專利名稱：改良的nogo-a結(jié)合分子及其藥學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的NogoA結(jié)合分子，例如單克隆抗體、其衍生物或Fab片段。
背景技術(shù)：
由于抑制性髓鞘環(huán)境的存在，在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中損傷后的神經(jīng)元再生 是有限的，該環(huán)境導(dǎo)致軸突被納入鞘中且形成瘢痕組織。在最近數(shù)年中，有關(guān)CNS在損傷后 為何無法自發(fā)修復(fù)其自身的分子認(rèn)識，已經(jīng)有了重要的進(jìn)展。髓鞘中的抑制性分子是軸突 再生的主要障礙，特別是緊在損傷后。迄今為止NogoA、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、和髓鞘-少 突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OMgp)已被表征為神經(jīng)突增生(outgrowth)的有力抑制劑。此外，髓鞘 還包含其他抑制性組分，例如硫酸軟骨素蛋白聚糖。Nogo-A是reticulon蛋白質(zhì)家族的成 員，并且它具有至少2個生物學(xué)活性且藥理學(xué)不同的結(jié)構(gòu)域，稱為氨基-Nogo和Nogo-66。 盡管前者的受體位點迄今未知，但Nogo-66可以經(jīng)由神經(jīng)元受體NgR在體外和體內(nèi)抑制神 經(jīng)元生長。除Nogo-66外，MAG和OMgp也以高親和力與NgR結(jié)合且抑制神經(jīng)突增生。目前尋求增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)的新研究方法包括使用軟骨素酶ABC消化瘢痕組織，使 用嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells)和干細(xì)胞以及蛋白質(zhì)生長因子的橋接技術(shù)以 加強(qiáng)神經(jīng)元生長。神經(jīng)突增生抑制劑的阻斷作用可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號介質(zhì)例如Rho， 一種膜結(jié)合鳥苷三磷酸酶(GTP酶)，而達(dá)到，Rho看起來是抑制軸突生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。環(huán)腺 苷一磷酸(cAMP)可以在體外克服髓鞘相關(guān)的抑制作用且在體內(nèi)誘導(dǎo)再生。NgR受體(NEP 1-40)的肽抑制劑可以用于在大鼠中在脊髓損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)元再生長和功能恢復(fù)。除使用上述方法外，更多關(guān)注也已集中于特定單克隆抗體的使用，以中和中樞 和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)突生長抑制分子，特別是中和NogoA的神經(jīng)突生長抑制活性。因 此，已顯示單克隆抗體IN-I或其IN-IFab片段在體外誘導(dǎo)神經(jīng)突增生且在體內(nèi)增強(qiáng)萌芽 (sprouting)和再生(Schwab ME 等人(1996) Physiol. Rev. 76，319-370)。關(guān)于 IN-1 的備選 抗體也已在W02004/052932(11C7-Ab)和W02005/028508 (3A6_Ab)中得到描述。就神經(jīng)突 生長抑制活性測試了 NogoA的不同結(jié)構(gòu)域，結(jié)果描繪出該分子中的幾個抑制結(jié)構(gòu)域(Chen 等人(2000) Nature 403,434-439 ；GrandPre 等人，(2000) Nature 403,439-444 ；Prinjha 等 人(2000)Nature 403，383-384。天然免疫球蛋白或抗體包括一般Y形的多聚體分子，所述分子在每個上臂末端處 具有抗原結(jié)合位點。該結(jié)構(gòu)的其余部分，特別是Y的莖，介導(dǎo)與免疫球蛋白相關(guān)的效應(yīng)子功 能?？贵w由2條重鏈和2條輕鏈組成。重和輕鏈都包括可變結(jié)構(gòu)域和恒定部分?？乖Y(jié)合 位點由與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合的重鏈可變結(jié)構(gòu)域組成。重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域具有相同的 一般結(jié)構(gòu)。更特別地，抗體的抗原結(jié)合特征基本上由重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域中的3個特別 區(qū)域決定，其稱為高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。3個高變區(qū)與4個構(gòu)架區(qū)(FRs)交替，F(xiàn)Rs 的序列相對保守并且不直接參與結(jié)合。這些⑶Rs形成環(huán)并且通過主要采用片層構(gòu)象 的構(gòu)架區(qū)保持緊密接近。重鏈的CDRs連同相關(guān)輕鏈的CDRs基本上構(gòu)成抗體分子的抗原結(jié) 合位點。關(guān)于何者構(gòu)成FR或⑶R區(qū)，通?？梢酝ㄟ^比較在相同物種中產(chǎn)生的多個抗體的氨 基酸序列來確定。用于鑒定CDR和FR區(qū)的一般規(guī)則是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識，并且可以例如在網(wǎng)站(www.bioinf.org.uk/abs/)中找到?？傮w地，仍明確需要在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中于損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)組織再生的 新型和改良方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的單克隆人抗體，其在體外和體內(nèi)實驗中具有優(yōu)良的NogoA活性調(diào) 節(jié)性質(zhì)并且對成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中損傷后的神經(jīng)元再生具有正面影響。因此，本發(fā) 明提供NogoA蛋白質(zhì)的新結(jié)合分子或其片段。在一個實施方案中，本發(fā)明因此提供了包括至少一個抗原結(jié)合位點的分離的分 子，所述抗原結(jié)合位點與人NogoA多肽(SEQ ID NO 2)或人NiG(SEQ ID NO 3)特異性結(jié) 合，所述抗原結(jié)合位點*順次包括高變區(qū)⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2_6A3 (SEQ IDNO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10)具有 至少90%同一性；且*順次包括高變區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中這些高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR_L2_6A3 (SEQ IDNO 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID N0:13)具 有至少90%同一性。在再一實施方案中，所述本發(fā)明的分離的分子的抗原結(jié)合位點* 順次包括高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO 8)、CDR-H2-6A3 (SEQID NO 9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10)；且* 順次包括高變區(qū) CDR-L1-6A3(SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQID NO 12)禾口 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13)。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合分子，其包括*至少一條免疫球蛋白重鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10)的可變結(jié)構(gòu)域，和 ( )人重鏈的恒定部分或其片段；和*至少一條免疫球蛋白輕鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO: 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)的可變結(jié)構(gòu)域，和 ( )人輕鏈的恒定部分或其片段。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子具有< IOOOnM的解離常數(shù)。在本發(fā)明的結(jié)合分子的一個備選實施方案中，人重鏈的恒定部分或其片段為Y 4 型的，而人輕鏈的恒定部分或其片段是κ型的。在一個進(jìn)一步的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子是人的或嵌合的或人源化的 單克隆抗體。在另外一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子包括選自SEQ IDNO :4(IgGl重)、 SEQ ID NO :5(IgGl 輕)、SEQ ID N0:24(IgG4 重)和 SEQ ID N0:25(IgG4 輕)的一個或多 個多肽序列。此外，本發(fā)明還提供了包括編碼本發(fā)明結(jié)合分子的核酸序列的分離的多核苷酸。在特定實施方案中，本發(fā)明的所述分離的多核苷酸包括*選自SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15禾口 SEQ ID NO 16的多核苷酸序列中的至少一個；或*選自SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18禾口 SEQ ID NO 19的多核苷酸序列中的至少一個。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包括* 順次包括 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的多核苷酸序列；禾口* 順次包括 SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 的多核苷酸序列。在另外一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包括* SEQ ID NO 6的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 7的多核苷酸序列，或，* SEQ ID NO 26的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 28的多核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供了包括如上定義的本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。此外，本發(fā)明提供了包括如上定義的表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，其中當(dāng)所述表達(dá)系統(tǒng) 或其部分存在于相容宿主細(xì)胞中時，所述表達(dá)系統(tǒng)或其部分能夠產(chǎn)生如上定義的本發(fā)明多 肽。此外，本發(fā)明還提供了包括如上定義的載體的分離的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的結(jié)合分子和載體的分離的組合物。此外，本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的多核苷酸和載體的分離的組合物。此外，本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明表達(dá)載體或本發(fā)明宿主細(xì)胞的分離的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了給需要治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的個 體施用根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的方法。本發(fā)明還提供了包括根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、根據(jù)本發(fā) 明的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)、或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞、以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體 或稀釋劑的藥物組合物。在特定實施方案中，所述藥物組合物是緩釋組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法， 其包括給需要此類治療的受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、根據(jù)本發(fā)明的多 核苷酸、根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)、或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在一個優(yōu)選實 施方案中，疾病是選自下述的神經(jīng)變性疾病阿爾茨海默氏病，帕金森病，肌萎縮側(cè)索硬 化(ALS)，路易小體樣病(Lewy like pathologies)或其他全面性癡呆(dementia in general)，顱、腦或脊髓創(chuàng)傷后的疾病，中風(fēng)和脫髓鞘疾病。在一個進(jìn)一步的實施方案中， 脫髓鞘疾病選自多發(fā)性硬化癥、單相脫髓鞘病、腦脊髓炎、多灶性白質(zhì)腦病、全腦炎、馬_比 (Marchiafava-Bignami)病、腦橋髓鞘脫失(myelmolysis)、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、 佩一梅(Pelizaeus-Merzbacher)病、海綿狀變性、亞歷山大(Alexander' s)病、卡納萬 (Canavan' s)病、異染色性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和克拉伯氏(Krabbe' s)病。備選地，疾病是變性眼病癥，其可以直接或間接涉及視網(wǎng)膜或角膜細(xì)胞變性。在一 個優(yōu)選實施方案中，變性眼病癥選自缺血性視網(wǎng)膜病變、眼前部缺血性視神經(jīng)病變、視神經(jīng) 炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、囊樣黃斑水腫(CME)、色素性視網(wǎng)膜炎、斯 塔加特(Stargardt' s)病、Best卵黃狀視網(wǎng)膜變性、萊伯氏(Leber‘ s)先天性黑蒙和其 他遺傳性視網(wǎng)膜變性、病理性近視、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、和Leber遺傳性視神經(jīng)病變、角膜 移植或角膜屈光手術(shù)的后效應(yīng)、和皰疹性角膜炎。備選地，疾病是精神病病狀。優(yōu)選地，所述精神病病狀選自精神分裂癥和抑郁癥。
在如上所述的治療方法中，優(yōu)選地進(jìn)行顱內(nèi)或鞘內(nèi)施用。此外，本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的方法，其包括借助于重 組DNA技術(shù)或借助于化學(xué)合成，在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體或系統(tǒng)中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核 苷酸。此外，本發(fā)明提供了在損傷部位局部施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法。最后，本發(fā)明還提供了包括，以用于在外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病 治療中同時、分開或相繼使用的組合制劑的形式，施用選自下述的一種或多種產(chǎn)品的方法: 根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體或系統(tǒng)、根據(jù)本發(fā) 明的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了借助于重組DNA技術(shù)或借助于化學(xué)合成，產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合 分子和編碼此類結(jié)合分子的多核苷酸、表達(dá)載體的方法。本發(fā)明還提供了包括根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或宿主 細(xì)胞、以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。還提供了包含所述結(jié)合 分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或所述宿主細(xì)胞、或其藥學(xué)上可接受的衍生物的產(chǎn)品，其 為用于在外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中同時、分開或相繼使用的組合 制劑形式。本發(fā)明還涉及治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包括給 需要此類治療的受試者施用有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或宿 主細(xì)胞。本發(fā)明在實施例中進(jìn)一步指出本發(fā)明藥物組合物和產(chǎn)品可以用于結(jié)合分子的緩 慢釋放和/或結(jié)合分子在損傷部位的局部沉積。附圖簡述圖 1編碼6A3-IgGl抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸(SEQ ID NO 7)和氨基酸(SEQ ID NO 5)。有下劃線的部分指示前導(dǎo)肽(SED ID NO 22)和編碼其的核苷酸序列(SED ID NO 23)。圖 2編碼6A3-IgGl抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸(SEQ ID NO 6)和氨基酸(SEQ ID NO 4)。有下劃線的部分指示肽(SED ID NO 20)和編碼其的核苷酸序列(SED ID NO 21)。圖 36A3-Ig4的輕(SEQ ID NO 28 ；上)和重(SEQ ID NO 26 ；下)可變部分的編碼區(qū)。圖 46A3-Ig4可變和恒定部分的重(SEQ ID NO 24 ；下)和輕(SEQ ID N025，上)鏈的 氨基酸序列。輕(SEQ ID NO 31)和重(SEQ ID NO 30)鏈的前導(dǎo)肽以斜體指示。圖 5上具有前導(dǎo)區(qū)(SEQID NO 22)以及 CDR-Ll (SEQ ID NO 11)、CDR_L2 (SEQ ID NO 12)和 CDR-L3 (SEQ ID NO 13)序列的 6A3_IgGl 抗體輕鏈氨基酸(SEQ ID NO 5)。下具有前導(dǎo)區(qū)(SEQID NO 20)以及 CDR-Hl (SEQ ID NO 8)、CDR-H2 (SEQ ID NO 9)和 CDR-H3(SEQ ID NO 10)序列的 6A3_IgGl 抗體重鏈氨基酸(SEQ ID NO 4)。圖 6
使用M03. 13RNA作為模板以及Nogo-A特異性引物的RT-PCR導(dǎo)致約200bp的獨(dú)特 DNA片段。圖 7使用6A3抗體免疫印跡檢測自M03 :13_細(xì)胞脂質(zhì)免疫沉淀的Nogo-A。在免疫沉淀(IP)M03. 13細(xì)胞裂解物和用6A3抗Nogo-Α抗體進(jìn)行免疫檢測后，對 于6A3-IgG4(泳道4)和llC7-IgGl (泳道6)抗體，均檢測到在預(yù)期大小(190kDa)的單個強(qiáng)帶。圖 8圖8a :M03. 13細(xì)胞的免疫熒光染色。圖8b =HOG細(xì)胞的免疫熒光染色。用6A3_IgG4和Alexa-Fluor 488標(biāo)記的抗人二抗免疫熒光染色透化處理的 M03. 13細(xì)胞和HOG細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的極亮染色(圖8a和8b，左側(cè)部分)，而僅用二抗基本上 未檢測出信號(右側(cè)部分)。圖 9在6個受試者中多達(dá)2個月測量的6A3抗體血清濃度。圖 10在6個受試者中多達(dá)2個月測量的6A3抗體CSF濃度。圖 11在猴SCI模型中6A3抗體處理提高功能恢復(fù)的速率和程度，與損傷大小無關(guān)。發(fā)明詳述在研究可以在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中提供損傷后神經(jīng)元再生的新改良方法 時，現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，新型單克隆人抗體6A3在體外和體內(nèi)實驗中具有優(yōu)良的調(diào)節(jié) NogoA活性的性質(zhì)，該抗體6A3在Medarex Inc的HuMab-mouse 中產(chǎn)生，所述HuMab-mouse 是其中人免疫球蛋白基因代替了其鼠類對應(yīng)物的遺傳重構(gòu)小鼠。6A3針對人MG產(chǎn)生，具有 IgG同種型并且具有比現(xiàn)有技術(shù)中描述的NogoA抗體更佳的性質(zhì)?，F(xiàn)可以構(gòu)建與所述6A3 抗體具有相同高變區(qū)的其他NogoA結(jié)合分子，產(chǎn)生具有6A3的有利性質(zhì)的新抗體。6A3-Ab 的衍生物——6A3-IgG4和6A3-Fab——分別以0. 14nM和1. InM的高親和力識別人NiG。此 外，本發(fā)明的抗體顯示高穩(wěn)定性以及延長的體外和體內(nèi)高半衰期和保持性。最后，本發(fā)明的 結(jié)合分子和抗體顯示出自引入部位的緩慢釋放，從而使得結(jié)合分子可以在損傷部位局部沉 積。已檢測到在脊髓損傷動物和患者中由連續(xù)輸注造成的6A3抗體的高腦脊髓(CSF)濃度。 在例如腦脊髓液中的這種令人驚訝的高6A3-Ab保持和停留使得可以使用快速濃注(bolus injections)(例如每周1_3次，但每2、3或4周一次的甚至更長間隔也是可行的)代替持續(xù) 輸注，使抗體進(jìn)入腦脊髓液內(nèi)?？梢允褂梅磸?fù)的鞘內(nèi)快速濃注。在一個優(yōu)選實施方案中，施 用通過鞘內(nèi)施用來完成，例如使用與便攜式泵連接的外置導(dǎo)管(externalized catheter) 0 在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，使用鞘內(nèi)快速濃注。實驗部分進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的 結(jié)合分子的有利性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了 NogoA或NiG的結(jié)合分子(下文稱為“本發(fā)明的結(jié)合分子”或 簡稱為“結(jié)合分子”)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合人NogoA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :2，由 SEQ ID N0:1編碼)或人NiG蛋白質(zhì)(其是NogoA的最有效神經(jīng)突增生抑制片段，起始于人NogoA的氨基酸186并終止于氨基酸1004，= SEQ ID NO :3)，優(yōu)選具有< IOOOnM的解離 常數(shù)(Kd)、或具有小于等于IOOnM的Kd、更優(yōu)選具有< IOOnM的Kd、或具有小于等于IOOnM 的Kd、最優(yōu)選具有< IOnM的Kd、或具有小于等于IOnM的Kd。結(jié)合反應(yīng)可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法 (包括定性和定量測定法)顯示，包括例如蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和生物傳感器親和力方法 (參照實施例4)。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子與人NogoA和人NiG的結(jié)合以及這些結(jié)合分子 在功能測定法中的功效，可以在例如如下所述的神經(jīng)突增生測定法中顯示。因此，在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)與用對照抗體處理的大鼠小腦顆粒細(xì) 胞的神經(jīng)突數(shù)目相比較時(所述對照抗體不與人NogoA多肽或人MG多肽結(jié)合(即，具有 > IOOOnM的解離常數(shù)))，本發(fā)明的結(jié)合分子(以ΙΟΟμ g/ml的濃度、優(yōu)選10μ g/ml、更優(yōu) 選以1. O μ g/ml、更加優(yōu)選以0. 1 μ g/ml)使在猴腦蛋白質(zhì)提取物基質(zhì)上的大鼠小腦顆粒細(xì) 胞的神經(jīng)突數(shù)目增加至少20 %、優(yōu)選50 %、最優(yōu)選80 %。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括至少一個與人NogoA多肽(SEQ ID NO 2) 或人NiG多肽(SEQ ID NO 3)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點的分離分子，其包括至少一個抗 原結(jié)合位點，所述抗原結(jié)合位點包括*高變區(qū)⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3中的至少一個，其中所述高變區(qū)各自分別與高 變區(qū) CDR-H1-6A3(SEQ ID NO :8)、CDR-H2_6A3 (SEQID NO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10) 具有至少90%同一性；和*高變區(qū)⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3中的至少一個，其中所述高變區(qū)各自分別與高 變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR_L2_6A3 (SEQ ID NO 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13)具有至少90%同一性。當(dāng) CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 或 CDR_L1、CDR_L2 和 CDR-L3 存在于本發(fā)明的結(jié)合分 子中時，對人NogoA或NiG的特異性識別得到保證。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在結(jié)合分子 中即使僅一個CDR結(jié)構(gòu)域的存在也可能足以確保與該識別分子的特異性結(jié)合。短語“至少 一個高變區(qū)”意指1、或2或3個高變區(qū)。短語“至少90%同一性”意指90%以上同一性，優(yōu) 選91%、92%、93%;94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性。2個氨基酸序列的同一 性百分比可以使用分析2個或更多個氨基酸序列的相對同一性的計算機(jī)算法，進(jìn)行確定， 例如在 NationalInstitutes of Health 網(wǎng)站上的 Basic Local Alignment Search Tool, (BLAST)，Altschul 等人 1994，Nature Genetics, 6 :119_129，Altschul 等人 1990，J. Mol. Biol. 215 403-410, Altschul 等人 1997，Nucleic AcidsResearch, 25 :1389_1402，Karlin 和 Altschul，1990PNAS，87 =2264-68, Karlin 和 Altschul，1993PNAS,90 :5873_68。本發(fā)明涉及具有< IOOOnM的解離常數(shù)、與人NogoA多肽(SEQ IDNO 2)或人NiG 多肽(SEQ ID NO :3)特異性結(jié)合的、包括至少一個抗原結(jié)合位點的分離分子，所述抗原結(jié)合 位點包括*至少高變區(qū)⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-H1-6A3(SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO 9)和 CDR-H3-6A3(SEQ ID NO 10)具 有至少90%同一性；和*至少高變區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQ ID N0:12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)
具有至少90%同一性。
短語“順次包括高變區(qū)的抗原結(jié)合位點”包括其中高變區(qū)彼此不鄰接的抗原結(jié)合 位點；優(yōu)選地所述抗體區(qū)域之間散置抗體構(gòu)架區(qū)，或非抗體構(gòu)架序列，優(yōu)選人抗體構(gòu)架區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合分子還可以包括至少一個抗原結(jié)合位點，所述抗原結(jié)合位點包 括* 順次地高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO 8)、CDR-H2-6A3 (SEQID NO 9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10)；或* 順次地高變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO 11)、CDR-L2-6A3 (SEQID NO 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)；或*其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。短語“至 少 90% 同一性”意指 90% 以上同一性，優(yōu)選 91%、92%、93%;94%、95%、96%、97%、98%、 99%以上同一性。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合分子還可以包括* 順次包括高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO 8)、CDR-H2-6A3 (SEQID NO 9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10)的第一抗原結(jié)合位點；和* 順次包括高變區(qū) CDR-L1-6A3(SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO 12)禾口 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)的第二抗原結(jié)合位點；或*其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。至少90% 同一性意指 90% 以上同一性，優(yōu)選 91%、92%、93%;94%、95%、96%、97%、98%、99% 以上
同一性。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合分子還可以包括*至少一條免疫球蛋白重鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10)的可變結(jié)構(gòu)域，和 ( )人重鏈的恒定部分或其片段；和*至少一條免疫球蛋白輕鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO: 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)的可變結(jié)構(gòu)域，和 ( )人輕鏈的恒定部分或其片段；或*其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。至少90% 同一性意指 90% 以上同一性，優(yōu)選 91%、92%、93%;94%、95%、96%、97%、98%、99% 以上
同一性。在本發(fā)明的結(jié)合分子中，人重鏈的恒定部分或其片段可以為Y型，優(yōu)選Y4型，而 人輕鏈的恒定部分或其片段可以為λ或優(yōu)選地κ型。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以是人 的、部分人的或嵌合的或人源化的單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合分子可以包括一個或多個如SEQ ID NO :4(IgGl重)、SEQ ID NO: 5(IgGl輕)、SEQ ID NO :24 (IgG4重)和SEQ IDNO :25 (IgG4輕)中任何一個所示的多肽序 列。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包括至少一個抗原結(jié)合位 點，所述抗原結(jié)合位點順次包括高變區(qū)CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3 (所述 CDR-H1-6A3具有氨基酸序列SEQ IDNO :8，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO :9， 并且所述⑶R-H3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID N0:10)；及其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。至少90%同一性意指90%以上同一性，優(yōu)選91%、 92%,93% ；94%、95%、96%、97%、98%、99% 以上同一性。在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子包括至少a)順次包括高變區(qū)CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3的第一結(jié)構(gòu)域；所述 ⑶R-H1-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO :8，所述⑶R-H2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO 9，并且所述⑶R-H3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO 10 ；和b)順次包括高變區(qū)CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的第二結(jié)構(gòu)域；所述 CDR-L1-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO :11，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO 12，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO :13 ；或c)其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。至少90% 同一性意指 90% 以上同一性，優(yōu)選 91%、92%、93%;94%、95%、96%、97%、98%、99% 以上
同一性。此外，本發(fā)明還提供了下述本發(fā)明的結(jié)合分子，其包括至少一個抗原結(jié)合位點，所 述位點包括a)6A3 的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 4)；或b)6A3 的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO :5)，或其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。當(dāng)抗原結(jié)合位點包括第一和第二結(jié)構(gòu)域兩者時，這些結(jié)構(gòu)域可以位于相同多肽分 子上，或優(yōu)選地，每個結(jié)構(gòu)域可以分別在不同鏈上，第一結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白重鏈或其片段 的部分，而第二結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白輕鏈或其片段的部分。本發(fā)明的結(jié)合分子的例子包括通過B細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的抗體和人的或嵌合的 或人源化的抗體或其任何片段，例如F(ab' )2 ；和Fab片段，以及單鏈或單結(jié)構(gòu)域抗體，如 美國專利公開US20070065440A1中描述的。如本文所使用的，“單結(jié)構(gòu)域抗體”是可以特異性結(jié)合表位或抗原或配體的可變結(jié) 構(gòu)域，所述結(jié)合不依賴于結(jié)合該表位、抗原或配體的另一個可變結(jié)合結(jié)構(gòu)域。單結(jié)構(gòu)域抗體 可以以同聚體形式存在、或以具有其他VH或VL結(jié)構(gòu)域的異聚體形式存在，其中該其他結(jié)構(gòu) 域不是該單結(jié)構(gòu)域抗體的抗原結(jié)合所必需的，即，該單結(jié)構(gòu)域抗體不依賴于該額外的VH或 VL結(jié)構(gòu)域來結(jié)合抗原。在一個優(yōu)選實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體包括分離的VH單結(jié)構(gòu)域或分 離的VL單結(jié)構(gòu)域。獲得具有其所衍生自的完整抗體的至少某些結(jié)合特異性的單結(jié)構(gòu)域抗 體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，Ward，等人在〃 Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin VariableDomains Secreted from Escherichia coli," Nature 341 644-646中，公開了一種篩選以獲得抗體重鏈可變區(qū)(VH單結(jié)構(gòu)域抗體)的方法，其中 所述可變區(qū)對其靶表位具有足夠的親和力，以致可以以分離的形式與該表位結(jié)合。單鏈抗體由通過肽接頭共價結(jié)合的抗體重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域/區(qū)組成，所述肽 接頭通常由10至30個氨基酸、優(yōu)選15至25個氨基酸組成。優(yōu)選方法包括使用例如就ScFv 分子描述的多肽接頭(Bird等人，(1988) Science 242:423-426)。因此，此類結(jié)構(gòu)不包括 重和輕鏈的恒定部分，并且據(jù)信該小肽間隔物應(yīng)比完整的恒定部分具有較小的抗原性?！扒?合抗體”意指這樣的抗體，其中重或輕抗體鏈或兩者的恒定區(qū)源于第一物種，而重和輕鏈兩 者的可變區(qū)源于第二物種。優(yōu)選地，“嵌合抗體”是這樣的抗體，其中重或輕鏈或兩者的恒定區(qū)是人源的，而重和輕鏈兩者的可變結(jié)構(gòu)域是非人(例如鼠源、猴、大鼠、豬、小鼠、雞、禽 類)源的?！叭嗽椿贵w”意指這樣的抗體，其中高變區(qū)(CDRs)是非人源的(例如鼠源的)， 而該免疫球蛋白的所有或基本上所有其他部分，例如恒定區(qū)和可變結(jié)構(gòu)域的高度保守部分 (即構(gòu)架區(qū))，是人來源的。然而，人源化抗體可以在與高變區(qū)鄰近的構(gòu)架區(qū)部分中保留鼠 源序列的少數(shù)氨基酸。高變區(qū)可以與任何類型的構(gòu)架區(qū)結(jié)合，優(yōu)選鼠或人源的構(gòu)架區(qū)。合適的構(gòu)架 區(qū)在"Sequences of proteins of immunological interest “，Kabat Ε. Α.等人， US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health中描述。優(yōu)選地，結(jié)合分子的人重鏈的恒定部分可以是IgG型的，更 優(yōu)選IgG4型，包括亞型，優(yōu)選地人輕鏈的恒定部分可以是λ或κ型的，更優(yōu)選κ型?？梢栽诜侨讼到y(tǒng)中，例如在小鼠中，產(chǎn)生針對所有人中天然存在的蛋白質(zhì)的單克 隆抗體。作為這個的直接后果，通過雜交瘤產(chǎn)生的異種抗體當(dāng)施用于人時，將引發(fā)不希望有 的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答主要由異種免疫球蛋白的恒定部分介導(dǎo)。這明顯地限制了此類抗 體的使用，因為它們不能長時間施用。因此，特別優(yōu)選使用單鏈、單結(jié)構(gòu)域、嵌合或人源化抗 體，當(dāng)施用于人時，其不太可能引發(fā)實質(zhì)性的異源(allogenic)應(yīng)答。鑒于前述，本發(fā)明的結(jié)合分子還可以選自嵌合抗體，其包括至少a) 一條免疫球蛋白重鏈或其片段，包括⑴順次包括高變區(qū)⑶R-H1-6A3、 ⑶R-H2-6A3和⑶R-H3-6A3的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii)人重鏈的恒定部分或其片段；所述 CDR-H1-6A3具有氨基酸序列(SEQ IDNO :8)，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 9)，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO :10)，和b) —條免疫球蛋白輕鏈或其片段，包括⑴順次包括高變區(qū)⑶R-L1-6A3、 ⑶R-L2-6A3和⑶R-L3-6A3的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii)人輕鏈的恒定部分或其片段；所述 CDR-L1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO :11)，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 12)，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 13)；或其直接等價物，所述等價物包括與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性的區(qū)域。備選地，本發(fā)明的結(jié)合分子可以選自包括抗原結(jié)合位點的單鏈結(jié)合分子，其中所 述抗原結(jié)合位點包括a)順次包括高變區(qū)CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3的第一結(jié)構(gòu)域；所述 CDR-H1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO :8)，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 9)，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 10)；和b)順次包括高變區(qū)CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的第二結(jié)構(gòu)域；所述 CDR-L1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO :11)，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 12)，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO 13)；和c)與第一結(jié)構(gòu)域的N末端和第二結(jié)構(gòu)域的C末端或與第一結(jié)構(gòu)域的C末端和第二 結(jié)構(gòu)域的N末端結(jié)合的肽接頭；或其直接等價物，所述等價物與所述高變區(qū)具有至少90%序列同一性。如眾所周知的，氨基酸序列中的小改變，例如一個或幾個氨基酸的缺失、添加或置 換，可以導(dǎo)致具有基本上相同性質(zhì)的、原始蛋白質(zhì)的等位形式。因此，術(shù)語“其直接等價物” 意指本發(fā)明的任何高變區(qū)、任何抗原結(jié)合位點、任何抗體鏈或其片段、或任何單結(jié)構(gòu)域結(jié)合
(i)其中該結(jié)合分子的高變區(qū)CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3各自與CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10)的等價高變區(qū)具 有至少90%同一性，更優(yōu)選至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%同一性，其中CDR-Hl與 CDR-H1-6A3 等價，CDR-H2 與 CDR-H2-6A3 等價，CDR-H3 與 CDR-H3-6A3 等價；且(ii)其能夠與人NogoA或人NiG結(jié)合，優(yōu)選具有< IOOOnM的解離常數(shù)(Kd)，更優(yōu) 選具有< IOOnM的Kd，最優(yōu)選具有< IOnM的Kd，或每結(jié)合位點具有至少一個、優(yōu)選2個結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明任何結(jié)合分子(分子6A3)(iii)其中高變區(qū) CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 各自與 CDR-H1-6A3(SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO :9)、CDR-H3-6A3(SEQ ID NO: 10)、 CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13) 的等價高變區(qū)具有至少90%同一性，更優(yōu)選至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%同一性， 其中 CDR-Hl 與 CDR-H1-6A3 等價，CDR-H2 與 CDR-H2-6A3 等價，CDR-H3 與 CDR-H3-6A3 等價， CDR-Ll 與 CDR-L1-6A3 等價，CDR-L2 與 CDR-L2-6A3 等價，CDR-L3 與 CDR-L3-6A3 等價；且(iv)其能夠結(jié)合人NogoA或人NiG，優(yōu)選具有< IOOOnM的解離常數(shù)(Kd)，更優(yōu)選 具有< IOOnM的Kd，最優(yōu)選具有< IOnM的Kd。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案是例如這樣的結(jié)合分子，其能夠以< IOOOnM的解 離常數(shù)與人NogoA或人MG結(jié)合，并且包括至少一個抗原結(jié)合位點，所述抗原結(jié)合位點包 括*順次地高變區(qū)⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2_6A3 (SEQ IDNO :9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10)具有 至少 90%，優(yōu)選 91、92、93、94、95、96、97、98、99% 同一性；和 / 或*順次地高變區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQ ID N0:12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) 具有至少 90% 同一性，優(yōu)選 91、92、93、94、95、96、97、98、99% 同一性。此外，如本文所描述的結(jié)合分子能夠以< IOOOnM的解離常數(shù)結(jié)合人NogoA或人 NiG,并且包括女順次包括高變區(qū)⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的第一抗原結(jié)合位點，其中所述 高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO 8)、CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO 9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10)具有至少 90%，優(yōu)選 91、92、93、94、95、96、97、98、99 % 同一性； 和女順次包括高變區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的第二抗原結(jié)合位點，其中所述 高變區(qū)各自分別與高變區(qū) CDR-L1-6A3(SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQ ID N0:12)禾口 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)具有至少 90%，優(yōu)選 91、92、93、94、95、96、97、98、99% 同一性。這個解離常數(shù)可以在各種測定法中方便地進(jìn)行測定，包括例如生物傳感器親和力 方法(BIAcore)(參見上文)。此外，結(jié)合分子的結(jié)合和功能效應(yīng)可以在例如如下文描述的 生物測定法中顯示。人重鏈的恒定部分可以為Yl ;γ2;γ3;γ4;α1 ;α2;δ或ε型，優(yōu)選、型，更 優(yōu)選Y 4型，而人輕鏈的恒定部分可以為λ或κ型(其包括λ 1 ;λ2 ;λ3 ；和λ4亞型)，但優(yōu)選κ型。所有這些恒定部分的氨基酸序列在Kabat等人(上引文)中給出。本發(fā)明結(jié)合分子的綴合物，例如酶或毒素或放射性同位素綴合物，也包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。在另一個方面，包含NogoA或NiG結(jié)合分子的組合物通過連接或結(jié)合(非多 肽)聚合穩(wěn)定化部分，例如糖基化(可通過體外或體內(nèi)方法獲得)，而被體內(nèi)穩(wěn)定。此類穩(wěn) 定化的例子在例如W099/64460 (Chapman等人)和EP1，160, 255 (King等人)中描述，所述 文獻(xiàn)各自通過引用合并入本文。特別地，這些參考文獻(xiàn)描述了使用合成的或天然存在的聚 合物分子，例如聚亞烷基、聚亞烯基、聚氧化烯或多糖，增加免疫球蛋白多肽的體內(nèi)半衰期。 穩(wěn)定化部分的典型例子是聚乙二醇或PEG、聚亞烷基。將PEG與免疫球蛋白多肽連接的方法 在這些參考文獻(xiàn)中描述，并且在本文中稱為“PEG化”。如文中描述的，NogoA或MG結(jié)合分 子可以如通過PEG與NogoA或NiG結(jié)合分子表面上的賴氨酸或其他氨基酸附著，而被隨機(jī) 地PEG化，或可以被位點特異性地PEG化，例如通過PEG與人工引入的表面半胱氨酸殘基附 著。依賴于NogoA或NiG結(jié)合分子，可能優(yōu)選使用聚合物附著的非隨機(jī)方法，因為通過在分 子上的一個或多個抗原結(jié)合位點中或附近進(jìn)行附著而發(fā)生的隨機(jī)附著通常改變分子對于 其靶抗原的親和力或特異性。優(yōu)選PEG或其它聚合物的添加不干擾抗體NogoA或NiG結(jié)合分子的抗原結(jié)合親和 力或特異性。“不干擾抗原結(jié)合親和力或特異性”意指，PEG連接的NogoA或NiG結(jié)合分子 具有的IC50或ND50分別比具有相同抗體單可變結(jié)構(gòu)域的非PEG連接的NogoA或NiG結(jié)合 分子的IC50或ND50大不超過10%。在備選方案中，短語“不干擾抗原結(jié)合親和力或特異 性”意指，NogoA或NiG結(jié)合分子的PEG連接形式保留該多肽的非PEG化形式的至少90% 抗原結(jié)合活性。可以用于增加體內(nèi)半衰期的PEG或其他聚合物一般大小是約5，000至50，000道 爾頓，例如約 5，OOOkD-IO, OOOkD,5, OOOkD-15, OOOkD,5, 000kD-20，000kD、5, 000-25，OOOkD、 5，000-30, OOOkD,5, 000kD-35, OOOkD,5, 000kD-40, OOOkD、或約 5，000kD-45, OOOkD。聚合物
大小的選擇依賴于復(fù)合物的預(yù)期用途。例如，當(dāng)希望穿透固體組織例如腫瘤時，有利地使 用約5，OOOkD左右的較小聚合物。相反，當(dāng)希望使復(fù)合物維持在循環(huán)中時，可以使用例如 25，OOOkD至40，OOOkD或更多的較大聚合物。本發(fā)明的藥物組合物可以包括“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明NogoA或 Mg結(jié)合分子?！爸委熡行Я俊敝?，在所需劑量和時間段，有效達(dá)到期望的治療結(jié)果的量。本 發(fā)明NogoA或Nig結(jié)合分子的治療有效量可以根據(jù)下述因素而改變，例如疾病狀態(tài)，個體的 年齡、性別和體重，以及本發(fā)明NogoA或Mg結(jié)合分子在個體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力。治療 有效量也是這樣的量，在該量，本發(fā)明的NogoA或Mg結(jié)合分子的治療有利效應(yīng)超過了其任 何毒性或有害效應(yīng)。“預(yù)防有效量”指，在所需劑量和時間段，有效達(dá)到所需預(yù)防結(jié)果的量。如本文所使用的，短語“特異性結(jié)合”指，通過表面等離子體共振分析，使用例如 BIAcore (r)表面等離子體共振系統(tǒng)和BIAcore (r)動力學(xué)評估軟件，確定本發(fā)明NogoA或 Nig結(jié)合分子以1 μ M或更低的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合抗原。如果本文不另行說明，那么“多肽”包括任何肽或蛋白質(zhì)，包括通過肽鍵彼此連接 的氨基酸，具有在N末端處開始且在C末端處結(jié)束的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是 單克隆抗體，更優(yōu)選是嵌合(也稱為V移植的)或人源化(也稱為CDR移植的)單克隆抗 體。人源化(也稱為CDR移植的)單克隆抗體可以包括或不包括引入受體抗體的構(gòu)架(FR)序列內(nèi)的進(jìn)一步突變。如本文所使用的，多肽的功能衍生物包括與本發(fā)明的多肽具有共同的定性生物學(xué) 活性的分子，即具有與人NogoA或人MG結(jié)合的能力。功能衍生物包括本發(fā)明多肽的片段 和肽類似物。片段包括在本發(fā)明多肽(例如具體公開序列)的序列內(nèi)的區(qū)域。術(shù)語“衍生 物”用于定義本發(fā)明多肽(例如具體公開序列)的氨基酸序列變體和共價修飾。根據(jù)本發(fā) 明的多肽(例如具體公開序列)，例如輕和重鏈的高變區(qū)，的功能衍生物，優(yōu)選與根據(jù)本發(fā) 明的多肽(例如具體公開序列)的氨基酸序列具有至少約90%，更優(yōu)選至少約91、92、93、 94、95、96、97、98、99%的全序列同一性，并且基本上保留結(jié)合人NogoA或人NiG的能力。如本文所使用的，短語“可變結(jié)構(gòu)域”指具有來自哺乳動物種系免疫球蛋白V區(qū)的 序列的多肽。在如下情況下，序列“來自哺乳動物種系V區(qū)”當(dāng)該序列分離自人個體時；自 非人動物例如嚙齒類動物例如小鼠分離時，其中該非人動物能夠響應(yīng)免疫原產(chǎn)生人免疫球 蛋白，更優(yōu)選地所述非人動物無法產(chǎn)生其物種內(nèi)源的抗體；從經(jīng)克隆的人抗體基因序列文 庫(或人抗體V區(qū)基因序列文庫)中分離時；或當(dāng)使用經(jīng)克隆的人種系V區(qū)序列產(chǎn)生一個或 多個多樣化序列(通過隨機(jī)或靶向誘變)并然后就與期望靶抗原的結(jié)合進(jìn)行選擇時。最低 限度，人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域與天然存在的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列具有至少85% 氨基酸相似性(包括例如87%、90%、93%、95%、97%、99%或更高相似性)。備選地或另 外地，“可變結(jié)構(gòu)域”是包括4個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)(FW1-FW4)(優(yōu)選是人的)， 如Kabat等人(1991，)所述的構(gòu)架區(qū)，的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域?！翱勺兘Y(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)”包 括a)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，優(yōu)選人的，和b)包括人構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列的至少8個連續(xù)氨 基酸的構(gòu)架區(qū)?？贵w可變結(jié)構(gòu)域可以包括FW1-FW4的氨基酸序列，其中所述序列與種系抗 體基因區(qū)段(優(yōu)選人的)所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同；或它還可以包括這樣的 可變結(jié)構(gòu)域，其中相對于種系抗體基因區(qū)段(優(yōu)選人的)所編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)氨基酸序列， FW1-FW4序列總共包含不超過10個氨基酸的序列差異(例如不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10個氨基酸序列差異)。如本文所使用的，短語“通用構(gòu)架”指，與Kabat等人(1991)定義 的序列保守的抗體區(qū)域相對應(yīng)的，或與Chothia禾口 Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196 :910_917 定義的人種系免疫球蛋白庫(repertoire)或結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的單個抗體構(gòu)架序列。本發(fā)明提 供了單個構(gòu)架或一組此類構(gòu)架的用途，已發(fā)現(xiàn)所述構(gòu)架允許通過單獨(dú)高變區(qū)的變異而獲得 基本上任何的結(jié)合特異性。在一個實施方案中，高變區(qū)或CDRs特異性結(jié)合NogoA和/或 NiG。術(shù)語“共價修飾”包括根據(jù)本發(fā)明的多肽(例如具體公開序列)；或其片段由有機(jī) 蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)衍生試劑的修飾，與異源多肽序列的融合，和翻譯后修飾。(例 如具體公開序列的)共價修飾多肽仍具有通過交聯(lián)與人NogoA或人MG結(jié)合的能力。共 價修飾可以通過下述方式常規(guī)引入使所靶向的氨基酸殘基與有機(jī)衍生試劑反應(yīng)，所述有 機(jī)衍生試劑能夠與所選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)；或利用在所選擇的重組宿主細(xì)胞中起作 用的翻譯后修飾機(jī)制。某些翻譯后修飾是重組宿主細(xì)胞對所表達(dá)的多肽作用的結(jié)果。谷 氨酰胺和天冬酰胺殘基常常在翻譯后被脫酰胺成為相應(yīng)的谷氨酸和天冬氨酸殘基。備選 地，這些殘基可以在輕度酸性條件下脫酰胺。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基 化，絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨 基的甲基化，參見例如Τ· Ε· Creighton，Proteins-Structure and Molecular Properties，W. H. Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁(1983)。共價修飾可以包括包含根據(jù)本 發(fā)明的多肽，例如特定序列及其氨基酸序列變體，的融合蛋白，例如免疫粘附素，和與異源 信號序列的N末端融合物。就天然多肽及其功能衍生物而言，“同一性”在本文中定義為，在使序列比對且需 要時引入空位以達(dá)到最大同一性百分比后，在不將任何保守置換考慮為序列同一性的一部 分的情況下，在候選序列中與相對應(yīng)天然多肽的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。N或C末 端延伸和插入都不應(yīng)解釋為減少同一性。用于比對的方法和計算機(jī)程序是眾所周知的，參 見Altschul等人同上?！鞍被帷敝杆刑烊淮嬖诘腖- α -氨基酸，例如且包括D-氨基酸。氨基酸可以通 過眾所周知的單字母或三字母命名法進(jìn)行標(biāo)識。術(shù)語“氨基酸序列變體”指與根據(jù)本發(fā)明的多肽(例如具體公開序列)相比較，在 其氨基酸序列中具有某些差異的分子。根據(jù)本發(fā)明的多肽(例如具體公開序列)的氨基 酸序列變體仍可以具有與人NogoA或人NiG結(jié)合的能力。置換變體是在根據(jù)本發(fā)明的多肽 (例如具體公開序列)中除去至少一個氨基酸殘基且在相同位置在其位置處插入不同氨基 酸的那些多肽。置換可以是單個的，其中分子中僅一個氨基酸已被置換，或可以是多個的， 其中在同一分子中有2個或更多個氨基酸已被置換。插入變體是在根據(jù)本發(fā)明的多肽(例 如具體公開序列)中于緊鄰特定位置的氨基酸處具有插入的一個或多個氨基酸的那些多 肽。與氨基酸緊鄰意指與該氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團(tuán)連接。缺失變體是在根據(jù) 本發(fā)明的多肽例如具體公開序列中具有一個或多個氨基酸被去除的那些多肽。通常，缺失 變體在分子的特定區(qū)域中具有一個或兩個氨基酸的缺失。本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。一般地，執(zhí)行本發(fā)明所需的核 酸分子和載體構(gòu)建體可以如標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊中所述進(jìn)行構(gòu)建和操作，例如Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning :A LaboratoryManual ,Cold Spring Harbor, USA。就這點而言， 可以構(gòu)建一種或多種編碼結(jié)合分子的DNA分子，將其置于合適的控制序列下并且轉(zhuǎn)移到合 適的宿主生物體內(nèi)用于表達(dá)。非常一般地，本發(fā)明因此提供了，(i)編碼本發(fā)明的高變區(qū)、抗原結(jié)合位點、抗體鏈或其片段、或單結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子 的DNA分子；和(ii)本發(fā)明的DNA分子通過重組方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合分子的用途。考慮到本文提供的信息，即高變區(qū)的氨基酸序列和編碼其的DNA序列，現(xiàn)有技術(shù) 狀況使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合成本發(fā)明的DNA分子。用于構(gòu)建可變結(jié)構(gòu)域基因的方法 例如在EP 239 400中描述，并且可以簡要概述如下克隆編碼具有無論何種特異性的單 克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域的基因。確定編碼構(gòu)架區(qū)和高變區(qū)的DNA區(qū)段，去除編碼高變區(qū)的 DNA區(qū)段，使編碼構(gòu)架區(qū)的DNA區(qū)段通過合適限制性位點在接合處融合在一起。限制性位 點可以通過標(biāo)準(zhǔn)操作誘變DNA分子而在合適位置處產(chǎn)生。通過DNA合成，根據(jù)上文給出的 CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3、CDR-H3-6A3、CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 和 CDR-L3-6A3 的序列，制 備合成的雙鏈CDR盒。這些盒提供粘性末端，從而它們可以通過標(biāo)準(zhǔn)方案在接合處與構(gòu)架 連接，獲得編碼免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的DNA分子。此外，為了獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA構(gòu)建體，自生產(chǎn)性雜交瘤細(xì)胞系得到mRNA并非是必需的。PCT申請WO 90/07861給出了在已知僅基因核酸序列的書寫信息的 情況下，通過重組DNA技術(shù)，產(chǎn)生單克隆抗體的全面指導(dǎo)。該方法包括合成多個寡核苷酸、通過PCR方法擴(kuò)增這些寡核苷酸、及將其拼接以 給出所需DNA序列。眾多載體是可公開獲得的，包括細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體和附加型載體。包 括一個或多個合適啟動子和/或編碼重和輕鏈恒定部分的基因的表達(dá)載體是可公開獲得 的。表達(dá)載體通常包含由宿主生物體識別的啟動子，所述啟動子與目的編碼序列可操作地 連接。此類啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。術(shù)語“可操作地連接”指并置，該并置導(dǎo)致所 述成分處于允許其以預(yù)期的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中。與編碼序列“可操作地連接的”控制序 列是以這樣的方式連接的，該連接使得編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下達(dá)到。 因此，制備本發(fā)明的DNA分子后，可以方便地將其轉(zhuǎn)移至合適的表達(dá)載體中。編碼單鏈抗體的DNA分子也可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法，例如如WO 88/1649中所述的方 法，制備。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的某些結(jié)合分子的重組手段包 括如下所述的第一和第二 DNA構(gòu)建體第一多核苷酸可以包括* SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15禾口 SEQ ID NO :16中所示的多核苷酸序列中的至 少一個；或* SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18禾口 SEQ ID NO 19中所示的多核苷酸序列中的至 少一個。根據(jù)本發(fā)明的另一多核苷酸包括* SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 中所示的多核苷酸序列；和* SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO 19 中所示的多核苷酸序列。在另一個實施方案中，多核苷酸包括* SEQ ID NO 6中所示的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 7中所示的多核苷酸序 列，或~k SEQ ID NO 26中所示的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 28中所示的多核苷酸 序列。在另外一個實施方案中，DNA構(gòu)建體編碼重鏈或其片段，并且包括a)編碼交替包括構(gòu)架區(qū)和高變區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域的第一部分，所述高變區(qū)順次包括 DNA-CDR-Hl-6A3 (SEQ ID NO :14)、DNA-CDR-H2_6A3 (SEQ ID NO :15)和 DNA-CDR-H3_6A3(SEQ ID NO 16)；此第一部分從編碼可變結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸的密碼子開始，且終止于編碼可 變結(jié)構(gòu)域的最后一個氨基酸的密碼子，和b)編碼重鏈恒定部分或其片段的第二部分，其從編碼重鏈恒定部分的第一個氨基 酸的密碼子開始，并且終止于編碼重鏈恒定部分或其片段的最后一個氨基酸的密碼子，隨 后為無義密碼子。優(yōu)選地，第二部分編碼人重鏈的恒定部分，更優(yōu)選人Y4鏈的恒定部分。該第二部 分可以是基因組來源的DNA片段(包括內(nèi)含子)或cDNA片段(不含內(nèi)含子)。在另一個實施方案中，DNA構(gòu)建體編碼輕鏈或其片段，并且包括
a)編碼交替包括構(gòu)架區(qū)和高變區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域的第一部分；所述高變區(qū)順次包括 DNA-CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :17)、DNA_CDR-L2_6A3 (SEQ ID NO :18)和 DNA-CDR-L3_6A3(SEQ ID NO 19)，此第一部分從編碼可變結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸的密碼子開始，并且終止于編碼 可變結(jié)構(gòu)域的最后一個氨基酸的密碼子，和b)編碼輕鏈恒定部分或其片段的第二部分，其從編碼輕鏈恒定部分的第一個氨基 酸的密碼子開始，并終止于編碼輕鏈恒定部分或其片段的最后一個氨基酸的密碼子，隨后 為無義密碼子。優(yōu)選地，第二部分編碼人輕鏈的恒定部分，更優(yōu)選人κ鏈的恒定部分。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以有利地進(jìn)一步包括位于已描述的部分上游并且編碼前 導(dǎo)肽的另一部分；此另外的部分從編碼前導(dǎo)肽的第一個氨基酸的密碼子開始并終止于該前 導(dǎo)序列的最后一個氨基酸。前導(dǎo)肽是這些鏈自表達(dá)它們的宿主生物體分泌所需的，隨后被 宿主生物體去除。優(yōu)選地，DNA構(gòu)建體的這個部分編碼這樣的前導(dǎo)肽，其具有與SEQ ID NO 20中所示的重鏈前導(dǎo)序列的氨基酸序列(IgGl的重鏈，起始于位置-19處的氨基酸，并終止 于位置-1處的氨基酸)基本上相同的氨基酸序列，具有SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列 (IgGl的輕鏈，起始于位置-20處的氨基酸，并終止于位置-1處的氨基酸)，具有與SEQ ID NO 30中所示的重鏈前導(dǎo)序列的氨基酸序列(IgG4的重鏈，起始于位置-19處的氨基酸，并 且終止于位置-1處的氨基酸)基本上相同的氨基酸序列，或具有SEQ ID N0:31中所示的 氨基酸序列(IgG4的輕鏈，起始于位置-20處的氨基酸，并且終止于位置-1處的氨基酸)。DNA構(gòu)建體各自置于合適控制序列的控制下，特別地置于合適啟動子的控制下?？?以使用任何類型的啟動子，前提是它適合于DNA構(gòu)建體將轉(zhuǎn)移到其內(nèi)用于表達(dá)的宿主生物 體。然而，如果表達(dá)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)生，那么特別優(yōu)選使用免疫球蛋白基因的啟動子。期望抗體可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。合適的轉(zhuǎn)基因動物可以根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，包括將置于合適控制序列下的第一和第二 DNA構(gòu)建體顯微注射到卵內(nèi)， 將如此制備的卵轉(zhuǎn)移到合適的假孕雌性體內(nèi)，選擇表達(dá)期望抗體的后代。當(dāng)抗體鏈必須在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生時，首先必須將這些DNA構(gòu)建體插入單個表達(dá) 載體或2種分開但相容的表達(dá)載體內(nèi)，后面一種可能方案是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明還提供了能夠在原核或真核細(xì)胞系中復(fù)制的表達(dá)載體，其包括上文 描述的至少一個DNA構(gòu)建體。本發(fā)明因此提供了包括本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及表達(dá)系統(tǒng)， 其中當(dāng)所述表達(dá)系統(tǒng)或其部分存在于相容的宿主細(xì)胞中時，所述表達(dá)系統(tǒng)或其部分能夠產(chǎn) 生本發(fā)明的多肽。還公開了包括本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的分離的宿主細(xì)胞。本申請中因此還涉及借助于重組DNA技術(shù)或借助于化學(xué)合成，用于產(chǎn)生結(jié)合分 子、多核苷酸、表達(dá)載體的方法。包含DNA構(gòu)建體的每種表達(dá)載體因此待轉(zhuǎn)移到合適的宿主生物體內(nèi)。當(dāng)DNA構(gòu)建 體分開插在2種表達(dá)載體上時，它們可以分開轉(zhuǎn)移，即一種類型的載體/細(xì)胞，或共轉(zhuǎn)移，這 個后面一種可能方案是優(yōu)選的。合適的宿主生物體可以是細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞系，后 者是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，哺乳動物細(xì)胞系是淋巴來源的，例如骨髓瘤、雜交瘤或正常永生化 B細(xì)胞，但不表達(dá)任何內(nèi)源抗體重或輕鏈。還優(yōu)選宿主生物體每細(xì)胞包含大量拷貝的載體，所述載體包含一種或多種DNA構(gòu)建體。如果宿主生物體是哺乳動物細(xì)胞系，那么此期望目的可以通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增拷 貝數(shù)目來達(dá)到。擴(kuò)增方法通常由就對藥物增加的抗性進(jìn)行的選擇來組成，其中所述抗性由 表達(dá)載體編碼。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的多鏈結(jié)合分子的方法，其包括 (i)培養(yǎng)用本發(fā)明的至少一種DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物體，和(ii)從培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的 活性結(jié)合分子。備選地，重和輕鏈可以例如分開回收，并且在體外重折疊后重構(gòu)為活性結(jié)合分子。 重構(gòu)方法是本領(lǐng)域眾所周知的；方法的例子在EP 120 674或EP 125 023中特別提供。因此，方法還可以包括(i)培養(yǎng)用編碼本發(fā)明的結(jié)合分子的第一 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的第一生物體，并且從 培養(yǎng)物中回收第一結(jié)合分子，和(ii)培養(yǎng)用編碼本發(fā)明的結(jié)合分子的第二 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的第二生物體，并且從 培養(yǎng)物中回收第二結(jié)合分子，和(iii)由(i)中獲得的第一結(jié)合分子和(ii)中獲得的第二結(jié)合分子在體外重構(gòu)本 發(fā)明的活性結(jié)合分子。需要時，可以產(chǎn)生更多種生物體或細(xì)胞，高達(dá)3、4、5、6、7或8種，并且用于提供更 多種結(jié)合分子。類似地，還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的單鏈或單結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的方法，其包括(i)培養(yǎng)分別用編碼本發(fā)明的單鏈或單結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的生物 體，和(ii)從培養(yǎng)物中回收所述分子。本發(fā)明的NogoA和NiG結(jié)合分子可以顯示出極佳的神經(jīng)再生活性，如在如下所述 的顆粒細(xì)胞神經(jīng)突增生模型中顯示的。1.顆粒細(xì)胞神經(jīng)突增生測定法(在體外)獲取腦組織(皮質(zhì)和腦干)，并且對于每個測定法，如先前所述新鮮制備蛋白質(zhì)提 IX^lJ (Spillmann^A 1998, Identification andcharacterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220)，J BiolChem. 1998 Jul 24 ；273 (30) 19283-93) 簡言之，將 一片冷凍組織(例如0. 25g)在3-4體積具有蛋白酶阻斷劑(10 μ g/ml抑酶肽-5 μ g/ml亮 抑酶肽-1μ g/ml 抑胃酶肽-ImM PMSF)的 6OmM Chaps-20mM Tris pH8. O-ImM EDTA 中在 4°C勻漿。將勻漿物放到旋轉(zhuǎn)器上在4°C 30分鐘，并且在TLA 100. 3轉(zhuǎn)子(Beckman TL-100 超速離心機(jī))中在100' OOOg在4°C離心45分鐘。自上清液，使用吸收分光光度計測定蛋 白質(zhì)濃度。如先前所述從出生后5-7天的大鼠小腦組織的胰蛋白酶消化物中純化小腦顆粒 細(xì)胞(Niederost 等人 1999，Bovine CNS myelin contains neuritegrowth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfateproteoglycans, J Neurosci. 1999 Oct 15； 19 (20) 8979-89) 0隨后本發(fā)明的結(jié)合分子在測試基底上預(yù)溫育30分鐘，并且在加入 細(xì)胞前去除。加入小腦顆粒細(xì)胞并且溫育24小時。為了停止實驗，將2ml 4%緩沖的甲醛 緩慢加入培養(yǎng)皿中。如上所述制備的猴腦膜蛋白質(zhì)提取物以15 μ g蛋白質(zhì)/cm2培養(yǎng)皿過 夜吸附在 Greiner 4 孑L皿(Greiner, Nuertingen, Germany)上。皿用溫漢克氏(Hank' s)溶液洗滌3次，之后神經(jīng)元鋪板。如上所述制備出生后(5-7)天的大鼠小腦顆粒細(xì)胞，并且 以50，000細(xì)胞/cm2鋪平板。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，固定，并且用神經(jīng)突標(biāo)記 MAB lb (Chemicon monoclonal Ab, 1 200)進(jìn)行免疫染色。對于細(xì)胞體的染色，在用MABlb 染色后使用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基-吲哚，二鹽酸鹽，來自Molecular Probes) 0對 于抗體實驗，抗Nogo-A mAbs或?qū)φ誌gG Ab在皿上預(yù)溫育30分鐘并且隨后去除。使用40X物鏡，對每個孔，在距孔邊緣規(guī)定距離處隨機(jī)采取4個視野，計數(shù)神經(jīng)突 與放置于通過觀察視野中心的一條線的所有相交點。還計數(shù)接觸線的所有細(xì)胞體，并且如 先前報告的對于每個孔計算神經(jīng)突/細(xì)胞體的指數(shù)比(Simonen等人，2003，Neuron 38， 201-211)。所有計數(shù)在編碼的實驗上盲法實施，并且表示為神經(jīng)突/細(xì)胞體指數(shù)。結(jié)果表 示為平均指數(shù)神經(jīng)突/細(xì)胞體?？梢杂^察到通過與本發(fā)明的結(jié)合分子預(yù)溫育在上文制備的脊髓提取物的非允許 環(huán)境中小腦顆粒細(xì)胞的神經(jīng)突增生被增強(qiáng)。本發(fā)明的分子的中和活性也可以通過在下文簡述的體內(nèi)脊髓損傷模型中測量再 生性萌芽和神經(jīng)突增生及功能恢復(fù)進(jìn)行評估。2.在大鼠和猴中的脊髓損傷模型(在體內(nèi))通過在第8胸椎水平雙側(cè)橫斷脊髓的背側(cè)(dorsal half)，通過顯微手術(shù)損傷成 年Lewis大鼠。椎板切除術(shù)、麻醉和手術(shù)在Schnell和Schwab 1993 (Eur. J. Neurosci. 5 1156-1171)中描述。神經(jīng)解剖學(xué)追蹤通過將順向示蹤劑生物素葡聚糖胺(BDA)注射到與 泵或移植物相對側(cè)的皮質(zhì)內(nèi)來追蹤運(yùn)動和感覺皮質(zhì)脊髓束。BDA在10-14天內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至脊髓， 并且如Brosamle等人，(2000J. Neurosci. 20 =8061-8068)中所述使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 作為底物進(jìn)行顯現(xiàn)。破壞脊髓T8段的約40%的脊髓損傷(主要在背側(cè)中，包括2個主要頸脊髓橫切 (CSTs))后2周在對照動物中CST的追蹤顯示束的中等程度的反應(yīng)性萌芽。這個現(xiàn)象與 文獻(xiàn)中眾所周知的響應(yīng)損傷的自發(fā)性萌芽相對應(yīng)。用本發(fā)明的結(jié)合分子或用遞送本發(fā)明的 結(jié)合分子的泵處理的損傷大鼠可以顯示在損傷部位處增強(qiáng)的萌芽，和受損軸突的再生、受 損神經(jīng)突的神經(jīng)突增生。此外，動物可以顯示感覺運(yùn)動功能的改良恢復(fù)。此類功能試驗先 前已有描述(Merkler 等人，2001，J. Neuroscience 21，3665-73)。 3.抗體在成年猴CNS中的組織分布將本發(fā)明的結(jié)合分子純化為IgG并且在PBS中濃縮至3mg/ml。小鼠血清來源的 IgG(Chemicon Int.，Temecula/CA, USA)或針對小麥生長素的 mAB (AMS Biotechnology, 0xon/UK)用作對照處理。在這個研究中使用2只雄性成年恒河猴(Macaca fascicularis) 用于鞘內(nèi)輸注。手術(shù)操作通過肌內(nèi)注射氯胺酮(Ketalar(r) ；Parke-Davis, 5mg/kg, i. m.)誘導(dǎo)麻醉。肌內(nèi) 注射阿托品(0.05mg/kg)以減少支氣管分泌物。將靜脈內(nèi)導(dǎo)管置在隊列靜脈中，用于持續(xù) 灌注丙泊酚(Fresenius (r))和葡萄糖4%溶液的混合物(1體積丙泊酚和2體積葡萄 糖溶液)，誘導(dǎo)更深層的麻醉。動物隨后放置在立體定位(stereotaxic)架中。在無菌條 件下，執(zhí)行從C2到Thl的垂直中線皮膚切開。切開筋膜，暴露C2至Thl棘突。牽縮椎旁肌 肉，并且解剖C6、C7和Thl椎板。隨后執(zhí)行完全的C6椎板切除術(shù)和上部C7半椎板切除術(shù)。暴露硬膜，并且在第7和第8頸椎段上縱向切開，與第6頸椎板覆蓋的脊椎部分的吻側(cè)區(qū) (rostral zone)相對應(yīng)。將與遞送hNogo-A抗體的滲透泵(Alzet (r)，2ML1 ；流動:50μ g/ 小時)連接的聚乙烯管(IOcm長)插在硬膜下，并且向吻側(cè)推數(shù)毫米，用縫線縫在硬膜上。 放置滲透泵，并將其固定在一個腔中，所述腔在左側(cè)在比椎板切除術(shù)低數(shù)厘米的背部肌肉 塊中形成。管沿著其軌道用縫線固定在肌肉組織上。縫合肌肉和皮膚，并且動物通常在用 丙泊酚靜脈灌注中斷后15-30分鐘從麻醉中蘇醒。動物用抗生素(氨芐西林10%，30mg/ kg, s. c)進(jìn)行手術(shù)后處理。在一周中每天給予另外劑量的卡洛芬。猴在植入滲透泵后8天處死。如上所述，首先用氯胺酮誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜，隨后為通 過腹膜內(nèi)(i.P.)注射致死劑量的戊巴比妥(90mg/kg)獲得深層麻醉。動物經(jīng)心臟 (transcardially)灌注0. 4升0. 9%鹽水，隨后為4升固定劑(多聚甲醛在0. IM磷酸鹽緩 沖液中的4%溶液，pH = 7. 6)。用濃度漸增的3種葡萄糖溶液(在固定劑中10%，在磷酸 鹽緩沖鹽水中20%和30% )持續(xù)灌注。組織學(xué)操作、免疫熒光和免疫組織化學(xué)小心解剖猴的腦和脊髓，在30%蔗糖中冷凍保護(hù)，并且在cryostate中以40 μ m進(jìn) 行切片。為檢測所灌注的mABs，使用抗人二抗(JacksonLaboratories)。對于雙重標(biāo)記，可 以使用下述抗體用于內(nèi)源NogoA的兔AS472 (親和力純化的)(Chen，2000)，用于星形膠質(zhì) 細(xì)胞的針對GFAP的兔抗體，和用于溶酶體定位的針對組織蛋白酶D(DAKO)的兔抗體。所有 抗血清通過TRITC或FITC偶聯(lián)的相應(yīng)二抗，或使用ABC-DAB系統(tǒng)(Vector)顯現(xiàn)。切片通 過表面熒光在Zeiss Axiophot上或通過共聚焦顯微術(shù)(ZEISS LSM 410)進(jìn)行分析。在輸注部位和其6cm尾側(cè)處進(jìn)行脊髓分析。高水平的本發(fā)明結(jié)合分子存在于輸注 部位。在更尾側(cè)的脊髓中，中央管和脊髓表面被強(qiáng)烈標(biāo)記，而灰質(zhì)和白質(zhì)顯示更同質(zhì)的標(biāo) 記，然而，這是特異性的并且明顯超過本底。相似情況存在于前腦中，其中表面和腦室被強(qiáng) 標(biāo)記且Nogo-A抗體良好滲透到實質(zhì)內(nèi)。這些實驗顯示脊柱鞘內(nèi)輸注針對CNS細(xì)胞表面抗原的抗體將導(dǎo)致本發(fā)明的結(jié)合 分子和抗體通過CSF循環(huán)在內(nèi)部(腦室、中央管)和外部流體空間中的良好分布。該IgG 抗體良好滲透到腦和脊髓組織內(nèi)。盡管陰性對照IgG抗體被快速洗掉，但針對Nogo-A的抗 體保留在腦和脊髓組織中。4.在猴中檢測脊髓損害的神經(jīng)修復(fù)和功能改善通過肌內(nèi)注射氯胺酮(Ketalar(r) ；Parke-Davis, 5mg/kg, i. m.)誘導(dǎo)麻醉。肌內(nèi) 注射阿托品(0.05mg/kg)以減少支氣管分泌物。將靜脈內(nèi)導(dǎo)管置于隊列靜脈中，用于持續(xù) 灌注丙泊酚(Fresenius (r))和葡萄糖4%溶液的混合物(1體積丙泊酚和2體積葡萄 糖溶液)，誘導(dǎo)更深層的麻醉。動物隨后放置在立體定位架中。在無菌條件下，執(zhí)行從C2到 Thl的垂直中線皮膚切開。切開筋膜，暴露C2至Thl棘突。牽縮椎旁肌肉，并且解剖C6、C7 和Thl椎板。隨后執(zhí)行完全的C6椎板切除術(shù)和上部C7半椎板切除術(shù)。為了緊靠損傷部位 遞送分子，將與泵連接的聚乙烯管的游離端固定在硬膜下于損傷吻側(cè)數(shù)毫米處。手指靈活性行為試驗可以根據(jù)公開的操作執(zhí)行。通過將坐在靈長類動物椅上的猴放置在包含隨機(jī)分布的50個洞的Perspex改 良的“Brinkman板"(10cmx20cm)前，訓(xùn)練手指靈活性；其中25個洞水平向并且25個 洞為垂直向{Liu, 1999 15428/id ;Rouiller，199813239/同上}. 2. 7。纖維的再生和萌芽可以如所述的進(jìn)行評估。在右半球中注射的順向示蹤劑是生物素化葡聚糖胺(BDA， Molecular Probe (r)，在鹽水中10 % )。在左半球中，注射熒光順向示蹤劑熒光素葡聚糖 (MolecularProbe (r)，在鹽水中 10% )?？梢匀缦惹霸敿?xì)描述{Rouiller，1994 8322/ 同 上}進(jìn)行組織學(xué)處理，以顯現(xiàn)示蹤劑。因此，本發(fā)明還提供了 (i)本發(fā)明的Nogo和NiG結(jié)合分子在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)，特別是人神經(jīng)系統(tǒng)，的神 經(jīng)修復(fù)中的用途，(ii)修復(fù)哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)，特別是人神經(jīng)系統(tǒng)，的神經(jīng)的方法，其包括給需要此 類治療的患者施用有效量的本發(fā)明的Nogo和NiG結(jié)合分子，或(iii)用于哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)，特別是人神經(jīng)系統(tǒng)，的神經(jīng)修復(fù)的藥物組合物，其 包括本發(fā)明的結(jié)合分子和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。因此，本發(fā)明提供了用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系 統(tǒng)和宿主細(xì)胞。特別地，所述結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或宿主細(xì)胞可以用于治 療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或用于制造用于治療外周(PNS)和/或中 樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。本發(fā)明還提供了包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑、以及根據(jù)本發(fā)明的 結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或宿主細(xì)胞的藥物組合物。還提供了包含所述結(jié)合分 子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或所述宿主細(xì)胞，或其藥學(xué)上可接受的衍生物的產(chǎn)品，所述 產(chǎn)品為用于在外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中同時、分開或相繼使用 的組合制劑。還涉及治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包括給需要此 類治療的受試者施用有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子、多核苷酸、表達(dá)載體或系統(tǒng)或宿主細(xì)胞。本發(fā)明在實施例中進(jìn)一步指出該藥物組合物和產(chǎn)品可以用于結(jié)合分子的緩慢釋 放和/或結(jié)合分子在損傷部位處的局部沉積。如本文所使用的，術(shù)語“緩慢釋放”或等價術(shù)語“控制釋放”或“延長釋放”是指這 樣的藥物制劑，其在施用于個體后歷經(jīng)一段時間釋放活性藥物，例如多肽藥物，包括本發(fā)明 的NogoA或NiG結(jié)合分子，例如針對NogoA或NiG的抗體。依賴于藥物制劑可以歷經(jīng)一段 時間，例如數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周或更長時間，發(fā)生的多肽藥物延長釋放，與標(biāo)準(zhǔn)制劑 不同，對于所述標(biāo)準(zhǔn)制劑，基本上整個劑量單位可經(jīng)由血流而獲得立即吸收或立即分布。優(yōu) 選的延長釋放制劑自單次施用導(dǎo)致維持例如8小時或更多、12小時或更多、24小時或更多、 36小時或更多、48小時或更多、60小時或更多、72小時或更多、84小時或更多、96小時或更 多、或甚至例如1周或2周或更多，例如1個月或更多的循環(huán)藥物水平。延長釋放制劑在本 領(lǐng)域中得到充分描述，并且可以根據(jù)優(yōu)選的抗體釋放譜進(jìn)行選擇。合適的聚合物包括生物 可降解和生物不可降解材料例如聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)。如本文所使用的，術(shù)語“表位”指通常被免疫球蛋白VH/VL對結(jié)合的結(jié)構(gòu)單位。表 位定義抗體的最小結(jié)合位點，并且因此是抗體的特異性的靶標(biāo)。在單結(jié)構(gòu)域抗體的情況下， 表位是由分離的單個可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)單位。如本文所使用的，術(shù)語“中和”，當(dāng)就本文所描述的NogoA或NiG結(jié)合分子而言使用 時，意指結(jié)合分子干擾NogoA或NiG的可測量活性或功能。如果NogoA或NiG結(jié)合分子可以使靶抗原例如Nogo或NiG的可測量活性或功能減少至少50%，并且優(yōu)選至少60%、70%、 80%,90%,95%或更多(直至且包括100%抑制)，則NogoA或NiG結(jié)合分子是“中和性”多 肽。靶抗原的可測量活性或功能的這種減少可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員，使用測量此活性或 功能的一或多種指示劑的標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行評估。作為例子，當(dāng)靶是Nogo或MG時，中和活性 可以使用下文所述的神經(jīng)突生長測定法進(jìn)行評估。特別地，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用于神經(jīng)纖維受損后的軸突再生和改善的萌芽。 因此，本發(fā)明的分子具有廣泛用途，特別是對于人受試者。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用 于治療外周(PNS)和中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)的各種疾病，即，更具體地，神經(jīng)變性疾病，例如阿 爾茨海默氏病，帕金森病，肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)，路易小體樣病或其他全面性癡呆，顱、腦 或脊髓創(chuàng)傷后的疾病，中風(fēng)或脫髓鞘疾病。此類脫髓鞘疾病包括但不限于多發(fā)性硬化癥、單 相脫髓鞘病、腦脊髓炎、多灶性白質(zhì)腦病、全腦炎、馬_比病、腦橋髓鞘脫失、腎上腺腦白質(zhì) 營養(yǎng)不良、佩-梅病、海綿狀變性、亞歷山大病、卡納萬病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和克拉伯 氏病。在一個例子中，本發(fā)明的結(jié)合分子的施用可以用于治療與NogoA蛋白質(zhì)相關(guān)的脫髓 鞘疾病。在另一個例子中，表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子的細(xì)胞可以移植至脊髓損傷部位，以促 進(jìn)遍及損傷部位的軸突生長。此移植的細(xì)胞可以提供用于在損傷或創(chuàng)傷后恢復(fù)脊髓功能的 手段。此細(xì)胞可以包括組織移植物或胎兒神經(jīng)的不同譜系的干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用于治療變性眼病癥，所述病癥可以直接或間接涉 及視網(wǎng)膜或角膜細(xì)胞變性，包括廣泛性缺血性視網(wǎng)膜病變、眼前部缺血性視神經(jīng)病變、所有 形式的視神經(jīng)炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、囊樣黃斑水腫(CME)、色素性 視網(wǎng)膜炎、斯塔加特病、Best卵黃狀視網(wǎng)膜變性、萊伯氏先天性黑蒙和其他遺傳性視網(wǎng)膜變 性、病理性近視、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和Leber遺傳性視神經(jīng)病變、角膜移植或角膜屈光手術(shù) 的后效應(yīng)、和皰疹角膜炎。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用于治療精神病病狀，特別是精神分裂癥和抑郁癥。對于這些適應(yīng)癥，合適劑量當(dāng)然將取決于例如待采用的本發(fā)明的具體分子、施用 方式以及待治療病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重度。一般而言，劑量優(yōu)選在1 μ g/kg/天到lmg/kg/天的 范圍內(nèi)。本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過泵方便地施用或作為治療劑在受損部位注射，例如它 們可以通過直接顱內(nèi)施用到CNS內(nèi)或鞘內(nèi)施用到脊髓內(nèi)而向損傷部位施用。脊髓周圍充滿 流體的空間被稱為蛛網(wǎng)膜下腔或鞘內(nèi)腔。腦脊髓液(CSF)流經(jīng)這個區(qū)域，浸浴且保護(hù)腦和 脊髓。鞘內(nèi)藥泵可以比口服藥物更有效得多地工作，因為它將藥物直接遞送到CSF內(nèi)，繞過 了 口服藥物通過身體的途徑。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，施用通過鞘內(nèi)施用來完成，例 如使用與便攜式泵連接的外置導(dǎo)管。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，使用鞘內(nèi)快速濃注。 用于藥物的鞘內(nèi)施用的合適手段和方法是本領(lǐng)域已知的。泵的非限制性例子是Alzet 泵和MedtronicSynchroMed 或isomed 輸注系統(tǒng)。結(jié)合分子可以連續(xù)輸注，或可以 優(yōu)選地以1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或30天的特定時間間隔施用固定劑量，例如通過在腦 脊髓液中的直接快速濃注。本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)或組合或與其他試劑順次組合提供。例如，本發(fā)明 的結(jié)合分子可以與抗炎劑，例如但不限于皮質(zhì)類固醇(在中風(fēng)或脊髓損傷后作為阻斷進(jìn)一步神經(jīng)元受損和抑制軸突再生的手段)，神經(jīng)營養(yǎng)因子例如神經(jīng)生長因子(NGF)、腦 源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，或用于神經(jīng)變性疾病的其他藥物，例如艾斯能(Exelon，tm) (Rivastigmine，利斯的明)或左旋多巴(L-D0PA (3，4-二羥基-L-苯丙氨酸))，組合施用。 用于治療中風(fēng)的其他合適組合伙伴是阿替普酶(Alt印lase)和去氨普酶(Desmot印lase) (DSPA，例如W090/09438中公開的)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了特別是用于治療中 風(fēng)的、包括本發(fā)明的結(jié)合分子和去氨普酶的組合，以及包括所述組合的藥物組合物。如本文 所使用的，當(dāng)2種藥劑同時施用或獨(dú)立地施用以致藥劑可以同時起作用時，這2種試劑被稱 作組合(聯(lián)合)施用。通過代碼號、通用名或商品名標(biāo)識的活性成分的結(jié)構(gòu)可以得自標(biāo)準(zhǔn)提綱"The Merck Index"的實際版本，或數(shù)據(jù)庫例如 Patents International (例如 IMS World Publications)或由IMS Health提供的其他數(shù)據(jù)庫。其相應(yīng)內(nèi)容通過引用在此合并。本領(lǐng) 域技術(shù)人員完全能夠識別這些活性成分，并且同樣能夠基于這些參考文獻(xiàn)進(jìn)行制造、以及 在體外和體內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)測試模型中檢測藥學(xué)適應(yīng)癥和性質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物可以以常規(guī)方式進(jìn)行制造。例如，包括本發(fā)明的分子的本發(fā) 明組合物優(yōu)選以凍干形式提供。為立即施用，可以將其溶解于合適的水性載體，例如無菌注 射用水或無菌緩沖生理鹽水中。為了幫助配制合適組合物，本發(fā)明的結(jié)合分子和任選地增強(qiáng)本發(fā)明結(jié)合分子的效 應(yīng)的第二藥物可以分開地包裝在相同容器內(nèi)，連同用于混合或相伴施用的說明書。在上文 提供了任選的第二藥物候選物。本發(fā)明結(jié)合分子和生長因子例如NGF的組合的協(xié)同效應(yīng)可以通過脊髓損傷模型 在體內(nèi)證明。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的藥物組合物用于制備本發(fā)明結(jié)合分子的緩慢釋放藥物的 用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的藥物組合物在制備用于使本發(fā)明結(jié)合分子在損傷部位局 部沉積的藥物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于緩慢釋放本發(fā)明的結(jié)合分子和用于在損傷部位局部沉積 本發(fā)明的結(jié)合分子的本發(fā)明藥物。本發(fā)明還涉及用于緩慢釋放本發(fā)明的結(jié)合分子和用于局部沉積本發(fā)明的結(jié)合分 子的方法。通過參考下述實施例將可以更全面地理解本發(fā)明。然而，這些實施例不應(yīng)解釋為 限制本發(fā)明的范圍。在下述實施例中，所有溫度是攝氏度(°C )。在實施例中提及的單克隆抗體是根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子，其包括由SEQ ID NO 5 表示的輕鏈可變區(qū)和由SEQ ID NO :4表示的重鏈可變區(qū)(6A3-IgGl)，或包括由SEQ ID NO: 25表示的輕鏈可變區(qū)和由SEQ IDNO 24表示的重鏈可變區(qū)(6A3_IgG4)。顯而易見的是，在上文給出的段落中，術(shù)語“包括”涵蓋術(shù)語“由......組成”。使用下述縮寫ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定法FACS熒光激活細(xì)胞分選術(shù)
FITC異硫氰酸熒光素FBS胎牛血清FCS小牛血清HCMV人巨細(xì)胞病毒啟動子IgG免疫球蛋白同種型GmAb單克隆抗體VH重鏈可變區(qū)VL輕鏈可變區(qū)LC 輕鏈HC 重鏈⑶R互補(bǔ)決定區(qū)BSA牛血清白蛋白aa氨基酸bp堿基對CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)HRP辣根過氧化物酶RT 室溫PBS磷酸鹽緩沖鹽水TBS Tris 緩沖鹽水CEA癌胚抗原IF免疫熒光IgG免疫球蛋白GPBS-T具有0. 05% Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水PFA多聚甲醛
實施例本發(fā)明通過下述非限制性實施例進(jìn)行舉例說明實施例1 :Medarex 6A3抗hu_NogoA單克隆抗體的序列。選擇對于NogoA的人NiG片段具有高親和力的人IgGl單克隆抗體。自小鼠 雜交瘤細(xì)胞克隆篩選該原始單克隆，其中所述雜交瘤細(xì)胞克隆通過標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)使 用"Medarex 小鼠〃獲得；“Medarex 小鼠〃是 MedarexInc.，Annandale，NJ 用人免疫球 蛋白基因通過重組方式重構(gòu)的小鼠。產(chǎn)生用人NiG免疫的Medarex小鼠、及產(chǎn)生其雜交瘤 是本領(lǐng)域熟知的；已遵循類似于WO 2005/028508中描述的那些條件。大多數(shù)雜交瘤的抗體 生產(chǎn)水平極低；因此，采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建專門化的表達(dá)載體，用于在細(xì)胞系中高水平生 產(chǎn)完整抗體或Fab片段。產(chǎn)生經(jīng)純化的Ab和Abs的Fab片段是眾所周知的，并且在例如WO 2005/028508中有詳細(xì)描述。已遵循相似步驟用于產(chǎn)生經(jīng)純化的6A3_mAb和6A3_Fab。通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))從雜交瘤mRNA擴(kuò)增編碼6A3_IgGl抗體的重和輕鏈的 可變區(qū)的cDNAs，克隆且通過測序進(jìn)行表征(

圖1和2 ；SEQ ID NO 7和6)。實施例2 =Fab和IgG4產(chǎn)生。
該6A3mAb具有IgGl同種型。人IgGl同種型抗體對于細(xì)胞Fc受體具有高親和力， 可以誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(AADC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) (Jerries等人，2002， Hezareh等人，2001)。此外，已報告，IgG mAbs可以經(jīng)由Fc受體介導(dǎo)的逆向胞轉(zhuǎn)作用，跨 越血腦屏障從腦中快速流出到血液(Zhang等人，2001)。為了去除6A3 IgGl mAb潛在的 Fc受體介導(dǎo)的相互作用，通過重組方式將其同種型轉(zhuǎn)換為IgG4，此外還用于重組產(chǎn)生單價 Fab片段，以在SP2/0細(xì)胞和大腸桿菌(E. coli)中高生產(chǎn)量表達(dá)。對該人抗NogoA抗體的重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的測序使得能夠在高生產(chǎn)量的生 產(chǎn)者細(xì)胞系中重組產(chǎn)生6A3-Fab片段和6A3-IgG4同種型抗體。對于Fab片段的大腸桿菌表達(dá)，cDNAs(SEQ ID NO :7和SEQ IDN0:6)被克隆 PASK116。用于克隆cDNAs的該質(zhì)粒提供小鼠IgGl/κ的恒定結(jié)構(gòu)域基因(Skerra，1994)。 抗體片段的2條多肽鏈在操縱子上在四環(huán)素啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下編碼。第一順反子編碼 Fab片段的重鏈部分。該VH結(jié)構(gòu)域在其N末端處與OmpA信號肽融合，并且在其C末端處與 鼠類IgGl的CHl結(jié)構(gòu)域融合。第二順反子編碼輕鏈，具有與PhoA前導(dǎo)肽和鼠類CHl結(jié)構(gòu) 域融合的VL結(jié)構(gòu)域。在誘導(dǎo)表達(dá)后，F(xiàn)ab片段的2條鏈同時分泌到大腸桿菌的周質(zhì)內(nèi)，在 其中發(fā)生蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成和鏈裝配。對于Fab在大腸桿菌中的表達(dá)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到 BMP用于大規(guī)模生產(chǎn)。對于為在SP2/0細(xì)胞中表達(dá)為IgG4抗體而進(jìn)行的6A3抗體的輕和重鏈可變區(qū)的 克隆，將相應(yīng)的cDNAs克隆到質(zhì)粒LCvec-AAL160和hcMCPf in內(nèi)。對于IgG4完整抗體的表 達(dá)，對于LC構(gòu)建體用NotI并且對于HC構(gòu)建體用PvuI進(jìn)行質(zhì)粒線性化，并且轉(zhuǎn)染到SP2/0 細(xì)胞內(nèi)。已成功地產(chǎn)生且純化了具有his-標(biāo)簽的6A3 IgG4和6A3 Fab單價片段。重組抗 體在BIAcore實驗中顯示出對于人NogoA片段hNiG的高親和力(參見下文)。相應(yīng)Kd值 是0. 14nM和1. InM,證實保留對于人NogoA片段hNiG的高親和力的Ab的正確和成功克隆
及重組表達(dá)。6A3-Ig4的重和輕鏈的編碼區(qū)和氨基酸序列顯示于圖3和4(SEQ IDNOs 24、25、28 和28)中。實施例3 :6A3-Ab的互補(bǔ)決定區(qū)的確定。使用在www. bioinf. org. uk/abs/的URL處的Kabat數(shù)據(jù)庫，確定6A3-抗體的可 變重和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)。Kabat定義基于序列變異性，并且是確定抗體可變區(qū)的CDRs的 最常用方法(Wu TT, Kabat EA, 1970) 所有6個CDR定義中除了 CDR-H2外與實驗測定的氨基酸序列良好相關(guān)，在CDR-H2 中于該CDR前的典型殘基應(yīng)是LEWIG，但發(fā)現(xiàn)的是LEWVA (圖5)。然而，許多變異對于CDR-H2 是可能的。實施例4 小鼠6A3-IgGl、6A3_IgG4和6A3Fab對NiG的生物傳感器親和力測量使用BIAcore 2000光學(xué)生物傳感器(Biacore，Uppsala, Sweden)，根據(jù)制造商的 說明書，通過表面等離子體共振(SI3R)，測量小鼠6A3-IgGlmAb、6A3-IgG4mAb和6A3Fab的親 和力。使用胺偶聯(lián)化學(xué)，將重組人NIG共價固定在CM5傳感器芯片的流體池上。簡言之；通 過注射包含0. 025M NHS和0. IM EDC的35 μ 1溶液，活化羧甲基化葡聚糖基質(zhì)。對于在傳 感器芯片上的固定，將重組人NIG在ρΗ 4的0. OlM檸檬酸緩沖液中稀釋，并且以5 μ 1/分鐘的流速注射，以達(dá)到允許親和力測量的偶聯(lián)水平。通過注射35 μ 1 IM乙醇胺鹽酸鹽(ρΗ 8.5)滅活剩余的NHS-酯基團(tuán)。通過注射5μ1 0. IM HC1，使傳感器芯片表面再生。對于親 和力的測量，以0. 50ηΜ至IOOnM的不同濃度以200 μ 1/分鐘的流速注射抗體。在每次注射 后，通過注射10 μ 1 0. IM HCl使傳感器芯片表面再生而不喪失在表面上的結(jié)合活性。使用 由制造商提供的BIAevaluations 3. 0軟件評估動力學(xué)常數(shù)ka和kd以及親和力常數(shù)KA和 KD。在BIAcore中的親和力測量使用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)(Biacore)，實時 測量了小鼠6A3-IgGl mAb、6A3-IgG4 mAb和6A3衍生的單價Fab片段對重組人NogoA的動 力學(xué)和親和力結(jié)合常數(shù)。對于這個分析，將重組人NIG偶聯(lián)在傳感器芯片表面上，并且注射 不同濃度的抗體。通過非線性曲線擬合自傳感圖(sensogram)得到結(jié)合相互作用的動力學(xué) 參數(shù)。對于6A3-IgG4、6A3-IgGl，6A3Fab，在這些抗體與人NIG平衡時的親和力常數(shù)在KDs 0. 13nM到2. 5nM的范圍內(nèi)。實施例5 抗 NogoA 抗體 NVP-6A3-Ab-NX_l 和 NVP-IIC7-NX-1 與內(nèi)源人 NogoA 的
社a
？口口。在這個實施例中，顯示了抗體與內(nèi)源人Nogo-A的結(jié)合。為此，測試了 2種人細(xì)胞 系，所述細(xì)胞系先前已被表征為顯示Nogo-A的少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)，并且隨后用 于抗體的特異性結(jié)合。人少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系M03. 13和HOG用于表征我們的2種抗Nogo-A 抗體 NVP-6A3-Ab-NX-l (6A3-Ab)和 NVP-IIC7Ab-NX_l (IIC7_Ab)對內(nèi)源 Nogo-A 的結(jié)合。細(xì) 胞可以進(jìn)一步用于開發(fā)生物測定法，表征用于臨床試驗的不同抗體批次。在2個獨(dú)立實驗 設(shè)置中，分析且檢測了在這些細(xì)胞中6A3-Ab與內(nèi)源人Nogo-A的結(jié)合。在第一步中，使用對于人Nogo-A特異的引物，通過RT-PCR分析M03 13細(xì)胞中 Nogo-A mRNA的存在。接著，通過M03 13細(xì)胞裂解物的免疫沉淀和免疫檢測來顯示2種抗 體與內(nèi)源Nogo-A的結(jié)合。最后，M03. 13和HOG細(xì)胞用6A3_Ab進(jìn)行特異性免疫熒光染色， 證實了來自免疫沉淀的結(jié)果。因此，發(fā)現(xiàn)6A3-AB和llC7_Ab都能夠與內(nèi)源人Nogo-Α特異性結(jié)合。方法細(xì)胞系M03.13 細(xì)胞得自 N. Cashman 博士，University of Toronto。它們起源自 人橫紋肌肉瘤(RD)的6-硫代鳥嘌呤-抗性突變體與培養(yǎng)自手術(shù)標(biāo)本的成人少突膠質(zhì)細(xì)胞 的融合物。HOG細(xì)胞得自G.Dawson博士，University of Chicago。這種細(xì)胞系自手術(shù)取 出的oligodenroglioma(少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤)建立。所有細(xì)胞在補(bǔ)充有Glutamax、10%胎牛 血清和青霉素/鏈霉素的高葡萄糖達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Gibco)中進(jìn)行培養(yǎng)。RT-PCR 總 RNA 使用 Tripure 試劑(Roche Diagnostics)由 5χ105Μ03· 13 細(xì)胞 制備。在DNA酶處理后，使用Omniscript RT(Qiagen)和寡dT-引物在20 μ 1總體積中 逆轉(zhuǎn)錄Iyg RNA。用于PCR的引物對于Nogo-A是特異的，擴(kuò)增起始于全長人Nogo-A 的 bp 位置 1197 的 194bp 片段(5 ‘ -TGAGGGAAGTAGGGATGTGC-S ‘ (SEQ ID NO 32), 5 ‘ -CAGGTGATGTACGCTCTGGA-S ‘ (SEQ ID NO :33))。使用 2 μ 1 cDNA (或 0. 1 μ g RNA-RT)、 5μ 1 IOx 緩沖液、3 μ 1 dNTPs (各 5mM)、2. 5μ 1 5'弓| 物(10 μ Μ)、2. 5 μ 1 3'弓| 物 (10 μ Μ)、0. 5 μ 1 HotStar Taq-聚合酶(Qiagen)和 34. 5 μ 1 Η20 設(shè)置反應(yīng)。使用下述 PCR 循環(huán)95°C 15 分鐘，(94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 15 秒)x35，72°C 10 分鐘，—> 4°C。在PCR完成后，在2%溴化乙啶瓊脂糖凝膠上分析10μ 1等分試樣。免疫沉淀和免疫檢測對于每個ΙΡ，生長至匯合的Μ03. 13細(xì)胞的1個IOcm 0培 養(yǎng)皿用PBS進(jìn)行洗滌，并且細(xì)胞在包含完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)的 500 μ 1 M-PER哺乳動物蛋白質(zhì)提取試劑(Pierce)中裂解。裂解物的可溶部分用蛋白質(zhì) G-瓊脂糖(Sigma)在RT(室溫)預(yù)凈化15分鐘。向預(yù)凈化的上清液中加入新鮮的蛋白質(zhì) G-瓊脂糖和相應(yīng)抗體(50nM終濃度)，并且在4°C在旋轉(zhuǎn)振蕩器上溫育4小時?？贵w是6A3 IgG4、llC7 IgGl或針對無關(guān)蛋白質(zhì)(癌胚抗原)的抗-CEAIgG4(其充當(dāng)陰性對照)。每 種上清液的等分試樣保留用于分析未結(jié)合的級分；瓊脂糖用TNS緩沖液(IOmM TrisHCl pH 7. 8,1% (w/v)N-月桂酰肌氨酸(Laurylsarcosine) UOOmM NaCl)洗滌 4 次，用 PBS 洗滌 1 次，并且用20 μ 1 SDS-PAGE上樣緩沖液(Invitrogen)洗脫瓊脂糖結(jié)合的級分。樣品加熱 至95°C 5分鐘，并且各10 μ 1等分試樣在NuPage 4-12%梯度凝膠(Invitrogen)上在MES 緩沖液中跑膠。以30V將蛋白質(zhì)印跡到纖維素膜上4小時，并且用Ponceau染色來分析完 全轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移后，膜在4°C在PBS-T中的western封閉試劑(Roche Diagnostics)中封閉 過夜。對于免疫檢測，膜與InM濃度6A3-IgG4抗體在RT溫育2小時，隨后與抗人過氧化物 酶偶聯(lián)的二抗在RT溫育1小時。使用ECL-Advance (Amersham)檢測信號，并且對膠片進(jìn)行 1分鐘曝光。免疫熒光M03. 13和HOG細(xì)胞鋪在8孔聚D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)室載玻片 (Becton Dickinson)上，并且生長直至80%匯合。在PBS中洗滌后，細(xì)胞在4% PFA中在室 溫固定30分鐘。非特異性結(jié)合用10% FCS,0. 1% Triton X-100封閉20分鐘。細(xì)胞在 FCS,0. 1% Triton X-100中與6A3_IgG45nM或僅緩沖液(作為陰性對照)溫育1小時。在 抗體溫育后，細(xì)胞用PBS洗滌3次，與在PBS中1 200稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗 人 IgG 抗體(Molecular Probes)溫育 1 小時。結(jié)果RT-PCR 使用M03. 13RNA作為模板的RT-PCR導(dǎo)致約200bp的獨(dú)特DNA片段(圖 6)。在陰性對照(未逆轉(zhuǎn)錄的RNA和H20)中未檢測出產(chǎn)物。PCR片段以194bps的預(yù)期大 小存在；在陰性對照樣品(DNA酶處理的RNA和H20)中未擴(kuò)增出產(chǎn)物。免疫沉淀在免疫沉淀(IP)M03. 13細(xì)胞裂解物和用6A3抗Nogo-Α抗體進(jìn)行免疫 檢測(圖7)后，對于6A3-IgG4(泳道4)和llC7_IgGl (泳道6)抗體，檢測出在預(yù)期大小 (190kDa)處的單個強(qiáng)條帶。在用針對無關(guān)蛋白質(zhì)(癌胚抗原)的抗CEA對照抗體進(jìn)行IP 后(泳道1)以及在未結(jié)合的級分中(泳道5和7)未檢測出信號。在IP前在粗M03. 13細(xì) 胞裂解物中可見微弱條帶(泳道2)。在不溶性細(xì)胞裂解物級分中觀察到較低分子量的微弱 非特異性信號(泳道3)。免疫熒光用6A3-IgG4和Alexa-Fluor 488標(biāo)記的抗人二抗免疫熒光染色透化處 理的M03. 13細(xì)胞和HOG細(xì)胞，導(dǎo)致了細(xì)胞的極亮染色(圖8a和8b，左側(cè)部分)，而僅用二 抗時基本上未檢測出信號(右側(cè)部分)。討論使用用于PCR的Nogo-A特異性引物對M03. 13細(xì)胞的RT-PCR分析，導(dǎo)致了預(yù)期大 小(194bp)的DNA片段，而用未逆轉(zhuǎn)錄的RNA樣品或水對照未檢測出PCR產(chǎn)物。根據(jù)這個 結(jié)果，得出結(jié)論細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源Nogo-A。
自M03. 13細(xì)胞裂解物的免疫沉淀和用抗Nogo-A抗體6A3的免疫檢測顯示了在預(yù) 期大小(190kDa)處的單個強(qiáng)Nogo-A條帶。相比之下，抗CEA(IgG4)對照抗體未產(chǎn)生相應(yīng) 大小的條帶。由6A3和11C7免疫沉淀導(dǎo)致的條帶間強(qiáng)度差異最可能是由于不同抗體同種 型對蛋白質(zhì)G瓊脂糖的不同親和力(親和力6A3 >親和力11C7)所致。來自M03. 13和HOG 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)免疫熒光染色的結(jié)果顯示了 6A3-IgG4與內(nèi)源Nogo-A結(jié)合。根據(jù)這些結(jié)果，得出結(jié)論2種細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)Nogo-A，并且6A3 IgG4(6A3_Ab)和 llC7IgGl(llC7-Ab)抗體均特異性結(jié)合內(nèi)源人Nogo-A。這些發(fā)現(xiàn)提示，M03. 13細(xì)胞系可以 用于建立Nogo-A結(jié)合測定法用于例如抗體表征。實施例6 :6A3處理對腦損傷的恒河猴的功能恢復(fù)的影響。在進(jìn)一步的研究中，如先前所述對恒河猴實施損傷，從損傷時開始用6A3或?qū)φ?IgG進(jìn)行4周鞘內(nèi)輸注處理。使用改良的Brinkmarm板試驗，在如本文前文所述的條件下測 定受影響的左手的手指靈巧度。與對照IgG處理相比較，6A3處理改善了功能恢復(fù)的速率和 程度。當(dāng)在實驗結(jié)束時測定損傷的大小時，發(fā)現(xiàn)對照IgG處理的猴的功能恢復(fù)大致與損傷 大小反相關(guān)，從50%損傷的90%恢復(fù)到90%損傷的53%恢復(fù)。相反，在抗Nogo-AmAb處理 的動物中恢復(fù)量未受損傷大小的顯著影響，并且即使當(dāng)損傷大小高達(dá)85%時，對于6A3處 理的動物，也幾乎達(dá)到了其損傷前的表現(xiàn)。實施例7 :6A3抗體在人受試者中的CSF保留和半衰期在為期14天CSF輸注(日劑量15mg/天)后測定6A3抗體在人受試者中的CSF 保留和半衰期，在血清和CSF中測量了各濃度(圖9和10)。與在輸注過程中測量到的水平相比較，在持續(xù)至第34和56天，即在輸注結(jié)束后約 20和42天，的2種情況下，CSF濃度保持恒定或僅微下降，這說明6A3在CSF中令人驚訝地 長的停留和/或半衰期。這種藥代動力學(xué)行為將允許使用不同施用途徑和具有更長間隔的 劑量方案。在2天或更多天或數(shù)周的時間間隔期中快速濃注入CSF內(nèi)將是可行的。6A3抗 體還將適合于控制釋放制劑，例如在生物可降解或生物不可降解的聚合物和埋植物中的制 劑。實施例8 在恒河猴SCI模型中的功效3只猴在C7/C8邊界處行脊髓單側(cè)切斷，一種已知會導(dǎo)致無法產(chǎn)生精細(xì)手指運(yùn)動 的損傷，以后植入滲透Alzet 泵，在對照動物中向損傷位點鞘內(nèi)遞送小鼠IgG抗體或在處 理動物中遞送6A3抗體，劑量Img/天共4周(圖11和Freund等人，Nat Med 12 790-2， 2006)。在改良Brinkman板試驗中，通過自垂直和水平槽的食物丸取得，評估手指靈巧度。 其他行為任務(wù)包括自抽屜取得食物丸，爆發(fā)式(ballistic)臂運(yùn)動，用于抓握食物的足運(yùn) 動能力以及有關(guān)疼痛和不適的行為觀察。試驗以規(guī)律的時間間隔從損傷前60天執(zhí)行到損 傷后120天。對猴實施單側(cè)脊髓切斷，并且用小鼠IgG對照抗體(η = 2，即Cont. 1具有50%損 傷和Cont. 2具有90%損傷)或6Α3(η = 2，即ATIl具有85%損傷和ΑΤΙ2具有80%損傷) 進(jìn)行鞘內(nèi)處理，劑量 Img/天共 4 周(猴體重Cont 1，5. lkg，Cont 2，4. lkg，ATI 1,5. Okg, ATI 2，4.5kg)。結(jié)果顯示為在測試期段(session)過程中在特定試驗天上的丸總數(shù)目。當(dāng) 表現(xiàn)水平保持穩(wěn)定時，使用損傷前和損傷后的個體行為得分計算值。與對照IgG處理的猴相比較，在猴中的6A3抗體處理給出了使用受影響的左手自水平和垂直槽獲取食物丸的逐步改善。對照猴顯示在自水平槽獲取丸方面的總體持續(xù)缺 陷，其中該運(yùn)動比自垂直槽的獲取需要更大的手指靈巧度。當(dāng)在Brinkmarm板試驗中恢復(fù)已達(dá)到最大的水平后，檢查猴用其受影響的左手抓 握抽屜把手、將其拉開并且從抽屜中的孔中拿出食物丸的能力。具有90%損傷的對照IgG 處理猴(Cont.2)完全無法抓握把手和打開抽屜。臂動作慢于正常，并且手形狀異常。這可 以得自雙箭頭線，說明損傷前的活動和損傷及用對照IgG抗體處理后的活動之間明顯的差 異，說明僅部分恢復(fù)。具有85% (ATI-I)或80% (ATI-2)損傷的6A3抗體處理的動物快速 且有效地恢復(fù)執(zhí)行任務(wù)的能力，與損傷大小無關(guān)。當(dāng)用6A3抗體處理時，損傷前和后的活動 不存在實質(zhì)性差異，指出由于6A3抗體處理導(dǎo)致的完全恢復(fù)。與IgG對照抗體處理相比較， 6A3抗體處理因此對恒河猴中經(jīng)誘導(dǎo)的腦損傷后的恢復(fù)提供了明顯的有利影響。實施例9:臨床試驗合適的臨床研究描述如下研究具有3個時期篩選期(包括基線)、開放標(biāo)簽(open-label)處理期和至少22 周的隨訪期。研究在獨(dú)立的數(shù)據(jù)安全監(jiān)測委員會(Data SafetyMonitoring Board, DSMB) 的監(jiān)督下進(jìn)行?？偣?2個患者入選4個部分重疊的相繼隊列(cohorts)，以接受6A3抗體的連續(xù) 輸注。所有患者具有輸注后至少22周的隨訪期用于進(jìn)一步的安全評估。隊列的患者分配以及處理劑量和持續(xù)時間如下·隊列1 3個截癱患者，24小時接受5mg[在2. 5ml中];·隊列2 3個截癱患者，24小時接受30mg[在2. 5ml中];·隊列3 6個截癱患者，14天接受高達(dá)30mg/天[在2. 5ml/天中]?！り犃? 10個截癱和四肢癱瘓患者，28天接受高達(dá)30mg/天[在2. 5ml/天中]。輸注開始后嚴(yán)密監(jiān)控患者至少6個月。通過生命體征測量，ECG記錄(由central facility解釋)和基于Matrices血液、尿和CSF的實驗室評價，緊密監(jiān)控患者的狀態(tài)。使用 ASIA量表(Applicable Standard NeurologicalClassification of Spinal Cord Injury by the American Spinal InjuryAssociation) (Ditunno, ^ Α 1994 ；American Spinal Cord InjuryAssociation. Paraplegia 32(2) 7080.)由合格臨床醫(yī)生執(zhí)行神經(jīng)學(xué)檢查以 評估功效，還評估脊髓損傷的潛在惡化。對于每個患者執(zhí)行總共4個腦和脊髓MRIs。在3 個時間點時(劑量前、在處理期過程中和在隨訪期過程中)從每個患者獲取CSF樣品用于 藥代動力學(xué)(PK)分析。在整個處理和隨訪期還獲得血樣用于PK分析。來自所有患者的數(shù) 據(jù)由獨(dú)立的DSMB根據(jù)方案進(jìn)行評論。
權(quán)利要求
包括至少一個抗原結(jié)合位點的分離的分子，其與人NogoA多肽(SEQ ID NO2)或人NiG(SEQ ID NO3)特異性結(jié)合，所述抗原結(jié)合位點＊順次包括高變區(qū)CDR H1、CDR H2和CDR H3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū)CDR H1 6A3(SEQ ID NO8)、CDR H2 6A3(SEQ IDNO9)和CDR H3 6A3(SEQ ID NO10)具有至少90％同一性；和＊順次包括高變區(qū)CDR L1、CDR L2和CDR L3，其中所述高變區(qū)各自分別與高變區(qū)CDR L1 6A3(SEQ ID NO11)、CDR L2 6A3(SEQ IDNO12)和CDR L3 6A3(SEQ ID NO13)具有至少90％同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合位點*順次包括高變區(qū) CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO :8)、CDR-H2-6A3 (SEQID NO 9)和 CDR-H3-6A3(SEQ ID NO: 10)；禾口*順次包括高變區(qū) CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO :11)、CDR-L2-6A3 (SEQID NO 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其包括*至少一條免疫球蛋白重鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R_H1-6A3(SEQ ID NO 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO 9)和 CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO 10)的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii) 人重鏈的恒定部分或其片段；和*至少一條免疫球蛋白輕鏈或其片段，包括(i)順次包括高變區(qū)⑶R_L1-6A3(SEQ ID NO 11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO 12)和 CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO 13)的可變結(jié)構(gòu)域，和(ii) 人輕鏈的恒定部分或其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其具有<IOOOnM的解離常數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其中所述人重鏈的恒定部分或其片段為Y4型，并且所 述人輕鏈的恒定部分或其片段為κ型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是人的或嵌合的或人源化的單克隆 抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子，其包括選自SEQID NO :4(IgGl重)、SEQ ID NO 5 (IgGl 輕)、SEQ ID N0:24(IgG4重)和SEQ IDNO :25 (IgG4輕)的一個或多個多肽序列。
8.分離的多核苷酸，其包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子的核酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的多核苷酸，其包括*選自SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :16的多核苷酸序列中的至少一個；或*選自SEQ ID NO 17,SEQ ID N0:18和SEQ ID NO :19的多核苷酸序列中的至少一個。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其包括*順次包括SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16的多核苷酸序列；禾口*順次包括SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18禾口 SEQ ID NO 19的多核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其包括女SEQ ID NO 6的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 7的多核苷酸序列，或，*SEQ ID NO 26的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO 28的多核苷酸序列。
12.表達(dá)載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項的多核苷酸。
13.表達(dá)系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其中當(dāng)所述表達(dá)系統(tǒng)或其部分存在于 相容宿主細(xì)胞中時，所述表達(dá)系統(tǒng)或其部分能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽。
14.分離的宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求12的載體。
15.分離的組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求12的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
16.給需要治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的個體施用根據(jù)權(quán)利要求 1的結(jié)合分子的方法。
17.藥物組合物，其包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑、以及根據(jù)權(quán)利要求1 的結(jié)合分子、根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求13的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)、或根據(jù) 權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
18.治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包括給需要此類治療的 受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子、根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要 求12或13的表達(dá)載體或系統(tǒng)、或根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病是選自下述的神經(jīng)變性疾病阿爾茨海默 氏病，帕金森病，肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)，路易小體樣病或其他全面性癡呆，顱、腦或脊髓創(chuàng) 傷后的疾病，中風(fēng)和脫髓鞘疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求18-19中任一項的方法，其中所述施用在損傷部位處局部地進(jìn)行、或 顱內(nèi)或鞘內(nèi)進(jìn)行。
21.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合分子的方法，其包括借助于重組DNA技術(shù)或借助于 化學(xué)合成，在根據(jù)權(quán)利要求12或13的表達(dá)載體或系統(tǒng)中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述組合物是緩慢釋放組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠以＜1000nM的解離常數(shù)與人Nogo-A多肽或人NiG結(jié)合的結(jié)合分子，編碼此類結(jié)合分子的多核苷酸；包括所述多核苷酸的表達(dá)載體；包括能夠產(chǎn)生結(jié)合分子的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)；包括如上定義的表達(dá)系統(tǒng)的分離的宿主細(xì)胞；此類結(jié)合分子作為藥物的用途，特別是在外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的用途；包括所述結(jié)合分子的藥物組合物；和治療外周(PNS)和/或中樞(CNS)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。
文檔編號A61P25/00GK101910200SQ200880123701
公開日2010年12月8日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者A·K·米爾, A·維塔利蒂, C·巴爾斯克, M·E·施瓦布, S·弗倫澤爾 申請人:諾瓦提斯公司;蘇黎世大學(xué)