專利名稱：針對癌相關(guān)的nfkbib變體的表位的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的抗體和抗原以及治療和檢測癌癥的方法和組合物。
背景技術(shù)：
在2000年，估計全世界有2200萬人患癌癥并且有620萬死于這類疾病。每年有超 過1000萬新的病例出現(xiàn)并且預(yù)期在未來15年該估計值以50%的的速率增長(WHO，World Cancer Report. Bernard W. Stewart 禾口 Paul Kleihues, eds. IARCPress, Lyon, 2003)。目前 的癌癥治療措施局限于創(chuàng)傷性的手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療，所有這些治療導(dǎo)致潛在的嚴(yán) 重副作用、非特定的毒害和/或損傷人們的體像和/或生活質(zhì)量。癌癥能夠耐化學(xué)治療，這 減少了進(jìn)一步的治療的選擇性和成功的可能性。一些癌癥的預(yù)后比其它的癥狀更加嚴(yán)重， 一些幾乎總是致命性的。另外，一些具有相對高治愈成功率的癌癥仍然是主要的殺手，因為 它們的發(fā)病率高。目前癌癥治療缺陷的一個原因是它們?nèi)狈疾〗M織和細(xì)胞的選擇性。手術(shù)切除 總是涉及作為“安全邊緣”(safety margin)的明顯正常的組織的去除，這會增加發(fā)病率和 并發(fā)癥的危險。也總是除去散布有腫瘤細(xì)胞并可能潛在維持或恢復(fù)患病器官或功能的一些 健康組織。放射治療和化學(xué)治療會由于其非特異性的作用方式而殺死或傷害許多正常細(xì) 胞。這會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用如嚴(yán)重惡心、體重減少和體力較小、頭發(fā)減少等，以及增加在生 命晚期發(fā)展繼發(fā)癌癥(secondary cancer)的危險。對癌細(xì)胞具有更大選擇性的療法會使 正常細(xì)胞不受傷害由此改善治療結(jié)果、副作用概況和生命質(zhì)量。癌癥治療的選擇性可以通過對癌細(xì)胞特異但是沒有發(fā)現(xiàn)對正常細(xì)胞特異的靶向 分子改善。這些分子接著被用作基于抗體的診斷劑或治療劑的靶或用作能夠改變它們功能 的藥物。IkB蛋白是一族結(jié)構(gòu)相關(guān)的胞內(nèi)蛋白，其結(jié)合NF-kB并通過位點和酶特異性的磷 酸化、反饋基因調(diào)節(jié)和細(xì)胞質(zhì)與核區(qū)室(nuclear compartments)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)其活 性。該家族的幾個成員已經(jīng)被鑒定，其包括IkBa、β、ε、γ和BCL-3 (見Hayden & Ghosh， Genes Dev 18 :2195_2224，2004，NF_kB途徑的綜述)。IkB蛋白之間的序列差異導(dǎo)致功能 的重大不同。IkB β 最初被鑒定為 TRIP-9，也稱為 NF_k_B 抑制劑 β、NF-k-BIB、I-k-B- β、 IkB^、IkB-β、IkB-B、甲狀腺受體相互作用蛋白9和TR相互作用蛋白9。已經(jīng)報道了兩 個主要的剪接變體，即IkB β 1和IkB β 2。這些同種型它們的C端不同，導(dǎo)致對它們的降解 產(chǎn)生了顯著的影響以及對NF-kB產(chǎn)生了影響。結(jié)果，β 2同種型似乎局限于細(xì)胞質(zhì)中并且 比 β 1 同種型降解的慢(Hirano 等人，MolCell Biol 18(5) =2596-2607,1998) 據(jù)報道在 來自ΗΤ-29人結(jié)腸癌細(xì)胞系的胞質(zhì)提取物中β 2同種型是主要的IkBii形式(Inan等人， Mol Carcinogenesis 29 :25_36，2000)。已經(jīng)提出用人IkB β 1蛋白治療炎癥和自身免疫疾 病(US 5，952，483)并且，與人IkB β 1類似的兔IkB β蛋白用于治序與NF_kB誘導(dǎo)的基因 活化相關(guān)的失調(diào)的治療(US 5，597，898)。
NF-kB-IkB β復(fù)合物通常保留在靜息細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，由此阻止了 NF_kB的轉(zhuǎn)錄 活性。在IkB β的位點特異性和信號誘導(dǎo)的磷酸化后，所述復(fù)合體解離并且標(biāo)記IkB β以觀 察其通過泛素-蛋白酶體途徑的分解。游離的NF-kB轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，在核中其結(jié)合到DNA并調(diào) 節(jié)各種基因的表達(dá)(Malek等人，JBC276 (48) =45225-235, 2001) 在細(xì)胞質(zhì)中，IkB^維持 NF-kB的能力似乎部分與C端PEST結(jié)構(gòu)域的磷酸化和另外的分子與所述復(fù)合體的結(jié)合相 關(guān)(Chen，Wu 和 Ghosh，JBC 278(25) :23101_106，2003 ;Chu 等人，Mol Cell Biol 16(11) 5974-84，1996)，因此在β 1與β 2同種型之間存在差異。新合成的或處于磷酸化的IkB β 可能轉(zhuǎn)移到核中并保留結(jié)合NF-kB的能力，但是不能阻止或中斷其基因轉(zhuǎn)錄活性(Tran等 人，Mol Cell Biol 17(9) :5386_99，1998)。相反，當(dāng)與 IkB α 結(jié)合時，NF_kB 不是絕對地 保留在細(xì)胞質(zhì)中，而是通過復(fù)合體進(jìn)出機(jī)制在核和細(xì)胞質(zhì)之間來回運(yùn)動，平衡時有利于其 定位在靜息細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。IkBa與IkBii在控制NF-kB的定位和活性的能力上的差異 被認(rèn)為部分是因為IkBii分子上存在插入蛋白而α形式上沒有(Chen，Wu和Ghosh，JBC 278(25) 23101-106,2003)。IkB蛋白的作用和具體調(diào)控遠(yuǎn)遠(yuǎn)未被完全理解，但是被普遍認(rèn) 可的是，這些蛋白是細(xì)胞質(zhì)蛋白，其中的一些能夠在核與胞質(zhì)之間轉(zhuǎn)移，并且所有的蛋白在 對細(xì)胞生長、凋亡、炎癥反應(yīng)和可能的癌癥的調(diào)節(jié)中具有重要的作用。已經(jīng)報道了在癌細(xì)胞中IkB α基因的突變(Cabannes等人，Oncogene 18 3063-70，1999)，但是到目前為止，沒有報道IkB β同種型突變。IkBa和IkB β的欠表達(dá)和 過表達(dá)也已經(jīng)牽涉癌細(xì)胞中NF-kB途徑的去調(diào)節(jié)(JBC274(26) 18827-835，1999).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新的抗體和抗原。具體地說，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新的癌特 異的抗體，其結(jié)合幾種類型的癌細(xì)胞，包括但不限于結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、皮 膚癌、卵巢癌、頭頸癌、前列腺癌和肺癌細(xì)胞。重要的是，抗體不顯著結(jié)合到正常的組織上， 使得其為癌癥治療和診斷的合適候選物。本發(fā)明人也已經(jīng)鑒定了新抗體特異性合的抗原。另外，本發(fā)明人鑒定了新的癌癥相關(guān)的抗原。具體地說，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了在癌 細(xì)胞表面表達(dá)的IkBii變體。在具體的實施方案中，新癌癥相關(guān)的抗原是在癌細(xì)胞表面上 表達(dá)的IkB β同種型2 (IkB β 2)變體。本發(fā)明人已經(jīng)克隆并測序了所述抗體并確定了抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)和互補(bǔ)決 定區(qū)1、2和3的序列。因此，本發(fā)明公開了包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的分離的輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)I(CDRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO :9)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2 (CDR2)；和 包含氨基酸序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO 10)的分離的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3)；包含氨基 酸序列SYAMH (SEQ ID NO 5)的分離的重鏈CDRl ；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 6)的分離的重鏈CDR2 ；和包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ IDNO 7)的分 離的重鏈⑶R3。本發(fā)明也提供了編碼包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的輕鏈⑶Rl的 分離的核酸序列；編碼包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 9)的輕鏈CDR2的分離的核酸 序列；和編碼包含氨基酸序列QAWDS STVV(SEQID NO 10)的輕鏈⑶R3的分離的核酸序列； 編碼包含氨基酸序列SYAMH(SEQID NO 5)的重鏈CDRl的分離的核酸序列；編碼包含氨基酸
6序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO 6)的重鏈⑶R2的核酸序列；和編碼包含氨基酸序列 AHSRLLffFGELLPSAFDY (SEQ ID NO 7)的重鏈 CDR3 的分離的核酸序列。本發(fā)明公開的另外的方面是包含本發(fā)明的輕鏈⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQ ID NOS 8-10)的分離的輕鏈可變區(qū)與包含本發(fā)明的重鏈CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NOS 5-7)的分離的重鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含圖IB中所示的氨基酸序 列(SEQ ID NO :4)。在另一個實施方案中，重鏈可變區(qū)包含圖IA中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。本發(fā)明也包括編碼本文公開的輕鏈可變區(qū)的分離的核酸序列和編碼本文公開的 重鏈可變區(qū)的分離的核酸序列。在一個實施方案中，編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列包括圖IB 中所示的核酸序列(SEQ ID NO :3)。在另一個實施方案中，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列包 括圖IA中所示的核酸序列(SEQ ID NO :1)。本發(fā)明的另一個方面是結(jié)合蛋白，優(yōu)選地抗體或抗體片段，其包含本發(fā)明公開的 至少一個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(即，SEQ ID NOS 8-10中的一個或以上)和/或本發(fā)明的至少 一個重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(即SEQ ID N0S:5-7中的一個或以上)。本發(fā)明也提供了結(jié)合蛋白， 優(yōu)選地抗體和抗體片段，其包含本文公開的輕鏈可變區(qū)和/或本文公開的重鏈可變區(qū)。如上所述，本發(fā)明也鑒定了本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合的抗原。因此，本發(fā)明提供了 結(jié)合到IkBP蛋白的結(jié)合蛋白，所述IkB β包括IkB β同種型1 (IkB β 1)、IkB β同種型 2 (IkB β 2)和癌相關(guān)的IkBii變體。在一個實施方案中，癌相關(guān)的變體是IkBii 2變體。另外，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的結(jié)合蛋白如抗體和抗體片段和藥學(xué)上可接受的 賦形劑、載體、緩沖液或穩(wěn)定劑的組合物。另外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的結(jié)合蛋白的分離的核酸序列。本發(fā)明的另外方面是免疫偶聯(lián)物，其包含(1)本發(fā)明的結(jié)合蛋白，優(yōu)選地結(jié)合癌 細(xì)胞上抗原或分子的抗體或抗體片段，所述結(jié)合蛋白附著到(2)效應(yīng)分子上。本發(fā)明的另 外方面是免疫偶聯(lián)物，其包含(1)本發(fā)明的結(jié)合蛋白，優(yōu)選地結(jié)合被癌細(xì)胞內(nèi)化的抗原或 分子的抗體或抗體片段，所述結(jié)合蛋白附著到(2)效應(yīng)分子上。在一個優(yōu)選的實施方案中， 所述效應(yīng)分子是(i)可直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記，或(ii)癌癥治療劑，其或者是 細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或者以另外的方式妨礙或降低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移的能力。 優(yōu)選地，癌癥治療劑是毒素或細(xì)胞毒素。在一個實施方案中，免疫偶聯(lián)物包含SEQ ID NO 67所定義的氨基酸序列。本申請還提供編碼本文的免疫偶聯(lián)物的分離的核酸序列。在一個實施方案中，分 離的核酸序列編碼包含SEQ ID NO :67所定義的氨基酸序列的蛋白。在另一實施方案中，分 離的核酸序列包含SEQ ID NO :66ο本申請還提供包含本申請的免疫偶聯(lián)物的組合物和免疫偶聯(lián)物在制造用于治療 或預(yù)防癌癥的藥物中的用途和用于診斷目的用途。此外，本申請?zhí)峁┦褂帽旧暾埖拿庖吲?聯(lián)物治療或預(yù)防癌癥的方法和相關(guān)的試劑盒。本申請的進(jìn)一步方面是檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)將從所述受試者取得的測試樣品與本申請的且特異性結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的結(jié) 合蛋白或免疫偶聯(lián)物接觸，以產(chǎn)生結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物；(2)測量測試樣品中結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物的量；和
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(3)比較測試樣品中與對照中結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物的量。本申請的另一方面是包含本申請的免疫偶聯(lián)物的診斷試劑，其中效應(yīng)分子是可以 直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記。本申請還包括可以特異性結(jié)合本申請的結(jié)合蛋白之一的分離的蛋白質(zhì)，及其核酸 序列和用途。如上所述，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了本申請的結(jié)合蛋白結(jié)合的抗原。因此，本發(fā)明包含包 括癌相關(guān)的IkBii變體的分離的蛋白。本發(fā)明也包括編碼癌相關(guān)的IkBii變體的分離的核 酸序列。本發(fā)明也包含結(jié)合癌相關(guān)的IkBii變體的結(jié)合蛋白。
本發(fā)明也包含本發(fā)明的抗原在治療和診斷癌中的用途。因此，本發(fā)明包括檢測或監(jiān)控受試者中癌癥的方法，其包括檢測樣品的細(xì)胞中的 本發(fā)明的抗原，其中如果在細(xì)胞上檢測到所述抗原，則表明患有癌癥。本發(fā)明也包括檢測或 監(jiān)測受試者癌癥的方法，所述方法包含檢測樣品中細(xì)胞的本發(fā)明的癌癥相關(guān)的IkBii變體 的RNA表達(dá)，其中如果檢測到癌相關(guān)的IkB β變體的RNA表達(dá)，那么表明患有癌癥。本發(fā)明也包括藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的抗原、編碼本 發(fā)明的抗原的分離的核酸序列或包含編碼本發(fā)明的抗原的核酸序列的重組表達(dá)載體以及 藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液或穩(wěn)定劑。本申請的進(jìn)一步方面是本申請所公開抗原、編碼本申請的抗原的分離的核酸序列 或者包含編碼本申請所公開抗原的核酸序列的重組表達(dá)載體在引起受試者中免疫反應(yīng)中 的用途。本申請的進(jìn)一步的方面是本申請的抗原、編碼本申請的抗原的分離的核酸序列或 者包含編碼本申請抗原的核酸序列的重細(xì)表達(dá)載體在治療或預(yù)防癌癥中的用途。此外，本申請包括用于治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法，包括向受試者或者來自 受試者的細(xì)胞施用有效量的本申請的抗原、編碼本申請的抗原的分離的核酸序列或者包含 編碼本申請的抗原的核酸序列的重組表達(dá)載體。本申請還包括用于誘導(dǎo)受試者對本申請的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，包括向受試 者或者來自受試者的細(xì)胞施用有效量的本申請的抗原、編碼本申請的抗原的分離的核酸序 列或者包含編碼本申請的抗原的核酸序列的重組表達(dá)載體。根據(jù)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理 解，本發(fā)明的詳細(xì)描述和具體實施例盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅以例證的方式 給出，因為根據(jù)該詳細(xì)描述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的許多改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言將變得顯而易見。


本發(fā)明現(xiàn)將參照附圖加以描述，其中圖 1 顯示 VB1-204 的(A) μ、VH3 (分別為 SEQ ID NOS :1 禾口 2)禾口 (B) λ、VL3 (分 別為SEQ ID NOS 3和4)的鏈的核苷酸和氨基酸序列。 圖2顯示VB1-204的腫瘤譜。將黑素瘤(Α-375)、肺(Α-549)、胰腺(CFPac-I 和 Panc-I)、肝 0fep-G2)、乳腺(MB-231、MB-435S 和 SK-BR-3)、前列腺(DU-145)和卵巢(SK-0V-3)的腫瘤細(xì)胞系與100 μ g/mL的VB 1-204溫育，并通過流式細(xì)胞術(shù)用偶聯(lián)到FITC 的羊抗人H&L抗體檢測結(jié)合的材料。顯示了兩個獨立實驗的相對于對照抗體的中位熒光 (MF)的平均值。圖3顯示通過共焦顯微鏡評價VB1-204的內(nèi)化A-375細(xì)胞與VBl-204(100y g/mL) 于4°C孵育，洗滌并加溫至37°C維持60分鐘。細(xì)胞被固定、透化并用抗人的IgM生物素化 的抗體標(biāo)記，接著與偶聯(lián)有FITC的鏈霉親和素溫育。A)，與VB1-204于4°C孵育60分鐘之 后的A-375細(xì)胞的熒光標(biāo)記，顯示標(biāo)記的周緣表面分布，通過白色箭頭指示，(60X χ 3)放 大率。B)，在抗體結(jié)合的細(xì)胞于37°C孵育60分鐘之后，細(xì)胞顯示細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)化抗體染色， (60X χ 3)放大率。圖4A顯示VB1-204飽和曲線，其通過經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測量增加濃度的VB1-204對 A-375癌細(xì)胞的反應(yīng)性來確定；B =Lineweaver-Burk法，結(jié)合常數(shù)通過Lineweaver-Burk法確定。圖5顯示用VB1-204免疫沉淀和探針檢測的從膜組分純化的蛋白的Western印跡 分析。圖6顯示對在用VB1-204免疫共沉淀后的來自陽性細(xì)胞系CFPAC-I的膜提取物以 及陰性細(xì)胞系PANC-I的MS分析對比。圖7顯示來自腫瘤細(xì)胞系A(chǔ) =CFPAC-U B :A_375和C :MB_231的MS分析的肽的鑒 定。從每個細(xì)胞類型回收的定位到IkBii 2的肽用下劃線和黑體表示。圖8顯示了經(jīng)從頭測序收集并且其定位對應(yīng)于IkBii 2的肽。收集的序列為黑體。 收集的肽的變異氨基酸用下劃線表示。圖9A顯示使用8個最強(qiáng)峰的中性肽Mr(calc)的單一同位素質(zhì)量1986. 9720， 固定的修飾脲甲基(C)離子得分47期望值le+002匹配(粗體紅色)3/176碎片離 子。圖9B顯示使用25個最強(qiáng)峰的中性肽Mr(calc)的單一同位素質(zhì)量1070. 5542，固定 的修飾脲甲基(C)可變修飾M1 氧化(M)離子得分52期望值7. 7e+002匹配(粗體紅 色)10/80碎片離子。圖9C顯示使用6個最強(qiáng)峰的中性肽MHcalc)的單一同位素質(zhì)量 1203. 5811，離子得分98期望值7. 2e-06匹配(粗體紅色)4/68碎片離子。圖10是VB1-204免疫沉淀的蛋白的Western印跡，所述蛋白來自整個細(xì)胞的裂解 物或來自純化的CFPAC-I膜組分。將所述印跡用VB 1-204或商業(yè)獲得的抗IkB β抗體探 針檢測。圖11顯示VB6-204核苷酸序列(SEQ ID NO 66)和氨基酸序列(SEQ IDNO 67)。圖12顯示了 CFPAC-I細(xì)胞中VB6-204的細(xì)胞毒性。圖13顯示C33A細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，結(jié)果顯示了存在抑制劑DEAB (圖13Α和 圖13C)或不存在抑制劑DEAB(圖13B和圖13D)時aldefluor的反應(yīng)性分布以及VB1-204 特異性地結(jié)合到這些細(xì)胞上(圖13C和圖13D)。圖14顯示DU-145細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，結(jié)果顯示了存在抑制劑DEAB (圖A和 圖C)或不存在抑制劑DEAB (圖B和圖D)時aldefluor的反應(yīng)性分布以及VB1-204特異性 地結(jié)合到這些細(xì)胞上(圖C和圖D)。
具體實施例方式(A)定義術(shù)語“細(xì)胞”包括單個細(xì)胞以及多個或者一群細(xì)胞。向細(xì)胞施用試劑包括體外和 體內(nèi)施用。術(shù)語“全身施用”，如本文所使用，意思是指免疫偶聯(lián)物和/或其它癌癥治療劑可 以以方便的方式全身性施用，例如通過注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等)、口服施用、吸入施用、 經(jīng)皮施用或局部應(yīng)用(例如局部乳膏劑或軟膏劑等)、栓劑應(yīng)用或植入方法。植入物可以是 多孔、非多孔或者凝膠材料，包括膜，例如sialastic膜或纖維。栓劑通常包含0. 5重量％ 至10重量％范圍的活性成分。術(shù)語“氨基酸”包括所有天然存在氨基酸以及修飾氨基酸。術(shù)語“抗體”，如本文所使用，旨在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體?？贵w可 以是重組來源和/或在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。術(shù)語“抗體片段”，如本文所使用，旨在包括但不 限于Fab、Fab'、F(ab' )2、sCFV、dSFV、dS-SCFV、二聚體微型抗體雙抗體、及其多聚體，多特異 性抗體片段和域抗體。抗體可以使用常規(guī)技術(shù)片段化。例如，F(xiàn)(ab' )2片段可以通過以胃蛋 白酶處理抗體產(chǎn)生?？梢蕴幚硭玫降腇(ab' )2片段以還原二硫鍵來產(chǎn)生Fab'片段。木 瓜蛋白酶消化可以導(dǎo)致形成Fab片段。Fab、Fab'和F(ab' )2、scFV、dsFV、ds-scFV、二聚體、 微型抗體、雙抗體、雙特異性抗體片段和其它片段也可以通過重組技術(shù)合成。本文所用術(shù)語“本申請的抗體或抗體片段”包含至少一個本申請的輕鏈互補(bǔ)決定 區(qū)(即SEQ ID NO 8-10中的一個或一個以上)和/或至少一個本申請的重鏈互補(bǔ)決定區(qū) (即SEQ ID NO 5-7中的一個或一個以上)。在一個實施方案中，抗體或抗體片段包含輕鏈 CDR序列(SEQ ID NO :8_10的全部)和/或重鏈CDR序列(SEQ ID NO :5_7中的全部)。在 另一實施方案中，抗體或抗體片段包含SEQID NO :4的氨基酸(輕鏈可變區(qū))和/或SEQ ID N0:2的氨基酸(重鏈可變區(qū))。該術(shù)語還包括結(jié)合本申請的抗原的抗體或抗體片段。本申 請的抗體或抗體片段還包括序列的功能變體，使得抗體或抗體片段可以結(jié)合癌細(xì)胞，而基 本上不結(jié)合正常細(xì)胞。本文所用術(shù)語“本申請的抗原”指本申請的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合的結(jié)合蛋白，并且包 括IkB β蛋白，IkB β蛋白包括IkB β同種型l(IkB β 1)、IkB β同種型2 (IkB β 2)和/或癌 癥相關(guān)的IkBii變體和其片段或部分(例如，癌癥相關(guān)的IkBii變體的胞外結(jié)構(gòu)域)。本文 所用術(shù)語“IkBi3同種型1或IkB β 1”指SEQ ID Ν0:28限定的蛋白。本文所用術(shù)語“ΙΙ Ββ 同種型2或IkB β 2”指SEQ ID NO ,21限定的蛋白。本文所用術(shù)語“癌癥相關(guān)的IkB β變體” 或“IkBi3變體”指在癌細(xì)胞表面表達(dá)且不顯著在非癌細(xì)胞表面表達(dá)的新IkBii變體。在本 發(fā)明的一個實施方案中，癌相關(guān)的IkBii變體具有與IkBii相同的功能，IkB^作為NFk-B 的抑制性調(diào)節(jié)因子，但是它們在細(xì)胞中的位置卻不同(即位于細(xì)胞膜上)。在另一個實施方 案中，癌相關(guān)的IkBii變體包括SEQ ID NO :32和/或36定義的氨基酸序列。在進(jìn)一步的 實施方案中，癌相關(guān)的IkBii變體包括SEQ ID NO :30定義的氨基酸序列。在附加的實施方 案中，癌相關(guān)的IkB β變體由SEQ ID NO :30定義的氨基酸序列組成。在另外的實施方案 中，癌相關(guān)的IkB^變體包括SEQ ID NO :27的序列，其中選自26、27、31、34、39、106和111 和112位的一個或多個氨基酸用另一個氨基酸取代或化學(xué)修飾。在另一個實施方案中，取 代或化學(xué)修飾導(dǎo)致相對于未修飾的蛋白(即SEQ ID NO 27)而改變的區(qū)域的疏水性增加。
10在另外的實施方案中，所述取代為以下的一種或多種P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、 E106V、E111V和/或K112A。在本發(fā)明的另一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB β變體包括含有 通常不存在于IkB β的一個或多個跨膜結(jié)構(gòu)域的IkBii。在一個實施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域包 含氨基酸序列SEQ ID Ν0:53或54。在一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB β變體是IkBi32的變體?！爸辽僦械葒?yán)格雜交條件”意思是指所選擇的促進(jìn)兩個互補(bǔ)補(bǔ)核酸分子在溶液中 選擇性雜交的條件。雜交可發(fā)生在核酸序列分子的全部或部分。雜交部分長度有代表性 地至少15個(例如20、25、30、40或50個)核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，核酸雙 鏈體或雜合體的穩(wěn)定性由Tm決定，其在含鈉緩沖液中是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm = 81. 50C -16. 6 (LoglO [Na+] )+0. 41(% (G+C)-600/1)，或相似方程)。因此，在洗滌條件中的 決定雜交穩(wěn)定性的參數(shù)是鈉離子濃度和溫度。為了鑒定與已知核酸分子相似、但不相同的 分子，可以假定的錯配會導(dǎo)致Tm降低大約1°C，例如，如果尋找具有> 95%同一性的核 酸分子，則最后的洗滌溫度降低大約5°C?；谶@些考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選 擇適宜的雜交條件。在優(yōu)選的實施方案中，選擇嚴(yán)格雜交條件。通過實例的方式，可以采用 下列條件以實現(xiàn)嚴(yán)格雜交基于上述方程，在5x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5x Denhardt' s 溶液/1.0% SDS中于Tm-5°C下雜交，然后以60°C的0. 2xSSC/0. SDS洗滌。中等嚴(yán)格 雜交條件包括在3x SSC中于42°C洗滌的步驟。然而，應(yīng)當(dāng)理解，等效的嚴(yán)格性可以使用替 代的緩沖液，鹽和溫度實現(xiàn)。關(guān)于雜交條件的另外的指導(dǎo)可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,N. Y. , 2002 禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 中 戈至Ij0術(shù)語“結(jié)合蛋白”，如本文所使用，指特異性結(jié)合另一物質(zhì)，如本申請的癌相關(guān)抗 原，的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白是抗體或抗體片段。“適宜體內(nèi)施用的生物學(xué)相容形式”意思是指待施用物質(zhì)的治療效應(yīng)勝過任何毒 性效應(yīng)的形式。術(shù)語“癌癥”，如本文所使用，包括可以被本申請的結(jié)合蛋白、優(yōu)選本申請的抗體或 抗體片段結(jié)合的任何癌癥。術(shù)語“癌細(xì)胞”包括癌癥或腫瘤形成細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或易于變成癌癥或腫瘤形成細(xì) 胞的細(xì)胞。術(shù)語“互補(bǔ)”指核酸序列能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則進(jìn)行堿基配對，或 者能夠在嚴(yán)格條件下與特定核酸片段雜交?！氨Ｊ匕被崛〈?，如本文所使用，是一種其中一種氨基酸殘基被另一種氨基酸 殘基置換，而沒有破壞蛋白質(zhì)的預(yù)期特性的取代。術(shù)語“對照”，如本文所使用，指來自受試者或者一組受試者的樣品，其已知患有癌 癥或未患有癌癥。術(shù)語“控釋系統(tǒng)”，如所使用，意思是指本申請的免疫偶聯(lián)物和/或其它癌癥治 療劑可以以受控的方式施用。例如，微泵可以向腫瘤區(qū)域直接遞送受控劑量，由此精細(xì) 調(diào)節(jié)藥物組合物的施用時間和濃度(見，例如Goodson，1984，Medical Applications of Controlled Release，第 2 卷，第 115-138 頁)。術(shù)語“肽衍生物”指具有一個或更多個通過功能性側(cè)基反應(yīng)所化學(xué)衍生殘基的肽。
11此類衍生分子包括例如，其中游離氨基已經(jīng)被衍生以形成胺氫氯化物、對甲苯磺?；?、芐氧 羰基、叔丁氧羰基、氯乙?；蚣柞；哪切┓肿?。游離羧基可以被衍生形成鹽、甲酯和乙 酯或者其他類型酯或酰胼。游離羥基可以被衍生形成0-酰基或0-烷基衍生物。組氨酸的 咪唑氮可以被衍生形成N-im-芐基組氨酸。作為衍生物還包括那些包含一個或一個以上 的二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥脯氨酸可以替代脯氨酸； 5_羥賴氨酸可以替代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以替代組氨酸；高絲氨酸可以替代絲氨酸； 和鳥氨酸可以替代賴氨酸。短語“檢測或監(jiān)測癌癥”指確定受試者是否具有或不具有癌癥、癌癥程度、癌癥嚴(yán) 重性和/或癌癥分級的方法或過程。術(shù)語“直接施用”，如本文所使用，意思是指癌癥治療劑可以施用，但不限于瘤內(nèi)、 血管內(nèi)和腫瘤旁施用。例如，癌癥治療劑可以通過一次或一次以上直接向腫瘤內(nèi)注射、通過 連續(xù)或間斷向腫瘤內(nèi)灌注、通過引入腫瘤治療劑儲存器、通過向腫瘤內(nèi)引入緩慢釋放裝置、 通過向腫瘤內(nèi)引入緩慢釋放制劑和/或通過向腫瘤上直接應(yīng)用來施用?！跋蚰[瘤內(nèi)”施用的 模式包括向腫瘤區(qū)域或者向基本上直接流入腫瘤區(qū)域的血管或淋巴管中引入癌癥治療劑。如本文所使用，短語“有效量”意思是指在此劑量時并且在達(dá)到預(yù)期結(jié)果所必需的 時間階段內(nèi)有效的量。治療有效量可以根據(jù)因素改變，例如動物的疾病狀態(tài)、年齡、性別、體 重?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。例如，每天可以施用數(shù)個分劑量，或者劑量可 以按比例減少，如通過治療狀態(tài)的緊急情況所指示。術(shù)語“引起免疫反應(yīng)”或者“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”，如本文所使用，意思是指啟動、觸發(fā)、 引起、增強(qiáng)、提高或者增進(jìn)免疫系統(tǒng)的任何反應(yīng)，例如體液免疫或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。免疫 反應(yīng)的啟動或增強(qiáng)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定法評價，包括但不限于，抗體則定 法(例如ELISA測定法)、抗原特異性細(xì)胞毒性測定法和細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如ELISP0T測 定法)。優(yōu)選地，本申請的分離的蛋白質(zhì)、核酸序列或重組表達(dá)載體和本申請的方法觸發(fā)或 增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，更加優(yōu)選T細(xì)胞反應(yīng)。術(shù)語“重鏈互補(bǔ)決定區(qū)”，如本文所用，指的是，抗體分子的重鏈可變區(qū)內(nèi)的高變 區(qū)。所述重鏈可變區(qū)具有三個互補(bǔ)決定區(qū)，從氨端到羧端分別稱為重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、重鏈 互補(bǔ)決定區(qū)2和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3。術(shù)語“重鏈可變區(qū)”，如本文所使用，指重鏈的可變區(qū)。本文所用的術(shù)語“本申請的免疫偶聯(lián)物”包含(1)本申請的結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體或 抗體片段，其附著至(2)效應(yīng)分子。效應(yīng)分子可以是人們希望遞送至癌細(xì)胞的任何分子，包 括但不限于(i)可以直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記，或(ii)癌癥治療劑，例如毒素，其 或者是細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移的 能力。術(shù)語“本申請的免疫毒素”指免疫偶聯(lián)物，其中效應(yīng)分子是癌癥治療劑，例如毒素，其 或者是細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移的 能力。術(shù)語“分離的核酸序列”，如本文所使用，指當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上沒 有細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)品的核酸。分離的 核酸還基本上沒有天然位于核酸側(cè)翼的序列(即位于核酸5'和3端的序列)，核酸是從這 些序列獲得。術(shù)語“核酸”旨在包括DNA和RNA，并且可以是雙鏈的或者單鏈的，并且代表有義鏈或反義鏈。此外，術(shù)語“核酸”包括互補(bǔ)核酸序列。術(shù)語“分離的蛋白”指當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上沒有細(xì)胞物質(zhì)或者培養(yǎng) 基，或者來自培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué) 物質(zhì)的蛋白質(zhì)。術(shù)語“輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)”，如本文所使用，指抗體分子的輕鏈可變區(qū)內(nèi)的高變區(qū)。輕 鏈可變區(qū)具有三個互補(bǔ)決定區(qū)，從氨基末端至羧基末端稱作輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、輕鏈互補(bǔ)補(bǔ) 決定區(qū)2和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3。 術(shù)語“輕鏈可變區(qū)”，如本文所使用，指輕鏈的可變區(qū)。術(shù)語“修飾的bouganin”，如本文所使用，意思是指如在PCT/CA2005/000410和以 US2005-0238642A1公布的美國專利申請?zhí)?1/084，080中所描述的具有降低的激活免疫反 應(yīng)傾向的修飾的bouganin。在一個實例中，修飾的bouganin具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKS SPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK0術(shù)語“核酸序列”，如本文所使用，指由天然存在堿基、糖和糖間(主鏈)鍵組成的 核苷或核苷酸單體的序列。術(shù)語還包括包含其非天然存在單體或其部分的修飾的或取代的 序列。本申請的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以 包括天然存在的堿基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列還可以包含修 飾的堿基。此類修飾堿基的實例包括氮雜和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧 啶；以及黃嘌呤和次黃嘌呤。術(shù)語“樣品”，如本文所使用，指來自可以被測定是否有癌癥的受試者的任何流體、 細(xì)胞或組織樣品。術(shù)語“序列同一性”，如本文所使用，指兩個多肽序列之間序列同一性的百分?jǐn)?shù)。 為了確定兩個多肽序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)，將這兩個序列的氨基酸序列比對，優(yōu)選使用 Clustal W算法(Thompson，JD，Higgins DG, Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res. 22(22) 4673-4680)連同 BLOSUM 62 打分矩陣(Henikoff S.和 Henikoff J. G.，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)和空位開放罰分10以及空位擴(kuò)展罰分0. 1，以便獲得兩 個序列之間的最高級配對，其中所述序列之一的總長度的至少50%參與比對?？梢杂糜诒?對的其它方法是由 Smith 和 Waterman 改良(Adv. Appl. Math.，1981,2 482)的 Needleman 和Wunsch(J. Mol. Biol.，1970，48 443)的比對方法，由此獲得兩個序列之間最高級配對 并確定兩個序列之間相同氨基酸的個數(shù)。其它計算兩個氨基酸序列之間同一性同一性百 分率的方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括Carillo和Lipton(SIAM J. Applied Math.，1988， 48 1073)所述以及在 Computational Molecular Biology, Lesk, e. d. OxfordUniversity Press,New York, 1988,Biocomputing Informatics and GenomicsProjects所述的那些方 法。通常，用于這方面的計算機(jī)程序包括但不限于GCG(DeVereuX等人Nucleic Acids Res.,1984，12 :387) BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul 等人，J. Molec. Biol.，1990 215 403)。術(shù)語“受試者”，如本文所使用，指動物界的任何成員，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。在 優(yōu)選的實施方案中，受試者被懷疑具有或者具有癌癥。如本文所使用，短語“治療或預(yù)防癌癥”指抑制癌細(xì)胞復(fù)制、防止細(xì)胞向癌癥形成 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、抑制癌癥擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)、抑制腫瘤生長、降低癌細(xì)胞數(shù)量或者腫瘤生長、降低癌 癥的惡性等級(例如增強(qiáng)的分化)或者改善癌相關(guān)癥狀。術(shù)語“變體”，如本文所使用，包括以與本申請的蛋白或核酸分子基本上相同的方 式執(zhí)行基本相同功能的、本申請的氨基酸和核酸序列的修飾物或化學(xué)等效物。例如，本申請 的蛋白變體包括但不限于保守氨基酸取代。本申請的蛋白變體還包括對本申請的蛋白的添 加和缺失。此外，變體肽和變體核苷酸序列包括其類似物和衍生物。本申請的癌相關(guān)抗原 的變體意思是指在癌細(xì)胞上但不在正常細(xì)胞上表達(dá)的蛋白質(zhì)序列。(B)互補(bǔ)決定區(qū)和結(jié)合蛋白(i)輕鏈和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和輕鏈和重鏈可變區(qū)本申請公開提供了包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC (SEQ ID NO 8)的分離的 輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)I(OTRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO 9)的分離的輕鏈互 補(bǔ)決定區(qū)2 (CDR2)；和包含氨基酸序列QAffDSSTVV (SEQ ID NO 10)的分離的輕鏈互補(bǔ) 決定區(qū)3(⑶R3)；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO 5)的分離的重鏈⑶Rl ；包含氨 基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 6)的分離的重鏈CDR2 ；和包含氨基酸序列 AHSRLLffFGELLPSAFDY (SEQ IDNO 7)的分離的重鏈 CDR3。本申請還包括⑶R序列變體，其可以結(jié)合至與由上面所公開⑶R序列所識別的相 同抗原。本申請的另外方面是包含本申請的輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ IDNO 8-10) 的分離的輕鏈可變區(qū)，和包含本申請的重鏈⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQ ID NO 5-7)的分離 的重鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含圖IB中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。在另一實施方案中，重鏈可變區(qū)包含圖IA中所示氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。本申請還公開了分離的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的變體，其可以結(jié)合至與由上面 所公開分離的輕鏈可變區(qū)和分離的重鏈可變區(qū)所識別的相同抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，本申請包括SEQ ID N0:5-10、2和4的氨基酸序列的變 體，包括本申請公開的序列的化學(xué)等效物。此類等效物包括以基本相同的方式執(zhí)行與本申 請的特定蛋白質(zhì)基本上相同功能的蛋白質(zhì)。例如，CDR序列的功能變體將能夠結(jié)合至天然 CDR序列所識別的抗原。例如，等效物包含但不限于保守的氨基酸的取代。在一個實施方案中，輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3和重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的變體氨 基酸序列與SEQ ID NO 5-10分別具有至少50%、優(yōu)選至少60%、更加優(yōu)選至少70%、最優(yōu) 選至少80 %、甚至更加優(yōu)選至少90 %、并且甚至最優(yōu)選95 %的序列同一性。在另一實施方案中，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的變體氨基酸序列與SEQ IDNO 2 和4分別具有至少50%、優(yōu)選至少60%、更加優(yōu)選至少70%、最優(yōu)選至少80%、甚至更加優(yōu) 選至少90 %并且甚至最優(yōu)選95 %的序列同一性。本申請還公開了編碼本申請的輕鏈可變區(qū)的分離的核酸序列和編碼本申請的重 鏈可變區(qū)的分離的核酸序列。在一個實施方案中，分離的核酸序列編碼包含圖IB中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的輕鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，分離的核酸序列編碼包含圖 IA中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的重鏈可變區(qū)。在進(jìn)一步的實施方案中，編碼輕鏈可 變區(qū)的核酸序列包含圖IB中所示的核酸序列(SEQ ID NO :3)。在又一個實施方案中，編碼 重鏈可變區(qū)的核酸序列包含圖IA中所示核酸序列(SEQ ID NO :1)。本申請還包括編碼本 申請的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴(yán)格雜交 條件下與編碼本申請的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核酸序列雜交的核苷酸序列。本申請還公開了編碼如下序列的分離的核酸包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的輕鏈CDRl、包含氫基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 9)的輕鏈CDR2 ；包含氨基酸 序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO 10)的輕鏈CDR3 ；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO 5)的重 鏈⑶Rl ；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重鏈⑶R2 ；和包含氨基酸 序列 AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ ID NO 7)的重鏈 CDR3。本申請還提供了編碼上面所討論的CDR序列和可變區(qū)序列的變體的分離的核酸 序列。變體核酸序列包括至少在中等嚴(yán)格雜交條件下與編碼SEQ ID NO :5_10、2和4中 所示氨基酸序列的核酸序列及其變體雜交的核酸序列。(ii)結(jié)合蛋白本申請的另一個方面是包含至少一個本申請的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(即SEQ IDNO 8-10中的一個或一個以上)和/或至少一個本申請的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(即SEQID NO :5_7 中的一個或一個以上)的結(jié)合蛋白，這樣的結(jié)合蛋白一般在本文中被稱為“本申請的結(jié)合 蛋白，，或優(yōu)選地“本申請的抗體或抗片段”。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白包含分別含有氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)、QDSKRPS (SEQ ID NO 9)和 QAWDSSTVV (SEQ ID NO :10)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū) 1、2 和 3 ；和分別含有氨基酸序列 SYAMH(SEQ ID NO:5) ；VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO:6)；和 AHSRLLffFGELLPSAFDY(SEQ ID NO 7)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1、2和3。本申請還公開了包含圖 IB中所示輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 4)和/或圖IA中所示重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)的結(jié) 合蛋白，優(yōu)選抗體或抗體片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，本申請包括以與上面所公開結(jié)合蛋白基本上相同的 方式執(zhí)行基本相同功能的上面所公開特定結(jié)合蛋白的變體，包括上面所公開序列的化學(xué) 等效物。結(jié)合蛋白的功能變體將能夠結(jié)合至與上面所公開結(jié)合蛋白相同的抗原。在一個 實施方案中，結(jié)合蛋白結(jié)合到IkBii蛋白上，包括IkBii同種型1 (IkB β 1)、IkB β同種型 2 (IkB β 2)和/或癌相關(guān)的IkB β變體。發(fā)明人已經(jīng)鑒定了本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合的抗原。因此，本發(fā)明提供了結(jié)合到 IkB β蛋白包括IkB β同種型l(IkB β 1)、IkB β同種型2 (IkB β 2)和/或癌相關(guān)的IkB β 變體的結(jié)合蛋白。如上所述，本申請的結(jié)合蛋白結(jié)合到癌細(xì)胞的表面上，但不顯著地結(jié)合到非癌細(xì) 胞的表面。因此，本申請包括結(jié)合到癌相關(guān)的IkBii變體的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白。癌相關(guān) 的IkBii變體的結(jié)構(gòu)能夠被本領(lǐng)域技術(shù)人員使用計算機(jī)建模來預(yù)測。例如，可以使用商業(yè) 獲得的軟件或服務(wù)(見Martz，Erie在2000年11月30日提交的Protein Explorer，最后 IfiTT 2003 ^f-4 J3i 30 H, http://molvis.sdsc.edu/visres/molvisfV/titles.jsp)。 $
15一個實施方案中，對SEQ IDNO 30限定的蛋白進(jìn)行計算機(jī)建模。在一個實施方案中，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含在或包含SEQ ID NO 27或30的氨基酸 52-97。在另一個實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含在或包含序列GYVTED⑶TALHLAVIHQHEPFLF LLGFSAGTEYMDLQNDLGQTA(SEQ IDNO 68)。在另一個實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO 27或30的氨基酸38_98 AELGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQ ID NO. 69)或AWLGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQIDN 0. 70)。在另一個實施方案中，本申請的結(jié)合蛋白結(jié)合到包含SEQ ID N0:27或30的氨基 酸38-102的肽AELGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA(SEQ ID NO 71)或 AWLGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA (SEQ ID NO 72)。在某些實施方案中，抗體或抗體片段包含全部或者部分的得鏈恒定區(qū)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE、IgM或者IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgM重鏈 恒定區(qū)。另外抗體或抗體片段可以包含全部的或部分的κ輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。 優(yōu)選地，輕鏈恒定區(qū)是λ輕鏈恒定區(qū)。為了產(chǎn)生人單克隆抗體，抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)可以從患有癌癥的人中取 得，并且通過標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合過程與骨髓瘤細(xì)胞融合，因此使這些細(xì)胞永生并且得到雜交 瘤細(xì)胞。此類技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(例如最初由Kohler和Milstein(Nature 256 495-497(1975))開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及其他技術(shù)例如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等， Immunol. Today 4 :72 (1983))、產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Roder等，Methods Enzymol, 121 140-67 (1986))和組合抗體文庫的篩選(Huse 等，Science 246 1275 (1989)) 也是本領(lǐng)域眾所周知的?？擅庖呋瘜W(xué)篩選產(chǎn)生與癌細(xì)胞特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞， 并且可以分離單克隆抗體。對特定抗原或分子(例如癌細(xì)胞上的抗原或分子)具有反應(yīng)性的特異性抗體 或抗體片段，也可以通過篩選與細(xì)胞表面成分一起表達(dá)于細(xì)菌中的編碼免疫球蛋白基因 或其部分的表達(dá)文庫產(chǎn)生。例如，完整的Fab片段、VH區(qū)和FV區(qū)可以使用噬菌體表達(dá)文 庫在細(xì)菌中表達(dá)(見例如 Ward 等，Nature 341 :544_546 (1989) ；Huse 等，Science 246 1275-1281(1989)；和 McCafferty 等，Nature 348:552-554(1990))。本申請包括結(jié)合至與本申請的抗體或抗體片段相同的抗原的所有抗體和抗體片 段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，結(jié)合測定可以用于找出與本申請的抗體和抗體片段具有相 同結(jié)合特異性的其它抗體和抗體片段。如下面所例證，競爭結(jié)合測定可以用于找出此類的 其它抗體。在使用流式細(xì)胞術(shù)開展競爭測定之前，確定對固定數(shù)量癌細(xì)胞給出最大結(jié)合的本 申請的抗體(Abl)的最低濃度。從指數(shù)生長培養(yǎng)物中收獲總計106個細(xì)胞并且與多種抗體濃度于4°C孵育1小時。洗滌細(xì)胞并且與適宜檢測抗體在4°C下再孵育1小時。在洗滌之 后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。對于每一測試抗體，通過中位熒光對抗體濃度作圖從數(shù)據(jù)產(chǎn) 生飽和曲線。對于競爭測定，如上制備癌細(xì)胞并且用固定濃度的抗體(Abl) —式兩份處理。固 定濃度是如上所確定的對固定數(shù)量的癌細(xì)胞產(chǎn)生最大結(jié)合的最低抗體濃度。在加入Abl之 后即刻向每一管中加入不同濃度的潛在抑制性抗體(Ab2)，并且將混合物在4°C下孵育1小 時。通過從對于每一測試樣品(Abl+Ab2)讀取到的中位熒光減去背景熒光(PBS-5%FCS)， 計算出抑制百分?jǐn)?shù)和相對于最大中位熒光的變化。然后將結(jié)果除以單獨Abl的中位熒光 (最大結(jié)合)減去背景(見下)。通過乘以100得到抑制百分?jǐn)?shù)結(jié)果。兩次重復(fù)試驗的平 均值連同它們各自的標(biāo)準(zhǔn)誤對抗體濃度作圖。下列公式用于計算抑制百分?jǐn)?shù)PI = [ (MF (Abl+Ab2) -MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100其中PI =抑制百分?jǐn)?shù)；MF(Abl+Ab2)=對于Abl+Ab2混合物測量的中位熒光；MFBgd = 具有PBS-5% FCS的背景中位熒光。因此，本申請?zhí)峁┠軌蚪Y(jié)合癌細(xì)胞上抗原的結(jié)合蛋白，其中結(jié)合蛋白可以通過包 括下列步驟的方法鑒定(1)將固定數(shù)量的癌細(xì)胞與對于固定數(shù)量癌細(xì)胞產(chǎn)生最大結(jié)合的最低濃度的本文 所公開結(jié)合蛋白、優(yōu)選抗體或抗體片段(Abl)孵育，并且測量Abl的中位熒光(MFam)；(2)通過向Abl和癌細(xì)胞加入Ab2測試兩種或兩種以上濃度的測試結(jié)合蛋白 (Ab2)，并且測定中位熒光(MF(Abl+Ab2))；(3)測定背景中位熒光(MFbgd)；(4)計算PI，其中PI = [ (MF (Abl+Ab2) "MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100 ；和(5)比較PI與對照PI值;其中，與對照PI具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異的PI表明測試結(jié)合蛋白能夠結(jié)合癌細(xì)胞 上本申請的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，親和性成熟技術(shù)通過增加對抗原的親和性，可用于改 良本申請的結(jié)合蛋白或免疫偶聯(lián)物。通常使用兩個策略增強(qiáng)抗體的結(jié)合親和性。一個方法是利用對Ab-Ag復(fù)合 物晶體結(jié)構(gòu)的解析來鑒定參與抗原結(jié)合的關(guān)鍵殘基(Davies D. R. , Cohen G. H. 1996. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc Natl. Acad. Sci. U. S A. 93, 7-12)。之后，這些殘基可以被突變以增強(qiáng)相互作用。另外的方法模擬體內(nèi)抗原刺激，該刺 激驅(qū)動由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白的親和性成熟。在免疫反應(yīng)的成熟過程中，免疫球蛋 白可變區(qū)經(jīng)受體細(xì)胞突變(Mc Heyzer-Williams M. 2003. B-cell signaling mechanism and activation. Fundamental Immunology,第五版，195-225)。該方法對免疫系統(tǒng)具有 高特異性，其特征在于以極高的比率引入點突變。它僅存在于編碼可變區(qū)的DNA片段中， 并且排除保守結(jié)構(gòu)域。然后，表達(dá)體細(xì)胞突變變體抗體的B細(xì)胞經(jīng)受抗原介導(dǎo)的選擇，導(dǎo) 致選擇出更高親和性的免疫球蛋白。為了體外復(fù)制該現(xiàn)象，已經(jīng)使用數(shù)種方法，或通過隨 機(jī)或通過定向過程來引入突變。隨機(jī)突變可以使用錯配PCR、鏈改組或增變株大腸桿菌引 Λ (Clackson Τ. Hoogenboom N. R. , Griffiths A. D.禾口 Winter G. 1991Makingantibodyfragments using phage display libraries. Nature 352，624—628，HawkinsR. E.，Russell S. J.禾口Winter G. 1992. Selection of phage antibodies by bindingaffinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226，889-896，Low N.，HolligerP.和 Winter G. 1996. Mimicking somatic hypermutation :affinity maturation ofantibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J Mol.Biol.260，359-368)。 該策略導(dǎo)致產(chǎn)生大文庫，其中反應(yīng)性克隆使用展示技術(shù)，如核糖體、噬菌體或酵母加以選 擇(Min L. (2000). Applications of display technology inprotein analysis. Nat. Biotechnol. 18，1251-1256)。已經(jīng)顯示，⑶R(特別是輕鏈和重鏈⑶R3)的定向突變是用于增強(qiáng)抗體親和性的有 效技術(shù)。⑶R3的3至4個氨基酸的區(qū)段或者稱作“熱點”的特異性區(qū)域被定向誘變。Yang 等報道，通過突變四個CDR殘基，抗HIV gpl20Fab片段提高420倍(Yang ff. P. , Green K.， Pinz-Sweeney S. , Briones A. T. , Burton D. R.禾口 Barbas C. F. III. 1995. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of apotent human anti—HIV—lantibody into picomolar range. J. Mol. Biol.，254，392-403)。在 C6. 5scFv 的 VL CDR3 中的一個 突變與VH⑶R3中三個突變的組合使親和性提高1230倍(Schier R.，McCall A.，Adams G. P.，Marshall K. ff.，Merrit H.，Yin M.，Crawford R. S. ffeiner L. M.，Marks C.和 Marks J. D. 1996. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2single-chain Fv by molecular evolutionof the complementary determining regions in the center of the antibody binding site. J. Mol. Biol. ,263,551-567)?！盁狳c”是在體內(nèi)發(fā)生體細(xì)胞高變的序列(Neuberger M. S和Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。熱點序列可以定義為某些密 碼子的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C或T 并且 W 可以是 A 或 T(Neuberger M. S 禾口 Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。此外，相對于對應(yīng)于潛在熱點序列的TCN編碼的那些，由核 苷酸AGY編碼的絲氨酸殘基大部分存在于可變結(jié)構(gòu)域的⑶R區(qū)(Wagner S. D.，Milstein C.禾口 Neuberger M. S. 1995. Codon bias targets mutation. Nature, 376, 732)。結(jié)構(gòu)分析 顯示CDR環(huán)對抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大，特別是CDR3環(huán)(Giudicelli V.，Chaume D.和Lefranc M. P.2004. IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cellreceptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 32, 435-440)。因此，掃描每一抗體的重鏈和輕鏈⑶R的核苷酸序列，確定是否存在熱點序列 和 AGY 密碼子。使用 International ImMunoGen Tics 數(shù)據(jù)庫(IMGT，http//imgt. cines. fr/textes/vquest/)將所鑒定的輕鏈和重鏈⑶R區(qū)的熱點與種系的重鏈和輕鏈序列比較 (Davies D. R. , Padlan E. A.禾口 Sheriff S. 1990. Antibody-antigencomplexes. Annu. Rev. Biochem. 59，439-473)。序列與種系相同，表明沒有發(fā)生體細(xì)胞突變；因此，模擬體內(nèi)發(fā)生的 體細(xì)胞事件的隨機(jī)突變被引入。與之相反，不同的序列表明已經(jīng)發(fā)生了一些體細(xì)胞突變。這 將仍需確定體內(nèi)體細(xì)胞突變是否是最佳的。編碼埋入CDR內(nèi)的氨基酸或者CDR中的保守氨 基酸的熱點沒有被誘變。這些殘基對于總體結(jié)構(gòu)通常是至關(guān)重要的，并且由于她們被埋藏， 所以不大可能與抗原相互作用。此外，序列可以與種系序列中、體細(xì)胞突變主要發(fā)生于此的 預(yù)期位置比較(Tomlinson I. M.，Cox J. P. L.，Gherardi E.，LeskA. M.和 Chotia C. 1995.
18The structural repertoire of the human V. 1domain. EMBO J. 14，4628—4638，Tomlinson I. M.，Walter G.，Jones P. T.，Dear P. H.，Sonnhammer E. L L 禾口 Winter G. 1996. The imprint of somatic hypermutation on therepertoire of human germline V genes. J. Mol. Biol. 256,813-817) o相似的策略應(yīng)用于BL22scFv的親和性成熟中。將點突變引 入到重鏈⑶R3中導(dǎo)致對多種⑶22陽性細(xì)胞系的結(jié)合活性提高5至10倍(Salvatore G.， Beers R.，MarguliesI.，Kreitman R. J.禾口Pastan I. 2002. Improved cytotoxic activity toward cell lines andfresh leukemia cells of a mutant anti-CD22immunotoxin obtained by antibody phagedisplay. Clinical Cancer research，8，995一1002)0 同#， 在⑶R1和⑶R2環(huán)中的多個氨基酸的突變也產(chǎn)生了親和性增加3倍至7倍的突變體(Ho M. , KreitmanJ. , On da M.禾口 Pastan I. 2005. In vitro antibody evolution targeting germline hotspots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin. J.Biol. Chem. ，280，607-617)。在通過隨機(jī)過程或者定向過程引入突變之后，表達(dá)抗體并評估其功能。例如，可以 基于結(jié)合進(jìn)行功能篩選。一旦評估了功能，則使用已知方法對所選擇抗休開展DNA測序。在另一實施方案中，Harvey，B等(PNAS 2004 June 22 ；101 (25) :9193_8)描述的 錨定周質(zhì)表達(dá)(APEx)方法用于本申請的結(jié)合蛋白或免疫偶聯(lián)物的親和性成熟。因此，本申請包括已經(jīng)被親和性成熟的本申請的結(jié)合蛋白，以增加結(jié)合蛋白對 IkB3蛋白包括IkBP同種型l(IkB3 1)、IkBP同種型2(IkB3 2)和/或癌相關(guān)的IkB3 變體的親和性。本申請還提供了包含本申請結(jié)合蛋白、優(yōu)選抗體和抗體片段與可藥用賦形劑、載 體、緩沖液或穩(wěn)定劑的組合物。此外，本申請?zhí)峁┝司幋a本申請的結(jié)合蛋白的分離的核酸序列。本申請還包括這 些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴(yán)格雜交條件下與編碼本申請的結(jié)合蛋白 的核酸序列雜交的核酸序列。(C)癌相關(guān)抗原發(fā)明人已經(jīng)鑒定了本申請的結(jié)合蛋白結(jié)合的抗原(包括IkBP蛋白，諸如IkB3 同種型1 (IkB 0 1)、IkB 0同種型2 (IkB 0 2)和/或癌相關(guān)的IkB 0變體)。癌相關(guān)的抗原 表達(dá)于癌細(xì)胞表面上并且在正常細(xì)胞表面上沒有明顯的表達(dá)。因此，本申請包括可特異性 結(jié)合本申請的結(jié)合蛋白之一的分離的蛋白及其核酸序列和用途。本申請包括新的癌相關(guān)抗原，即癌相關(guān)的IkB 0變體。在一個實施方案中，癌相關(guān) 的IkB0變體表達(dá)于癌細(xì)胞表面上并且在正常細(xì)胞表面上沒有明顯的表達(dá)。在進(jìn)一步的實 施方案中，癌相關(guān)的IkB0變體具有與IkB0相同的功能(IkB0是NFk-B的抑制性調(diào)節(jié)因 子)，但在細(xì)胞中的位置不同(即位于細(xì)胞膜上)。在另一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB3變 體包含SEQ ID NO :32和/或36限定的氨基酸序列。在另一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB3 變體包含SEQ IDN0:30限定的氨基酸序列。在另一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB0變體由 SEQ IDN0:30限定的氨基酸序列組成。在進(jìn)一步的實施方案中，癌相關(guān)的IkB0變體包含 SEQ ID NO :27的序列，其中選自26、27、31、34、39、106、111和112位的一個或多個氨基酸 被另一個氨基酸取代或化學(xué)修飾。在進(jìn)一步的實施方案中，取代或化學(xué)修飾導(dǎo)致相對于未 修飾的蛋白(即SEQ ID 27)發(fā)生改變的區(qū)域疏水性增加。在另外的實施方案中，取代是以
19下的一個或多個P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、E106V、E111V 和 / 或 K112A。在進(jìn)一 步的實施方案中，癌相關(guān)的IkB0變體包含具有通常不存在于IkB0中的一個或多個跨膜 結(jié)構(gòu)域的IkB0。在一個實施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQID NO :53或54。 在一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB0變體是IkB0 2的變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，本申請包括上述的氨基酸序列的變體，包括本申請公 開的序列的化學(xué)等效物。此類等效物包括與本申請的特異性蛋白質(zhì)以基本相同的方式執(zhí)行 基本相同功能的蛋白質(zhì)。例如等效物包括但不限于保守氨基酸取代物。在一個實施方案中，本申請的變體氨基酸序列與SEQ ID NO :30、32、36、53或54具 有至少50%、優(yōu)選至少60%、更加優(yōu)選至少70%、最優(yōu)選至少80%、甚至更加優(yōu)至少90%、 并且甚至最優(yōu)選至少95%的序列同一性。本申請包括本申請的新的癌癥相關(guān)抗原的用途。例如，本申請的新的癌癥相關(guān)抗 原用于產(chǎn)生可以用于治療或預(yù)防癌癥的結(jié)合蛋白和免疫偶聯(lián)物的用途，或者可以用于檢測 或監(jiān)測受試者中癌癥的用途或者用于制造治療或預(yù)防癌癥的藥物的用途。此外，本申請?zhí)峁┝司幋a本申請的新癌癥相關(guān)抗原的分離的核酸序列。本申請還 包括這些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴(yán)格雜交條件下與編碼本申請的新 癌癥相關(guān)抗原的核酸序列雜交的核苷酸序列。(D)免疫偶聯(lián)物本申請還包括免疫偶聯(lián)物，包含(1)本申請的結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體或抗體片段，其 已經(jīng)附著至(2)效應(yīng)分子。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白結(jié)合至癌細(xì)胞上的抗原或分子。在 一個實施方案中，所述抗原或分子包含IkB0蛋白，IkB0同種型l(IkB0 l)、IkB0同種型 2 (IkB 3 2)和/或癌相關(guān)的IkB 3變體。在一個優(yōu)選的實施方案中，效應(yīng)分子是⑴可以直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo) 記，或(ii)癌癥治療劑，其或者是細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降 低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移的能力。這樣的免疫偶聯(lián)物在本文中一般可以被稱為“本申請的 免疫偶聯(lián)物”。在本申請的一個實施方案中，效應(yīng)分子是癌癥治序劑。癌癥治療劑優(yōu)選地是毒素， 其或者是細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移 能力。因此，本申請的一個方面是免疫偶聯(lián)物，其包含(1)本申請的結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體或 抗體片段，其附著至(2)癌癥治療劑，例如細(xì)胞毒素。在另一實施方案中，免疫偶聯(lián)物被內(nèi)化，并且癌癥治療劑是阻斷細(xì)胞的蛋白質(zhì)合 成、由此導(dǎo)致細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒素。重要的是，由于大多數(shù)正常細(xì)胞沒有廣泛表達(dá)在癌細(xì)胞 上存在的抗原，它們不能結(jié)合并內(nèi)化免疫偶聯(lián)物，并且被保護(hù)免予毒素或其他癌癥治療劑 的殺傷作用。多種效應(yīng)分子可以用于本申請的免疫偶聯(lián)物上，并且大量的此類效應(yīng)分子是胞內(nèi) 活性分子。因此，在一個實施方案中，免疫偶聯(lián)物被癌細(xì)胞內(nèi)化。在優(yōu)選的實施方案中，效應(yīng)分子是癌癥治療劑，更加優(yōu)選包含具有核糖體失活活 性的多肽的細(xì)胞毒素，包括但不限于白樹毒蛋白、bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖 麻毒蛋白A鏈、異株瀉根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假單胞屬(Pseudomonas)外毒素A 及其變體。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是核糖體失活性蛋白質(zhì)時，免疫偶聯(lián)物結(jié)合至癌細(xì)胞后必須被內(nèi)化，以便于蛋白質(zhì)對于細(xì)胞是細(xì)胞毒性的。因此，在一個實施方案中，效應(yīng)分子是細(xì)胞毒素并且免 疫偶聯(lián)物被癌細(xì)胞內(nèi)化。在一個實施方案中，毒素是bouganin或假單胞菌屬外毒素A，及其變體。在另一 實施方案中，毒素是修飾的bouganin或者缺乏細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短形式的假單胞菌屬 外毒素A。在進(jìn)一步的實施方案中，毒素是基本上無T細(xì)胞表位的bouganin，或者由氨基酸 252-608組成的截短形式的假單胞菌屬外毒素A。在其他非限定性實施方案中，癌癥治療劑包括起作用以斷裂DNA的試劑。因此，癌 癥治療劑可以選自，但不限于，烯二炔(例如加利車霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子 試劑(例如博來霉素、甲錠丙基-EDTA-Fe (II))。根據(jù)本發(fā)明的有用的其他癌癥治療劑包括 但不限于柔紅霉素、多柔比星、偏端霉素A、順鉬、絲裂霉素C、海鞘素、倍癌霉素/CC-1065、 和博來霉素/匹來霉素。在其他非限定性實施方案中，癌癥治療劑包括起作用以打斷微管蛋白的試劑。 此類試劑可以包括，但不限于，根霉素/美登素、泰素、長春新堿和長春堿、秋水仙堿、 auristatin、多拉司他汀 10MMAE、禾口 peloruside A。在其他非限定性實施方案中，本申請的免疫偶聯(lián)物的癌癥治療劑部分可以包含 燒化劑，包括但不限于 Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNUNSC 409962、白消安 NSC 750、羧基鄰苯二甲酸鉬 NSC 271674、CBDCA NSC241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC 3088、氯脲霉素NSC 178248、順鉬NSC 119875、克羅米松NSC 338947、氰基嗎啉代多柔比星NSC 357704、環(huán)戊二烯NSC 348948、二脫水半乳糖醇NSC 132313、氟多潘 NSC 73754、h印sulfam NSC 329680、海恩酮 NSC 142982、美法倉 NSC8806、 甲基 CCNU NSC 95441、絲裂霉素 C NSC 26980、米托唑酰胺 NSC353451、氮芥 NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪雙酮NSC135758、哌泊溴燒NSC 25154、泊非霉素NSC 56410、螺妙斯定 NSC 172112、替羅昔隆 NSC 296934、四鉬 NSC 363812、噻替派 NSC 6396、曲 他胺 NSC9706、尿嘧啶氮芥 NSC 34462 和 Yoshi-864 NSC 102627。在其他非限定性實施方案中，本申請的免疫偶聯(lián)物的癌癥治療劑部分可以包含抗 有絲分裂劑，包括但不限于異秋水仙堿NSC 406042、大田軟海綿素BNSC 609395、秋水仙堿 NSC 757、秋水仙堿衍生物NSC 33410、多拉司他汀10NSC 376128 (NG-auristatin衍生的)、 美登素NSC 153858、根霉素NSC332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫 代秋水仙堿NSC 361792、三苯甲基半胱氨酸NSC 83265、硫酸長春堿NSC 49842和硫酸長春 新堿 NSC 67574。在其他非限定性實施方案中，本申請的免疫偶聯(lián)物的癌癥治療劑部分可以包含 拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，包括但不限于喜樹素NSC 94600、喜樹素鈉鹽NSC100880、氨基喜樹 素NSC 603071、喜樹素衍生物NSC 95382、喜樹素衍生物NSC 107124、喜樹素衍生物NSC 643833、喜樹素衍生物NSC 629971、喜樹素衍生物NSC 295500、喜樹素衍生物NSC 249910、 喜樹素衍生物NSC 606985、喜樹素衍生物NSC 374028、喜樹素衍生物NSC 176323、喜樹 素衍生物NSC295501、喜樹素衍生物NSC 606172、喜樹素衍生物NSC 606173、喜樹素衍生 物NSC 610458、喜樹素衍生物NSC 618939、喜樹素衍生物NSC 610457、喜樹素衍生物NSC 610459、喜樹素衍生物NSC 606499、喜樹素衍生物NSC610456、喜樹素衍生物NSC 364830、 喜樹素衍生物NSC 606497和嗎啉代多柔比星NSC 354646。
在其他非限定性實施方案中，免疫偶聯(lián)物的癌癥治療劑部分可以包含拓?fù)洚悩?gòu)酶 II抑制劑，包括但不限于多柔比星NSC 123127、氨萘非特NSC308847、m-AMSA NSC 249992、 蒽吡唑衍生物NSC 355644、吡唑啉吖啶NSC366140、比桑郡HCL NSC 337766、柔紅霉素NSC 82151、脫氧多柔比星NSC267469、米托蒽醌NSC 301739、美諾立爾NSC 269148、N，N-二節(jié) 基道諾霉素 NSC 268242、比散特隆 NSC 349174、佐柔比星 NSC 164011、VM-26NSC122819 和 VP-16NSC 141540。在其他非限定性實施方案中，本申請的免疫偶聯(lián)物的癌癥治療劑部分可以包含 RNA或DNA抗代謝物，包括但不限于L-丙氨菌素NSC 153353、5_氮胞苷NSC 102816、5_氟 尿嘧啶NSC 19893、阿西維辛NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC 132483、氨基蝶呤衍生物 NSC 184692、氨基蝶呤衍生物NSC 134033、抗葉酸劑NSC 633713、抗葉酸劑NSC 623017、 Baker ‘ s可溶性抗葉酸劑NSC139105、二氯烯內(nèi)基指甲花醌NSC 126771、布喹那NSC 368390、替加氟(前藥)NSC 148958、5，6-二氫-5-氮胞苷 NSC 264880、甲氨蝶呤 NSC 740、 甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(膦酰基乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)NSC 224131、吡唑霉 素 NSC 143095、三甲曲沙 NSC 352122、3_HP NSC 95678,2'-脫氧 _5_ 氟尿苷 NSC 27640、 5-HP NSC 107392、a -TGDR NSC 71851、艾菲地可寧甘氨酸酯 NSC 303812、阿糖胞苷 NSC 63878、5_ 氮雜-2'-脫氧胞苷 NSC 127716、3-TGDR NSC 71261、環(huán)胞苷 NSC 145668、胍唑 NSC 1895、羥基脲NSC32065、肌苷乙醇二酸NSC 118994、麥克菌素II NSC 330500、吡唑咪 唑NSC51143、硫鳥嘌呤NSC 752和硫嘌呤NSC 755。在另一非限定性實施方案中，免疫偶聯(lián)物的治療部分可以是核酸?？梢允褂玫暮?酸包括但不限于反義RNA、基因或其他多核苷酸、核酸類似物，例如硫鳥嘌呤和硫嘌呤。本申請進(jìn)一步提供了免疫偶聯(lián)物，包含(i)本申請的結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體或抗體 片段，其附著至(2)效應(yīng)分子，其中效應(yīng)分子是可以間接或直接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記。這 些免疫偶聯(lián)物可以用于研究應(yīng)用或者診斷應(yīng)用，如癌癥的體內(nèi)檢測。標(biāo)記優(yōu)選地能夠直接 或間接產(chǎn)生可檢測信號。例如，標(biāo)記可以是不透射線的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、 35S、123I、125I、131I ；熒光(熒光團(tuán))或化學(xué)發(fā)光(生色團(tuán))化合物，例如異硫氰酸熒光素、羅 丹明或螢光素；酶，例如堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；顯像劑；或金屬離 子。在另一實施方案中，免疫偶聯(lián)物是間接可檢測性的。例如，對免疫偶聯(lián)物具有特異 性并且包含可檢測標(biāo)記的二級抗體可以用于檢測免疫偶聯(lián)物。本申請的結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體或抗體片段，可以通過結(jié)合蛋白可以結(jié)合或連接至 效應(yīng)分子的任何方式“附著至”效應(yīng)分子。例如，結(jié)合蛋白可以通過化學(xué)或重組方式附著至 效應(yīng)分子。用于制備融合物或者連接物的化學(xué)方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且可以用于 制備免疫偶聯(lián)物。用于將結(jié)合蛋白和效應(yīng)分子連接的方法必須能夠?qū)⒔Y(jié)合蛋白與效應(yīng)分子 接合，而不干擾結(jié)合蛋白結(jié)合至癌細(xì)胞上抗原的能力。本申請的結(jié)合蛋白可以間接連接至效應(yīng)分子。例如，結(jié)合蛋白可以直接連接至包 含幾種類型之一的效應(yīng)分子的脂質(zhì)體。一種或多種效應(yīng)分子和/或結(jié)合蛋白還可以結(jié)合至 固體表面。在一個實施方案中，結(jié)合蛋白(優(yōu)選抗體或抗體片段)和效應(yīng)分子均是蛋白質(zhì)，并 且可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)連接。有數(shù)百種能將兩種蛋白質(zhì)連接的交聯(lián)劑可利用
22(見例如"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，， 1991, Shans Wong, CRC Press,Ann Arbor)。交聯(lián)劑通?；诮Y(jié)合蛋白(優(yōu)選抗體或抗體片段)和/或效應(yīng)分 子上可利用的或者插入的活性官能基進(jìn)行選擇。此外，如果不存在反應(yīng)基，可以使用光活化 交聯(lián)劑。在某些情況下，希望在結(jié)合蛋白(優(yōu)選抗體或抗體片段)與效應(yīng)分子之間包含間 隔子。本領(lǐng)域已知的交聯(lián)劑包括同雙功能試劑戊二醛、二甲基己二亞酰胺和雙(重氮聯(lián)苯 胺)和異雙功能試劑(m maleimidobenzoyl)順丁烯酰胺苯甲酸_N_羥基琥珀酰亞胺和硫 代順丁烯酰胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺。在某些情況下，本申請的結(jié)合蛋白可以用用于效應(yīng)分子化學(xué)附著的特定殘基進(jìn)行 工程改造。本領(lǐng)域已知的用于分子化學(xué)附著的特定殘基包括賴氨酸和半胱氨酸。交聯(lián)劑基 于結(jié)合蛋白上插入的活性官能基和效應(yīng)分子上可利用的活性官能基來選擇。結(jié)合蛋白-效應(yīng)分子蛋白質(zhì)融合也可以使用重組DNA技術(shù)制備。在此種情況下， 編碼結(jié)合蛋白的DNA序列融合至編碼效應(yīng)分子的DNA序列，產(chǎn)生嵌合DNA分子。嵌合DNA 序列被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。可以從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收融合蛋白并 且使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化。將作為標(biāo)記的效應(yīng)分子附著至結(jié)合蛋白的實例包括描述于Hunter，等，Nature 144:945(1962) ；David，等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain，等，J. Immunol. Meth. 40 219(1981) ；Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30 407(1982) ；ffensel 禾口 Meares， Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy, Elsevier, N. Y. (1983)； 和 Colcher 等，"Use OfMonoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Athymic Mice" , Meth. Enzymol. , 121 :802_16(1986) 中的方法。在一個實施方案中，免疫偶聯(lián)物包含由SEQ ID NO :67定義的氨基酸序列。本申請 還包括該序列的變體。本申請還提供了編碼本申請的免疫偶聯(lián)物的分離的核酸序列。在一個實施方案 中，分離的核酸序列編碼包含SEQ ID NO :67限定的氨基酸序列的蛋白。在另一實施方案 中，分離的核酸序列包含SEQ ID NO :660本申請還包括這些核酸序列的變體。例如，變體包括在至少中等嚴(yán)格雜交條件下 與編碼本申請的免疫偶聯(lián)物的核酸序列雜交的核酸序列。(E)蛋白質(zhì)的制備本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，本申請的蛋白質(zhì)，例如本申請的輕鏈和重鏈互補(bǔ)決定 區(qū)、輕鏈和重鏈可變區(qū)、抗體和抗體片段、免疫偶聯(lián)物、新癌相關(guān)抗原可以以數(shù)種方法任一 種制備，但是最優(yōu)選使用重組方法制備。因此，本申請的核酸分子可以以已知方式整合入保證本申請的蛋白蛋白質(zhì)良好表 達(dá)的適宜表達(dá)載體中?？赡艿谋磉_(dá)載體包括，但不限于，粘粒、質(zhì)粒、或改造的病毒(例如復(fù) 制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，只要載體與所使用的宿主細(xì)胞相容即可。表 達(dá)載體“對于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是適宜的”，這意味著表達(dá)載體包含本申請的核酸分子和在待用 于表達(dá)的宿主細(xì)胞基礎(chǔ)上選擇的、有效連接至核酸分子的調(diào)節(jié)序列。有效連接旨在指以允 許核酸表達(dá)的方式將核酸連接至調(diào)節(jié)序列。因此，本申請包括包含本申請的核酸分子或其片段和對于所插入蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)節(jié)序列的重組表達(dá)載體。適宜調(diào)節(jié)序列可以來源于多種來源，包括細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動物、或昆蟲基因 (例如，見 Goeddel, Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述的調(diào)節(jié)序列)。適宜調(diào)節(jié)序列的選擇如下面所討論依 賴于所選擇的宿主細(xì)胞，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地實現(xiàn)。此類調(diào)節(jié)序列的實 例包括轉(zhuǎn)錄啟動子和增強(qiáng)子或者RNA聚合酶結(jié)合序列、核糖體結(jié)合序列，包括翻譯起始信 號。此外，取決于所選擇的宿主細(xì)胞和所采用的載體，其它序列，例如復(fù)制起點、額外的DNA 限制位點、增強(qiáng)子、和賦予轉(zhuǎn)錄可誘導(dǎo)性的序列可以整合入表達(dá)載體中。本申請的重組表達(dá)載體還可以包含選擇標(biāo)記基因，其利于選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有本申 請的重組分子的宿主細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因的實例是編碼下列蛋白質(zhì)的基因，例如賦予對某 些藥物抗性的G418和潮霉素、0 -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲螢光素酶或者免 疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白、優(yōu)選IgG的Fc部分。選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄通過選擇 標(biāo)記蛋白例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或螢火蟲螢光素酶濃度的變化來監(jiān)測。 如果選擇標(biāo)記基因編碼賦予抗生素抗性如新酶素抗性的蛋白質(zhì)，則轉(zhuǎn)化體細(xì)胞可以用G418 篩選。已經(jīng)整合有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡。這使得可以顯現(xiàn)和測定 本申請的重組表達(dá)載體的表達(dá)，并且具體而言可以確定突變對表達(dá)和表型的效應(yīng)。應(yīng)當(dāng)意 識到，選擇標(biāo)記可以引入到與目的核酸分開的載體上。重組表達(dá)載體還可以包含編碼融合部分的基因，所述融合部分提供了增強(qiáng)的重組 蛋白表達(dá)；增強(qiáng)的重組蛋白溶解度；和通過充當(dāng)親和純化中的配體來幫助靶重組蛋白的純 化。例如，蛋白酶水解位點可以加入至靶重組蛋白中以允許在融合蛋白純化之后將重組蛋 白與融合部分分離。代表性的融合表達(dá)載體包括pGEX(Amrad Corp. , Melbourne，澳大利 亞)、pMal(New England Biolabs,Beverly, MA)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ),它 們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A與重組蛋白融合。重組表達(dá)載體可以引入至宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)化有”、 “轉(zhuǎn)染有”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在包括通過本領(lǐng)域已知的多種可能技術(shù)之一將核酸(例如載 體)引入細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”，如本文所使用，旨在還包括已經(jīng)以本申請的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的、能夠糖基化的細(xì)胞。原核細(xì)胞可以通過例如電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化以核酸轉(zhuǎn)化。例如，核酸可以通過常規(guī)技術(shù)，例如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚 糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、lipofectin (脂轉(zhuǎn)染試劑)、電穿孔或微注射引入至哺乳動物細(xì)胞中。用于 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)和其它實驗室教科書中找 到。適宜的宿主細(xì)胞包括廣泛多種的真核宿主細(xì)胞和原核細(xì)胞。例如，本申請的 蛋白質(zhì)可以在酵母細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。其它適宜宿主細(xì)胞可以在Goeddel， Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego, CA(1991)中找到。此外，本申請的蛋白質(zhì)可以在原核細(xì)胞，例如大腸酐菌中表達(dá)(Zhang
Science 303(5656) :371_3 (2004))。此外，可以使用基于假單胞菌屬的表達(dá)系統(tǒng)，例 如熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)(美國專利申請公布號US 2005/0186666， Schneider, Jane C 等)。
適宜開展本申請酵母和真菌宿主細(xì)胞包括，但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和曲霉屬 (Aspergillus)的多個種。用于在釀酒酵母中表達(dá)的載體實例包括pY印Seel (Baldari. 等，Embo J. 6 :229-234(1987))、pMFa (Kur jan 和 Herskowitz，Cell 30 :933_943 (1982))、 pJRY88(Schultz 等，Gene 54 113-123(1987))和 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。用于酵母和真菌轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的(見Hirmen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929(1978) ；Ito 等，J. Bacteriology 153:163(1983)， 和 Cullen 等.(Nat BiolTech 5:369(1987))。除了其它，適宜實施本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞包括C0S (例如ATCC號CRL1650或 1651)、BHK (例如 ATCC 號 CRL 6281)、CH0 (ATCC 號 CCL 61)、HeLa (例如 ATCC 號 CCL 2)、 293 (ATCC號1573)和NS-1細(xì)胞。用于指引在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的適宜表達(dá)載體通常包 括啟動子(例如衍生自病毒物質(zhì)，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40)以 及其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8(Seed，B. , Nature 329 840(1987))和 pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J. 6 187-195 (1987))。按照本文提供的教導(dǎo)，啟動子、終止子和用于將適宜類型表達(dá)載體引入植物、禽類 和昆蟲細(xì)胞內(nèi)的方法也可以容易實現(xiàn)。例如，在一個實施方案中，本申請的蛋白質(zhì)可以從 植物細(xì)胞表達(dá)(見Sinkar等，J. Biosci (Bangalore) 11 :47_58 (1987)，其綜述了毛根農(nóng)桿 菌(Agrobacterium rhizogenes)載體的應(yīng)用；還見 Zambryski 等，Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender 和 Setlow(編者)，第 VI 卷，第 253-278 頁，Plenum Press, New York (1984)，其描述了表達(dá)載體用于植物細(xì)胞的用途，包括PAPS2022、PAPS2023 和 PAPS2034 等)。適宜實施本發(fā)明的昆蟲細(xì)胞包括來自蠶(Bombyx)、粉紋夜蛾(Trichoplusia) 或斜紋夜蛾(Spodotera)物種的細(xì)胞和細(xì)胞系?？衫玫挠糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(SF 9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，Mol.CellBiol.3 2156-2165(1983))禾口 pVL 系列(Luckow, VA.，禾口 Summers, M. D.，Virology 170 31-39(1989)?？蛇x地，本申請的蛋白質(zhì)還可以在非人轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)，例如大鼠、兔、綿羊和 豬(Hammer 等.Nature 315 :680_683(1985) ；Palmiter 等 Science222 :809_814(1983)； Brinster 等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442(1985) ；Palmiter 和 Brinster Cell 41 343-345 (1985)和美國專利號 4，736，866)。本申請的蛋白質(zhì)還可以通過使用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，例如固相合 成(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85 2149-2154 (1964) ；Frische 等，J. Pept. Sci. 2(4) 212-22(1996)) $ 同 夕夜內(nèi)(Houbenweyl, Methods ofOrganic Chemistry, H # E. Wansch，第 151 和 II 卷，Thieme, Stuttgart (1987))的化學(xué)合成來制備。包含與其它分子例如蛋白質(zhì)連接的本申請的蛋白質(zhì)的N末端或C末端融合蛋白 質(zhì)，可以通過重組技術(shù)經(jīng)融合加以制備。所得到的融合蛋白質(zhì)包含融合至如本文所述的所 選擇蛋白質(zhì)或標(biāo)記蛋白質(zhì)的本申請的蛋白質(zhì)。本申請的重組蛋白質(zhì)還可以通過已知技術(shù)連 接至其它蛋白質(zhì)。例如，可以使用如W0 90/10457中所述的異雙功能含巰基連接體N-琥珀 酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代丙酸酯)或N-琥珀酰亞胺基5硫代乙酸酯將蛋白質(zhì)偶聯(lián)。可以用于制備融合蛋白質(zhì)或連接物的蛋白質(zhì)的實例包括細(xì)胞結(jié)合蛋白，例如免疫球蛋白、激 素、生長因子、凝集素、胰島素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、內(nèi)啡肽類、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鈴蟾肽、脫 唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。因此，本申請?zhí)峁┝税幋a本申請的蛋白質(zhì)的核酸序列的重組表達(dá)載體，本申 請的蛋白質(zhì)為例如本申請的輕鏈和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)、輕鏈和重鏈可變區(qū)、結(jié)合蛋白例如抗 體和抗體片段、免疫偶聯(lián)物以及新的本申請的分離蛋白質(zhì)。此外，本申請?zhí)峁┝税旧暾?的核酸序列或重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。(f) ^^ma^m&^^mmmmm^^發(fā)明人已經(jīng)證明了本申請的結(jié)合蛋白顯示對IkB0蛋白-包括IkB0 l、IkB0 2和 癌相關(guān)的IkB0變體具有特異性。IkB0通常是胞內(nèi)的。然而，發(fā)明人已經(jīng)證實癌細(xì)胞可在 癌細(xì)胞表面表達(dá)可檢測的IkB0變體。因此，本發(fā)明人已經(jīng)證實本申請的結(jié)合蛋白顯示對 癌細(xì)胞的特異性。此外，發(fā)明人還證明了本申請的結(jié)合蛋白被癌細(xì)胞內(nèi)化。因此，本申請的 結(jié)合蛋白可以用于靶向遞送生物活性或者醫(yī)學(xué)相關(guān)試劑，例如成像劑、放射活性劑或細(xì)胞 毒性劑。一個實施方案是治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向患有或者懷疑患有癌癥的受試者 施用有效量的本申請的免疫偶聯(lián)物。另一實施方案是有效量的本申請的免疫偶聯(lián)物在制造 用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。此外，本申請?zhí)峁┝擞行Я康谋旧暾埖拿庖吲悸?lián)物 的用途，還包括附加的癌癥治療劑在制造用于同時、單獨或者依次治療或預(yù)防癌癥的藥物 中的用途。本申請還提供了有效量的本申請的免疫偶聯(lián)物用于治療或預(yù)防癌癥的用途。此 外，本申請?zhí)峁┝擞行Я康谋旧暾埖拿庖吲悸?lián)物的用途，還包括額外的癌癥治療劑用于同 時、單獨或依次治療或預(yù)防癌癥的用途。在一個實施方案中，癌癥包括，但不限于，胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌，以及宮頸癌、子 宮癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、頭頸癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃腸癌、乳腺癌(例如導(dǎo)管癌、小葉 癌和乳頭癌)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴細(xì)胞性白血 病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、和慢性髓性白血病)、腦癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肉 瘤、直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、漿細(xì)胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在另一實施方案中， 癌癥是結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、皮膚癌、子宮癌、頭頸癌、前列腺癌或肺癌。在又 一個實施方案中，癌癥是結(jié)腸癌、胰腺癌或腎癌。本申請的免疫偶聯(lián)物選擇性抑制或破壞癌性細(xì)胞的能力可以使用癌細(xì)胞系在體 外容易地試驗。本申請的免疫偶聯(lián)物的選擇性抑制作用可以通過例如證明癌細(xì)胞的細(xì)胞增 殖被選擇性地抑制來確定。毒性也可以基于細(xì)胞生存力測量，例如可以比較暴露于免疫偶聯(lián)物的癌細(xì)胞和正 常細(xì)胞培養(yǎng)物的生存力。細(xì)胞生存力可以通過已知技術(shù)，例如臺盼蘭排斥試驗評價。在另一實例中，可以使用許多模型以測試本申請的免疫偶聯(lián)物的有效性。 Thompson, E. ff.等(Breast Cancer Res. Treatment 31:357—370(1994))已經(jīng)描述了用 于通過測量腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的對細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶解和腫瘤細(xì)胞對重建基膜(膠原、層 粘連蛋白、纖連蛋白、Matrigel或明膠)的侵襲來確定人乳腺癌細(xì)胞體外侵襲的模型。其 它可應(yīng)用的癌細(xì)胞模型包括培養(yǎng)的卵。巢腺瘤細(xì)胞(Young，T.N.等.Gynecol. Oncol. 62 89-99(1996) ；Moore, D. H.等.Gynecol. Oncol. 65 :78_82 (1997))、人濾泡性甲狀腺癌細(xì)胞
26(Demeure, M.J.等，World J. Surg. 16 :770_776 (1992))、人黑素瘤(A-2058)和纖維肉瘤 (HT-1080)細(xì)胞系(Mackay，A. R.等 Lab. Invest. 70 781 783(1994))和肺鱗狀(HS-24)和 腺癌(SB-3)細(xì)胞系(Spiess，E.等.J. Histochem. Cytochem. 42 :917_929 (1994))。也已經(jīng) 描述了涉及在無胸腺裸鼠中腫瘤植入和測定腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)試驗系統(tǒng)(Thompson， E. ff.等,Breast Cancer Res. Treatment 31 :357_370(1994) ；Shi,Y. E.等，Cancer Res. 53 1409-1415(1993))。本申請的免疫偶聯(lián)物可以配制成用于向受試者施用的、適宜體內(nèi)施用的生物相容 形式的藥物組合物。物質(zhì)可以施用至活有機(jī)體，包括人和動物。本發(fā)明的治療有效量的藥 物組合物的施用定義為，在此劑量下和達(dá)到預(yù)期結(jié)果所必需的時間階段內(nèi)有效的量。例如， 物質(zhì)的治療有效量可以根據(jù)多種因素而變化，如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及 本申請的重組蛋白在個體內(nèi)引起所希望的反應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的治 療反應(yīng)。例如，可以每日施用數(shù)個分次劑量，或者如治療狀況的急迫性所指示，劑量可以按 比例減少。因此，本申請?zhí)峁┯糜谥委熁蝾A(yù)防癌癥的藥物組合物，包含本申請的免疫偶聯(lián)物 和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物中免疫偶聯(lián)物的效應(yīng)分 子是癌癥治療劑，更加優(yōu)選毒素。包含免疫偶聯(lián)物的藥物制劑可以全身施用。藥物制劑可以直接向癌癥部位施用。 取決于施用途徑，免疫偶聯(lián)物可以包裹在材料中以保護(hù)化合物不受酶、酸和可能使化合物 失活的其它天然條件作用。根據(jù)本申請的一個方面，免疫偶聯(lián)物通過直接施用遞送至患者。本申請考慮了藥 物組合物以至少足以達(dá)到終點的量施用，并且必要時包含可藥用載體。本申請還提供用于降低術(shù)后并發(fā)癥危險的方法，包括在手術(shù)治療癌癥之前、之中 或之后施用有效量的免疫偶聯(lián)物。本文所述的組合物可以通過用于制備可向受試者施用的可藥用組合物的實質(zhì)上 已知的方法來制備，以致于有效量的活性物質(zhì)與可藥用賦形劑組合在混合物中。適宜賦形 劑描述于，例如 Remington' s PharmaceuticalSciences (Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 20 版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa.，USA，2000)。在此基礎(chǔ)上，組合 物包括，然而非排他性地包括，物質(zhì)與一種或一種以上可藥用賦形劑或稀釋劑結(jié)合的溶液， 并且包含在具有適宜PH和與生理流體等滲的緩沖溶液中。藥物組合物包括但不限于，凍干粉末或者水性或非水性無菌注射溶液或混懸液， 其還可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得組合物基本上與預(yù)期接收者的組織或血液 相容的溶質(zhì)。可以存在于此類組合物中的其它成分包括例如水、表面活性劑(例如Tween)、 醇類、多元醇類、甘油和植物油類。臨時配制的注射溶液和混懸液可以從無菌粉末、顆粒、片 劑、或濃溶液或混懸液制備。免疫偶聯(lián)物可以作為在向患者施用之前用無菌水或鹽水重構(gòu) 的凍干粉末加以提供，但不限于此方式。藥物組合物可以包含可藥用載體。適宜可藥用載體包括基本上化學(xué)惰性的和無 毒的不干擾藥物組合物生物活性有效性的組分。適宜藥物載體的實例包括但不限于水、 鹽溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2，3-二油?；?oleyloxy))丙基)N，N, N_三甲基氯化銨 (D0TMA)、二油?；字?phosphotidyl)乙醇胺(DOPE)和脂質(zhì)體。此類組合物應(yīng)包含治
27療有效量的化合物以及適宜量的載體以便提供用于向患者直接施用的形式。組合物可以是可藥用鹽的形式，其包括但不限于與游離氨基形成的那些，例如從 鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的那些，和與游離羧基形成的那些，例如從氫氧化鈉、 氫氧化鉀、氫氧化胺、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡 因等衍生的那些。在多個實施方案中，藥物組合物直接全身施用，或者直接向一個或多個腫瘤區(qū)施用。藥物組合物可以用于治療患有癌癥的動物(包括哺乳動物，優(yōu)選人)的方法中。待 施用的免疫偶聯(lián)物的劑量和類型將取決于多種因素，其可以在人受試者中容易地監(jiān)測。此 類因素包括癌癥的病原學(xué)和嚴(yán)重性(級別和階段)。使用本申請的免疫偶聯(lián)物治療癌癥的臨床結(jié)果可由相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員，如醫(yī)生 容易地辨別。例如，測量癌癥的臨床標(biāo)志的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)試驗可以是治療有效性的強(qiáng)指示劑。此 類試驗可包括，但不限于，身體檢查、性能尺度、疾病標(biāo)志物、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、腫瘤測量、組織 活檢、細(xì)胞檢查、細(xì)胞學(xué)、腫瘤的最長直徑計算、放射攝影術(shù)、腫瘤的數(shù)字成像、生命體征、體 重、不良事件記錄、感染發(fā)作的評估、伴行用藥的評估、疼痛評估、血液或血清化學(xué)、尿液分 析、CT掃描、和藥物代謝動力學(xué)分析。此外，包括免疫偶聯(lián)物和另一癌癥治療劑的聯(lián)合治療 的協(xié)同效應(yīng)可通過與經(jīng)受單一療法的患者進(jìn)行比較研究來確定。在大多數(shù)許可的癌癥治療法中，癌癥治療法用于與其它癌癥治療法聯(lián)合。因此， 本申請?zhí)峁┦褂帽旧暾埖拿庖吲悸?lián)物與至少一種另外癌癥治療法聯(lián)合預(yù)防或治療癌癥的 方法。其它癌癥治療法可以在免疫偶聯(lián)物施用之前施用、交叉重疊施用、并行施用和/或 之后施用。當(dāng)并行施用時，免疫偶聯(lián)物和其它癌癥治療劑可以在單一制劑中施用或者在 分開的制劑中施用，并且，如果分開施用，則任選通過不同施用模式施用。一種或一種以 上免疫偶聯(lián)物和一種或一種以上其它癌癥治療法的組合將協(xié)同作用以對抗腫瘤或癌癥。 其它癌癥治療法包括但不限于其它癌癥治療劑，包括但不限于2，2，2三氯三乙胺鹽酸鹽 4,4' -(1,2-乙二基(Ethanediyl))雙(1_異丁氧基羰基氧基甲基_2，6-哌嗪二酮、5， 6- 二氫-5-氮胞苷、5-羥基-2-甲酰基吡啶硫代縮氨基脲、6-氮雜尿苷、6-重氮-5-氧 代-L-正亮氨酸、相思豆毒蛋白、阿西維辛、阿柔比星、阿地流津、阿侖單抗、異秋水仙堿、甲 胎蛋白、a-硫脫氧鳥苷、六甲蜜胺、氨基喜樹素、氨基格魯米特、氨基蝶呤衍生物、氨萘非 特二鹽酸鹽、氨萘非特L-蘋果酸鹽、安吖啶、阿那曲唑、鹽酸安西他濱、血管生成素、反義寡 核苷酸、血管抑制素、蒽霉素、蒽吡唑、艾菲地可寧甘氨酸酯、門冬酰胺酶auristatin E、自 體細(xì)胞或組織、阿扎胞苷、偶氮絲氨酸、氮丙啶、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)、卡介 苗活疫苗、苯替派(benzot印a)、^倍他米松、0硫鳥嘌呤脫氧核糖核苷、貝伐單抗、金霉 素、比卡魯胺、比?？?、博來霉素、勃地酮、布喹那、布舍瑞林、白消安、放線菌素c、加利車霉 素、卡普睪酮、卡培他濱、卡鉬、碳鉬、羧基鄰苯二甲酸鉬、癌胚抗原肽1、癌胚抗原肽1-6D、 卡氮芥、卡柔比星、嗜癌菌素A、CC-1065、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、醋酸氯地孕酮、氯脲霉 素、色霉素、順鉬、克拉屈濱、克羅米松、秋水仙堿、秋水仙堿衍生物、皮質(zhì)醇、可的松、氰基嗎 啉代多柔比星、環(huán)戊二烯、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、細(xì)胞松弛素B、達(dá)卡巴嗪更生霉素、達(dá)沙替 尼、柔紅霉素、地西他濱(decitabine)、秋水仙胺、地尼白介素(denileukin diftitox)、 脫氧多柔比星、地塞米松、二脫水半乳糖醇、地吖醌、二氯烯丙基指甲花醌、白喉毒素、偏
28端霉素A、多西他塞、多拉司他汀10、去氧氟尿苷、多柔比星、屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯 (dromostanolone propionate)、柔紅霉素酉享(duborimycin)、倍癌霉素 A、倍癌霉素 SA、依 達(dá)曲沙、依洛尼塞、依利醋銨、依米丁、乙嘧替氟、內(nèi)皮抑制素、依諾他濱、表柔比星、環(huán)硫雄 醇、鹽酸埃羅替尼、埃斯波霉素、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙錠、依托格魯、依托泊苷、法倔唑、 芬維A胺(fenretinide)、氟脲苷、氟達(dá)拉濱、氟多潘、氟他胺、福美坦、磷雌酚、福莫司汀、硝 酸鎵、吉非替尼、鹽酸吉西他濱、吉妥珠單抗奧唑米星、糖皮質(zhì)激素、戈舍瑞林、短桿菌肽D、 胍唑、大田軟海綿素B、h印sulfam、己烷雌酚、人絨毛膜促性腺激素、海蒽酮、羥基脲、伊達(dá) 比星、異環(huán)磷酰胺、甲磺酸伊馬替尼、英丙舒凡、肌苷乙醇二醛(inosineglycodialdehyde)、 干擾素、干擾素-a、干擾素、干擾素-Y、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15、白細(xì)胞介 素-18、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_6、白細(xì)胞介素類、伊 立替康、異丙鉬、L"門冬酰胺酶、拉帕替尼二苯甲磺酸酯、鹽酸伊立替康、香菇多糖、來曲 唑、甲酰四氫葉酸鈣、醋酸亮丙瑞林(抑那通)、左旋咪唑、利多卡因、羅莫司丁、氯尼達(dá) 明(lonidamine)、lucorteum、淋巴因子、淋巴毒素、麥克菌素II、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、甘 露醇氮芥、美登素、鹽酸氮芥、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、 美雄烷、巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物、美烏替派、單甲基auristatin E、 miltefosine、二溴甘露醇、丙米腙(mitoguazone)、二溴衛(wèi)矛醇、絲裂霉素C、曼托坦、米托 蒽醌、米托唑酰胺、蒙匹胺醇、嗎啉代多柔比星、突變的腫瘤特異性抗原、霉酚酸、N-(膦乙 ?；?-L_天冬氨酸、N、N- 二芐基柔紅霉素、神經(jīng)生長因子、尼羅替尼、尼魯米特、尼莫司 汀、二胺硝吖啶(nitracine)、諾加拉霉素、非自體細(xì)胞或組織、奧利默森(oblimersen)、雌 激素、0GX-011、橄欖霉素類、骨黏連蛋白0NYX-015、草酸鉬、泰素、泰素衍生物、1-(2_氯乙 基)-3-(2，6_ 二氧-3-哌啶基)-1_亞硝基脲、培門冬酶、噴司他丁(pentostatin)、派來霉 素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、苯芥膽留醇、普卡霉素、哌嗪衍生物、哌嗪雙 酮、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、卩比曲克辛、piroxantrone、血小板衍生生長因子、纖維蛋 白溶酶原kringle 5、普卡霉素、鬼白毒素、聚磷酸雌二醇、聚谷氨酸毒樹堿卟吩姆鈉、紫菜 霉素、松龍苯芥、潑尼松、丙卡巴胼、普魯卡因、丙帕鍺(propagermanium)、普萘洛爾、假單 胞菌屬外毒素、多糖-K，蝶羅呤(pteropterin)、嘌呤霉素、吡唑霉素、吡唑啉吖啶、吡唑咪 唑、雷替曲塞(raltitrexed)、雷諾氮芥(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、重組人細(xì)胞單 細(xì)胞集落刺激因子、類視黃醇、根霉素、蓖麻毒蛋白A、利妥昔單抗羅喹美克、絲氫酸蛋白酶 抑制劑、甲苯磺酸索拉非尼、鍺螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、鏈黑菌 素、鏈脲霉素、蘋果酸舒尼替尼、檸檬酸他莫昔芬、替加氟脲、替莫唑胺(temozolomide)、替 尼泊苷、細(xì)交鏈孢菌酮酸(enuazonicacid)、臺羅西隆(teroxirone)、睪內(nèi)脂、丁卡因、四氯 己鉬胺(tetraplatin)、沙立度胺、硫代秋水仙堿、硫鳥嘌呤、硫嘌呤、噻替派、trabectedin、 血小板反應(yīng)蛋白I衍生的肽、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、拓?fù)涮婵怠⑼腥鹈追?、曲妥珠?抗、維甲酸、三嗪苯酰胺、三亞胺醌、三亞乙基三聚氰胺、曲洛司坦、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲 普瑞林、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、trofosfamide、殺結(jié)核菌素、腫瘤壞死因子樣細(xì)胞因子、 重組腫瘤壞死因子家族蛋白、烏苯美司、尿嘧啶芥子、尿嘧啶、烏瑞替哌、聚氨酯、凡德他尼、 VEGF反義寡核苷酸、長春堿、硫酸長春堿、長春新堿、硫酸長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、吉 雄-864(yoshi-864)、凈司他丁、佐柔比星。 在另一實施方案中，一種或一種以上的本申請的免疫偶聯(lián)物可以與一種或一種以上的下列癌癥治療法或者下列類別治療劑組合施用，包括但不限于放射治療、手術(shù)治療、基 因治療、控制副作用的試劑(例如抗組胺劑、抗惡心劑)、癌癥疫苗、血管發(fā)生抑制劑、免疫 調(diào)節(jié)劑、抗炎劑、免疫抑制劑、提高抗原表達(dá)的試劑、與癌癥治療相關(guān)的其它試劑、化學(xué)治療 劑、免疫治療劑、光敏劑、tk抑制劑、抗生素、抗代謝物劑、用于斷裂DNA的試劑、用于斷裂微 管蛋白的試劑、烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑、細(xì)胞因子、生長因子、 激素治療、長春花生物堿、植物生物堿和/或抗有絲分裂劑。的確，向需要此類治療的患者施用有效量的免疫偶聯(lián)物將導(dǎo)致具有顯著臨床功效 的另一癌癥治療劑的劑量減少。降低其它癌癥治療劑劑量的此種功效在不施用免疫偶聯(lián)物 時觀察不到。因此，本申請?zhí)峁┝酥委熌[瘤或癌癥的方法，包括施用減少劑量的一種或一種 以上其它癌癥治療劑。此外，向需要此種治療的患者進(jìn)行包含免疫偶聯(lián)物的聯(lián)合治療與標(biāo)準(zhǔn)治療方案的 持續(xù)期間和周期數(shù)相比治療時間相對縮短。因此，本申請?zhí)峁┲委熌[瘤或癌癥的方法，包括 在相對短的持續(xù)時間內(nèi)和/或在較少的治療周期中施用一種或一種以上其它癌癥治療劑。因此，根據(jù)本申請，包含免疫偶聯(lián)物和另一癌癥治療劑的聯(lián)合治療可以降低總體 癌癥治療的毒性(即副作用)。例如，與單一治療或者另種聯(lián)合治療相比，當(dāng)遞送減少劑量 的免疫偶聯(lián)物和/或其它癌癥治療劑和/或當(dāng)減少周期的持續(xù)時間(即單一施用的周期或 一系列此類施用的周期)和/或當(dāng)減少周期數(shù)時，可以觀察到毒性降低。因此，本申請?zhí)峁┧幬锝M合物，其包含免疫偶聯(lián)物和一種或一種以上另外的抗癌 治療劑，任選地在可藥用載體中。本申請還提供試劑盒，包含有效量的免疫偶聯(lián)物，任選地與一種或一種以上其它 癌癥治療劑組合，以及其用于治療癌癥的使用說明書。試劑盒還可以包括輔助試劑。例如， 試劑盒可以包括用于將免疫偶聯(lián)物注射入受試者的器械，如注射器；儲藏或運(yùn)輸免疫偶聯(lián) 物的容器；和/或可藥用賦形劑、載體、緩沖液或穩(wěn)定劑。如上所述，使用免疫偶聯(lián)物的聯(lián)合治療可以使癌癥或腫瘤對另一癌癥治療劑的施 用敏感。因此，本申請考慮了用于預(yù)防、治療癌癥和/或防止癌癥復(fù)發(fā)的聯(lián)合治療，包括在 施用減少劑量的癌癥治療劑之前、之后或者同時施用有效量的免疫偶聯(lián)物。例如，使用免疫 偶聯(lián)物的最初治療將增加癌癥或腫瘤對隨后的癌治療劑劑量治療的敏感性。該劑量接近或 低于當(dāng)癌癥治療劑單獨施用時或者在缺乏免疫偶聯(lián)物的情況下施用時標(biāo)準(zhǔn)劑量的低值。當(dāng) 并行施用時，免疫偶聯(lián)物可以與癌癥治療劑分開施用，并且任選地通過不同的施用模式施 用。在可選實施方案中，另一癌癥治療劑的施用將使癌癥或腫瘤對免疫偶聯(lián)物或結(jié)合 蛋白敏感。在此種實施方案中，另一癌癥治療劑可以在免疫偶聯(lián)物或結(jié)合蛋白施用之前給 與。在一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括順鉬，例如PLATIN0L或 PLATINOL-AQ (Bristol Myers)，劑量為約 5-10、11-20、21_40 或 41_75mg/m2/周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括卡鉬，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，劑量為約 2-3、4_8、9_16、17-35/ 或 36_75mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括環(huán)磷酰胺，例如CYTOXAN (Bristol Myers Squibb)，劑量為約 0. 25-0. 5,0. 6-0. 9、1_2、3-5、6_10、11—20 或 21_40mg/kg/ 周期。
在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括阿糖胞苷，例如 CYTOSAR-υ(Pharmacia & Upjohn)，劑量為約 0. 5_1、2-4、5_10、11_25、26_50 或 51-IOOmg/ m2/周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括阿糖胞苷脂質(zhì)體，例如 DEPOCYT(Chiron Corp.)，劑量為約 5_50mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括達(dá)卡巴嗪，例如DTIC或 DTICDOME(Bayer Corp.)，劑量為約 15_250mg/m2/ 周期、約 0. 2_2mg/kg/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括拓?fù)涮婵?，例如?HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，劑量為約 0. 1 到 0. 2,0. 3 到 0. 4,0. 5 到 0. 8 或 0. 9 到 1. 5mg/m2/周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括拓?fù)涮婵?，例如?CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn)，劑量為約 5 到 9、10 到 25 或 26 到 50mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括氟達(dá)拉賓，例如，F(xiàn)LUDARA(Berlex Laboratories)，劑量為約 2. 5 到 5、6 到 10、11 到 15 或 16 到 25mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括阿糖胞苷(Ara-C)，劑量為約200到 2000mg/m2/ 周期、300 到 1000mg/m2/ 周期、400 到 800mg/m2/ 周期或 500 到 700mg/m2/ 周 期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括多西他賽，例如，TAX0TERE(Rhone Poulenc Rorer)，劑量為約 6 到 10、11 到 30 或 31 到 60mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括泰素，例如，TAXOL(BristolMyers Squibb)，劑量為約 10 到 20,21 到 40,41 到 70 或 71 到 135mg/kg/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括5-氟尿嘧啶，劑量為約0. 5到5mg/ kg/周期、1到4mg/kg/周期或2-3mg/kg/周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括多柔比星，例如， ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、D0XIL(Alza)、RUBEX(Bristol MyersSquibb)，劑量為約 2 到 4、5 到 8、9 到 15、16 到 30 或 31 到 60mg/kg/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括依托泊苷，例如， VEPESID (Pharmacia & Upjohn)，劑量為約 3. 5 到 7、8 到 15、16 到 25 或 26 到 50mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括長春堿，例如，VELBAN(EliLilly), 劑量為約0. 3到0. 5、0. 6到0. 9、1到2或3到3. 6mg/m2/周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括長春新堿，例如，ONCOVIN(Eli Lilly)，劑量為約 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6 或 0. 7mg/m2/ 周期。在另一種實施方案中，另外的癌癥治療劑包括甲氨喋呤，劑量為約0.2到0.9、1到 5、6 到 10 或 11 到 20mg/m2/ 周期。因此，聯(lián)合治療可以增加癌癥或腫瘤對所施用免疫偶聯(lián)物和/或另一癌癥治療劑 的敏感性。以該種方式，更短的治療周期是可能的，由此減少了毒性事件。周期持續(xù)時間 可以根據(jù)使用的特定癌癥治療劑而變化。本申請還考慮了連續(xù)或者間斷施用，或者日劑量 分成數(shù)個部分施用。對于特定癌癥治療劑的適宜周期持續(xù)時間將由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定， 并且本申請考慮了對于每一癌癥治療劑的最佳治療方案的連續(xù)評估。對于技術(shù)人員的具體指導(dǎo)在本領(lǐng)域是已知的。見例如Therasse等，2000，“New guidelines to evaluate the response to treatmentin solid tumors。 European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute ofCanada,"J N atl Cancer Inst. Feb 2 ；92 (3) :205_16o考慮了免疫偶聯(lián)物可以通過任可適宜方法施用，例如注射、口服施用、吸入經(jīng)皮或 者瘤內(nèi)施用，而任何其它癌癥治療劑可以通過相同施用模式或者另一施用模式遞送至患 者。此外，當(dāng)打算將多重癌癥治療劑遞送至患者時，免疫偶聯(lián)物和一種或一種以上其它癌癥 治療劑可以通過一種方法遞送，而其它癌癥治療劑可以通過另一種施用方式遞送。(G) ■齢舶麵斿龍_關(guān)去禾口i·所公開的結(jié)合蛋白選擇性地結(jié)合至癌細(xì)胞上或癌細(xì)胞內(nèi)，但是沒有明顯地結(jié)合至 正常細(xì)胞。因此，結(jié)合蛋白可以用于癌癥診斷。因此，本申請包括診斷方法、試劑和試劑盒，其本身可以使用，或者在治療方法之 前、之中或者之后使用以確定是否存在癌細(xì)胞在一個實施方案中，本申請?zhí)峁z測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)將來自所述受試者的測試樣品與本申請的特異性結(jié)合至癌細(xì)上抗原的結(jié)合蛋 白或免疫偶聯(lián)物接觸，以產(chǎn)生結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物；(2)測量測試樣品中結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物的量；和(3)比較測試樣品和對照中結(jié)合蛋白_抗原復(fù)合物的量。在一個實施方案中，抗原是IkBP蛋白，如IkBP l、IkBi32和/或癌相關(guān)的IkBii 變體。本申請還包括用于診斷癌癥的試劑盒，包含任何一種本申請的結(jié)合蛋白或免疫偶 聯(lián)物和用于診斷癌癥的使用說明書。試劑盒還可包括輔助試劑。例如，試劑盒可以包括額 外的試劑，例如直接或間接檢測本申請的結(jié)合蛋白或免疫偶聯(lián)物的試劑；用于儲存或運(yùn)輸 結(jié)合蛋白或免疫偶聯(lián)物的容器；陽性和/或陰性對照或參照標(biāo)準(zhǔn)；和/或其他緩沖液或穩(wěn) 定劑。對于在診斷應(yīng)用中的使用，結(jié)合蛋白、優(yōu)選抗體或抗體片段可以以可檢測標(biāo)記來 標(biāo)記，例如不透射線的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I ；熒光化合物(熒 光團(tuán))或化學(xué)發(fā)光化合物(生色團(tuán))，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或螢光素；酶，例如堿性 磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；顯像劑；或金屬離子。如上所述，將標(biāo)記附著至 結(jié)合蛋白(例如抗體或抗體片段)的方法是本領(lǐng)域已知的。本申請的另一個方面是檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，包括步驟(1)測量從所述受試者取得的測試樣品中本申請的抗體的量；和(2)比較測試樣品和對照中本申請的抗體的量。在一個實施方案中，通過例如ELISA測量測試樣品中抗體的量來測量抗體的量。 在另一個實施方案中，通過例如RT-PCR測量測試樣品中編碼本申請的抗體的核酸的表達(dá) 水平來測量抗體的量。(H)藥物組合物、方法和抗原的用途本申請已經(jīng)鑒定了在癌細(xì)胞表面上遞呈，但是在正常細(xì)胞上表面沒有明顯表達(dá)的 抗原。因此，該抗原可以用于治療和預(yù)防癌癥的治療中。如上所述，IkB β蛋白，諸如IkB β 1和IkB β 2通常不含餓跨膜結(jié)構(gòu)域，并且不在細(xì)胞表面上表達(dá)。因此，本發(fā)明的抗原抗可以 用做治療靶來治療和預(yù)防癌癥。例如，癌相關(guān)的IkBii變體或其部分(諸如胞外結(jié)構(gòu)域) 可以用于引發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng)。此外，本申請包括使用抗原以檢測或監(jiān)測癌癥。⑴藥物組合物一個實施方案是藥物組合物，包含與適宜稀釋劑或載體混合的、有效量的本申請 的抗原。另一個實施方案是藥物組合物，包含與適宜稀釋劑或載體混合的、有效量的分離的 核酸，所述分離的核酸編碼本申請的抗原。本申請的進(jìn)一步的方面是藥物組合物，包含與適 宜稀釋劑或載體混合的、有效量的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含編碼本申請的抗 原的核酸序列。在一個實施方案中，本申請的抗原是癌相關(guān)的IkBii變體。例如，本申請的藥物組合物可以用于治療或預(yù)防癌癥。此外，藥物組合物可以用于 引發(fā)受試者針對在細(xì)胞表面表達(dá)本申請的抗原的癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。藥物組合物可以如上制備和施用。藥物組合物可以用于與如上所述的其它抗癌癥 治療劑聯(lián)使用。如果免疫試劑(即本申請的抗原或其變體、和/或其編碼核酸序列、和/或重組表 達(dá)載體的試劑)和/或組合物與佐劑共同免疫，而不管施用形式如何，可以顯著改善免疫原 性。通常，佐劑作為0.05%至1.0%的磷酸緩沖鹽水溶液使用。佐劑增強(qiáng)免疫原的免疫原 性，但是本身不必然是免疫原性的。佐劑可通過將免疫原保留在施用部位的局部附近而發(fā) 揮作用，以產(chǎn)生儲存效應(yīng)，利于免疫原向免疫系統(tǒng)的細(xì)胞緩慢持續(xù)釋放。佐劑也可以將免疫 系統(tǒng)的細(xì)胞吸引至免疫原庫，并且刺激此類細(xì)胞以引起免疫反應(yīng)。由此，實施方案包括還包 含佐劑的藥物組合物。多年來已經(jīng)使用佐劑改善宿主對例如疫苗的免疫反應(yīng)。內(nèi)部佐劑(例如脂多糖 類)正常情況下是用作疫苗的滅活或減毒細(xì)菌的成分。外部佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑，其有代表 性地非共價連接至抗原并且被配制為增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)。因此，已經(jīng)鑒定了增強(qiáng)對胃腸外 遞送的抗原的免疫反應(yīng)的佐劑。然而，這些佐劑中的一些是毒性的，并且會產(chǎn)生不良副作 用，使得它們不適宜在人和多種動物中使用。實際上，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(通稱明礬) 是常規(guī)用作人疫苗和獸疫苗中的佐劑。已經(jīng)良好確立了明礬在增強(qiáng)對白喉毒素和破傷風(fēng)毒 素的抗體反應(yīng)中的有效性。盡管如此，它確實具有局限性。例如，明礬對于流感疫苗接種是 無效的，并且與其它免疫原引起的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)不一致。由使用明礬作為佐劑的抗 原在小鼠中引出的抗體主要是IgGl同種型，其對于由一些疫苗試劑提供的保護(hù)而言不是 最佳的。廣泛的外部佐劑可刺激針對免疫原的有效免疫反應(yīng)。這些佐劑包括與膜蛋白抗原 復(fù)合的皂苷類(免疫刺激復(fù)合物)、帶有礦物油的普盧蘭尼克聚合物、滅活的分枝桿菌和礦 物油、弗氏完全佐劑、細(xì)菌產(chǎn)物如胞壁?；?MDP)和脂多糖(LPS)、以及脂質(zhì)Α、和脂質(zhì) 體。在本申請的一個方面中，在任何本文所述實施方案中可用的佐劑如下。對于腸 胃外免疫的佐劑包括鋁化合物(例如氫氧化鋁、磷酸鋁和羥基磷酸鋁(aluminum hydroxy phosphate))0根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，抗原可以與鋁化合物沉淀或者被吸附至鋁化合物上。其他佐 劑例如RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)也可以在腸胃外施用中使用。對于黏膜免疫的佐劑包括細(xì)菌毒素(例如霍亂毒素(CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒
33素(LT)、艱難梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)、或其組合、亞基、類毒素或突變體)。例如， 天然霍亂毒素亞基B(CTB)的純化制劑是可以使用的。這些毒素中任何毒素的片段、同 系物、衍生物和融合物也是適宜的，只要它們保留了佐劑活性即可。優(yōu)選地，使用具有降 低毒性的突變體。適宜突變體已經(jīng)描述(例如在WO 95/17211 (Arg-7-Lys CT突變體)、 W09606627(Arg-192-Gly LT 突變體)、和 WO 95/34323 (Arg-9-Lys 和 Glu-129-Gly PT 突變 體)中)。可以在本申請的方法和組合物中使用的另外的LT突變體包括例如Ser-63-Lys、 Ala-69-Gly、Glu-l IO-Asp和Glu-112-Asp突變體。其它佐劑(例如多種來源(如大腸桿菌、 明尼蘇達(dá)沙氏桿菌(Salmonella minnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium) 或福氏志賀菌(Shigella fIexneri))的細(xì)菌單磷酰脂A(MPLA)、皂苷類、或聚交酯乙交酯 共聚物PLGA)微球)也可以用于粘膜施用中。對于黏膜免疫和腸胃外免疫兩者有用的佐劑包括聚磷腈(例如W09502415)、 DC-chol (3b-(N-(N' , N' - 二甲氨基甲烷)_氨甲酰基)膽固醇)(例如美國專利號 5，283，185 和 W 96/14831)和 QS-21 (例如，W08809336)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)途徑用藥物組合物免疫受試者，所述藥 物組合物包含本申請的抗原、編碼其的分離的核酸序列和/或重組表達(dá)載體。這可以包括， 例如經(jīng)過黏膜(例如眼睛的、鼻內(nèi)的、口腔的、胃的、肺的、腸的、直腸的、陰道的或泌尿道 的)表面的免疫、經(jīng)過腸胃外(例如皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))途徑的免疫或者 結(jié)節(jié)內(nèi)免疫。優(yōu)選的途徑依賴于所選擇的免疫原，并且這對于本領(lǐng)域技述人員是顯而易見 的。施用可以以單一劑量或者定期重復(fù)來實施。合適的劑量依賴于技術(shù)人員能理解的多種 參數(shù)，例如免疫原本身(即是肽還是核酸(并且更加具體而言是其類型))、施用途徑和待免 疫的動物的狀況(體重、年齡等等)。本申請還提供試劑盒，包含有效量的本申請的抗原，任選地一種或一種以上其它 癌癥治療劑組合，以及其使用說明書。試劑盒還可以包含輔助試劑。例如，試劑盒可以包括 用于向受試者注射本申請的抗原的器械，例如注射器；用于儲存或運(yùn)輸本申請的抗原的容 器；佐劑；和/或可藥用賦形劑、載體、緩沖液或穩(wěn)定劑。在一個實施方案中，本申請的抗原 是癌相關(guān)的IkBii變體。(ii)治療方法如上面所提到，本申請的抗原存在于癌細(xì)胞上，但是不明顯存在于正常細(xì)胞上。因 此，本申請的抗原或其部分(諸如胞外結(jié)構(gòu)域)可以用于預(yù)防或治療癌癥的治療方法中。此 外，本申請的抗原或其部分(諸如胞外結(jié)構(gòu)域)可以用于引起受試者例如疫苗免疫反應(yīng)。—個實施方案是本申請的抗原在制造治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。另一個實 施方案是抗原在制造引起受試者中免疫反應(yīng)的藥物中的用途。本申請還包括編碼本申請的抗原的分離的核酸序列在制造治療或預(yù)防癌癥的藥 物中的用途。此外，本申請包括編碼抗原的分離的核酸序列在制造引起受試者中免疫反應(yīng) 的藥物中的用途。進(jìn)一步的實施方案是重組表達(dá)載體在制造治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途，所述 重組表達(dá)載體包含編碼本申請的抗原的分離的核酸序列。同樣，本申請包括重組表達(dá)載體 在制造引起受試者中免疫反應(yīng)的藥物中的用途，所述重組表達(dá)載體包含編碼本申請的抗原 的分離的核酸序列。
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另外的實施方案是治療或預(yù)防患有或者懷疑患有癌癥的受試者中癌癥的方法，包 括向所述受試者施用有效量的本申請的抗原。此外，本申請包括治療或預(yù)防患有或懷疑患 有癌癥的受試者中癌癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的分離的核酸序列，所述分 離的核酸序列編碼本申請的抗原。此外，本申請包括治療或預(yù)防患有或者懷疑患有癌癥的 受試者中癌癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體 包含編碼本申請的抗原的分離的核酸序列。另一個實施方案是誘導(dǎo)受試者中針對癌癥的免疫反應(yīng)的方法，包括向所述受試者 施用有效量的本申請的抗原。此外，本申請包括誘導(dǎo)受試者中針對癌癥的免疫反應(yīng)的方法， 包括向所述受試者施用有效量的分離的核酸序列，所述分離的核酸序列編碼本申請的抗 原。此外，本申請包括誘導(dǎo)受試者中針對癌癥的免疫反應(yīng)的方法，包括向受試者施用有效量 的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含編碼本申請的抗原的分離的核酸序列。在一個實施方案中，本申請的抗原是癌相關(guān)的IkBii變體。(iii)診斷方法本申請的抗原表達(dá)癌細(xì)胞上，并且沒有明顯地表達(dá)于正常細(xì)胞上，因此對本申請 的細(xì)胞表面上抗原的檢測可以用作癌癥的診斷方法。另外，對癌相關(guān)的IkBii變體的RNA 的檢測可以用作癌癥的診斷方法。一個實施方案是檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，包括檢測樣品中細(xì)胞上的本申 請的抗原，其中如果在細(xì)胞上檢測到本申請的抗原，則表明具有癌癥。多種技術(shù)可以用于檢測細(xì)胞上的本申請的抗原。例如，本申請的結(jié)合蛋白可以用 于免疫測定中以檢測本申請的抗原的細(xì)胞表面表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，多種技 術(shù)可以用于檢測和/或定量抗原的細(xì)胞表面表達(dá)，包括Western印跡、免疫沉淀接著進(jìn)行 SDS-PAGE、免疫細(xì)胞化學(xué)、FACS、蛋白質(zhì)陣列等。本申請一個方面是檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，包括檢測樣品中細(xì)胞的本申 請的癌相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)，其中如果在細(xì)胞內(nèi)檢測到癌相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)，則 表明具有癌癥。在一個實例中，編碼本申請的癌相關(guān)的IkBii變體的RNA表達(dá)產(chǎn)物用于檢 測細(xì)胞內(nèi)癌相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，可以通過檢測編碼癌相 關(guān)的IkB β變體的mRNA、或者特異性和/或選擇性雜交至編碼癌相關(guān)的IkB β變體的mRNA 的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產(chǎn)物、合成DNA、合成RNA或者天然存在的或修飾的核苷酸 的其它組合來檢測或定量RNA表達(dá)產(chǎn)物。多種方法可以用于檢測和/或定量細(xì)胞內(nèi)癌相關(guān)的IkBii變體的RNA表達(dá)，包括 RT-PCR、核酸酶保護(hù)試驗如核糖核酸酶保護(hù)試驗和Sl核酸酶試驗、和Northern印跡等。在分離編碼本申請的抗原的mRNA和/或癌相關(guān)的IkB β變體的mRNA后也可以使 用本領(lǐng)域已知的方法檢測基因組突變。在一個實施方案中，癌相關(guān)的IkB β變體是IkB β 2變體。(I)其它方法IkB β是NFk-B的抑制調(diào)節(jié)劑。由此，IkB β在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡和炎性反應(yīng)中 發(fā)揮重要的作用。通常在細(xì)胞表面不存在IkB β。通常非磷酸化的IkBii結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)中 的NFk-B中，并阻止NFk-B進(jìn)入細(xì)胞核中。相反，癌相關(guān)的IkBii變體具有至少一個跨膜結(jié) 構(gòu)域并且存在于癌細(xì)胞的表面上。因此，不限于理論，所述癌癥相關(guān)的IkBii變體能夠破壞
35癌細(xì)胞中IkBii中的正常作用。由此，本申請包括通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中癌相關(guān)的IkBii變體 的活性或恢復(fù)或取代癌細(xì)胞中IkBii活性來治療和預(yù)防受試者癌癥的方法。在本申請的一個實施方案中，治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法包括預(yù)防或降低癌 相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)或功能或修復(fù)或代替癌細(xì)胞中IkBii的正常功能?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來預(yù)防或降低細(xì)胞中癌相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)，包括使用對 癌相關(guān)的IkBii基因變體的轉(zhuǎn)錄物反應(yīng)的反義分子、三螺旋分子或核酶分子。例如，標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于產(chǎn)生反義核酸分子，S卩，與編碼目的多肽的有義核酸互補(bǔ) 的分子，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)的分子，或與mRNA序列互補(bǔ)的分子。因此，反 義核酸分子能夠氫鍵合到有義核酸。反義核酸能夠互補(bǔ)于整個編碼鏈或其部分，例如，全部 或部分的蛋白編碼區(qū)(或開放閱讀框)。反義核酸分子能夠反義于編碼目的多肽的核苷酸 序列的編碼鏈的全部或部分非編碼區(qū)。非編碼區(qū)(“5’和3’非翻譯區(qū)”)是編碼區(qū)兩側(cè)的 5’和3’序列，并且不翻譯為氨基酸。反義寡核苷酸可以是例如長約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸或以
上。本申請的反文核酸可以使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)通過本領(lǐng)域已知的過程構(gòu)建軍。例 如，反義核酸(例如反義寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多種修飾的核苷酸化學(xué) 合成，所述修飾的核苷酸設(shè)計為增加分子的生物穩(wěn)定性或增加反義核酸分子與有義核酸分 子之間形成的雙鏈的物理穩(wěn)定性，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸可以使用。 能夠用于產(chǎn)生反義核酸的修飾的核苷酸的實例包括5氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶、5氯尿嘧啶、5 碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4乙?；奏?、5(羧羥甲基)嘧啶、5羧甲基氨甲基2硫尿 苷、5羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β D乳糖基核苷、N6異戊烯基腺嘌呤、1甲基鳥嘌 呤、1甲基肌苷、2，2 二甲基鳥嘌呤、2甲基腺嘌呤、2甲基鳥嘌呤、3甲基胞嘧啶、5甲基胞嘧 啶、Ν6腺嘌呤、7甲基鳥嘌呤、5甲基氨甲基尿嘧啶、5甲氧基氨甲基2硫尿嘧啶、β D甘露糖 基核苷、5’甲氧羧甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲基硫Ν6異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶5氧乙 酸(ν)、Wybut0X0Sine、假尿嘧啶、核苷、2硫胞嘧啶、5甲基2硫尿嘧啶、2硫尿嘧啶、4硫尿嘧 啶、5甲基尿嘧啶、尿嘧啶5氧乙酸甲酯、尿嘧啶5氧乙酸(ν)、5甲基2硫尿嘧啶、3 (3氨基 3N 2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2，6 二氨基嘌呤?？商娲?，反義核酸可以用表達(dá)載體生 物學(xué)產(chǎn)生，其中核酸已經(jīng)以反義方向被亞克隆到表達(dá)載體中(即，從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA 與目的靶核酸反義取向)。施用至受試者的或原位產(chǎn)生的反義核酸分子以便它們雜交至或結(jié)合至編碼目的 多肽的細(xì)胞mRNA，由此抑制例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑制表達(dá)。雜交可以通過常規(guī) 的核苷酸互補(bǔ)形成穩(wěn)定的雙鏈體，或為例如在結(jié)合DNA雙鏈體的反義核酸分子的情況下經(jīng) 雙鏈體大溝中的特異的相互作用。本申請的反義核酸分子的施用途徑包括直接注射在組織 部位。替代地，反義核酸分子可以被修飾成靶向作用選擇的細(xì)胞并接著全身施用。例如，對 于全身施用，反義核酸分子可以被修飾，以便它們例如通過將反義核酸分子連接到結(jié)合細(xì) 胞表面受體或抗原的肽或抗體，特異性地結(jié)合到在選擇的細(xì)胞上例如T細(xì)胞或腦細(xì)胞上表 達(dá)的受體或抗原。如下所述，用載體例如基因治療載體反義核酸分子也可以被遞送到細(xì)胞 中。為了達(dá)到足夠胞內(nèi)濃度的反義分子，其中反義核酸分子位于強(qiáng)polll或polIII啟動子 控制下的載體構(gòu)建物是優(yōu)選的。目的反義核酸分子可以是α端基異構(gòu)核酸分子。α端基異構(gòu)核酸分子與互補(bǔ)RNA形成雙鏈雜合體，其中與通常的單元不同，所述雙鏈走向互相平行(Gaultier等，1987， Nucleic Acids Res. 15 :66256641)。所述反義核酸分子也可以包含2，-ο-甲基核糖核苷 酸(Inoue 等，1987，Nucleic Acids Res. 15 61316148)或嵌合的 RNADNA 類似物(Inoue 等 1987，F(xiàn)EBS Lett. 215 327330)。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能夠裂解單鏈核酸，如mRNA，在 mRNA上他們具有互補(bǔ)區(qū)，并且也可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生。由此，核酶(例如錘頭核酶(描述 于 Haselhoff 和 Gerlach，1988，Nature 334:585591))也可以用于催化性裂解 mRNA 轉(zhuǎn)錄 物由此抑制mRNA編碼的蛋白的翻譯。對編碼目的多肽的核酸分子特異性的核酶可以基 于編碼癌相關(guān)的IkBii變體的cDNA核苷酸序列設(shè)計。例如，在Cech等人的U. S. Patent No. 4，987，071 和 Cech 等人 U. S. Patent No. 5，116，742 中，可以構(gòu)建四膜蟲 L 19IVS RNA 的 衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與被降解的核苷酸序列互補(bǔ)?？商娲?，編碼目的多肽 的mRNA可以用于從RNA分子庫中選擇具有特異性的核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如見 Bartel 和 Szostak，1993，Science 261:1411 1418。三螺旋結(jié)構(gòu)也可以用公知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，目的多肽的表達(dá)可以通過靶向作 用與編碼多肽的基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列以形成阻 止靶細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)加以抑制。一般見Helene，1991，Anticancer Drug Des.6 (6) 56984 ；Helene,1992，Ann.N. Y Acad. Sci. 66027 36 禾口 Maher，1992，Bioassays 14(12) 807 15。在許多實施方案中，核酸組分可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架進(jìn)行修飾以改 進(jìn)例如分子的穩(wěn)定性、雜交或分子的溶解性、例如，核酸的脫氧核糖磷酸骨架可以被修飾以 產(chǎn)生肽核酸(見 Hyrup 等，1996，Bioorganic & MedicinalChemistry 4(1) :523)。如本文 所用，術(shù)語“肽核酸’或“PNAs，，指核酸模擬物，例如DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸骨架被 假肽骨架取代并且只保留四種天然的核堿基。已經(jīng)顯示中性PNAs骨架在低離子強(qiáng)度下實 現(xiàn)與DNA和RNA的特異性雜交?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的固相肽合成方案，如如上述的Hyrup等1996、 PerryO' Keefe 等 1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14670675 所述開展 PNA 寡聚體的合 成。PNAs可以例如被修飾，通過將親脂基團(tuán)或其他輔助基團(tuán)結(jié)合到PNA、通過形成PNA DNA嵌合體或通過使用脂質(zhì)體或其他的本領(lǐng)域已知的藥物遞送技術(shù)例如增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性 或細(xì)胞攝取。例如，可以產(chǎn)生可結(jié)合PNA和DNA優(yōu)良特性的PNA DNA嵌合體。這樣的嵌合 體使得DNA識別酶例如RNAse H和DNA聚合酶與DNA部分相互作用，而PNA部分將提供高 的結(jié)合親合力和特異性。用基于堿基堆積、核堿基之間的鍵的個數(shù)和取向選擇的適當(dāng)長度 的接合體可以連接PNA DNA嵌合體(Hyrup，1996，見上)。PNA DNA嵌合體的合成可以在如 Hyrup，1996，如上和 Finn 等 1996，Nucleic Acids Res. 24(17) :335763 所述開展。例如， 可以在支持物上用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺偶聯(lián)化學(xué)和修飾的核苷類似物合成DNA鏈?；衔锶?5’(4甲氧基三苯甲基)氨基5’脫氧胸苷亞磷酰胺可以用作PNA和DNA 5’端之間的接頭 (Mag等，1989，Nucleic Acids Res. 17 5973 88)。接著以分步的方式偶聯(lián)PNA單體以產(chǎn) 生含有 5，PNA 片段和 3，DNA 片段的嵌合分子(Finn 等 1996，Nucleic Acids Res. 24(17) 3357 63)?？商娲?，嵌合分子可以用5，DNA片段和3，PNA片段合成(Peterser等1975， Bioorganic Med. Chem. Lett. 5 1119 11124)。
在其他的實施方案中，寡核苷酸可以包括其他附加的基團(tuán)例如肽(例如用于體 內(nèi)靶向作用宿主細(xì)胞受體)或促進(jìn)通過細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)脑噭?見，例如Letsinger等1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553 6556 ；Lemaitre 等 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648 652 ;International Publication No. W088/09810)或促進(jìn)通過血腦屏障運(yùn)輸?shù)脑?劑(見，例如International Publication No. W089/10134)。另外，寡核苷酸可以用雜交 引起的裂解劑修飾(見，例如Krol等人1988，Bio/Techniques 6 =958976)或插入劑修飾 (見，例如Zon, 1988, Pharm. Res. 5 539549)。為了達(dá)到該目的，寡核苷酸可以綴合到另一個 分子上，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交觸發(fā)的裂解劑等。本申請的另一個方面是治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法，其包括修復(fù)或代替 IkB^的表達(dá)或功能。在一個實施方案中，這與治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法聯(lián)合進(jìn)行， 其包括阻止或減少癌相關(guān)的變體IkB β的表達(dá)或功能。本發(fā)明的另一個方面是鑒定能夠調(diào)節(jié)癌相關(guān)的IkBii變體的表達(dá)或活性的化合 物的方法，其可以用于預(yù)防或治療癌癥。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于鑒定化合物預(yù)防 或治癌癥的能力的方法包括步驟(a)將表達(dá)癌相關(guān)的IkBii變體的細(xì)胞與測試化合物接觸；和(b)測定癌相關(guān)的IkB β變體的表達(dá)或功能；和(c)比較癌相關(guān)的IkBii變體與對照的表達(dá)或功能，其中癌相關(guān)的IkBii變體與對 照相比表達(dá)或功能的減少指示了化合物可以用于預(yù)防或治療癌癥。本發(fā)明的另一個方面是重組表達(dá)形式的本申請的抗原和/或相似修飾的其它IkB 蛋白或其片段或相應(yīng)的核酸序列的制備，用于檢測跨膜形式的IkB蛋白和/或本申請的抗 原的存在。所述檢測可以包括檢測蛋白、編碼本申請的修飾的IkB蛋白或基本申請的抗原 的基因和/或mRNA。所述重組形式可以用于制備抗體或檢測患者或受試者循環(huán)中的存在的 抗體。上面的公開一般性地描述了本發(fā)明。通過參照下面的具體實施例可以得到更加完 全的理解。這些實施例僅以例證的目的描述并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)環(huán)境暗示或 出現(xiàn)應(yīng)急情況時考慮了形式改變和等效替代物。雖然在本文中已經(jīng)采用了特定術(shù)語，但是 此類術(shù)語旨在是描述意義的，而不是限制的目的。下列非限定性實施例用于說明本發(fā)明。實施例實施例1 :VB1_204單克隆抗體的產(chǎn)生和測序VB1-204是一種IgM MAb，其從乳腺癌患者的淋巴結(jié)產(chǎn)生。信使RNA從雜交瘤細(xì)胞分離并且使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后 cDNA用于通過PCR分離重鏈和輕鏈抗體片段。V1^n λ的共有序列框架區(qū)的PCR引物分別 用于擴(kuò)增重鏈和輕鏈。5，VH 弓丨物1 5，CCA GCC ATG GCG CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT G(SEQID NO 12)2 5’ CCAGCC ATG GCG SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG(SEQID NO 13)3 5’ CCAGCC ATG GCG CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG(SEQID NO 14)4 5，CCA GCC ATG GCG SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG(SEQ ID NO 15)
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5 CCA GCC ATG GCG GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG(SEQID NO 16)
65，CCAGCCATG GCG CAG GTG CAG CTACAGCAG TGG GG(SEQ ID NO 17)
75，CCAGCCATG GCG CAG STG CAG CTGCAGGAG TCS GG (SEQ ID NO 18)
85，CCAGCCATG GCG CAG GAR GTG CAGCTGGTG CAG TCT GG (SEQ ID 19)
95，CCAGCCATG GCG CAG CAG GTA CAGCTGCAG CAG TCA GG(SEQ ID NO 20)
3，引物
15’ CCAGGAGAA AGT GAT GGA GTC GGGAAGGAA GTC CTGTGC GAG(SEQ ID NO 21)
25’ CGACGGGGA ATT CTC ACA GGA GACGAGGGG GAA AAGGGT TGG(SEQ ID NO 22)
λ引物
5，引物
15’ ATGGCCTGS WCY CCT CTC YTC CTCAYC(SEQ ID NO 23)
25’ ATGGCCTGG GCT CTS YTB YTS YTCASC (SEQ ID NO 24)
35’ ATGGCMTGG AYC SYT CTC YTC CTCGGC(SEQ ID NO 25)
3，引物
5，CAC TAG TGT GGC CTT GTT GGC TTG GAC CTC CTC AGA GGAGGG(SEQ ID NO 26)
注釋為了分離鏈，對于某些共有序列，5’引物混合物使用混合的堿基R = A+G，
S = C+G, W = A+T, Y = C+T, D = A+T, H = A+C, K = T+G, B = T+C+G, M = A+C。PCR反應(yīng)包括50 μ L反應(yīng)體積，其包含10XPCR 緩沖液5 μ L2mM dNTP5 μ L引物 5，20pmol引物 3，20pmolTaq DNA 聚合酶2. 5UDNA 模板50ngPCR循環(huán)條件是94°C下1分鐘，62 °C下1分鐘，72 °C下1分鐘，30個循環(huán)，并且最 后在72°C延伸10分鐘。采用兩輪30個循環(huán)并且在第一輪30個循環(huán)采用以下引物5’ VH 引物和3’引物-1.。接著用5’ VH引物和3’引物_2將IyL的第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物再擴(kuò)
+飽
+曰ο擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳分離。切下目的條帶并使用Qiaquick凝 膠提取試劑盒純化、克隆入TOPO PCR 2. 1克隆載體中，然后使用373DNA測序儀測序。序列 分析表明，重鏈和輕鏈的亞類分別是VH3(圖1A)和VL3(圖1B)。輕鏈和重鏈可變區(qū)顯示在 圖 1 (SEQ ID NO 1-4)中。VB1-204 的 CDR 序列顯示在表 1 中(SEQ ID NO :5_10)。實施例2 通過測量腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性抗體表征通過流式細(xì)胞術(shù)測試VB1-204對代表7種不同類型的上皮癌的反應(yīng)性(圖2)并 將結(jié)果總結(jié)于表2中。MF值表示兩個實驗中相對于對照抗體的中位熒光的平均增加倍數(shù)。 值零表明相對于對照抗體沒有反應(yīng)性。結(jié)合最強(qiáng)的是CF-Pac-I和MB-231細(xì)胞，其后緊跟 著A-375。因此，VB1-204結(jié)合到局限于腫瘤細(xì)胞的膜的抗原上。
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實施例3 通過比較腫瘤對正常組織微陣列來分析抗體性質(zhì)檢測VB1-204并與在正常關(guān)鍵組織的低密度(LD)陣列上的同種型對照(IgM骨髓 瘤)比較(表3A)。正常關(guān)鍵組織的膜染色被認(rèn)為是最少的，在肺組織、結(jié)腸細(xì)織和肝組織 的膜有一些染色。發(fā)現(xiàn)在所有檢測的正常關(guān)鍵組織的細(xì)胞質(zhì)中存在顯著的染色，這表明與 存在于正常細(xì)胞中的胞內(nèi)蛋白發(fā)生了結(jié)合。接著在高密度(HD)福爾馬林固定的腫瘤組織微陣列中檢測VB1-204的反應(yīng)性 (表3B)。與正常組織不同，在肝、結(jié)腸、肺、胰腺和腎膜上檢測到VB1-204的反應(yīng)性。在結(jié)腸 上每組織樣品的膜染色頻率是最高的。在肝、結(jié)腸、腎、胰腺和肺上檢測到膜染色，發(fā)生率、 強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分比不同。實施例4通過共焦顯微鏡術(shù)評定VB1-204的內(nèi)化VB1-204和對照抗體95E9，已知為細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化抗體)被用于評定VB1-204的內(nèi) 化。為了確定細(xì)胞表面結(jié)合的VB1-204是否內(nèi)化，使用了借助于激光掃描共焦顯微鏡術(shù)的 熒光分布和胞內(nèi)染色的直接顯影。A-375細(xì)胞與VBl-204(100yg/mL)或?qū)φ湛贵w在4°C溫 育。在細(xì)胞沖洗后一半抗體在37°C溫育1小時，另一半維持在4°C。用熒光素標(biāo)記的第二 抗體標(biāo)記固定的(用甲醛溶液)和未固定的細(xì)胞。如5E9陽性對照抗體所示，與VB1-204 在4°C溫育60分鐘的A-375細(xì)胞顯示了熒光標(biāo)記的周向分布(圖3A)。將VB1-204處理的 細(xì)胞加熱到37°C在60分鐘內(nèi)顯示胞內(nèi)染色圖案，如圖3B所示，這表明了 VB1-204/抗原復(fù) 合物的內(nèi)化。實施例5 :VBl-204的結(jié)合親合力使用流式細(xì)胞術(shù)來評定VB1-204的結(jié)合親合力，針對固定數(shù)目的腫瘤細(xì)胞 (A-375)對一系列的抗體濃度檢測了 2小時，獲得飽和曲線。使用Sigma PlotQandel Scientific, San Rafael, CA)生成值和圖像分析結(jié)果。將測定的中位熒光的倒數(shù)繪制為抗 體濃度的倒數(shù)的函數(shù)曲線以通過Lineweaver-Burk方法確定KD。產(chǎn)生了直線并且從曲線 斜率計算Kd (圖4A和4B)。通過以下公式確定解離常數(shù)和Kd :1/F = 1/Fmax+(KD/Fmax) (1/ IgM)，其中F =背景減去中位熒光，F(xiàn)max從曲線計算。如圖4A和4B所示，計算的VB1-204 的解離常數(shù)為5xl(T9M。實施例6 抗原的分離和鑒定腫瘤細(xì)胞系Α375 (黑素瘤)、H印G2 (肝細(xì)胞癌)、MB 231 (乳腺癌)CF-PAC-I和 PANC-I (胰腺癌)和DU-145 (前列腺癌)被用于鑒定結(jié)合VB1-204的膜相關(guān)的抗原。這些 細(xì)胞系通過流式細(xì)胞術(shù)基于腫瘤細(xì)胞特性進(jìn)行選擇。細(xì)胞系購自ATCC和按照ATCC的指南培養(yǎng)。結(jié)合VB1-204的抗原的初步表征VB1-204被用于免疫沉淀來自腫瘤細(xì)胞系的膜提取物的蛋白。接著在SDS-PAGE 凝膠上分離純化的蛋白，隨后用VB1-204進(jìn)行western印跡。在ID-PAGE上檢測到一條 65士2kDa的帶以及一條 34kDa的帶。在用2% SDS在65°C還原純化的蛋白60分鐘后， 所有的帶被破壞成在所有反應(yīng)細(xì)胞系始終可見的單條強(qiáng)的 34KDa帶。這些實驗數(shù)據(jù)將 VB1-204抗原歸類為“可印跡的”含有N-聚糖掩蔽的表位的抗原。如在圖5A和5B中所示， 在所有的陽性細(xì)胞系中觀察到強(qiáng) 34kDa。帶的強(qiáng)度也反應(yīng)了在該特定細(xì)胞系中抗原表達(dá) 水平。
質(zhì)譜分析和蛋白鑒定來自陽性細(xì)胞系CFPAC-I膜組分以及陰性細(xì)胞系Panc-I膜的蛋白用VB1-204免 疫沉淀并在ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)上分離。在陽性細(xì)胞系中觀察到在10. 85分鐘洗脫 的單峰而在陰性細(xì)胞系中不存在該峰，如圖6所示。MS分析的組合結(jié)果將在腫瘤細(xì)胞系CFPAC-I、A375和MB231上的VB1-204的抗原 鑒定為IkBii 2的變體形式。最初從這些細(xì)胞系收集的、與數(shù)據(jù)庫序列100%匹配的肽在圖 7A、7B和7C中顯示以基于最高概率的得分定位到其蛋白的位置上，并包括在表4中(SEQ ID NO 31-52) ο 例如，針對 IkB^ 2 (SEQ ID NO 27)、IkB β 1 (SEQ ID NO 28)和 IkB^ 2 β 概念 變體(conceptual variant) (SEQ ID NO 29)繪制圖譜，顯示具有最高的蛋白得分并顯示了 最相關(guān)的鑒定。所有從全部細(xì)胞系收集的、或在最初MS分析或隨后的片段化中獲得肽以及 被鑒定為變體肽的肽(下述)被組合并在圖8中將它們相應(yīng)的定位到IkB β 2變體中(SEQ ID NO 30)，列在表 4 中(SEQ ID NO :31_52)。肽1985. 978172 和 1070. 468308 的 MS 片段化從頭序列鑒定導(dǎo)致鑒定了變體肽以及那些100%定位到序列的肽。安裝在納米 源上的分離的納米噴霧頭用于此目的。碰撞能為48V，簾氣和CAD氣分別保持為25和6， 并且將樣品循環(huán)1.667分鐘(100周期)來實現(xiàn)穩(wěn)定的離子片段化。對所述肽中的兩個 進(jìn)行MS/MS片段化(1985. 978172和1070. 468308)產(chǎn)生了圖9A和9B中所示的片段離 子。來自肽分子量1985. 978172的肽LGVLAAAVGGVGLGAffL(SEQ ID NO 34)和來自肽分 子量1070. 468308的肽ILGVTSTVVAL (SEQ ID NO 37)顯示與IkB β 2的兩側(cè)序列具有 100%的同源性，但與中間序列沒有這樣的同源性，這表明了鑒定了新的序列。所述序列 包括8個氨基酸的改變，導(dǎo)致形成了兩個特有的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)。這些區(qū)大約 為 LGSLGVLAAAVGGVGLGAWLGPG (SEQ ID NO 53)和 LAAILGVTSTWALYAAGAGLCV (SEQ ID NO: 54)?？缒そY(jié)構(gòu)域的確切跨度隨所用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模算法而少許不同。疏水可變結(jié)構(gòu)域 M IkB β 的野生型區(qū)隔開。一個肽(1205. 378172 來自(402. 800000,3+) (SEQ ID NO 35)) 的MS/MS片段化產(chǎn)生了如圖9C所示的另外的碎片離子，其顯示與IkBii 2具有100%的同源 性。實施例7 來自癌細(xì)胞提取物的IkB β 2免疫沉淀VB1-204被用于免疫沉淀來自腫瘤細(xì)胞系CFPAC-I的純化膜的和全細(xì)胞的提取物 的蛋白。接著在SDS-PAGE凝膠上分離純化的蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)通過Western印跡用 VB1-204和用可商業(yè)途徑獲得的識別IkBiil和IkBii 2同種型的抗體分析。商業(yè)抗體抗覆 蓋的氨基酸56-145 (Abnova，H00004793-M01)的重組肽序列。該區(qū)在癌相關(guān)的IkB β 2 變體中含有3個氨基酸改變(位于106、111和112位)并也含有推定的所述變體的胞外部 分(大約在氨基酸38與102之間)。圖10顯示VB1-204結(jié)合到存在于全細(xì)胞裂解物和膜 部分中的蛋白質(zhì)，而商業(yè)抗體只結(jié)合到全細(xì)胞裂解物蛋白。所有的條帶都具有相同的MW。 數(shù)據(jù)表明VB1-204也檢測位于細(xì)胞內(nèi)以及膜形式的野生型IkBii，但是商業(yè)抗體只檢測胞 內(nèi)野生型并且其與癌相關(guān)的變體的結(jié)合被免疫肽中的氨基酸改變阻止。實施例8衍生自VB1-204的免疫毒素的細(xì)胞毒性VB1-204的可變區(qū)被用于構(gòu)建用于治療癌癥的免疫偶聯(lián)物。改良形式的植物毒素 bouganin融合到Fab形式的VB1-204上。
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VB6-204 構(gòu)建通過產(chǎn)生EcoRI-PelB-VH204_ApaI 和 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 片段，將 它們插入 EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/pING3302 質(zhì)粒構(gòu)建 VB6-204 構(gòu)建物。 構(gòu)建的片段被直接克隆到pING3302Xoma載體上處于阿拉伯糖誘導(dǎo)的araBAD啟動子控制 下。在經(jīng)L-(+)阿拉伯糖誘導(dǎo)后，緊鄰目的基因的PelB前導(dǎo)序列的存在使得蛋白分泌到培 養(yǎng)基上清液中。置于結(jié)構(gòu)域的N端的組氨酸親和標(biāo)簽使得能夠利用Ni2+螯合俘獲方 法進(jìn)行純化。通過剪接重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒匆訮elB和VB1_204_VHDNA質(zhì)粒為模板以及下列 引物組裝 EcoRI-PelB-VH204-ApaI 片段1)5，PelB :5，GAA TTC CCT GCA GGT CTA TGG AAC GAT AAA TGC (SEQ ID NO 56)2)3，PelB-VH204 :5，CGC CAT CGC TGG TTG GGC AGC GAG TAA TAACAA TCC(SEQ ID NO 57)3)5，PelB-VH204 5' GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAG GTG CAGCTG GTG GAG TCT GGG(SEQ ID NO 58)4)3，VH204-ApaI :5，GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGAGAC GGT GAC CAG GGT(SEQ ID NO 59)用上述的全部4條引物進(jìn)行兩步剪接重疊延伸PCR方法來構(gòu)建和擴(kuò)增 EcoRI-PelB-VH204-ApaI。加入EcoRI和ApaI限制位點(黑體)來幫助將PelB_VH204克隆 到 EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302 載體上。PCR 反應(yīng)包括含有以下的 50 μ L 反應(yīng)體積IOX PCR緩沖液5 μ L
2mM dNTPs5 μ L
50mM MgCl22μ L
引物5’20pmol
引物3’20pmol
Taq DNA聚合酶2. 5U
DNA模板50ngPCR循環(huán)條件為94°C lmin，62°C Imin和72 °C 1. 5min，總共20個循環(huán)，最后在 72°C延伸 IOmin0步驟1第一個PCR反應(yīng)包含引物1和2，以及PelB模板。產(chǎn)生在5’端為含有EcoRI限制 位點的PelB區(qū)以及在3，端為PelB前導(dǎo)信號的片段(131bp)。在分開的另一個PCR反應(yīng)中，用引物3和4與204VH模板產(chǎn)生乂』。*片段(438bp)， 其5’端一側(cè)為PelB前導(dǎo)信號和Vh結(jié)構(gòu)域的起點和3’端一側(cè)為含有ApaI位點的Ch結(jié)構(gòu) 域的21核苷酸。步驟2在接下來的PCR反應(yīng)中，用引物1和4以及1 μ L的各PCR產(chǎn)物來產(chǎn)生 EcoRI-PelB-VH204-ApaI 片段(548bp)。
通過剪接重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法使用VB1-204輕鏈DNA質(zhì)粒作為模板和以 下引物組裝 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 片段1)5，De-boug-AflII 5' ATC CTT AAG TTT AAA AGC TCC AAA TAGTGA TCT AGA GTC GAC (SEQ ID NO 60)2)3，PelB-6xHis :5，GTG ATG GTG ATG GTG ATG CGC CAT CGC TGG(SEQ ID NO 61)3)5' 6xHis-VL-204 5' ATG GCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TCC TATGAG CTG ACT CAG CCA CCC (SEQ ID NO 62)4) 3'Vl-Cl:5，GAC CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GACGGT CAG CTT GGT CCC(SEQ ID NO 63)5)5，入恒定區(qū)5，CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTGTTC(SEQ ID NO 64)6)3，端-XhoI 入恒定區(qū) 5，CTC GAG TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGGGGC CAC TGT(SEQ ID NO 65)用以上列出的全部6條引物進(jìn)行兩步剪接重疊延伸PCR方法來構(gòu)建和擴(kuò)增 AflII-PelB-6xHis-VL204-CLXhoL· 加 Λ AflII 和 XhoI 限制位點(加黑)來幫助將 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 克隆到 EcoRI-Apal-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302 載體上。步驟1在第一個PCR反應(yīng)中，引物1和2為用于擴(kuò)增PelB片段(195bp)，該片段在5’端 一側(cè)含有AflII限制位點，在3’端側(cè)含有6xHis標(biāo)簽。在第二個PCR反應(yīng)中，引物3和4以及VB1-204輕鏈模板用于擴(kuò)增6xHis-VL204 片段(379bp)，該片段兩側(cè)，在5’端含有6xHis以及在3’端為Q結(jié)構(gòu)域的前21個核苷酸。用引物5和6以及Q模板進(jìn)行第3個PCR反應(yīng)，產(chǎn)生了含有3’端XhoI限制位點 的入輕鏈恒定區(qū)(327bp)。步驟2在接下來的PCR循環(huán)中，用引物1和6和1 μ L的各PCR產(chǎn)物來產(chǎn)生 AflII-PelB-6xHis-VL204-C^XhoI片段(833bp)。一旦序列得到了證實，將PelB_VH204片段用EcoRI和ApaI限制酶消化并連接到用 同樣的酶預(yù)先消化的EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302載體中。用所述連接 反應(yīng)物轉(zhuǎn)化IOF感受態(tài)細(xì)胞并涂板到補(bǔ)充有四環(huán)素的LB瓊脂板上。通過質(zhì)粒PelB-VH204 -CH-de-bouganin-Af 111-XhoI/3302的限制圖譜證實了插入片段的存在。接著用AflII和 XhoI限制酶消化AflII-PelB-6XHiS-\204-c￡xhoI片段并連接到預(yù)先用同樣的酶消化的 PelB-VH204-CHde-bouganin-AflII-XhoI/3302 載體上來構(gòu)建 VB6-204。在證實了存在正確 的插入后，將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E104細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。純化和檢測從6L TB碎片化產(chǎn) 生的VB6-204蛋白。VB6-204免疫偶聯(lián)物的核苷酸SEQID NO :36)和氨基酸序列(SEQ ID NO 37)顯示在圖11中。VB6-204蛋白的細(xì)胞毒性通過MTS分析來測量VB6-011的細(xì)胞毒性。簡單地說，接種抗原陽性和抗原陰性的細(xì)胞，每孔1000個細(xì)胞，并在37°C培養(yǎng)3小時。隨后將不同濃度的VB6-204和de_bouganin 加到細(xì)胞中，并在5天后檢測存活率。經(jīng)過5天培養(yǎng)后，由于大量的細(xì)胞死亡，確定抗原陽 性細(xì)胞系的計算的VB6-204的IC50。相反，由于抗原陰性細(xì)胞保持活力，所有沒有測定細(xì)胞 系的IC50。實施例9 癌干細(xì)胞分析與aldef luor (ALDHl)染色相關(guān)的VB1-204結(jié)合用于評價癌干細(xì)胞反應(yīng)性。一般， 具有強(qiáng)ALDH染色的腫瘤細(xì)胞代表能夠在異種移植物中自我更新并能夠產(chǎn)生腫瘤的癌干細(xì) 胞部分。高ALDHl活性被認(rèn)為賦予對化學(xué)治療劑抗性，導(dǎo)致新腫瘤過度生長和患者隨后的 復(fù)發(fā)(Wicha MS, Liu S 和 Dontu G. 2006, CancerRes. 66,1883-1890 ；Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E et al. 2007, CellStem Cell，1，555-567)。2 色流式細(xì)胞術(shù)被用于測 定結(jié)合宮頸細(xì)胞系C33A和前列腺細(xì)胞系DU-145的ALDHl陽性細(xì)胞的VB1-204。結(jié)合ALDHl 陽性的C33A和DU-145亞群的VB1-204突出了其對抗癌干細(xì)胞系的潛在用途。實驗設(shè)計簡單地說，將2xl05個細(xì)胞與aldefluor試劑在37°C培養(yǎng)30分鐘。接 著沖洗細(xì)胞并在25 μ g/mL的VB1-204存在下在4°C培養(yǎng)2小進(jìn)。結(jié)合到細(xì)胞上的VB1-204 用生物素化山羊抗人H&L接著用鏈霉親和素Cy5檢測。IgM黑素瘤、人IgM anti-Id被用作 陽性對照。另外，在作為反應(yīng)的抑制劑DEAB的存在下證實了 aldefluor染色的特異性。結(jié)果結(jié)果顯示在圖13和14中。數(shù)據(jù)分析顯示2. 98%和4. 2%的C33A和DU-145 細(xì)胞對癌干細(xì)胞標(biāo)記aldefluor是陽性的(圖13B和14B的右下四分之一圖)。VB1-204 結(jié)合大部分的C33A(92. 5% )&DU-145(96.8% )細(xì)胞，顯示為細(xì)胞特征變換到圖13C和14C 的左上四分之一圖。圖13D和14D顯示在存在VB1-204時ALDHl陽性的C33A細(xì)胞(2. 3% ) 和DU-145(5. 0% )也轉(zhuǎn)換到右上四分之一圖。這個數(shù)據(jù)表明VB1-204結(jié)合C33A & DU-145 的癌干細(xì)胞部分以及表明VB1-204識別的抗原代表了癌干細(xì)胞部分。盡管本申請已通過目前被認(rèn)為優(yōu)選的實施例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明 不限于所公開的實施例。恰恰相反，本發(fā)明旨在涵蓋處于所附權(quán)利要求書精神和范圍內(nèi)的 多種修改和等同排列。本文所有出版物、專利和專利申請以其全文通過引用并入本文，其程度為似乎各 個出版物、專利、專利申請被明確且單個標(biāo)明其全文通過引用并入本文表1 :VBl-204 的 CDR 序列 表2 通過流式細(xì)胞術(shù)表征腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性的抗體特征
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評分是基于在0-3+尺度評價的，其中0 =無染色和微量的、小于1+但大于0的染 色。級別1+到3+代表染色強(qiáng)度增加，其中3+為最強(qiáng)。表3B :VBl-204的高密度腫瘤組織微陣列染色 得分在0-3+尺度上評價，0 =沒有染色和微量的、少于1+但是大于0的染色。1+ 至3+級表示染色強(qiáng)度增加，3+為強(qiáng)的黑棕色染色。頭和頸癌包括氣管、喉、扁桃體、喉管、軟 腭、舌、口和唇的癌癥。括號內(nèi)的值指在所得分范圍內(nèi)染色細(xì)胞的最高百分?jǐn)?shù)表4:對應(yīng)于IKKi3 2(TRIP_9)和變體的肽以及各自的計算的質(zhì)量
權(quán)利要求
分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其選自下組包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 1或其變體；包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 2或其變體；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的分離的輕鏈CDR 3或其變體；包含SEQ ID NO5的氨基酸序列的分離的重鏈CDR 1或其變體；包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的分離的重鏈CDR 2或其變體；和包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的分離的重鏈CDR 3或其變體；
2.編碼權(quán)利要求1的互補(bǔ)決定區(qū)的分離的核酸序列，或其變體。
3.分離的可變區(qū)，其選自下組包含SEQ ID NO :8，9和/或10限定的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的分離的輕鏈可變區(qū)，或其變 體；和包含SEQ ID NO :5，6和/或7限定的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的分離的重鏈可變區(qū)，或其變體。
4.權(quán)利要求3的可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO :4的氨基酸序列，或其 變體。
5.權(quán)利要求3的可變區(qū)，其中所述分離的重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO :2的氨基酸序列， 或其變體。
6.編碼權(quán)利要求3-5任一項的可變區(qū)的分離的核酸序列，或其變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的分離的核酸序列，其包含SEQID NO 3的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的分離的核酸序列，其包含SEQID NO 1的序列。
9.結(jié)合蛋白，其包含SEQID N0:8，9和/或10限定的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，或其變體。
10.結(jié)合蛋白，其包含SEQID NO :5，6和/或7限定的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，或其變體。
11.結(jié)合蛋白，其包含包括由SEQID NO :8，9和/或10限定的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ) 決定區(qū)和/或包括由SEQ ID NO :5，6和/或7限定的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，或其 變體。
12.權(quán)利要求9-11任一項的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白結(jié)合包含SEQIDNO 28, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO 30 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的結(jié)合蛋白，其中所述蛋白質(zhì)是跨膜蛋白并且所述結(jié)合蛋白對所 述蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域是特異的。
14.能夠結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白可以通過競爭結(jié)合分析被 鑒定，其中所述競爭結(jié)合分析包括(1)將固定數(shù)目的癌細(xì)胞與最小濃度的對固定數(shù)目的癌細(xì)胞產(chǎn)生最大結(jié)合的根據(jù)權(quán)利 要求23-33任一項的結(jié)合蛋白(Abl)溫育，并測定Abl的中位熒光(MFAbl)；(2)將測試結(jié)合蛋白(Ab2)加到Abl和癌細(xì)胞中，檢測兩種或以上濃度的Ab2，并測定 中位熒光(MF(Abl+Ab2))；(3)測定背景中位熒光(MFbgd)；(4)計算PI，其中PI = [(MF(Abl+Ab2)-MFBgd)/(MFAbl-MFBgd)]XlOO ；和(5)比較所述PI和對照PI值；其中，與對照PI值統(tǒng)計學(xué)顯著不同的PI表明了所述測試結(jié)合蛋白能夠結(jié)合癌細(xì)胞上包含 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO 30 的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求9-14任一項的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白是抗體。
16.權(quán)利要求15的結(jié)合蛋白，其中所述抗體是抗體片段。
17.權(quán)利要求16的結(jié)合蛋白，其中所述抗體片段是Fab、Fab'、F(ab') 2,scFv,dsFv, ds-scFv、二聚體、微型抗體、二抗體，或其多聚體或雙特異的抗體片段。
18.分離的核酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項的結(jié)合蛋白。
19.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項的結(jié)合蛋白和藥用賦形劑、載體、緩沖液 或穩(wěn)定劑。
20.免疫偶聯(lián)物，其包含(1)結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項的結(jié)合蛋 白，所述結(jié)合蛋白附著到(2)癌癥治療劑，所述癌癥治序劑是細(xì)胞毒性的、細(xì)胞抑制性的或 以另外的方式阻止或降低癌細(xì)胞分裂和/或轉(zhuǎn)移的能力。
21.權(quán)利要求20的免疫偶聯(lián)物，其中所述癌癥治療劑是細(xì)胞毒素。
22.權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述細(xì)胞毒素是核糖體失活多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述細(xì)胞毒素選自下組白樹毒蛋白、 bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈、異株瀉根毒蛋白、白喉毒素、局限 曲菌素、假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素A或其變體。
24.權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述細(xì)胞毒素是修飾的bouganin或其變體。
25.權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述細(xì)胞毒素是由氨基酸252-608組成的截短形 式的假單胞菌外毒素A或其變體。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-25任一項的免疫偶聯(lián)物，其中所述免疫毒素被癌細(xì)胞內(nèi)化。
27.根據(jù)權(quán)利要求20的免疫偶聯(lián)物，其包含SEQID NO 67的氨基酸序列。
28.編碼根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項的免疫偶聯(lián)物的分離的核酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的分離的核酸序列，其包括SEQID NO :66的核酸序列。
30.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項的免疫偶聯(lián)物以及藥用賦形劑、載體、 緩沖液或穩(wěn)定劑。
31.有效量的根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項的免疫偶聯(lián)物在治療或預(yù)防癌癥中的用途。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其還包含一種或多種另外的癌癥治療劑在同時、分開或 依次治療或預(yù)防癌癥的用途。
33.治療或預(yù)防癌癥的試劑盒，其包含有效量的權(quán)利要求20-27任一項的免疫偶聯(lián)物 和其治療或預(yù)防癌癥的使用指南。
34.檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，其包括步驟(1)將取自所述受試者的測試樣品與特異性結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的權(quán)利要求9-17的結(jié) 合蛋白的任一個接觸，產(chǎn)生結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物；(2)測量測試樣品中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量；和(3)比較測試樣品和對照中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量。
35.診斷癌癥的試劑盒，其包含結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的權(quán)利要求9-17的結(jié)合蛋白的任一 個和其使用指示。
36.診斷試劑，其包含(1)結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白附著到(2)直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記。
37.權(quán)利要求36的診斷試劑，其中所述標(biāo)記是放射性同位素、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化 合物、酶、顯像劑或金屬離子。
38.試劑盒，其包含權(quán)利要求36或37的診斷試劑和其使用指示。
39.重組表載體，其包含權(quán)利要求2、6、7、8、18、28或29任一項的核酸分子。
40.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求39的重組表達(dá)載體。
41.分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO: 30、32、36、53或54的氨基酸序列，或其變體。
42.權(quán)利要求41的分離的蛋白質(zhì)，由SEQID NO 30的氨基酸序列或其變體組成。
43.包含SEQID N0:27的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)，其中選自第26、27、31、34、39、 106、111和112位的一個或多個氨基酸被另一個氨基酸取代或化學(xué)修飾。
44.權(quán)利要求43的分離的蛋白質(zhì)，其中所述取代是以下的一個或多個P026V、D027L、 P031V、P034V、E039W、E106V、ElllV 禾口 / 或 K112A。
45.分離的核酸序列，其編碼權(quán)利要求41-44任一項的分離的蛋白質(zhì)。
46.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求45的核酸序列。
47.檢測或監(jiān)測受試者中癌癥的方法，其包括檢測樣品中細(xì)胞上的權(quán)利要求41-46任 一項的分離的蛋白質(zhì)，其中如果在細(xì)胞上檢測到所述分離的蛋白質(zhì)，表明患有癌癥。
48.檢測或監(jiān)測受試者癌癥的方法，其包括檢測樣品中細(xì)胞的權(quán)利要求41-46任一項 分離的蛋白質(zhì)的RNA表達(dá)，其中如果檢測到分離的蛋白質(zhì)，則表明患有癌癥。
49.藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求41-46任一項分離的蛋白質(zhì)或其片段和與 其混合的合適的稀釋劑或載體。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，還包含佐劑。
51.藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求45的分離的核酸序列或權(quán)利要求46的表達(dá) 載體和與其混合的合適的稀釋劑或載體。
52.權(quán)利要求51的藥物組合物，還包含佐劑。
53.權(quán)利要求41-44任一項的分離的蛋白質(zhì)或其片段在治療或預(yù)防癌癥的用途。
54.權(quán)利要求41-44任一項的分離的蛋白質(zhì)或其片段在制造引發(fā)受試者免疫反應(yīng)的藥 物中的用途。
55.根據(jù)權(quán)利要求45的分離的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求46的重組表達(dá)載體在治療或 預(yù)防癌癥的用途。
56.根據(jù)權(quán)利要求45的分離的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求46的重組表達(dá)載體在引發(fā)受 試者免疫反應(yīng)的用途。
57.鑒定化合物預(yù)防或治療癌癥的能力的方法，包含步驟(a)將在細(xì)胞表面上表達(dá)權(quán)利要求41-44任一項的分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞與測試化合物 接觸；和(b)檢測所述分離的蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能；(c)將所述分離的蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能與對照比較，其中所述分離的蛋白質(zhì)的表達(dá)或 能比對照減少，則表明化合物能夠用于預(yù)防或治療癌癥。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝税┌Y特異性抗體的重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列和核酸序列。另外，本申請?zhí)峁┝税┌Y特異性的抗體和包含附著到毒素或標(biāo)記的癌癥特異性抗體的免疫偶聯(lián)物，及其方法和用途。本申請也涉及使用本申請的癌癥特異性抗體的診斷方法和試劑盒。另外，本申請?zhí)峁┝诵碌陌┌Y相關(guān)抗原及其用途。
文檔編號A61K47/48GK101925612SQ200880125628
公開日2010年12月22日 申請日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者吉恩尼克·西茲爾尤, 弗蘭西娜·C·查海爾 申請人:維文蒂阿生物技術(shù)公司