專利名稱：預(yù)防和治療腫瘤的方法和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療腫瘤的方法和化合物。還提供在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序 性細胞死亡的方法和在受試者中診斷發(fā)生贅生物風(fēng)險的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是全世界死亡的主要原因，并且是發(fā)達國家中死亡的第二個主要原因，甚至 是例如澳大利亞、日本、韓國、新加坡和英國及西班牙的男性人群死亡的首要原因。每年患 癌癥的人數(shù)量不斷增加。目前，癌癥治療包括手術(shù)或集中在與細胞轉(zhuǎn)化成惡性細胞相關(guān)的功能或遺傳改變 上。理想的抗癌藥物應(yīng)該選擇性地殺死，或至少抑制快速增殖的癌性細胞，而不影響非癌 性細胞。目前的方法包括使用針對選定類型癌細胞的標(biāo)記的抗體的免疫療法(例如美國 專利申請2005/0244417)、應(yīng)用在特定類型癌細胞上表達的受體的拮抗劑(美國專利申請 2006/0147456)、應(yīng)用含有干擾素的殼聚糖-脂類顆粒(美國專利申請2005/0266093)，以及 應(yīng)用作為特定類型前列腺癌細胞的細胞毒性劑通過未知機制起作用的化合物(美國專利 申請 2005/0245559)。目前已經(jīng)努力研究的另一手段是開發(fā)外遺傳癌癥療法，因為已知在癌細胞中具 有DNA甲基化的異常模式超過20年了(對于綜述，參閱例如Brown，R.和Strathdee，G.， Trends in Molecular Medicine(2002)8,4(Suppl.), S43—S48，or Yoo, C. B.禾口 Jones， P. Α.，Nature Reviews Drug Discovery (2006) 5，1，37-50)。然而，僅兩種 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶
抑制劑5-氮胞苷(Vidaza )和脫氧氮雜胞苷(Dacogen )已經(jīng)進入市場。已經(jīng)允 許它們用于治療骨髓增生異常綜合征，這是也稱為“白血病前期”的一種血液學(xué)病癥。因此 本領(lǐng)域仍然需要用于治療或預(yù)防癌或腫瘤性疾病的新化合物和組合物，其優(yōu)先快速殺死癌 性細胞。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供能夠優(yōu)先殺死癌細胞而不影響非癌性細胞的方法，以 及化合物和組合物。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供診斷腫瘤發(fā)生風(fēng)險的方法。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供防止、抑制、阻止或逆轉(zhuǎn)細胞中腫瘤發(fā)生的方法。所述方法包括增加細胞中DACT( "dapper, β聯(lián)蛋白的激動劑、同源物”)蛋白質(zhì)或其功能片段的量 和/或活性。第二方面，本發(fā)明提供在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡的方法。所述方法包括 增加細胞中DACT蛋白質(zhì)或其功能片段的量和/或活性。一般地，程序性細胞死亡在腫瘤細 胞中被優(yōu)先誘導(dǎo)，而非腫瘤細胞保持基本不受影響。在一些實施方案中，程序性細胞死亡僅 在腫瘤細胞中選擇性被誘導(dǎo)，而非腫瘤細胞保持不受影響。第三方面，本發(fā)明提供藥物組合物。所述藥物組合物包括以下兩種化合物的組合 第一種化合物是通式(I)的化合物 在通式(I)中，A是CH或N，R4和R5相互獨立地是H、脂肪族基團、脂環(huán)族基團、芳 香族基團、芳基脂肪族基團和芳基脂環(huán)族基團，其可任選地包括0-3個雜原子。所述雜原子 可以是N、0、S或Si。R4和R5可任選地連接，以確定脂肪族烴基橋。R2是H或鹵素，如F、 Cl、Br或I。R3是H，或包括1_8個主鏈碳原子和0_3個雜原子的脂肪族或芳基脂肪族基團。 所述雜原子可以是N、0、S、Si，或鹵素，例如Cl、F、Br或I。在一些實施方案中，R2是F或 Cl。在一些實施方案中，R3也可以單獨或與R2同時是F或Cl。第二種化合物是組蛋白脫乙 酰酶抑制劑，如異羥肟酸化合物、環(huán)四肽、苯甲酰胺、親電子的酮、SAHA( Vorinostat⑧)、 PXDlOl ( Belinostat )、MS275、LAQ824/LBH589、CI994、MGCDO103 或 sirtuin 抑制劑。第四方面，本發(fā)明提供通式(I)的化合物在治療腸腫瘤，包括直腸腫瘤和結(jié)腸腫 瘤中的用途。在該方面，本發(fā)明還涉及通式(I)的化合物在制備用于治療腸腫瘤，例如腸癌 的藥物中的用途。第五方面，本發(fā)明提供診斷細胞中腫瘤發(fā)生風(fēng)險的方法。所述方法包括評估(i) 細胞中DACT蛋白質(zhì)的量，(ii)細胞中DACT蛋白質(zhì)的活性，和(iii)翻譯后組蛋白修飾模 式中的一項或更多項。該翻譯后組蛋白修飾通常是組蛋白甲基化和/或組蛋白乙?；?。第六方面，本發(fā)明涉及預(yù)測贅生物對通式(I)的化合物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑
的組合是否敏感的方法。所述方法包括評估(i)DACT蛋白質(zhì)的量，(ii)DACT蛋白質(zhì)的活性，
和(iii)贅生物中翻譯后組蛋白修飾的模式中的一項。在評估DACT蛋白質(zhì)的量中，其減少
的量表明贅生物對通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合敏感。在評估DACT
蛋白質(zhì)的活性中，其降低的活性表明贅生物對通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑
的組合敏感。在評估翻譯后組蛋白修飾的模式中，改變的翻譯后組蛋白修飾其改變表明贅生物對通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合敏感。例如可在DACT蛋白質(zhì)的 基因座處改變翻譯后組蛋白修飾的模式。第七方面，本發(fā)明涉及增加細胞中DACT蛋白質(zhì)的量，如絕對量的核酸分子和/或 低分子量有機分子在制備用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。第八方面，本發(fā)明提供鑒定能夠在細胞中預(yù)防腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo) 程序性細胞死亡的候選化合物的方法。所述方法包括向能夠表達DACT蛋白質(zhì)或其功能片 段的細胞中導(dǎo)入所述化合物。此外，所述方法包括確定DACT蛋白質(zhì)的表達。DACT蛋白質(zhì)的 升高表達表示所述化合物能夠在細胞中預(yù)防腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細 胞死亡。第九方面，本發(fā)明提供鑒定能夠在細胞中預(yù)防腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo) 程序性細胞死亡的化合物的體外方法。所述方法包括將所述化合物、DACT蛋白質(zhì)或其功能 片段與dishevelled蛋白接觸。DACT蛋白質(zhì)與dishevelled蛋白之間復(fù)合體形成的增強表 明所述化合物能夠在細胞中預(yù)防腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。附圖簡述當(dāng)結(jié)合非限制性實例和附圖進行考慮時，參考詳細說明更好地理解本發(fā)明。

圖1是Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑特征的簡化圖。沒有Wnt信號，β-聯(lián)蛋白被降解(A)。 Wnt/β-聯(lián)蛋白信號途徑激活后，Dvl結(jié)合Frz受體，由此允許β _聯(lián)蛋白進入細胞核并激 活轉(zhuǎn)錄(B)。在本發(fā)明方法的實施方案中，期望Dvl與DACT蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，從而恢復(fù)到 圖IA的狀態(tài)(C)。圖2描述了人DACT3轉(zhuǎn)錄起始位點的作圖。圖3比較了結(jié)腸癌中的DACT3表達與DNA甲基化。A 腫瘤⑴相比于正常粘膜 (N)中Wnt抑制劑(上圖)與Wnt/β-聯(lián)蛋白靶基因(下圖)的等級聚類。B:來自腫瘤和 粘膜樣品的SFRPl和DACT基因的RT-PCR分析。C 腫瘤中SFRPl和DACT3的甲基化狀態(tài)。 D 癌細胞系相比于正常組織中SFRPl和DACT基因的RT-PCR分析。E 癌細胞系中SFRPl和 DACT基因的甲基化狀態(tài)。F 非癌性細胞系和癌細胞系的DNA中的CpG位點的甲基化狀態(tài)。 G 在沒有和有5-AzaC的癌細胞中以及缺少DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和3b的細胞中DACT基因啟 動子的甲基化特異性PCR。H 用5-AzaC處理的癌細胞中SFRPl和DACT基因的RT-PCR分 析。圖4描述了通過Chip技術(shù)對DACT基因中組蛋白修飾的分析，顯示了癌細胞(B) 和非癌細胞(C)中DACT3處的組蛋白標(biāo)記(A)、H3K27me3和H3K4me3。圖5表明了 DZN印/TSA組合對癌細胞中DACT3表達(A，B)和組蛋白修飾(C，D)的影響。圖6表明了 DZN印/TSA組合對癌細胞中β -聯(lián)蛋白磷酸化(A)和定位(B)、Wnt/ β-聯(lián)蛋白信號途徑組分(C，D)和程序性細胞死亡(E-G)的影響。圖7描述了癌細胞中DACT基因的組蛋白修飾。圖8顯示了在mRNA水平(A，C)和程序性細胞死亡(B，C)方面，與使用siRNA缺 失DACTl的癌細胞相比，DZN印/TSA對使用shRNA(A，B)和siRNA(C，D)缺失DACT3的癌細 胞的影響。圖9表明通過Western印跡(A，B)、免疫熒光成像(C)和細胞生長⑶檢測在結(jié)腸直腸癌細胞中異源過表達DACT3對Dvl2和β -聯(lián)蛋白的影響。圖10顯示了在DZNep/TSA存在和缺失下GSK-3抑制(LY2119301)對B-聯(lián)蛋白水 平的影響。圖11描述了癌細胞系中DACT3mRNA(A)和蛋白質(zhì)⑶的水平。圖12列出了癌細胞中被DZN印/TSA處理重新激活的基因。圖13表明了 DZN印與其他組蛋白脫乙酰酶抑制劑在誘導(dǎo)程序性細胞死亡㈧和 誘導(dǎo)DACT3并抑制β-聯(lián)蛋白⑶中的協(xié)同作用。圖14Α顯示了 DZN印/TSA施用對腫瘤體積的體內(nèi)影響。圖14Β顯示了 DZN印與其它組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合對腫瘤體積的體內(nèi)影 響。圖15描述了用于獲得圖14Β數(shù)據(jù)的方案設(shè)計。圖16描述了在用DZN印和SAHA抑制HCT116異種移植物腫瘤生長的過程中體重 的改變。圖17描述了在用DZN印和SAHA抑制HCT116異種移植物腫瘤生長的過程中的腫 瘤體積。圖18是總結(jié)在體內(nèi)用DZN印和SAHA處理的過程中腫瘤生長抑制的表。發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)DACT蛋白質(zhì)，特別是DACT3作為Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 負調(diào)節(jié)物起作用。在多種生物中也稱為Dapper (Dpr)、Frodo、(Frd)、THYEX3、HNG3和 MTNG3的DACT蛋白質(zhì)家族目前已知包括3個成員，稱為DACTl到DACT3 (Fisher，D. Α.，等， Developmental Dynamics (2006) 235，2620—2630)。DACT3 包括例如 UniProtKB/Swiss—Prot 登錄號 Q96B18 (人)、Q0PHV7 (小鼠)，NCBI 登錄號 AAH16161 (人)，UniProtKB/TrEMBL 登錄號A8IP73(小鼠)的蛋白質(zhì)或NCBI登錄號NW_001838496 (人)、NM_145056 (人)、 NM_145056(爪蟾)、XR_027789 (牛)、NW_001084763 (大鼠)、NW_047556 (大鼠)、 ΝΜ_001081655 (小鼠)、NW_001030832 (小鼠)、DQ832319 (小鼠)或 NW_876270 (狗)的核 酸分子編碼的蛋白質(zhì)。DACT2包括例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q673G8(斑馬魚)、 Q5SW24 (人)，或Q7TN08 (小鼠)，UniProtKB/TrEMBL登錄號Q4V9Q8 (斑馬魚)的蛋白質(zhì)或 NCBI 登錄號 BC111790(人)、BC111764(人)、BC092498 (人)、ΝΜ_001077794 (斑馬魚)、 NM_001107464(大鼠)、NW_001236578 (黑猩猩)、XM_001145122 (黑猩猩)、BV677538 (稱 猴)、AC_000039 (小鼠)、NM_172826 (小鼠)、NW_001030598 (小鼠)、NT_039649 (小鼠)或 BC058740(小鼠)的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。已經(jīng)鑒定了編碼人DACTl的HDPRl基因的兩 個選擇性剪接轉(zhuǎn)錄物，稱為α和β (Yau，Oncogene (2005) 24，1607-1614)。術(shù)語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指細胞機制和響應(yīng)某一條件或變化而在細胞 組分上起作用的分子。通常此類機制和分子傳送胞外信號通過細胞膜變成胞內(nèi)信號。該信 號然后可以刺激細胞響應(yīng)?！癢nt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分”通常是轉(zhuǎn)導(dǎo)來自Wnt蛋白質(zhì)和Frz受 體和/或Wnt蛋白質(zhì)和LRP蛋白質(zhì)(LDL-相關(guān)受體蛋白)，例如LRP5或LRP6之間相互作 用的信號的組分。因為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是復(fù)雜的，并涉及廣泛的反饋調(diào)節(jié)，所以具有許多 可能還未發(fā)現(xiàn)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。示例性Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分包括(至少暫時 地)膜結(jié)合蛋白Axin和Dishevelled、胞外Wnt相互作用蛋白sFRP、WIF-I, LRP滅活蛋白
13Dkk和Krn、胞質(zhì)蛋白β-聯(lián)蛋白、β-聯(lián)蛋白“降解復(fù)合體” APC、GSK30、CKIa和PP2A的 成員、核轉(zhuǎn)運蛋白APC、pygopus和bcl9/legless、和轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF、Groueho和多種組 蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶如CBP/p300和Brg-I。已經(jīng)顯示DACT (Dpr/Frodo)基因家族的成員通過與Dishevelled(Dvl)相互 作用參與 Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Cheyette，B. N.，等，Dev Cell (2002) 2，449-461)， 所述DisheveIled(Dvl)是胞質(zhì)支架蛋白，其是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心組分(Bilic，J.， 等，Science(2007)316，1619-1622 ;Logan，C. Y.，& Nusse，R.，Annu Rev Cell Dev Biol (2004) 20，781-810)。已經(jīng)顯示DACT 1通過保守的C末端PDZ結(jié)合基序結(jié)合Dvl PDZ 結(jié)構(gòu)域與 Dvl 形成復(fù)合體(Cheyette 等，2002，上文；Wong，H. -C.，等，Molecular Cell (2003) 12，5，1251-1260)。公開的數(shù)據(jù)揭示，DACT 1 的 PDZ 結(jié)合肽可與 Frizzled 受 體競爭Dvl-I的相同位點(Wong，H.-C.，等，2003，上文)。然而迄今為止沒有確定DACT 蛋白質(zhì)的確切功能。一些數(shù)據(jù)看起來表明DACTl和DACT2在一些生物背景中拮抗Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而其它數(shù)據(jù)看起來表明它們可能在其它生物背景中激活Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且 它們也可能在TGF-β/Nodal信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用(Gloy，J.，等，Nat Cell Biol (2002) 4, 351-357 ；Hikasa, H.，& Sokol, S. Y.，Development (2004) 131，4725-4734 ；Su, Y.，等，F(xiàn)ASEB J (2007) 21,682-690 ；Zhang, L.,等，J Biol Chem(2006) 281,8607-8612 ；Zhang, L.,等， Science(2004)306，114-117 ;Bikkavilli，R. K.，等Journal of Cell Science (2008)，121， 2，234-245)。在本申請的優(yōu)先權(quán)日后，獨立于本發(fā)明，已經(jīng)報道了 DACTl通過防止β -聯(lián)蛋 白與轉(zhuǎn)錄因子淋巴增強因子I(LEFl)形成復(fù)合體并通過增強細胞核中LEFl與組蛋白脫乙 酰酶1之間的相互作用來控制Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Gao，X.，等，J. Biol. Chem. (2008) doi/10. 1074/jbc. M804088200)。特別是對于DACT3，在任何生物中至今仍未知道信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 的功能并且對與疾病如腫瘤發(fā)生的任何相關(guān)性也一無所知。Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(對于最近的簡單綜述，參閱例如Cadigan，K.M.， Current Biology (2008) 18, 20, R943-R947)是古老且高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與多種 生理學(xué)過程如胚胎發(fā)育、組織再生，包括例如祖細胞形成和增殖、前體細胞的分化和維持、 和干細胞系或干細胞的自我更新。Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑的激活增強了體細胞重新發(fā)育成誘 導(dǎo)的多能干細胞(Marson，Α.，等Cell Stem Cell (2008) 3，132-135)。所述途徑也涉及多 種狀況如心血管疾病、骨畸形、衰老、肥胖、糖尿病、神經(jīng)變性(包括精神分裂和阿爾茨海默 病)、急性腎功能衰竭和多囊腎以及炎癥。其也可促進附肢再生和傷口恢復(fù)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 氧化應(yīng)急激活該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在該方面，在視網(wǎng)膜色素上皮中，已經(jīng)報道了所述途徑在白 光照射后被激活，導(dǎo)致失去上皮標(biāo)記并獲得間質(zhì)標(biāo)記(Iriyama，Α.，等，Biochem. Biophys. Res. Commun. (2008)375，173-177)。還已知異常的Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與癌相關(guān)。也已經(jīng)在潰瘍性結(jié)腸炎中 發(fā)現(xiàn)了異常的Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中所述途徑在惡性發(fā)展的早期階段被激活 (van Dekken, H.,等，Acta Histochemica(2007) 109，4，266/272)。Wnt/β -聯(lián)蛋白信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活例如是結(jié)腸癌中的主要驅(qū)動力(Kinzler，K. W.，& Vogelstein, B.， Cell (1996) 87，159-170 ；Su, L. K.，等，Science (1992) 256，668-670 ；van de ffetering, Μ.， 等，Cell (2002) 111，241-250)。多于90%的全部結(jié)腸直腸癌包括Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑的激 活突變，使得這種癌成為用于分子干預(yù)的有吸引力的模型。
Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑組分包括APC、Axin和β -聯(lián)蛋白本身中的突變是導(dǎo)致癌癥的 異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的公認原因(Lammi,L.，等，Am J Hum Genet (2004) 74，1043-1050· ；Liu, W.，等，Nat Genet (2000) 26，146-147. ；Morin, P. J.，等，Science (1997) 275，1787-1790.； Su等，1992，上文)。作為示例性實例，由移碼、無義或剪接位點突變引起的APC等位基因的 截短突變導(dǎo)致腺瘤息肉病，其為一種類型的人類結(jié)腸癌。作為另一實例，已經(jīng)顯示乳腺和上 皮的癌干細胞的形成通過Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑被激活。也已經(jīng)顯示聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 參與癌干細胞群體的維持(Malanchi，I.，等，Nature (2008) 452，7187，650-653)。已經(jīng)顯示 DMBA-TPA或Ras-誘導(dǎo)的腫瘤中β -聯(lián)蛋白基因的缺失導(dǎo)致腫瘤的完全消退。導(dǎo)致癌癥的Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑的組分的遺傳缺陷共同擁有的是它們導(dǎo)致β -聯(lián) 蛋白在細胞核中的積累。在非癌性細胞中，因為酪蛋白激酶1和糖原合酶激酶3的磷酸化作 用，在缺少Wnt配體的情況下β-聯(lián)蛋白的胞質(zhì)水平保持低水平。磷酸化的β-聯(lián)蛋白被泛 素化，隨后被降解(參閱圖1Α)。然而突變可導(dǎo)致胞質(zhì)β -聯(lián)蛋白的積累，由此模仿組成型 的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已經(jīng)在多種癌形式中發(fā)現(xiàn)了 Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑組分(包括β-聯(lián)蛋白 基因)的突變，所述癌形式如黑素瘤、食管癌、甲狀腺癌、小腸腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、 胃癌、卵巢癌、子宮癌、肝細胞癌、乳腺癌、毛基質(zhì)細胞腫瘤(毛基質(zhì)瘤)、硬纖維瘤、Wilm’ s 腫瘤(腎)、成神經(jīng)管細胞瘤(兒童期最常見的腦腫瘤)、滑膜肉瘤和子宮內(nèi)膜癌(對于綜 述，參閱例如 Giles，RH，等，Biochim Biophys Acta (2003) 1653，1-24)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Wnt 信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起作用。認為非磷酸化并因此穩(wěn)定的β-聯(lián)蛋白易位到細胞核中(參閱圖1Β)。細胞核 β _聯(lián)蛋白與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄輔因子家族的成員相互作用來激活下游靶基因，如可導(dǎo)致細胞 轉(zhuǎn)化的 Cyclin Dl 和 Myc (He, Τ. C.，等，Science (1998) 281，1509-1512 ；Morin 等，1997， 上文；Tetsu 和 McCormick，1999，上文；van de Wetering 等，2002，上文)。結(jié)腸癌細胞中 Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)程序性細胞死亡或生長抑制這一事實 (Fujii, N.，等，Cancer Res (2007) 67，573-579 ；He, B.，等，Oncogene (2005) 24，3054-3058 ； Kwong, K. Y.，等，Oncogene (2002) 21，8340-8346)已經(jīng)推動了開發(fā)靶向該途徑的治療 策略的大量努力(Barker，N.，&C1 ever s，H. Nat Rev Drug Discov (2006) 5,997-1014 ； Lepourcelet，M.，等，Cancer Cell (2004) 5，91-102 ;Li，H.，等，Cancer Biol Ther (2002) 1, 621-625)。如上所提及，最近其它人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DACTl可通過其C末端結(jié)構(gòu)域與β-聯(lián)蛋白 相互作用(Gao等，2008，上文)。DACTl還具有核定位信號以及核輸出信號并從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn) 移到細胞核中，反之亦然(如上)。已經(jīng)揭示β-聯(lián)蛋白的與DACTl相互作用的區(qū)域?qū)?yīng)于 與LEF/TCF相互作用的區(qū)域，并且已經(jīng)顯示β -聯(lián)蛋白與LEFl之間復(fù)合體的形成被DACTl 破壞(如上)。通過該機制，DACTl很可能拮抗Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。進一步顯示DACTl 能通過其C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合組蛋白脫乙酰酶1并加強組蛋白脫乙酰酶1與LEFl之間的相 互作用(如上)。這揭示了 DACTl能夠控制Wnt/ β -聯(lián)蛋白的靶標(biāo)，例如c-MYC或細胞周期 蛋白Dl的表達，通過增強協(xié)阻抑物組蛋白脫乙酰酶1的作用進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到包括DACT3的DACT蛋白質(zhì)與DisheveIled(DVL)蛋白質(zhì)形成 復(fù)合體。術(shù)語“復(fù)合體”指至少兩個分子彼此結(jié)合的裝配體。Dvl蛋白由N末端DIX結(jié)構(gòu) 域、中間PDZ結(jié)構(gòu)域和C末端DEP結(jié)構(gòu)域組成。這三個結(jié)構(gòu)域中，PDZ結(jié)構(gòu)域在Wnt信號轉(zhuǎn)
15導(dǎo)中起最重要的作用。已經(jīng)報道了超過20種天然配體結(jié)合Dvl PDZ結(jié)構(gòu)域，已經(jīng)表明其中 大多數(shù)對經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt信號途徑在生物學(xué)上是重要的。Dvl也對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān) 重要(Bilic 等，2007，上文；Logan, C. Y. , & Nusse, R. Annu Rev Cell Dev Biol (2004) 20， 781-810)。癌細胞和其它背景中Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的激活在分子上觀察為細胞核 與細胞質(zhì)中未磷酸化的非膜結(jié)合的β-聯(lián)蛋白的積累(Peifer，Μ.，& Polakis，P.， Science(2000)287，1606-1609 ；Polakis, P.，Curr Opin Genet Dev(2007) 17，45-51)。已 經(jīng)在幾種類型的癌，如非小細胞肺癌和間皮瘤中觀察到了 Dvl蛋白的過表達。已經(jīng)顯示Dvl 蛋白的表達與肺癌的弱分化相關(guān)，并且已經(jīng)顯示Dvl蛋白通過Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促 進了肺癌的轉(zhuǎn)移(Wei，Q.，等，Lung Cancer (2008) doi 10. 1016/j. lungcan. 2008. 06. 018)。如上指出，前面已經(jīng)通過酵母雙雜交系統(tǒng)和免疫沉淀表明DACT 1與Dvl之 間可形成復(fù)合體，其為Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的主要激活子(Gloy，J.，等，Nature Cell Biology (2002) 4，351-357，Cheyette 等，2002，上文)。Gloy 等(上文)鑒定了 DACT 的保 守C末端結(jié)構(gòu)域與N末端DIX結(jié)構(gòu)域之間的相互作用和Dvl的相鄰序列(如上)，其含有 PDZ結(jié)構(gòu)域?；诮Y(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，Cheyette等(上文)鑒定了在復(fù)合體形成中Dvl 1的PDZ結(jié) 構(gòu)域與DACT的C末端區(qū)的相互作用。使用化學(xué)位移干擾NMR譜和酵母雙雜交篩選，Wong 等(2003，上文)鑒定了 DACT的C末端結(jié)構(gòu)域是PDZ結(jié)合基序并且Dvl 1的中心結(jié)合區(qū)是 Dvl 1的PDZ結(jié)構(gòu)域。同時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述PDZ結(jié)構(gòu)域為許多蛋白質(zhì)，包括Frizzled受體的 C末端區(qū)，以及蛋白激酶、磷酸酶和接頭蛋白質(zhì)提供?？课稽c，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DIX結(jié)構(gòu)域允許 Dvl蛋白與Dvl家族的其它成員以及與Axin 二聚化。所有三種Dishevelled蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)域排列，包括PDZ結(jié)構(gòu)域和DIX結(jié)構(gòu) 域。所有三種蛋白質(zhì)也在細胞系中表達，其中Dvl2表達最強(Lee，Y.-N.，等，Cellular Signalling(2008) 20,443-452)。使用siRNA進行的敲除和缺失揭示了三種蛋白質(zhì)的各自 作用，它們至少在Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用看起來依賴于彼此的存在并協(xié)同作用 (如上)。不希望受限于理論的束縛，推測增加細胞中DACT蛋白的量和/或活性的一種結(jié)果 涉及DACT蛋白之間復(fù)合體的形成以及隨后Dvl蛋白的降解。在該方面，本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)與 以前觀察結(jié)果一致，即升高的DACT蛋白水平的一種結(jié)果可能是DisheveIled(DVL)蛋白的 降解(Zhang, L.，等，Science (2004) 306，114-117)。在一些實施方案中，本發(fā)明的用途和方 法因此是實現(xiàn)細胞中Dvl蛋白，如Dvl-1、Dvl-2或Dvl_3總量降低的方法。本發(fā)明人的發(fā) 現(xiàn)也為人結(jié)腸直腸癌中DACTl的表達下調(diào)的前述報道提供了新思路(Yau，T. -0.，等，2005， 上文)。在一般基礎(chǔ)上，本發(fā)明還涉及診斷、預(yù)防和/或治療Wnt-介導(dǎo)的病癥，即以異常 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為特征的生理病癥、狀況或疾病的方法和用途(例如參閱上文)。在該方面， 本發(fā)明還提供藥物組合物，以及預(yù)測Wnt-介導(dǎo)的病癥對該組合物反應(yīng)性的方法。在特定方 面，異常的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是懷疑患有疾病的細胞或組織中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的水平超過類似的 沒有患病的細胞或組織中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的水平。在一些實施方案中，Wnt-介導(dǎo)的病癥包括 腫瘤，包括癌。在該實施方案中，本發(fā)明的方法、化合物和組合物可用于與腫瘤，包括癌相關(guān) 的診斷和/或治療目的。在一些實施方案中，這些方法、化合物和組合物可用于與生理狀況 相關(guān)的診斷和/或治療目的，所述生理狀況選自例如神經(jīng)變性狀況、心血管疾病、急性腎衰竭和多囊腎、骨畸形、衰老、肥胖、糖尿病或炎癥。此外合適的用途包括維持干細胞或祖細胞 的多潛能狀態(tài)和/或自我更新特征、祖細胞形成、祖細胞增殖或體細胞重新發(fā)育成誘導(dǎo)的 多潛能干細胞的調(diào)節(jié)/控制。術(shù)語“癌”指由惡性贅生性細胞的增殖引起的任何癌，例如腫瘤、贅生物、癌、肉瘤、 白血病、淋巴瘤。例如，癌包括，但不限于，間皮瘤、白血病和淋巴瘤，如皮膚T細胞淋巴瘤 (CTCL)、非皮膚外周T細胞淋巴瘤、與人T細胞淋巴細胞病毒(HTLV)相關(guān)的淋巴瘤，如成人 T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B細胞淋巴瘤、急性非淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血 病、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴 性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T細胞白血 病淋巴瘤、急性粒細胞白血病(AML)、慢性粒細胞白血病(CML)或肝細胞癌。更多的實例包 括脊髓發(fā)育不良綜合征、兒童實體瘤，如腦腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細胞瘤、維爾 姆斯瘤、骨腫瘤和軟組織肉瘤、成人常見的實體瘤如頭頸癌-如口腔、喉、鼻咽和食管癌；生 殖泌尿癌-如前列腺、膀胱、腎臟、子宮、卵巢、睪丸癌；肺癌-如小細胞和非小細胞癌；乳腺 癌；胰腺癌；黑素瘤和其它皮膚癌；胃癌；腦腫瘤；與戈爾林綜合征相關(guān)的腫瘤-如成神經(jīng) 管細胞瘤或腦脊膜瘤；和肝癌。本發(fā)明方法處理的癌的額外示例性形式包括，但不限于，骨 骼或平滑肌的癌、胃癌、小腸癌、直腸癌、唾液腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺癌、肛門癌、直腸癌、 甲狀旁腺癌和垂體癌。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防細胞中癌發(fā)生的方法。如此處所用，術(shù) 語癌發(fā)生(癌發(fā)生)指將正常細胞轉(zhuǎn)化成具有增殖病癥的細胞，特別是腫瘤細胞的過程。各 細胞可產(chǎn)生良性腫瘤和/或惡性腫瘤(癌)。良性腫瘤不擴散到身體的其它部位或侵入其 它組織。然而，其可以變得危及生命，其中其壓縮重要結(jié)構(gòu)或在生理上活躍(例如通過產(chǎn)生 激素)。惡性腫瘤可侵入其它器官，擴散到遠處(轉(zhuǎn)移)并對生命造成威脅。各方法包括 施用如上定義的通式(I)的化合物和任選地組蛋白脫乙酰酶抑制劑。在其它實施方案中， 例如通過測定個體細胞，例如腫瘤細胞中DACT蛋白的量監(jiān)測個體中的治療。在監(jiān)測疾病的 治療或進行中，可在不同時間點，如在治療疾病如癌之前、過程中和/或之后從個體中獲得 樣品。在特定實施方案中，將來自個體樣品的DACT蛋白的量、其活性水平和/或外遺傳變 化(見下文)的存在與在不同時間點獲得的其各自對應(yīng)物進行比較。將DACT蛋白的量或 活性和/或外遺傳變化的存在與例如疾病的治療的成功和/或進展相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的一些方法和用途中，DACT蛋白或其功能片段的量和/或活性在細胞中 升高。所述細胞可以是能夠表達Dact蛋白的任何細胞。其例如可以是單個細胞或細胞群 的細胞。在一些實施方案中，所述細胞是體細胞。合適的體細胞的實例包括，但不限于成纖 維細胞、髓樣細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、骨細胞、骨髓細胞、周細胞、樹突細胞、角質(zhì)形成 細胞、脂肪細胞、間充質(zhì)細胞、上皮細胞、表皮細胞、內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、丘細胞、神經(jīng)細胞、 神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、心臟細胞、食管細胞、肌細胞(例如平滑肌或骨骼肌細胞)、 胰臟β細胞、黑素細胞、造血細胞、肌細胞、巨噬細胞、單核細胞和單核細胞。體細胞可以 是任何組織，如皮膚、腎、脾、腎上腺、肝、肺、卵巢、胰腺、子宮、胃、結(jié)腸、小腸、脾、膀胱、前列 腺、睪丸、胸腺、肌肉、結(jié)締組織、骨、軟骨、血管組織、心臟、眼或神經(jīng)組織的細胞。在一些實施方案中，細胞獲得于或來自宿主生物，其可以是任何生物。例如可從各 宿主生物中以樣品例如活組織解剖或血樣的形式直接取得(例如分離)細胞。其也可以從宿主生物中例如分離獲得并隨后培養(yǎng)、生長、轉(zhuǎn)化或暴露于所選治療。在一些實施方案中， 所述細胞可包括在宿主生物中。其例如存在于宿主生物的血液或組織中，包括器官中。從 中衍生或獲得(包括分離、純化或富集)細胞的宿主生物，或其中包括細胞的宿主生物可以 是任何生物，如微生物、動物，如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥、哺乳動物，包括嚙齒類、無脊椎 動物類，例如滑體亞綱，其包括例如青蛙、蟾蜍、蠑螈或東方蠑螈，或植物。哺乳動物的實例 包括但不限于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、狗、山羊、豬、雞、獼猴、黑猩猩 或人。在一些實施方案中，細胞是腫瘤細胞，例如癌細胞。也可從生物，例如從哺乳動物 中獲得各種腫瘤細胞。在其它實施方案中，所述腫瘤細胞可包括在哺乳動物，例如大鼠、 奶牛、豬和人中。也可培養(yǎng)各種腫瘤細胞。其例如可以是細胞系的細胞，如，但不限于，結(jié) 腸直腸癌細胞系 SW480、HT29、RKO、LST-Rl、Caco-2、WiDr、GP2d、HCTl 16、LoVo, LS174T、 VAC05HCA7、LS411、C70、LIM1863、SL-174T、SW1417、SW403、SW620、SW837 或 VAC04A,黑 素瘤細胞系 Α375、Β16(包括 B16-F10)、Bm、K1735-M2、M14、0CM-1 或 WM793，肝瘤細胞系 FHCC-98、H4IIEHep G2、Hep G2f、Huh_7、PLHC-U SMMC-7721、SK-Hepl 或 QGY，肺癌細胞系 A549、ABC-I、EBC-I、LC-l/sq、LCD、LC0K、LK-2、Lul35、MS-I、NCI-H69、NCIH157、NCI-N231、 NL9980、PCI、PC3、PC7、PC9、PC10、PC14、QG56、RERF-LCMS、RERF-LCAI, RERF-LCKJ, SBC3 或 SQ5，食管癌細胞系 A549、EC109、EC9706 或 HKESC-4，胃癌細胞系 BGC823、KAT0-III、MGC803、 MKN-45、SGC7901 或卵巢癌細胞系 A2780、C13 *、CA0V3、D0V_13、H08910 (包括 H0-8910PM)、 OvCA 3、OvCA 420、OvCA 429、OvCA 432、OvCA 433、OvCar 3、0vCar5、OvCA 420、OVHM 或 SK0V-3。用于本發(fā)明方法中的細胞通常能夠表達DACT蛋白，因為其包括一般以DACT蛋白 (無論內(nèi)源還是外源)的功能基因形式存在的編碼DACT蛋白(如DACT2或DACT3)的核酸 序列。在一些實施方案中，所述細胞表達DACT蛋白。在一些實施方案中，例如編碼DACT蛋 白的各內(nèi)源基因在功能上活躍并表達DACT蛋白。在一些實施方案中，編碼DACT蛋白的內(nèi) 源核酸序列是功能上活躍的。然而在這些實施方案中的一些實施方案中，DACT蛋白一般從 外源DACT基因表達?？赏ㄟ^重組技術(shù)，例如通過攜帶DACT蛋白基因的載體(也參考下文) 引入編碼DACT蛋白的外源基因。在該方面，進一步使用含有在宿主細胞中有效起始轉(zhuǎn)錄的 啟動子(無論內(nèi)源還是外源)的載體是有利的。術(shù)語“載體”指可轉(zhuǎn)染到細胞中并在細胞基因組內(nèi)復(fù)制或獨立于基因組復(fù)制的單 鏈或雙鏈環(huán)形核酸分子?？汕懈瞽h(huán)形雙鏈核酸分子并由此通過限制性酶處理將其線性化。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地獲得各種核酸載體、限制性酶和核苷酸序列切割知識。可通過 用限制性酶切割載體并連接兩個片段將編碼DACT蛋白的核酸分子插入到載體中。如此處所用，術(shù)語“啟動子”指基因序列表達所需的核酸序列。啟動子區(qū)因生物不 同而有所變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知不同生物的啟動子區(qū)。例如，在原核生物中，啟動子 區(qū)含有啟動子(其指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的起始)以及DNA序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA時，其將發(fā)起始合成 的信號。這種區(qū)域通常包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的那些5'-非編碼序列，如TATA盒、帽 化序列、CAAT序列等。根據(jù)具體實施方案的需要，組成型和誘導(dǎo)型啟動子均可用于本發(fā)明。 眾所周知多種潛在的宿主細胞識別的大量啟動子。所選啟動子可效連接編碼此處所述多肽 的順反子DNA，通過限制酶消化去除來自源DNA的啟動子并將分離的啟動子序列插入所選載體中實現(xiàn)所述連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子可用于指導(dǎo)所選核酸序列的擴增 和/或表達。如此處所用，術(shù)語“核酸”指任何可能構(gòu)型，如單鏈、雙鏈或其組合的任何核酸分 子。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸類似物或使用核酸化學(xué)產(chǎn)生的DNA或 RNA的類似物、鎖定核酸分子(LNA)、肽核酸分子(PNA)和tecto-RNA分子(例如Liu，B.， 等，J. Am. Chem. Soc. (2004) 126，4076-4077)。PNA分子是其中主鏈?zhǔn)羌匐亩翘堑暮怂岱?子。因此，與例如DNA或RNA相反，PNA—般具有荷電的中性主鏈。然而，PNA能夠雜交至 少互補的和基本互補的核酸鏈，就像DNA或RNA —樣(認為PNA是其結(jié)構(gòu)模擬物)。LNA分 子具有修飾的RNA主鏈，其在C4'和02'之間具有亞甲基橋，所述亞甲基橋鎖定了 N型構(gòu) 型中的呋喃糖，為各分子提供了更高的雙鏈體穩(wěn)定性和核酸酶抵抗力。不像PNA分子，LNA 分子具有荷電的主鏈。DNA或RNA可以是基因組或合成來源并可以是單鏈或雙鏈的。核酸 分子一般是寡聚或多聚的。寡聚核酸分子理解為是大致具有約6到約15個單體單元的分 子。該核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因組DNA、cDNA、合成DNA、DNA和RNA的共 聚物、寡核苷酸等。各核酸還含有非天然核苷酸類似物和/或連接到親和標(biāo)記或標(biāo)簽。已知具有許多核苷酸類似物并且其可用于本發(fā)明的方法中。核苷酸類似物是在例 如堿基、糖或磷酸部分具有修飾的核苷酸。作為示例性實例，已知2’ F，2’ O-Me或2’ H殘基 對siRNA的2’ -OH殘基的取代提高了各RNA的體內(nèi)穩(wěn)定性。堿基部分的修飾包括A、C、G 和T/U的天然和合成修飾、不同嘌呤或嘧啶堿基，如尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基和2-氨 基腺嘌呤-9-基，以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸堿基。其它核苷酸類似物作為通用堿基。通 用堿基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用堿基能夠與任何其它堿基形成堿基對。堿基 修飾經(jīng)常與例如糖修飾，如2' -0-甲氧基乙基組合，例如以實現(xiàn)獨特的性質(zhì)(如提高的雙 鏈體穩(wěn)定性)。可通過增加的表達，通過降低的降解或通過兩者的組合來增加細胞中DACT蛋白 的量?？赏ㄟ^刺激細胞中內(nèi)源DACT蛋白的表達來確定DACT蛋白的增加的表達。因此，可 刺激編碼各DACT蛋白的細胞的各內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯或可降低或終止其抑制狀態(tài)。也可通過在細胞中表達外源DACT蛋白實現(xiàn)DACT蛋白的增加的表達(上文)。作 為示例性實例，例如以載體的形式將包括編碼各DACT蛋白的序列的核酸分子引入各細胞 中。在一些實施方案中，提高細胞中DACT蛋白的活性包括在DACT蛋白與化合物，如有 機低分子量化合物、無機化合物、肽或蛋白質(zhì)之間形成復(fù)合體。如上指出，在一些實施方案中，細胞不表達DACT蛋白。在此類實施方案中，本發(fā)明 的方法可包括激活編碼DACT蛋白的內(nèi)源基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括向細 胞中引入核酸分子，通常是異源核酸分子(上文)，其編碼DACT蛋白，其能夠允許該蛋白質(zhì) 在細胞中表達。此類實施方案中的方法還包括表達外源DACT蛋白。本發(fā)明的方法和用途可還包括評估細胞中DACT蛋白或DACT蛋白的相應(yīng)功能片段 的量或活性。例如可通過抗體如綴合到標(biāo)記上的免疫球蛋白來評估細胞中DACT蛋白的量。在 細胞是分離的細胞或微生物的情況下，例如在細胞膜透化后將細胞內(nèi)免疫球蛋白引入細 胞。然后可在體內(nèi)或離體進行檢測。在一些實施方案中，例如對細胞提取物或細胞裂解物體外進行所述檢測。此類技術(shù)可包括電泳、HPLC、流式細胞術(shù)、熒光相關(guān)光譜學(xué)或這些技術(shù) 的修飾形式或組合。術(shù)語“抗體”一般指免疫球蛋白、其片段或具有免疫球蛋白樣功能的蛋白質(zhì)結(jié) 合分子。(重組)免疫球蛋白片段的實例是Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、雙 抗體、三抗體(Iliades，P.，等，F(xiàn)EBS Lett (1997) 409，437-441)，四抗體(Stone，Ε.，等， Journal of Immunological Methods (2007) 318，88-94)和其它結(jié)構(gòu)域抗體(Holt，L. J.， 等，Trends Biotechnol. (2003)，21，11，484-490)。具有免疫球蛋白樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合 分子的實例是基于脂籠蛋白家族的多肽的突變蛋白(W0 2003/029462 ；WO 2005/019254 ； W02005/019255 ；WO 2005/019256 ；Beste 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1999)96, 1898-1903)。脂籠蛋白，如后膽色素結(jié)合蛋白、人嗜中性粒細胞明膠酶結(jié)合的脂籠蛋白、人 載脂蛋白D、人眼淚脂籠蛋白或生殖糖蛋白具有天然配體結(jié)合位點，其可被修飾使得它們結(jié) 合所選的稱為半抗原的小蛋白區(qū)域。其他蛋白質(zhì)結(jié)合分子的其它非限制性實例是所稱作的 球體(glubody)(參閱TO 96/23879)、基于錨蛋白支架的蛋白質(zhì)(Mosavi，L. K.，等，Protein Science (2004) 13，6，1435-1448)或基于晶狀支架的蛋白質(zhì)(W02001/04144)、Skerra 描 述的蛋白質(zhì)(J. Mol. Recognit. (2000) 13，167-187)、AdNectins,四連蛋白、Avimers 和 擬肽。Avimers含有所謂的A結(jié)構(gòu)域，其在幾種細胞表面受體中作為多個結(jié)構(gòu)域串出現(xiàn) (Silverman, J，等，Nature Biotechnology (2005) 23,1556-1561)。來自人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域 的Adnectins含有三個環(huán)，其可被改造用于免疫球蛋白樣結(jié)合靶標(biāo)(Gill，D. S. & Damle， N. K. ,Current Opinion in Biotechnology (2006) 17，653-658)。來自各種人同三聚體蛋白 質(zhì)的四連蛋白同樣在C型凝集素結(jié)構(gòu)域中含有環(huán)區(qū)，其可被改造用于想要的結(jié)合(上文)。 可作為蛋白質(zhì)配體的擬肽是不同于肽的寡聚(N-烷基)甘氨酸，因為側(cè)鏈連接酰胺氮而非 α碳原子。擬肽通常對蛋白酶和其它修飾酶具有抗性并且比肽具有高得多的細胞滲透性 (參閱例如 Kwon，Y. -U.，和 Kodadek，Τ.，J. Am. Chem. Soc. (2007) 129，1508-1509)。當(dāng)想要 時，可使用修飾劑進一步增加各部分對任何或某一形式、類型等的靶物質(zhì)的親和力。評估DACT蛋白活性可包括測定所述蛋白質(zhì)與Dvl蛋白的結(jié)合。此類測定例如 依賴于體內(nèi)和體外的光譜、光化學(xué)、光度計、熒光計、放射學(xué)、酶學(xué)或熱力學(xué)手段。光譜檢 測方法的實例是熒光相關(guān)光譜學(xué)(參閱例如Haustein，Ε.，& Schwille，P.，Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2007) 151-169)。光化學(xué)方法例如是光化學(xué)交聯(lián)。光敏的、熒光 的、放射性的或酶促標(biāo)記各自的用途是光度計、熒光計、放射學(xué)和酶促檢測方法的示例性 實例。作為示例性實例，也可以使用熒光團和量子點，包括體內(nèi)測定(參閱例如D. S.，等， Current Protocols in Cell Biology(2007)25. 1. 1-25. 1. 18，doi :10·1002/0471143030. cb2501s36)。體內(nèi)熒光用途的其它示例性實例是在雙分子熒光互補方法中使用合適的蛋白 質(zhì)，例如增強的黃色熒光蛋白(EYFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、“超折疊GFP”(sfGFP)或增強 的藍綠色熒光蛋白(ECFP)(對于綜述參閱例如Shyu，Y. J.，& Hu C. -D.，Trends Biotech. (2008)26，11,622-630)。Xie et al. (Annu. Rev. Biophys. (2008)37，417-44)給出了使 用熒光探針的一般性綜述。檢測可例如基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移或光譜。熱力學(xué)檢測方法 的實例是等溫滴定量熱法。測定DACT蛋白與Dvl蛋白結(jié)合的合適方法的又一實例是表 面等離振子共振技術(shù)，如局部表面等離子體共振(例如Endo，Τ.，等，Analytica Chimica Acta (2008)614, 2，182-189)。這些方法中的一些可包括額外的分離技術(shù)，如電泳或HPLC。詳細地說，標(biāo)記用途的實例包含作為探針的化合物或具有附著酶的免疫球蛋白，其催化的 反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號。使用放射性標(biāo)記和通過電泳分離的方法的實例是電泳遷移率變動 分析。評估細胞中DACT蛋白的量也包括評估細胞中編碼各DACT蛋白的核酸例如RNA的 量。核酸探針可用于通過任何常見雜交方法探測樣品以檢測DACT蛋白的核酸分子的量。為 了獲得核酸探針，可進行化學(xué)合成。合成的核酸探針首先可用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中 的引物，該PCR根據(jù)公認的PCR技術(shù)，主要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR方案，利用合適的模板進行來獲得 本發(fā)明的探針。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地基于為DACT蛋白獲得的序列設(shè)計這種探 針?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記技術(shù)如用放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素_親和素標(biāo)記、化學(xué) 發(fā)光、納米顆粒等標(biāo)記雜交探針。雜交后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯示探針。盡管技術(shù)人員熟知該事 實，保險起見應(yīng)注意的是在大多數(shù)實施方案中，在細胞中核酸量的評估不足以評估細胞中 蛋白質(zhì)的量，因為細胞中各蛋白質(zhì)的半衰期不能僅基于編碼核酸評估。然而，該技術(shù)可用于 某些實施方案或與使用蛋白質(zhì)結(jié)合劑組合例如用于驗證目的。如上指出，在一些實施方案中，可通過在細胞中增加內(nèi)源核酸序列，通常是編碼所 述DACT蛋白的基因的表達來增加細胞中DACT蛋白的量?？赏ㄟ^實現(xiàn)外遺傳改變實現(xiàn)這種 表達的增加。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法是外遺傳方法。例如可通過實現(xiàn)一種 或更多翻譯后組蛋白修飾模式的改變來進行提高DACT蛋白的表達。例如其可通過實現(xiàn)組 蛋白甲基化的改變來進行。其也可通過實現(xiàn)組蛋白乙?；哪Ｊ降母淖儊磉M行(也參閱下 文)。在一些實施方案中，改變組蛋白甲基化和組蛋白乙?；哪Ｊ健Ｔ谝粋€實施方案中，在 DACT蛋白的基因座處，如DACT3蛋白的基因座處改變組蛋白甲基化和/或組蛋白乙?；?模式。作為實例，編碼DACT3蛋白的NCBI GeneID 629378的基因定位在小鼠基因組7號染 色體位置7A2上。編碼DACT3蛋白的具有NCBI GeneID 539209的相應(yīng)基因定位在?；蚪M 18號染色體位置L0C539209上。在黑猩猩基因組19號染色體位置L0C745677和人基因組19 號染色體位置19ql3. 32上發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)基因。編碼DACT2蛋白的NCBI GeneID 240025的基因 定位在小鼠基因組17號染色體位置17A2上。在黑猩猩基因組(NCBIGeneID 742130)6號染 色體位置L0C741906和L0C742320之間、獼猴基因組4號染色體位置L0C694467、人基因組 (NCBI GeneID 168002) 6號染色體位置6q27、大鼠基因組1號染色體位置lql2、斑馬魚基因 組6號染色體位置L0C799123和L0C100000099之間以及雞基因組(NCBI GeneID421561) 3 號染色體鄰近L0C395933位置處發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)基因。在一些實施方案中，檢測一個或更多，或 任何上文命名的外遺傳改變(也參閱上文)。在一些實施方案中，在所選時間里監(jiān)測一個 或更多外遺傳改變。監(jiān)測該改變例如可用于監(jiān)測治療、預(yù)測對治療的反應(yīng)或確定診斷。監(jiān) 測外遺傳改變以及監(jiān)測DACT蛋白的水平或活性可進一步定義為確定個體對癌治療的抵抗 力，特別是定義為確定對通式(I)的化合物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合的抵抗力。當(dāng) 個體對這種癌治療具有抵抗力時，可對所述個體施用備選的癌治療。可使用本領(lǐng)域確定的常規(guī)方法檢測技術(shù)人員稱為可逆改變的外遺傳改變(對于 一般介紹，參閱例如 Iacobuzio-Donahue，C. Α. ，Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. (2009)4， 229-249)。作為實例，甲基化特異性PCR，為基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。 為此，使用對未甲基化DNA(U)特異的一對引物，和對甲基化DNA(M)特異的一對引物(也參 考下文實施例)。各引物對中至少一條引物具有有一個或更多CpG位點的序列。作為四個其它實例，亞硫酸氫鹽基因組測序、亞硫酸氫鹽焦磷酸測序、甲基化敏感的單核苷酸引物延 伸(MS-SnuPE)和甲基化敏感的單鏈構(gòu)象分析(MS-SSCA)可用于測定DNA分子胞嘧啶殘基 的任何甲基化。在這些方法中，用亞硫酸氫鹽處理DNA，引起胞嘧啶殘基脫氨成尿嘧啶，而 5-甲基胞嘧啶殘基保持大部分完整。作為兩個其它實例，甲基化特異性限制性分析和甲基 化DNA免疫沉淀(MeDIP)可用于評估DNA甲基化。外遺傳改變一般伴隨備選的基因表達模式。此類改變包括例如DNA的一個或更多 共價修飾，如胞嘧啶甲基化，一個或更多染色體蛋白質(zhì)，尤其是組蛋白的一個或更多共價修 飾，和染色體外調(diào)節(jié)性小RNA和非編碼RNA分子群體的形成。在該方面，肉眼可見的染色質(zhì) 由DNA和周圍纏繞DNA的組蛋白構(gòu)成。組蛋白裝配成由兩個拷貝的組蛋白2A、組蛋白2B、 組蛋白3和組蛋白4組成的八聚體。迄今為止在體外和體內(nèi)獲得的數(shù)據(jù)表明外遺傳改變不僅是基因表達的反映，在該 方面還指導(dǎo)基因表達或引發(fā)基因。某些這些改變引起轉(zhuǎn)錄沉默，而其它改變激活轉(zhuǎn)錄。因 此，在各細胞中存在翻譯后外遺傳修飾的模式。改變這些修飾中單個修飾，例如改變基因組 中一個堿基的甲基化從而導(dǎo)致翻譯后外遺傳修飾的細胞模式的改變，并可產(chǎn)生改變的基因 活性狀態(tài)。因此，單個基因型可采取賦予不同表型的多種后生型。與等位基因的存在類似， 因此也存在表等位基因。已經(jīng)在多種癌中發(fā)現(xiàn)了外遺傳改變，例如整體DNA低甲基化或啟 動子超甲基化(參考Iacobuzio-Donahue，2009，上文)。組蛋白的外遺傳修飾因此是翻譯后修飾。已知有許多組蛋白的翻譯后修飾，并且 更多的可能仍未發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明方法的過程中，可改變，例如添加、去除或防止改變?nèi)魏未?類組蛋白修飾。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙酰化、磷酸化和泛素化增加轉(zhuǎn)錄，而發(fā)現(xiàn)蘇素 化減少轉(zhuǎn)錄。在一些情況下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化增加轉(zhuǎn)錄，在其它情況下減少轉(zhuǎn)錄。通 過特定酶如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶或某些轉(zhuǎn)錄因子如具 有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的激活轉(zhuǎn)錄因子2 (ATF2)或CLOCK實現(xiàn)這些修飾的改變。組蛋白 甲基化特別復(fù)雜并可以單、二(me2)或三甲基化(me3)狀態(tài)存在。這些狀態(tài)的每一種狀態(tài) 均可募集獨特的輔調(diào)蛋白并對轉(zhuǎn)錄活性施加不同的影響。此外，組蛋白各賴氨酸殘基的甲 基化對轉(zhuǎn)錄具有不同，且經(jīng)常相反的影響。例如可通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)檢測組蛋白、特別是高度保守的核心組蛋白 H2A、H2B、H3和H4的修飾，如單甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化或磷酸化。通常用交聯(lián) 分子如甲醛或3，3’- 二硫代丙亞氨酸二甲酯將組蛋白與DNA交聯(lián)。在細胞裂解并且DNA片 段化后，可使用特異性抗體檢測改變的或未改變的組蛋白的存在。適合于檢測組蛋白修飾 的技術(shù)的其它實例是質(zhì)譜技術(shù)(參閱例如Brumbaugh，J.，等，Epigenetics (2008) 3，5 ；可在 http //www, landesbioscience. com/ journals/epigenetics/article/7005 獲得)。例如 可通過串聯(lián)MS方法測定組蛋白任何修飾的位置。第一步，可通過蛋白質(zhì)水解消化產(chǎn)生組蛋 白片段。然后例如可通過碰撞激活解離(CAD)MS/MS進行測序。作為另一此類方法，如上述 可進行亞硫酸氫鹽-轉(zhuǎn)化。然后，DNA分子或其目的片段例如可在體外轉(zhuǎn)錄成RNA，然后使 用RNase A進行堿基特異性切割，并通過MALDI-T0F分析切割的片段。如上解釋，已知外遺傳事件在沒有DNA突變的情況下在基因表達中誘導(dǎo)改變。在 該方面，本發(fā)明的方法也涉及鑒定與DACT蛋白的改變表達相關(guān)的外遺傳模式。腫瘤細胞， 特別是癌細胞用于介導(dǎo)不適當(dāng)?shù)幕虮磉_的基因調(diào)節(jié)的兩個主要外遺傳機制是DNA甲基化和組蛋白修飾，其通常在賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈上?；騿幼訁^(qū)域中CpG富含區(qū)的超甲 基化通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子的進入或通過增強轉(zhuǎn)錄阻抑物的結(jié)合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默，并認為是通過 引起腫瘤抑制基因的表達降低在癌中起重要作用。異常的組蛋白修飾如低乙酰化通過腫 瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默同樣與惡性腫瘤相關(guān)。組蛋白結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且組 蛋白脫乙?；ㄟ^如下事實介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制從組蛋白去除乙?；鶊F允許它們與DNA更緊 密相互作用，由此限制DNA用于轉(zhuǎn)錄的可及性。通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰酶 (HDAC)的相反活性調(diào)節(jié)組蛋白乙?；Ｇ懊嬉阎膺z傳事件可促進包括癌細胞中Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常 激活。在人結(jié)腸直腸癌細胞中已經(jīng)報道了導(dǎo)致細胞外Wnt抑制子，如分泌的Frizzled相 關(guān)蛋白(SFRPs)、Wnt抑制因子1 (WIF-I)和DICKK0PF-1 (DKK-I)轉(zhuǎn)錄沉默的啟動子甲基化 (AguiIera, 0.，等，Oncogene (2006) 25，4116-4121 ；He 等，2005，上文；Morin 等，1997，上文； Suzuki, H.，等，Nat Genet (2002) 31，141-149)。相反，Wnt 抑制子表達如 SFRP1/2 的恢復(fù) 甚至在存在下游APC或β -聯(lián)蛋白突變的情況下也導(dǎo)致Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制和 結(jié)腸直腸癌細胞的程序性細胞死亡(Baylin, S. B.，& Ohm, J. Ε.，Nat Rev Cancer (2006) 6， 107-116 ；Suzuki, H.，等，Nat Genet (2004) 36，417-422)。與本發(fā)明方法和用途相反，外遺 傳沉默領(lǐng)域中的努力至今卻集中在直接干擾癌細胞中與TCF/β聯(lián)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活上 (Barker & Clevers，2006，上文；L印ourcelet 等，2004，上文)。本發(fā)明方法的一些實施方案包括實現(xiàn)或防止翻譯后組蛋白修飾的模式，如組蛋白 甲基化和/或組蛋白乙?；母淖儭崿F(xiàn)翻譯后組蛋白修飾的改變可包括在一個或更多氨 基酸位置上實現(xiàn)一個或更多翻譯后組蛋白修飾的去除。該修飾例如可以是轉(zhuǎn)錄抑制修飾。 實現(xiàn)翻譯后組蛋白修飾模式改變可包括在一個或更多氨基酸位置上實現(xiàn)一個或更多翻譯 后組蛋白修飾的添加。在該方面，術(shù)語“添加”指共價結(jié)合相應(yīng)氨基酸，例如共價附著甲基 或乙?；鶊F的形成。該修飾例如可以是轉(zhuǎn)錄激活修飾。實現(xiàn)翻譯后組蛋白修飾模式的改 變也可包括在一個或更多氨基酸位置上抑制或防止一個或更多翻譯后組蛋白修飾的去除。 在一些實施方案中，翻譯后組蛋白修飾的改變包括在兩個氨基酸位置上翻譯后組蛋白修飾 的改變。在一些實施方案中，可實現(xiàn)激活翻譯后組蛋白修飾和失活(抑制)翻譯后組蛋白 修飾的組合。在一些實施方案中，可實現(xiàn)去除一個或更多轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾和添 加一個或更多轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的組合。在下文實施例中還示例的是，本發(fā)明人已經(jīng)在DACT3啟動子中鑒定了組蛋白甲基 化模式，其包括抑制和激活組蛋白甲基化事件的共存。在一些實施方案中，本發(fā)明預(yù)后和診 斷的方法包括檢測此類組蛋白甲基化模式的存在。對應(yīng)地，預(yù)防、阻止或逆轉(zhuǎn)細胞中腫瘤發(fā) 生方法的一些實施方案包括降低或去除激活組蛋白修飾的組合，例如甲基化和失活組蛋白 修飾，例如甲基化，或防止該組合的形成。本發(fā)明的一些方法包括檢測激活組蛋白甲基化和 失活組蛋白甲基化的此類組合的存在。本發(fā)明的一些方法還包括其它外遺傳修飾，如DNA 甲基化的檢測。還可在本發(fā)明方法的一些實施方案中改變這種其它的外遺傳修飾或防止其 改變。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，在一個或更多組蛋白氨基酸位置上實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑 制翻譯后組蛋白修飾的去除，所述實施方案包括引起翻譯后組蛋白修飾模式的改變。在本 發(fā)明方法的一些實施方案中，在一個或更多組蛋白氨基酸位置上實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的附著，所述方案包括引起翻譯后組蛋白修飾模式的改變。在防止翻譯后組蛋白修 飾抑制模式改變的一些實施方案中，在組蛋白氨基酸位置上引起轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修 飾附著的抑制或阻斷。在防止翻譯后組蛋白修飾抑制模式改變的一些實施方案中，在組蛋 白氨基酸位置上引起轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾去除的抑制或阻斷。在該方法的一些實施方案中，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾的去除與轉(zhuǎn)錄激活 翻譯后組蛋白修飾的附著的組合。合適的激活翻譯后組蛋白修飾的實例包括，但不限于組 蛋白3上賴氨酸4的甲基化、組蛋白3上賴氨酸9的乙?；徒M蛋白3上賴氨酸14的乙酰 化。合適的抑制性翻譯后組蛋白修飾的實例包括，但不限于組蛋白3上賴氨酸9的甲基化、 組蛋白3上賴氨酸27的甲基化和組蛋白4上賴氨酸20的甲基化。通過應(yīng)用，例如施用化合物或化合物的組合在本發(fā)明的特定方法和用途的一些實 施方案中引起組蛋白甲基化和/或組蛋白乙?；Ｊ降母淖儭Ｈ缦挛慕忉?，可使用鑒定在 該方面有效的化合物的方法鑒定此類化合物。合適的化合物的其它實例是通式(I)的化合 物(上文，也參閱下文)?；衔锝M合的示例性實例是通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶 抑制劑的組合。除了或除改變各細胞的內(nèi)源組蛋白的甲基化和/或乙?；Ｊ街猓墒褂卯愒?組蛋白。例如可在細胞中通過常規(guī)重組技術(shù)表達編碼組蛋白的異源核酸分子形成此類異源 組蛋白。當(dāng)與細胞的內(nèi)源組蛋白相比時，該組蛋白可具有突變/改變，其模擬具有特定甲基 化/乙酰化模式的組蛋白或者其在目的位置不能被甲基化和/或乙?；Ｔ谶M行體外方法 時，一個或更多分離的組蛋白也可進行化學(xué)修飾。也可使用一個或更多氨基酸衍生物，例如 一個或更多甲基化賴氨酸類似物在體外形成組蛋白。本發(fā)明的一些方法和用途包括或旨在在參與細胞增殖病癥，如超常增生、發(fā)育不 良和癌前病變的一個或更多細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。在一些實施方案中，這些方法包 括或旨在在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。程序性細胞死亡是編程性細胞死亡并通常是 多細胞生物中去除不想要的細胞的機制。當(dāng)細胞經(jīng)歷或起始程序性細胞死亡的能力受損或 終止時，損壞的細胞能夠以不加控制的方式增殖，由此發(fā)展成癌細胞。凋亡細胞顯示了特征 性形態(tài)，在顯微鏡下通過所述特征性形態(tài)其可以得到鑒定。通過在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性 細胞死亡，還可使用相應(yīng)的方法作為治療或預(yù)防癌癥的療法。在一些實施方案中，通過改變，例如增加蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白的磷酸化狀態(tài)在腫瘤 細胞，包括癌細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。在此類實施方案中，例如通常通過改變腫瘤細胞 中DACT蛋白質(zhì)的量和/或活性改變，例如增加蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白的磷酸化狀態(tài)。作為示例 性實例，可在腫瘤細胞中增加DACT蛋白質(zhì)的量，由此降低腫瘤細胞中dishevelled蛋白質(zhì) 的量。例如一旦在dishevelled蛋白質(zhì)和DACT蛋白之間形成了復(fù)合體，可通過降解降低腫 瘤細胞中dishevelled蛋白的量。因此，可激活蛋白糖原合酶激酶3，由此增加蛋白質(zhì)β-聯(lián) 蛋白的磷酸化狀態(tài)。需要時，例如通過溴化乙錠染色、膜聯(lián)蛋白V-FITC染色、流式細胞分析或其組合， 以及線粒體功能異?；螂滋斓鞍酌?激活監(jiān)測腫瘤細胞中的程序性細胞死亡的進程。本發(fā) 明的方法通常觸發(fā)凋亡細胞死亡應(yīng)答，涉及線粒體破裂和胱天蛋白酶激活。然而，非癌性細 胞僅顯示微小的細胞死亡響應(yīng)(如果存在)。在一些實施方案中，除了在各細胞中測定程序 性細胞死亡，本發(fā)明方法可包括在各細胞中測定細胞活力。在本領(lǐng)域中良好建立了各方法。
如上指出，在本發(fā)明方法的一些實施方案中，在各細胞中降低dishevelled蛋白 和/或DACT蛋白的量。這可通過將異源分子，如核酸分子引入細胞中來進行。作為實例，可 使用非編碼核酸分子，例如適體或Spiegelmer (描述于wo 01/92655)。非編碼核酸分 子也可以是nc-RNA分子(對于天然nc-RNA分子的介紹，參閱例如Costa，F(xiàn)F，Gene (2005)， 357，83-94)。nc-RNA分子的實例包括，但不限于反義RNA分子、L-RNA Spiegelmer 、沉 默RNA分子(如雙鏈神經(jīng)元限制性沉默子元件)、微小RNA(miRNA)分子、短發(fā)夾RNA (shRNA) 分子、小干擾RNA(siRNA)分子、重復(fù)相關(guān)的小干擾RNA(rasiRNA)分子或與Piwi蛋白相互 作用的RNA(piRNA)(簡短的綜述，參閱例如Lin，H.，Science (2007) 316，397)。此類非編碼 核酸分子例如可用于指導(dǎo)mRNA降解或終止mRNA翻譯。小干擾RNA的使用變成了“擊倒”特異基因的工具。Weiss等已經(jīng)給出了合成小有 機化合物和RNAi用途之間差異的綜述(Nature Chem. Biol. (2007) 3，12，739-744)。小的干 擾RNA通過RNA干擾(RNAi)利用基因沉默或基因抑制，其在翻譯后水平上發(fā)生并涉及mRNA 降解。RNA干擾代表了保護基因組的細胞機制。SiRNA分子通過連接siRNA與多酶復(fù)合體 形成所謂的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)介導(dǎo)其互補RNA的降解。所述siRNA變成RISC 的一部分并靶向互補RNA種類，其然后被切割。這導(dǎo)致各基因表達的損失(對于簡短綜述 參閱 Zamore, PD, &Haley, B, Science (2005) 309，1519-1524)。該技術(shù)例如應(yīng)用于沉默寄生 DNA序列，如HIVRNA的切割，如在美國專利申請2005/0191618中公開。當(dāng)siRNA分子從外源雙鏈RNA形成時，miRNA分子是從基因組轉(zhuǎn)錄的RNA分子， 盡管其在結(jié)構(gòu)上與siRNA分子類似。原則上，miRNA分子可以與siRNA分子相同的方式 進行操作(對于綜述，參閱例如 Liu，J.，Current Opinion in Cell Biology (2008) 20, 214-221)。盡管最初僅知道m(xù)iRNA作用于轉(zhuǎn)錄物3’-非翻譯區(qū)，同時還已經(jīng)描述了 miRNA， 其可在單個mRNA分子的編碼序列或不同mRNA分子的CDS中同時靶定幾個位點(Tay，Y.， 等，Nature (2008) doi 10. 1038/nature07299)。還揭示了短干擾 RNA 分子可通過與 siRNA 僅部分互補的編碼序列內(nèi)的位點調(diào)節(jié)基因表達(如上)。這些發(fā)現(xiàn)打開了指導(dǎo)蛋白質(zhì)的所 選同種型、剪接變體或突變體的降解或破壞其翻譯的可能性。本發(fā)明siRNA或miRNA的典型實施方案包括約10到35個核苷酸的體外或體內(nèi)合 成分子，在一些實施方案中為約15到25個核苷酸。在目的細胞，包括微生物和動物部分的 細胞中直接合成各siRNA或miRNA分子。其也可以引入各細胞和/或遞送到各細胞中。向 所選的細胞體內(nèi)遞送siRNA分子的示例性實例是其非共價結(jié)合重鏈抗體片段(Fab)和核酸 結(jié)合蛋白魚精蛋白的融合蛋白(Song, Ε.等，Nature Biotech. (2005) 23，6，709-717)。在 本發(fā)明的實施方案中，使用siRNA和/或miRNA分子誘導(dǎo)編碼一個或更多DACT蛋白或目的 dishevelled蛋白的mRNA分子的降解。如上指出，Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的激活在癌干細胞形成中起作用(Malanchi等， 2008，上文)。也有證據(jù)表明Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在上皮干細胞和早期祖細胞的維持中 起重要作用(de Lau, W.，等，F(xiàn)ront Biosci (2007) 12，471-491 ；Fodde，R.，& Brabletz, T.， Curr Opin Cell Biol (2007) 19，150-158)。已經(jīng)顯示激活 Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑的 GSK-3 抑 制劑6-溴代靛紅玉-3' _肟維持多能性人和小鼠胚胎干細胞的未分化狀態(tài)(Sato，N.，等， NatureMedicine (2004) 10，1，55-63)。已經(jīng)顯示通過Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑的激活引起成人 骨骼肌的干細胞群體衛(wèi)星細胞的增殖(Otto，Α.，等，Journal of CellScience (2008) 121，
252939-2950)。已經(jīng)顯示W(wǎng)nt/β -聯(lián)蛋白信號途徑的抑制降低了兔胚胎干細胞的多潛能 性和增殖能力并導(dǎo)致了其增強的分化(Wang，S.，等，J. Biol. Chem. (2008) doi/10. 1074/ jbc.M804091200)o還已經(jīng)顯示果蠅(Drosophila)的多能腸干細胞的維持和自我更 新依賴對應(yīng)于Wnt/β-聯(lián)蛋白信號途徑的途徑，其為Wingless(Wg)途徑(Lin，G.，等， Nature (2008) 455,1119-1124)。同樣，已經(jīng)顯示通過Wnt/β -聯(lián)蛋白途徑的激活增強了體 細胞向誘導(dǎo)的干細胞的重新編程(Marson等，2008，上文)。在該方面，還有數(shù)據(jù)表明在腺 瘤獲得完全轉(zhuǎn)化APC突變之前，上調(diào)Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號途徑的初始外遺傳事件可能在結(jié) 腸直腸腺瘤中發(fā)生(Siu，I.M.，等，Cancer Res (1999) 59，63-66 ;Suzuki 等，2004，上文)。 DACT3處的二價組蛋白修飾是一個此類外遺傳事件。本發(fā)明的組合藥理學(xué)方法(其在一些 實施方案中靶定結(jié)腸直腸癌細胞特征性外遺傳特征并且能夠消除Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn) 導(dǎo))可能具有靶向癌干細胞的潛力，所述癌干細胞依賴于這種基因沉默機制并需要高水平 的Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號活性用于其自我更新和存活。因此，本發(fā)明的方法也可用于控制，包括防止和終止干細胞的維持和/或增殖。在 一些實施方案中，該干細胞可以是癌干細胞，例如結(jié)腸癌干細胞。結(jié)腸癌干細胞，也稱為結(jié) 腸癌腫瘤起始細胞通常發(fā)現(xiàn)于原發(fā)結(jié)腸癌中(例如Huang，Ε. H.，& Wicha，Μ. S.，Trends Mol. Med. (2008) 14，11,503-509)。本發(fā)明的方法還可用于控制，包括防止或終止至少部分 分化細胞的重新編程，如體細胞向多能細胞，尤其是干細胞的重新編程。在后一種情況的典 型實施方案中，所述方法是控制，包括防止和終止至少部分分化細胞的去分化的方法。在一 些實施方案中，該方法是防止癌細胞形成的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以是在治療和/或預(yù)防心血管疾病或病癥如 心肌梗塞中的方法或用途。如在國際專利申請WO 2008/122440中公開的，β-聯(lián)蛋白的消 耗對心臟具有保護效果。在該公開內(nèi)容中顯示聯(lián)蛋白的下調(diào)在成人心臟中起始適應(yīng)性 心肌細胞肥大并在血管緊張肽II-誘導(dǎo)的應(yīng)激后恢復(fù)保護性肥大需要的信號途徑。本發(fā)明 的方法導(dǎo)致激活的聯(lián)蛋白水平的降低(參考例如圖6Α)和TCF/β-聯(lián)蛋白靶基因的表 達(參考例如圖6C和圖6D)。已經(jīng)顯示該影響導(dǎo)致適應(yīng)性心臟肥厚，其具有心臟保護性功 能(W0/2008/122440)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解與前述方法相反(如上)，本發(fā)明方法的一 些實施方案可在不需要向靶細胞插入外源DNA的情況下實現(xiàn)該效果。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法或用途包括使用以下通式(I)的化合物 在該通式⑴中，A是CH或N，R4和R5是H或獨立選擇的脂肪族基團、脂環(huán)族基團、 芳香族基團、芳基脂肪族基團和芳基脂環(huán)族基團，其可任選地包括0-6個，在一些實施方案 中0-4個，并且在一些實施方案中0-3個雜原子。所述雜原子可以是N、0、P、S、Se或Si。 在一些實施方案中，R4和R5可以相同。在一些實施方案中，R4和R5可以連接以確定脂肪 族橋，例如烴基橋。各橋可以例如包括1-12個，在一些實施方案中2-10個，并且在一些實 施方案中2-8個主鏈碳原子，并含有1-5個，在一些實施方案中1-4個，并且在一些實施方 案中1-3個選自N、0、P、S、Se和Si的雜原子。R2可以是H或鹵素原子，如F、Cl、Br或I。 在一些實施方案中，R2是F或Cl。R3可以是H，鹵素原子如F或Cl，或脂肪族、脂環(huán)族、芳香 族、芳基脂肪族、芳基脂環(huán)族烴基基團。該烴基基團可包括1-12個，在一些實施方案中1-8 個，并且在一些實施方案中1-4個主鏈碳原子和0-4，如0-3、0-2個選自N、0、P、S、Se或Si 的雜原子。烴基基團還可結(jié)合任一取代基或多個取代基(見下文)，其包括一個或更多官能 團，如鹵素，例如F或Cl。雜原子是不同于碳原子的任何原子。實例包括，但不限于N、0、P、S、Si和Se。其 中在本發(fā)明方法的反應(yīng)物或產(chǎn)物的部分中存在幾個雜原子時，它們可獨立地選擇。除非另有說明，術(shù)語“脂肪族的”表示直鏈或分支烴鏈，其可以是飽和的或單不飽 和或多不飽和的。不飽和脂肪族基團含有一個或更多雙鍵和/或三鍵。烴鏈的分支包括線 性鏈以及非芳香族環(huán)狀元素。除非另有說明，烴鏈可以是任何長度并含有任何數(shù)量的分支。 主鏈以及分支還可包含雜原子，例如N、0、P、S、Se或Si。除非另有說明，術(shù)語“脂環(huán)族的”表示非芳香環(huán)狀烴部分，其可以是飽和的或單不 飽和或多不飽和的。環(huán)狀烴部分可用成非芳香環(huán)以及鏈元素取代。除非另有說明，環(huán)狀烴 部分的主鏈可以是任何長度并含有任何數(shù)量的非芳香環(huán)狀和鏈元素。環(huán)狀烴部分及環(huán)狀和 鏈狀取代基還可包含雜原子，例如N、0、S、Se或Si。除非另有說明，術(shù)語“芳香族的”表示共軛雙鍵的平面環(huán)狀烴部分，其可以是單環(huán) 或包括多個稠合的或共價連接的環(huán)。除非另有說明，環(huán)狀烴部分的主鏈可以是任何長度并 含有任何數(shù)量的雜原子，例如N、0、和S。術(shù)語“芳基脂肪族”表示烴部分，其中一個或更多芳基附著到一個或更多脂肪族基 團上或是其上的取代基。因此，術(shù)語“芳基脂肪族”包括例如烴部分，其中兩個或更多芳基 通過一個或更多脂肪族鏈或任何長度的鏈，如亞甲基連接。如此處所用，術(shù)語“脂肪族的”、“脂環(huán)族的”、“芳香族的，，和“芳基脂肪族”意在包
括各部分的取代和非取代形式。取代基可以是任何功能基團，例如，但不限于氨基、酰氨基、 疊氮基、羰基、羧基、氰基、異氰基、二噻烷、鹵素、羥基、硝基、有機金屬、有機硼、硒基、甲硅 烷基、silano、磺?；⒘虼?、氰硫基、三氟甲基磺酰基、對-甲苯磺?；?、溴代苯磺?；?、硝 基苯磺?；图淄榛酋；？蓪⑼ㄊ?I)的典型化合物認為是腺苷的類似物(包括碳環(huán)類似物)。合適 的化合物的示例性實例是3-deazan印lanocin A (5_ (4-氨基-IH-咪唑并[4，5_c]吡 啶-I-基)-3-(羥甲基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，化學(xué)文摘號102052-95-9)，5- (4-氨 基-IH-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基)-3- (1-羥乙基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，化學(xué)文 摘號 146424-81-9，5-(4-氨基-IH-咪唑并[4, 5-c]吡啶-1-基)-3_(1，1_ 二羥丙 基)-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 851071-63-1，5-(4-氨基-IH-咪唑并[4, 5-c]吡啶-I-基)-3-[1_ 羥基-2-丙烯基]-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 851071-61-9， 5_(4-氨基-IH-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基)-4_氟-3-(羥甲基)-3_環(huán)戊烯-1，2-二 醇，CAS-No. 127828-67-5，5-(4-氨基-IH-咪唑并[4，5_c]吡啶-1-基)_3_(2-丙烯 基)-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 851071-58-4，5-(4-氨基-IH-咪唑并[4，5_c]吡 啶-1-基)-3_ 甲基-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 224453-13-8，5-(4-氨基-IH-咪唑 并[4，5-c]吡啶-1-基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 111005-71-1，5- (4-氨基-IH-咪 唑并[4, 5-c]吡啶-1-基)-4-氯-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 127828-64-2，5-(6-氨 基-9H-嘌呤-9-基)-3-(羥甲基)-3_ 環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 88824-06-0，4-(6-氨 基-9H-嘌呤-9-基)-3a，6a- 二氫_2，2_ 二甲基-4H-環(huán)戊二烯并_1，3_間二氧雜環(huán)戊 烯-6-甲醇，CAS-No. 88824-08-2，N- [9- [5-(乙酰氧基)~4~ 羥基 _3_ (羥甲基)-2-環(huán) 戊烯-1-基]-9H-嘌呤-6-基]-苯甲酰胺，CAS-No. 83844-33-1，5-(6-氨基-9H-嘌 呤-9-基)-3-(甲氧基甲基)-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 138571-48-9，4-甲基-苯甲酸 [3- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-羥基-5- [ (4-甲基苯甲酰基)氧基]-1-環(huán)戊烯-1-基] 甲酯，CAS-No. 142888-07-1，5- (6-氨基 _2_ 氟-9H-嘌呤 _9_ 基)-3-(羥甲基)-3-環(huán)戊 烯-1，2- 二醇，CAS-No.(鹽酸鹽)138660-07-8，5- (6-氨基-8-氯代-9H-嘌呤-9-基)_4_ 氯 代-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 127828-72-2，3- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4，5- 二羥 基-I-環(huán)戊烯-I-羧酸，CAS-No. 179929-29-4，5- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)~3~ 丙基-3-環(huán) 戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 851071-49-3，5- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)_3_ (氟代甲基)_3_ 環(huán) 戊烯-1,2- 二醇，CAS-No. 303964-14-9，5_(6_ 氨基-9H-嘌呤-9-基)_4_ 氟代 _3_(氟代 甲基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 805245-51-6, 5- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)_4_ 氟 代"3-(巰基甲基)-3_ 環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 805245-54-9，5-(6-氨基-9H-嘌 呤-9-基)-3- (1-羥基-2-丙炔基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 141794-36-7，9- [ (3aS, 4R, 6aR) -6- [ [ [ (1，1- 二甲基乙基)二苯基甲硅烷基]氧基]甲基]-3a, 6a- 二氫-2，2- 二甲 基-4H-環(huán)戊二烯并-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺，CAS-No. 952418-12-1， 9- [ (3aS, 4R, 6aR) -3a, 6a- 二氫 _2，2_ 二甲基-6a- [2~ (三苯基甲氧基)乙基]-4H-環(huán)戊二 烯并-1,3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺，CAS-No. 902455-29-2，9-[ (3 ‘ aS， 6' aR)-3' a,6' a_ 二氫螺[環(huán)己烷_1，2 ‘ -[4H]環(huán)戊二烯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊 烯]-4'-基]-9H-嘌呤-6-胺，CAS-No. 874443-97-7，9-[ (3aS，4R，6aR) _3a，6a_ 二氫-2， 2-二甲基-6-(三氟代甲基)-4H-環(huán)戊二烯并-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4-基]-9H-嘌 呤-6-胺，CAS-No. 872624-41-4，(1S，2R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)_3_(三氟 代甲基)-3_ 環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 872624-35-6，(1S，2R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌 呤-9-基)-3-(1，1- 二羥基-2-丙烯基)-3-環(huán)戊烯-1，2- 二醇，CAS-No. 851071-54-0， (1S，2R，5R) -5- (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3- (2-丙烯基)_3_ 環(huán)戊烯 _1，2- 二醇，CAS-No 851071-50-6,1-[(3' aS,6' aR)-3' a, 6' a_ 二氫螺[環(huán)己烷-1，2' _[4H]環(huán)戊二烯并 [1,3]間二氧雜環(huán)戊烯]-4'-基]-IH-咪唑并[4, 5-c]吡啶-4-胺，CAS-No. 874443-98-8， (lR，2S，5S)-5-(4-氨基-IH-咪唑并[4, 5-c]吡啶基)_3_(羥甲基)_3_環(huán)戊烯-1， 2- 二醇，CAS-No. 948306-87-4，(IS, 2R, 5S) ~5~ (6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟代-3-(氟 代甲基)-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇，CAS-No. 805245-51-6，CAS-No. 1062238-89-4 的化合物， CAS-No. 1062238-85-0 的化合物，CAS-No. 1062238-82-7 的化合物，CAS-No. 1062238-79-2的化合物，CAS-No. 1062238-77-0 的化合物，和 CAS-No. 1062238-66-7 的化合物。通式(I)的化合物例如通常能夠引起或防止翻譯后組蛋白修飾模式，特別是一個 或更多組蛋白甲基化或組蛋白乙酰化的改變。此類化合物通常能夠引起組蛋白3上賴氨酸 27的脫甲基化或組蛋白4上賴氨酸20的脫甲基化和/或防止這些賴氨酸殘基，特別是如圖 5C中所示在DACT蛋白質(zhì)基因座上這些賴氨酸殘基的甲基化。在一些實施方案中，通式(I)的化合物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑組合使用。任何 組蛋白脫乙酰酶抑制劑可用于本發(fā)明的上下文中。已經(jīng)描述了來自多種化學(xué)類別的組蛋 白脫乙酰酶抑制劑，其具有四個最重要的類別，S卩(i)異羥肟酸類似物，(ii)苯甲酰胺類似 物，(iii)環(huán)肽(一般是四肽)/肽內(nèi)酯類和(iv)脂肪酸類似物。組蛋白脫乙酰酶抑制劑 在其針對多種組蛋白脫乙酰基酶的特異性上不同。根據(jù)其序列同源性和表達模式將這些酶 分成四個主要類別。組蛋白脫乙酰酶抑制劑在其對四個主要類別的組蛋白脫乙酰酶的特 異性上不同。根據(jù)其序列同源性和表達模式將這些酶分成四個類別。一般地，異羥肟酸類 似物對類別I，II、IV酶有效，苯甲酰胺類似物對類別I有效，并且一些也對類別II、III和 /或IV有效，環(huán)肽/肽內(nèi)酯類對類別I有效，脂肪酸類似物對類別I和II有效。Smith和 Workman最近已經(jīng)給出了關(guān)于組蛋白脫乙酰酶抑制劑的簡短綜述(International Journal of Biochemistry & Cell Biology(2008)doi 10.1016/j.biocel. 2008. 09. 008),并且 在更廣背景中，Szyf也給出了這方面的綜述(Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2009)49， 243-263)。組蛋白脫乙酰酶抑制劑的合適實例包括，但不限于N'-羥基-N-苯基-辛二酰 胺(辛二酰苯胺異羥肟酸，SAHA)、pyroxamide、M-羧基肉桂酸雙羥酰胺(CBHA)、曲古抑菌素 A (TSA)、曲古抑菌素C、水楊酸基異羥肟酸(SBHA)、壬二雙羥肟酸(azelaic bishydroxamic acid) (ABHA)、壬二 -1-異羥肟酸_9_苯胺(AAHA)、6_(3_氯代苯基脲基)carpoic異羥肟 酸(3C1-UCHA)、oxamflatin、A-161906、scriptaid、PXD-10U LAQ-824、含異羥肟酸的環(huán) 肽(CHAP)、ITF-2357、MW2796、MW2996、trapoxin A、FR901228(FK 228 或 D印sip印tide)、 FR225497、apicidin、CHAP、HC-毒素、WF27082、chlamydocin、丁酸鈉、異戊酸鹽、戊酸鹽、 4_苯丁酸鹽(4-PBA)、4-苯基丁酸鈉(PBS)、精氨酸丁酸酯、丙酸鹽、丁酰胺、異丁酰胺、 苯乙酸鹽、3-溴代丙酸鹽、丁酸甘油酯、丙戊酸、丙戊酸鹽、CI-994、MS-27-275(MS-275或 SNDX-275)、MS-27-275 的 3'-氨基衍生物、MGCDO103 或 D印udecin，和 SNDX-275。目前在 臨床上檢測了許多組蛋白脫乙酰酶抑制劑，F(xiàn)DA目前已經(jīng)批準(zhǔn)SAHA(Vorinostat )用于 治療皮膚T細胞淋巴瘤。在一些實施方案中，組蛋白脫乙酰酶抑制劑是通式(II)或通式(III)的化合物 在這些通式(II)和(III)中，L是包括脂肪族或芳基脂肪族基團的橋，其包括1到 約8個主鏈碳原子和0到約3個雜原子，如N、0或Si。R6是H，氨基、醚基團、脂肪族基團或 芳基脂肪族基團。R6是氨基時，可用兩部分獨立取代該氨基。這些例如可以是H、脂肪族基 團、脂環(huán)族基團、芳香族基團、芳基脂肪族基團或芳基脂環(huán)族基團。此類基團可以獨立地包 括0到約3個雜原子，如N、0、S或Si。R6是醚基團時，可用脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂 肪族或芳基脂環(huán)族基團取代醚基團的氧原子，所述基團可包括0到約3個雜原子，如N、0、S 或Si。通式(II)的實例包括，但不限于，7-[R_(E，E)]-[4_( 二甲氨基)苯基]-N-羥 基-4，6- 二甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(曲古抑菌素A，化學(xué)文摘號58880-19-6)， 7-[4-( 二甲氨基)苯基]-N-羥基-4，6，6-三甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-84-3)，4-( 二甲氨基)-N-羥基--氧-苯戊酰胺(CASNo. 139675-90-4)，N-羥 基-6-(苯甲?；?己酰胺(CAS No. 91489-63-3)，3-對-甲苯?；?丙烯異羥肟酸(CAS No. 96985-88-5)，(2E, 4E, 6R) -7- [4-(環(huán)己基氨基)苯基]-N-羥基-4，6- 二甲基 _7_ 氧-2， 4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-79-6)，N-羥基-6，6-二甲基-7-(4-甲氧基苯甲酰 基)庚酰胺(CAS No. 362669-76-9), (2E，4E，6R) _6-[4_( 二甲氨基)苯甲?；鵠-N-羥 基-4-甲基-2，4-八碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-83-2)，(2E，4E，6R)-N-羥基-4，6-二 甲基-7-氧-7-[4-(1-吡啶基)苯基]_2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-81-0)，(2E， 4E, 6R) -N-羥基-4，6- 二甲基-7-氧-7- [4- (1-吡咯烷基)苯基]-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-80-9)，(2E，4E，6R)-N-羥基 _7-[4_[ [ (4-甲氧基苯基)甲基]氨基]苯基]_4， 6_ 二甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-77-4)，(2E，4E，6R)-7-[4_(環(huán)戊基 氨基)苯基]-N-羥基-4，6- 二甲基-7-氧-2,4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-78-5)， (2E，4E，6R)-N-羥基_4，6-二甲基-7-氧-7-[4-[(苯基甲基)氨基]苯基]_2，4-七碳二 烯酰胺(CAS No. 1051944-76-3)，(2E，4E，6R)-N-羥基-4，6-二甲基-7_[4_[ (1-甲基乙基) 氨基]苯基]-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-74-1)，(2E，4E，6R)-7-[4-(二丁 基氨基)苯基]-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-72-9)， (2E，4E，6R) -7-[4- ( 二乙基氨基)苯基]-N-羥基-4，6- 二甲基-7-氧_2，4-七碳二烯酰 胺(CAS No. 1051944-70-7)，(2E，4E，6R)-7-[4_( 二丙基氨基)苯基]-N-羥基-4，6-二甲 基-7-氧 _2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-71-8)，(2E，4E，6R) -N-羥基-4，6_ 二甲 基-7-[4-[(2-甲基丙基)氨基]苯基]-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CASNo. 1051944-75-2)， (2E，4E，6R)-7-[4-[二 [(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]苯基]-N-羥基-4，6-二甲 基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 1051944-73-0)，N-羥基-4-甲氧基-ε，ε - 二 甲基- ξ-氧-苯庚酰胺(CAS No. 1044238-80-3)，9-[1，1 ‘ -二 苯基]-4-基-N-羥 基-9-氧-2，4-壬二碳烯酰胺(CAS No. 1025304-96-4)，6-[[4-[3-(羥基氨基)-1，3-二氧 丙基]苯基]氨基]-3-吡啶羧酸(CAS No. 867336-59-2)，N-羥基- β，4-二甲基- γ-氧-苯 丁酰胺(CAS No. 861777-21-1)，7-[4-( 二甲氨基)苯基]-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2， 4-七碳二烯酰胺(CAS No. 503610-77-3), (2E，4E，6R)-7-[4_( 二甲氨基)苯基]-N-羥 基-6-甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 674767-32-9)，(2E，4E，6R)-7-(4-氨基 苯基)-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 528854-93-5)，N-羥 基-ε-氧-4-苯氧基-苯己酰胺(CAS No. 461404-99-9)，(Ε，Ε)-N-羥基 _7_[ (4-二苯基)羰基]_2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 362671-60-1), (2E，4E，6R)-N-羥基-4，6-二甲 基-7-[4-(甲基氨基)苯基]-7-氧-2，4-七碳二烯酰胺(CAS No. 528854-92-4)，4'-氯 代-N-羥基-η-氧-[1，1 ‘ -二苯基]-4-辛酰胺(CAS No. 461404-93-3) ,4'-氯代-N-羥 基-ξ-氧-[1，1' -二苯基]-4-庚酰胺(CAS No. 461404-92-2)，N-羥基-7-[4-(4-嗎 啉基)苯甲酰基]庚酰胺(CAS No. 362670-88-0)，N-羥基-7-[4_(l-吡啶基)苯甲酰 基]庚酰胺(CASNo. 362670-85-7)，N-羥基-η-氧-4-(4-苯基-1-哌嗪基)-苯辛酰 胺(CAS No. 362670-82-4), N-羥基-η -氧-4-[ (3-吡啶基甲基)氨基]-苯辛酰胺(CAS No. 362670-79-9)，N-羥基-η-氧 _4-(1_ 哌嗪基)-苯辛酰胺(CAS No. 362670-72-2)， N-羥基-η -氧-4- (2-吡啶基氨基)-苯辛酰胺(CAS No. 362670-73-3)，4- [4- [8-(羥基氨 基)-1，8_二氧代辛基]苯基]-1-哌嗪羧酸1，1_二甲基乙酯(CAS No. 362670-69-7)，N-羥 基-4-(甲基苯基氨基)-η -氧-苯辛酰胺(CAS No. 362670-66-4)，N-羥基-7- [4- (4-甲氧 基苯基)苯甲?；鵠庚酰胺(CAS No. 362670-48-2)，N-羥基-6-(4-甲氧基苯甲?；?己酰 胺(CAS No. 362670-37-9)，N-羥基-8-(苯甲?；?辛酰胺(CAS No. 362670-36-8)，N-羥 基-5-(苯甲?；?戊酰胺(CAS No. 362670-35-7)，N-羥基-7-(4-苯氧基苯甲?；?庚酰 胺(CASNo. 362670-31-3)，N-羥基 _7_[ (4- 二苯基)羰基]庚酰胺(CAS No. 362670-01-7) 和4- ( 二甲氨基)-N-羥基-ε，γ -二甲基- ξ-氧-苯庚酰胺(CAS No. 362669-82-7)。通式(III)的化合物的示例性實例包括，但不限于，N-羥基-6-甲氧 基-ε -氧-2-萘己酰胺(CAS No. 110842-40-5)，N-羥基-ξ -氧-2-萘庚酰胺(CAS No. 362670-38-0)，N-羥基-η -氧-2-萘辛酰胺(CAS No. 362669-68-9)，N-羥基-α -甲 基-η -氧-2-萘辛酰胺(CAS No. 362671-29-2)，N-羥基-6-甲氧基-η -氧-2-萘辛酰 胺(CAS No. 362670-32-4)，N-羥基-ε -氧-2-萘己酰胺(CAS No. 461404-94-4)和 N-羥 基-β -甲基-η -氧-2-萘辛酰胺(CAS No. 362671-55-4)。組蛋白脫乙酰酶抑制劑如通式(II)的化合物和通式(I)的化合物的組合一般能 夠引起，例如引起或誘導(dǎo)，或防止翻譯后組蛋白修飾模式，如組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化 的改變。翻譯后組蛋白修飾的模式也可以位于DACT蛋白質(zhì)的基因座上。通常，組蛋白脫乙 酰酶抑制劑和通式(I)的化合物的組合能夠引起氨基酸位置上轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修 飾的去除和/或引起氨基酸位置上轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的附著。組蛋白脫乙酰酶抑 制劑和通式(I)的化合物的組合也能夠阻止氨基酸位置上轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾的 附著和/或氨基酸位置上轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的去除。各組合一般也能夠引起轉(zhuǎn)錄 抑制翻譯后組蛋白修飾去除和轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾附著的組合。其還能夠阻止轉(zhuǎn)錄 抑制翻譯后組蛋白修飾的附著和轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的去除的組合。組蛋白脫乙酰酶抑制劑和通式(I)的化合物的組合一般能夠引起的激活翻譯后 組蛋白修飾，和/或其去除后通常能夠防止激活翻譯后組蛋白修飾的實例包括，但不限于， 組蛋白3上賴氨酸4的甲基化、組蛋白3上賴氨酸9的乙?；徒M蛋白3上賴氨酸14的乙 酰化。組蛋白脫乙酰酶抑制劑和通式(I)的化合物的組合一般能夠去除的，和/或通常能 夠防止其附著的轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾的實例包括，但不限于組蛋白3上賴氨酸9的 甲基化、組蛋白3上賴氨酸27的甲基化和組蛋白4上賴氨酸20的甲基化。作為示例性實 例，圖5C描述了 3-deazan印lanocin A和曲古抑菌素A的組合能夠引起組蛋白3上賴氨酸 4的甲基化、組蛋白3上賴氨酸9和/或組蛋白3上賴氨酸14的乙?；教岣?。該圖還表明這兩種化合物的組合能夠引起組蛋白3上賴氨酸27的甲基化、組蛋白3上賴氨酸9的 甲基化和組蛋白4上賴氨酸20的甲基化的水平降低。在一些實施方案中，通式(I)的化合物(上文)和組蛋白脫乙酰酶抑制劑順序施 用。在一些實施方案中，通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑以至少基本同時的方 式施用。在一些實施方案中，在同一藥物組合物中包括通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰 酶抑制劑。在一些實施方案中，通過由腸內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、皮下和經(jīng)口組成的 一種或更多種途徑對患者施用所述組合。在一些實施方案中，通過相同途徑施用通式(I) 的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑。在其它實施方案中，通過不同于組蛋白脫乙酰酶抑制 劑的途徑施用通式(I)的化合物。與一種或更多其它治療劑“組合”施用包括同時(共同)和以任何順序連續(xù)施用。已經(jīng)鑒定了 11種人組蛋白脫乙酰酶并且基于序列和功能同源性可將它們細分成 類型1(組蛋白脫乙酰酶1、2、3、8、11)和類型II組蛋白脫乙酰酶(組蛋白脫乙酰酶4、5、6、 7、9、10)。此外，具有7個輔因子依賴性脫乙酰酶，其被分類為類型III的組蛋白脫乙酰酶 或sirtuins。組蛋白脫乙酰酶抑制劑誘導(dǎo)組蛋白尾部的超乙?；?，導(dǎo)致DNA染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的 松弛和被抑制基因的再激活。還提供的是通過對需要該治療的患者施用調(diào)節(jié)DACT蛋白的活性和/或量的物質(zhì) 來治療或預(yù)防疾病或病癥的方法。在一些實施方案中，待治療或預(yù)防的疾病或病癥涉及 Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常組分，其可能是因為突變或種系改變。待用本發(fā)明方法 治療或預(yù)防的疾病或病癥例如是癌癥。術(shù)語“預(yù)防”指降低生物感染或發(fā)生異常狀況的可能性?！爸委煛被颉爸委煛被颉皽p輕”指治療性治療和預(yù)防性或預(yù)防措施，其中目標(biāo)是在生 物中預(yù)防、減緩(減輕)或至少部分緩和或消除異常的，包括病理學(xué)狀況。需要治療的那些 人包括已經(jīng)患有病癥的那些人以及易于患病癥的那些人或其中待預(yù)防所述病癥(預(yù)防)的 那些人。當(dāng)Wnt-介導(dǎo)的病癥是癌癥時，如果已經(jīng)經(jīng)歷了包括增加本發(fā)明DACT蛋白的量和 /或活性的治療后，個體顯示一種或更多以下情況的可觀察和/或可檢測降低或缺失癌細 胞數(shù)量的減少或癌細胞的缺失；腫瘤大小的減少；癌細胞滲入外周器官包括癌擴散到軟組 織和骨中的抑制(即，一定程度上減慢并優(yōu)選終止)；腫瘤生長得到一定程度上的抑制；和 /或一定程度上減輕了與特定癌相關(guān)的一種或更多癥狀；降低的發(fā)病率和死亡率，和生活 質(zhì)量的改善，那么受試者或哺乳動物被成功“治療”或顯示減少的腫瘤負擔(dān)。在本發(fā)明用途 或方法可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度上，其可以是細胞生長抑制的和/或細胞 毒性的。各患者還可感受這些體征或癥狀的減輕?？赏ㄟ^醫(yī)師熟悉的常規(guī)操作容易地測定用于評估成功治療和疾病改善的上述參 數(shù)。對于癌治療，例如可通過評估疾病進展的時間(TDP)和/或確定應(yīng)答率(RR)來測定效 果。可通過分期測試和用于鈣水平的骨掃描和測試和其它酶測定來測定向骨的擴散來測定 轉(zhuǎn)移。也可以進行CT掃描來尋找區(qū)域內(nèi)向骨盆和淋巴結(jié)的擴散。通過已知方法進行的肝 臟酶水平的胸部X線檢查和測定用于尋找分別到肺和肝的轉(zhuǎn)移。用于監(jiān)測疾病的其它常規(guī) 方法包括經(jīng)直腸超聲檢查(TRUS)和經(jīng)直腸針吸組織檢查(TRNB)。術(shù)語“施用”指向生物的一個或更多細胞或組織中摻入化合物的方法。術(shù)語“治療效果”指引起或促進異常狀況的因素的抑制或激活。治療效果在一定
32程度上減輕了異常狀況的一種或更多癥狀。術(shù)語“異?！被颉爱惓５摹迸c細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的功能結(jié)合時指該過程的組分，例 如在生物中過表達或表達不足的激酶發(fā)生改變，使得其催化活性比相應(yīng)的野生型活性更低 或更高，使得其不再與天然結(jié)合配偶體相互作用，不再被另一因子例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)磷 酸酶修飾，或不再與天然結(jié)合配偶體相互作用。當(dāng)生物的細胞或組織在生物內(nèi)或生物外存在時，可預(yù)防或治療由DACT蛋白的量 或活性降低引起的異常狀況?？稍诩毎囵B(yǎng)皿中維持或培養(yǎng)生物外存在的細胞。對于生物 內(nèi)攜帶的細胞，本領(lǐng)域中存在許多技術(shù)施用化合物，包括(但不限于)口腔、腸胃外、皮膚、 注射和氣溶膠應(yīng)用。對于生物外的細胞，本領(lǐng)域中存在許多技術(shù)施用化合物，包括(但不限 于)細胞顯微注射技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)和載體技術(shù)。還可通過向Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有異常的一組細胞施用化合物來 預(yù)防或治療異常狀況，其中所述細胞包括在生物內(nèi)或是生物的一部分。然后可監(jiān)測施用化 合物對生物功能的影響。所述生物可以是或者例如是哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山 羊、狗、猴子或猿。在一些實施方案中，所述生物是人。術(shù)語“異常狀況”指生物的細胞或組織中偏離該生物中其正?；驑?biāo)準(zhǔn)功能的功能。 異常狀況可涉及細胞增殖、細胞分化或細胞存活。術(shù)語“細胞增殖病癥”和“增殖病癥”指 與一定程度的異常細胞增殖相關(guān)的病癥，如腫瘤。如此處所用，詞語“腫瘤”指所有的贅生 細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，和所有癌變前的和癌性細胞和組織。因此，詞 語“腫瘤發(fā)生”指贅生細胞生長和增殖的產(chǎn)生，包括誘導(dǎo)。腫瘤發(fā)生的實例是癌發(fā)生——癌 細胞的產(chǎn)生，其通常是體細胞向癌細胞，包括癌干細胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果。異常細胞增殖病癥包括癌、纖維變性和系膜病癥、異常血管發(fā)生和血管發(fā)生、創(chuàng)傷 愈合、牛皮癬、糖尿病和炎癥。此外，所述增殖病癥可涉及其中消除程序性細胞死亡(凋亡) 途徑的病癥。表達處于Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制下的許多蛋白質(zhì)與程序性細胞死 亡途徑相關(guān)，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常可導(dǎo)致細胞永生。在本發(fā)明的方法和用途中，可使用額外的化合物，例如改變dishevelled蛋白 活性的化合物，例如其拮抗劑。低分子量有機化合物(Dvl PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用的拮抗 劑)的實例是吲哚-2-甲醇衍生物，其已經(jīng)由You等公開(Mol Cancer Ther (2008) 7,6, 1633-1638)。Dvl PDZ結(jié)構(gòu)域相互的拮抗劑的其它合適實例是Mahindroo等(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2008) 18,946-949)公開的吲哚 _2_ 羧酸酰胺衍生物。例如可用于與3-Deazan印lanocin A和組蛋白脫乙酰酶抑制劑或與如上述組合物 組合的額外化合物的其它實例是抑制蛋白激酶功能的化合物。已經(jīng)報道抑制蛋白激酶功能 的低分子量化合物的實例包括，但不限于，雙單環(huán)、二環(huán)或雜環(huán)芳基化合物(國際專利申請 WO 92/20642)、亞乙烯基-氮雜吲哚衍生物(國際專利申請WO 94/14808)、1_環(huán)丙基-4-批 啶基-喹諾酮(美國專利號5，330，992)、苯乙烯基化合物(美國專利號5，217，999)、苯乙烯 基_取代的吡啶基化合物(美國專利號5，302，606)，某些喹唑啉衍生物(歐洲專利申請?zhí)?O 566 266A1)、硒代吲哚和硒化物(國際專利申請WO 94/03427)、三環(huán)多羥基化合物(國際 專利申請WO 92/21660)和芐基膦酸化合物(國際專利申請WO 91/15495)。能夠調(diào)節(jié)蛋白激酶活性的物質(zhì)的其它實例包括，但不限于，吲哚酮、tyrphostins, 喹唑啉、喹喔啉和喹啉。上文涉及的吲哚酮、喹唑啉、tyrphostins、喹啉和喹喔啉包括文獻中描述的眾所周知的化合物。可用于與本發(fā)明化合物、藥物組合物、方法或用途組合的化合物的其它實例是 抗激素劑，其發(fā)揮作用以調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素的效果。此類化合 物經(jīng)常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們本身可以是激素。實例包括抗雌激素和選擇性 的雌激素受體調(diào)節(jié)物(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、 EVISTA 雷洛昔芬、著洛西芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛西芬、LYl 17018、 奧那斯酮和FARESTON 托瑞米芬；抗_黃體酮；雌激素受體下調(diào)物(ERD)；抑制或 關(guān)閉卵巢的試劑，例如促促黃體素釋放素-釋放激素(LHRH)激動劑，如LUPRON 和ELIGARD 醋酸亮丙瑞林、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林和tripterelin;其它抗 雄激素，如氟利坦、尼魯米特和比卡魯胺；和抑制酶芳香酶的芳香酶抑制劑，其調(diào)節(jié)在 腎上腺中雌激素的產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE 醋酸甲地孕酮、 AROMASIN 依西美坦、formestanie、法曲唑、RIVISOR 伏羅唑、FEMARA 來曲唑和ARIMIDEX 阿那曲唑。此外，化學(xué)治療劑的此類定義包括二膦酸類，如氯屈 膦酸二鈉(例如，BONEFOS 或OSTAC )、DIDROCAL 羥乙磷酸、NE-58095、 ZOMET A 唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX 阿侖特羅、AREDIA 氨 羥二磷酸二鈉、SKEIJD 替魯膦酸鈉或ACTONEL 利塞膦酸鈉；以及曲沙他 濱(ι，3-二氧戊環(huán)腺苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細胞增殖 的信號途徑中基因表達的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)； 疫苗，如THERATOPE 疫苗和基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、 LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；LURTOTECAN 拓撲異構(gòu)酶ι抑制劑； ABARELIX rmRH ；拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(ErbB-2和還稱為GW572016的EGFR二元酪 氨酸激酶小分子抑制劑)；和上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。如此處所用， 術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指待施用物質(zhì)的性質(zhì)，例如組合物、載體、稀釋劑或活性化合物的性 質(zhì)，其能夠?qū)θ嘶蛟谌松鲜┯?，在所用劑量或量時至少基本上不產(chǎn)生不希望的生理效應(yīng)，如 惡心、頭暈或心嘈。特別地，該物質(zhì)的所用量或劑量不會在阻止施用組合物的程度上引起這 種效應(yīng)。當(dāng)用于此處時，“生長抑制劑”指在體外或體內(nèi)抑制細胞生長，尤其是具有Wnt信號 活性的癌細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低此類細胞在S期 中百分比的試劑。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期進展(處于非S期)的試劑，如誘 導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的試劑。典型的M期阻滯劑包括長春胺(長春新堿和長春堿)、紫杉 烷類，和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，如阿霉素、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素。阻滯 Gl的那些試劑還導(dǎo)致S期阻滯，例如DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉬、 氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。紫杉烷(紫杉醇和多西他賽)是來自紫杉的抗癌藥物。來 自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE )是紫杉醇(TAXOL )的半合成類似物。 紫杉醇和多西他賽促進從微管蛋白二聚體裝配微管并通過防止解聚穩(wěn)定微管，其導(dǎo)致對細 胞中有絲分裂的抑制。在藥物組合物中包括的其它活性成分的實例包括，但不限于，核酸烷化劑、蒽環(huán)類 抗生素、抗生素、芳香酶抑制劑、葉酸拮抗劑、雌激素受體調(diào)節(jié)物、無機砷酸鹽、亞硝基脲、破 骨細胞抑制劑、含鉬化合物、類維生素A、拓撲異構(gòu)酶1抑制劑、異構(gòu)酶2抑制劑、胸苷酸合酶抑制劑、芳香酶抑制劑、環(huán)加氧酶抑制劑、異黃酮、酪氨酸激酶抑制劑、生長因子、二膦酸和 單克隆抗體。 本發(fā)明藥物組合物中可包括的烷化劑包括但不限于白消安(Myleran 、 Busilvex )、苯丁 酸氮芥(Leukeran )、異環(huán)磷酰胺(Mitoxana ,有或
沒有MESNA)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan 、Neosar )、葡磷酰胺、苯丙氨酸氮芥/ L-PAM(Alkeran )、達卡巴嗪(DTIC-Dome )和 temOZOlamide( Temodar )。 作為示例性實例，也常稱為環(huán)磷酰胺的化合物2- 二 [ (2-氯代乙基)氨基]四-氫-2H-1， 3，2-氧氮磷雜環(huán)己烷，2-氧化物是用于治療III和IV期惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血 病、蕈樣霉菌病、成神經(jīng)細胞瘤、卵巢腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤和乳腺癌的烷化劑。本發(fā)明藥物組合物中可包括的蒽環(huán)類抗生素包括，但不限于阿霉素 (Adriamycin , Doxil ，Rubex )、米托蒽醌(Novantrone )、伊達比星 (Idamycin )、戊柔比星(Valstar )和表柔比星(Ellence )。作為一個實例，化 合物(8S，10S)-10-(4-氨基-5-羥基-6-甲基-四氫-2H-吡喃-2-基氧基)-6，8，11-三 羥基-8-(2-羥基乙酰基)-l-甲氧基_7，8，9，10-四氫并四苯-5，12- 二酮，更常稱為阿霉 素，是從波賽鏈霉菌青灰變種(Sti^ptomyces peucetius var. caesius)的培養(yǎng)物中分離的 細胞毒性蒽環(huán)類抗生素。阿霉素已經(jīng)成功用于產(chǎn)生散布的瘤形成狀況的消退，所述狀況如 急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血病、維爾姆斯瘤、成神經(jīng)細胞瘤、軟組織和骨肉瘤、乳 腺癌、卵巢癌、移行細胞膀胱癌、甲狀腺癌、霍奇金和非霍奇金類型的淋巴瘤、支氣管癌和胃 癌。本發(fā)明藥物組合物中可包括的抗生素包括但不限于更生霉素、更生霉素 D (Cosmegen )、柔紅霉素 / 道諾霉素(Cerubidine ，DanuoXome )、博來霉 素(Blenoxane )、表柔比星(Pharmorubicin )和米托蒽醌(Novantrone
)。用于本發(fā)明實踐中的芳香酶抑制劑包括但不限于阿那曲唑(Arimidex )和來曲唑 (Femara )。本發(fā)明藥物組合物中可包括的二膦酸抑制劑包括但不限于唑來膦酸鹽 (Zometa )。本發(fā)明藥物組合物中可包括的環(huán)加氧酶抑制劑包括但不限于乙酰水楊酸 (Aspirin )、塞來考昔(Celebrex )和羅非考昔(Vioxx 、Ceoxx 、Ceeoxx
)。本發(fā)明藥物組合物中可包括的雌激素受體調(diào)節(jié)物包括但不限于他莫昔芬(Nolvadex )和氟維司群(Faslodex )。本發(fā)明藥物組合物中包括的葉酸拮抗劑包括但不限于氨甲 喋呤(Trexall 、Rheuman*ex )和曲美沙特(Neutrexin )。作為示例性實例，
化合物(S)-2-(4-(((2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲基氨基)苯甲酰氨基)戊二酸，常 稱為氨甲喋呤，是已經(jīng)用于治療妊娠絨毛膜癌并用于治療患絨毛膜腺瘤和葡萄胎的患者的 抗葉酸藥物。其還用于治療惡性淋巴瘤的晚期并用于治療蕈樣肉芽腫病的晚期。如上指出，本發(fā)明還涉及鑒定處于變成致腫瘤性的，包括致癌的風(fēng)險中細胞和/ 或具有腫瘤易感性的細胞的方法。本發(fā)明還涉及預(yù)后、評估疾病狀態(tài)、預(yù)測個體響應(yīng)，包括 個體的腫瘤對治療的響應(yīng)、評估對治療響應(yīng)的可能性、預(yù)測疾病過程并監(jiān)測已知患有或懷 疑發(fā)生腫瘤如癌的個體的癌疾病的治療的方法。在一些實施方案中，各方法是預(yù)測贅生物 對通式(I)的化合物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合是否敏感的方法。所述贅生物例如腫瘤，如癌在一些實施方案中可包括在哺乳動物中。這些方法包括評估三個參數(shù)中的一個或更多個。這些參數(shù)中的第一個參數(shù)是各細 胞中或各個體的細胞中DACT蛋白的量。也可從相應(yīng)的個體中分離該細胞或者該細胞可以 是從相應(yīng)個體中取出的組織樣品的細胞。上述三個參數(shù)的第二個參數(shù)是細胞中DACT蛋白的活性，并且第三個參數(shù)是組蛋 白修飾的模式，通常是組蛋白甲基化和/或組蛋白乙酰化。在其中評估細胞中或組織樣品 中DACT蛋白的量或活性時，DACT蛋白的量或活性降低表明細胞將變成致腫瘤性的風(fēng)險增 加。在診斷的上下文中，DACT蛋白的降低的活性和/或細胞量表明個體發(fā)生癌的風(fēng)險增加。 當(dāng)預(yù)測贅生物的敏感時，DACT蛋白的量或活性降低可表明所述贅生物對通式(I)的化合物 與組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合敏感。例如可在DACT蛋白的基因座處評估組蛋白甲基化和/或組蛋白乙?；哪Ｊ健?DACT蛋白的基因座理解為包括編碼DACT蛋白的序列的區(qū)域。在一些實施方案中，其可指 從各基因轉(zhuǎn)錄起始下游約900bp的區(qū)域，包括從其下游約600bp到編碼DACT蛋白的序列末 端。在一些實施方案中，其可指從DACT蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄起始下游約600bp到該基因的轉(zhuǎn) 錄起始的區(qū)域，并可包括所述基因編碼區(qū)。組蛋白3上賴氨酸9和/或賴氨酸14的乙酰化 降低表示細胞具有變成致腫瘤性的易感性。在診斷的上下文中，組蛋白3上賴氨酸9和/ 或賴氨酸14的乙?；档捅硎緜€體患癌的風(fēng)險增加。組蛋白3上賴氨酸4和27的甲基化 增加也表示細胞具有變成致腫瘤性的易感性。組蛋白4上賴氨酸20和組蛋白3上賴氨酸9 的額外增加的甲基化通常還表示細胞具有變成致腫瘤性的易感性。同樣，在診斷的上下文 中，組蛋白3上賴氨酸4和27甲基化的增加值表示個體患癌的風(fēng)險增加。組蛋白4上賴氨 酸20和組蛋白3上賴氨酸9的額外增加的甲基化通常還表示個體患癌的風(fēng)險增加。在一些實施方案中，該方法是評估個體將響應(yīng)治療的機會的方法，所述治療包括 組合施用通式(I)的化合物(上文)與組蛋白脫乙酰酶抑制劑。組蛋白3上賴氨酸9和/ 或賴氨酸14的乙酰化降低表示各個體將響應(yīng)治療，所述治療包括組合施用通式(I)的化合 物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑。此外，組蛋白3上賴氨酸4和27的甲基化增加表示各個體將 響應(yīng)該治療。組蛋白4上賴氨酸20和組蛋白3上賴氨酸9的額外增加的甲基化通常也表 示個體將響應(yīng)該治療。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測例如生物或其組織或細胞中DACT蛋 白的表達、亞細胞定位和/或活性。作為示例性實例，可在一段時間里監(jiān)測DACT蛋白的細 胞量、表達、亞細胞定位和/或活性。本發(fā)明的方法還包括比較測定DACT蛋白的細胞量、表達、亞細胞定位和/或活性 的結(jié)果與對照測定(或“參考”測定)的結(jié)果。在該對照測定中，在對照組織或?qū)φ占毎性u 估一個或更多上面提到的參數(shù)，即DACT蛋白的量、DACT蛋白的活性和組蛋白修飾的模式。 該對照組織或?qū)φ占毎话阒辽倩緵]有變成致腫瘤性的風(fēng)險。在一些實施方案中，將已 經(jīng)在許多前述對照測定中獲得的一個或更多參數(shù)與平均值比較，可能進行統(tǒng)計學(xué)分析。在 診斷背景的一些實施方案中，例如懷疑與先有平均數(shù)據(jù)具有可能小的差異時，來自同一個 體的一個或更多組織樣品可用于進行一個或更多對照測定。通常從期望具有變成致腫瘤性 的相當(dāng)?shù)偷娘L(fēng)險的組織中或已知沒有變成致腫瘤性的可能風(fēng)險的健康組織中取得各樣品。在鑒定適合于阻滯、抑制或預(yù)防腫瘤發(fā)生的化合物的方法的上下文(見下文)中，對照測定可包括使用不調(diào)節(jié)DACT蛋白的細胞量、表達、亞細胞定位和/或活性的條件。在 比較細胞量、表達和/或活性時，例如將檢測到的水平與對照水平比較。如此處所用，術(shù)語 “對照水平”指例如在細胞中各蛋白的分子數(shù)量，DACT蛋白的mRNA或蛋白質(zhì)表達水平，以及 對照樣品中DACT蛋白的活性水平。所述術(shù)語因此包括正常對照水平和癌對照水平(也見 下文)。該術(shù)語可指單次參考測定或多次參考測定。在一些實施方案中，對照水平可以是從 前面進行的測定中得到的表達或活性值數(shù)據(jù)庫。術(shù)語“常規(guī)水平”指在正常健康個體或已 知沒有遭受贅生物，包括癌的個體群體中檢測的DACT蛋白的表達水平或DACT蛋白的活性 水平。正常個體是沒有各贅生物臨床癥狀的個體。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)與對照水平相比，基因表達/活性/量增加或降低約10%、約 25 %、約50 %、約75 %、約100 %或更高時，認為例如細胞中蛋白質(zhì)的基因表達水平或活性 水平或量“改變了 ”或“不同了 ”。或者，當(dāng)與對照水平相比，基因表達/或活性增加或降低 至少約0. 1、至少約0. 2、至少約1、至少約2、至少約5或至少約10或更高倍時，認為表達水 平或活性水平“增加了 ”或“降低了 ”。本發(fā)明的方法可包括改變細胞中Dishevelled蛋白，如Dishevelled-1、 Dishevelled-2或Dishevelled-3的量。在一些實施方案中，所述方法包括防止、抑制、阻滯 或逆轉(zhuǎn)Dishevelled蛋白的激活。在典型實施方案中，調(diào)節(jié)DACT蛋白的量或活性可導(dǎo)致在 細胞中調(diào)整Dishevelled蛋白的活性和Dishevelled蛋白的降解。通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑還可以代謝產(chǎn)物或前體藥物的形式 使用。如此處所用，術(shù)語“前體藥物”表示在人或動物體內(nèi)例如酶促、機械或電磁轉(zhuǎn)化或 釋放成其具有藥效的活性形式的化合物?！扒绑w藥物”因此是親本“藥物”分子的藥理學(xué)上無 活性的衍生物。其需要在向其中施用的人或動物的生理系統(tǒng)內(nèi)的自發(fā)或酶促生物轉(zhuǎn)化?！扒?體藥物”在本領(lǐng)域中通常用于克服與穩(wěn)定性、毒性、特異性缺失或有限的生物利用率相關(guān)的 問題。它們經(jīng)常在哺乳動物生物中提供可溶性、組織相容性或延遲釋放的優(yōu)勢。作為示例 性實例，“前體藥物”可以是金屬triangulo化合物，其具有保護基保護部分或其官能團，由 此可逆地抑制金屬triangulo化合物的活性。當(dāng)保護基被溶劑解離或酶去除時，各“前體藥 物”可在體內(nèi)或體外變得在藥學(xué)上有活性。作為其它示例性實例，可僅在生化轉(zhuǎn)化如氧化、 磷酸化或糖基化時將官能團引入通式(I)的化合物中。因此，在人或動物體中僅通過酶、胃 酸等將各“前體藥物”轉(zhuǎn)化成通式(I)的化合物。通式(I)的化合物的“前體藥物”可以是 水合物或非水合物。常見的“前體藥物”包括酸衍生物，如通過親本酸與合適的醇(例如低 級鏈烷醇)反應(yīng)制備的酯、通過親本酸化合物與胺(例如上述的)反應(yīng)制備的酰胺，或反應(yīng) 形成酰化堿衍生物(例如低級烷基酰胺)的堿性基團。此處所述的化合物，以及通過本發(fā)明方法鑒定的化合物可對細胞、動物或人患者 本身施用，或在藥物組合物中，其中它們與其它活性成分混合(如在組合療法中)或與合適 的載體或賦形劑，包括穩(wěn)定劑、增溶劑和乳化劑混合。此類載體、賦形劑或穩(wěn)定劑一般是藥 學(xué)上可接受的，因為它們在使用的劑量和濃度上對暴露于其的細胞或哺乳動物沒有毒性。 通常，生理上可接受的載體是水性pH緩沖液。生理上可接受的載體的實例包括緩沖液，如 磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(低于約10個殘基) 的多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡 萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ；糖醇，如甘露醇或山梨醇；鹽形成平衡離子，如鈉；和 /或非離子表面活性劑，如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS 。示例性途 徑包括，但不限于口腔、經(jīng)皮膚和腸胃外遞送。合適的施用途徑例如包括貯庫、口腔、直腸、經(jīng)粘膜或腸內(nèi)施用；腸胃外遞送，包 括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。合適的 施用途徑例如包括貯庫、口腔、直腸、經(jīng)粘膜或腸內(nèi)施用，腸胃外遞送，包括肌內(nèi)、皮下、靜脈 內(nèi)、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。還可以例如通過將化合物 如以貯庫或持續(xù)釋放制劑直接注射到實體瘤中以局部而不是全身方式施用化合物或藥物 組合物。此外，各化合物或藥物組合物可用于靶向藥物遞送系統(tǒng)中，例如用于腫瘤特異性抗 體包被的脂質(zhì)體中。例如此類脂質(zhì)體可被腫瘤選擇性地靶定并吸收。此外，可將藥物在靶向藥物遞送系統(tǒng)中施用，例如用腫瘤特異性抗體包被的脂質(zhì) 體。例如脂質(zhì)體將被腫瘤可選擇性地靶定并吸收。例如通過常規(guī)的混合、溶解、?；?、制成錠劑、研磨、乳化、包膠、捕獲(entrapping) 或凍干方法以本身已知的方式制備本發(fā)明的藥物組合物。因此，使用一種或更多種生理上可接受的載體，包括促進活性化合物加工成可在 藥學(xué)上使用的制劑的賦形劑和輔劑以常規(guī)方式配制根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物。適當(dāng)?shù)?制劑依賴于所選的施用途徑。為了注射，在水溶液，例如在生理上相容的緩沖液如Hanks' s溶液、林格液或生 理鹽水緩沖液中配制本發(fā)明的化合物。為了經(jīng)粘膜施用，在制劑中使用適合于待滲透的屏 障的滲透劑。此類滲透劑一般為本領(lǐng)域所知。為了經(jīng)口施用，可通過組合活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體來容 易地配制化合物。此類載體使得本發(fā)明的化合物可配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、 凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等用于被待治療的患者經(jīng)口攝入。可通過添加固體賦形劑，任選地研磨所得混合物并在需要時，在添加合適的輔助 劑后加工顆?；旌衔镆垣@得片劑或錠劑核來獲得用于經(jīng)口使用的藥物制劑。合適的賦形 劑特別是充填劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，如玉米淀粉、小麥 淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素 鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時，可添加崩解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，如藻酸鈉。以合適的包衣提供錠劑核。為此，可使用濃縮糖溶液，其可任選地含有阿拉伯膠、 滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或 溶劑混合物。可向片劑或錠劑包衣中加入染料或色素用于鑒定或表征活性化合物劑量的不 同組合?？山?jīng)口使用的藥物制劑包括由明膠制成的推入契合膠囊，以及由明膠和增塑劑， 如甘油或山梨醇制成的軟的密封膠囊。推入契合膠囊可含有與充填劑如乳糖，粘合劑如淀 粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，和任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，可將 活性化合物溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可加 入穩(wěn)定劑。用于經(jīng)口施用的所有制劑應(yīng)該是適合于此類施用的劑量。對于含服施用，組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。對于通過吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物以加壓包裝或噴霧器產(chǎn)生的氣霧劑 形式方便地遞送，所述加壓包裝或噴霧器使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲 烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥門遞 送測定量來測定劑量單位?？膳渲朴糜谖肫骰虼党銎鞯睦缑髂z膠囊和藥筒，其含有所 述化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物?？膳渲苹衔镉糜谕ㄟ^注射，例如快速濃注或連續(xù)輸注進行腸胃外施用。用于注 射的制劑可以單位劑量形式，例如安瓿或多劑量容器呈現(xiàn)，其添加有防腐劑。組合物可采取 這樣的形式，如油或水性載體中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并含有配制試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定 劑和/或分散劑。用于腸胃外施用的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可將 活性化合物的懸浮液制備成適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫?。合適的親脂溶劑或載體包括脂肪油， 如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有 增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述懸浮液還可含 有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑以允許制備高度濃縮的溶液?；蛘?，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合適載體，例如滅菌無致熱原水 重構(gòu)。還可在直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑中配制化合物，例如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如 可可脂或其它甘油酯。除了上述制劑，化合物還可配制成貯庫制劑。可通過移植(例如皮下或肌內(nèi))或 通過肌內(nèi)注射使用此類長效制劑。因此，例如，化合物可用合適的聚合或疏水性材料(例如 在可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或配制成微溶性衍生物，例如微溶的鹽。用于本發(fā)明疏水性化合物的藥物載體是共溶劑系統(tǒng)，其包括苯甲醇、非極性表面 活性劑、可與水混溶的有機聚合物和水相。所述共溶劑系統(tǒng)可以是VPD共溶劑系統(tǒng)。VPD是 3% w/v苯甲醇、8% w/v非極性表面活性劑聚山梨酯80和65% w/v聚乙二醇300的溶液， 用無水乙醇補足體積。所述VPD共溶劑系統(tǒng)(VPD :D5W)由VPD用5%葡萄糖水溶液1 1 稀釋組成。該共溶劑系統(tǒng)很好地溶解疏水性化合物，并且在全身施用后其自身產(chǎn)生低毒性。 自然界中，共溶劑系統(tǒng)的比例有顯著變化，但不破壞其可溶性和毒性特征。此外，共溶劑組分的身份可以變化例如，可以使用其它低毒性非極性表面活性 劑代替聚山梨酯80 ；聚乙二醇的級分大小可以變化；其它生物相容的聚合物可替換聚乙二 醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其它糖或多糖可替換葡萄糖。還可使用用于疏水性藥物化合物的其它遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是用于疏水性藥 物的遞送運載體或載體的眾所周知的實例。也可使用某些有機溶劑，如二甲基亞砜，盡管一 般以更高的毒性為代價。此外，可使用持續(xù)釋放系統(tǒng)，如含治療劑的固體疏水性聚合物的半 透性基質(zhì)遞送化合物。已經(jīng)確定了多種類型的持續(xù)釋放材料，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。 根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，持續(xù)釋放膠囊可在幾周到超過100天時間里釋放化合物。根據(jù)治療試劑 的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可使用用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的其它策略。藥物組合物還可包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。此類載體或賦形劑的實 例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二醇。
本發(fā)明中使用的許多化合物提供為具有藥學(xué)上相容的平衡離子的鹽?？捎迷S多 酸，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等形成藥學(xué)上相容的鹽。 鹽在水或其它質(zhì)子溶劑(其為相應(yīng)的游離堿形式)中趨向于更可溶。適合用于本發(fā)明的藥物組合物包括組合物，其中以有效達到其預(yù)期目的的量包含 活性成分。更尤其是，治療有效量表示有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或延長所治療受試者 存活的化合物的量。治療有效量的確定為本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)，尤其是參考此處 提供的詳細公開內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法的任何化合物，可從細胞培養(yǎng)測定中初步評估治療有效劑 量。例如，可用動物模型中設(shè)計劑量以達到循環(huán)濃度范圍，其包括如細胞培養(yǎng)中測定的 IC50 ( S卩，在細胞中實現(xiàn)DACT的活性半最大抑制或DACT蛋白的量半最大減小的測試化合物 的濃度)。該信息可用于更精確地在人類中確定有用劑量?？赏ㄟ^細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)藥物程序確定此處所述化合物的毒性和治 療效果，例如用于確定LD5tl (50%群體致死的劑量)和ED5tl (在50%群體中治療有效的劑 量)。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，并且其可表達為LD5tl和ED5tl之間的比 例。可期望使用顯示高治療指數(shù)的化合物。從這些細胞培養(yǎng)測定和動物研究中獲得的數(shù)據(jù) 可用于設(shè)計用于人的劑量范圍。此類化合物的劑量優(yōu)選處在包括幾乎沒有或沒有毒性的 ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。該劑量根據(jù)所用的劑量形式和利用的施用途徑在所述范圍內(nèi)變動。 各醫(yī)師可根據(jù)患者的狀況選擇精確制劑、施用途徑和劑量?？蓚€別調(diào)整劑量和時間間隔以提供足以維持DACT、調(diào)整效果的活性部分的血清 水平，或最低有效濃度(MEC)。MEC對每一種化合物不同，但可從體外數(shù)據(jù)估計；例如，達到 DACT蛋白50-90%抑制必須的濃度。達到MEC必須的劑量將取決于個體特征和施用途徑。 然而，HPLC測定或生物測定可用于確定血清濃度。還可使用MEC值確定劑量間隔。應(yīng)使用方案施用化合物，所述方案維持高于MEC 的血清水平10-90%時間，例如從約30到約90%，如從約50到約90%。在局部施用或選擇 性吸收的情況下，藥物的有效局部濃度可以不與血清濃度相關(guān)。當(dāng)然所施用組合物的量將 取決于被治療的受試者、受試者的體重、痛苦的嚴重程度、施用方式和處方醫(yī)師的判斷。需要時，可在包裝或分配器裝置中給予組合物，所述包裝或分配器裝置包含含有 活性成分的一個或更多單位劑量形式。所述包裝可例如包括金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包 裝或分配器裝置可附帶施用說明書。包裝或分配器還可以附帶與容器結(jié)合通知，其為政府 機構(gòu)規(guī)定藥物的生產(chǎn)、使用或銷售的形式，所述通知反映了該機構(gòu)批準(zhǔn)該化合物形式用于 人或獸醫(yī)施用。此類通知例如可以是美國食品和藥品管理局或其他政府部門為處方藥批準(zhǔn) 的標(biāo)簽，或批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。還可用相容性藥物載體配制本發(fā)明的組合物，置于適當(dāng)容器中，并將其標(biāo)記用于 治療指出的狀況。在標(biāo)簽上指出的合適狀況包括，例如癌的治療。根據(jù)本發(fā)明，方法、化合物和藥物組合物可用于治療細胞增殖病癥，如腫瘤或癌。 任何腫瘤或癌可被選擇用于治療，包括例如良性腫瘤和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤。實例包括，但不限 于血液學(xué)惡性腫瘤和實體瘤。實體瘤包括例如來自結(jié)締組織或支持組織的肉瘤、來自身體 腺細胞和上皮細胞的癌、或淋巴瘤(淋巴組織的癌，如淋巴結(jié)、脾和胸腺)。實體瘤的實例包 括，但不限于乳腺癌、肺癌、腦腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤、結(jié)腸癌、直腸癌、膀胱癌、肝腫瘤、胰臟腫
40瘤、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤。如上解釋，本發(fā)明包括細胞中DACT蛋白的診斷、預(yù)后和治療用途，包括其量或活 性。特別是基于所述量或活性，尤其提供監(jiān)測治療、預(yù)測對治療響應(yīng)、監(jiān)測最小殘留疾病和 /或疾病預(yù)后的方法和用途?；诎l(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供鑒定能夠在細胞中預(yù)防、抑 制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生，包括癌發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡的化合物 的方法。這些方法中的一些方法是體內(nèi)或離體方法。一些方法是鑒定各種化合物的體外方 法。所述化合物能夠與DACT蛋白或其功能片段形成復(fù)合體。本發(fā)明的一些方法包括將該 復(fù)合體的組分彼此暴露，無論是體外或體內(nèi)。一種該方法是體外方法，其包括將彼此形成或 懷疑形成復(fù)合體的組分接觸。例如，懷疑與DACT蛋白形成復(fù)合體的DACT蛋白和藥物候選 分子可彼此接觸。化合物能夠改變DACT蛋白與dishevelled蛋白之間的復(fù)合體形成。在 一些實施方案中，各方法包括將化合物、DACT蛋白或其功能片段和dishevelled蛋白接觸。 在此類實施方案中，檢測DACT蛋白與dishevelled蛋白之間的復(fù)合體形成。在一些實施方案中，方法還包括檢測復(fù)合體的形成?？墒褂脵z測復(fù)合體形成的任 何合適方法。檢測方法例如可包括電泳、HPLC、流式細胞術(shù)、熒光相關(guān)光譜或這些技術(shù)的修 飾形式(也見上文)。其它技術(shù)涉及生物分子結(jié)合本身的測定。此類測定例如可依靠光譜、 光化學(xué)、光度計、熒光計、放射學(xué)、酶學(xué)或熱力學(xué)手段(上文)。DACT蛋白與dishevelled蛋 白之間復(fù)合體形成的增強說明所述化合物能夠在細胞中預(yù)防、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生 和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。當(dāng)所述方法是體內(nèi)或離體方法時，其可包括提供微生物。所述微生物表達DACT結(jié) 合蛋白，懷疑所述化合物能夠與所述結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，懷疑所述化合物增加所述結(jié)合 蛋白與dishevelled蛋白的復(fù)合體形成或懷疑所述化合物能夠增加所述結(jié)合蛋白的表達。 在一些實施方案中，所述微生物可內(nèi)源表達所述DACT結(jié)合蛋白。在一些實施方案中，所述 微生物是重組細胞或轉(zhuǎn)基因微生物(也見上文)。本發(fā)明的方法包括向微生物中加入各化合物。在各方法的一些實施方案中，監(jiān)測 DACT蛋白的表達。在各方法的一些實施方案中，監(jiān)測DACT蛋白的活性。在一些實施方案 中，監(jiān)測細胞表型的改變。在一些實施方案中，該方法包括對照測定(也見上文)。將對照 測定的結(jié)果與使用該化合物獲得的結(jié)果比較。對照測定例如可包括使用已知不影響DACT 結(jié)合蛋白的表達或活性，或已知不影響DACT蛋白與dishevelled蛋白之間形成的化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使各微生物例如細胞(如腫瘤細胞)與預(yù) 定量的通式(I)的化合物(見上文)和預(yù)定量的組蛋白脫乙酰酶抑制劑接觸。在一些實施 方案中，使用至少兩種不同預(yù)定量的通式(I)的化合物。在一些實施方案中，使用至少兩種 不同預(yù)定量的通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合。在這些實施方案的一些 實施方案中，使用至少第一種和第二種細胞。所述第一種細胞與兩個預(yù)定量的較低者接觸， 并且第二種細胞與兩個預(yù)定量的較高者接觸。各實施方案例如可以是篩選測定、細胞毒性 測試或劑量/響應(yīng)曲線的測定。在一些實施方案中，從同一患者中獲得第一種細胞(例如腫瘤細胞)和第二種細 胞(例如腫瘤細胞)。該方法例如可以是預(yù)測患者或動物對通式(I)的化合物和組蛋白脫 乙酰酶抑制劑的組合的個體響應(yīng)的方法。單核苷酸多態(tài)性和基因表達的個體差異一般在響 應(yīng)所施用的化合物的患者間引起個體差異。在一些實施方案中，本發(fā)明的各方法也可以是鑒定影響患者對通式(I)的化合物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合的響應(yīng)的遺傳變體的 方法。通常，通過許多蛋白質(zhì)測定對動物或患者作為藥物應(yīng)用的化合物的效果，使得與非遺 傳因素偶聯(lián)的多個基因中的混合遺傳多態(tài)性決定了對化合物的響應(yīng)。本發(fā)明的各方法因此 可以是測定患者基因型的方法，例如來保證最大效果與最小不利效應(yīng)。對于本發(fā)明的一些實施方案，可以文庫形式使用化合物。此類文庫的實例是化學(xué) 合成為模式化合物的多種小的有機分子，或含有大量序列變體的核酸分子的集合。在根據(jù)本發(fā)明方法分析大量候選化合物以鑒定能夠預(yù)防、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤 發(fā)生的實施方案中，該實施方案通常稱為篩選方法。例如可同時、連續(xù)或以任何不同相方式 彼此獨立地分析這些候選化合物。在體內(nèi)或離體實施方案中，例如可向細胞培養(yǎng)基中加入 候選抑制劑或向生物例如小鼠或果蠅施用候選抑制劑。在一些體外實施方案中，例如使用 市售機器人自動地，也可以重復(fù)地進行多種候選化合物的任何大量分析步驟。為此，可使 用任何數(shù)量的自動裝置，例如自動化的讀出系統(tǒng)、移液機器人、沖洗機器人或全自動篩選系 統(tǒng)。作為示例性實例，所述方法可以是例如使用一個或更多自動工作站在多孔微量培養(yǎng)板 (例如常規(guī)的48孔、96孔、384孔或1536孔板)中進行的體外篩選方法。因此，在一些實施 方案中，本發(fā)明提供高通量篩選的方法。也可以使用試劑盒，例如設(shè)計用于進行本發(fā)明方法 的試劑盒實施所述方法。其它相關(guān)方法是體內(nèi)方法，其包括提供宿主生物?？梢蕴峁┤魏蜗胍乃拗魃铮?只要其能夠容納并培養(yǎng)腫瘤細胞，例如癌細胞。宿主生物的實例包括，但不限于哺乳動物、 魚、兩棲動物和鳥。合適哺乳動物的實例見上文。任何想要的癌細胞可用于該目的(見上 文的實例)。所述方法還包括向宿主生物中引入癌細胞。此外，所述方法包括如上述化合 物，即懷疑能夠與DACT蛋白形成復(fù)合體、能夠調(diào)節(jié)DACT結(jié)合蛋白的量、能夠調(diào)節(jié)DACT蛋白 的活性、或能夠增強DACT蛋白和dishevelled蛋白之間復(fù)合體形成的化合物的用途。在一 些實施方案中，所述癌細胞包括所述化合物。因此，可在向宿主生物中引入同一化合物之前 將其引入癌細胞中。在一些實施方案中，在宿主生物中引入癌細胞之前、之后或同時向宿主 生物施用所述化合物。通常，在方法的特定階段向癌細胞中引入所述化合物。所述方法還 包括監(jiān)測在宿主生物中腫瘤的生長。通過以下非限制性實施例和附圖進一步說明本發(fā)明。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本 發(fā)明公開內(nèi)容中容易理解的，根據(jù)本發(fā)明還可利用與此處所述相應(yīng)示例性實施方案行使基 本相同功能或?qū)崿F(xiàn)基本相同結(jié)果的目前存在的或以后開發(fā)的其它物質(zhì)組合物、手段、用途、 方法或步驟。發(fā)明的示例性實施方案圖1. Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑的重要特征的簡化圖示㈧在缺少Wnt信號的情況下， 通過形成多蛋白復(fù)合體來調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的水平，確定了細胞質(zhì)破壞復(fù)合體。所述復(fù)合體 包括腫瘤抑制劑腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)、支架蛋白軸蛋白、酪蛋白激酶I(CKI)和糖原合 酶激酶3(GSK3i3)。其引起聯(lián)蛋白的磷酸化，由此標(biāo)記其用于泛素化，并因此通過蛋白 酶體被降解。(B)在Wnt結(jié)合Frizzled(Fz)受體和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白如 LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)時，Dvl被募集到該受體上，導(dǎo)致其激活，由此觸發(fā)事件級聯(lián)。由 于破壞復(fù)合體被抑制，低磷酸化的聯(lián)蛋白被穩(wěn)定，累積并轉(zhuǎn)移到細胞核中。在那里其與 T細胞因子(TCF)和/或淋巴樣增強子結(jié)合因子(LEF)形成復(fù)合體，由此激活包括c-MYC、細胞周期蛋白D1、胃泌素或基質(zhì)溶解因子在內(nèi)的許多基因的轉(zhuǎn)錄。(C)預(yù)期增加本發(fā)明DACT 的量和/或活性可導(dǎo)致其與Dvl形成復(fù)合體，由此阻斷圖IB中描述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因為 形成了圖IA中指示的多蛋白復(fù)合體，聯(lián)蛋白被磷酸化并降解。圖2描述了跨越人DACT3轉(zhuǎn)錄起始位點的基因組區(qū)的基因作圖。5’RACE用于確定 實驗操作中描述的DACT3的轉(zhuǎn)錄起始位點。轉(zhuǎn)錄起始位點示于黑色的“克隆X的數(shù)目(相 對于ORF起始密碼子)”。顯示了啟動子區(qū)和外顯子1的DNA序列。斜體序列(白色框)指 出了外顯子1的編碼區(qū)。圖3顯示了結(jié)腸癌中不依賴于DNA甲基化的DACT3表達的損失。A 人結(jié)腸直腸腫 瘤⑴和匹配的正常粘膜(N)中Wnt抑制劑(上)和Wnt/β-聯(lián)蛋白靶基因(下)的分級 聚類。上圖中的白色信號表示超過平均表達；下圖中的白色信號表示低于平均表達。B:來 自隨機選擇的8對人結(jié)腸直腸腫瘤和匹配的粘膜的SFRPl和DACT1、2和3的RT-PCR分析。 C 通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測測定的8個腫瘤中SFRPl和DACT3的甲基化狀態(tài)。Ml、 M2、M3和M4代表覆蓋DACT3啟動子的完整CpG島的檢測的PCR區(qū)。D —組結(jié)腸直腸癌細 胞系相比于正常組織SFRPl和DACT1、2和3的RT-PCR分析。E 結(jié)腸直腸癌細胞系中SFRPl 和DACT1、2和3的甲基化狀態(tài)。F 通過測序來自正常和結(jié)腸直腸癌細胞系中的亞硫酸氫 鹽修飾的DNA測定CpG位點的甲基化狀態(tài)。箭頭指示轉(zhuǎn)錄起始位點。空心圓形代表未甲基 化的CpG ；實心圓形表示甲基化的CpG。G 未用5-AzaC處理或用其處理的HCT116細胞和 HCT116-DWTl/DWT3b-/-(DK0)細胞中 DACT1、2 和 3 啟動子的MSP 分析。H 用 5_AzaC(5 μ Μ) 處理3天的HCT116和DLDl細胞和DKO細胞中SFRPl和DACT1、2和3的RT-PCR分析。圖4.結(jié)腸癌細胞中DACT1、2和3的組蛋白修飾。使用針對指定組蛋白修飾的抗體 進行ChIP測定并通過定量PCR進行分析。以數(shù)字說明用于PCR分析的覆蓋相對于DACT1、2 和3的轉(zhuǎn)錄起始位點的-3. 5kb到+3. 5kb區(qū)的基因組DNA片段。顯示了在各基因座上各組 蛋白標(biāo)記的包含所指區(qū)域的相對富集(結(jié)合/輸出)(一式三份測定的均值士SD)。A :HT-29 細胞中DACT1-3基因座上的組蛋白標(biāo)記。B :SW480和RKO細胞中DACT3基因座上H3K27me3 和H3K4me3的富集。C 正常人腸上皮細胞(His 74Int)、非癌性乳腺上皮MCFlOA細胞和肺 成纖維MRC5細胞中DACT1-3基因座上H3K27me3和H3K4me3的富集。圖5. DZN印和TSA的組合對DACT3和組蛋白修飾的影響。A 在用5 μ M DZNep,5 μ M 5-AzaC、200nM TSA 或其組合處理的 DLDl 細胞中使用 Illumina Beadarray 的 DACT3mRNA 表 達分析。所示數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗的均值士 SD。B:用DZN印、TSA或兩者處理所示結(jié)腸 直腸癌細胞系。收集RNA并進行陣列分析(1 :DCAT2，2 :DACT2，3 :DCAT3，4 :DKK4，5 :DKK3， 6:DKKL1,7:DKK2,8:DKK3，9 =DKKl,10 :SFRP4，11 :SFRP2，12 :SFRP5，13 :SFRP3，14:SFRP1)。 顯示了已知Wnt/ β -聯(lián)蛋白拮抗劑的表達變化。C :ΗΤ29細胞和SW480細胞中用DZN印、TSA 或兩者誘導(dǎo)的大量組蛋白修飾的免疫印跡分析。D 表示未用DZN印和TSA處理(白色條) 或用其處理(黑色條)的ΗΤ29細胞中DACTl和DACT3基因座上組蛋白標(biāo)記的改變的ChIP 分析。所述值代表在藥物處理前和后針對低背景區(qū)的改變的歸一化富集。所述數(shù)據(jù)表示三 次獨立實驗的均值士 SD。圖6. DZNep和TSA的組合導(dǎo)致結(jié)腸直腸癌細胞中Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號的阻斷和大 量程序性細胞死亡。A 在用DZN印(5 μ Μ) ,TSA(IOOnM)或兩者處理的SW480和DLDl細胞中 DACT3、DVL2、總的β -聯(lián)蛋白和非磷酸化β -聯(lián)蛋白(活性β-聯(lián)蛋白)的免疫印跡分析。B 用DZN印/TSA處理的DLDl和SW480細胞的免疫熒光圖。β -聯(lián)蛋白染色是紅色，細胞核 染色是綠色(DRAQ5)。C 如上處理所示的結(jié)腸直腸癌細胞系；收集RNA并進行陣列分析。使 用基因聚類程序顯示已知的Wnt/β-聯(lián)蛋白靶基因的表達變化。上圖中的白色表示上調(diào)的 基因，下圖中的白色表示下調(diào)的基因。D:圖6C中所示數(shù)據(jù)的數(shù)值(D+T = DZN印+TSA)。Ε 如在A中處理DLDl和ΗΤ29細胞，并通過PI染色和FACS分析測定細胞死亡。所述數(shù)據(jù)表 示三次獨立實驗的均值士SD。F 如在A中處理ΗΤ29細胞，并通過FACS分析測定胱天蛋白 酶3活性。G 如在A中處理ΗΤ29細胞，然后進行JC-I染色和FACS分析。圖7. SW480細胞中DACT1-DACT3基因座上的組蛋白標(biāo)記。使用Solexa技術(shù)進行 SW480細胞的所示組蛋白標(biāo)記的ChIP測序。顯示了完整的DACTl、2和3基因座上H3K27me3、 H3K4me3 和 H3K9/14ac 的富集。圖8. DACT3在通過DZN印/TSA抑制Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和程序性細胞死 亡誘導(dǎo)中起作用。Α:用DZN印、TSA或兩者處理表達DACT3shRNA的兩個DLDl穩(wěn)定克隆 (DACT3-shl和DACT3-sh2)或表達非靶定對照shRNA的DLDl細胞(NC)。通過RT-PCR分析 測定DACT3和肌動蛋白mRNA水平；通過免疫印跡評估DVL2、活性β -聯(lián)蛋白和總β -肌動 蛋白水平。B 如上處理NC、DACT3-shl和DACT3_sh2細胞并通過PI染色和FACS分析測定 程序性細胞死亡。所述數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗的均值士SD。* *，p < 0. 01。C 如在A中 處理用 DACT3 SmartPool siRNA (DACT3-SP)和獨立的 DACT3 siRNA (DACT3-2)轉(zhuǎn)染的 SW480 細胞。A.所述數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的均值士SD。**，p<0.05。如上述測定程序性 細胞死亡、DACT3 mRNA水平、DVL2、活性β-聯(lián)蛋白水平和程序性細胞死亡。D 不用或用 DZN印/TSA處理轉(zhuǎn)染了 DACTl siRNA的SW480細胞，并如上收集用于mRNA和程序性細胞死 亡分析。所述數(shù)據(jù)表示三次獨立實驗的均值士SD。圖9.結(jié)腸直腸癌細胞中DACT3過表達對Dvl2和β-聯(lián)蛋白的影響。A 內(nèi)源表達 的DACT3與Dvl2結(jié)合。用所示Flag或HA標(biāo)簽的表達構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞。用抗 Flag免疫沉淀DACT3，并用抗HA抗體探測免疫沉淀物。在下圖中顯示DACT3和Dvl2之間 的相互共免疫沉淀。B 在共轉(zhuǎn)染了 Flag-DACT3或空載體的SW480細胞中的HA標(biāo)記的Dvl2 蛋白水平的Western印跡分析。C 轉(zhuǎn)染了 Myc-標(biāo)記的DACTl或DACT3表達構(gòu)建體72小時 的SW480細胞的免疫熒光圖像。通過用抗myc (綠色)和抗β-聯(lián)蛋白(紅色)染色檢測 Myc-標(biāo)記的DACTl或DACT3和β-聯(lián)蛋白的水平。通過DRAQ5染色細胞核(藍色)。箭頭 表示表達DACT3-myc的轉(zhuǎn)染細胞。D 顯示DACT3的異位表達抑制結(jié)腸細胞生長的集落形成 測定。用DACT3表達載體或空載體轉(zhuǎn)染DLDl細胞，并用Zeocin選擇12天。在右邊顯示了 一式三份中相對于對照的集落數(shù)目(誤差線均值士SD)。圖10. GSK-3處理的低分子量有機化合物抑制恢復(fù)了 DZN印/TSA對β -聯(lián)蛋白的 下調(diào)。如在GSK-3抑制劑LY2119301 (5mM)存在或缺失下所示處理DLDl細胞。然后收集細 胞用于與指定抗體進行免疫印跡。圖11. DACT3抗血清檢測預(yù)期大小(69kD)的DACT3。在圖IlA中顯示了 RK0、HCT116 和SW480細胞中DACT3mRNA的表達水平。如同下文實施例中所述通過針對人DACT3肽產(chǎn)生 的抗體所檢測到的，圖IlB顯示了這些細胞中相應(yīng)的DACT3蛋白的水平。圖12列出了發(fā)現(xiàn)在DLD1、SW480和HT29細胞中通過DZN印和TSA組合處理再激 活的81種基因。通過數(shù)值描述了三種癌細胞系中所有81種基因表達的增加。顯著的是，DACTA3的誘導(dǎo)是最高的。圖13. DZNep還與其它HDAC抑制劑協(xié)作以誘導(dǎo)程序性細胞死亡㈧和DACT3的誘 導(dǎo)禾口 β —聯(lián)蛋白的抑制(B)。SAHA (2 μ M)、PXDlOl(IyM)禾口 DZN 印(5 μ Μ)。圖14Α.結(jié)腸癌ΗΤ-29細胞異種移植物模型，顯示了對用載體、TSA
、 DZNep[2mg/kg]和DZN印[2mg/kg]與TSA
組合處理的動物的體內(nèi)影響。圖14B.在HCTl 16異種移植物腫瘤生長抑制中DZN印和SAHA的協(xié)同作用。描述 了腫瘤體積(SB-030)。*表示與載體對照相比在One-WayANOVA/Dunnett中ρ < 0. 05。圖15.為SB-HCT-116-030設(shè)計方案，其腫瘤體積數(shù)據(jù)示于圖14Β中。當(dāng)根據(jù)腫 瘤大小將動物隨機化以實現(xiàn)均勻組(平均腫瘤體積91-107mm3，在該研究中不包括一些小 鼠，因為它們不產(chǎn)生腫瘤或產(chǎn)生太大/不均勻形狀的腫瘤)時，通過在第_7天皮下植入 5X IO6HCT-116細胞并以在第0天開始描述的DZNep和SAHA的組合對動物給藥，在雌性 BALB/c裸鼠中建立腫瘤。如所示(紅色和藍色箭頭)在第0天開始用DZN印、SAHA和各載 體對四組給藥，并在灰色箭所示的日期評估體重(BW)和腫瘤體積。在第14天終止所有處 理。圖16.在用DZN印和SAHA進行的HCT116異種移植物腫瘤生長抑制中體重的改 變。當(dāng)平均腫瘤體積為91-107mm3時，通過在第_7天皮下植入5 X IO6HCT-116細胞并以在 第0天開始描述的DZN印和SAHA的組合對動物給藥在雌性BALB/c裸鼠中建立腫瘤。在所 有組中體重維持在> 80%。在SAHA組中記錄了 INTRD(第4天)和ITRD (第10天，體重 82% )。η = 7/ 組。圖17.在用DZN印和SAHA進行的HCT116異種移植物腫瘤生長抑制中的腫瘤體積。 當(dāng)平均腫瘤體積為91-107mm3時，通過在第_7天皮下植入5 X IO6HCT-116細胞并以在第0天 開始描述的DZN印和SAHA的組合對動物給藥，在雌性BALB/c裸鼠中建立腫瘤。在第14天評 估腫瘤負荷(體積以mm3計)并顯示為腫瘤體積的中值/分布(Box & WhiskersDiagram)。 與載體對照組相比，僅用DZN印+SAHA處理的動物的腫瘤體積顯著不同(單向ANOVA中ρ < 0. 01，然后是 Dunnett，s post 檢驗)。圖18. SB-HCT-116-030中腫瘤生長抑制的百分比(參考圖14B到圖17)。當(dāng)平均 腫瘤體積為91-107mm3時，通過在第_7天皮下植入5 X IO6HCT-116細胞并以在第0天開始 描述的DZN印和SAHA的組合對動物給藥在雌性BALB/c裸鼠中建立腫瘤。在第3、7、10和 14天評估腫瘤負荷(體積以mm3表示)，并如下文描述計算腫瘤生長抑制(TGI)。顯示的是 基于平均數(shù)以及基于中值計算的數(shù)據(jù)集。由于在第4天的管飼失誤失去了 SAHA組的一只 動物(NTRD)，并且在SAHA組中第二只小鼠在82%的體重時死亡(TRD)。
實施例實驗方法樣品、細胞系和藥物處理使用由新加坡國立大學(xué)的學(xué)院審查委員會批準(zhǔn)的方案從Singapore Tissue Network獲取人組織樣品；從提供組織的每一個體獲得了知情同意書。本研究中使用的結(jié) 腸直腸癌細胞系和非轉(zhuǎn)化細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection (Manassas, VA))。具有 DWT1(DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 1)和 DWT3B(DNA 甲基轉(zhuǎn)移
45酶 3B) (HCT116DK0)遺傳破壞的 HCTl 16 細胞由 Bert Vogelstein 博士(Johns Hopkins University，MD)友情提供。對于藥物處理，在藥物處理前一天接種細胞。將細胞用 5 μ M 3-Deazaneplanocin A(DZNep)(獲自 National Cancer Institute, USA 的 Victor Ε. Marquez博士)或5μΜ 5_氮雜_2’_脫氧胞苷(5_AzaC ； Sigma)處理72小時并用 100-200nM的曲古抑菌素A(TSA ;Cell Signaling)處理24小時。對于5-AzaC處理，每24 小時用新加入的5-AzaC替換培養(yǎng)基。對于用DZN印和TSA共處理細胞，加入DZN印24小 時后加入TSA額外24小時用于基因表達分析并且在48小時后用于FACS分析。1.2小鼠和飼養(yǎng)按照 National Institutes of Health (NIH)禾口 National Advisory Committee for Laboratory Animal Research (NACLAR)的教導(dǎo)在受控條件下(12小時光周期， 21-22 V，40-60 %濕度，任意接觸滅菌后的自來水和由19 %蛋白質(zhì)/5 %脂肪/5 %纖維組 成的受輻射的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飲食)將雌性無胸腺BALB/c裸鼠(Harlan，M，10_12周齡) 飼養(yǎng)在Biological Resource Centre，Biopolis (BRC)的獨立通風(fēng)籠中。動物護理許 可獲自 Biopolis Institutional Animal Care and Use Committee (Biopolis IACUC approval#050076)。1. 3定位DACT3轉(zhuǎn)錄起始位點和克隆全長DACT3cDNA使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)從 HEK293 細胞分離 10 μ g 總 RNA。除了逆轉(zhuǎn)錄 和PCR步驟外，使用FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion)根據(jù)生產(chǎn)商說明書通過RNA連 接介導(dǎo)的5’ RACE來定位DACT3轉(zhuǎn)錄起始位點。使用Thermo-X聚合酶(Invitrogen)和基 因特異性寡核苷酸5-GACCCAGGCGACCATAGGAGCTGGATC-3，(SEQ ID NO 1)在接頭連接后在 64°C進行逆轉(zhuǎn)錄1小時。使用PfuUltraPhusion聚合酶(Stratagene)以及由FirstChoice RLM-RACE試劑盒提供的正向引物和基因特異性反向引物5’ -GCTGGATCCAGAGA AGCCACTGTCCCCA-3，(SEQ ID NO :2)和5，-CACAGAAGGTTGAGGGTGGTGAATCTGGACCT_3，(SEQ ID NO 3)來進行嵌套PCR。將PCR產(chǎn)物克隆至pCR-Bluntll-TOPO載體(Invitrogen)并且用 M13引物測序?；趍RNA起始位點定位產(chǎn)生含最長的可讀框的經(jīng)標(biāo)記的DACT3表達構(gòu)建體 用于過表達研究。使用來自HEK293細胞的5 μ g總mRNA和以下引物5，-ATTGAATTCAATGATC CGGGCCTTCTCGTTCCCGGT-3’ (SEQ ID NO 4)和 5’ -ATTAGATCTTCACACTGTAGTCATGACCTTGAG AGAACCCGA-3，(SEQ ID NO :5)通過RT-PCR擴增全長DACT3編碼區(qū)。將PCR產(chǎn)物克隆至 p3xFLAG-CMV10的EcoRI和BglII位點間并測序。L4RNA 干擾從Dharmacon(Lafayett5CO)購買靶向 DACT3 的SMARTpOOl siRNA和非靶向 對照。從 Sigma-Proligo 獲得靶向以下序列5，-GGUUCUCUCAAG⑶CAUGA-3，(SEQ ID NO 6) 的單獨的DACT3siRNA。為了產(chǎn)生DACT3小發(fā)夾RNA (shRNA)穩(wěn)定細胞，將DACT3siRNA序列 (GGAGAAUCGCCUGCCUUCA) (SEQ ID NO 7)克隆至 pSIREN-RetroQ 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體。使 用pSIREN-RetroQ-Neg載體作為陰性對照shRNA (BD Bioscience)并且如描述選擇并擴大 細胞(Tan，J.，等，Genes Dev (2007) 21，1050-1063)。1. 5免疫印跡分析如之前描述進行免疫印跡(Tan等，2007，上文)。用購自Upstate的以下抗體抗 H3K27me3 (07-449)、抗 H3K9me3 (07-442)、抗 H3K9/K14ac (06-599)、抗 H3K4me3 (07-473)和抗活性β-聯(lián)蛋白(05-665)探測印跡?？笻4K20me3 (ab9053)來自Abeam?？功?聯(lián)蛋白 (6Β3)和抗 Η3(3Η1)來自 Cell Signaling 并且抗 DVL2 (sc-8026)來自 Santa Cruz。針對 來自人DACT3的14氨基酸肽(LSLESGGLEQESGR，(SEQ ID NO 8)產(chǎn)生抗DACT3的兔多克隆 抗體并經(jīng)親和層析柱純化。1. 6轉(zhuǎn)染和免疫沉淀使用Fugen 6. 0 (Roche)瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞。轉(zhuǎn)染后48小時時，用Iml裂解緩 沖液(20mM Tris-HCl, pH 7. 4,2mM EDTA, 25mM NaF, 1% Triton X-100)加蛋白酶抑制劑 (Roche)在4°C裂解細胞30分鐘。經(jīng)12，OOOg離心30分鐘后，裂解物與抗FLAG M2瓊脂 糖親和凝膠(Sigma)或抗HA親和基質(zhì)(Roche)在4°C免疫沉淀過夜。用洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl, pH8. 0，150mM NaCl, 1% Nonidet P-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，和 0. 1% SDS)洗滌沉 淀物三次并用含SDS的樣品緩沖液在95°C洗脫免疫復(fù)合物5分鐘并通過SDS-PAGE分 析。用針對HA標(biāo)簽(sc-805，Santa Cruz)或FLAG標(biāo)簽(F1804，Sigma)的一級抗體進行免 疫印跡。1. 7程序性細胞死亡和流式細胞術(shù)分析收集細胞并在70%乙醇中固定。用RNase (100 μ g/mL)處理后用碘化丙錠(50 μ g/ mL)染色固定的細胞。在 FACSCalibur (Becton Dickinson Instrument, San Jose, CA)中 用熒光激活細胞分選(FACS)分析染色細胞的DNA含量。使用CellQuest軟件(Becton Dickinson)定量細胞凋亡亞Gl級分。為了測定線粒體跨膜電勢(MTP)，根據(jù)生產(chǎn)商說明書 (BD Bioscience)用 JC-I 對細胞染色，并使用 CellQuest 軟件(BD Bioscience)測定 JC-I 檢測陽性的細胞。為測定細胞胱天蛋白酶3活性，按說明用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)固定細胞并隨后用異硫氰酸熒光素綴合的兔抗活性胱天蛋白酶3單克隆抗 體(BD Biosciences)染色。通過流式細胞術(shù)進行對胱天蛋白酶3檢測陽性的細胞的定量。1. 8微陣列基因表達分析和半定量RT-PCR使用Trizol (Invitrogen)分離總 RNA 并用 RNeasy Mini Kit (Qiagen)進行純化。 使用RNA Amplification試劑盒(Ambion)進行逆轉(zhuǎn)錄。如描述(Tan等，2007，前述)使 用 Illumina Gene Expression Sentrix BeadChipHumanRef_8_V2 進行微陣列雜交并使 用來自Agilent Technologies的GeneSpring軟件進行數(shù)據(jù)分析。對于RT-PCR，使用寡聚 (dT) 12-18引物用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogene)對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。使用 IOOngcDNA進行PCR并且引物序列如下DACT3 正向5，-CTCCCCAGCGTCGTCTGCTTTA-3，(SEQ ID NO 9)DACT3 反向5，-ATTCGCTCTCCCCGTAACCC-3，(SEQ ID NO 10)DACT2 正向5，-CCTGCACGCCGTGGCTCTAC-3，(SEQ ID NO 11)DACT2 反向5，-CCCTGTTCTCCCTCGCTACCCTT-3，(SEQ ID N0:12)DACTl 正向5，-CAGTCGCCTGGAGGAGAAGT-3，(SEQ ID NO 13)DACTl 反向5，-CTGCTTGTCAAGCTCTTGCA-3，(SEQ ID NO 14)DKKl 正向5，-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3，(SEQ ID NO 15)DKKl 反向5，-TGCATTTGGATAGCTGGTTTAGTG-3，(SEQ ID NO 16)DKK2 正向5，-CGCGTTGATGCGGAGCAAGGAT-3，(SEQ ID NO 17)DKK2 反向5，-TTATTGCAGCGGGTACTGGGGCAG-3，(SEQ ID NO 18)
DKK3 正向5，-AGGAGGCCACCCTCAATGAG-3，(SEQ ID NO: 19)DKK3 反向5，-CAGCTTCTTCTGCCTCCATC-3，(SEQ ID NO 20)SFRPl 正向5，-TCGGCCGCGAGTACGACTA-3，(SEQ ID NO 21)SFRPl 反向5，-TCTTGTAGCCCACGTTGTGG-3，(SEQ ID NO 22)MYC 正向5，-CTGGATTTTTTTCGGGTAGTGG-3，(SEQ ID NO 23)MYC 反向5，-TCGCAGTAGAAATACGGCTG-3，(SEQ ID NO 24)CCNDl 正向5，-ATGGAACACCAGCTCCTGTG-3，(SEQ ID NO 25)CCNDl 反向5，-TTGAAGTAGGACACCGAGGG-3，(SEQ ID NO 26)GAPDH 正向5，-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3，(SEQ ID NO 27)GAPDH 反向5，-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3，(SEQ ID NO 28)肌動蛋白正向5，-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，(SEQID NO 29)肌動蛋白反向5，-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3，(SEQID NO 30)1. 9DNA甲基化分析通過在亞硫酸氫鹽修飾后PCR分析并隨后通過甲基化特異性PCR(MSP)和 亞硫酸氫鹽基因組測序(BGS)測定CpG島DNA甲基化狀態(tài)(Yoshikawa，H.，等，Nat Genet (2001) 28, 29-35)。設(shè)計所有亞硫酸氫鹽基因組測序和甲基化特異性PCR引物靠近轉(zhuǎn) 錄起始位點并位于所研究基因的CpG島中。引物序列如下DACT3-3U 反向5，-AACACCTACTACACACAATACTC-3，(SEQ ID NO 50)
DACT3-4M 正向5，-TTCGTTTGTGTTTGTTTGTTTC-3，(SEQ ID NO 51)
DACT3-4M 反向5，-ACCCGATCTCGAATTTAACA-3，(SEQ ID NO 52)
DACT3-4U 正向5，-ATTTTTGTTTGTGTTTGTTTGTTTT-3，(SEQ ID NO 53)
DACT3-4U 反向5，-TACCCAATCTCAAATTTAACACA-3，(SEQ ID NO 54)
SFRPlM 正向5;-CGCGTTTGGTTTTAGTAAATC-3’ (SEQ IDNO 55)
SFRPlM 反向-CCGAAAATACGACGAACA-3’ (SEQ ID NO56)
SFRPlU 正向5;AGTTGTGTTTGGTTTTAGTAAATT-3’ (SEQID NO 57)
SFRPlU 反向-CTCCCAAAAATACAACAAACA-3， (SEQ IDNO 58)
BGS
DACTIBGS 正向5’ -ATTGGGGGTTATGAAGTYG-3‘ (SEQ IDNO 59)
DACTIBGS 反向5’ -TCCAAAAACTTCTCCTCCAAAC-3‘ (SEQID NO 60)
DACT2BGS 正向5，-TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3，(SEQ ID NO 61)
DACT2BGS 反向5，-CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3，(SEQ ID NO 62)
DACT3BGS 正向5，-AAGAGGGTGGAATTTGTTGTA-3，(SEQ ID NO 63)
DACT3BGS 反向5，-TCACCRTCTCATCTACATAAAC-3，(SEQ ID NO 64)
1.10染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)測定
如前述進行ChIP測定(Zhao等，2005,上文)。使用PRISM 7900Sequence
Detection System (Applied Biosystems)通過實時定量PCR對免疫沉淀的DNA進行定 量。選擇引物對用于擴增所述區(qū)域附近約100-150bp。在ChIP研究中使用如下抗體抗 H3K27me3 (Upstate)、抗 H3K9me3 和抗 H3K9me2 (Abeam)、抗 H3K20me3 (Upstate)、抗 H3K9/ K14ac和抗H3K4me3 (Upstate)。相對于輸入量對在檢查區(qū)域處的這些組蛋白標(biāo)記的富集進 行定量。為了比較來自未處理細胞和處理細胞的兩個DNA材料池，將Δ Ct值針對顯示低背 景富集區(qū)域進行進一步的歸一化。PCR引物的序列如下DACTlC正向1:5，-GTGCAACTGATGCCCCTTAC--3，(SEQIDNO65)
DACTlC反向1:5，-TTGTCCAGCGGTGAACATTC--3，(SEQIDNO66)
DACTlC正向2:5，-GCTTGTCTGCCTGACTTAAG--3，(SEQIDNO67)
DACTlC反向2:5，-TGGCCTGTGTTATGTCACAC--3，(SEQIDNO68)
DACTlC正向3:5，-TGTGCTAGCCACGTTGTAAG--3，(SEQIDNO69)
DACTlC反向3:5，-GCTATGGGAACCTGCTGTTG--3，(SEQIDNO70)
DACTlC正向4:5，-GACGAGAAAGAGCCAATGAG--3，(SEQIDNO71)
DACTlC反向4:5，-CCTTTTCGGGTTTACTGCAC--3，(SEQIDNO72)
DACTlC正向5:5，-CTTGGAGGAGAACATCTTGC--3，(SEQIDNO 73)
DACTlC反向5:5，-TTCGGGCACGACCTACCAAT--3，(SEQIDNO74)
DACTlC正向6:5，-TCGCCTAGTTCTAACGTTCG--3，(SEQIDNO75)
DACTlC反向6:5，-CGGGAGGAGATAAAGTCAAG--3，(SEQIDNO76)
DACTlC正向7:5，-TCTGCCAGCTGTGATTGGTG--3，(SEQIDNO77)
DACTlC反向7:5，-ACTGAGACACTGACAGAAAC--3，(SEQIDNO78)
DACTlC正向8:5，-GAGGCGTTCAAATCTCGATG--3，(SEQIDNO79)
DACT3C 正向 10 :5，-GGAATTAGACTTGGCAGAAC-3，(SEQ ID NO 119)DACT3C 反向 10 :5，-CTTCAGCCTGAGAGACTTTG-3，(SEQ ID NO 120)DACT3C 正向 11 :5，-GTGAGGTCCCAGAGACTATG-3，(SEQ ID NO 121)DACT3C 反向 11 :5，-TGATTACAGCCTGCAGTCAC-3，(SEQ ID NO 122)1. 11免疫熒光染色和共焦顯微術(shù)將細胞接種至4孔或8孔培養(yǎng)室載玻片中。處理或轉(zhuǎn)染72小時后，將細胞用PBS中 3. 7%的多聚甲醛固定并用0.2% Triton-XlOO進行透化。用一級抗體(抗Myc或抗β-聯(lián) 蛋白)和Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546綴合的二級抗體(Invitrogen)每種順序 溫育1小時并在Fluorsave (Merck)封固介質(zhì)中封固。在封固介質(zhì)中稀釋DRAQ5 (Biostats， UK)用于核染色。用Zeiss LSM510共焦顯微鏡檢查染色的細胞。1. 12集落形成測定如之前描述進行集落形成測定來體外評估腫瘤細胞生長(Yoshikawa等，2001，上 文)。使用6孔平板以每孔30 X IO4的密度將DLDl細胞鋪板，并使用Fugen 6 (Roche)根據(jù) 生產(chǎn)商方案用pcDNA4. 0-DACT3或骨架pcDNA4. O (2. O μ g)轉(zhuǎn)染。將細胞以一式三份重新鋪 板并在含Zeocin (100 μ g/ml)的完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天。甲醇固定后用Gentian Violet將存活的集落染色并對可見集落(X50細胞)計數(shù)。1. 13小鼠中的腫瘤植入使用G23針頭將50 μ 1體積中5Χ IO6個HCT-116人結(jié)腸癌細胞皮下植入到小鼠 右側(cè)腹。每周監(jiān)測腫瘤生長兩次。7天后，將動物分配至不同的處理組中，使得在三組的每 一組中獲得91-107mm3的平均腫瘤體積。使用以下公式計算腫瘤體積腫瘤體積(mm3)= (w2X1)/2(W = HCT-116癌的寬度且1 = HCT-116癌的長度，以謹計)。1.14小鼠中使用的藥物由新加坡基因組研究所(Genome Institute Singapore (GIS，vial#ll))提供 DZN印，并溶解于鹽水中。對于DZNep給藥，每只小鼠接受按每千克體重IOml體積適當(dāng)溶于 鹽水的DZN印(0. 5mg/ml的濃度用于5mg/kg劑量等)。使用S * BIO制造的SAHA第8批， 并將其溶于MC/Tween(20mg/ml的濃度用于200mg/kg給藥等)。1. 15治療時間表對于最初MTD研究，將BALB/c裸鼠按每組3只動物隨機分為4組。從第O天開始 以2. 5、5、10和15mg/kg劑量每周3次腹膜內(nèi)施用DZN印。在第五天終止該MTD研究。對于HCT-116研究，將在_7天已接受HCT-116異種移植物的裸鼠按每組7只動 物分為4組，并且在第O天開始進行藥物處理(方案概要見圖1)組1-兩種所用的化合物 的載體對照(清晨每周三次腹膜內(nèi)注射鹽水，下午MC/Tween p.o.q.d.)；組2-SAHA(下午 200mg/kg q. d. p. ο.，且3次/周清晨腹膜內(nèi)注射DZN印載體鹽水)；組3-DZN印(清晨腹膜 內(nèi)注射5mg/kg，加下午SAHA載體MC/Tween p. ο. q. d)組4-DZN印加SAHA (清晨腹膜內(nèi)注 射5mg/kg DZNep,且在下午200mg/kg q. d. p. ο.)。在+14天終止該研究。1. 16功效評估通過腫瘤生長抑制(TGI)方法評估DZN印治療的功效，其中將多個治療組中治療 實現(xiàn)的腫瘤體積的下降與載體組比較。使用以下公式計算腫瘤生長抑制% TGI = (VCon 第 χ 天-VTr 第 χ 天)/ (VCon 第 χ 天-VCon 第 0 天)X 100
(% TGI =腫瘤生長抑制百分比，VCon·^ =在第χ天時對照/載體組的腫瘤體積 中值或平均值，=在第X天時治療組中腫瘤體積的中值或平均值，VConlc^ =在第 O天=研究起始時對照/載體組中的腫瘤體積中值或平均值)。1.17 毒性每天對動物稱重，并經(jīng)常檢查任何不利的、藥物相關(guān)的副作用的臨床病征，包括活 性(無活性/過活性)、皮膚水化/脫水作用、當(dāng)置于體重秤上時的姿勢(例如弓背)、步 態(tài)、抽搐、體溫(例如觸摸冷感)和發(fā)聲。NCI將小鼠中癌癥藥物的可接受毒性定義為在試 驗過程中平均組體重下降少于20%，并且在十只處理動物中不多于一只因毒性死亡。如果 在組中發(fā)現(xiàn)超過1只動物治療相關(guān)死亡(TRD)或者當(dāng)治療組的體重下降至低于第0天體重 的80 %時，停止對該組的治療。1.18體內(nèi)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計使用單向ANOVA (方差分析)及Durmett’ s post檢驗來確定腫瘤體積中值的統(tǒng)計 學(xué)顯著性。將ρ值< 0.05用*號表示。使用軟件GraphPad Prism(第4版)用于所有統(tǒng) 計學(xué)分析和圖形表示。2.結(jié)果2. 1結(jié)腸直腸癌中DACT3的表達獨立于啟動子甲基化被抑制如上提及，研究Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、及其病理性變更和其中的介入的 近乎理想的模型是結(jié)腸直腸癌。本領(lǐng)域技術(shù)人員因此將理解用該模型所獲的結(jié)果可以容易 地轉(zhuǎn)移至與異常Wnt/β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的任何其它病癥中。因此，本實施例基于該 模型。為了表征結(jié)腸直腸癌中Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的外遺傳效應(yīng)物，發(fā)明人最初關(guān) 注14種代表性Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑上，包括SFRP、WIF1、DKK和DACT基因家族成員，其中一 些之前已顯示出在多種人癌癥中轉(zhuǎn)錄失活或抑制(He等；2005，上文；Aguilera等，2006，前 述；He 等，2005，上文；Suzuki 等，2002，上文；Suzuki 等，2004，上文)。他們使用 Illumina Human Ref-8_V2 Sentrix BeadChip (參考圖3A)確定在24種人結(jié)腸直腸腫瘤相對于與 之匹配的正常粘膜中的基因表達。發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，SFRP家族成員的表達在幾乎所 有人結(jié)腸直腸腫瘤樣品中都顯著下降(P < 0.001)，該發(fā)現(xiàn)與之前的報道相一致(Suzuki 等，2004，上文)。相反，盡管之前報道在建立的結(jié)腸直腸癌細胞系中的WIF-I和DKKl沉默 (Aguilera等，2006，上文；He等，2005，上文)，但在腫瘤樣品中WIF-I和DKKl的表達并未 與對照顯著不同。有趣的是，在所有24個腫瘤樣品中DACT3的表達下降(p<0.001)，而 在腫瘤和對照組織中DACTl和DACT2的表達水平并未出現(xiàn)顯著差異(分別為ρ = 0. 24和 P = 0. 64)。與導(dǎo)致增強的基線Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號激活的Wnt抑制劑的表達下降相一致， 與對照組織相比，這些腫瘤展現(xiàn)出包括MYC (He，Τ. C.，等，Science (1998) 281，1509-1512)、 細胞周期蛋白 Dl 基因 CCNDl (Tetsu，0.，和 McCormick，F(xiàn).，Nature (1999) 398，422-426)、 LEFl (淋巴樣增強子結(jié)合因子 1 ；cf. Filali, M.，等，J Biol Chem(2002) 277，33398-33410) 和 CD44(Wielenga，V. J.，等，Am JPathol (1999) 154，515-523)在內(nèi)的確定的 β-聯(lián)蛋白 / TCF靶基因增強的表達。8對隨機選擇的患者樣品的RT-PCR分析證實了與對照相比在結(jié)腸 直腸癌中SFRPl和DACT3而非DACTl的抑制(圖3Β)。值得注意的是，還在8份腫瘤樣品中 的3份中觀察到了 DACT2表達的下降。因此，除了之前鑒定到的諸如SFRPs的Wnt抑制劑表達的下降，還發(fā)現(xiàn)了 DACT3表達在結(jié)腸直腸癌中相應(yīng)地下降。因此，發(fā)現(xiàn)了至少在一些結(jié) 腸直腸腫瘤中DACT2表達也下降的證據(jù)。已顯示SFRPs在癌細胞中通過啟動子甲基化轉(zhuǎn)錄失活(Suzuki等，2004，上文)。 為了測定DACT3啟動子的甲基化狀態(tài)，本發(fā)明人在8份結(jié)腸直腸癌樣品中在經(jīng)5’ -RACE測 定的轉(zhuǎn)錄起始位點附近進行了甲基化特異性PCR(MSP)分析(圖2)。DACT3啟動子包含CpG 島(圖3C)。覆蓋整個CpG島的MSP分析顯示在結(jié)腸直腸腫瘤樣品中的DACT3啟動子處缺 少DNA甲基化(圖3C)。作為陽性對照，使用相同技術(shù)證實了在這些相同腫瘤樣品中SFRPl 的啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化(圖3C)。該發(fā)現(xiàn)揭示了盡管在結(jié)腸直腸癌中DACT3表達下降，但 它的發(fā)生獨立于這些細胞中之前與基因沉默相關(guān)聯(lián)的DNA甲基化。為了確定在結(jié)腸直腸癌細胞系中如上觀察是否重演，本發(fā)明人在7種此類株系中 進行了 DACT和SFRPl基因的RT-PCR分析(圖3D)。與始終在結(jié)腸癌中沉默的SFRPl不同， DACT3顯示出在不同的細胞系中變化的基礎(chǔ)表達水平。值得注意的是，其它兩個DACT家族 成員DACTl和DACT2的表達在這些細胞系中的幾種細胞系中幾乎喪失，而這在上文檢測的 原發(fā)性腫瘤組織中未觀察到。因此，檢測了在這些結(jié)腸直腸癌細胞系中所有三種DACT基因 的甲基化狀態(tài)。如同在原發(fā)腫瘤樣品中，在所有檢測的細胞系中DACT3啟動子未發(fā)生甲基 化，而發(fā)現(xiàn)DACTl和DACT2啟動子分別發(fā)生了部分和完全甲基化(圖3E)。在RKO和HT29 癌細胞系中的亞硫酸氫鹽基因組測序確證了該MSP分析的結(jié)果，顯示分別在DACTl和DACT2 啟動子中部分和幾乎完全的甲基化CpGs，但在DACT3啟動子中幾乎沒有甲基化的胞嘧啶 (圖 3F)。使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2，脫氧胞苷(5-AzaC)在HCT116結(jié)腸直 腸癌細胞系中在藥理學(xué)上干擾啟動子甲基化。5-AzaC處理降低了 DACTl和DACT2啟動子 的甲基化(圖3G)，導(dǎo)致了 SFRPU DACTl和DACT2而非DACT3的表達增加(圖3H)。類似 地，其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因DNMTl和DNMT3B被遺傳破壞的HCT116細胞系(Rhee，I.，等 Nature (2002) 416，552-556)顯示出DACT1、DACT2和SFRPl的下降的啟動子甲基化(圖3G ； DK0)和增加的表達，但DACT3未出現(xiàn)明顯變化(圖IG和H)。在DLDl細胞中也獲得了類似 結(jié)果(圖3H)。這些結(jié)果支持了在結(jié)腸直腸癌細胞中，與SFRPl和DACTl和DACT2基因不 同，啟動子甲基化不促進DACT3的外遺傳抑制的結(jié)論。此外，發(fā)現(xiàn)在患者腫瘤樣品中DACTl 啟動子未發(fā)生甲基化且僅在具有DACT2表達下降的幾個腫瘤樣品中檢測到了 DACT2啟動子 甲基化(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，所檢測的在臨床腫瘤樣品中DACT1/2甲基化的缺乏可以解釋 為何通常在這些腫瘤中它們沒有被下調(diào)。 2. 2DACT3的外遺傳抑制與二價組蛋白修飾相關(guān) 使用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)確定染色質(zhì)狀態(tài)是否與DACT3抑制相關(guān)。將該測定 與定量PCR結(jié)合來表征潛在相關(guān)的染色質(zhì)標(biāo)記。設(shè)計覆蓋三個DACT基因的每一個的轉(zhuǎn)錄 起始位點附近> 7kb區(qū)域的一組8-10個引物對。檢測到存在組蛋白標(biāo)記，包括存在抑制 性標(biāo)記(例如參考 Szyf，2009，上文)H3K27me3、H3K9me3、H3K9me2 和 H4K20me3，以及激活 標(biāo)記H3K4me3 (如上)和H3K9/14ac (圖4A)。在HT29細胞中DACT3的轉(zhuǎn)錄起始位點下游 500bp處檢測到抑制性H3K27me3的大量富集和較少程度的抑制性的H4K20me3。此外，還在 DACT3更上游的啟動子區(qū)域檢測到更弱的H3K27me3。該發(fā)現(xiàn)與最近幾個基因組范圍的研究 是一致的，這些研究顯示出在癌和胚胎干細胞中的轉(zhuǎn)錄起始位點的近下游區(qū)域均檢測到大
53量的H3K27me3(Pan，G.，等，Cell Stem Cell (2007) 1，299 ;Yu，J.，等，Cancer Res (2007) 67, 10657-10663 ;Zhao，Y.，等，Proc Natl Acad Sci USA (2005) 102，16090-16095)。相反，在 HT29細胞中DACT3啟動子區(qū)未檢測到抑制性H3K9甲基化標(biāo)記。在HT29細胞中DACT3轉(zhuǎn)錄起始位點附近還檢測到了高水平的激活標(biāo)記H3K4me3， 揭示了在這些細胞中DACT3啟動子同時受抑制性和激活性(二價)組蛋白甲基化事件的 修飾。此類二價組蛋白狀態(tài)之前已與低水平轉(zhuǎn)錄的基因相關(guān)(Azuara，V.，等，Nat Cell Biol (2006)8, 532-538 ；Bernstein, B. Ε·，等，Cell (2006) 125，315-326 ；Mikkelsen, T. S.， 等，Nature (2007) 448，553-560 ；Pan 等，2007，上述；Zhao, X.，等，Cell Stem Cell (2007) 3， 286)。如果這種情況對于DACT3基因也是真實的話，可以預(yù)測抑制性H3K27me3的存在應(yīng) 該與DACT3表達水平負相關(guān)。與該假說一致的是，還在表達低水平DACT3的SW480細胞 中DACT3處檢測到了高水平的H3K27me3 ；在更低程度上在具有中度DACT3表達的RKO細 胞中也檢測到了 H3K27me3(圖4B)。此外，在正常人腸上皮細胞O7Hs 74Iht)和其它兩種 非癌性細胞系乳腺上皮MCFlOA和肺成纖維細胞MRC5中的DACT3處僅檢測到了高水平的 H3K4me3 (而非H3K27me3)(圖4C)，提示了在DACT3處的該二價修飾是癌特異性的。為了進 一步證實在DACT3啟動子表達受到抑制的細胞中DACT3啟動子處于二價組蛋白狀態(tài)，使用 ChIP-Seq Solexa技術(shù)在SW480細胞中進行主要組蛋白標(biāo)記的全基因組作圖。該組蛋白修 飾的高分辨率圖譜清楚地說明H3K27me3和H3K4me3在DACT3處的共修飾(圖7)。在DACTl處還檢測到H3K4me3的富集和較低程度的H3K27me3，但在DACT2基因座 上沒有檢測到包括H3K4me3在內(nèi)的這些組蛋白標(biāo)記的富集峰(圖4A)。通常對于DACT基因 家族，這些結(jié)果提示H3K4me3的水平與DNA甲基化狀態(tài)負相關(guān)在DACTl啟動子(其部分甲 基化)處及在DACT3啟動子(其未甲基化)處而不在DACT2啟動子(其完全甲基化)處檢 測到H3K4me3(參考圖IF和圖2)。該發(fā)現(xiàn)與近期關(guān)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)先與非甲基化的 H3K4結(jié)合(Ooi, S. K.，等，Nature (2007) 448，714-717)及H3K4的甲基化傾向于保護周圍核 苷酸免受甲基化(Weber，M.，等，NatGenet (2007) 39，457-466)的報道是一致的。連同更早 期的數(shù)據(jù)顯示DACT3的表達對于CpG島甲基化不敏感，我們的數(shù)據(jù)如下假說一致與在結(jié)腸 癌細胞中，DACT3主要經(jīng)組蛋白修飾而抑制，并且尤其是在此類細胞中DACT3基因座存在于 同時含有抑制性和激活性組蛋白修飾的二價染色質(zhì)狀態(tài)中。2. 3通過抑制組蛋白甲基化和脫乙?；乃幚韺W(xué)方法對DACT3的強烈去抑制最近已公開了 S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制劑3-Deazan印lanocin A(DZNep) 消耗polycomb抑制性復(fù)合體2的組分并且抑制組蛋白甲基化，包括抑制性H3K27me3和 H4K20me3 (Tan等，2007，上文)。檢測了在結(jié)腸直腸癌細胞中DZN印是否能夠單獨或與組蛋 白脫乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA) ,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AzaC或者兩者組合來恢復(fù) DACT3表達。為了允許最準(zhǔn)確地測定基因表達的變化，使用了 Illumina beadarray.使用該 工具可以在沒有中間核酸擴增步驟的情況下準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)錄水平。觀察到當(dāng)作為單一試劑使 用時，這些藥物在DLDl細胞中最低程度地誘導(dǎo)了 DACT3表達(圖5A)。然而，DZNep與TSA 的組合處理強烈地誘導(dǎo)了 DACT3表達，而其它組合如DZN印/Aza或TSA/Aza無法實現(xiàn)(圖 5A)。相反，DZN印/TSA組合僅誘導(dǎo)了 DACTl表達的中度增加(圖5B)。另一方面，通過含 5-AzaC的處理僅誘導(dǎo)了 DACT2表達(圖3H和3B)，這與通過更典型的啟動子甲基化的外遺 傳沉默是一致的。
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為了測定DZN印/TSA組合處理對于DACT3去抑制的特異性相對于其它已知的Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑抑制劑表達上的變化，再次使用來自未經(jīng)或經(jīng)DZN印、TSA或其兩者處理的 2個結(jié)腸癌細胞系(DLD1和ΗΤ-29)中的RNA來分析Illumina基因的表達。該分析揭示了 DACT3是DZN印/TSA處理強烈誘導(dǎo)的唯一 Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑抑制劑并且其在兩種結(jié)腸癌 細胞系中均發(fā)生(圖5Β)?？傊覀兊陌l(fā)現(xiàn)顯示出DACT3與其它Wnt途徑抑制劑的不同， 因為其在結(jié)腸癌細胞中的抑制似乎與二價組蛋白修飾而不是DNA甲基化相關(guān)，并且因此可 經(jīng)專門靶向組蛋白修飾的藥理學(xué)方法來將其強烈地去抑制化。為了更好地理解藥物活性化合物DZN印和TSA的組合將DACT3表達再激活的機 制，通過Western印跡在處理和未處理的細胞中檢測組蛋白修飾譜(圖5C)。如之前報道 的，單獨的DZN印處理導(dǎo)致了 H3K27me3和H4K20me3的強烈減少，而對H3K9me3幾乎沒有 影響(Tan等，2007，上文)。盡管組合處理導(dǎo)致H3K9me3 —定的輕度抑制，但與用DZN印或 TSA單獨處理相比，最顯著的協(xié)同變化是H3K9/14乙?；膹娏艺T導(dǎo)(圖5C)。有趣的是，不 考慮單獨DZN印處理時H3K4me3的輕微下降，H3K4me3也受該組合處理誘導(dǎo)。因此，DZNep 與TSA的藥理學(xué)組合導(dǎo)致組蛋白修飾的有趣的總體偏移它降低了某些抑制性組蛋白標(biāo) 記(H3K27me3、H4K20me3和H3K9me3)卻顯著增加了一些激活性組蛋白標(biāo)記(H3K9/14ac和 H3K4me3)。從機制上說，這揭示了這些染色質(zhì)標(biāo)記間存在相互干擾，使得由DZNep對抑制性 組蛋白甲基化的抑制為受TSA誘導(dǎo)的組蛋白乙?；a(chǎn)生了有利的染色質(zhì)環(huán)境。在這些處理 后的細胞中總體組蛋白譜中觀察到效應(yīng)強度進一步揭示了該現(xiàn)象在基因組中是廣泛存在 的。這又導(dǎo)致顯然包括DACT3在內(nèi)的特定靶基因表達的增加。使用ChIP進一步評估在DACT3基因座上對DZN印/TSA組合處理特異應(yīng)答中組蛋 白修飾的變化。與由Western印跡分析發(fā)現(xiàn)的修飾的組蛋白水平的整體變化相一致，用 DZN印/TSA處理的細胞在DACT3基因座上具有減少的H3K27me3和H4K20me3，并且伴隨著 H3K4me3和H3K9/K14ac增加(圖5D)。DACTl基因座處的此類效應(yīng)更微弱，并且因此與該藥 理學(xué)處理分別對DACT3和DACTl基因表達的相對效應(yīng)良好相關(guān)。DACT3基因座上組蛋白甲 基化和乙?；瘶?biāo)記的顯著變化符合并有助于解釋DZN印/TSA處理后DACT3表達水平上同樣 的顯著變化?？傊诟綀D中圖解的上面的生化、藥物學(xué)及表達數(shù)據(jù)都支持了如下模型其中 DACT3表達的抑制是經(jīng)二價組蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生。此外，該抑制作用可通過組合藥理學(xué)方法有 效逆轉(zhuǎn)，該方法同時抑制組蛋白甲基化和脫乙酰化，從而導(dǎo)致在顯然包括DACT3基因座在 內(nèi)的此類二價修飾的基因的亞類中染色體結(jié)構(gòu)的主要變化。2. 4結(jié)腸直腸癌細胞中DACT3的去抑制與Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制和大量 程序性細胞死亡相關(guān)檢測了上述藥物活性化合物單獨和組合對DVL2和β-聯(lián)蛋白水平的影響。由 于DVL2是在所有或大部分細胞類型中均表達的三種功能冗余且保守的DVL家族成員之一 (Hamblet, N. S.，等 Development (2002) 129，5827-5838)，所以任意選擇了它作為 DVL 基因 家族的代表。與在轉(zhuǎn)錄物水平上觀察到的變化相一致，如通過Western印跡分析檢測到的 (圖6A和圖11)，DZNep和TSA組合處理時DACT3蛋白質(zhì)水平顯著提高(在SW480和DlDl 細胞中)。組合處理進一步導(dǎo)致了 DVL2水平的下降。相反，DZNep或TSA的單獨處理不能 引起此類變化(圖6A)。
同時，如Western印跡所示，激活的(非磷酸化的)β _聯(lián)蛋白的水平在DZN印/TSA 處理的細胞中下降(參考圖6Α)。該發(fā)現(xiàn)通過免疫細胞化學(xué)得到驗證，所述免疫細胞化學(xué)顯 示用DZN印/TSA處理后細胞核β-聯(lián)蛋白染色減少(圖6Β)。最后，TCF/β-聯(lián)蛋白靶基因 (包括MYC、LEF、CCNDl和⑶44)的表達在DZN印/TSA處理的細胞中顯著降低，但在單獨用 DZNep或TSA處理的細胞中沒有降低(圖6C和6D)。這些發(fā)現(xiàn)一致地說明DZN印/TSA組合 處理抑制Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，觀察到通過用GSK-3的小分子抑制劑處理細胞 可有效恢復(fù)DZN印/TSA處理后β-聯(lián)蛋白的降低，而DVL2的下調(diào)保持不受影響(圖10)。 這揭示了 DACT3-DVL2通過GSK-3傳遞來調(diào)節(jié)β -聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性。在所有三種癌細胞系中受DZN印/TSA處理表達增加的81種基因中，DACT3受誘 導(dǎo)最強烈(參考圖12)。根據(jù)本發(fā)明人知識，該列表中沒有其它基因(參考圖12)與Wnt/ β _聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)直接相關(guān)。總之，此處所得的結(jié)果支持DZN印/TSA組合處理在結(jié)腸直腸 癌細胞系中通過增加DACT3基因表達和蛋白質(zhì)水平，其次使有效的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的內(nèi) 源DVL蛋白去穩(wěn)定而降低Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相反，它們提示了 DACT3的抑制是結(jié) 腸直腸癌形成中的關(guān)鍵性外遺傳事件。預(yù)期Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制阻斷前存活途徑并在習(xí)慣于該途徑的癌細 胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡(Fujii等，2007，上文；He等，2005，上文)。實際上，如通過碘化 丙錠(PI)和熒光激活細胞分選(FACS)評估(圖6Ε)，發(fā)現(xiàn)DZN印/TSA對Wnt/β -聯(lián)蛋白信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制伴隨著DLDl和ΗΤ29細胞中細胞死亡的強烈協(xié)同誘導(dǎo)(圖6Ε)。使用其它結(jié) 腸癌細胞系獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，用DZN印/Aza處理的細胞(所述處理 不有效去抑制DACT3表達)不經(jīng)歷相當(dāng)水平的細胞死亡。類似地，向DZN印/Aza組合中加入 5-AzaC(其不產(chǎn)生DACT3基因表達的進一步增加)也不產(chǎn)生細胞死亡的額外增加。這揭示 了 5-AzaC對DNA甲基化的調(diào)節(jié)和對其它潛在靶基因的所得影響并不促進對Wnt/ β -聯(lián)蛋 白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的進一步影響，并且DZN印/TSA單獨對DACT3的誘導(dǎo)與最大細胞死亡相關(guān)。進 一步確定DZN印/TSA誘導(dǎo)的細胞死亡是程序性細胞死亡。如圖6F所示，DZN印/TSA組合處 理，而不是僅單個這些藥物活性劑的處理導(dǎo)致ΗΤ29細胞中胱天蛋白酶3的顯著激活(參考 圖6F)。此外，組合處理誘導(dǎo)線粒體跨膜電位(MTP) (Δ Vm)的急劇下降，表明特征為程序性 細胞死亡的線粒體功能異常(參考圖6G)。也在組合DZN印與其它HDAC抑制劑(如PXDlOl和辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)) 的處理中見到DZN印/TSA處理對組蛋白修飾、DACT3基因表達、激活的β -聯(lián)蛋白水平和程 序性細胞死亡的特定影響(見圖13)。這表示已經(jīng)定義的該藥理學(xué)策略的效果取決于DZN印 與HDAC抑制劑的組合作用，并且不是與DZNep組合施用的TSA的特殊結(jié)果。2. 5DACT3作為Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子的功能驗證為了評估是否需要DACT3轉(zhuǎn)錄去抑制以在處理的結(jié)腸直腸癌細胞中降低Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從穩(wěn)定表達短發(fā)夾RNA靶向DACT3的DLDl產(chǎn)生細胞系。與對照shRNA 細胞相比，在DZN印/TSA處理后，表達DACT3shRNA的兩個DLDl克隆中DACT3mRNA的水平極 大地降低(圖8A)。Western印跡分析表明對DVL2和未磷酸化的β -聯(lián)蛋白水平的DZ^p/ TSA誘導(dǎo)的影響在DACT3shRNA細胞中降低(圖8A)。此外，當(dāng)測定程序性細胞死亡時， DZN印/TSA對程序性細胞死亡的誘導(dǎo)在表達DACT3shRNA的細胞系中顯著下降(圖8B)。這 些DACT3擊倒效果不大可能是由siRNA的脫靶效果引起，因為這些效果也在瞬時轉(zhuǎn)染兩個其它獨立DACT3siRNA的SW480細胞中觀察到了(圖8C)。相反，DACTl的擊倒(其在DZ^p/ TSA處理后僅顯示輕微的增加)對程序性細胞死亡沒有抑制效應(yīng)(圖8D)?？傊?，這些結(jié)果 說明DACT3的轉(zhuǎn)錄去抑制促進對Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制和DZNep/TSA處理結(jié)腸直 腸癌細胞后的程序性細胞死亡。還直接檢測了 DACT3在調(diào)節(jié)Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能。先前已經(jīng)顯示多 個物種中DACT家族成員與DVL蛋白通過高度保守的C末端基序相互作用并負調(diào)節(jié)β -聯(lián) 蛋白的功能(Cheyette 等，2002，上文；Zhang，L.，等，J Biol Chem(2006) 281，8607-8612)。 為了證實DACT3也與DVL蛋白相互作用，通過用Flag-標(biāo)記的DACT3和HA-標(biāo)記的Dvl2的 表達載體轉(zhuǎn)染SW480細胞進行免疫共沉淀實驗。在使用任一標(biāo)簽抗體的這些條件下，Dvl2 與DACT3有效地免疫沉淀，并且反過來DACT3與Dvl2有效地免疫沉淀(圖9A)。此外，與共 轉(zhuǎn)染了空載體的Dvl2-HA表達細胞相比，Dvl2-HA與DACT3_Flag的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致Dvl2_HA蛋 白表達顯著下降(圖9B)。這些結(jié)果證明，如從與其它DACT家族成員的同源性預(yù)測，如通過 Dvl2示例，DACT3確實可與DVL家族成員相互作用。它們還顯示該相互作用可至少在這些 共轉(zhuǎn)染條件下降低DVL蛋白的穩(wěn)定性。使用共焦免疫化學(xué)類似地研究SW480細胞中異位DACT3表達對β -聯(lián)蛋白水平 的影響。表達Myc-標(biāo)記的DACT3或DACTl的SW480細胞具有幾乎檢測不到水平的細胞核 β -聯(lián)蛋白，而未轉(zhuǎn)染細胞或轉(zhuǎn)染了非相關(guān)基因產(chǎn)物Myc-標(biāo)記RPS27L的細胞保持高水平的 細胞核β _聯(lián)蛋白(圖9C)。此外，異位表達DACT3的SW480細胞顯示程序性細胞死亡典型 的濃縮細胞核。這些結(jié)果證實像其它Dact家族成員一樣(Cheyette等，2002，上文；Hikasa， H.，& Sokol, S. Y. Development (2004) 131,4725-4734 ;Zhang 等，2006，上文)，異位表達的 DACT3可負調(diào)節(jié)Wnt/ β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括在結(jié)腸直腸癌細胞中。為了測定DACT3是否由于致癌Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制而抑制了細胞生 長，用轉(zhuǎn)染了 DACT3表達質(zhì)?；?qū)φ湛蛰d體的DLDl細胞進行集落形成測定。轉(zhuǎn)染了 DACT3 的細胞與對照細胞相比在集落數(shù)目上顯示顯著下降(圖9D)。該結(jié)果進一步證實了 DACT3 在結(jié)腸癌中作為潛在的腫瘤抑制劑起作用。2. 6初始最大耐受劑量的DZN印毒性(體內(nèi)MTD研究)該研究的目標(biāo)是(i)在BALB/c裸鼠中評估每周三次給予的3-Deazan印lanocin A(DZNep)的最大耐受劑量(MTD)，并(ii)在HCT-116人結(jié)腸癌異種移植物模型中評估 DZNep與HDAC抑制劑SAHA組合的功效。在HCT-116細胞接種用于功效研究時，在第0、2和4天用2. 5、5、10和15mg/kg DZN印腹膜內(nèi)注射3只小鼠/組以收集原始MTD數(shù)據(jù)。體重減輕非常有限，并在10mg/kg組 觀察到最多的體重減輕(在第2天2. 2%，原始數(shù)據(jù)未顯示)。在第3天15mg/kg組中三只 小鼠中的兩只在沒有顯著的體重減輕的情況下死亡(原始數(shù)據(jù)未顯示)。因此在該方案中 DZNep的MTD是10mg/kg。對于使用DZN印作為致敏劑的以下組合研究，我們決定以充分低 于MTD的劑量(即5mg/kg)施用DZN印。如使用圖15中描述的方案進行研究。使用攜帶HCT-116腫瘤的四組BALB/c裸 鼠開始組合研究(η = 7只小鼠/組，接種后6天的初始平均腫瘤體積91-107mm3)。我們 進行完全載體對照的該研究，其中一組小鼠作為兩種所用化合物(每周上午鹽水腹膜內(nèi)注 射3次，下午q. d. p. ο. MC/Tween)的對照，第二組接受SAHA (下午q. d. p. ο. 200mg/kg)加上
57DZN印載體(每周上午鹽水腹膜內(nèi)注射3次)，第三組用DZN印處理(上午腹膜內(nèi)注射5mg/ kg)加SAHA載體(下午MC/Tweenq. d. p. ο.)，最后一組用DZN印加SAHA處理(上午腹膜內(nèi) 注射 5mg/kg DZN印，加下午 200mg/kg q. d. p. ο.)。圖16顯示在14天內(nèi)載體組中體重穩(wěn)定增加至106. 8%時，單獨的DZN印和SAHA 處理誘導(dǎo)了非常適度的體重減輕(分別為94. 5%和96. 8% )。組合治療組在第14天顯示 為顯著，但仍然可容許的體重減輕至87. 9%。由于第4天的管飼法錯誤失去了 SAHA組中的 一只動物，并且SAHA組中的第二只小鼠在體重為82%的時候也死亡(視為TRD)。然而在 該實驗中BALB/c裸鼠很好地耐受每周三次5mg/kg DZN印加200mg/kg SAHA q. d.的組合。2. 7HCT-116模型中DZN印與SAHA組合的功效如圖14B所示，在14天里載體對照組中所有的腫瘤生長穩(wěn)定，并且在處理后第14 天的平均腫瘤體積是395. 4mm3。在圖17中以圖示了 MTV腫瘤分布數(shù)據(jù)，并在圖18中顯示 了第3、7、10和14天的所有TGI數(shù)據(jù)。沒有顯示個體腫瘤測徑器測定結(jié)果和體重(原始數(shù) 據(jù))。在治療14天后，SAHA組具有55%的腫瘤生長抑制(TGI)(不顯著)，而DZN印治 療的動物完全沒有顯示TGI。DZNep加SAHA的組合治療誘導(dǎo)83%的顯著TGI (145. Imm3的 平均腫瘤體積，P < 0. 05AN0VA/Dunnett' s)。3.討論本發(fā)明基于在人結(jié)腸直腸癌中促進Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組成型激活的外遺 傳事件的發(fā)現(xiàn)。此處顯示DACT3基因的轉(zhuǎn)錄抑制在結(jié)腸直腸癌細胞系和患者來源的腫瘤中 頻繁地發(fā)生。給出了數(shù)據(jù)，其揭示DACT3與SFRP —起可能是在該疾病過程中Wnt/ β -聯(lián)蛋 白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵性外遺傳調(diào)節(jié)物。DACT3因此是旨在控制異常Wnt/β-聯(lián)蛋白信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌癥療法的潛在重要靶標(biāo)。上文說明的技術(shù)可容易地用于本發(fā)明的方法和用途中。不像SFRP基因(其表達經(jīng)常被啟動子DNA甲基化完全沉默)，DACT3在結(jié)腸癌細胞 系中以低水平表達。本發(fā)明顯示該外遺傳事件通過二價組蛋白修飾發(fā)生，所述二價組蛋白 修飾在DACT3基因座含有抑制性(H3K27me3)和激活性的(H3K4me3)組蛋白標(biāo)記并且不涉 及或需要啟動子DNA的甲基化。由于該外遺傳調(diào)節(jié)，可通過靶向組蛋白修飾的藥學(xué)治療強 烈誘導(dǎo)DACT3的水平尤其是，同時干擾組蛋白甲基化和脫乙?；慕M合治療。相比，該治 療不重新活化主要由DNA甲基化沉默的基因，如SFRPl或DACT2，并且僅適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)DACT， 在結(jié)腸癌細胞中其抑制與DNA甲基化和組蛋白修飾相關(guān)聯(lián)。該數(shù)據(jù)說明DZNep和組蛋白脫 乙酰酶抑制劑如TSA的組合施用優(yōu)先再活化主要被最小DNA甲基化引起的二價組蛋白修飾 抑制的基因。先前已經(jīng)在胚胎干細胞(ES)和一些分化細胞中描述了二價染色質(zhì)，其中它們 一般與低水平表達的基因相關(guān)(Azuara等，2006，上文；Bar ski，Α.，等，Cell (2007) 129， 823-837 ；Bernstein 等，2006，上文；Mikkelsen 等，2007，上文；Pan 等，2007，上文；Zhao 等， 2007，上文)。在ES細胞中具有二價組蛋白標(biāo)記的一些腫瘤抑制基因在腫瘤生成過程中丟 失H3K4me3標(biāo)記，相反通過DNA甲基化變得完全沉默(Ohm, J. Ε.，等，Nat Genet (2007) 39， 237-242 ；Schlesinger, Y.，等，Nat Genet (2007) 39，232-236 ；Widschwendter, Μ.，等，Nat Genet (2007) 39，157-158)。本發(fā)明人獲得的數(shù)據(jù)提示在癌細胞中發(fā)生的二價染色質(zhì)狀態(tài)還 可能促進癌性轉(zhuǎn)化。重要的是，因為在正常腸上皮細胞中DACT3基因座處沒有觀察到此類修飾，在DACT3基因座處的這種外遺傳修飾顯然是癌特異性的。在癌細胞中該二價染色質(zhì) 狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的基因(如DACT3)因此代表了獨特的治療靶標(biāo)。不像被DNA甲基化沉默的腫 瘤抑制劑，可通過如用DZN印和組蛋白脫乙酰酶抑制劑(其靶向組蛋白甲基化和脫乙?；? 處理特別操作攜帶二價染色質(zhì)的基因(如DACT3)。因為它們很可能對僅靶向DNA甲基化的 療法(如Aza)不敏感，所以鑒定這些備選調(diào)節(jié)的腫瘤抑制基因也是重要的。盡管目前是推測的，但在本發(fā)明上下文中結(jié)腸直腸癌細胞中DACT3基因座上觀察 到的染色質(zhì)模式是干細胞樣癌細胞的分子特征的一部分。有證據(jù)表明Wnt/β-聯(lián)蛋白信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)在維持上皮干細胞和早期祖細胞中起重要作用，并且其參與產(chǎn)生iPS細胞(見上文)。 在一些實施方案中靶向尤其是結(jié)腸直腸癌細胞的外遺傳特征并能夠消除Wnt/β-聯(lián)蛋白 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明的組合藥理學(xué)方法可能具有靶向癌干細胞的潛力，所述癌干細胞依賴于 這種基因沉默機制并需要高水平的Wnt/β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性用于其自我更新和存活。所獲得的結(jié)果說明參與癌細胞中的基因抑制的外遺傳機制的多樣性和復(fù)雜性。 DZNep作為組蛋白甲基化抑制劑與其它染色質(zhì)重塑化合物的組合中的用途使得其可能發(fā)現(xiàn) 通過多種外遺傳機制調(diào)節(jié)的其它癌基因。DZNep和HDAC抑制劑如TSA對總的組蛋白修飾 模式的組合效果是引人感興趣的，因為這種藥物組合看起來通過同時減少抑制性組蛋白標(biāo) 記(H3K27me3)和增加激活標(biāo)記(H3K4me3和H3K9/14ac)將抑制性的染色質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)換成激 活狀態(tài)。該藥理學(xué)介入與DNA甲基化抑制劑一起因此可能具有將在一些癌細胞中發(fā)現(xiàn)的總 的“惡性”染色質(zhì)狀態(tài)還原到更正?！傲夹浴比旧|(zhì)狀態(tài)的潛力。盡管在生物化學(xué)上仍然需 要確定用DZNep和組蛋白脫乙酰酶抑制劑處理怎樣在組蛋白乙?；挟a(chǎn)生這種強烈的協(xié) 同作用，但是這很可能反映了這兩種類型組蛋白修飾之間的直接相互干擾。給出的數(shù)據(jù)還 揭示了基因組中組蛋白修飾模式的此類藥理學(xué)外遺傳“重新編程”可導(dǎo)致基因表達的極大 改變，同時影響多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。實際上，我們的微陣列數(shù)據(jù)顯示DACT3不是以該方式調(diào) 節(jié)的唯一基因；至少81種其它基因的表達顯著受DZN印和組蛋白脫乙酰酶抑制劑組合處理 的影響。Wnt/β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制可能與其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同作用導(dǎo)致產(chǎn)生在該組合 處理時觀察到的最大細胞凋亡應(yīng)答。本發(fā)明表明通過藥理學(xué)去抑制或通過異位表達在結(jié)腸直腸癌細胞中提高DACT3 蛋白的水平導(dǎo)致DVL2的強烈降解和激活的聯(lián)蛋白的減少。該DACT3-DVL2信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)相互作用可能通過GSK-3傳送以調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定性。GSK-3的小分子抑制劑可 恢復(fù)由DZN印和組蛋白脫乙酰酶抑制劑處理引起的激活β-聯(lián)蛋白的減少這一發(fā)現(xiàn)支 持了該想法。如此處報道，本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由增加的DACT3引起的激活的β-聯(lián) 蛋白的降低甚至在APC突變存在下發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)與揭示在攜帶APC突變的結(jié)腸直腸癌 細胞中仍然發(fā)生失調(diào)的β-聯(lián)蛋白磷酸化和降解的許多報道一致(CalViell0，G.，等， Carcinogenesis (2007) 28，1202-1209 ；Rice, P. L.，等，Mol Cancer Ther (2003) 2,885-892 ； Suzuki 等，2004，上文；Yang，J.，等，J Biol Chem(2006) 281，17751-17757)。特別是，已經(jīng) 顯示SFRP1/2的恢復(fù)表達可在攜帶這些下游突變的結(jié)腸直腸癌細胞中有效降解β _聯(lián)蛋白 (Calviello等，2007，上文；Rice等，2003，上文；Suzuki等，2004，上文)。這些發(fā)現(xiàn)與前面 的研究一起提示存在備選的分子機制，其在結(jié)腸直腸癌細胞中獨立于APC促進β-聯(lián)蛋白 調(diào)節(jié)。本發(fā)明上下文中獲得的數(shù)據(jù)也揭示多個異常外遺傳事件可能促進結(jié)腸癌中Wnt/
59聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常激活。這些多個事件可能在相同細胞中發(fā)生，或它們可在腫 瘤內(nèi)不同細胞中存在。通過增加腫瘤細胞群體中的異質(zhì)性，外遺傳事件可促進癌進展，并還 促進治療抗性和癌復(fù)發(fā)。簡而言之，該公開內(nèi)容的數(shù)據(jù)表明DACT3的外遺傳抑制在結(jié)腸直腸癌細胞中導(dǎo)致 異常的Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的數(shù)據(jù)代表了理解以前未知的外遺傳事件怎樣促進 結(jié)腸直腸癌中Wnt/β-聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的重要進展。該工作還提供了重要的理論證 據(jù)，即藥理學(xué)策略可特異性靶向此類外遺傳事件以對Wnt/β -聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生強烈影 響，導(dǎo)致癌根除的重要結(jié)果。體內(nèi)研究中獲得的結(jié)果表明，當(dāng)以低的良好耐受劑量給予DZN印時，S-腺苷高半 胱氨酸水解酶抑制劑DZN印和SAHA可有效抵抗實體瘤。83%的TGI數(shù)據(jù)是顯著的，而單獨 用DZN印處理根本無效(0%TGI)。因為單獨的SAHA在幾個前述實驗中具有約50%的TGI， 可斷定在DZNep和SAHA的效應(yīng)之間存在協(xié)同作用。4.所用簡寫的列表
簡寫描述
b. i. d.每天兩次
BRC生物資源中心，Biopolis
Bff體重
CR完全消退
DZN印3-Deazaneplanocin A
HDAC組蛋白脫乙酰酶
IACUC機構(gòu)動物管理和使用委員會
i. p.腹膜內(nèi)
LTTFS長期無腫瘤存活者
MC/Tween0. 5% 甲基纖維素 +0. 1% Tween 80
MTD最大耐受劑量
MTV中值腫瘤體積
NTRD非處理相關(guān)的死亡
ρ. 0.經(jīng)口，口服
PR部分消退
q. d.每天一次
SAHA辛二酰苯胺異羥肟酸
TGI腫瘤生長抑制
TRD處理相關(guān)的死亡
TSA曲古抑菌素A
此處已經(jīng)廣泛并一般性地描述了本發(fā)明。落入該
種類和亞類也構(gòu)成部分本發(fā)明。這包括本發(fā)明的一般性描述，條件是或負面限定是從該屬 中去除任何主題，不管所去除的材料是否是此處明確引用的。其它實施方案在以下權(quán)利要 求內(nèi)。此外，在以馬庫什組描述了本發(fā)明的特征或方面的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本發(fā)明也按照馬庫什組的任何個體成員或亞組成員描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解本發(fā)明很好地適合進行目標(biāo)并獲得所提及的目的 和優(yōu)勢，以及其中固有的那些。此外，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可在不背離本發(fā)明范 圍和精神的情況下對此處公開的發(fā)明進行不同的替換和修飾。此處描述的組合物、方法、步 驟、處理、分子和特定化合物目前代表優(yōu)選的實施方案，其為示例性的并且不旨在限制本發(fā) 明范圍。本發(fā)明精神內(nèi)包含的本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的改變和其它用途由權(quán)利要求的范圍定 義。該說明書中先前出版文件的列表或討論不應(yīng)必然被認為承認所述文件是本領(lǐng)域現(xiàn)狀的 一部分或普遍的一般知識?？稍跊]有此處明確公開的任何要素、限制情況下適當(dāng)?shù)貙嵺`此處闡明性描述的本 發(fā)明。因此，例如術(shù)語“包含”、“含有”等應(yīng)廣義地閱讀并且沒有限定。詞語“包含”或變形 如“含有”因此理解為暗示包含所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。此外， 此處所用的術(shù)語和表述已經(jīng)用作說明書的術(shù)語，并且不是限制，并且在此類術(shù)語和表述的 使用中不意在排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但認識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)可 進行多種修飾。因此，應(yīng)理解盡管已經(jīng)通過示例性實施方案和任選特征詳細公開了本發(fā)明， 但本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到此處公開的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修飾和變型，并且認為此類修飾 和變型在本發(fā)明范圍內(nèi)。
6權(quán)利要求
防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)細胞中腫瘤發(fā)生的方法，所述方法包括增加DACT(“dapper、β 聯(lián)蛋白的拮抗劑、同源物”)蛋白或其功能片段的量和活性中的至少一種。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是體細胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細胞是直腸細胞或結(jié)腸細胞。
4.權(quán)利要求1-3任何一項的方法，其中所述腫瘤發(fā)生是癌發(fā)生。
5.在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡的方法，所述方法包括在細胞中增加DACT蛋白 或其功能片段的量和活性中的至少一種。
6.權(quán)利要求5的方法，其還包括測定腫瘤細胞中程序性細胞死亡。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述腫瘤是癌和潰瘍性結(jié)腸炎中的一種。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述癌是結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、食管癌、肺癌、卵巢癌、肝細 胞癌和子宮內(nèi)膜癌中的一種。
9.權(quán)利要求1-8任何一項的方法，其中所述細胞從宿主生物中獲得，或包含在宿主生 物中。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主生物是微生物、魚、兩棲動物、鳥和哺乳動物中的一種。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、奶牛、山羊、綿羊、豬、狗、 豚鼠、黑猩猩和人。
12.權(quán)利要求1-11任何一項的方法，其中培養(yǎng)所述細胞。
13.權(quán)利要求1-12任何一項的方法，其中所述方法包含在增殖疾病或病癥的治療或預(yù) 防中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中待治療的所述增殖疾病或病癥是癌。
15.權(quán)利要求1到14任何一項的方法，其包括施用增加DACT蛋白或其功能片段的表達 和/或活性的化合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述化合物是肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸分子、無機化合物 和低分子量有機分子中的一種。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸分子是DNA和RNA中的一種。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述核酸分子包含編碼DACT蛋白或其功能片段的 序列。
19.權(quán)利要求1-18任何一項的方法，其中在細胞中增加DACT蛋白或其功能片段的量包 括增加DACT蛋白或其功能片段的表達。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法是外遺傳方法。
21.權(quán)利要求20的方法，其包括實現(xiàn)或防止翻譯后組蛋白修飾模式的改變。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述翻譯后組蛋白修飾是組蛋白甲基化和組蛋白乙?；?中的一種。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中在DACT蛋白的基因座處實現(xiàn)翻譯后組蛋白修飾模 式的改變。
24.權(quán)利要求21-23任何一項的方法，其中實現(xiàn)翻譯后組蛋白修飾模式的改變包括實 現(xiàn)(i)在氨基酸位置上去除轉(zhuǎn)錄抑制性翻譯后組蛋白修飾和(ii)在氨基酸位置上附著轉(zhuǎn) 錄激活翻譯后組蛋白修飾中的至少一種。2
25.權(quán)利要求21-24任何一項的方法，其中防止翻譯后組蛋白修飾模式的改變包括抑 制(i)在氨基酸位置上附著轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾和(ii)在氨基酸位置上去除轉(zhuǎn)錄 激活翻譯后組蛋白修飾中的至少一種。
26.權(quán)利要求21-24任何一項的方法，其包括實現(xiàn)在去除轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾 和附著轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾的組合。
27.權(quán)利要求24-26任何一項的方法，其中所述激活翻譯后組蛋白修飾是在組蛋白3上 賴氨酸4的甲基化、組蛋白3上賴氨酸9的乙?；徒M蛋白3上賴氨酸14的乙?；械囊?種，并且其中所述轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾是組蛋白3上賴氨酸9的甲基化、組蛋白3上 賴氨酸27的甲基化和組蛋白4上賴氨酸20的甲基化中的一種。
28.權(quán)利要求1-27任何一項的方法，其中增加DACT蛋白或其功能片段的量和活性中的 至少一種還包括增加蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白的磷酸化狀態(tài)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中增加蛋白質(zhì)聯(lián)蛋白的磷酸化狀態(tài)包括激活糖原合酶 激酶3。
30.權(quán)利要求1-29任何一項的方法，其中增加DACT蛋白或其功能片段的量和活性中的 至少一種還包括減少細胞中dishevelled蛋白的量。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述dishevelled蛋白是Dvll、Dvl2和Dvl3中的一種。
32.權(quán)利要求30或31的方法，其中通過降解降低細胞中dishevelled蛋白的量。
33.權(quán)利要求30-32任何一項的方法，其中所述dishevelled蛋白與所述DACT蛋白形 成復(fù)合體。
34.權(quán)利要求1-33任何一項的方法，其還包括評估細胞中DACT蛋白的量和活性的至少一種。
35.權(quán)利要求34的方法，其中評估所述DACT蛋白的量和/或活性包括評估一段時間內(nèi) 的量和/或活性。
36.權(quán)利要求34或35的方法，其中通過測定細胞中DACT蛋白的基因表達實現(xiàn)評估細 胞中DACT蛋白的量。
37.權(quán)利要求36的方法，其還包括比較DACT基因表達的測定結(jié)果與對照測定的結(jié)果。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述對照測定包括使用至少基本上不調(diào)節(jié)DACT蛋白基因 表達的條件。
39.權(quán)利要求1-38任何一項的方法，其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一種。
40.權(quán)利要求1-39任何一項的方法，其包括將所述細胞與預(yù)定量的通式(I)的化合物接觸 其中在通式(I)中， A是CH或N，R1 > R4和R5相互獨立地選自H和脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂環(huán)族烴 基，包含選自N、0、S和Si的0-3個雜原子，其中R4和R5可任選地連接以確定脂肪族烴基 橋，R2選自H和鹵素，并且R3是H，或包括1-8個主鏈碳原子和選自N、0、S、Si，和鹵素的0-3個雜原子的脂肪族或芳基脂肪族烴基。
41.權(quán)利要求1-40任何一項的方法，其包括將所述細胞與預(yù)定量的通式(I)的化合物 和組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合接觸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑是通式(II)和通式(III)中 的一種化合物， 其中R6是H、氨基、醚基、脂肪族基團和芳基脂肪族基團中的一個，并且 L是包含脂肪族或芳基脂肪族基團的橋，所述基團包含1-8個主鏈碳原子和選自Ν、0和Si的0-3個雜原子。
43.權(quán)利要求42的方法，其中R6的氨基或醚基用脂肪族、脂環(huán)族、芳族、芳基脂肪族或 芳基脂環(huán)族基團取代，所述基團包含選自N、0、S和Si的0-3個雜原子。
44.權(quán)利要求40-43任何一項的方法，其中通式(I)的化合物是(1S，2R， 5R)-5-(4-氨基-IH-咪唑并[4,5-c]吡啶基)_3_ (羥甲基)-3-環(huán)戊烯-1，2-二醇 (3-deazaneplanocin)。
45.權(quán)利要求43或44的方法，其中通式(II)的化合物是(2E，4E，6R)-7_[4_(二甲基 氨基)苯基]-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧代-2，4-七碳二烯酰胺(曲古抑菌素-A)。
46.診斷細胞中腫瘤發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法包括評估(i)細胞中DACT蛋白的量， ( )細胞中DACT蛋白的活性，(iii)細胞中翻譯后組蛋白修飾的模式中的一種。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述翻譯后組蛋白修飾是組蛋白甲基化和組蛋白乙?；?中的至少一種。
48.權(quán)利要求46或47的方法，其中所述方法是鑒定具有變成腫瘤發(fā)生傾向的細胞的方法。
49.權(quán)利要求46-48任何一項的方法，其中所述方法包括比較所得結(jié)果與對照測定。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述對照測定包括在已知至少基本上沒有變成腫瘤發(fā)生 風(fēng)險的細胞中評估(i)DACT蛋白的量，(ii)DACT蛋白的活性，(iii)翻譯后組蛋白修飾的模 式中的一種。
51.權(quán)利要求47-50任何一項的方法，其中在評估組蛋白乙?；哪Ｊ街?，組蛋白3上 (i)賴氨酸9和(ii)賴氨酸14中至少一個的降低乙?；砻魉黾毎麑⒆兂赡[瘤發(fā)生的 風(fēng)險增加。
52.權(quán)利要求47-51任何一項的方法，其中在評估組蛋白甲基化的模式中，組蛋白3上 賴氨酸4和27的增加的甲基化表明所述細胞將變成腫瘤發(fā)生的風(fēng)險增加。
53.權(quán)利要求46-52任何一項的方法，其中評估DACT蛋白的基因座上翻譯后組蛋白修 飾的模式。
54.權(quán)利要求46-53任何一項的方法，其中轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄抑制組 蛋白翻譯后組蛋白修飾的組合表明所述細胞將變成腫瘤發(fā)生的風(fēng)險增加。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述激活翻譯后組蛋白修飾是在組蛋白3上賴氨酸4的 甲基化、組蛋白3上賴氨酸9的乙酰化和組蛋白3上賴氨酸14的乙?；械囊环N，并且其 中所述轉(zhuǎn)錄抑制翻譯后組蛋白修飾是組蛋白3上賴氨酸9的甲基化、組蛋白3上賴氨酸27 的甲基化和組蛋白4上賴氨酸20的甲基化中的一種。
56.權(quán)利要求54或55的方法，其中組蛋白3上賴氨酸4和27的甲基化表明所述細胞 將變成腫瘤發(fā)生的風(fēng)險增加。
57.權(quán)利要求46-49任何一項的方法，其中在評估細胞中DACT蛋白的量中，DACT蛋白 降低的量表明所述細胞將變成腫瘤發(fā)生的風(fēng)險增加。
58.在受試者中診斷發(fā)生贅生物的風(fēng)險的方法，所述方法包括評估(i)細胞中DACT蛋 白的量，(ii)細胞中DACT蛋白的活性，(iii)翻譯后組蛋白修飾的模式中的一種。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述贅生物是腫瘤。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述腫瘤是黑素瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、食管腫瘤、甲狀腺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮腫瘤、帶形纖維瘤、維爾 姆斯瘤、成神經(jīng)管細胞瘤和毛基質(zhì)細胞腫瘤中的一種。
61.權(quán)利要求58-60任何一項的方法，其中所述翻譯后組蛋白修飾是組蛋白甲基化和 組蛋白乙?；闹辽僖环N。
62.權(quán)利要求58-61任何一項的方法，其中轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄抑制組 蛋白翻譯后組蛋白修飾的組合表明受試者中發(fā)生贅生物的風(fēng)險。
63.權(quán)利要求62的方法，其中轉(zhuǎn)錄激活翻譯后組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄抑制組蛋白翻譯后組 蛋白修飾的組合是組蛋白3上賴氨酸4和27的甲基化組合。
64.權(quán)利要求58-63任何一項的方法，其中在DACT蛋白的基因座處評估翻譯后組蛋白 修飾的模式。
65.預(yù)測贅生物是否對組蛋白脫乙酰酶抑制劑和通式(I)的化合物的組合敏感的方法 (I)其中在通式(I)中，A是CH或N，R1 > R4和R5相互獨立地選自H和脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂環(huán)族烴 基，包含選自N、0、S和Si的0-3個雜原子，其中R4和R5可任選地連接以確定脂肪族烴基 橋，R2選自H和鹵素，并且R3是H，或包含1-8個主鏈碳原子和選自N、0、S、Si，和鹵素的0-3個雜原子的脂肪族 或芳基脂肪族烴基，所述方法包括評估贅生物中(i)DACT蛋白的量，(ii)DACT蛋白的活性，(iii)翻譯后組 蛋白修飾模式中的一種，其中⑴DACT蛋白的減少量，(ii)DACT蛋白的降低活性，(iii)和改變的翻譯后組蛋白 修飾中的一種表明所述贅生物對通式(I)的化合物與組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合敏感。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述贅生物包含在哺乳動物中。
67.權(quán)利要求65或66的方法，其中所述贅生物是腫瘤。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述腫瘤是黑素瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、結(jié)腸直腸 腫瘤、食管腫瘤、甲狀腺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮腫瘤、帶形纖維瘤、維爾 姆斯瘤、成神經(jīng)管細胞瘤和毛基質(zhì)細胞腫瘤中的一種。
69.權(quán)利要求65-68任何一項的方法，其中所述改變的翻譯后組蛋白修飾是組蛋白甲 基化和組蛋白乙?；闹辽僖环N。
70.權(quán)利要求65-69任何一項的方法，其中在DACT蛋白的基因座處評估組蛋白甲基化 和/或組蛋白乙?；哪Ｊ健?br> 71.在細胞中增加DACT蛋白的絕對量的核酸分子和/或低分子量有機分子在制備用于 預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。
72.權(quán)利要求71的用途，其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3的一種。
73.藥物組合物，其包括以下的組合 (i)通式⑴的化合物 (I)其中在通式(I)中， A是CH或N，R1 > R4和R5相互獨立地選自H和脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂環(huán)族烴 基，包含選自N、0、S和Si的0-3個雜原子，其中R4和R5可任選地連接以確定脂肪族烴基橋， R2選自H和鹵素，并且R3是H，或包括1-8個主鏈碳原子和選自N、0、S、Si，和鹵素的0-3個雜原子的脂肪族 或芳基脂肪族烴基；和( )組蛋白脫乙酰酶抑制劑。
74.權(quán)利要求73的藥物組合物，其中所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑是 SAHA(Vorinostat )或 pxdioi (Belinostat )。
75.權(quán)利要求73的藥物組合物，其中所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑是通式(II)和通式 (III)的一種化合物， 其中在通式(II)和(III)中，R6是H、氨基、醚基、脂肪族基團和芳基脂肪族基團中的一個，并且 L是包含脂肪族或芳基脂肪族基團的橋，所述基團包含1-8個主鏈碳原子和選自N、0和 Si的0-3個雜原子。
76.權(quán)利要求75的藥物組合物，其中R6是氨基或醚基，所述氨基或醚基被包含選自N、 0、S和Si的0-3個雜原子的脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂環(huán)族基團之一取 代。
77.通式(I)的化合物在治療結(jié)腸直腸癌和黑素瘤之一中的用途 其中在通式(I)中， A是CH或N，R1 > R4和R5相互獨立地選自H和脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、芳基脂肪族和芳基脂環(huán)族烴 基，包含選自N、0、S和Si的0-3個雜原子，其中R4和R5可任選地連接以確定脂肪族烴基橋， R2選自H和鹵素，并且R3是H，或包括1-8個主鏈碳原子和選自N、0、S、Si，和鹵素的0-3個雜原子的脂肪族 或芳基脂肪族烴基。
78.權(quán)利要求77的用途，其中所述用途還包括使用組蛋白脫乙酰酶抑制劑。
79.鑒定能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序 性細胞死亡的候選化合物的的方法，所述方法包括向能夠表達DACT蛋白或其功能片段的 細胞中引入化合物，并確定所述DACT蛋白的表達，其中所述DACT蛋白的增加的表達表明所 述化合物能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性 細胞死亡。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一種。
81.鑒定能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序 性細胞死亡的候選化合物的方法，所述方法包括向表達DACT蛋白或其功能片段的細胞中 引入化合物，并確定所述DACT蛋白的表達和/或活性，其中所述DACT蛋白的增加的表達和 /或活性表明所述化合物能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞 中誘導(dǎo)程序性細胞死亡。
82.權(quán)利要求81的方法，其還包括比較所得結(jié)果與對照測定的那些結(jié)果。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述對照測定包括使用不調(diào)節(jié)DACT蛋白的表達和/或活 性的化合物。
84.權(quán)利要求81-83任何一項的方法，其中所述細胞是癌細胞。
85.權(quán)利要求81-84任何一項的方法，其中所述細胞來自結(jié)腸直腸組織、皮膚組織、乳 腺組織、肺組織、膀胱組織和輸卵管組織中的一種。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述細胞是細胞系的細胞。
87.權(quán)利要求81-86任何一項的方法，其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一種。
88.鑒定能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程 序性細胞死亡的化合物的體外方法，所述方法包括將化合物、DACT蛋白或其功能片段與 dishevelled蛋白接觸，其中所述DACT蛋白與Dishevelled蛋白之間的復(fù)合體形成的增強 表明所述化合物能夠在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生和/或在腫瘤細胞中誘導(dǎo) 程序性細胞死亡。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述dishevelled蛋白是Dvll、Dvl2和Dvl3中的一種。
90.權(quán)利要求88或89的方法，其包括(a)向試管中加入懷疑能夠增強DACT蛋白或其功能片段與dishevelled蛋白之間的復(fù) 合體形成的化合物，(b)向所述試管中加入所述DACT蛋白或其功能片段，(c)加入所述dishevelled蛋白，并(d)檢測所述復(fù)合體形成。
91.權(quán)利要求90的方法，其中通過合適的光譜、光化學(xué)、光度計、熒光計、放射學(xué)、酶學(xué) 或熱力學(xué)方法進行所述檢測。
92.權(quán)利要求88-91任何一項的方法，其中所述DACT蛋白是DACT2和DACT3中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細胞中防止、抑制、阻滯或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生的方法，以及在腫瘤細胞中誘導(dǎo)程序性細胞死亡的方法。所述方法包括在細胞中增加DACT蛋白或其功能片段的量和/或活性。還提供了包含通式(I)的化合物的藥物組合物，其中A是CH或N，R4和R5相互獨立地選自H和脂肪族基團、脂環(huán)族基團、芳香族基團、芳基脂肪族基團和芳基脂環(huán)族烴基，其包含0-3個雜原子。所述雜原子可以是N、O、S或Si。R4和R5可任選地連接以確定脂肪族烴基橋。R2選自H或鹵素，如F、Cl、Br或I。R3是H、F、Cl，或包括1-8個主鏈碳原子和0-3個雜原子的脂肪族或芳基脂肪族基團。所述藥物組合物還包含組蛋白脫乙酰酶抑制劑。
文檔編號A61K31/52GK101909630SQ200880123400
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者于強 申請人:新加坡科技研究局