專利名稱：具有增強的抗炎活性和降低的細胞毒性的多肽以及相關方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于設計治療炎性疾病的治療多肽的新方法。
背景技術：
盡管在將近40年之前就首次確認了免疫球蛋白的細胞受體，但是在最近的十年 間才發(fā)現(xiàn)了它們在免疫應答中重要作用。它們在免疫應答的傳入和傳出期中都起到關鍵作 用設定B細胞激活和抗體產生的閾值，調節(jié)樹突細胞的成熟和將抗體響應的高度特異性 與效應器途徑(effector pathway)耦聯(lián)，如吞噬作用、抗體依賴性細胞的細胞毒性及炎性 細胞的募集和激活。它們在將體液免疫系統(tǒng)與先天效應細胞相耦聯(lián)中的重要作用使得它們 成為受到關注的用于提高或限制抗體體內活性的免疫治療靶標?？贵w和抗體-抗原復合物與免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用產生多種應答，包 括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、炎 性介質的釋放、抗體的清除和抗體的半衰期(綜述參見Daron，Armu Rev Immunol, 15, 203-234(1997) ；Ward禾口Ghetie，Therapeutic Immunol, 2, 77-94 (1995) ；Ravetch禾口Kinet， Annu Rev Immunol，9，457-492 (1991)，各文獻均通過引用方式結合在本文中)?？贵w的恒定域并不直接參與抗體與抗原的結合，而是表現(xiàn)出各種不同的效應子功 能。取決于它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白可以劃分為不同的類。有5 類主要的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些類中的幾種還可以進一步劃分為亞類 (同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。對應于不同類免疫球蛋白的重鏈 恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y和μ。在各種不同的人免疫球蛋白類中，人IgGl和IgG3比 IgG2和IgG4更有效地介導ADCC。抗體進行木瓜蛋白酶消化產生了兩個相同的抗體結合片段(稱為Fab片段，各 片段具有單個的抗原結合位點)以及剩余的“Fe”片段(其名稱反應了其容易結晶的能力)。Fc區(qū)對于抗體的效應子功能是至關重要的。人IgG Fc區(qū)的晶體結構已經被確定 (Deisenhofer, Biochemistry, 20，2361-2370 (1981)，其通過引用方式結合在本文中)。在 人IgG分子中，F(xiàn)c區(qū)是由木瓜蛋白酶切割N末端至Cys，226產生的。一直以來，IgG被認為通過由其Fc片段介導的相互作用來介導促炎活性和抗炎活 性。因此，盡管Fc-FcyR相互作用是造成免疫復合物和細胞毒性抗體的促炎性質的原因，但 是靜脈用丙種球蛋白(IVIG)及其Fc片段是抗炎的，并且廣泛地用于抑制炎性疾病。該矛 盾性質的準確機理還是未知的，但是已經有人提出IgG的糖基化對于調節(jié)IgG的細胞毒性 和炎性能力是關鍵的。IgG在其兩條重鏈的每一條上的CH2域中在Asn297包含單個N連接的聚糖。共價 連接的復合糖包含核心，含N-乙酰葡糖胺(GIcNAc)和甘露糖(man)的雙觸角五聚糖。核心 糖結構的進一步修飾在存在可變的巖藻糖、分支GIcNAc、半乳糖(gal)和末端唾液酸(sa) 部分的情況下在血清抗體中觀察到。因此已經檢測到超過40種不同的糖形(glycoform)共 價連接到該單一糖基化位點上(Fujii等人，J. Biol. Chem 265，6009 (1990))。已經表明IgG 的糖基化通過維持兩條重鏈的開放構型對于與所有FcyR的結合是至關重要的(Jefferis 和 Lund, Immune. 1 Lett. 82，57 (2002)，Sondermann 等人，J. Mol. Biol. 309，737 (2001))。 IgG糖基化對于FcyR結合的這一絕對必要條件解釋了去糖基化的IgG抗體不能介導體內 引發(fā)的炎性應答(如ADCC、吞噬作用和炎性介質的釋放)的原因(Nimmerjahn和Ravetch， Immunity 24，19(2006))。還觀察到IgG的單個糖形可能炎性應答的調節(jié)有影響，這已經由 所報道的包含或缺少巖藻糖的IgG抗體對單個FcyR的親和力改變以及隨之它們對細胞毒 性的影響所證明(Shields 等人，J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn andRavetch, Science 310,1510 (2005)) 0在患類風濕性關節(jié)炎和幾種自身免疫血管炎(其中已經報道 了 IgG抗體的半乳糖基化和唾液酸化的降低)的患者中已經觀察到自身免疫狀態(tài)與IgG抗 體的特定糖基化模式之間的聯(lián)系(Parekh等人，Nature 316，452 (1985)，Rademacher等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,6123(1994), Matsumoto 等人，128，621 (2000)，Holland 等 人，Biochim.Biophys.Acta Dec 27 ； [Epub ahead ofprint] 2005)。據報道，IgG 糖形的變 化也與老化相關和在免疫時出現(xiàn)，盡管還未確定這些改變在體內的重要性(Shikata等人， Glycoconj. J. 15，683 (1998)，Lastra 等人，Autoimmunity 28，25 (1998))。因此，需要發(fā)展考慮到體內IVIG性質的完全不同現(xiàn)象的產生多肽的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明通過提供這樣的方法和分子來滿足前述需要。一方面，本發(fā)明提供了包含 至少一個IgG Fc區(qū)的分離的多肽，所述多肽與未純化的抗體制劑相比具有改變的性質，其 中所述分離的多肽的唾液酸化比未純化的抗體制劑的唾液酸化高。在一個實施方式中，包 含至少一個IgF Fc區(qū)的分離的多肽被至少一個a 2，6鍵連接到相應的末端唾液酸部分上 的半乳糖部分糖基化，且其中所述多肽與未純化的抗體相比具有較高的抗炎活性。在一個 實施方式中，包含至少一個IgF Fc區(qū)的分離的多肽被至少一個通過a 2，6鍵連接到相應的 末端唾液酸部分上的半乳糖部分糖基化，且其中與未純化的抗體制劑相比，所述多肽與Fc 激活受體的結合降低。在進一步的實施方式中，該Fc激活受體選自Fc y RIIA、Fc y RIIC和 Fc yRIIIA。
一方面，分離的多肽來自重組源。另一方面，本發(fā)明提供了藥物制劑，所述制劑包含含有至少一個Fc區(qū)、具有較高 抗炎活性的多肽以及合適的載體或稀釋劑。另一方面，本發(fā)明提供了調節(jié)包含F(xiàn)c區(qū)的多肽的性質的方法，包括改變Fc區(qū)的多 糖鏈的唾液酸化。在一個實施方式中，該方法包括提供包含至少一個Fc區(qū)的多肽的未純化源，所 述包含至少一個Fc區(qū)的多肽的未純化源包括包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多 肽，所述多糖鏈包含通過a 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末端唾液酸，和包含缺少多糖鏈 的至少一個Fc區(qū)的多個多肽，所述多糖鏈包含通過a 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末端唾 液酸；和提高所述包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽與所述包含缺少多糖鏈的 至少一個Fc區(qū)的多個多肽的比，所述多糖鏈包含通過a 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末端 唾液酸。在再另一方面，本發(fā)明提供了治療炎性疾病的方法，包括向需要的受試者施用包 含多個分離的多肽的治療組合物，該多個分離的多肽各包含至少一個IgG Fc區(qū)，其中各個 Fc區(qū)的第一部分包含具有通過2，6鍵連接到相應的末端唾液酸上的半乳糖部分的相應糖 鏈；所述治療組合物的劑量小于包含多個分離的多肽的第二組合物的劑量，該多個分離的 多肽各包含至少一個IgG Fc區(qū)，具有包含相應糖鏈的相應Fc區(qū)的第二部分，所述糖鏈具有 通過2，6鍵連接到相應的末端唾液酸上的半乳糖部分；和或者第一部分比第二部分大，從 而所述治療組合物的劑量和所述第二組合物的劑量抑制炎癥的程度基本相同，或者第一部 分比第二部分大，從而所述治療組合物抑制炎癥的程度比相同劑量的所述第二組合物高。附圖簡述

圖1是顯示SNA+FC連接的MALDI-Tof分析的示意圖。圖2總結了證明唾液酸和半乳糖之間a2，6鍵的富集提高了 IVIG Fc片段的抗炎 性能的試驗。圖3總結了證明唾液酸和半乳糖之間a2，6鍵的去除減弱了 IVIG Fc片段的抗炎 性能的試驗。圖4表明細胞毒性的降低并不依賴半乳糖和唾液酸之間的連接。圖5表明2，6唾液酸化的IgG Fc的體內抗炎活性僅僅是IgG Fc聚糖的特性。
具體實施例方式本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，IgG Fc域的細胞毒性和抗炎性反應是由Fc連接的核心多 糖的不同唾液酸化造成的。IgG抗體的細胞毒性在唾液酸化時降低；相反，IVIG的抗炎活性 增加。IgG的唾液酸化表明在誘導抗原特異性的免疫應答時被調節(jié)，因此提供了一種將IgG 從處于穩(wěn)態(tài)的先天性抗炎分子轉變?yōu)樵诳乖ぐl(fā)時的適應性促炎物質的新型方式。Fc-唾 液酸化的IgG與巨噬細胞上的獨特受體結合，其隨之上調抑制性Fcy受體(Fc yR)，因而防 止自身抗體介導的病變。一般地參見Ravetch禾口 Nimmerjahn，J.Experim. Medicine 24(1) 11-15(2007)。本發(fā)明人還進一步驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗炎性反應依賴于半乳糖和唾液酸部分之 間連接的性質。IVIG的抗炎活性取決于Fc上的精確聚糖結構這一觀察進一步支持了本 發(fā)明人之前提出的模型(Y. Kaneko, F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science313,670 (2006)；F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch，JExp Med 204,11(2007))特定的凝集素受體而不是標準的 Fc受體參與該途經。作為本發(fā)明基礎的數據支持了 2，6唾液酸化的Fc與在調節(jié)性骨髓細 胞群上表達的其同源凝集素受體的結合導致位于炎癥位點(如發(fā)炎的關節(jié))的效應巨噬細 胞上的抑制性IgG Fc的反式上調的模型，因而提高了細胞毒性IgG結合激活FcR和引發(fā)炎 性反應所需的閾值(F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510(2005))。因此，本文提供了建立和選擇具有理想的細胞毒性和抗炎能力的IgG的有利策 略。定義在本發(fā)明的整個說明書和權利要求中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號為如Kabat 等 人’ Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th EdPublic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中的 EU 編碼，該文獻通 過引用方式明確地結合在本文中。“Kabat中的EU編碼”是指人IgGlEU抗體的殘基編號。術語“天然的”或“母本的”是指包含F(xiàn)c氨基酸序列的未修飾的多肽。母本多肽 可以包含天然序列的Fc區(qū)或具有預先存在的氨基酸序列修飾(如插入、缺失和/或取代) 的Fc區(qū)。術語“多肽”是指包含至少一個IgG Fc區(qū)的蛋白質及其片段的任何片段，包括但 不限于全長功能性蛋白質，例如，舉例來說抗體(如IgG抗體)。當本發(fā)明的多肽與未純化 的抗體制劑對比時，這一制劑通常為來自哺乳動物(例如人類供體)的血液樣品、血清樣品 和/或IVIG樣品。該制劑可以是未分級的或部分分級的，但是通常僅包含約2-4%唾液酸 化的含F(xiàn)c的蛋白質。經富集或配制成具有免疫抑制活性的本發(fā)明的組合物通常包含至少 約5%或更多(例如5-10%、10-30%、30-50%、50-100%或其范圍或區(qū)間)的唾液酸化的 含F(xiàn)c的蛋白質。術語“Fc區(qū)”用于限定免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域。“Fc區(qū)”可以是天然序列Fc 區(qū)或變異Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的分界線可以發(fā)生變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū) 通常定義為從Cys226位或Pro230位的氨基酸殘基延伸到其羧基末端。人IgG Fc區(qū)的“CH2域”(也稱為“Cy2”域)通常是從大約氨基酸231延伸到大 約氨基酸340。CH2域是獨特的，因為其不與另一域緊密配對。相反，兩個N-連接的分支糖 鏈插在完整的天然IgG分子的兩個CH2域之間。據推測，糖可以提供域_域配對的替代，并 有助于穩(wěn)定CH2域(Burton，Mol Immunol，22，161-206 (1985)，其通過引用方式結合在本文 中)。"CH3域”包括Fc區(qū)中C末端殘基到CH2域的一段(即從IgG的大約氨基酸殘基 341到大約氨基酸殘基447)。術語“鉸鏈區(qū)”通常定義為人IgGl的Glu216延伸到Pro230 (Burton (1985))。其 他IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過將形成重鏈間S-S鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放 在相同位置而與IgGl序列比對。術語“結合域”是指多肽結合另一分子的區(qū)域。對于FcR，結合域可以包括其多肽 鏈(例如，其a鏈)負責結合Fc區(qū)的一部分。結合域的一個例子是FcR鏈的細胞外域?！肮δ苄訤c區(qū)”具有至少天然序列Fc區(qū)的部分“效應子功能”。示例性的“效應子 功能”包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調等。這些效應子功能通常 需要Fc區(qū)與結合域(例如抗體可變域)結合，并且可以使用例如本文公開的各種不同分析 方法進行評估。該術語還包括Fc片段，只要該片段包含如本文所述的糖基化的或適合糖基 化的至少一個氨基酸殘基?！疤烊恍蛄蠪c區(qū)”包含與天然發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。如本 領域普通技術人員所理解的，“變異Fc區(qū)”由于至少一個“氨基酸的飾”而包含與天然序列 Fc區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，變異Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或母本多肽的 Fc區(qū)相比具有至少一個氨基酸取代，例如天然序列Fc區(qū)中或母本多肽的Fc區(qū)中的大約1 個_大約10個氨基酸取代，優(yōu)選大約1個-大約5個氨基酸取代。本文的變異Fc區(qū)優(yōu)選 與天然序列Fc區(qū)和/或母本多肽的Fc區(qū)具有至少大約80%的同源性，更優(yōu)選與其具有至 少大約90%的同源性，更優(yōu)選與其具有至少大約95%的同源性，再更優(yōu)選與其具有至少大 約99%的同源性。術語“改變的糖基化”是指在如上定義的多肽(天然的或修飾的)中，對糖添加到 重鏈恒定區(qū)上進行操控以增加或減少特定的糖組分。例如，在特定細胞系(例如，舉例來 說，Lec2或Lec3)中制備的多肽(例如，舉例來說，抗體)可能缺少糖部分(例如巖藻糖和 唾液酸)的連接。術語“Fc受體”或“FcR”用于描述結合抗體Fc區(qū)的受體。在本發(fā)明的一個實施方 式中，F(xiàn)cR是天然序列人FcR。在另一實施方式中，F(xiàn)cR(包括人FcR)結合IgG抗體(Y受 體)，并包括Fc y RI、Fc y RII和Fc y RIII亞類的受體(包括這些受體的等位基因變異體 或可選擇地剪接形式)。FcyRII受體包括FCYRIIA( “激活受體”)和FCYRIIB( “抑制 受體”)，其具有相似的氨基酸序列，主要不同是其胞質域。激活受體Fc y RIIA在其胞質域 中包含免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質域中包含免疫受體 酪氨酸抑制基序(ITIM)(參見綜述Daron，Annu Rev Immunol，15，203-234 (1997) ；FcR 的綜 述 Ravetch 禾口 Kinet, AnnuRev Immunol, 9,457-92 (1991) ；Capel 等人，Immunomethods, 4, 25-34(1994)；和 de Haas等人，J Lab Clin Med，126，330-41 (1995)，Nimmerjahn和Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, edffilliam Paul 5th Ed.，所 有文獻均通過引用方式結合在本文中)?！翱贵w依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指其中表達FcR的細胞毒性細胞 (例如單核細胞，如自然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞)識別在目標細胞上的結合抗體，繼而引 起目標細胞裂解的體外或體內的細胞介導的反應。一般而言，具有激活Fc y R的任何效應 細胞可被引發(fā)以介導ADCC。一種這樣的細胞(NK細胞)僅表達FcyRIII，而單核細胞(取 決于其激活狀態(tài)、定位或分化)可以表達？0￥1 1、？(3￥1 11和？(3￥1 111。造血細胞上的FcR 表達總結在Ravetch和Bolland，Annu Rev Immunol, (2001)中，其通過引用方式結合在本 文中?！叭诵毎笔潜磉_一種或多種FcR并執(zhí)行效應子功能的白細胞。優(yōu)選地，該細 胞表達至少一種類型的激活Fc受體(例如，舉例來說，F(xiàn)c yRIII)并且執(zhí)行ADCC效應功能。 介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞和 嗜中性白細胞，PBMC和NK細胞是優(yōu)選的。效應細胞可從其天然來源分離，例如如本文所述 從血液或PBMC分離。
術語“抗體”以廣義含義使用，且特別地涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、 多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們珠表現(xiàn)出希望的生物 學活性。短語抗體的“唾液酸含量”是指抗體重鏈的Fc區(qū)上唾液酸殘基的總數和指未純化 抗體制劑中唾液酸化的抗體與未唾液酸化的抗體的比，除非該短語在上下文中清楚地表明 是指另一含義。如本發(fā)明的目的所限定的，“抗體片段”包括完整抗體的一部分，通常包括完整抗 體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)，或保留FcR結合能力的抗體Fc區(qū)。抗體片段的例子包括線性抗 體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w片段優(yōu)選保留至少鉸鏈的部分 和任選地IgG重鏈的CH1區(qū)。更優(yōu)選地，抗體片段保留IgG重鏈的整個恒定區(qū)，并包括IgG 輕鏈。如本文使用的術語“單克隆抗體”是指從基本同源抗體的群體獲得的抗體，即構成 該群體的單個抗體除了可能少量存在的可天然發(fā)生的突變以外是相同的。單克隆抗體是 高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑(通常包括針對不同 決定簇(表位)的不同抗體)相反，各單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單 克隆”表明從基本同源的抗體群體獲得的抗體的特征，并不理解為需要通過任何特定的方 法來產生該抗體。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法進行制備(該方法 首先在Kohler和Milstein，Nature，256，495-497 (1975)中描述，其通過引用方式結合在 本文中)，或者可以通過重組DNA方法進行制備(參見例如美國專利No. 4，816，567，其通過 引用方式結合在本文中)。單克隆抗體還可以通過使用例如Clackson等人，Nature, 352, 624-628(1991)和 Marks 等人，J Mol Biol，222，581-597 (1991)中描述的技術從噬菌體抗 體文庫中分離，各文獻通過引用方式結合在本文中。在本發(fā)明的其它實施方式中，包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽可與其他蛋白質片 段(包括但不限于全蛋白質)融合。本領域普通技術人員清楚地知道，許多蛋白質可以 與本發(fā)明的多肽融合，包括但不限于其他免疫球蛋白，特別是缺少其相應Fc區(qū)的免疫球 蛋白?；蛘?，其他生物活性蛋白質或其片段也可以與本發(fā)明的多肽融合，例如美國專利 No. 6, 660, 843中所描述的，該文獻通過引用方式結合在本文中。該實施方式對于將這些生 物活性蛋白質或其片段輸送到表達Fc受體的細胞是特別有利的。此外，可以使用不同的標 志物，例如，舉例來說，GST標簽或者綠色熒光蛋白質或GFP。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈 的一部分與源自特定物種或屬于特定抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源， 而該鏈中的剩余部分與源自另一物種或屬于另一抗體類型或亞類的抗體及這些抗體的 片段中的相應序列相同或同源，只要它們表現(xiàn)出希望的生物學活性即可(參見美國專利 No. 4,816，567 ；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA，81，6851-6855 (1984) ；Neuberger 等人，Nature，312，604-608 (1984) ；Takeda 等人，Nature，314，452-454 (1985)；國際專利申 請No. PCT/GB85/00392，其各通過引用方式結合在本文中)。非人(例如鼠科動物)抗體的“人源化”形式是包含源自非人類免疫球蛋白的最 少序列的嵌合抗體。對于絕大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來 自受體的超變區(qū)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)的具有希望的特異性、親和力和能力的超變區(qū)的殘基取代。在一些情況下，人免疫球蛋 白的Fv框架區(qū)(FR)被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可以包含未在受體抗體 或供體抗體中出現(xiàn)的殘基。進行這些修飾來進一步優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體包 括至少一個且通常兩個可變域的基本所有，其中所有或基本所有的超變環(huán)對應于非人類免 疫球蛋白的那些超變環(huán)，并且所有或基本所有的FR殘基是人免疫球蛋白序列的那些殘基。 任選地，人源化抗體還包含至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的 恒定區(qū)(Fc)。進一步細節(jié)可以參見 Jones 等人，Nature，321，522-525 (1986) ；Riechmann 等 人，Nature，332，323-329 (1988) ；Presta,Curr Op Struct Biol，2，593-596 (1992)；美國專 利No. 5，225，539，其各通過引用方式結合在本文中。本發(fā)明的多肽可以重組產生，例如從cDNA(例如，舉例來說，SEQID NO 1)重組產 生。不同實施方式的多肽包括Fc區(qū)或其功能性片段。包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽包括其中通過使用重組DNA技術改變編碼重鏈恒 定區(qū)的基因而將特定的氨基酸取代、插入或缺失引入到母本序列中的那些多肽。按照如 手冊(如 Molecular Cloning(Sambrook andRussel, (2001)))中描述的公知的分子生物 學技術引入這些修飾。此外，具有至少一個Fc區(qū)的多肽包括已經過選擇以包含特定的糖 修飾的那些多肽，其或者通過在已知其糖基化特異性的細胞系中進行表達獲得(Stanley P.等 A, Glycobiology,6,695-9 (1996) ；ffeikert S.等人，NatureBiotechnology，17， 1116-1121(1999) ；Andresen DC 禾口 Krummen L. , Current Opinion in Biotechnology, 13, 117-123(2002))，或者通過使用特定凝集素的富集或貧化或通過酶處理獲得(Hirabayashi 等人，JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，771，67—87 (2002) ；Robertson禾口 Kennedy, Bioseparation,6,1-15(1996))。本領域已知抗體糖基化的質量和程度隨所使用 的細胞類型和培養(yǎng)條件而不同。例如，Patel等人，Biochem J，285，839-845 (1992)已經報 道了如果抗體作為腹水或者在不含血清或含血清的培養(yǎng)基中產生，抗體連接的糖側鏈中唾 液酸的含量顯著不同。此外，Kunkel等人，Biotechnol Prog, 16,462-470 (2000)已經證明 用于細胞生長的不同生物反應器和培養(yǎng)基中溶解氧的量影響抗體連接的糖部分中半乳糖 和唾液酸的量。但是這些研究并沒有解釋唾液酸殘基的不同水平是怎樣影響抗體的體內活 性的。宿主表達系統(tǒng)本發(fā)明的多肽可以在能夠進行N連接糖基化的宿主表達系統(tǒng)(即宿主細胞)中 表達。通常，這類宿主表達系統(tǒng)可以包括細菌、真菌、植物、脊椎動物或無脊椎動物表達系 統(tǒng)。在一個實施方式中，宿主細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系(例 如 CH0-K1 ；ATCCCCL-61)、綠猴細胞系(COS)(例如 COS 1 (ATCC CRL-1650)、COS 7 (ATCC CRL-1651))、小鼠細胞(例如NS/0)、幼倉鼠腎(BHK)細胞系(例如，ATCC CRL-1632或 ATCC CCL-10)或人細胞(例如 HEK293(ATCC CRL-1573)或 293T(ATCC CRL-11268))或任何 其他合適的細胞系，例如可以從公開保藏機構(如American Type Culture Collection, Rockville,Md)獲得的。此外，可以使用昆蟲細胞系(如磷翅類(L印idoptora)細胞系，例 如Sf9)、植物細胞系、真菌細胞系(如酵母，如舉例來說，釀酒酵母、畢赤酵母、漢遜酵母屬) 或基于桿菌(如枯草桿菌或大腸桿菌)的細菌表達系統(tǒng)。本領域普通技術人員知道，在一 些情況下可能需要對宿主細胞進行修飾以確保發(fā)生N連接糖基化和聚糖成熟而產生通常
11在人IgG的Fc域上發(fā)現(xiàn)的復合雙觸角的糖。治療制劑可以通過混合具有理想純度的本發(fā)明的多肽和任選的生理學可接受的載體、賦形 劑或穩(wěn)定劑(參見如 Remington' s Pharmaceutical Sciencesl6th edition, Osol, A. Ed. (1980))來制備凍干制劑或水溶液形式的包含含有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽的治療制劑 用于儲存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，且 包括緩沖劑(如磷酸、檸檬酸和其他有機酸)、抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫氨酸)、防腐 劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨、 氯化芐乙氧銨；苯基醇、丁醇或芐醇；烷基對羥苯甲酸酯如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸 丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間-甲酚)、低分子量(少于大約10個殘基) 多肽、蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯酮)、氨 基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、組氨酸、精氨酸或賴氨酸)、單糖、二糖或其他糖類包 括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合劑(例如EDTA)、糖(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)、 成鹽反離子(如鈉)、金屬螯合物(如Zn-蛋白質螯合物)和/或非離子表面活性劑(如 TWEEN , PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG))。本文的制劑還可以根據待治療的特定適應癥的需要包含多于一種的活性化合物， 優(yōu)選具有不會對彼此產生不利影響的互補活性的那些活性化合物。這類分子適當地以對預 期目的有效的量組合存在。活性成分還可以封閉在例如分別通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊 (例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，在膠質藥物遞 送系統(tǒng)(例如脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中或在乳劑中。這類技 術公幵在 Remington' sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed. (1980)中。在優(yōu)選的實施方式中，用于體內施用的制劑是無菌的。本發(fā)明的制劑可以方便地 滅菌，例如通過無菌過濾膜的過濾。還可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適的例子包括包含修飾的抗體的固體疏水性 聚合物的半透性基質，該基質是以成形顆粒的形式，如薄膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括 聚酯、水凝膠(如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(參見例如 美國專利No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙基酯的共聚物、非降解的乙烯-醋酸 乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPR0N DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮 丙瑞林構成的注射微球)和聚-D-(-)_3-羥丁酸。盡管聚合物(例如乙烯-醋酸乙烯酯和 乳酸-乙醇酸)使得分子的釋放超過100天，但是某些水凝膠在較短的時間內釋放蛋白質。 當包封的抗體在體內長時間保留時，它們可能由于在37°C暴露在潮濕中而變性或聚積，從 而造成生理活性的喪失或可能的免疫原性改變。取決于涉及的機理，可以設計合理的策略 進行穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚積機理是通過硫醇_ 二硫化物互變形成分子間S-S鍵，則可以 通過修飾巰基、從酸性溶液凍干、控制水分含量、使用合適的添加劑和開發(fā)特定的聚合物基 質組成來獲得穩(wěn)定。包含至少一個IgG Fc區(qū)的唾液酸化多肽的產生本發(fā)明的多肽可以進一步純化或修飾，從而它們與未修飾的和/或未純化的抗體 相比具有增加量的唾液酸。已有多種方法可以實現(xiàn)該目的。在一種方法中，未純化多肽(例如，舉例來說，IVIG)的源通過包含已知結合唾液酸的凝集素的柱子。本領域普通技術人員 知道，不同的凝集素相對于半乳糖和唾液酸之間的a-2，3鍵對a_2，6鍵顯示出不同的親 和力。因此，選擇特定的凝集素使得能夠富集在唾液酸與半乳糖之間具有希望的鍵類型的 抗體。在一個實施方式中，從西洋接骨木(Sambuccusnigra)分離凝集素。本領域普通技術 人員知道，西洋接骨木凝集素(SNA)對通過a (2-6)鍵連接到半乳糖或N_乙酰半乳糖胺 上的唾液酸是特異性的(Shibuya等，J. Biol. Chem.，262 1596-1601 (1987))。相反，山槐 (Maakiaamurensis) ( “MAA”)凝集素結合通過a (2-3)鍵連接到半乳糖上的唾液酸(Wang 等，J Biol Chem.，263 :4576_4585 (1988))。因此，具有希望的半乳糖和唾液酸之間的鍵的包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽的部 分將會保留在柱子中，而缺乏這種鍵的部分將會通過柱子。包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽 的唾液酸化的部分可以通過具有不同嚴格性條件的另一沖洗步驟洗脫出來。因此，有可能 獲得本發(fā)明的多肽的制劑，其中唾液酸的含量與正常含量相比升高。此外，可以利用唾液酸 轉移酶和例如在美國專利No. 20060030521中描述的唾液酸供體的酶反應。用于本發(fā)明的方法中的唾液酸轉移酶的合適的非限制性例子是ST3Gal III (其也 稱為a-(2,3)唾液酸轉移酶(EC 2. 4. 99. 6))和a-(2,6)唾液酸轉移酶(EC 2. 4. 99. 1)。a-(2,3)唾液酸轉移酶催化唾液酸轉移到Gal-0 ，3GlcNAc或Gal-3 ， 4GlcNAc 糖苷的 Gal 上(參見如 Wen 等人，J. Biol. Chem. 267 :21011 (1992) ；Van den Eijnden等人，J. Biol. Chem. 256 3159 (1991))，并負責糖肽中天冬酰胺連接的寡糖的唾液 酸化。唾液酸通過形成兩個糖之間的a-鍵連接到Gal上。糖之間的鍵(連接)是在NeuAc 的2-位和Gal的3-位之間?？梢詮拇笫蟾闻K分離該特定的酶(Weinstein等人，J. Biol. Chem. 257 13845 (1982))；人 cDNA(Sasaki 等人(1993)J. Biol. Chem. 268 :22782_22787 ； Kitagawa & Paulson(1994)J. Biol. Chem. 269 1394-1401)和基因組(Kitagawa 等人 (1996) J. Biol. Chem. 271 :931_938)DNA序列是已知的，從而有助于通過重組表達產生該 酶。a-(2,6)唾液酸轉移酶的活性產生6_唾液酸化的寡糖，包括6_唾液酸化的半乳 糖。名稱“a_(2，6)唾液酸轉移酶”是指將唾液酸連接到受體多糖的第六個原子上的唾液 酸轉移酶家族。可以從不同組織分離得到a-(2，6)唾液酸轉移酶的不同形式。例如該酶 的一種特定形式ST6Gal II可以從大腦或胎兒組織中分離出來(Krzewinski-Recchi等人， Eur. J. Biochem. 270,950 (2003))。此外，本領域普通技術人員知道，可以控制細胞培養(yǎng)條件來改變唾液酸化速率。例 如，為了增加唾液酸含量，降低生產率并將克分子滲透壓濃度一般地維持在適于特定宿主 細胞培養(yǎng)的下限。大約250m0sm-大約450m0sm的克分子滲透壓濃度適于更高的唾液酸含 量。這一細胞培養(yǎng)條件和其他合適的細胞培養(yǎng)條件描述在例如美國專利No. 6，656，466中。 Patel等人，Biochem J，285，839-845 (1992)已經報道了，如果抗體作為腹水或者在不含血 清或含血清的培養(yǎng)基中產生，抗體連接的糖側鏈中唾液酸的含量顯著不同。此外，Kimkel等 人，Biotechnol. Prog.，16，462-470 (2000)已經表明，使用不同的生物反應器進行細胞生長 和培養(yǎng)基中溶解氧的量影響抗體連接的糖部分中半乳糖和唾液酸的量。在另一實施方式中，宿主細胞(例如，舉例來說，永生化人胚胎視網膜細胞)可以 通過引入可操作地與啟動子(例如，舉例來說，CMV啟動子)連接的編碼唾液酸轉移酶(例如，舉例來說，a-2，3-唾液酸轉移酶或a-2，6唾液酸轉移酶)的核酸進行修飾。a-2， 3-唾液酸轉移酶可以是人a -2，3-唾液酸轉移酶，稱為SIAT4C或STZ(GenBank登錄號 L23767)且在如美國專利No. 20050181359中描述。編碼唾液酸轉移酶的核酸可以通過本領域普通技術人員已知的任何方法引入宿 主細胞。引入外源核酸序列的合適的方法還在Sambrook和Russel，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd Edition), ColdSpring Harbor Press，NY，2000 中有所描述。這些 方法包括但不限于物理轉移技術(例如，舉例來說，顯微注射或電穿孔)、轉染(例如，舉例 來說，磷酸鈣轉染)、使用例如脂質體的膜融合轉移和病毒轉移(例如，舉例來說，使用DNA 或逆轉錄病毒載體的轉移)。包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽可以從培養(yǎng)上清液中回收，且如果需要的話，可以 進行一個或多個純化步驟，例如，舉例來說，離子交換或親和色譜。合適的純化方法是本領 域普通技術人員很清楚的。本領域普通技術人員可以理解，上述的唾液酸化方法的不同組合可以導致產生具 有非常高唾液酸化水平的包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽。例如，可以如上所述在過表達唾 液酸轉移酶的宿主細胞中表達包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽，然后通過例如在酶反應中唾 液酸化這些多肽、再使用含凝集素的柱子進行親和色譜而進一步富集這些多肽的唾液酸化 的部分。類似地，酶反應之后進行親和色譜可以用于包含至少一個IgGFc區(qū)的多肽的IVIG 源。為了檢驗在包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽上糖基化的程度，可以純化這些多肽并 在還原條件下在SDS-PAGE中進行分析。可以通過將分離的多肽與特定的凝集素反應來確 定糖基化，或者可選地，如本領域普通技術人員所知道的，可以使用HPLC然后再使用質譜 鑒別糖形(Wormald，MR 等人，Biochem 36:1370(1997))。為了更加詳細地描述本發(fā)明，下面給出幾個非限制性的說明性實施例。
實施例實施例1.唾液酸含量增加的IVIG顯示細胞毒性降低為了確定IgG的特定糖形是否參與調節(jié)抗體的效應子功能，對特定的Asn297-連接 的糖在介導確定的IgG單克隆抗體的細胞毒性中的作用進行了研究。使用質譜來分析如原 先所描述的(6)在293細胞中表達為IgGl、2a或2b開關變異體(switch variant)的源 自6A6雜交瘤的抗血小板抗體，從而確定它們特定的糖組成和結構。這些抗體包含最少的 唾液酸殘基。通過西洋接骨木凝集素親和色譜富集含唾液酸的種類產生唾液酸含量富集了 60-80倍的抗體。比較唾液酸化的和非唾液酸化的6A6-IgGl和2b抗體介導血小板清除的能 力表明，唾液酸化和體內活性反相關。6A6IgG抗體的唾液酸化使其生物活性降低40-80%。為了確定該活性下降的機理，就各小鼠FcYR對這些抗體和其同源抗原進行表面 等離子體共振結合。如Nimmerjahn 和 Ravetch，Science 310,1510(2005)中所描述的進行表面等離 子體共振分析。簡而言之，在其糖側鏈中包含高和低水平唾液酸殘基的6A6抗體變異體被 固定在CM5傳感器芯片的表面上。在室溫下于HBS-EP運行緩沖液(10mM Hepes, pH 7.4， 150mM NaCl，3. 4mMEDTA和0. 005%表面活性劑P20)中通過流動池注入不同濃度的可溶性Fey受體，流速為30ul/分鐘?？扇苄訤c受體注入3分鐘，且到結合分子的解離觀察7分 鐘。自動減去對照流動池的背景結合。進行對照試驗以排除質量傳輸限制。通過對結合和 解離相的同時擬合以及對數據組中所有的曲線的全擬合(global fitting)從傳感圖數據 (sensorgram data)中獲得親和常數。1 1朗繆爾結合模型很好地擬合觀察到的傳感圖 數據并用于所有試驗中。與它們的非唾液酸化形式相比，這些抗體的唾液酸化形式對它們各自的激活FcyR 的結合親和力觀察到降低了 5-10倍，而沒有觀察到對抗原的結合親和力的變化。由于 IgG2b以較高親和力與其激活受體FcyRIV結合，當與IgGl結合其激活受體FcyRIII相比 時，唾液酸化的作用是使IgG2b與其激活受體FcyRIV的結合親和力與未唾液酸化的IgGl 與其激活受體FcYRlII的結合親和力相當。這一激活受體結合中的量差異的這種作用使得 唾液酸化的IgG2b顯示出與未唾液酸化的IgGl相當的體內活性。同樣，IgGl的唾液酸化 降低了其對于激活受體FcyRlll的原已很低的結合親和力7倍，因而產生了生理學失活的 抗體。因此，IgG的Asn297連接聚糖結構的唾液酸化降低了對亞類限制性激活FcyR的結合 親和力，并因此降低了它們的體內細胞毒性。為了確定IgG的N連接聚糖的唾液酸化參與調節(jié)其體內炎性活性現(xiàn)象的普遍性， 我們下一步研究了 N連接聚糖對IVIG的抗炎活性的作用。當以高劑量(l_2g/kg)靜脈內 施用時，從5-10，000個供體的混合血清中獲得該純化的IgG部分廣泛使用的治療炎性疾 病的治療劑(Dwyer, N. Engl. J. Med. 326，107 (1992))。該抗炎活性是Fc片段的性質，且在 ITP、RA和腎毒性腎炎中是保護性的(Imbach等人，Lancet 1,1228(1981), Samuels son等 人，Science 291,484(2001), Bruhns 等人，Immunityl8，573 (2003)，Kaneko 等人，J. Exp. Med. 203(3) 789-97 (2006)) 現(xiàn)提出該抗炎活性的共同機理包括在效應巨噬細胞上誘導抑制性FcyRIIB分子 的表面表達，因此提高了細胞毒性IgG抗體或免疫復合物通過引發(fā)激活FcyR來誘導效應細 胞反應所需的閾值(Nimmerjahn 和 Ravetch，Immunity24,19(2006))。實施例2. IVIG的唾液酸化降低了小鼠關節(jié)炎模型中IVIG的抗炎作用小鼠C57BL/6 禾口 NOD 小鼠是從 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)購得的。 FcyRIIB+小鼠在本發(fā)明人的實驗室中產生，并與C57BL/6背景本底12代。C57BTO背景(K/ B)的 KRN TCR轉基因小鼠是由 D. Mathis 和 C. Benoist(Harvard Medical School,Boston, MA)贈送，并與NOD小鼠配種以產生K/BxN小鼠。6_10周大的雌性小鼠用于所有的試驗，并 在洛克菲勒大學動物中心飼養(yǎng)。血清如原先所描述的(Bruhns等人，Immunity 18,573(2003))制備。簡單地說，血 清從由K/BxN小鼠(6-12周大)收集的血液中分離出來。將幾周收集的血清合并在一起， 等分冷凍以用于本文描述的所有試驗中。1.5X稀釋的K/BxN血清的一次靜脈注射(每克小 鼠4 yl合并的K/BxN血清)誘導關節(jié)炎。通過臨床檢驗對關節(jié)炎進行評分。將所有四只 爪子的指數相加0[未影響的]、1 [一個關節(jié)腫脹]、2[多于一個關節(jié)腫脹]和3[整個爪 子嚴重腫脹]。在K/BxN血清注射之前一小時注射IVIG。一些小鼠接受缺乏6A6-IgG2b抗 體的5 ii g血小板，并使用Advia 120血液學系統(tǒng)(Bayer)在處理后0、4和24小時確定血 小板計數。所有的試驗符合聯(lián)邦法律和學院指導方針的，并且由洛克菲勒大學(紐約，NY) 批準。
抗體和可溶性Fc受體6A6抗體開關變異體是通過瞬時轉染293T細胞然后再如所描述的用蛋白質G進 行純化產生的(Nimmerjahn和Ravetch，Science 310,1510 (2005)) 唾液酸富集的抗體變 異體是通過使用西洋接骨木凝集素(SNA)瓊脂糖(Vector Laboratories,Burlingame,CA) 的凝集素親和色譜從這些抗體制劑中分離出來的。唾液酸含量的富集是通過凝集素印跡 確認的(見下文)。人靜脈內免疫球蛋白(IVIG，5%于10%麥芽糖中，色譜純化的)是從 Octapharma(Hemdon,VA)購得的。按照所描述的進行人IVIG的消化(Kaneko Y.等人，Exp. Med. 203(3) :789_97 (2006))。簡而言之，IVIG在37°C用0. 5mg/ml的木瓜蛋白酶消化1小 時，并通過添加2. 5mg/ml碘代乙酰胺(iodoasetamide)終止消化。在HiPr印26/60S-200HR 柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上將生成Fab和Fc的片段與非消化的IVIG分離，然后 再用蛋白質G柱(GE Healthcare)和蛋白質L柱(Pierce，Rockford，IL)純化Fc和Fab片 段。片段純度是通過使用抗人IgG Fab或Fc特異性的抗體(Jackson ImmunoResearch，West Grove, PA)的免疫印跡檢測的。純度經判斷大于99%。F4/80抗體來自Serotec (Oxford， UK)。Ly 17. 2抗體來自Caltag(Burlingame,CA)。綿羊抗腎小球基底膜(GBM)抗血清(腎 毒性血清，NTS)是由M.P.Madai0 (賓夕法尼亞大學，費城，PA)贈送。包含C末端六組氨酸 標簽的可溶性Fc受體是通過293T細胞的瞬時轉染產生的，并如廠商(Qiagen)所建議的用 Ni-NTA瓊脂糖從細胞培養(yǎng)上清液中純化。IVIG用神經氨酸苷酶處理，并通過質譜分析產生的制劑的組成和結構。在神經氨 酸苷酶處理之后，沒有殘留可檢測的含唾液酸的聚糖。然后測試這些IgG制劑防止通過KxN 血清的被動轉移誘導的小鼠關節(jié)炎癥(IgGl免疫復合物介導的炎性疾病模型)的能力。神 經氨酸苷酶的去唾液酸化在KXN血清誘導關節(jié)炎模型中消除了 IVIG制劑的保護效應。該 活性的喪失并不是非唾液酸化IgG制劑的血清半衰期降低的結果，也不是IgG的單體組成 或結構完整性改變的結果。使用PNGase去除所有聚糖具有相似的效果并消除IVIG的體內 保護效應。實施例3.具有增強的唾液酸含量的IVIG部分減輕了小鼠關節(jié)炎模型中的炎癥具有增加的唾液酸含量的IVIG的制備由于唾液酸看起來是IVIG的抗炎活性所需要的，因此對于該抗炎活性的高劑量 需求(lg/kg)的基礎可能是總IVIG制劑中唾液酸化IgG的限制濃度。IVIG在SNA-凝集素 親和柱上分級以獲得唾液酸修飾的聚糖結構富集的IgG分子。測試這些唾液酸富集的部分與未分級的IVIG相比在KxN血清轉移關節(jié)炎模型中 的保護效果。對于SNA結合部分觀察到保護增強10倍，因而與lg/kg未分級的IVIG相比， 0. lg/kg的SNA富集的IVIG可獲得相當的保護。SNA富集部分的血清半衰期和IgG亞類分 布與未分級的IVIG相當。唾液酸化的效應對IgG是特異性的；唾液酸化的N連接糖蛋白 (如具有類似的雙觸角復合糖結構的胎球蛋白或鐵傳遞蛋白)在IgG的等摩爾濃度下不具 有統(tǒng)計學顯著的抗炎活性。最后，唾液酸化的IVIG制劑的保護作用機理與未分級的IVIG 相似，其取決于FcyRIIB表達，并導致效應巨噬細胞上該抑制受體的表達增加。實施例4.具有增加的唾液酸含量的IVIG抗炎應答的增強是由Fc域上N連接聚 糖的唾液酸化介導的由于IVIG中的多克隆IgG還可以包含可被唾液酸化的輕鏈或重鏈可變域上的0和N連接聚糖，我們確認SNA富集的IgG制劑的抗炎活性增加是由Fc上N連接糖基化位點 的唾液酸化增加產生的。Fc片段是從未分級的和SNA分級的IVIG產生的，并測試它們的 體內活性。如對完整的IgG所觀察到的，當與由未分級的IVIG產生的Fc片段比較時，SNA 純化的Fc片段的體內保護作用提高。相反，F(xiàn)ab片段在該體內測定中未顯示抗炎活性。因 此，IVIG抗炎活性的高劑量要求可以歸因于總制劑中存在的唾液酸化IgG的較小貢獻。因 此通過唾液酸結合凝集素色譜富集這些部分提高了抗炎活性。使用IgG抗體的被動免疫的這些結果表明，IgG從促炎物質轉換為抗炎物質的能 力受Fc域上N連接聚糖的唾液酸化程度的影響。實施例5.由IgG唾液酸化介導的抗炎活性的增加在主動免疫反應中出現(xiàn)古德帕斯丘病(Goodpasture，s Disease)的鼠模型在該模型中，小鼠首先用綿羊IgG和助劑一起致敏，四天后注射綿羊抗小鼠腎小 球基底膜制劑(腎毒性血清，NTS)。簡而言之，使用于CFA中的200i!g綿羊IgG(SeroteC) 經腹膜內對小鼠預免疫，然后在四天后再靜脈注射每克體重2. 5iU NTS血清?？笹BM抗 血清注射之后四天，從非處理的對照小鼠中收集血液，并通過蛋白質G(GE Healthcare, Princeton, NJ)和瓊脂糖結合的綿羊IgG柱(通過在NHS活化瓊脂糖柱(GE Healthcare, Princeton, NJ)上共價偶聯(lián)綿羊IgG產生)的親和色譜純化血清IgG。預致敏后用NTS進行處理以誘導小鼠IgG2b抗綿羊IgG抗體(NTN免疫的)(Kaneko Y.等人，Exp. Med.，203 =789(2006)) 小鼠IgG2b抗體與NTS抗體一起沉積在腎小球中，并 通過IgG2b介導的浸潤巨噬細胞上FcyRIV的激活產生急性和暴發(fā)性炎性反應。沒有預致 敏的情況下，沒有觀察到炎癥，表明小鼠IgG2b抗綿羊IgG抗體是炎性反應的介質。為了確定是否產生促炎IgG的主動免疫與唾液酸化的改變相關，來自預免疫和 NTS免疫小鼠的血清IgG和IgM通過SNA凝集素結合對唾液酸含量進行表征。與未免疫對 照相比，免疫小鼠中總IgG唾液酸化平均降低40%。該效應對IgG是特異性的；IgM的唾液 酸化在免疫之前和之后相當。在分析來自小鼠血清的綿羊特異性IgG部分時，唾液酸化中 的這一差別更加明確，表明與預免疫的IgG相比唾液酸化降低50-60%。這些結果由MALDI-T0F-MS 分析得到確認。通過 CSDGlycotechnology Core Resource (San Diego, CA)進行單糖組成分析。糖蛋白樣品用SDS和2_巰基乙醇變性，并 用PNGase F消化。釋放的混合N-聚糖通過反相HPLC和固相萃取進行純化，然后N-聚糖 的暴露的羥基被甲基化。得到的衍生化糖再次通過反相HPLC純化，并進行MALDI-T0F-MS 分析。免疫前和免疫后IgG的分析確認了 N-聚糖結構的改變對末端唾液酸部分是特異 性的。在腎小球中沉積的小鼠IgG2b抗綿羊抗體之前表明負責攜帶FcyRIV的浸潤巨噬細 胞的接入(engagement)，與預免疫的對照相比顯示出降低的唾液酸含量。實施例6. IVIG中唾液酸和半乳糖之間的連接的分析進行SNA+(西洋接骨木凝結素)IVIG Fc連接的順序Maldi-Tof分析來確定如上所 述在ITP、RA和腎毒性腎炎模型中保護性的唾液酸化的IgG Fc部分的結構。對Maldi-Tof 中產生的聚糖峰進行分離，進一步分級，并重新分析直到獲得半乳糖_唾液酸結構。具有體 內抗炎活性的富集半乳糖_唾液酸的結構的足跡直方圖(footprint histogram)(圖1A) 與唾液酸鍵標準品a 2-3唾液乳糖(圖1B)和a 2-6唾液乳糖(圖1C)的直方圖相比。標準品的特征峰由分別對應a 2_3(圖1B)或a 2_6(圖1A和1C)的箭頭標明，且與從樣品獲 得的峰相比較。實施例7.通過體外糖基化富集a 2-6鍵的IVIG Fc片段提高了 IVIG的抗炎性能。如圖2A所示，IVIG Fc片段的聚糖Maldi-Tof MS分析顯示不以半乳糖作為末 端(峰GO)、以一個半乳糖作為末端(峰G1)、以兩個半乳糖作為末端(峰G2)或以唾液 酸作為末端(由標明“末端唾液酸”的括弧表示)的結構。為了確定2，3或2，6唾液酸化 的IgG Fc的體內活性，樣品用唾液酸酶進行處理，然后再用半乳糖轉移酶將GO(沒有半乳 糖)和G1(單個半乳糖)轉化成G2(完全半乳糖基化)，以增加潛在的唾液酸化位點。如 圖2B所示，超半乳糖基化是通過比較通過ECL測量的末端半乳糖的相對帶強度比和考馬斯 (Coomassie)上樣對照進行確認。使用a 2-6唾液酸轉移酶(“ST6Gal”)或a 2-3唾液酸 轉移酶(“ST3Gal”)進行體外唾液酸化(圖2C)，并使用SNA對a 2_6鍵(上部)或使用 ECL對a 2-3鍵(中間)和對考馬斯(底部)的凝集素印跡分析來進行確認。為了評價體 外唾液酸化的Fc抑制炎癥的能力(圖2D)，小鼠接受0. 66mg的a 2-6唾液酸化Fc (黑三 角)或0. 66mg的a 2-3唾液酸化的Fc (紅三角)。一小時之后，施用0. 2ml的K/BxN血清， 并在接下來的7天中觀察足墊腫脹(臨床評分)。觀察到2，6唾液酸化的IgG Fc片段的抗 炎活性，但是沒有觀察到2，3唾液酸化分子的抗炎活性。這些結果與以上所示的數據一致， 并表明優(yōu)先的2，6唾液酸-半乳糖鍵參與唾液酸化IgG的抗炎活性。實施例8.去除a 2-6而非2，3唾液酸鍵消除了 IVIG的免疫抑制性質使用連接特異性的唾液酸酶(SA)來處理IVIG，并通過凝集素印跡(圖3A)確認消 化。上圖顯示出IVIG中a 2-6鍵(左道)和a2-3SAtx IVIG (中間道)的陽性西洋接骨木 凝集素(SNA)染色，但是在a2-3，6SA tx IVIG(右道)中并未顯示出陽性染色。中間圖是 a 2-3唾液酸鍵(MAL I)的點印跡，僅對于胎球蛋白陽性對照顯示為陽性染色；每個點上樣 100 Pg蛋白質。下圖顯示考馬斯上樣對照。在印跡和凝膠中顯示10 yg/道。為了檢驗特 異性去除唾液酸部分的效應，小鼠在施用200iaK/BxN血清之前給予lg/kg的IVIG制劑。 如圖3B所示，在一周的時間內在施用K/BxN的血清的小鼠(白圈)中觀察到腳墊腫脹，如 臨床評分所測量的。IVIG處理的小鼠顯示出最小的腫脹(黑三角)，使用a2-3SA tx IVIG 處理的小鼠(白三角)也是這樣，而接受a 2-3，6SA tx IVIG的小鼠(方形)沒有受到對 腳墊腫脹的保護。實施例9.細胞毒性降低不依賴于唾液酸和半乳糖之間連接的性質本發(fā)明人之前已經證明，與IgG的Fc域結合的N連接聚糖的唾液酸化造成FcR結 合降低，導致A/I比例的降低(Kaneko等人，Science 313，670 (2006))，該比例是由IgG Fc 結合單個激活(A)或抑制(I)IgG Fc受體的親和常數得到的值。已經表明，該比例是特定 IgG Fc 的體內細胞毒性的指征(F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510(2005))。 因此，F(xiàn)c唾液酸化降低了 IgG抗體在誘導的血小板減少癥模型和體外ADCC模型中的細胞毒 性(Kaneko 等人，Science 313，670 (2006)，Scallon 等人，Mol. Immunol 44,1524(2007))。 因此，本發(fā)明人開始確定是否FcR結合和細胞毒性的這種降低受到唾液酸_半乳糖鍵的影 響。原先已經證明導致血小板消耗的單克隆抗血小板IgG2b抗體如上所述在體外進行唾液 酸化，并測試其體內活性。在血小板減少癥的體內模型中(圖4)，體外末端2，3和2，6唾 液酸化的IgG Fc都降低了該抗血小板抗體6A6-IgG2b的細胞毒性，這與之前的研究一致(Kaneko 等人，Science 313，670 (2006)，Scallon 等人，Mol. Immunol 44,1524(2007))。因 此，F(xiàn)c唾液酸化對IgG抗體的細胞毒性的作用并不依賴于與倒數第二個半乳糖的連接的特 異性。相反，唾液酸化的IgG Fc片段的抗炎活性(本發(fā)明人已經證明依賴于標準IgG Fc 受體的性質(F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510 (2005) ；F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch,J Exp Med 204,11(2007)))對2，6唾液酸-半乳糖鍵顯示出明顯的優(yōu)先性， 如圖3B所示。這些結果進一步支持本發(fā)明人之前的觀察，即IVIG的抗炎性質是通過不參與 與標準Fc y R結合的獨特途徑介導的，這與之前接受的模型截然相反(Park-Min等人， Immunity 26,67(2007) ；Siragam 等人，Nat Medl2，688 (2006))。實施例10. 2，6唾液酸化的IgG Fc的體內抗炎活性僅僅是IgG Fc聚糖的性質為了完全證明2，6唾液酸化的IgG Fc的體內抗炎活性僅僅是IgG Fc聚糖的性質 而不是由可能在異源的IVIG Fc制劑中發(fā)現(xiàn)的其他組分產生的，使用源自293T細胞中表達 的cDNA(SEQ ID NO. 1)的同源重組人IgGl Fc底物(rRc)來重演唾液酸化的IVIG Fc的抗 炎活性。純化的重組人IgGl Fc片段是如上所述通過0 1，4半乳糖基化，然后再進行2，6唾 液酸化而體外工程化的聚糖(圖5A)。該制劑進行純化并在體內分析之前通過凝集素印跡 和MALDI-T0F分析進行表征(圖5A)。通過凝集素印跡對具有ECL的末端半乳糖(上圖)、 具有SNA的a 2，6唾液酸(中間圖)確認糖基化，且考馬斯上樣對照顯示于底圖中。在K/BxN血清之前一小時向小鼠施用IVIG、SNA+IVIG Fc或唾液酸化的rFc (2，6ST rFc)，然后在接下來的幾天內監(jiān)測足墊腫脹。如圖5B所示，2，6唾液酸化的重組人IgGl Fc 片段顯示出與IVIG衍生的唾液酸富集Fc片段(SNA+IVIG Fc)或體外2，6唾液酸化的IVIG 衍生Fc片段(2，6ST IVIG Fc)相當的抗炎活性。每組4_5只小鼠的臨床評分的平均值和 標準差進行作圖，*表示通過Kruskal-Wallis Anova，再進行Dunn’ s post hoc確定的p < 0. 05。這些制劑中的各個制劑在30mg/kg時是有效的，這與天然IVIG所需的 1，000-2，000mg/kg 形成對比(表 1)。表1.在關節(jié)炎模型中導致相同程度的炎癥抑制的含F(xiàn)c片段的制劑的不同劑量。
本文中引用的所有專利和非專利出版物通過引用方式結合在本文中，就好像這些
專利和非專利出版物的每篇均通過引用方式全文結合在本文中。此外，盡管本發(fā)明根據具
體實施例和實施方式進行了描述，但是應該理解，這些實施例和實施方式僅僅是本發(fā)明的
原理和應用的說明。因此，可以理解的是，可以對舉例說明的實施方式做出多種改變，且可
以在不偏離如下面的權利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下采用其他的配置。
權利要求
一種包含至少一個IgG Fc區(qū)的分離的多肽，所述多肽與未純化的抗體制劑相比具有改變的性質，其中所述分離的多肽的唾液酸化比未純化的抗體制劑的唾液酸化高。
2.如權利要求1所述的分離的多肽，其中所述至少一個IgFFc區(qū)被至少一個半乳糖部 分糖基化，該半乳糖部分通過α 2,6鍵連接到相應的末端唾液酸部分上，且其中所述多肽 與未純化的抗體制劑相比具有較高的抗炎活性。
3.如權利要求1所述的分離的多肽，其中所述至少一個IgFFc區(qū)被至少一個半乳糖部 分糖基化，該半乳糖部分通過α 2,6鍵連接到相應的末端唾液酸部分上，且其中與未純化 的抗體制劑相比，所述多肽與選自Fc y RIIA、Fc y RIIC和Fc Y RIIIA的Fc激活受體的結合 降低。
4.如權利要求1所述的分離的多肽，包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)，所述多肽 與未純化的抗體相比具有較高含量的所述通過α 2，6鍵連接到相應的末端唾液酸部分上 的至少一個半乳糖部分。
5.如權利要求1所述的分離的多肽，來自天然存在的抗體源或重組抗體源。
6.如權利要求1所述的分離的多肽，其中所述未修飾的抗體包含IVIG。
7.如權利要求1所述的分離的多肽，其從重組源產生且缺少Fab區(qū)，其中所述至少一個 IgG Fc區(qū)被兩個半乳糖部分糖基化。
8.如權利要求1所述的分離的多肽，由包含SEQID NO 1的核酸序列編碼。
9.如權利要求1所述的分離的多肽，源自具有在蛋白質的多糖鏈中至少一種半乳糖部 分和相應的末端唾液酸之間產生α 2，6鍵的增強的活性的細胞系。
10.如權利要求1所述的分離的多肽，通過用α2-6唾液酸轉移酶處理進行修飾。
11.一種調節(jié)包含F(xiàn)c區(qū)的多肽的性質的方法，包括改變Fc區(qū)的多糖鏈的唾液酸化。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述性質包括比未純化的抗體更高的抗炎活性。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述改變唾液酸化的步驟包括提供包含至少一個Fc區(qū)的多肽的未純化源，所述包含至少一個Fc區(qū)的多肽的未純化 源包括個包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽，所述多糖鏈包含通過α 2，6鍵連 接到半乳糖部分上的末端唾液酸，和包含缺少多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽，所述多 糖鏈包含通過α 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末端唾液酸；和提高所述包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽與所述包含缺少多糖鏈的至少 一個Fc區(qū)的多個多肽的比，所述多糖鏈包含通過α 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末端唾液 酸。
14.如權利要求11所述的方法，其中通過在表達系統(tǒng)中表達包含核酸序列的載體來提 供所述包含至少一個Fc區(qū)的多肽的未純化源，其中所述核酸序列被翻譯成IgG抗體。
15.如權利要求11所述的方法，其中所述提高包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個 多肽與包含缺少多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽的比的步驟是通過去除包含缺少多糖 鏈的至少一個Fc區(qū)的多肽實現(xiàn)的，所述多糖鏈包含通過α 2，6鍵連接到半乳糖部分上的末 端唾液酸。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述去除是通過選自HPLC、凝集素親和色譜、高ρΗ 陰離子交換色譜及其任意組合的方法實現(xiàn)的。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述凝集素親和色譜是使用對半乳糖部分和末端唾液酸之間的α2，6鍵的親和力比對α _2，3鍵的親和力低的凝集素進行的。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述提高包含具有多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個 多肽與包含缺少多糖鏈的至少一個Fc區(qū)的多個多肽的比的步驟是通過富集包含具有多糖 鏈的至少一個Fc區(qū)的多肽的所述未純化源實現(xiàn)的，所述多糖鏈包含通過α 2，6鍵連接到半 乳糖部分上的末端唾液酸。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述富集是通過選自HPLC、凝集素親和色譜、高ρΗ 陰離子交換色譜及其任意組合的方法實現(xiàn)的。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述凝集素親和色譜是使用對半乳糖部分和末端 唾液酸之間的α2，6鍵的親和力比對α _2，3鍵的親和力高的凝集素進行的。
21.如權利要求18所述的方法，其中所述富集是通過使用酶進行化學反應實現(xiàn)的，所 述酶在連接到包含至少一個Fc區(qū)的多肽上的糖和末端唾液酸之間建立α 2，6鍵。
22.—種治療炎性疾病的方法，所述炎性疾病選自關節(jié)炎、血小板減少癥和腎炎，該方 法包括向患者施用治療有效劑量的權利要求1所述的多肽。
23.一種治療炎性疾病的方法，包括向需要治療的受試者施用包含多個分離的多肽的 治療組合物，所述多個分離的多肽各包含至少一個IgG Fc區(qū)，其中各個Fc區(qū)的第一部分包含具有通過2，6鍵連接到相應的末端唾液酸上的半乳糖部分 的相應糖鏈；所述治療組合物的劑量小于包含多個分離的多肽的第二組合物的劑量，該多個分離的 多肽各包含至少一個IgG Fc區(qū)，具有包含相應糖鏈的相應Fc區(qū)的第二部分，所述糖鏈具有 通過2，6鍵連接到相應的末端唾液酸上的半乳糖部分；和或者第一部分比第二部分大，從而所述治療組合物的劑量和所述第二組合物的劑量抑制炎 癥的程度基本相同，或者第一部分比第二部分大，從而所述治療組合物抑制炎癥的程度比相同劑量的所述第二 組合物高。
24.一種包含含有Fc區(qū)的糖蛋白的組合物，其中所述組合物配制成包含足以在哺乳動 物中獲得免疫抑制活性的量的唾液酸化糖蛋白。
25.如權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含的唾液酸化糖蛋白的量為約 5%或更多。
26.如權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含的唾液酸化糖蛋白的量為約 10%或更多。
27.如權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含的唾液酸化糖蛋白的量為約 30%或更多。
28.如權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含的唾液酸化糖蛋白的量為約 5% -約 30%。
29.如權利要求24所述的組合物，其中所述唾液酸化糖蛋白包含一個或多個末端唾液 酸殘基或其類似物。
30.如權利要求29所述的組合物，其中所述末端唾液酸殘基通過α2，6鍵連接到糖蛋白上。
31.一種IVIG衍生的組合物，配制成包含約5% -約30%量的唾液酸化的含F(xiàn)c的糖蛋白，其中所述唾液酸化的糖蛋白包含通過α 2，6鍵連接到糖蛋白上的一個或多個末端唾液酸殘基。
32.—種重組Fc糖蛋白或其片段，包含通過α 2，6鍵連接到糖蛋白上的至少一個末端 唾液酸殘基或其類似物。
33.一種重組Fc糖蛋白，包含在Asn 297處的N連接的糖，其中所述糖具有雙觸角的 GlnNac2、Man3、GlcNAc2、Gal2結構，所述結構具有通過α 2，6鍵連接的一個或多個末端唾液酸殘基。
34.包含前述權利要求中任一項所述的含F(xiàn)c的糖蛋白，其中所述Fc區(qū)是IgG或其亞類。
35.一種包含權利要求24所述的糖蛋白的藥物制劑。
36.一種通過使用權利要求35所述的藥物制劑治療受試者的炎性疾病的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含至少一個IgG Fc區(qū)的多肽，其中所述至少一個IgG Fc區(qū)被至少一個半乳糖部分糖基化，該半乳糖部分通過α2，6鍵連接到相應的末端唾液酸部分上，且其中所述多肽與未純化的抗體相比具有較高的抗炎活性。
文檔編號A61K39/395GK101896202SQ200880120908
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2007年12月14日
發(fā)明者F·尼默雅恩, J·拉韋施, 金子佳賢 申請人:洛克菲勒大學