連接至ii)包含mRNA穩(wěn)定區(qū)段(例如衍生自CryIIIa基因，如WO1999/043835中所示)的DNA序列；iii)標(biāo)志物基因(例如氯霉素抗性基因)；和iv)分別作為多核苷酸上游和下游5’和3’側(cè)翼區(qū)段的來(lái)自枯草芽孢桿菌的基因組DNA，以通過(guò)側(cè)翼區(qū)段與芽孢桿菌屬基因組間的同源重組實(shí)現(xiàn)基因組整合。本發(fā)明的蛋白酶可以與脂肪酶組合使用。在本語(yǔ)境中，脂肪酶指羧酸酯水解酶EC3.1.1.-，其包括如下活性，如EC3.1.1.310三?；视椭久?、EC3.1.1.4磷脂酶Al、EC3.1.1.5溶血磷脂酶、EC3.1.1.26半乳糖脂肪酶、EC3.1.1.32磷脂酶Al、EC3.1.1.73阿魏酸酯酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，脂肪酶是EC3.1.1.3三?；视椭久?。在具體的實(shí)施方案中，脂肪酶是哺乳動(dòng)物脂肪酶，例如為來(lái)自豬的胰提取物形式，或者微生物脂肪酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉屬。具體地，脂肪酶可源自根霉屬，如爪哇根霉(Rhizopusjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)或德氏根霉(Rhizopusdelemar)的菌株，例如商業(yè)上可從AmanoPharmaceuticals,Japan得到的產(chǎn)品脂肪酶DAmano2000(也稱(chēng)作脂肪酶D2)。在另外的具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的脂肪酶是重組生成的微生物脂肪酶，例如源自真菌如腐質(zhì)霉屬(Humicola)或根毛霉屬(Rhizomucor)，酵母如假絲酵母屬(Candida)，或者細(xì)菌如假單胞菌屬。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶衍生自疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginose)或曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的菌株。疏棉狀腐質(zhì)霉(同物異名細(xì)毛嗜熱霉(ThermomycesIanuginosus))脂肪酶記載于EP305216，而特定的脂肪酶變體記載于例如WO92/05249、W092/19726、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、W099/42566、WO00/32758、WO00/60063、WO01/83770、WO02/055679、WO02/066622和WO2006/136159。真菌脂肪酶的更進(jìn)一步的例子是記載于EP785994的來(lái)自特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)的角質(zhì)酶，和記載于EP869167的來(lái)自尖鐮孢(Fusariumoxysporum)的磷脂酶。酵母脂肪酶的例子是來(lái)自南極假絲酵母(CandidaAntarctica)的脂肪酶A和B，其中脂肪酶A記載于EP652945，而脂肪酶B由例如Uppenberg等在Structure，2(1994)，293中描述。細(xì)菌脂肪酶的例子是源自洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)的脂肪酶，其描述于EP214761。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶與也記載于WO2006/136159中的SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶至少70%相同。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，與SEQIDNO:2的氨基酸1-269的同一性程度是至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。包含(優(yōu)選具有)下列氨基酸序列的脂肪酶是優(yōu)選的(i)SEQIDN0:2的氨基酸+1至+269，(ii)SEQIDNO2的氨基酸_5至+269，(iii)SEQIDNO2的氨基酸_4至+269；(iv)SEQIDNO2的氨基酸_3至+269；(v)SEQIDNO2的氨基酸_2至+269；(vi)SEQIDNO2的氨基酸-1至+269，(vii)SEQIDNO2的氨基酸+2至+269，以及(viii)(i)-(vii)的兩種以上脂肪酶的任何混合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，脂肪酶選自(i)，(ii)的脂肪酶和(i)和(ii)的任何混合物。(i)和(ii)的優(yōu)選混合物包含至少5%，優(yōu)選至少10%、20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%、90%或至少95%的脂肪酶⑴，百分比是通過(guò)使用Edman方法進(jìn)行的N端測(cè)序而確定的，如W02006/136159的實(shí)施例5中所描述的。其它優(yōu)選的混合物是(a)包含35-75%，優(yōu)選40-70%，更優(yōu)選45-65%的脂肪酶(ii)的組合物；(b)包含20-60%，優(yōu)選25-55%，更優(yōu)選30-50%，最優(yōu)選35-47%的脂肪酶(i)的組合物；(c)包含多至30%，優(yōu)選多至25%，更優(yōu)選多至20%，最優(yōu)選多至16%的脂肪酶(vii)的組合物；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任何組合，如包含45-65%的脂肪酶(ii)、35-47%的脂肪酶⑴和多至16%的脂肪酶(vii)的組合物。在一個(gè)更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶(如哺乳動(dòng)物胰脂肪酶)是1，3_位特異性脂肪酶。本發(fā)明的蛋白酶(會(huì)有或不含有如上文所述的脂肪酶)也可以與淀粉酶組合使用。在本語(yǔ)境中，淀粉酶是催化對(duì)淀粉和其它線(xiàn)性和分支寡糖和多糖的內(nèi)水解的酶。淀粉的直鏈淀粉部分富含1，4-a-糖苷鍵，而支鏈淀粉部分分支更多，不僅含有l(wèi)，4_a-而且含有l(wèi)，6-a_糖苷鍵。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，淀粉酶是一種屬于EC3.2.1.1組的酶。在具體的實(shí)施方案中，淀粉酶是哺乳動(dòng)物淀粉酶，例如為來(lái)自豬的胰提取物形式，或者微生物淀粉酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌株，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉jMo具體地，淀粉酶可以源自曲霉屬，如黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉或蜂蜜曲霉的菌株，例如商業(yè)上可從AmanoPharmaceuticals,日本得到的源自米曲霉的產(chǎn)品淀粉酶A1或商業(yè)上可從Extract-Chemie，德國(guó)得到的源自蜂蜜曲霉的淀粉酶EC之任一種。真菌淀粉酶的其它例子是黑曲霉淀粉酶(SWISSPROTP56271)(其也記載于W089/01969的實(shí)施例3中)，和米曲霉淀粉酶。米曲霉淀粉酶的變體的例子記載于TO01/34784。源自地衣芽孢桿菌的a-淀粉酶是細(xì)菌a-淀粉酶的例子。在例如W099/19467中描述了此淀粉酶，連同源自例如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和嗜熱脂肪芽孢桿菌的其它同源性細(xì)菌a-淀粉酶，以及其變體。另外的淀粉酶變體的例子是記載于美國(guó)專(zhuān)利No.4，933，279；EP722490，EP904360，及W02006/136161的那些。優(yōu)選的淀粉酶是⑴包含SEQIDNO5的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或1-486)、SEQIDNO3的氨基酸1-481和/或SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，淀粉酶是具有或包含如下氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列與下列任一項(xiàng)至少70%相同(i)SEQIDN05的氨基酸1-513，(ii)SEQIDNO3的氨基酸1-481，和/或(iii)SEQIDNO4的氨基酸1-483。SEQIDNO:3_5的淀粉酶可以例如如TO2006/136161中所描述的那樣制備。在(i)、(ii)或(iii)任一項(xiàng)的其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，同一性程度是至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。一般而言，根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶(下文為“酶”)可以是自動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物(例如人或豬酶)；自植物，或自微生物獲得的天然的或野生型的酶，而且還可以是其展現(xiàn)出想要的酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成酶，如改組酶(shuffledenzyme)，禾口共有酶(consensusenzyme)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，酶是低變應(yīng)原性變體，其被設(shè)計(jì)成在暴露于動(dòng)物(包括人)時(shí)引起降低的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)免疫應(yīng)答應(yīng)當(dāng)理解為由暴露于酶的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的任何反應(yīng)。一類(lèi)免疫應(yīng)答是變應(yīng)性應(yīng)答，導(dǎo)致暴露動(dòng)物中的IgE水平升高。可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)制備低變應(yīng)原性變體。例如，可以將酶與聚合物模塊(moieties)綴合，所述聚合物模塊屏蔽(shield)免疫應(yīng)答中牽涉的酶的部分或表位。與聚合物的綴合可以牽涉聚合物與酶的體外化學(xué)偶聯(lián)，例如如W096/17929、W098/30682、W098/35026和/或W099/00489中所述。另外/或者，綴合可以牽涉聚合物與酶的體內(nèi)偶聯(lián)?？梢匀缦聦?shí)現(xiàn)此類(lèi)綴合，即遺傳改造編碼酶的核苷酸序列，在酶中插入編碼額外的糖基化位點(diǎn)的共有序列，并在能夠使酶糖基化的宿主中表達(dá)酶，參見(jiàn)例如W000/26354。提供低變應(yīng)原性變體的另一種方式是遺傳改造編碼酶的核苷酸序列，從而引起酶自我寡聚體化，實(shí)現(xiàn)酶單體可屏蔽其它酶單體的表位，由此降低寡聚物的抗原性。此類(lèi)產(chǎn)物及其制備記載于例如WO96/16177?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法如記載于WO00/26230和WO01/83559中的噬菌體展示方法，或記載于EP561907中的隨機(jī)方法來(lái)鑒定免疫應(yīng)答中牽涉的表位。一旦鑒定出表位，便可以通過(guò)已知的基因操作技術(shù)如定點(diǎn)誘變(參見(jiàn)例如WO00/26230，W000/26354和/或WO00/22103)來(lái)改變其氨基酸序列以產(chǎn)生改變的酶免疫學(xué)特性，和/或可以與表位足夠接近地完成聚合物的綴合以使聚合物屏蔽表位。在具體的實(shí)施方案中，蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶⑴在PH4-8，優(yōu)選還有在PH3-4，更優(yōu)選在ρΗ3·5是穩(wěn)定的；(ii)在pH4-9，優(yōu)選4-8,更優(yōu)選在ρΗ6·5是有活性的；(iii)針對(duì)通過(guò)胃蛋白酶和其它消化性蛋白酶(如胰腺蛋白酶，即主要為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)進(jìn)行的降解是穩(wěn)定的；和/或(iv)在存在膽汁鹽的情況中是穩(wěn)定的和/或有活性的。術(shù)語(yǔ)“與...組合”指根據(jù)本發(fā)明組合使用蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶。組合使用可以是同時(shí)的、重疊的或順序的，這三個(gè)術(shù)語(yǔ)一般按照內(nèi)科醫(yī)生開(kāi)出的處方進(jìn)行解讀。術(shù)語(yǔ)“同時(shí)的”指所述酶同時(shí)有活性所處的情況，例如在它們同時(shí)作為一種或多種分開(kāi)的藥用產(chǎn)品施用時(shí)，或者若它們?cè)谕环N藥物組合物中施用。術(shù)語(yǔ)“順序的”指一種和/或兩種酶首先起作用，隨后為第二種和/或第三種酶的此類(lèi)情況。順序作用可以通過(guò)如下獲得作為分開(kāi)的藥物配制物以想要的時(shí)間間隔，或者作為其中所討論的酶進(jìn)行有差別地配制(分隔)(例如著眼于獲得不同的釋放時(shí)間，提供改善的產(chǎn)品穩(wěn)定性，或者優(yōu)化酶劑量)的一種藥物組合物施用所討論的酶。術(shù)語(yǔ)“重疊”指這樣的情況，酶活性期間既不是完全同時(shí)也不是完全順序，即有某段期間所述酶兩者或全部是有活性的。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或一種”例如在本發(fā)明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的語(yǔ)境中使用時(shí)意味著至少一個(gè)或一種。在具體的實(shí)施方案中，“一個(gè)或一種”意味著“一個(gè)或一種或多個(gè)或多種”或“至少一個(gè)或一種”，其又指一個(gè)或一種、兩個(gè)或兩種、三個(gè)或三種、四個(gè)或四種、五個(gè)或五種等。以參數(shù)“同一性”(其在上文詳細(xì)描述(在蛋白酶部分))描述兩種氨基酸序列之間的相關(guān)性。定義和方法同樣也可應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明使用的脂肪酶和淀粉酶?？梢允褂萌魏魏线m的測(cè)定法來(lái)測(cè)量本發(fā)明的酶活性。一般而言，測(cè)定PH和測(cè)定溫度應(yīng)當(dāng)適應(yīng)所討論的酶。測(cè)定pH值的例子是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12。測(cè)定溫度的例子是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95°C。本文實(shí)施例1中包括合適的酶(主要為蛋白酶)測(cè)定法的例子，關(guān)于合適的脂肪酶和淀粉酶測(cè)定法，還可分別參考WO2006/136159和WO2006/136161。MM在本語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“藥物”指治療、預(yù)防和/或減輕疾病癥狀，優(yōu)選治療和/或減輕疾病癥狀的化合物或化合物的混合物。藥物可以是內(nèi)科醫(yī)生開(kāi)出處方的，或者它可以是非處方產(chǎn)品。藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)手段來(lái)實(shí)施本發(fā)明酶的分離、純化和濃縮。例如，它們可以通過(guò)常規(guī)方法(包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)自發(fā)酵培養(yǎng)液回收，并通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法(包括但不限于層析(例如離子交換、親合、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如制備等電聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取)來(lái)進(jìn)一步純化(參見(jiàn)例如ProteinPurification，J._C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。例如，SEQIDNO:2的脂肪酶可以基于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，869，438制備，即通過(guò)在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)作為該美國(guó)專(zhuān)利的SEQIDN0:1的相應(yīng)修飾的DNA序列來(lái)進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)進(jìn)行此類(lèi)修飾，如本領(lǐng)域中公知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分開(kāi)制備各種酶的濃縮的固體或液體制備物。也可以(至少部分)分開(kāi)配制這些濃縮物，如下文更為詳細(xì)地解釋的。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的藥物組合物中以固體濃縮物形式并入酶?？梢酝ㄟ^(guò)正如本領(lǐng)域中已知的多種方法使酶達(dá)到固體狀態(tài)。例如，固體狀態(tài)可以是晶體的(其中酶分子以高度有序形式排列)，或沉淀物(其中酶分子以有序性較小，或混亂形式排列)。例如，可以在接近酶pi的pH和在低電導(dǎo)率(例如lOmS/cm或更小)時(shí)進(jìn)行結(jié)晶，如EP691982中所描述的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的脂肪酶是晶體脂肪酶，其可以如EP600868B1的實(shí)施例1中所描述的那樣制備。此外，可以如TO2006/044529中所描述的那樣交聯(lián)脂肪酶晶體。多種沉淀方法是本領(lǐng)域中已知的，包括用鹽(如硫酸銨和/或硫酸鈉)；用有機(jī)溶劑，如乙醇和/或異丙醇；或者用聚合物，如PEG(聚乙二醇)進(jìn)行沉淀。在備選方案中，可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法(例如凍干、蒸發(fā)(例如在減壓下)和/或噴霧干燥)通過(guò)除去溶劑(通常為水)自溶液沉淀酶。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，酶的固體濃縮物相對(duì)于固體濃縮物的總蛋白質(zhì)含量具有至少50%(w/w)的活性酶蛋白含量。在更進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，相對(duì)于固體濃縮物總蛋白質(zhì)含量的活性酶蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%(w/w)。可以測(cè)量蛋白質(zhì)含量，正如本領(lǐng)域中已知的，例如通過(guò)使用例如來(lái)自BI0-RAD的GS-800校準(zhǔn)密度計(jì)對(duì)經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行密度計(jì)掃描；通過(guò)使用商業(yè)上可從Roche得到的商業(yè)試劑盒，如蛋白質(zhì)測(cè)定ESL，訂單號(hào)1767003；或者基于W001/58276的實(shí)施例8中所述的方法來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選地，酶蛋白構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明使用的固體酶濃縮物的蛋白質(zhì)譜的至少50%，更優(yōu)選至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97%，如通過(guò)對(duì)經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠的密度計(jì)掃描所測(cè)量的。此類(lèi)酶可以稱(chēng)作“分離的”酶或多肽。本發(fā)明的藥物組合物包含酶，優(yōu)選處于濃縮的酶制備物形式，更優(yōu)選固體濃縮物，連同至少一種藥學(xué)可接受的輔助性或補(bǔ)充性材料，如(i)至少一種載體和/或賦形劑；或(ii)至少一種載體、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。任選的其它成分(均為藥學(xué)可接受)的非限制性例子是崩解齊IJ、滑潤(rùn)齊IJ、緩沖齊IJ、濕潤(rùn)劑、防腐劑、調(diào)味齊IJ、溶劑、增溶齊IJ、懸浮齊IJ、乳化劑、穩(wěn)定劑、推進(jìn)劑和媒介物。一般而言，特別取決于所討論的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥，可以針對(duì)本領(lǐng)域中已知的所有施用方式，優(yōu)選包括腸施用(經(jīng)由消化道)來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明的組合物。如此，組合物可以處于固體、半固體、液體或氣體形式，如片劑、膠囊、粉劑、粒劑、微球、軟膏劑、乳劑(cream)、泡沫、14溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、洗劑(lotion)和氣溶膠。醫(yī)學(xué)從業(yè)人員會(huì)知道選擇最合適的施用路徑，而且當(dāng)然會(huì)避免潛在有危險(xiǎn)的或其它方面不利的施用路徑。因此以下方法和輔助性材料僅僅是例示性的，而決不是限制性的。對(duì)于固體口服制品，酶可以單獨(dú)地或者與合適于制備丸劑(pellet)、微丸劑(micropellet)、片劑、微片劑、粉劑、粒劑或膠囊的添加劑，例如與常規(guī)的載體如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與賦形劑或粘合劑，如晶體或微晶、纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠(acacia)、玉米淀粉或明膠；與崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與滑潤(rùn)劑，如加拿巴蠟(carnaubawax)、白蠟、蟲(chóng)膠(shellac)、無(wú)水膠質(zhì)硅石、1500至20000的聚乙二醇(PEG，也以術(shù)語(yǔ)Macrogol為人所知)，特別是PEG4000、PEG6000、PEG8000，聚乙烯吡咯酮(povidone)、滑石、甘油單油酸酯(monolein)或硬脂酸鎂；而且若想要的話(huà)，與稀釋劑、佐劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑如對(duì)羥基苯甲酸甲酯(E218)、著色劑如二氧化鈦(E171)和調(diào)味劑如蔗糖、糖精、橙油、檸檬油和香草醛組合使用。口服制劑是用于治療PEI的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的優(yōu)選制劑的例子。相當(dāng)通常地，也可以將酶配制成液體口服制劑，其通過(guò)將它們?cè)谒匀軇┤缢?，或非水性溶劑如植物油或其它?lèi)似的油、合成的脂族酸甘油酯、高級(jí)脂肪酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG4000或低級(jí)醇如線(xiàn)性或分枝的C1-C4醇，例如2-丙醇中溶解、懸浮或乳化來(lái)進(jìn)行；而且若想要的話(huà)，與常規(guī)的補(bǔ)充性材料或添加劑如增溶劑、佐劑、稀釋劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起配制。脂質(zhì)體作為遞送媒介物的用途是可能普遍感興趣的另一種方法。脂質(zhì)體與靶位點(diǎn)的細(xì)胞融合，并在細(xì)胞內(nèi)遞送腔內(nèi)容物。使用多種用于維持接觸的手段如分離、結(jié)合劑等來(lái)維持脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間以進(jìn)行融合。在本發(fā)明的一方面，將脂質(zhì)體設(shè)計(jì)成為氣溶膠化的以進(jìn)行肺施用?？梢杂媒閷?dǎo)膜融合的純化蛋白質(zhì)或肽，如仙臺(tái)病毒或流感病毒等來(lái)制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)可以是已知的脂質(zhì)體形成脂質(zhì)(包括陽(yáng)離子或兩性離子脂質(zhì)，如磷脂酰膽堿)的任何有用組合。剩余的脂質(zhì)通常會(huì)是中性或酸性脂質(zhì)，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。對(duì)于制備脂質(zhì)體，可以使用由Kato等(1991)J.Biol.Chem.266:3361所描述的方法。可以提供用于口服或直腸施用的單位劑量形式如糖漿劑、酏劑、粉劑和懸浮液，其中每個(gè)劑量單位例如茶匙量(teaspoonful)、湯匙量(tablespoonful)、膠囊、片劑或栓劑含有預(yù)先確定量的酶。類(lèi)似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑量形式可以在作為無(wú)菌水、正常鹽水或另一種藥學(xué)可接受載體中的溶液的組合物中包含酶。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指對(duì)于人和動(dòng)物受試者適合作為單一劑量的物理離散單元，每個(gè)單元含有足以產(chǎn)生想要效果的量的預(yù)先確定量的酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于腸(優(yōu)選口服)施用。在另外的具體實(shí)施方案中，口服組合物是(i)含有酶晶體的液體組合物；(ii)(高度)純化的酶的沉積物的液體懸浮液；(iii)含有固體或溶解形式的酶的凝膠；(iv)固定化酶或吸附至顆粒等的酶的液體懸浮液；或(v)處于含酶粉末、丸狀、顆?；蛭⑶蛐问?，若想要的話(huà)，處于片劑、膠囊等(任選地，其用例如酸穩(wěn)定性涂層)形式的固體組合物。在組合物的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依靠例如分開(kāi)涂層將酶分隔，即彼此分開(kāi)。在組合物的一個(gè)更進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，將蛋白酶與組合物的其它酶成分如脂肪酶和/或淀粉酶分開(kāi)。酶劑量會(huì)隨要施用的特定酶、施用頻率、施用方式、癥狀嚴(yán)重性和受試者對(duì)副作用的易感性等而廣泛變化。一些特定的酶能比其它酶更有力。本發(fā)明酶的固體口服制劑的例子包括(i)具有SEQIDNO:6、7、8、9、10或11的蛋白酶；(ii)與SEQIDNO:2的氨基酸1-269具有至少70%同一性的脂肪酶；和/或(iii)與選自下組的淀粉酶具有至少70%同一性的淀粉酶a)具有SEQIDNO5的氨基酸1-513的淀粉酶，b)具有SEQIDNO3的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶。在本發(fā)明的更優(yōu)選的固體口服制劑中，(ii)脂肪酶包含SEQIDNO2的氨基酸1-269，而(iii)淀粉酶包含SEQIDNO5的氨基酸1_486。(i)、(ii)和(iii)的酶的預(yù)期每日臨床劑量的例子如下(均按每kg體重(bw)mg酶蛋白計(jì))對(duì)于⑴的蛋白酶0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.l_50mg/kgbw；對(duì)于(ii)的脂肪酶0.01-1000,0.05-500,0.1-250或0.5-100mg/kgbw；對(duì)于(iii)的淀粉酶0.001-250、0·005-100、0·01-50或0.05-10mg/kgbw，優(yōu)選對(duì)于⑴的蛋白酶0·05-100、0.1-50或0.5-25mg/kgbw；對(duì)于(ii)的脂肪酶0.1-250,0.5-100或l_50mg/kgbw；而對(duì)于(iii)的淀粉酶0.01-50,0.05-10或0.l_5mg/kgbw。為了關(guān)于口服的更大穩(wěn)定性，可以修飾酰胺(肽)鍵，以及氨基和羧基端。例如，可以使羧基端酰胺化?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的酶摻入丸劑中來(lái)準(zhǔn)備適合于治療消化性病癥、PEI、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的本發(fā)明藥物組合物的具體實(shí)施方案。丸劑一般可包含10-90%(w/w，相對(duì)于所得丸劑的干重)的生理學(xué)可接受的有機(jī)聚合物、10-90%(w/w，相對(duì)于所得丸劑的干重)的纖維素或纖維素衍生物，和80-20%(w/w，相對(duì)于所得丸劑的干重)的酶，有機(jī)聚合物、纖維素或纖維素衍生物和酶的總量在每種情況中達(dá)到100%。生理學(xué)可接受的有機(jī)聚合物可以選自下組聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羥丙基甲基纖維素、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯的共聚物和所述有機(jī)聚合物的混合物。優(yōu)選聚乙二醇4000作為生理學(xué)可接受有機(jī)聚合物。纖維素或纖維素衍生物可以例如選自纖維素、乙酸纖維素、纖維素脂肪酸酯、硝酸纖維素、纖維素醚、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、甲基乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素。優(yōu)選纖維素，特別是微晶纖維素作為纖維素或纖維素衍生物。可以用合適的腸溶衣、其它非功能性涂層包被或者在沒(méi)有此類(lèi)涂層的情況中直接地使用所得的丸劑。此外，可以在具有合適大小的膠囊(如硬明膠膠囊或無(wú)明膠膠囊)中填充所得的丸劑，用于治療如上文更為詳細(xì)地描述的病癥或疾病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將自不同酶類(lèi)型，特別自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶生成的丸劑填充入所述膠囊中。在用不同酶類(lèi)型填充膠囊時(shí)，可以使單一酶類(lèi)型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的劑量給料(dosing)適應(yīng)于某一適應(yīng)癥組或某一患者亞組的特定需要，其通過(guò)將規(guī)定量的任何脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶添加至膠囊來(lái)實(shí)現(xiàn)，即可以生成在其脂肪酶蛋白酶淀粉酶比率方面有所變化的膠囊。WO2005/092370中描述了本發(fā)明蛋白酶的優(yōu)選的藥物組合物，特別是包含其中所提及的優(yōu)選賦形劑的配制物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物包含單、二和三?；视王ズ椭咀錍6-C22羧酸的聚乙二醇(PEG)單酯和二酯的Macrogol甘油酯混合物，和還有可能的小比例的甘油和游離的聚乙二醇。優(yōu)選地，Macrogol甘油酯混合物中含有的聚乙二醇(PEG)是具有每個(gè)分子平均6至最多40個(gè)環(huán)氧乙烷單元或200和2000之間的分子量的PEG。本發(fā)明的一個(gè)另外的方面提供了本發(fā)明酶的藥物組合物，包含由表面活性劑、助表面活性劑和親脂相組成的系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有大于或等于10的HLB值(親水性-親脂性平衡)和大于或等于30°C的熔點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，系統(tǒng)具有10至16，優(yōu)選12至15的HLB值，而且具有30-600°C，優(yōu)選40_500°C的熔點(diǎn)。具體地，以HLB值和熔點(diǎn)表征的系統(tǒng)是單、二和三?；视王ズ途垡叶?PEG)與具有8至20，優(yōu)選8至18個(gè)碳原子的脂肪族羧酸的單酯和二酯(由此聚乙二醇優(yōu)選具有每個(gè)分子約6至約32個(gè)環(huán)氧乙烷單元)的混合物，而且任選地，系統(tǒng)含有游離的甘油和/或游離的聚乙二醇。優(yōu)選地，此系統(tǒng)的HLB值受到PEG鏈長(zhǎng)度調(diào)節(jié)。此系統(tǒng)的熔點(diǎn)受到脂肪酸的鏈長(zhǎng)、PEG的鏈長(zhǎng)和脂肪酸鏈飽和度，并且因此受到用于制備Macrogol甘油酯混合物的起始油調(diào)節(jié)。“脂肪族C8-C18羧酸”指以顯著且可變的比例含有辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、豆蔻酸(C14)、棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)的混合物(若這些酸是飽和的話(huà))，及相應(yīng)的不飽和C8-C18羧酸。這些脂肪酸的比例可以隨起始油而變化?？梢岳缤ㄟ^(guò)具有200-1500的分子量的聚乙二醇與起始油之間的反應(yīng)來(lái)獲得單、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)與具有8至18個(gè)碳原子的脂肪族羧酸的單酯和二酯的此類(lèi)混合物，所述起始油由具有選自下組的脂肪酸的甘油三酯混合物組成辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕櫚醛、硬脂酸、油酸和亞麻酸(單獨(dú)地或作為混合物)。任選地，此類(lèi)反應(yīng)的產(chǎn)物還可以含有小比例的甘油和游離的聚乙二醇。此類(lèi)混合物是以例如商品名Ge-lucire商品化的。本發(fā)明的一個(gè)有利的實(shí)施方案提供了，在商品名Gehicire下知曉的產(chǎn)品中，特別是“Gelueire50/13”和/或“Gelucire44/14”代表適合于在根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑中使用的混合物。Gelueire50/13是具有單、二和三?；视王ズ途垡叶寂c分別為40%至50%和48%至58%(構(gòu)成結(jié)合脂肪酸的主要比例)的棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)的單酯和二酯的混合物。在每種情況中辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例小于3%，而在每種情況中月桂酸(C12)和豆蔻酸(C14)的比例小于5%。Gelueire44/14是具有單、二和三?；视王ズ途垡叶嫉膯熙ズ投サ幕旌衔铮壤謩e為棕櫚酸(C16)4至25%，硬脂酸(C18)5至35%，辛酸(C8)小于15%，癸酸(C10)小于12%，月桂酸(C12)30至50%和豆蔻酸(C14)5至25%。可以例如通過(guò)使用棕櫚仁油和聚乙二醇1500進(jìn)行的醇解/酯化反應(yīng)來(lái)制備-Gelueire44/14。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了本發(fā)明酶的藥物組合物，其包含的系統(tǒng)含有單、二和三?；视王ズ椭咀錍8-C18羧酸的聚乙二醇單酯和二酯的混合物和還有可能的小比例的甘油和游離的聚乙二醇，該系統(tǒng)具有40°C_55°C的熔點(diǎn)和12-15范圍內(nèi)的HLB值。更優(yōu)選地，系統(tǒng)具有44°C-50°C的熔點(diǎn)和13-14范圍內(nèi)的HLB值。或者，系統(tǒng)具有44°C左右的熔點(diǎn)和14的HLB值，或者系統(tǒng)具有50°C左右的熔點(diǎn)和13的HLB值。治療方法根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白酶(任選地，與脂肪酶和/或淀粉酶(本發(fā)明的酶)組合)可用于治療性和/或預(yù)防性處理動(dòng)物中的多種疾病或病癥。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，而且特別是人類(lèi)。動(dòng)物的例子是非反芻類(lèi)，和反芻類(lèi)如綿羊、山羊和牛(例如肉牛和奶牛)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，動(dòng)物是非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如馬、豬(包括但不限于小豬、飼育豬和母豬)；禽類(lèi)如火雞、鴨和雞(包括但不限于肉仔雞、蛋雞)’幼年牛犢；寵物如貓和犬；和魚(yú)(包括但不限于鮭魚(yú)、鱒魚(yú)(trout)、羅非魚(yú)(tilapia)、鯰魚(yú)(catfish)和鯉魚(yú)(carp)；和甲殼類(lèi)(crustacean)(包括但不限于蝦和對(duì)蝦)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更具體的是人類(lèi)。例如，酶可用于治療消化性病癥如消化不良(maldigestion)或消化不良(dysp印sia)，它們常常由在正常情況下從胃和胰分泌的消化酶的生成和/或向胃腸道中的分泌不足引起。此外，酶在治療PEI中是特別有用的?？梢蕴貏e使用Borgstr6m測(cè)試(jop.jPancreas(在線(xiàn))2002;3(5):116_125)來(lái)驗(yàn)證PEI，并且它可以是由疾病和狀況如胰腺癌、胰和/或胃手術(shù)，例如胰的全部或部分切除、胃切除術(shù)、后胃腸旁路手術(shù)(例如比爾羅特II胃腸吻合術(shù))；慢性胰腺炎；熱帶胰腺炎；遺傳性胰腺炎；舒_戴二氏綜合征(ShwachmanDiamondSyndrome)；胰腺或常見(jiàn)膽管的導(dǎo)管阻塞(例如由于新生物)；和/或囊性纖維化(一種遺傳性疾病，其中粘稠的粘液阻斷胰腺導(dǎo)管)引起的。酶在治療急性胰腺炎中也可以是有用的?？梢匀鏓P0600868中一般所描述的那樣測(cè)量酶對(duì)消化性病癥的效果，其中實(shí)施例2描述了用于在胃條件下測(cè)量脂肪酶穩(wěn)定性的體外消化率測(cè)試，而實(shí)施例3描述了用于在存在膽汁鹽的情況中脂肪酶活性的體外消化率測(cè)試?？梢詫?duì)蛋白酶和淀粉酶建立相應(yīng)的測(cè)試。還有，W002/060474披露了合適的測(cè)試，例如(1)用于測(cè)量豬測(cè)試飼料中的脂質(zhì)消化的體外測(cè)試，和(2)用胰腺機(jī)能不全的豬進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)，其中測(cè)量脂肪、蛋白質(zhì)和淀粉的消化率。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用實(shí)施例4的體內(nèi)篩選測(cè)試來(lái)測(cè)量本發(fā)明蛋白酶的效果。作為另一個(gè)例子，酶在治療I型和/或II型糖尿病中是有用的，特別對(duì)于在通常伴隨此疾病的消化性病癥的糖尿病療法中的輔助治療(著眼于減少晚期并發(fā)癥)。可以通過(guò)W000/54799中所描述的一種或多種方法來(lái)確定酶對(duì)糖尿病的影響，例如通過(guò)控制糖基化血紅蛋白水平、血糖水平、低血糖發(fā)作(hypoglycaemicattack)、脂溶性維生素如維生素A、D和E的狀態(tài)、所需要的胰島素日劑量、體重系數(shù)和高血糖周期來(lái)進(jìn)行。本文中所描述和要求保護(hù)的發(fā)明在范圍方面并不受限于所公開(kāi)的本文中的具體實(shí)施方案，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意圖作為本發(fā)明數(shù)個(gè)方面的例示。意圖任何等同實(shí)施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。確實(shí)，在那些于本文中所顯示和描述的之外對(duì)本發(fā)明的各種修飾從上文的描述出發(fā)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得顯而易見(jiàn)。還意圖此類(lèi)修飾落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。在矛盾的情況中，以本公開(kāi)內(nèi)容(包括定義)為準(zhǔn)。本文中弓丨用各種參考文獻(xiàn)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述而完整并入。實(shí)施例所使用的化學(xué)品是至少試劑級(jí)別的商品。實(shí)施例1酶測(cè)定法FIP(國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì)(F6d6rationInternationalePharmaceutique))以及歐洲藥典和美國(guó)藥典已經(jīng)發(fā)表了用于豬胰酶制劑(pancreatin)的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的測(cè)定法。1個(gè)FIP-單位=1個(gè)Ph.Eur.-單位(歐洲藥典)。測(cè)定法記載于例如國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì)，科學(xué)部分國(guó)際藥用酶標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(InternationalCommissionforthestandardisationofpharmaceuticalenzymes)。已)"PharmaceuticalEnzymes(用醇)，，，R.Ruyssen禾口k.Lauwers編，E.StoryScientia,Ghent,Belgium(1978)，b)歐洲藥典。還可參見(jiàn)Deemester等，于LauwersA,ScharpeS(編)pharmaceuticalEnzymes,NewYork,MarcelDekker，1997，第343-385頁(yè)。合適的酶標(biāo)準(zhǔn)品可以獲自國(guó)際藥用酶委員會(huì)(InternationalCommissiononPharmaceuticalEnzymes),標(biāo)準(zhǔn)中心(CentreforStandards),Harelbekestraat72,B-9000Ghent。下文描述了蛋白酶FIP測(cè)定法以及其它適合于蛋白酶、脂肪酶和淀粉的測(cè)定法。蛋白酶FIP測(cè)定法可以使用FIP測(cè)定法(國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì))，1個(gè)FIP-單位=1個(gè)Ph.Eur.-單位(歐洲藥典)來(lái)測(cè)定蛋白酶活性。此測(cè)定法與其它FIP測(cè)定法一起記載于國(guó)際藥學(xué)聯(lián)合會(huì)，科學(xué)部分國(guó)際藥用酶標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)。a)“PharmaceuticalEnzymeM藥用酶)”R.Ruyssen禾口k.Lauwers編，E.StoryScientia,Ghent,Belgium(1978)，b)歐洲藥典。還可參見(jiàn)Deemester等，于LauwersA,ScharpeS(編)pharmaceuticalEnzymes,NewYork,MarcelDekker,1997，第343-385頁(yè)。使用此測(cè)定法來(lái)測(cè)定胰酶制劑中的蛋白酶活性。對(duì)于測(cè)定微生物蛋白酶的FIP活性，省略通過(guò)添加腸激酶進(jìn)行的活化步驟。原理蛋白酶在pH7.5和35°C的溫度時(shí)水解底物酪蛋白。通過(guò)添加三氯乙酸來(lái)使反應(yīng)停止，并濾掉未降解的酪蛋白。通過(guò)在275nm處的分光光度法來(lái)測(cè)定溶液中殘留的肽量?；钚缘亩x通過(guò)參照已知FIP活性的胰參照粉末(蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn))，測(cè)定不被5.0%(wt/vol，即5.0g/100ml)三氯乙酸溶液沉淀的肽量作為蛋白酶活性。材料和方法酪蛋白溶液將1.25g酪蛋白(干重)(例如Calbiochem號(hào)218680)在水中懸浮，直至獲得實(shí)質(zhì)上澄清的溶液。將PH調(diào)節(jié)至8.0，并用水將溶液稀釋至終體積100ml。在這里和在下文中，水意味著去離子水。硼酸鹽緩沖液pH7.5:將2.5g氯化鈉、2.85g四硼酸二鈉和10.5g硼酸在900ml水中溶解，將pH調(diào)節(jié)至pH7.5+/-0.1，并用水稀釋至1000ml。濾紙具有125mm直徑的折疊濾紙，例如Schleicher&Schuell號(hào)15731/2。濾紙測(cè)試將5ml5.0%三氯乙酸過(guò)濾流過(guò)濾紙。使用未過(guò)濾的三氯乙酸溶液作為空白，濾液在275nm處的吸光度應(yīng)當(dāng)小于0.04。蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)上可從國(guó)際藥用酶委員會(huì)，標(biāo)準(zhǔn)中心，Harelbekestraat72，B_9000Ghent，Belgium得到的蛋白酶(胰)。該標(biāo)準(zhǔn)品具有以FIP/Ph.Eur.-單位/g計(jì)的標(biāo)記活性(A)。精確稱(chēng)重對(duì)應(yīng)于約130個(gè)蛋白酶-FIP/Ph.Eur.-單位的量。添加一刮勺尖端的海沙，用幾滴冰冷的0.02M氯化鈣(pH6.0-6.2)潤(rùn)濕，并用平端玻璃棒搗碎全部。用約90ml相同的冰冷氯化鈣溶液稀釋?zhuān)⒃诒≈袛噭?dòng)懸浮液達(dá)15至30分鐘。將pH調(diào)節(jié)至6.1，并用相同氯化鈣溶液將體積調(diào)節(jié)至100ml。用硼酸鹽緩沖液pH7.5將5.Oml此懸浮液稀釋至100ml。對(duì)于活性測(cè)試，使用1.0、2.0和3.Oml此溶液作為參照(在下文中稱(chēng)作S1、S2和S3，S代表標(biāo)準(zhǔn))。測(cè)試懸浮液使用等于約260個(gè)FIP/Ph.Eur.-單位的樣品量制備樣品懸浮液，如上文關(guān)于蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)所描述的。將PH調(diào)節(jié)至6.1，并將水添加至100ml。將5.Oml此溶液與5ml氯化鈣溶液混合。用硼酸鹽緩沖液將5ml此稀釋液進(jìn)一步稀釋至100ml。對(duì)該測(cè)定法使用2.Oml此溶液(在下文中樣品稱(chēng)作Un，其表示未知活性的樣品，數(shù)目η)。測(cè)定方法(活性測(cè)試)對(duì)三種參照懸浮液(Si、S2、S3)和樣品懸浮液(Un)(均一式三份)實(shí)施測(cè)定法。每種樣品一個(gè)空白是足夠的(分別稱(chēng)作5113、5213、5313，和此13)。在沒(méi)有樣品/標(biāo)準(zhǔn)品的情況中制備盲樣(B)作為分光光度計(jì)的補(bǔ)償液體(Ablind(B)ispreparedwithoutwithoutsample/standardascompensationliquidforthespectrophotometer)。如下將硼酸鹽緩沖液添加至管盲樣(B)3.Oml；樣品(Un)1.Oml；標(biāo)準(zhǔn)品(S1、S2和S3)分別為2.0、1.0和Oml0如下將蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)品添加至Si、S2和S3分別為1.0,2.0和3.Oml0如下將測(cè)試懸浮液添加至樣品管(Un)2.Oml0將5ml三氯乙酸添加至所有盲樣(Sib、S2b、S3b、Un和B)，接著立即混合。用玻璃塞塞住所有管，并在水浴中于恒定的溫度(35+/-0.5°C)與底物溶液一起放置。在達(dá)到溫度平衡時(shí)，在時(shí)間0時(shí)，將2.Oml酪蛋白溶液添加至管Si、S2、S3和Un，接著立即混合。正好30分鐘后，將5.Oml三氯乙酸添加至各管Si、S2、S3和Un，接著立即混合。從水浴取回管，并容許于室溫豎立20分鐘以完成蛋白質(zhì)的沉淀。將每管的內(nèi)容物過(guò)濾通過(guò)同一濾紙兩次，并使用來(lái)自管B的濾液作為補(bǔ)償液體在275nm處測(cè)量濾液的吸光度。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品(S1、S2、S3)的已知標(biāo)記活性(A)計(jì)算以FIP單位計(jì)的樣品(Un)活性。減去各個(gè)盲樣的吸光度值(例如Sl吸收減去Slb吸收)應(yīng)當(dāng)處于0.15-0.60的區(qū)間。蛋白酶ProtazymeAK測(cè)定法底物2.Oml0.01%TritonX-100中懸浮的1片ProtazymeAK片劑(MegazymeT-PRAK1000)。通過(guò)攪動(dòng)制備均質(zhì)懸浮液。溫度37°C測(cè)定緩沖液IOOmMHEPES/NaOH,0.01%TritonX-100，pH7.0將500ul(微升)ProtazymeAK底物懸浮液和500ul測(cè)定緩沖液在Eppendorf管中混合，并在冰上放置。添加20ul蛋白酶樣品(在0.01%TritonX-100中稀釋的)。通過(guò)將Eppendorf管轉(zhuǎn)移至Eppendorf恒溫混合器(其被設(shè)置至37°C)來(lái)啟動(dòng)測(cè)定法。在Eppendorf恒溫混合器上以其最高搖動(dòng)速率(HOOrpm)將管溫育15分鐘。通過(guò)將管轉(zhuǎn)移回冰浴來(lái)使溫育停止。幾分鐘后，在冷的離心機(jī)中對(duì)管離心(15000rpm，3分鐘)。將200ul上清液轉(zhuǎn)移至微量滴定板。讀取0D650作為蛋白酶活性的量度。測(cè)定法中包括緩沖盲樣(代替酶)。蛋白酶Suc-AAPF-dNA測(cè)定法底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)。測(cè)定緩沖液100mM琥珀酸、lOOmMHEPESUOOmMCHES、lOOmMCABS、ImMCaCl2、150mMKC1、0.01%TritonX-100，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)至pH9.0。測(cè)定溫度25°C。將300u1稀釋的蛋白酶樣品與1.5ml測(cè)定緩沖液混合，通過(guò)添加1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMS0中，并用0.01%TritonX-100進(jìn)一步稀釋45x的)來(lái)開(kāi)始活性反應(yīng)，并在混合后，通過(guò)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)A-增加作為蛋白酶活性的量度。將蛋白酶樣品稀釋?zhuān)筮M(jìn)行活性測(cè)量以確保所有活性測(cè)量均落入測(cè)定法的劑量響應(yīng)曲線(xiàn)的線(xiàn)性部分內(nèi)。脂肪酶底物對(duì)-硝基-苯基(pNP)戊酸鹽測(cè)定pH:7.7測(cè)定溫度40°C反應(yīng)時(shí)間25分鐘具有黃色的消化產(chǎn)物具有405nm處的特征性吸光度。其量通過(guò)分光光度法測(cè)量?？梢韵鄬?duì)于已知活性的酶標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定脂肪酶活性。活性可以以Lipolase單位(LU)表示。1個(gè)LU(Lipolase單位)是在上文的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘釋放lmmol可滴定丁酸的酶量。1KLU=1000LU。淀粉酶底物Phadebas片劑(PharmaciaDiagnostics；交聯(lián)的、不溶性的、著藍(lán)色的淀粉聚合物，其與牛血清清蛋白和緩沖物質(zhì)混合，并制成片劑)。測(cè)定溫度37°C測(cè)定pH:4.3反應(yīng)時(shí)間20分鐘在水中懸浮后，淀粉被a-淀粉酶水解，給出可溶性藍(lán)色片段。在620nm處測(cè)量的所得藍(lán)色溶液的吸光度是a“淀粉酶活性的函數(shù)。1個(gè)真菌a-淀粉酶單位(1個(gè)FAU)是在標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定條件下每小時(shí)分解5.26g淀粉(Merck，可溶性淀粉Erg.B.6，批次9947275)的酶量。實(shí)施例2蛋白酶的制備通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)制備SEQIDNO:6、7、8、9、10和11的蛋白酶變體，簡(jiǎn)言之將隨機(jī)和/或定點(diǎn)突變引入基因中，用突變基因轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞，發(fā)酵經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如如記載于W02004/111220的實(shí)施例1的)，并自發(fā)酵培養(yǎng)液純化蛋白酶。在枯草芽孢桿菌中以類(lèi)似的方式重組生成參照蛋白酶(SEQIDN0:1)。對(duì)于純化較大量的蛋白酶，將培養(yǎng)液離心(13.000rpm.達(dá)20分鐘)以給出澄清的上清液，并將上清液過(guò)濾通過(guò)0.45Pm濾紙以除去剩余的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。用3MTris將濾液的pH調(diào)節(jié)至pH9.0，并將蛋白酶溶液上樣至在50mMTris/HCl,pH9.0中平衡的MEPHypercel柱(PALLLifeSciences)0用數(shù)個(gè)柱體積的平衡緩沖液清洗柱后，用50mMCH3C00H/Na0H,pH4.0洗脫蛋白酶。對(duì)洗脫過(guò)程中收集的級(jí)分測(cè)試蛋白酶活性(使用實(shí)施21例1的終點(diǎn)ProtazymeAK測(cè)定法)。匯合活性級(jí)分，將pH調(diào)節(jié)至pH4.5，并用去離子水稀釋匯合物以給出與20mMCH3C00H/Na0H、50mMH3B03、lmMCaCl2，pH4.5(SP平衡緩沖液)相同的電導(dǎo)率。將所調(diào)節(jié)的匯合物上樣至在SP平衡緩沖液中平衡的SPSepharoseHP柱。用數(shù)個(gè)柱體積的SP平衡緩沖液清洗柱后，在5個(gè)柱體積里用相同緩沖液中的線(xiàn)性NaCl梯度(0->0.5M)洗脫柱。對(duì)洗脫過(guò)程中收集的級(jí)分測(cè)試蛋白酶活性(使用ProtazymeAK測(cè)定法)。匯合來(lái)自柱的活性級(jí)分作為純化的蛋白酶產(chǎn)品。對(duì)于制備較少量的蛋白酶(微純化)，將培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾通過(guò)0.45ym濾紙。向?yàn)V板(Whatman,UnifiIter800u1,25-30umMBPP)的每孔添加約100ulMEP-HyperCel層析介質(zhì)漿體。通過(guò)如下用200ill25mMTris、25mM硼酸鈉、2mMCaC12，pH8.5清洗層析介質(zhì)兩次于室溫在有力搖動(dòng)(Heidolph，TitramaxlOLlOOOrpm)以攪拌層析介質(zhì)的條件下溫育5分鐘，隨后通過(guò)真空(Whatman，UniVac3)除去液體。然后將100yl結(jié)合緩沖液(0.5MTris、25mM硼酸鈉、10mMCaCl2，pH8.5)和400yl培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至濾板的各孔。通常對(duì)每種蛋白酶微純化4個(gè)孔。為了將蛋白酶結(jié)合至層析介質(zhì)，在有力搖動(dòng)的情況中將濾板溫育30分鐘。通過(guò)真空除去未結(jié)合的材料后，重復(fù)結(jié)合步驟添加100u1結(jié)合緩沖液和400yl培養(yǎng)上清液，在搖動(dòng)的情況中溫育30分鐘，并通過(guò)真空除去未結(jié)合的材料。然后將MEP-HyperCel介質(zhì)用0.1MTris、25mM硼酸鈉、2mMCaCl2，pH8.5清洗一次，用25mMTris、25mM硼酸鈉、2mMCaCl2，pH8.5清洗一次，并且用10mMTris、25mM硼酸鈉、2mMCaCl2，pH8.5清洗一次。在每次清洗步驟中，添加200u1緩沖液，并在有力的搖動(dòng)下于室溫將平板溫育10分鐘，并通過(guò)真空除去緩沖液。為了自層析介質(zhì)釋放蛋白酶，添加100yl洗脫緩沖液(50mM乙酸鈉、2mMCaCl2,pH4.3)，并于室溫在有力搖動(dòng)的情況中將濾板溫育10分鐘。通過(guò)真空將含有蛋白酶的洗脫緩沖液轉(zhuǎn)移至96孔板。如下重復(fù)洗脫步驟，即添加100u1洗脫緩沖液，于室溫?fù)u動(dòng)10分鐘，并在同一96孔板中收集。將匯合的微純化蛋白酶貯存于_18°C。酶蛋白濃度如下文所描述的那樣通過(guò)活性位點(diǎn)滴定來(lái)測(cè)定，或者基于A280值和氨基酸序列(氨基酸組成)來(lái)計(jì)算，其使用s.C.Gill和P.H.vonHippel,AnalyticalBiochemistry182，319-326，(1989)中所概述的原理來(lái)進(jìn)行。也可以通過(guò)氨基酸分析來(lái)測(cè)定酶蛋白濃度，例如如W02004/111221的實(shí)施例3中所描述的。如下使用緊密結(jié)合性大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑2A(CI-2A；參見(jiàn)Ludvigsen，S.,Shen,H.Y.,Kjaer,M.,Madsen,J.C.,Poulsen,F.M.Refinementofthethree-dimensionalsolutionstructureofbarleyserineproteinaseinhibitor2andcomparisonwiththestructuresincrystals.J.Mol.Biol.,卷222,第621頁(yè)-第635頁(yè)，1991)來(lái)通過(guò)活性位點(diǎn)滴定測(cè)定酶濃度。在微量滴定板中，將20yl等分試樣的微純化的蛋白酶(用0.1MTris.O.0225%Brij35(聚氧乙烯(23)月桂醚)，pH8.6適當(dāng)稀釋)與20ii1CI-2A(通常用0.1MTris.O.0225%Brij35,pH8.6稀釋至2、1.5、1、0.5、0.25、0.125,0.0625和0yM)混合。在搖動(dòng)的情況中溫育1小時(shí)后，通過(guò)如下測(cè)量剩余活性添加160u1底物溶液(通常為0.4mg/ml自DMS0中的200mg/ml儲(chǔ)液制備的在0.1MTris,0.0225%Brij35，pH8.6中的Suc-Ala-Ala-Ala-pNA)，并每10秒測(cè)量405nm處的吸光度達(dá)3分鐘(Spectramax，MolecularDevices)。從剩余活性對(duì)具有(顯著)剩余活性的孔的抑制劑濃度的線(xiàn)性回歸計(jì)算活性蛋白酶濃度。表1是本發(fā)明的選擇變體的列表。如下文實(shí)施例中所述測(cè)試這些蛋白酶。表1變體的列表變體SEQIDNO:突變參照蛋白酶1-VAR2946E125DVAR2957R38TVAR3758T44K+S99PVAR2139S69TVAR30710R165SVAR20311S69T+E125D實(shí)施例3具有改善的pH_比率的蛋白酶在pH5.6和pH8.0測(cè)試蛋白酶變體VAR294(SEQIDNO6)蛋白酶活性，并如下文所述與參照蛋白酶(SEQIDN0:1)的相應(yīng)活性進(jìn)行比較。蛋白酶測(cè)定法使用來(lái)自MolecularProbes(Invitrogen，產(chǎn)品目錄編號(hào)E6639)的EnzChek蛋白酶測(cè)定試劑盒。作為底物，它使用用pH不靈敏的紅色熒光BODIPYTR-X染料重度標(biāo)記的酪蛋白衍生物，導(dǎo)致幾乎全部猝滅綴合物的熒光。蛋白酶催化的水解釋放經(jīng)熒光BODIPYTR-X染料高度標(biāo)記的肽。伴隨的熒光增強(qiáng)與蛋白酶活性成比例。試劑將針對(duì)紅色熒光的一管EnzChek蛋白酶測(cè)定試劑盒(200ug)在200yl0.lMNaHC03(pH8)中溶解以給出lmg/mL的儲(chǔ)液。通過(guò)用HC1將100mMTris/堿調(diào)節(jié)至pH8.0來(lái)制備測(cè)定緩沖液pH8。添加6.25iig/ml經(jīng)標(biāo)記的底物。通過(guò)將25ml0.2M琥珀酸與37.5ml0.2MNaOH混合來(lái)制備測(cè)定緩沖液pH5.6(參考文獻(xiàn):Gomori,Meth.Enzymol.1，141(1955))。為了補(bǔ)償所添加的蛋白酶，為每100ml測(cè)定緩沖液添加1.143ml1MHC1。由此，將緩沖液的pH降低至約5.0。添加5ug/ml經(jīng)標(biāo)記的底物。樣品分析將10ill0.5iiM蛋白酶溶液(參照蛋白酶、蛋白酶變體，均一式兩份)與40ill各自的緩沖液在384孔板中混合。于室溫溫育60分鐘；以750rpm/分鐘有力搖動(dòng)。在t=0和t=60分鐘時(shí)在熒光微量板讀板儀中讀取熒光。經(jīng)B0DIPYTR-X標(biāo)記的肽具有589/617nm的激發(fā)/發(fā)射最大值。使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光素濾光片(filters)(激發(fā)=590nm，發(fā)射=635nm)來(lái)檢測(cè)經(jīng)BODIPYTR-X染料標(biāo)記的肽。計(jì)算在pH5.6在t=60分鐘的讀數(shù)必須為與t=0時(shí)相比的4倍高。計(jì)算在pH5.6的讀數(shù)與在PH8的讀數(shù)之間的比率。所得的數(shù)目必須為參照酶的各數(shù)目的1.4倍。將變體的比率與每塊96孔板上的8個(gè)參照孔的平均比率進(jìn)行比較。對(duì)于計(jì)算，在這兩個(gè)pH值時(shí)都用t=60減去t=0。結(jié)果下文表2中所列的變體與pH5.6/pH8比率為1.00的參照蛋白酶相比具有不同的在pH5.6/pH8.0的活性比率。表2實(shí)施例4針對(duì)蛋白酶功效的體內(nèi)篩選測(cè)試在患有誘發(fā)性胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)的3-4頭雌性G6ttingen迷你豬(Ellegaard)的組中在蛋白酶篩選測(cè)試中研究純化的蛋白酶變體VAR294、VAR295、VAR375、VAR213和VAR307(SEQIDNO:6、7、8、9和10)。通過(guò)結(jié)扎胰管在迷你豬中誘發(fā)胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)，并且它們還配有回_盲腸折返插管(均在異熒烷麻醉下和在約25kg的重量)，如在其它方面記載于Tabeling等(Tabeling等(1999):“Studiesonnutrientdigestibilities(pre-caecalandtotal)inpancreaticduct-ligatedpigsandtheeffectsofenzymesubstitution",J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82251-263)禾口Gregory等(Gregory等(1999)”Growthanddigestioninpancreaticductligatedpigs,Effectofenzymesupplementation，，in"BiologyofthePancreasinGrowingAnimals，，(SGPierzynowski禾口R.Zabielski編),ElsevierScienceBV,Amsterdam,第381-393頁(yè))的。容許從手術(shù)恢復(fù)至少4周的一段時(shí)間，之后開(kāi)始研究。研究開(kāi)始前，經(jīng)由糞便胰凝乳蛋白酶測(cè)試(商業(yè)上可以產(chǎn)品目錄編號(hào)K6990從ImmimdiagnostikAG，ffiesenstrasse4，D-64625Bensheim，德國(guó)得到)來(lái)證實(shí)每頭豬的PEI狀態(tài)。測(cè)定法研究過(guò)程中，按12:12h光-暗周期將豬圈養(yǎng)在改良的代謝籠中，容許自由獲取水，并且每天喂養(yǎng)兩餐。測(cè)試餐測(cè)試餐含有21.3%蛋白質(zhì)、51.9%淀粉、2.6%脂肪，而且具有下列組成(g/100g干物質(zhì))魚(yú)粉3.5、禽類(lèi)肉粉10.2、小麥粉29.5、帶殼稻米(shelledrice)14、馬鈴薯淀粉11、玉米淀粉14、酪蛋白5.9、纖維素粉4.3、維生素、礦物和痕量元素7.6(按照豬/小豬的營(yíng)養(yǎng)需要，參見(jiàn)例如W001/58276的表A)。體為了評(píng)估蛋白酶功效，給豬喂養(yǎng)與1升水、0.625gCr203(氧化鉻標(biāo)志物)混合且在喂養(yǎng)前立即向其中混合不同量的SEQIDNO1的參照蛋白酶(0mg、20mg、50mg和120mg酶蛋白，等于0、500、1250和3000個(gè)FIPU蛋白酶/餐)的單一250g測(cè)試餐。對(duì)于試驗(yàn)自身，根據(jù)mg酶蛋白(20mg、50mg和120mg/餐)劑量施用本發(fā)明的蛋白酶變體，以與參照蛋白酶比較體內(nèi)功效。在回腸中第一次出現(xiàn)膳食標(biāo)志物(綠色食糜)后，在冰上收集回腸食糜總共8小時(shí)，并在分析前貯存于-20°C。在分開(kāi)的測(cè)定之間容許至少一天的沖洗。分析24將冷凍的回腸食糜樣品冷凍干燥，磨碎，并分析干物質(zhì)(DM)和粗制蛋白質(zhì)。冷凍干燥，接著于103°C溫育8小時(shí)后按重量評(píng)估DM。以氮(N)乘以因數(shù)6.25計(jì)算粗制蛋白質(zhì)，即粗制蛋白質(zhì)(g/kg)=N(g/kg)x6.25,如AnimalNutrition,第4版，第13章(P.McDonald,R.A.Edwards禾口J.F.D.Greenhalgh編，LongmanScientificandTechnical,1988，ISBN0-582-40903-9)中所規(guī)定的。用Dumas燃燒方法(PGWiles,IKGray,RCKissling,JAOACInt.1998May-Jun；81(3):620_32)使用“VarioMAXCNS”元素分析儀(ElementarAnalysensystemeGmbH)來(lái)測(cè)定氮含量。Cr2O3被氧化成鉻酸鹽，并經(jīng)由365nm處的消光(分光光度計(jì))如Petry和Rapp于ZeitungfurTierphysiologie(1970),卷27，第181-189頁(yè)(Petry和Rapp1970；Z.Tierphysiol.27；181-189)所述來(lái)計(jì)算鉻含量，。通過(guò)標(biāo)志物方法根據(jù)以下公式進(jìn)行表觀盲腸前蛋白質(zhì)消化率的計(jì)算回腸蛋白質(zhì)―g^^cK二二fr。。其中Cr2O3和蛋白質(zhì)表示為g/100g干物質(zhì)。此外，從個(gè)體回歸曲線(xiàn)(excel)外推實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)分別所需要的蛋白酶量(mg)。為了更有效地比較參照蛋白酶的50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)，計(jì)算所謂的改善因數(shù)“IF”。分別通過(guò)用實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)所需要的參照蛋白酶量(mg)除以實(shí)現(xiàn)50%和60%蛋白質(zhì)消化率(％CNA)所需要的變體蛋白酶量(mg)來(lái)測(cè)定每種蛋白酶變體的IF50和IF60值。結(jié)果和結(jié)論在下文表3中顯示了回腸蛋白質(zhì)消化結(jié)果。蛋白酶劑量以每餐的毫克酶蛋白(mg/meal)指明。還測(cè)試了表4中所提及的所有變體。它們都具有0.8或更多的IF。如實(shí)施例2中所述制備蛋白酶變體VAR295(SEQIDNO7)的液體濃縮物。將液體濃縮物進(jìn)行微生物過(guò)濾，噴霧干燥，并測(cè)量經(jīng)干燥的粉末的蛋白酶蛋白含量。優(yōu)選地，蛋白酶蛋白含量高于50%(根據(jù)調(diào)節(jié)性需要)。將500g干燥的蛋白酶粉末與200g微晶纖維素和300g聚乙二醇4000(MaCrOgOlTM4000)一起在商業(yè)上可得到的混合器中預(yù)先混合。添加足夠量的通常使用的潤(rùn)濕劑，并于室溫充分混合所得的濕物質(zhì)(wetmass)0然后在商業(yè)上可得到的擠出機(jī)中擠出均質(zhì)化的物質(zhì)，所述擠出機(jī)裝有具有某種孔直徑(例如約0.8mm)的沖孔模以形成圓柱形丸劑。通過(guò)添加必要量的通常使用的濕潤(rùn)劑用商業(yè)上可得到的球形化器(spheronizer)將所生成的擠出物圓整為球形丸劑。在商業(yè)上可得到的真空干燥器中于約40°C的產(chǎn)品溫度干燥丸劑。然后通過(guò)使用具有合適大小的篩(例如具有0.7和1.4mm篩)的機(jī)械篩分機(jī)來(lái)分離經(jīng)干燥的丸劑以獲得想要的篩分級(jí)分。收集所收集的篩分級(jí)分(例如>0.7mm和<1.4mm)，并將包含想要的標(biāo)準(zhǔn)化的活性物質(zhì)含量的部分裝入合適大小的膠囊中。通過(guò)應(yīng)用具有如實(shí)施例1中所述省略活化步驟的改良的針對(duì)來(lái)自胰粉末的蛋白酶的FIP方法來(lái)對(duì)所得的丸劑測(cè)試蛋白水解活性。然后根據(jù)歐洲藥典2.9.1.(章節(jié)“Disintegrationoftabletsandcapsules”)對(duì)所得的丸劑測(cè)試崩解(測(cè)試溶液水_500mL，37°C)。實(shí)施例6:體外毒性使用用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞測(cè)定法來(lái)進(jìn)行蛋白酶毒性的體外篩選。測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞的代謝能力，因此測(cè)量成活力。用HT-29和Caco-2細(xì)胞講行的體外毒件測(cè)定法將HT-29細(xì)胞(來(lái)自德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物中心(Germancollectionofmicro-organismsandCellCultures)，DSMZ的ACC299)在補(bǔ)充有10%FBS(Sigma，產(chǎn)品目錄編號(hào)F-6178)的McCoy氏5A培養(yǎng)基(Cambrex)中培養(yǎng)。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，在96孔培養(yǎng)板中以4*104個(gè)細(xì)胞/孔/200iU的密度培養(yǎng)細(xì)胞。使細(xì)胞適應(yīng)各孔24小時(shí)后，在補(bǔ)充有0.5g/l卩1~013111^11(1^11101^)、1%胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒補(bǔ)充物(Invitrogen)和青霉素和鏈霉素(Invitrogen)的無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM:F12，Invitrogen)中以2倍稀釋一式三份以9種不同濃度(重量/體積酶蛋白)添加測(cè)試組分(蛋白酶)，并再溫育24小時(shí)。通過(guò)細(xì)胞的代謝能力來(lái)測(cè)量成活力，其通過(guò)使用Alamar藍(lán)(Invitrogen)測(cè)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。將Caco-2細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和非必需氨基酸的DMEM(Invitrogenl1960-044)中培養(yǎng)，并在濕潤(rùn)的5%C02大氣中培養(yǎng)。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，在96孔板中以3*104個(gè)細(xì)胞/孔/200iU的密度培養(yǎng)細(xì)胞。適應(yīng)各孔24小時(shí)后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加測(cè)試組分以避免蛋白酶受血清中存在的蛋白酶抑制劑的結(jié)合，并再溫育24小時(shí)，其后測(cè)量成活力。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞代謝Alamar藍(lán)的能力來(lái)測(cè)量細(xì)胞成活力。在無(wú)血清條件下完成關(guān)于測(cè)試蛋白酶變體的所有實(shí)驗(yàn)。在不添加任何蛋白酶的孔中觀察到最大代謝活性(并設(shè)為100%)。用對(duì)所測(cè)試的蛋白酶獲得最大代謝活性的50%所處的濃度除以對(duì)參照蛋白酶獲得最大代謝活性的50%所處的濃度，并將所得的“毒性比率”從下表4中顯而易見(jiàn)。濃度越高，毒性越?。欢覍?duì)參照蛋白酶的比率越高，降低的毒性越多。因而，蛋白酶VAR203的毒性與參照蛋白酶相比是降低的。已經(jīng)對(duì)Caco-2和HT-29細(xì)胞兩者測(cè)試變體。表4變體毒性HT-29Caco-2參照蛋白酶(野生型)11S69T+E125D(VAR203)1.7未測(cè)試T41A,T68R,V88A1.4>2G12D2.11.4N47H，G48D2.32.3G12N,T22A,N23D,N47T,R165H2.72.8R14I,R38T,T151I1.62.3G34A,T68A,R165T1.21.4AIT,N47S,Q54L,T68S,R165G，T166A1.11.0R38T,E53K,L73P1.11.4實(shí)施例7體外消化性能包括1小時(shí)pH3(胃)步驟以及2小時(shí)pH6(腸的)步驟的體外消化模型中測(cè)定表4中所提及的蛋白酶VAR203(SEQIDNO:11)和其它變體的性能，并與參照蛋白酶(SEQIDN0:1)的性能進(jìn)行比較。如實(shí)施例2中所述純化蛋白酶，并通過(guò)A28Q測(cè)量以mg/ml計(jì)的酶蛋白含量。將飲食(其與實(shí)施例4的測(cè)試餐相同)在0.1MHC1中溶解，給出0.2g飲食/ml的工作漿體。用HC1將pH調(diào)節(jié)至pH2.5。將100u1飲食漿體添加至MTP(微量滴定板)中的每孔，并與20ill胃蛋白酶(MerckVL317492437，產(chǎn)品目錄號(hào)1.0792.0001，700mg/l，終濃度93ug/ml)和30ill稀釋的酶(稀釋至10uM(0.2mg/ml))混合。所有孔中的最終pH是2.8至3.0。對(duì)每種酶(在20mM乙酸鹽，0.01%TritonX-100,pH5中稀釋)制備一式兩份4種濃度(0.2,0.1、0.05和0.025mg/ml)。這于37°C，750rpm(Eppendorf恒溫混合器)溫育1小時(shí)，并定義為體外消化模型的胃步驟。為了開(kāi)始腸步驟，通過(guò)將25ill緩沖液(0.8MMES、0.8M咪唑、0.8M乙酸鹽，40%/60%混合，pH5/9)添加至每孔將pH提高至6.0至6.05。另外，將25yl膽汁鹽(在去離子水，MilliporemilliQ中溶解的80mM膽汁鹽，來(lái)自SolvayPharmaceuticals，批次176.01-PA-7374的膽汁鹽混合物)添加至10mM的終濃度，接著于37°C，750rpm溫育2小時(shí)。通過(guò)如下終止腸步驟通過(guò)以2700rpm，于4°C離心10分鐘來(lái)分開(kāi)蛋白酶與飲食漿體。通過(guò)使用0PA方法(鄰苯二醛(o-phthaldialdehyde))定量上清液中的游離氨基來(lái)測(cè)定蛋白酶活性。減去“僅有胃蛋白酶”的孔的具有酶的孔中的游離氨基酸數(shù)目反映蛋白酶性能。將上清液在酶稀釋緩沖液(20mM乙酸鹽pH5，0.01%TritonX-100)中稀釋10x，并將20ill稀釋的上清液與200u10PA試劑(混合3.81g十水合四硼酸二鈉、lmL10%SDS、88mgDTT，并添加80mg在2mL96%乙醇中溶解的0PA，之后添加去離子水至總體積100ml)混合。包括絲氨酸稀釋列(將0.5mg/ml儲(chǔ)液稀釋2倍)作為定量游離氨基的標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)量340nm處的吸光度。通過(guò)使針對(duì)無(wú)酶進(jìn)行修正的水解氨基的絕對(duì)數(shù)據(jù)(通過(guò)OPA測(cè)定獲得的)與三參數(shù)邏輯斯諦方程(logisticequation)擬合來(lái)實(shí)施所測(cè)試變體相對(duì)于參照蛋白酶的表觀改善因數(shù)(IF)的計(jì)算其中NH2是游離氨基的量(mM)，NH2(最大)是蛋白酶能自飲食釋放的游離氨基的最大量，濃度是蛋白酶濃度(mg酶每餐(250g))，斜率是平行曲線(xiàn)(參見(jiàn)下文)的斜率，而1(50)是計(jì)算IF的變量。倒置的V意味著指數(shù)(exp)。使用極高劑量的參照蛋白酶以實(shí)驗(yàn)方法將NH2(最大)確定至20mM。為了使所獲得的數(shù)據(jù)與此方程擬合，進(jìn)行兩種假設(shè)。第一，假設(shè)所有獲得的經(jīng)水解氨基對(duì)劑量添加的mg酶的曲線(xiàn)是平行的(斜率恒定)。第二，底物可用性是活性的限制因素，并且因此在明顯高的酶濃度時(shí)會(huì)獲得經(jīng)水解氨基量的平穩(wěn)狀態(tài)(NH2(最大))。改善因數(shù)(IF)定義為IF=I(50)(參照)/I(50)(變體)其中I(50)(參照)指為了獲得半數(shù)NH2(最大)所需要的參照酶的濃度而I(50)(變體)指為了獲得半數(shù)NH2(最大)所需要的變體濃度。蛋白酶變體VAR203具有2.6的改善因數(shù)，參照蛋白酶(根據(jù)定義)具有1.0的改善因數(shù)。這意味著為了獲得與參照蛋白酶類(lèi)似的效果需要低2.6倍量(2.etimesloweramount)的VAR203蛋白酶。表4中所列的所有變體具有0.7以上的IF。實(shí)施例8使用胃插入導(dǎo)管的大鼠模型進(jìn)行的毒物學(xué)評(píng)估測(cè)試系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)顯示，通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行蛋白酶管飼進(jìn)行口服施用后，測(cè)試物品反流(regurgitation)的風(fēng)險(xiǎn)升高，隨后有非故意暴露于肺的風(fēng)險(xiǎn)。因此，使用專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)區(qū)別蛋白酶變體與野生型(SEQIDNo:1)對(duì)胃腸道的體內(nèi)毒性。在這些實(shí)驗(yàn)中使用由CharlesRiverLaboratoriesGermanyGmbH提供的胃插入導(dǎo)管的大鼠。經(jīng)由胃導(dǎo)管每天將測(cè)試物品直接施用入胃中達(dá)14天，這消除向氣管中誤劑量添加(mis-dosing)的風(fēng)險(xiǎn)，而且降低從胃反流測(cè)試物品的風(fēng)險(xiǎn)。施用體積對(duì)于所有蛋白酶為10mL/kg，并在施用前約4小時(shí)撤出食物，并在劑量添加后4小時(shí)再提供。單獨(dú)地圈養(yǎng)動(dòng)物，并防止導(dǎo)管阻塞；每次施用后且每周一次在下午用自來(lái)水對(duì)它進(jìn)行沖洗。腿劑量添加前和后個(gè)別地對(duì)大鼠觀察行為變化、對(duì)處理的反應(yīng)或疾病的任何體征。研究過(guò)程中在劑量添加前(pre-dose)和劑量添加后1小時(shí)時(shí)用肛門(mén)探測(cè)器測(cè)量所有動(dòng)物的體溫三次。以每周的時(shí)間間隔測(cè)量體重和食物消耗，而通過(guò)每日目視檢查水瓶來(lái)測(cè)量水消耗。在終止時(shí)，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行詳細(xì)的尸檢(autopsy)，并對(duì)潛在的靶器官(包括胃、氣管和肺)實(shí)施組織病理學(xué)(研究)。MM29本研究中所觀察到的死亡率主要與測(cè)試物品向呼吸道中的回流有關(guān)，而且還與技術(shù)問(wèn)題(包括從施用位點(diǎn)(胃)泄露測(cè)試物品)有關(guān)。死亡率在700mg/kg劑量水平在經(jīng)野生型蛋白酶處理的組中最為顯著。在組織病理學(xué)檢查中，認(rèn)為與上皮的鱗狀上皮細(xì)胞增生有關(guān)的前胃炎癥是靶標(biāo)毒性。基于這些測(cè)試物品誘導(dǎo)的對(duì)胃粘膜的局部影響，野生型蛋白酶與作為組的變體相比更具毒性?？傊?，組合的死亡率和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)顯示，野生型比變體更具毒性。表5在14天毒性研究中的野生型和變體的死亡率表6胃插入導(dǎo)管的雄性大鼠中的組織病理學(xué)刺激發(fā)現(xiàn)(以受影響動(dòng)物的數(shù)目給出)權(quán)利要求一種蛋白酶，其與SEQIDNO1的氨基酸1-188具有至少90％的同一性，而且其與SEQIDNO1的氨基酸1-188相比包含選自下列取代的至少一個(gè)取代A1T；I3V；G12；R14I；T22A；N23D；G34A；R38；T41A；T44K；N47；G48D；E53K；Q54L，D；T68A，R，S；S69T；L73P；V88A；S99P；P124L；E125；M131V；T151I；R165；和T166A。2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其包含至少一個(gè)下列取代:G12D,N,H；R38T；N47H,T，S；E125D和R165S,H,G,T。3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白酶，其包含至少一個(gè)下列取代或取代組合G12D;和(N47H+G48D)。4.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其包含至少一個(gè)下列取代或取代組合R38T、(T44K+S99P)、S69T、(S69T+E125D)、E125D和R165S。5.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其用作藥物。6.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其與脂肪酶或淀粉酶組合用作藥物。7.根據(jù)權(quán)利要求6的與脂肪酶或淀粉酶組合的蛋白酶，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；和/或(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO3的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO5的氨基酸1-513的淀粉酶。8.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。9.根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白酶，其與脂肪酶或淀粉酶組合。10.根據(jù)權(quán)利要求9的與脂肪酶或淀粉酶組合的蛋白酶，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；和/或(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶具有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO3的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO5的氨基酸1-513的淀粉酶。11.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1中所限定的蛋白酶連同至少一種藥學(xué)可接受的輔助性材料。12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其進(jìn)一步包含脂肪酶或淀粉酶。13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；和/或(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶具有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO3的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO5的氨基酸1-513的淀粉酶。14.一種用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，其通過(guò)施用治療有效量的如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)中所限定的蛋白酶來(lái)進(jìn)行。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括施用治療有效量的脂肪酶或淀粉酶。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；和/或(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶具有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO3的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO4的氨基酸1-483的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO5的氨基酸1-513的淀粉酶。17.如權(quán)利要求1中所限定的蛋白酶用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其進(jìn)一步包括使用脂肪酶或淀粉酶。19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO2的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；和/或(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶具有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO3的氨基畫(huà).11-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO4的氨基畫(huà).11-483的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO5的氨基畫(huà).11-513的淀粉酶。全文摘要本發(fā)明涉及源自擬諾卡氏菌屬菌種的蛋白酶(SEQIDNO1)及緊密相關(guān)蛋白酶的新變體，以及其藥學(xué)用途。所述變體在治療胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)方面顯示改良的性能。所述變體可以與脂肪酶和/或淀粉酶組合。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的其它例子是治療消化性病癥、胰腺炎、囊性纖維化、Ⅰ型糖尿病和/或Ⅱ型糖尿病。文檔編號(hào)A61K38/48GK101889084SQ200880119369公開(kāi)日2010年11月17日申請(qǐng)日期2008年12月2日優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日發(fā)明者坦加·M·R·凱爾,彼得·C·格雷戈里,托馬斯·倫哈德,拉斯·貝耶爾,西格恩·E·拉森,阿蘭·斯文德森申請(qǐng)人:諾維信公司;索爾維醫(yī)藥有限責(zé)任公司