專利名稱：：異硫氰酸鹽衍生物作為抗骨髓瘤劑的用途的制作方法異硫氰酸鹽衍生物作為抗骨髓瘤劑的用途本發(fā)明涉及glucomoringin或相應(yīng)異硫氰酸鹽衍生物作為抗骨髓瘤劑的用途。
背景技術(shù)：
：蔬菜是具有化學(xué)預(yù)防效能的化合物的最重要來源其中，在Sidransky關(guān)于異硫氰酸鹽(isothiocyanate，ITC)誘導(dǎo)的腫瘤生長抑制的首次研究[1]后，十字花科(Brassicaceae)(如綠花椰菜、抱子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、花椰菜等)中產(chǎn)生的異硫氰酸鹽類(ITC)，當(dāng)前引起了廣泛的興趣。在蔬菜中，ITC以稱為硫代葡糖酸鹽類(glucosinolate，GL)的非活性前體形式儲(chǔ)存，可在組織損傷后通過涉及黑芥子硫苷酸酶(myrosinase，MYR,Ε.C.1.2.1.147)的酶解作用釋放，所述黑芥子硫苷酸酶是在正常條件下從GL物理分離出來的硫葡糖苷酶(thioglucosideglucohydrolase)[2，3]0由于哺乳動(dòng)物(包括人類)的腸微生物叢具有類似黑芥子硫苷酸酶的活性，GL也可以在其消化道內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镮TC[4，5]。在不同的體內(nèi)臨床前研究中ITC已報(bào)道為腫瘤生長的抑制劑[6-8]，并且流行病學(xué)研究顯示出十字花科的飲食消耗和患肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)之間的反向關(guān)系[9-11]。ITC通過許多效應(yīng)顯示其對(duì)抗癌演進(jìn)的保護(hù)作用它們可以i)經(jīng)過Nrf-2通路誘導(dǎo)如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)和醌還原酶(quinone-reductase,QR)等2相酶(phase-2-enzyme)[12-15]，ii)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[16-18]，iii)抑制1相酶和NF-kB相關(guān)基因[19，20]。近年來，萊菔硫烷(sulphorafane)已被廣泛研究，這是由于其作為化學(xué)預(yù)防劑的作用，并且多個(gè)研究顯示出其作為新型化學(xué)療法化合物的潛在用途[7，11，20]。Glucomoringin(GMG)是硫代葡糖酸鹽類(GL)家族的罕見成員，顯示出獨(dú)特特性，該特性在于其支鏈的第二糖基。這種GL是屬于辣木屬(Moringaceae)的蔬菜的典型次級(jí)代謝產(chǎn)物，所述辣木屬由14個(gè)種組成，其中辣木(Moleifera)分布最為廣泛。辣木是在許多熱帶或中緯度地區(qū)生長的多用途樹。該植物的種子和其他部位的醫(yī)學(xué)價(jià)值，在民間醫(yī)學(xué)中早已得到公認(rèn)[21]。由GMG的黑芥子硫甘酸酶解得到的糖基化異硫氰酸鹽類(GMG-ITC)，已顯示出廣泛的生物活性，同時(shí)顯示出其發(fā)揮有效的抗腫瘤活性(antitumorpromotingactivity)[22]。GMG-ITC可從純GMG開始大量純化。GMG-ITC在室溫下是固態(tài)、沒有氣味、穩(wěn)定的化合物，與其他天然生物活性ITC不同，其他ITC是液態(tài)的，易揮發(fā)并帶有刺激性氣味。多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞的惡性病，其特征在于骨骼破壞、腎衰竭、貧血和高鈣血癥[23]。診斷的平均年齡是68歲。骨髓瘤在白色人種中占全部惡性病的1%，在黑色人種中占2%，并且在所有血液癌癥中分別占13%和33%[24]。骨髓瘤的治療包括支持療法(supportivetreatment)和注入式化學(xué)療法，對(duì)較年輕的患者，隨后進(jìn)行高劑量化學(xué)療法和自體移植[25]。對(duì)骨髓瘤生物學(xué)理解的利用帶來了新型治療方法的發(fā)展[26]。盡管使用新型療法治療骨髓瘤中已有較大進(jìn)展，但目前不能代替標(biāo)準(zhǔn)療法。因此，仍然存在對(duì)新型、更具活性和/或備選藥物的持續(xù)需求。3發(fā)明詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有下式的glucomoringin(GMG)或其脫硫葡糖苷(des-thio-glucoside,GMG-1TC)GMGGMG-ITC對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系具有顯著的細(xì)胞毒性活性。該活性也在試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫襟w內(nèi)證實(shí)。因此，本發(fā)明涉及GMG或GMG-ITC用于藥物制備的用途，所述藥物用于骨髓瘤的治療，特別用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。為了所考慮的治療用途，特別是對(duì)于腸內(nèi)或腸胃外給藥，將根據(jù)熟知方法將GMG或GMG-ITC配制為適當(dāng)劑型。適當(dāng)組合物的實(shí)例包括片劑、膠囊、用于肌內(nèi)或靜脈注射的滅菌溶液或懸液，等等。實(shí)際劑量和治療方法如常依賴于幾個(gè)因素，即藥物代謝動(dòng)力學(xué)和毒理特性、患者情況(體重、性別和年齡)和病期(stadiation)。熟練的醫(yī)師根據(jù)已確立的方法，將容易決定最有效的給藥方案。據(jù)信人體中有效治療劑量范圍在lmg/Kg/die到30mg/Kg/die之間，盡管考慮到GMG和GMG-ITC兩者的有限毒性，不能排除更高的劑量。GMG和GMG-ITC可作為單獨(dú)治療使用，或與已可得的用于骨髓瘤治療的其他已知化學(xué)治療劑結(jié)合使用。本發(fā)明現(xiàn)在在以下實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。實(shí)施例1、化合物的分離和純化GMG和GRA分別從辣木種(MoringaoleiferaL.)(辣木科(fam.Moringaceae))禾口禾1I1(BrassicaoleraceaL.)(+^(fam.Brassicaceae)；^^M(var.acephala)；subvar.laciniata)的種子中分離出來。根據(jù)先前報(bào)道的方法[27，28]，兩種GL均在兩個(gè)連續(xù)步驟中純化陰離子交換和尺寸排阻色譜。個(gè)體GL通過1H和13CNMR光譜表征，純度根據(jù)ISO9167-1方法通過脫硫衍生物(desulfo-derivative)的HPLC分析測(cè)定[29]，基于峰面積值得率約99%，但由于其較高的吸濕性，基于重量得率約90-92%。根據(jù)已報(bào)道方法[30]作一些修改，從白芥(SinapisalbaL.)種子中分離MYR酶。本研究使用的儲(chǔ)備溶液有約60單位/mg可溶蛋白的比活性，在水中稀釋后以34U/ml保存于4°C。一個(gè)MYR單位定義為pH6.5和37°C下能夠以1μmole/min水解黑芥子硫苷酸鉀的酶量。使用以前MYR溶液在4°C下儲(chǔ)存于無菌蒸餾水中。GMG-ITC通過黑芥子硫苷酸酶催化的GMG水解產(chǎn)生，水解在PH6.5、37°C下在0.IM磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。將7.0克純GMG溶解到4350ml緩沖液中，加入40U黑芥子硫苷酸酶后，溶液保持在37°C下4_6小時(shí)來制備反應(yīng)混合物。純GMG到GMG-ITC的總轉(zhuǎn)化率通過脫硫衍生物的HPLC分析[29]確認(rèn)，這允許我們監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物中GMG的減少直至完全消失。隨后向混合物加入乙腈直到終濃度為10%，GMG-ITC通過反相色譜純化，所述反相色譜用填充LiChrospherRP-C18(MERCK)或SOURCE15RPC(AmershamBiosciences)的HR16/10柱進(jìn)行，柱連接到裝備Frac-900級(jí)分收集器和紫外線監(jiān)測(cè)器(UVmonitor)UPC-900(AmershamBioscences)的AKTA-FPLC上。以10%乙腈洗滌后，用梯度達(dá)60%的乙腈進(jìn)行洗脫。收集級(jí)分并用帶有Inertsil0DS3柱(250x3mm,5mm)的Hewlett-PackardModelllOOHPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜在30°C下以lmL/min流速進(jìn)行，20分鐘內(nèi)用線性梯度的30%B到80%的水㈧和乙腈⑶進(jìn)行洗脫。GMG-ITC的洗脫用二極管陣列檢測(cè)，監(jiān)測(cè)229nm處的吸光度。收集含有GMG-ITC(峰純度>99%)的級(jí)分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中的濃縮除去溶劑，凍干最終溶液。GMG-ITC通過1H-和13C-NMR以及質(zhì)譜技術(shù)表征和明確鑒定。實(shí)施例2、生物學(xué)結(jié)果體外數(shù)據(jù)表1顯示H460人肺腫瘤細(xì)胞系對(duì)glucomoringine的敏感性。黑芥子硫苷酸酶存在時(shí)GMG濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性效應(yīng)。來自辣木的異硫氰酸鹽(GMG-ITC)對(duì)一組人腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性。在同一表格中，用ITC萊菔硫烷(GRA)獲得的值作為參照標(biāo)準(zhǔn)顯示于以下表2中。表中顯示的數(shù)據(jù)清楚表明，與不同腫瘤類型的其他腫瘤細(xì)胞系相比，ITC在骨髓瘤細(xì)胞系中更具有細(xì)胞毒性。體內(nèi)試驗(yàn)表3中顯示體內(nèi)施用的GMG-ITC的抗腫瘤活性，所述GMG-ITC施用在攜帶皮下移植人骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的SCID小鼠中。參考文獻(xiàn)ISidranskyH，ItoN,VerneyE.(1966)Influenceofalpha-naphthyl-isothiocyanateon1ivertumorigenesisinratsingestingethionineandN-2-fluorenylacetamide.JNatlCancerInst.1966Nov；37(5):677_86·2Fenwick,G.R.，Heaney,R.K.&Mullin,W.J.(1983)Glucosinolatesandtheirbreakdownproductsinfoodandfoodplants.CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr.181232013Fahey，J.W.，Zalcmann，A.T.&Talalay,P.(2001)Thechemicaldiversityanddistributionofglucosinolatesandisothiocyanatesamongplants.Phytochemistry56551.4ShapiroTA，F(xiàn)aheyJW,WadeKL，StephensonKK，TalalayP.(1998)Humanmetabolismandexcretionofcancerchemoprotectiveglucosinolatesandisothiocyanatesofcruciferousvegetables.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.1998Dec；7(12):1091_1005GetahunSM,ChungFL.(1999)Conversionofglucosinolatestoisothiocyanatesinhumansafteringestionofcookedwatercress.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.1999May；8(5)447-516ZhangY，TalalayP.(1994)Anticarcinogenicactivitiesoforganicisothiocyanates:chemistryandmechanisms.CancerRes.1994Apr1；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