專利名稱：14-3-3η抗體及其用于診斷和治療關節(jié)炎的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及特異性結合14-3-3蛋白之η同工型(isoform)并能夠區(qū)分η同工 型與其它14-3-3蛋白同工型的抗體。
背景技術：
14-3-3蛋白是在真核生物中普遍表達的保守的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子家族。14-3-3蛋 白能夠結合多種功能各異的信號傳導蛋白質(zhì)，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體。事實上，已報 道超過100種信號傳導蛋白質(zhì)為14-3-3之配體。14-3-3蛋白可以被認為是34肽重復超 家族(Tetratrico Peptide R印eatsuperfamily)的演化成員。它們一般具有9或10個 α螺旋，并通常沿其氨基端螺旋形成同二聚體和/或異二聚體相互作用。這些蛋白質(zhì)含 有多個已知結構域，包括二價陽離子相互作用區(qū)域、磷酸化和乙?；瘏^(qū)域以及蛋白質(zhì)水解 切割區(qū)域等。14-3-3蛋白有七種不同基因編碼的已知在哺乳動物中表達的同工型，其中 每種同工型包含242 255個氨基酸。所述七種14-3-3蛋白同工型分別稱為14_3_3 α / β (alpha/beta)、14-3-3 δ/ξ (delta/zeta)、14_3_3 ε (epsiIon)、14_3_3γ (gamma)、 14-3-3 n (eta)、14-3-3 τ/θ (tau/theta)禾口 14—3—3 σ (sigma/stratifin)。14-3-3蛋白具有高度的序列相似性。因此，抗14-3-3抗體通常識別多于一種 14-3-3蛋白同工型。已經(jīng)表征的幾種抗14-3-3抗體制備物可商購獲得。例如，識別14_3_3 蛋白的兔多克隆抗體可從 Biomol, Santa CruzBiotechnology, Upstate Biotechnology, and Assay Designs獲得。這些多克隆抗體制備物識別某種形式的14-3-3 η ；但是，它們 并非相對于其它14-3-3蛋白同工型來說選擇性針對η同工型。也參見Martin，H.等人 (1993)Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. FEBS331 296-303。還參見2007年5月9日提交的WO 2007/128132。除了缺少同工型選擇性之外， 幾乎沒有14-3-3抗體顯示識別天然構型的14-3-3蛋白。已提示14-3-3蛋白參與多種疾病。然而，14-3-3蛋白的普遍存在和功能多樣性極 大地妨礙了與多種14-3-3蛋白同工型(“泛14-3-3抗體”)結合和/或不能識別天然構型 14-3-3蛋白之抗體的治療性應用。此外，已提示特定的14-3-3同工型參與特定的疾病，泛 14-3-3抗體不能在診斷測定中進行確定無疑地檢測，并且這些泛14-3-3抗體不能以靶向 方式進行治療。例如，已提示14-3-3 n和14-3-3 γ參與關節(jié)炎。參見2007年5月9日提交 的 W02007/128132。還參見 Kilani 等人(2007，J. Rheum. 34 1650-1657 ；W02007/128132)， 其報道14-3-3蛋白質(zhì)家族的兩個成員(具體為14-3-3 n和14_3_3 γ )存在于關節(jié)炎患者 的滑膜液和血清中，并且這些同工型與滑膜液和血清中的MMP-I和ΜΜΡ-3水平直接相關。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地來自于出人意料的發(fā)現(xiàn)盡管14-3-3同工型之間具有高度的序列 同一性，仍可使用選定的14-3-3 η表位來制備針對天然構型14-3-3蛋白η同工型具有選 擇性的抗體。特別地，本發(fā)明提供了具有如下性質(zhì)的抗14-3-3蛋白抗體⑴通過例如免 疫沉淀所證明地，特異性結合天然構型的14-3-3 η蛋白；以及(ii)相對于其它14-3-3蛋 白同工型來說，選擇性地結合14-3-3 η蛋白。該性質(zhì)組合使得本發(fā)明的抗體區(qū)別于現(xiàn)有技 術，并提供了選擇性抗14-3-3 n抗體在針對14-3-3 n所參與之疾病的診斷和治療方法中 的用途。因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了抗14-3-3 n抗體。本發(fā)明的抗14-3-3抗體能 夠(i)通過例如天然14-3-3 n的免疫沉淀所證明地，特異性結合天然構型的人14-3-3 n 蛋白；以及(ii)相對于其它的人14-3-3蛋白同工型來說，選擇性地結合人14-3-3 η蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 Il抗體能夠結合在關節(jié)炎中異常定 位于細胞外滑膜腔(synovial space)的14-3-3 η蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 n抗體不與位于人14-3-3 η蛋白N 端的表位結合。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體能夠結合包含選自以下之肽 的表位14-3-3 n環(huán)肽、14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽，其中η環(huán)肽是尤其優(yōu)選 的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 n環(huán)肽包含選自SEQ ID NO 11-16的氨基酸 序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 n抗體結合與對應于選自SEQ ID NO 11-16之序列的 氨基酸序列重疊的14-3-3 n區(qū)域。在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 n螺旋肽包含選自SEQ ID NO :1_10的氨基 酸序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 η抗體結合與對應于選自SEQ ID N0:l_10之序列 的氨基酸序列重疊的14-3-3 n區(qū)域。在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 n非螺旋肽包含選自SEQ ID NO 17-32的氨 基酸序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 n抗體結合與對應于選自SEQ ID NO 17-32之序 列的氨基酸序列重疊的14-3-3 n區(qū)域。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體結合選自 LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO 30), KKLEKVKAYR(SEQ ID NO 31)和 KNSWEASEAAYKEA(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。示例性14-3-3 n環(huán)、螺旋和非螺旋肽公開于本文表1中。要注意的是，SEQ ID NO 30與對應的14-3-3 n序列的不同在于14-3-3 n序列中的半胱氨酸被絲氨酸所替換以避 免形成二硫鍵。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體，其還結合包含半胱氨酸的與 SEQ ID NO :30相關的天然14-3-3序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠結合如下 肽序列的抗體，所述肽序列與表1所列肽序列的不同在于用絲氨酸替換半胱氨酸。示例性14-3-3 n環(huán)、螺旋和非螺旋肽公開于本文表1中。要注意的是，SEQ ID NO 30與對應的14-3-3 n序列的不同在于14-3-3 n序列中的半胱氨酸被絲氨酸所替換以避 免形成二硫鍵。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體，其還結合包含半胱氨酸的與 SEQ ID NO :30相關的天然14-3-3序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠結合如下肽序列的抗體，所述肽序列與表1所列肽序列的不同在于用絲氨酸替換半胱氨酸。在一個實施方案中，抗14-3-3 η抗體能夠抑制14-3-3 η對MMP的誘導。優(yōu)選地， 所述 MMP 選自 ΜΜΡ-1、3、8、9、10、11 和 13，尤其優(yōu)選 ΜΜΡ-1 和 ΜΜΡ-3。在一個方面中，本發(fā)明提供了診斷涉及14-3-3 η之疾病和病癥的方法。所述方法 包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體來檢測14-3-3 η蛋白的變化，例如表達、定位、功能等 的變化。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 II抗體進行免疫沉淀。在一 個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體進行ELISA。在一個實施方案中， 檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體進行Western印跡。在一個實施方案中，檢測包括 將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于免疫組織化學中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明 的抗14-3-3 η抗體用于免疫熒光中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η 抗體用于FACS分析中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于放 射性免疫測定中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于試條測試 (strip test)中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于床邊檢 驗(point of care test)中。在一個實施方案中，將檢測14_3_3 η與檢測另一種疾病標 志物(例如針對關節(jié)炎的MMP)聯(lián)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷炎性病癥的方法。在一個優(yōu)選實施 方案中，提供了用于診斷關節(jié)炎的方法。包括用于診斷選自以下之疾病的方法強直性 脊柱炎、白塞病(Beh$et，S Disease)、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis，DISH)、?！斁C合征(Ehlers-Danlos Syndrome，EDS)、費爾 蒂綜合征(Felty’s Syndrome)、纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、 混合性結締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病 (Paget' sDisease)、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn) 象(Raynaud’ s Phenomenon)、反應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征 (Sj5gren，S Syndrome)、斯蒂爾病(Still，s Disease)和韋格納肉芽腫病(Wegener，s granulomatosis)。在一個實施方案中，所述方法包括檢測患者的滑膜液、血漿或血清中的14-3-3 n 蛋白。在一個實施方案中，通過使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體對來自滑膜液、血漿或血清 的14-3-3 n蛋白進行免疫沉淀來進行檢測。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗 14-3-3 n抗體進行ELISA。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14_3_3 n抗體對 包括來自患者的滑膜液、血漿或血清的樣品進行Western印跡。在一個實施方案中，檢測包 括使用放射性免疫測定。在一個實施方案中，檢測包括使用試條測試。在一個實施方案中， 檢測包括使用床邊檢驗。在一個實施方案中，將檢測14-3-3 n與檢測另一種關節(jié)炎標志物 (例如，MMP、抗CCP抗體、抗RF抗體和/或CRP)聯(lián)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷神經(jīng)性病癥的方法。在一個優(yōu)選實施 方案中，提供了用于診斷選自細菌性腦膜炎和克-雅病(Creutzfeldt Jakob disease)之 疾病的方法。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于治療涉及14-3-3 n之疾病的方法。所述方法包 括向患者施用治療有效量的本發(fā)明抗14-3-3 η抗體。在一些實施方案中，所述方法包括聯(lián) 合治療。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療炎性病癥的方法。在一個優(yōu)選實施方案中， 提供了用于治療關節(jié)炎的方法。包括治療選自以下疾病的方法強直性脊柱炎、白塞病、彌 漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌痛、痛風、感染性 關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性多肌 痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、 硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個實施方案中，所述方法包括聯(lián)合治療，其中除了施用一種或多種本發(fā)明抗 14-3-3 11抗體之外還施用至少一種另外的治療劑。在一個優(yōu)選實施方案中，所述治療劑 選自改變病因的抗風濕藥物(disease-modifyingantirheumatic drug, DMARD)、改變病 因的骨關節(jié)炎藥物(diseasemodifying osteoarthritis drug, DMOAD ；例如參見 Loeser， Reumatologia，21 104-106，2005)、抗 TNF α 抗體、抗 IL-1 抗體、抗 CD4 抗體、抗 CTLA4 抗 體、抗CD20抗體、抗IL-6抗體、來氟米特、柳氮磺吡啶和甲氨蝶呤。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于預防涉及14-3-3 η之病癥發(fā)生的預防性方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在具有發(fā)生炎性疾病風險的對象中預防炎 癥疾病發(fā)生的預防性方法。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了在具有發(fā)生關節(jié)炎風險的對象 中預防關節(jié)炎的預防性方法。包括預防選自以下疾病的預防性方法強直性脊柱炎、白塞 病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌痛、痛風、感 染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性 多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類風濕性關 節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。所述方法包括向?qū)ο笫┯帽景l(fā) 明的抗14-3-3 η抗體。在一個實施方案中，所述抗14-3-3 η抗體作為本文所述聯(lián)合療法 的組分進行施用。在一個方面中，本發(fā)明提供了監(jiān)測涉及14-3-3 η之疾病的治療的方法。所述方法 包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體測定患者樣品中14-3-3 η的水平，以及監(jiān)測進行治療 的患者中14-3-3 η的水平。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測炎性病癥之治療的方法。在一個優(yōu)選 實施方案中，提供了用于監(jiān)測關節(jié)炎治療的方法。包括用于監(jiān)測選自以下之疾病的治療的 方法強直性脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂 綜合征、纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨 關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反 應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于確定患者對涉及14-3-3 11之疾病的治療的響 應潛力的方法。在一個實施方案中，所述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體測定患者 樣品中的14-3-3 η水平。在一個優(yōu)選實施方案中，將患者樣品中的14-3-3 η水平與來自 已知能夠響應于治療之對象的樣品中的14-3-3 η水平進行比較。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于確定患者對炎性疾病之治療的響應潛力的 方法。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了用于確定患者對關節(jié)炎治療的響應潛力的方法。包 括用于確定對選自以下疾病之治療的響應潛力的方法強直性脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā) 性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性多肌痛、多肌炎 和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍 格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于區(qū)分涉及14-3-3 η之疾病亞型的方法。在一個實施方案中，提供了用于區(qū)分炎性疾病亞型的方法。在一個優(yōu)選實施方案 中，提供了用于區(qū)分關節(jié)炎亞型的方法。包括用于區(qū)分選自以下之疾病的方法強直性脊 柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌 痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特 病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類 風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個實施方案中，所 述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體測定患者樣品中的14-3-3 η水平。在一個優(yōu)選 實施方案中，將患者樣品中的14-3-3 11水平與來自炎性疾病或預后亞型已知的對象之樣 品中的14-3-3 η水平進行比較。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于減少由外傷引起的關節(jié)損傷的方法。所述方法 包括向具有外傷受損關節(jié)的對象施用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。在一個實施方案中，所述 抗14-3-3 η抗體作為本文所述聯(lián)合治療的組分來施用。在一個方面中，本發(fā)明提供了降低MMP表達的方法。在一個實施方案中，待降低的 MMP表達是在滑膜中。所述方法包括向存在產(chǎn)生MMP之細胞的組織或區(qū)室遞送本發(fā)明的抗 14-3-3 η抗體，其中產(chǎn)生MMP的細胞響應于14-3-3 η蛋白?？梢灾苯踊蜷g接地遞送至受影 響組織或區(qū)室。在一個優(yōu)選實施方案中，所述響應細胞是成纖維細胞或FLS細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，待降低的MMP表達是與關節(jié)炎相關的MMP表達。在一個優(yōu)選實施方案中，待降低的MMP表達是選自以下MMP的表達:ΜΜΡ_1、3、8、9、 10、11和13。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，待降低的MMP表達是MMP-I或ΜΜΡ-3的表達。在一個方面中，本發(fā)明提供了抑制14-3-3 n蛋白對MMP之誘導的方法。抑制可以 是部分的或完全的。所述方法包括向存在產(chǎn)生MMP之細胞的組織或區(qū)室遞送本發(fā)明的抗 14-3-3 n抗體，其中所述產(chǎn)生MMP的細胞響應于14-3-3 η蛋白?？梢灾苯踊蜷g接遞送至受 影響組織或區(qū)室。在一個優(yōu)選實施方案中，將所述抗14-3-3 η抗體施用到滑膜。在一個優(yōu) 選實施方案中，所述響應細胞是成纖維細胞或FLS細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，待抑制的MMP誘導是對在關節(jié)炎中上調(diào)之MMP的誘導。在一個優(yōu)選實施方案中，待抑制的MMP誘導是對選自以下MMP的誘導ΜΜΡ_1、3、8、 9、10、11和13。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，待抑制的MMP誘導是MMP-I或ΜΜΡ-3的誘導。在一個方面中，本發(fā)明提供了降低對象中關節(jié)腫脹的方法。所述方法包括向受影 響對象施用本發(fā)明的抗14-3-3 n抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了降低對象中軟骨降解的方法。所述方法包括向受影 響對象施用本發(fā)明的抗14-3-3 n抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了降低對象中骨降解的方法。所述方法包括向受影響 對象施用本發(fā)明的抗14-3-3 n抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了降低滑膜液中促炎細胞因子積累的方法。所述方法包括向受影響對象施用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。對于涉及向受影響對象施用抗14-3-3 η抗體的方法，在一個優(yōu)選實施方案中，使 用囊內(nèi)遞送。在另一實施方案中，使用系統(tǒng)性遞送。配制治療性組合物，并施用以使得這樣 遞送的抗14-3-3 η抗體可結合位于細胞外的14-3-3 η蛋白。在一個方面中，本發(fā)明提供了可用于診斷涉及14-3-3 11的疾病或者確定受涉及 14-3-3 n之疾病影響的患者之預后的試劑盒。在一個方面中，本發(fā)明提供了可用于治療涉及14-3-3 n之疾病的藥物組合物。所 述藥物組合物包含本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了可用于治療 關節(jié)炎的藥物組合物。在一個方面中，本發(fā)明提供了制備可用于治療涉及14-3-3 11之疾病的藥物的方法。


圖1. ELISA 小鼠抗AUG1-CLDK免疫血清(第二次加強后)針對AUGl-CLDK-BSA抗 原的測試血液效價(僅IgG應答)。圖2. ELISA 小鼠抗AUG2-KKLE免疫血清(第二次加強后)針對AUG2-KKLE-BSA抗 原的測試血液效價(僅IgG應答)。圖3. ELISA 小鼠抗AUG3-CKNS免疫血清(第二次加強后)針對AUG3-CKNS-BSA抗 原的測試血液效價(僅IgG應答)。圖4.多種14-3-3蛋白同工型的序列比對。圖5. Western印跡，顯示市售14_3_3 η多克隆抗體與7種14_3_3蛋白同工型的 交叉反應性。圖6. Western印跡，顯示由針對人全長重組14_3_3 η產(chǎn)生之單克隆抗體免疫沉淀 的來自細胞裂解物之14-3-3 n蛋白和人重組14-3-3 n。圖7. Western印跡，顯示由針對來自所述蛋白質(zhì)非螺旋區(qū)的人14-3-3 η肽片段 142-158SEQ ID NO :24產(chǎn)生之單克隆抗體免疫沉淀的來自細胞裂解物之14_3_3 η蛋白和 人重組14-3-3 n。圖8. ELISA 小鼠抗14_3_3 η免疫血清(第二次加強后)針對14_3_3 η抗原的 測試血液效價(僅IgG應答)。發(fā)明詳述如果抗體或其抗原結合片段以可檢出水平(例如在ELISA測定中)與配體反應， 并且在相似條件下不與無關配體可檢出地反應，則稱抗體或其抗原結合片段與配體“特異 性結合”、“免疫結合”和/或“免疫反應”。本文所用的免疫結合一般是指發(fā)生在免疫球蛋白分子與該免疫球蛋白特異性的 抗原之間的非共價相互作用類型。免疫結合相互作用的強度或親和力可用相互作用的解離 常數(shù)(Kd)來表示，其中較小的Kd表示較大的親和力。可使用本領域公知的方法對免疫結合 特性進行定量。例如，參見 Davies 等人(1990)Annual Rev. Biochem. 59 :439_473?！翱贵w”是指包含特異性結合相應抗原之蛋白質(zhì)的組合物，并且其具有免疫球蛋白 的一般共同結構。術語“抗體”特別地包括多克隆抗體、單克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性即可?？?體可以是鼠源的、人源的、人源化的、嵌合的或者源自其它物種。通常，抗體會包含由二硫鍵 相互連接的至少兩個重鏈和兩個輕鏈，當它們組合時形成與抗原相互作用的結合結構域。 每個重鏈包含重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。重鏈恒定區(qū)包括三個結構域——CHU CH2和CH3，并且可以為μ、δ、γ、α和ε同種型。類似地，輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(VL)和 輕鏈恒定區(qū)(CL)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結構域構成——CL，其可以為κ或λ同種型。VH 和VL區(qū)域還可進一步細分成高變區(qū)(稱為互補決定區(qū)(CDR))，其被稱為框架區(qū)(FR)的較 保守區(qū)域間隔開。每個VH和VL包含3個⑶R和4個FR，從氨基端至羧基端以下列順序排 列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結 合結構域。抗體的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的多種細 胞(例如，效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結合。重鏈恒定區(qū)介導免疫球 蛋白與宿主組織或宿主因子的結合，特別是通過細胞受體(例如Fc受體(例如，F(xiàn)cyRI, FcyRILFCYRIII等))的結合。如本文所用，抗體還包括免疫球蛋白中保留了結合抗原 之能力的抗原結合部分。這些包括例如F(ab)——VL CL和VH CH抗體結構域的單價片段； 和F(ab' )2片段——包含由鉸鏈區(qū)二硫鍵相連的兩個Fab片段的二價片段。術語“抗體” 還指重組的單鏈Fv片段(scFv)和雙特異性分子，例如雙抗體、三抗體和四抗體(參見例如 美國專利 No. 5,844，094)?？贵w可以多種形式制備和使用，包括抗體復合物。本文使用的術語“抗體復合物” 是指一種或多種抗體與另一抗體或者與抗體片段的復合物，或者是兩種或更多種抗體片段 的復合物?？贵w復合物包括多聚形式的抗14-3-3抗體，例如如本發(fā)明所述的同綴合物和異 綴合物以及其它交聯(lián)抗體?！翱乖弊鲝V義理解，其是指可特異性結合抗體的任何分子、組合物或顆粒。抗原具 有一個或多個與抗體相互作用的表位，盡管其不一定誘導該種抗體的產(chǎn)生。術語“交聯(lián)”及其語法上的等同形式是指兩個或更多個抗體結合形成抗體復合物， 也可稱為多聚化。交聯(lián)或多聚化包括兩個或更多個同樣抗體的結合(例如，同二聚化)，以 及兩個或更多個不同抗體的結合(例如，異二聚化)。本領域技術人員還會了解，交聯(lián)或多 聚化也稱為形成抗體同綴合物和抗體異綴合物。這樣的綴合物可包括同一克隆來源的兩個 或更多個單克隆抗體的結合(同綴合物)或者兩個或更多個不同克隆來源的抗體的結合 (也稱為異綴合物或雙特異性)?？贵w可通過非共價或共價結合進行交聯(lián)。本領域技術人 員會了解適于交聯(lián)的多種技術?？赏ㄟ^使用特異性針對第一抗體種類的第二抗體來實現(xiàn)非 共價結合。例如，可使用山羊抗小鼠(goat anti-mouse, GAM)第二抗體來交聯(lián)小鼠單克隆 抗體。可通過使用化學交聯(lián)物來實現(xiàn)共價結合。“表位”是指能夠特異性結合抗體的決定簇。表位是通常存在于分子表面上并且有 機會與抗體相互作用的化學特征。典型的化學特征是具有三維結構特征以及包括電荷、親 水性和親脂性等化學性質(zhì)的氨基酸和糖部分。構象表位與非構象表位的不同在于其在分 子的空間要素變化而沒有任何內(nèi)在化學結構的變化時喪失與抗體的反應性。“人源化抗體”是指盡可能少地含有源自非人免疫球蛋白之序列的免疫球蛋白分 子。人源化抗體包括這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者互補決定區(qū)(CDR)的 殘基被具有所需特異性、親和力和容量的來自非人物種例如小鼠、大鼠或兔的CDR(供者抗體)的殘基替換。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人殘基所替換。 人源化抗體還可包含在受者抗體或者所引入的CDR或框架序列中均不存在的殘基。一般 地，人源化抗體會包含至少一個以及通常兩個可變結構域的基本全部，其中全部或基本上 全部的CDR區(qū)域?qū)诜侨嗣庖咔虻鞍字械哪切?，全部或基本上全部的框?FR)區(qū)是人免 疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗體還涵蓋包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)之至少一部 分(其一般是人免疫球蛋白的)的免疫球蛋白(Jones等人，Nature 321 =522-525(1986)； Reichmann 等人，Nature 332 :323_329 (1988))。“免疫原”是指刺激產(chǎn)生免疫應答的物質(zhì)、化合物或組合物。術語“免疫球蛋白基因座”是指這樣的遺傳元件或者一組連鎖的遺傳元件，其包含 B細胞或B細胞前體可利用來表達免疫球蛋白多肽的信息。該多肽可以是重鏈多肽、輕鏈多 肽或者重鏈和輕鏈多肽的融合物。在未經(jīng)重排基因座的情形中，B細胞前體對遺傳元件進 行組裝以形成編碼免疫球蛋白多肽的基因。在經(jīng)重排基因座的情形中，基因座內(nèi)包含編碼 免疫球蛋白多肽的基因。“同種型(isotype)”是指由重鏈恒定區(qū)定義的抗體類別。重鏈一般分為Y、μ、 α、δ、ε，并命名為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每個同種型內(nèi)的差異又將其分為多種亞型， 例如IgG的亞型分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，而IgA分為IgAl和IgA2。IgY同種型是鳥 類特有的。“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一分子組成的抗體分子制備物。單 克隆抗體組合物顯示出對特定表位的單一結合特異性和親和力。術語“人單克隆抗體”包括具有來源于人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和/或恒定區(qū) (如果存在的話)的顯示單一結合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體由這樣 的雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包含與永生化細胞融合的、具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基 因之基因組的、從轉(zhuǎn)基因非人動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細胞?！皢捂淔v”或“scFv”是指包含抗體VH和VL區(qū)域的抗體，其中這些結構域存在于 單個多肽鏈中。通常，scFv還包含VH和VL結構域之間的多肽接頭，其使得scFv形成抗原 結合的所需結構。“對象”和“患者”可互換使用，其是指哺乳動物例如人和非人靈長類以及兔、大鼠、 小鼠、山羊、豬以及其它哺乳動物物種，另有指明除外。“重組抗體”是指所有通過重組技術產(chǎn)生的抗體。這些包括從免疫球蛋白基因座為 轉(zhuǎn)基因的動物獲得的抗體、從重組表達載體表達的抗體以及通過將任意免疫球蛋白基因序 列剪接成任何其它核酸序列而產(chǎn)生、制備和表達的抗體?？?4-3-3 抗體在一個方面中，本發(fā)明提供了抗14-3-3 η抗體。本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體能夠 (i)通過例如免疫沉淀所證明地，特異性結合天然構型的人14-3-3 η蛋白，以及(ii)相對 于其它的人14-3-3蛋白同工型來說，選擇性結合人14-3-3 n蛋白。特異性結合“天然構型”的人14-3-3 n蛋白意指有如在體內(nèi)接觸時結合14-3-3蛋 白的能力。這可例如通過抗體對來自生物樣品的14-3-3 η蛋白進行免疫沉淀的能力來證 明?！跋鄬τ谄渌娜?4-3-3蛋白同工型來說，針對所述人14-3-3 η蛋白的選擇性”意指在同樣的條件下，與其它的人14-3-3蛋白同工型相比，特異性結合人14-3-3 η蛋白 并優(yōu)先結合14-3-3 η的能力?？衫缡褂肊LISA測定來證明選擇性，該測定可使用例如 雜交瘤克隆的上清液來進行。優(yōu)選使用對照(例如免疫前血清)?！斑x擇性”抗體能夠識別 14-3-3 η，并且與其它的14-3-3同工型相比產(chǎn)生更高的針對14_3_3 η的信號，優(yōu)選相比于 其它同工型高出至少1.5倍的信號，更優(yōu)選高出至少2倍的信號。在一個優(yōu)選實施方案中， 相比于其它14-3-3同工型，選擇性抗體能夠選擇性免疫沉淀14-3-3 η。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗14-3-3 η抗體顯示出相比于人14-3-3 α、β、δ、 ε、Y、τ和ξ蛋白來說針對所述人14-3-3 11蛋白的選擇性。這可例如通過ELISA來證 明。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體能夠結合在關節(jié)炎中異常定 位于細胞外滑膜腔中的14-3-3 η蛋白。這可通過例如對存在于關節(jié)炎患者之滑膜液樣品 中的14-3-3 η蛋白進行免疫沉淀來證明。在一個優(yōu)選實施方案中，抗14-3-3 η抗體能夠抑制14-3-3 η對MMP的誘導。優(yōu)選 地，所述MMP選自MMP-1、3、8、9、10、11和13，特別優(yōu)選MMP-1和ΜΜΡ-3。該能力可通過體外測 定或體內(nèi)測定來確定。如本領域技術人員所了解地，設計該測定使得在不存在抗14-3-3 η 抗體時，14-3-3 η的存在會導致MMP誘導。降低14-3-3 η對MMP之誘導的能力可證明抗 14-3-3抗體的該功能抑制能力。14-3-3 η 表位在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體不結合14-3-3 ηΝ端的表位。 14-3-3 η 的 “N 端”是指 1-12 位氨基酸(即，DREQLLQRARLA (SEQ ID NO :33))。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體能夠結合包含選自以下肽的 表位14-3-3 η環(huán)肽、14-3-3 η螺旋肽和14-3-3 η非螺旋肽，其中η環(huán)肽是特別優(yōu)選的。 參見本文表1。示例性的14-3-3 η環(huán)、螺旋和非螺旋肽公開于本文表1中。要注意的是， SEQ ID NO 30與對應的14_3_3 n序列的不同在于14_3_3 n序列中存在的半胱氨酸被絲 氨酸所替換，以避免形成二硫鍵。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體，其還結合 與SEQ ID NO :30相關的包含半胱氨酸的天然14_3_3序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提 供了能夠結合如下肽序列的抗體，所述肽序列與表1所列肽序列的不同在于用絲氨酸替換 半胱氨酸。(i)環(huán)肽在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 n環(huán)肽包含選自SEQ ID NO 11-16的氨基酸 序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 n抗體結合與對應于選自SEQ ID NO 11-16之序列的 氨基酸序列重疊的14-3-3 n區(qū)域。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體結合選自以下的氨基酸 序列LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO :30)、KKLEKVKAYR(SEQ ID NO :31)和 KNSWEASEAAYKEA(SEQ ID NO 32)。(ii)螺旋肽在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 n螺旋肽包含選自SEQ ID NO :1_10的氨基 酸序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 η抗體結合與對應于選自SEQ ID N0:l_10之序列 的氨基酸序列重疊的14-3-3 n區(qū)域。
(iii)非螺旋肽在一個優(yōu)選實施方案中，所述14-3-3 η非螺旋肽包含選自SEQ ID NO 17-32的氨 基酸序列。在另一實施方案中，抗14-3-3 η抗體結合與對應于選自SEQ ID NO 17-32之序 列的氨基酸序列重疊的14-3-3 η區(qū)域。單克隆抗體、雜交瘤及其制備方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗14-3-3 η抗體，其為抗14_3_3 η單克隆抗 體。還提供了能夠產(chǎn)生此類抗體的雜交瘤細胞系。還提供了用于產(chǎn)生此類雜交瘤的方法以 及產(chǎn)生此類抗體的方法。所提供的抗14-3-3 η單克隆抗體包括與本文所述14-3-3 η環(huán)、螺旋和非螺旋肽 結合的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了通過融合來源于小鼠的脾細胞而產(chǎn)生的雜交瘤，其 中所述小鼠用包含14-3-3 η環(huán)、螺旋或非螺旋肽的免疫原進行免疫。還提供了此類雜交瘤 產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生這些單克隆抗體或其衍生物的方法，包括在合適條件下培養(yǎng) 本發(fā)明的雜交瘤，由此產(chǎn)生單克隆抗體，并從細胞和/或細胞培養(yǎng)基獲得抗體和/或其衍生 物。本領域技術人員可容易地制備抗體。由雜交瘤制備單克隆抗體的一般性方法 已是本領域公知的。參見例如Μ. Schreier等人，HybridomaTechniques (Cold Spring Harbor Laboratory) 1980 ；Hammerling 等 人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier Biomedical Press)1981。在一些實施方案中，這些方法包括在合適條件下培養(yǎng)產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細 胞，以及從所述細胞和/或細胞培養(yǎng)基獲得抗體和/或其衍生物。本發(fā)明還考慮到使用噬菌體文庫來篩選能夠結合本文所述之目的14-3-3肽的抗 體。例如參見 Konthur 等人，Targets, 1 :30_36，2002?？赏ㄟ^本領域技術人員已知的方法來純化通過任意方法制備的抗體。純化方法 包括選擇性沉淀、液相色譜、HPLC、電泳、色譜聚焦和多種親和技術等。選擇性沉淀可使用 硫酸銨、乙醇(Cohn沉淀)、聚乙二醇或其它本領域可用的試劑。液相色譜介質(zhì)包括離子 交換介質(zhì)DEAE、聚天冬氨酸、羥磷灰石、尺寸排阻(例如，基于交聯(lián)瓊脂糖、丙烯酰胺、葡聚 糖等的尺寸排阻)、疏水性基質(zhì)(例如Blue S印harose)。親和技術通常依賴于與免疫球 蛋白Fc結構域相互作用的蛋白質(zhì)。來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的蛋 白A可用于純化基于人Y 1、Y 2或γ 4重鏈的抗體(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62 1-13 (1983))。來自C群和G群鏈球菌的蛋白G可用于所有小鼠同種型和人Y 3 (Guss等人， EMBO J. 5 15671575 (1986))。蛋白 L (一種大消化鏈球菌(P印tostr印tococcusmagnus)細 胞壁蛋白質(zhì)，其通過κ輕鏈相互作用與免疫球蛋白(Ig)結合(BD Bioscience/ClonTech. Palo Alto, CA)可用于Ig亞類IgM、IgA、IgD、IgG、IgE和IgY的親和純化。這些蛋白質(zhì)的 重組形式也有市售。如果所述抗體含有金屬結合殘基(例如構建成含有組氨酸標簽的噬菌 體展示抗體)，可使用金屬親和色譜法。當有足夠量的特異性細胞群可用時，可用細胞制備 抗原親和基質(zhì)以提供純化所述抗體的親和方法。在一個優(yōu)選實施方案中，分離包括使用14-3-3 η或其片段的親和色譜法。
本發(fā)明提供了本文所述的抗體，以及相應的抗體片段和抗原結合部分。所有這些 都涵蓋在術語“抗14-3-3 η抗體”中。本文所用的本發(fā)明術語“抗體片段”或抗體的“抗 原結合部分”(或簡稱“抗體部分”)是指保留了特異性結合抗原能力的一個或多個抗體片 段。已顯示，抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來實現(xiàn)。術語“抗體片段”或抗體的 “抗原結合部分”所涵蓋的結合片段實例包括(i)Fab片段——由VL、VH、CL和CHl結構域 組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段——包含由鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩個Fab片段的二 價片段；(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂上的VL和VH結構 域組成的 Fv 片段，(ν) dAb 片段(例如，Ward 等人，(1989)Nature 341 :544_546)，其由 VH 結構域組成；(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)，和(vii)雙特異性單鏈Fv 二聚體(例如PCT/ US92/09965)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域(VL和VH)由單獨的基因編碼，但可以通過 合成的接頭使用重組方法將它們連接，所述接頭使得它們能夠制備成單個蛋白質(zhì)鏈，其中 VL和VH區(qū)域?qū)π纬蓡蝺r分子(稱為“單鏈Fv (scFv) ”；參見例如Bird等人(1988) Science 242 423-426 ；以及 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883)。這樣的 單鏈抗體也旨在涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”中。使用本領域技術人員已知的常規(guī) 技術獲得這些抗體片段，使用與完整抗體同樣的方式篩選片段?？蓪λ隹贵w片段進行修 飾。例如，可通過整合入連接VH和VL結構域的二硫橋來穩(wěn)定所述分子(Reiter等人，1996， Nature Biotech. 14 1239-1245)?？蓪⒚庖咔虻鞍追肿忧懈畛善?。所述分子的抗原結合區(qū)域可分為F(ab' )2或 Fab片段。F(ab' ) 2片段是二價的，可用于Fc區(qū)域是不期望的或不需要的特征時。Fab片 段是單價的，可用于抗體對其抗原具有非常高的親和力時。從抗體中去除Fc區(qū)域降低了 Fc 區(qū)域與具有Fc受體之細胞之間的非特異性結合。為了得到Fab或F(ab' )2片段，用酶消 化抗體。在免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)進行切割的蛋白酶保留了連接Fab結構域的二硫鍵， 使它們在切割后仍連在一起。適于此目的的蛋白酶是胃蛋白酶。為產(chǎn)生Fab片段，選擇蛋白 酶以使得切割發(fā)生在含有連接重鏈之二硫鍵的鉸鏈區(qū)以上，但其仍保留了連接重鏈和輕鏈 的完整二硫鍵。適于制備Fab片段的蛋白酶是木瓜蛋白酶。通過上述方法純化所述片段， 需要完整Fc區(qū)域的親和方法除外(例如蛋白A親和色譜法)?？赏ㄟ^抗體的有限蛋白水解產(chǎn)生抗體片段，其稱為蛋白水解抗體片段。這些包括 但不限于F(ab' ) 2片段、Fab'片段、Fab' -SH片段和Fab片段。通過將抗體有限暴露于 蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或無花果蛋白酶)而從抗體釋放“F(ab' )2片段”。F(ab' )2 片段包含兩個“臂”，其中每個臂均包含針對共同抗原并與其特異性結合的可變區(qū)。兩個 Fab'分子通過重鏈鉸鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵連接；所述Fab'分子可以針對相同(二價)或 不同(雙特異性)的表位。“Fab'片段”含有單個抗原結合結構域，其包含F(xiàn)ab以及穿過鉸 鏈區(qū)的額外重鏈部分?！?Fab' -SH片段”通常由F(ab' ) 2片段制備，其在F (ab ‘ )2片段 中由H鏈之間的二硫鍵連接在一起。用弱還原劑(例如但不限于，巰基乙胺)處理，斷 裂二硫鍵，繼而從一個F(ab' ) 2片段釋放兩個Fab'片段。Fab' -SH片段是單價且單特 異性的?！癋ab片段”(即含有抗原結合結構域并包含輕鏈和由二硫鍵橋連之部分重鏈的抗 體片段)可通過木瓜蛋白酶消化完整抗體來產(chǎn)生。簡便的方法是使用固定于樹脂上的木瓜 蛋白酶，從而可容易地除去所述酶并終止消化。Fab片段不具有F(ab' )2片段中存在的H 鏈之間的二硫鍵。
“單鏈抗體”是一類抗體片段。術語“單鏈抗體”常縮寫為“scFv”或“sFv”。這些 抗體片段使用DNA重組技術制備。單鏈抗體由多肽鏈組成，所述多肽鏈包含Vh和\結構 域，其相互作用以形成抗原結合位點。所述Vh和\結構域通常由10 25個氨基酸殘基的 肽連接。術語“單鏈抗體”還包括但不限于二硫鍵連接的Fv(dSFv)，其中兩個單鏈抗體 (每個可針對不同的表位)通過二硫鍵連接在一起；雙特異性sFv，其中具有不同特異性的 兩個獨立的scFv通過肽接頭相連；雙抗體(當?shù)谝?sFv的Vh結構域與第二 sFv的\結構域 組裝以及所述第一 sFv的\結構域與所述第二 sFv的Vh結構域組裝時形成的二聚化sFv ； 雙抗體的兩個抗原結合區(qū)域可針對相同或不同的表位)；以及三抗體(三聚化sFv，以類似 于雙抗體的方式形成，只是其中在單個復合物中形成三個抗原結合結構域；所述三個抗原 結合結構域可針對相同或不同的表位)。“互補決定區(qū)肽”或“CDR肽”是另一種抗體片段形式。在一個實施方案中，本發(fā)明 提供了這樣的⑶R肽。在一個優(yōu)選實施方案中，此類⑶R肽用作14-3-3 η拮抗劑。⑶R肽 (也稱為“最小識別單位”)是對應于單個互補決定區(qū)(OTR)的肽，并且可通過構建編碼目 的抗體之CDR的基因來制備。例如通過使用聚合酶鏈式反應從產(chǎn)生抗體之細胞的RNA合成 可變區(qū)來制備這些基因。參見，例如Larrick等人，Methods :A Companion toMethods in Enzymology 2 :106，1991。在“經(jīng)半胱氨酸修飾的抗體”中，通過基因操作將半胱氨酸插入或替換于抗體表面 上，用于將所述抗體與另一分子通過例如二硫橋進行綴合?？贵w的半胱氨酸替換或插入已 有描述(參見美國專利No. 5，219，996)。將Cys殘基引入IgG抗體恒定區(qū)中用于抗體之位 點特異性綴合的方法描述于Stimmel等人(J. Biol. Chem 275 =330445-30450,2000)。本公開內(nèi)容還提供了人源化和非人源化的抗體。人源化形式的非人(例如小鼠) 抗體是盡可能少地含有來源于非人免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。通常，人源化抗體是非 人抗體，其可變結構域框架區(qū)替換為人抗體中存在的序列。人源化抗體可以是這樣的人免 疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者高變區(qū)的殘基被來自非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或 非人靈長類)的具有期望特異性、親和力和容量的高變區(qū)(供者抗體)的殘基所替換。在 一些情形中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基所替換。此外，人源化抗 體可包含在受者抗體或供者抗體中均不存在的殘基。進行這些修飾以進一步優(yōu)化抗體的性 能。一般地，人源化抗體會包含至少一個以及通常兩個可變結構域的基本上全部，其中全 部或基本上全部的高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白中的高變環(huán)，并且全部或基本上全部的FR 是人免疫球蛋白序列中的FR。任選地，人源化抗體還會包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū) (Fe)(通常是人免疫球蛋白的Fe)?！愕?，在人源化抗體中，除⑶R以外的整個抗體均由人源的多核苷酸編碼，或者 除了⑶R以外均與此抗體一致。將⑶R(其中一些或全部由非人生物來源之核酸編碼)“嫁 接”于人抗體可變區(qū)的片層框架，產(chǎn)生特異性由所“嫁接”⑶R決定的抗體。這些抗體 的產(chǎn)生描述于例如 W092/11018，Jones，1986，Nature 321 :522_525，Verhoeyen 等人，1988， Science239 =1534-1536中。人源化抗體還可使用具有遺傳改造之免疫系統(tǒng)的小鼠來得到， 例如 Roque 等人，2004，Biotechnol. Prog. 20 :639_654。在效應物功能方面對本發(fā)明抗體進行修飾可以是理想的。例如，可將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)域，從而允許在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。還可使用異雙功能交聯(lián)劑來制 備同二聚化抗體，例如Wolff等人CancerResearch, 53 =2560-2565 (1993)?；蛘撸筛脑?抗體使其具有兩個Fc區(qū)域。參見例如，Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design, 3 219-230(1989)。經(jīng)修飾抗體在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗14-3-3 η抗體，其為經(jīng)修飾的抗體。經(jīng)修飾 抗體包括如本文所述的重組抗體。本領域技術人員會了解多種類型的經(jīng)修飾抗體或重組抗體。合適類型的經(jīng)修飾或 重組抗體包括但不限于經(jīng)改造單克隆抗體(例如嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體)、 結構域抗體(例如Fab、FV、VH、ScFV和dsFv片段)、多價或多特異性抗體(例如雙抗體、微 抗體(minibody)、微抗體(miniantibody)、(scFv) 2、三抗體和四抗體)以及如本文所述的 抗體綴合物。在一方面中，本發(fā)明提供了作為結構域抗體的抗14-3-3 η抗體。“結構域抗體”是 抗體的功能性結合結構域，其對應于人抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區(qū)。結構域抗 體可具有約13kDa的分子量或者小于完整抗體大小的十分之一。它們在多種宿主中很好 地表達，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞系統(tǒng)。另外，結構域抗體高度穩(wěn)定，并且甚至在經(jīng) 歷嚴苛條件(例如冷凍干燥或熱變性)之后仍保持活性。參見例如，美國專利6，291，158 ； 6，582，915 ；6，593，081 ；6，172，197 ；美國序列號 No. 2004/0110941 ；歐洲專利 0368684 ；美 國專利 6，696，245、W004/058821、W004/003019 和 W003/002609。在一個實施方案中，本發(fā) 明的結構域抗體是單結構域。單結構域抗體可如例如美國專利No. 6，248，516中所述來制 備。在另一方面中，本發(fā)明包括多特異性抗體。多特異性抗體包括雙特異性、三特異性 抗體等。雙特異性抗體可通過重組手段制備，例如通過使用亮氨酸拉鏈部分(即，來自Fos 和Jun蛋白，其優(yōu)先形成異二聚體；例如Kostelny等人，1992，J. Immnol. 148 1547)或者其 它鎖鑰相互作用結構域結構來實現(xiàn)，例如美國專利No. 5，582，996中所述。其它可用的技術 包括美國專利No. 5，959，083和美國專利No. 5，807，706中所述的技術。雙特異性抗體有時也稱為“雙抗體”。它們是與兩種(或更多種)不同抗原結合的 抗體。本領域中還已知三抗體(三聚化sFv，以類似于雙抗體的形式形成，只是其中在單個 復合物中形成三個抗原結合結構域；所述三個抗原結合結構域可針對相同或不同表位)或 四抗體(在單個復合物中形成四個抗原結合結構域，其中所述四個抗原結合結構域可針對 相同或不同表位)。雙抗體、三抗體或四抗體可采用本領域中已知的各種方法來制備(例如 Holliger 和 Winter, 1993，Current Opinion Biotechnol. 4 :446_449)，例如化學方法制備 或者從雜交瘤制備。另外，這些抗體及其片段可通過基因融合來構建(例如，Tomlinson等 人，2000，Methods Enzymo 1. 326 461-479 ；W094/13804 ；HolIiger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :6444_6448)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了微抗體，其是最小化的抗體樣蛋白質(zhì)，包含與 CH3結構域連接的scFv(其來源于抗14-3-3 η抗體)。微抗體可如本領域中所述來制備 (例如，Hu 等人，1996, Cancer Res. 56 3055-3061)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了 14-3-311結合結構域-免疫球蛋白融合蛋白。在一個實施方案中，所述融合蛋白可包含與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的14-3-3 11 結合結構域多肽，所述鉸鏈區(qū)多肽與融合了免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽的免疫球蛋 白重鏈CH2恒定區(qū)多肽融合。在本發(fā)明中，14-3-3抗體融合蛋白可通過本領域技術人員 所了解的方法來制備(參見例如，公開的美國專利申請No. 20050238646、20050202534、 20050202028、2005020023、2005020212、200501866216、20050180970 和 20050175614)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了來源于抗14-3-3 η抗體的重鏈蛋白。已利用 天然重鏈抗體(例如不具有輕鏈的駱駝抗體)開發(fā)抗體衍生的治療性蛋白質(zhì)，其通常保 留了天然重鏈抗體的結構和功能性質(zhì)。它們在本領域中稱作“納米抗體(nanobody)”?？?通過本領域技術人員了解的方法來制備來源于抗14-3-3 11重鏈抗體的重鏈蛋白(參見 例如，公開的美國專利申請 No. 20060246477、20060211088、20060149041、20060115470 和 20050214857)。此外，有關在輕鏈缺陷型小鼠中生產(chǎn)僅含重鏈的抗體，參見例如Zou等人， JEM, 204 :3271-3283，2007。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了作為人抗體的經(jīng)修飾抗14-3-3 η抗體。在一 個實施方案中，提供了全人14-3-3抗體。“全人抗體”是指僅具有來源于人染色體之抗體 基因序列的人抗體。所述抗14-3-3全人抗體可通過使用產(chǎn)生人抗體的小鼠的方法獲得， 所述小鼠具有含人抗體重鏈和輕鏈基因的人染色體片段[參見例如，Tomizuka, K.等人， Nature Genetics, 16，133-143 頁，1997 ;Kuroiwa，Y.等人，Nuc. Acids Res.，26，3447-3448 頁，1998 ;Yoshida, H.等人，Animal Cell Technology :Basic and Applied Aspects 卷 10,69-73 頁(Kitagawa, Y. , Matuda, Τ.禾口 Iijima, S.編)，Kluwer AcademicPub 1 ishers, 1999 ；Tomizuka, K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000]；或者通過用 選擇人抗體文庫的噬菌體展示獲得人抗體的方法獲得(參見例如，fformstone, I. M.等 人’ Investigative Ophthalmology &Visual Science. 43(7),2301-8 頁，2002 ;Carmen, S.等人，Briefings inFunctional Genomics and Proteomics, 1 (2), 189-203 頁，2002 ; Siriwardena, D.等)κ, Ophthalmology, 109 (3)，427-431 Μ, 2002)。在一個方面中，本發(fā)明提供了作為抗體類似物的14-3-3抗體，其有時稱作“合成 抗體”。例如，可使用“嫁接”了 CDR的替代性蛋白質(zhì)骨架或人工骨架。這些骨架包括但不限 于例如由生物相容性聚合物組成的合成骨架。參見例如，Korndorfer等人，2003，Proteins Structure, Function, andBioinformatics,卷 53, Issue 1 :121_129 ；Roque 等人，2004, Biotechnol. Prog. 20 :639_654。此夕卜，可使用肽抗體模擬物(ρ印tide antibody mimetics, “PAM”)以及利用纖連蛋白組分作為支骨架的抗體模擬物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了交聯(lián)抗體，其包含彼此結合形成抗體復合物的 本文所述兩個或更多個抗體。交聯(lián)抗體也稱為抗體多聚體、同綴合物和異綴合物。在一些實施方案中，本文提供的抗體復合物包括多聚體形式的抗14-3-3抗體。例 如，本發(fā)明的抗體復合物可采用單體免疫球蛋白分子的抗體二聚體、三聚體或更高級多聚 體的形式。可通過本領域已知的多種方法進行抗體的交聯(lián)。例如，抗體交聯(lián)可通過抗體的 天然聚集、通過化學或重組連接技術或本領域已知的其它方法來實現(xiàn)。例如，經(jīng)純化的抗體 制備物可自發(fā)地形成含有抗體同二聚體以及其它更高級抗體多聚體的蛋白質(zhì)聚集體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了特異性結合14-3-3 η的同二聚化抗體。可通過本領域已知的連接技術對抗體進行交聯(lián)或二聚化?？衫梅枪矁r連接方法。在一個具體實施方案中，可通過使用第二交聯(lián)劑抗體來實現(xiàn)抗體的交聯(lián)。所述交聯(lián)劑 抗體可來源于不同于目的抗體的動物。例如，可將山羊抗小鼠抗體(Fab特異性)添加到小 鼠單克隆抗體中以形成異二聚體。該二價交聯(lián)劑抗體識別兩個目的抗體的Fab或Fc區(qū)域， 從而形成同二聚體。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用山羊抗小鼠抗體(GAM)交聯(lián)特異性結合14-3-3 抗原的抗體。在另一實施方案中，GAM交聯(lián)劑識別兩種抗體的Fab或Fc區(qū)域，其中每種抗 體均特異性結合14-3-3 η。還可使用共價或化學連接抗體的方法?；瘜W交聯(lián)劑可以是同雙功能的或異雙功能 的，并且會共價結合兩個抗體，形成同二聚體。交聯(lián)劑是本領域中公知的；例如，公知同雙 功能接頭或異雙功能接頭(參見，2006 PierceChemical Company Crosslinking Reagents Technical Handbook ；Hermanson, G. Τ. , Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA(1996) ；Aslam Μ.禾口 Dent AH. , Bioconjugation :protein couplingtechniques for the biomedical sciences, Houndsmills, England :MacmillanPublishers (1999)； Pierce Applications Handbook & Catalog, PerbioScience, Ermbodegem, Belgium(2003-2004) ；Haughland, R. P. , Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene，第 9 版，MolecularProbes, OR(2003)以及美國專利 No. 5，747，641)。 本領域技術人員會了解多種官能團對修飾抗體氨基酸(包括交聯(lián))的適合性。用于抗體 交聯(lián)的合適化學交聯(lián)劑實例包括但不限于SMCC[4-(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸 琥珀酰亞胺酯]、SATA[S-硫代乙酰基-乙酸N-琥珀酰亞胺酯]、N-羥基琥珀酰亞胺的半 琥珀酸酯；N-羥基硫代琥珀酰亞胺；羥基苯并三唑和對硝基酚；二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 1-(3_ 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亞胺(EOT)和1-(3_ 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亞 胺甲碘化物(EDCI)(參見例如，美國專利No. 4，526，714，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本 文)。其它連接試劑包括谷胱甘肽、3-( 二乙氧基磷酰氧基)_1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮 (3- (diethoxyphosphoryloxy)-1,2, 3-benzotriazin-4 (3H) -one, DEPBT)、基于鐵鹽的偶聯(lián) 劑、基于聚環(huán)氧乙烷的異雙功能交聯(lián)試劑等(Haitao等人，Organ Lett 1 =91-94(1999)； Albericio 等人，J Organic Chemistry63 9678-9683 (1998) ；Arpicco 等人，Bioconjugate Chem. 8 327-337 (1997) ；Frisch 等人，Bioconjugate Chem. 7 180-186 (1996) ；Deguchi 等 人，Bioconjugate Chem. 10:32-37(1998) ；Beyer 等人，J. Med. Chem. 41 :2701_2708 (1998)； Drouillat 等人，J. Pharm. Sci. 87 :25_30(1998) ；Trimble 等人，Bioconjugate Chem. 8 416-423(1997))。用于形成抗體同二聚體的示例性方案在美國專利公開20060062786中 給出。將治療性化合物與抗體綴合的方法也描述于Arnon等人，"Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancers Therapy,"Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Reisfeld 等人編，243-256 頁，Alan R. Liss, Inc. (1985) ；Thorpe 等人 ‘‘The Preparation and Cytotoxic Properties of AntibodyToxin Conjugates, ”Immunol. Rev. 62 119-58(1982)以及 Pietersz，G. A.，"The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatmentof cancer, '^Bioconjugate Chemistry 1(2) 89-95 (1990)中，所有參考文獻均通過弓I用并入本文。另外，本發(fā)明的抗體_抗體綴合物可通過本領域已知的技術彼此共價結合，例 如使用異雙功能交聯(lián)試劑——GMBS(maleimidobutryloxysuccinimide,馬來酰亞胺丁氧基琥珀酰亞胺)和SPDP(3-(2_吡啶二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯)[參見例如， Hardy, “ Purification And Coupling OfFluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry" ，Handbook OfExperimental Immunology，卷 1，Immunochemistry, Weir 等人 (編)，31·4-31· 12 頁，第 4 版，(1986)以及 Ledbetter 等人，美國專利 No. 6，010，902]。另外，抗體可通過硫醚交聯(lián)進行連接，如美國專利公開20060216284、美國專利 No. 6，368，596中所述。如本領域技術人員所了解地，抗體可以在Fab區(qū)域交聯(lián)。在一些實 施方案中，理想的是，化學交聯(lián)劑不與抗體的抗原結合區(qū)域相互作用，因為這可能影響抗體 功能。綴合抗體本文公開的抗14-3-3 η抗體包括與無機或有機化合物綴合的抗體，包括例如但 不限于其它蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、類固醇和脂質(zhì)(參見例如，Green等人，Cancer Treatment Reviews, 26 :269_286 (2000)。所述化合物可以具有生物活性?！吧锘钚浴笔侵?與未暴露于化合物的細胞相比，所述化合物對細胞具有生理作用。生理作用是生物過程中 的變化，包括例如但不限于DNA復制和修復、重組、轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌、膜周轉(zhuǎn)、細胞粘附、信 號轉(zhuǎn)導、細胞死亡等。生物活性化合物包括藥物化合物。在一個實施方案中，將抗14-3-3 η 抗體與14-3-3拮抗劑肽(優(yōu)選R-18)綴合，優(yōu)選通過接頭進行綴合。有關R18，參見例如 Wang等人1999-參考文獻35。藥物組合物、施用和劑量可將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體摻入適于向?qū)ο笫┯玫乃幬锝M合物中。通常，所述 藥物組合物包含本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體以及可藥用載體。本文使用的“可藥用載體”包 括任意及全部的生理相容性溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延 遲劑等?？伤幱幂d體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合中 的一種或多種。在許多情形中，優(yōu)選在所述組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露 醇、山梨醇)或氯化鈉。可藥用物質(zhì)例如潤濕物質(zhì)或少量輔助物質(zhì)(如潤濕劑或乳化劑、防 腐劑或緩沖劑)提高了抗14-3-3 η抗體的保存期或有效性。在一個優(yōu)選實施方案中，抗14-3-3 11抗體靶向位于細胞外的14_3_3 η蛋白。 因此，配制治療性組合物并施用，以使得這樣遞送的抗14-3-3 11抗體可供與細胞外的 14-3-3 n蛋白結合之用。本發(fā)明的組合物可采用多種形式。這些包括例如液體、半固體和固體劑型，例如液 體溶液(例如注射液和輸注液)、分散系或混懸液、片劑、丸劑、粉末劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu) 選形式取決于預定的施用模式和治療性應用。典型的優(yōu)選組合物采用注射液或輸注液的 形式，例如與用其它抗體對人進行被動免疫時使用的組合物類似的組合物。優(yōu)選的施用模 式是腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)，其中尤其優(yōu)選囊內(nèi))施用。在一個實施方 案中，所述抗14-3-3 η抗體通過靜脈內(nèi)輸注或注射施用。在另一優(yōu)選實施方案中，所述抗 14-3-3 n抗體通過肌內(nèi)或皮下注射施用。在一個優(yōu)選實施方案中，直接注射進滑膜內(nèi)。治療性組合物通常必須是無菌的并且在制備和儲存條件下是穩(wěn)定的。所述組合 物可以配制成溶液、微乳劑、分散系、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它有序結構?？扇缦轮?備無菌注射液將所需量的活性化合物摻入根據(jù)需要含有一種上文所列成分或成分組合的 合適溶劑中，隨后過濾除菌。一般地，如下制備分散系將所述活性化合物摻入含有基礎分散介質(zhì)和所需的其它上文所列成分的無菌載體中。對于用來制備無菌注射液的無菌粉末來 說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其得到來自先前經(jīng)過濾滅菌之溶液的活性成 分和任意額外所需成分的粉末?？衫缤ㄟ^使用包衣(例如卵磷脂)、在分散系的情形中通 過維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑來維持溶液的適當流動性。注射用組合物的延長 吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現(xiàn)。本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體可通過本領域已知的多種方法來施用，包括靜脈內(nèi)注 射或輸注。直接施用至滑膜是一種優(yōu)選的施用途徑。如本領域技術人員所了解地，施用途徑 和/或模式將根據(jù)期望結果而有所不同。在某些實施方案中，所述活性化合物可與保護該 化合物免于快速釋放的載體一起制備，例如受控釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊 化遞送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酐、聚乙醇 酸、膠原蛋白、聚正酯和聚乳酸。制備這些制劑的許多方法都是專利方法或者是本領域技術 人員——般所知白勺。參見例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編，Marcel Dekker, Inc. ,New York, 19780 代表性的制備技術在 Remington : The Science andPractice of Pharmacy，第19片反，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995) 禾口 Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版，Kibbe, A. H.編，Washington DC, American Pharmaceutical Association(2000)等中有教導。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體可經(jīng)口施用，例如，與惰性稀釋劑 或可吸收食用載體一起施用。所述化合物(及其它成分，如果需要的話)還可封裝在硬殼 或軟殼明膠膠囊中，壓制成片劑或者直接摻入對象的飲食中。為了經(jīng)口治療性施用，所述活 性化合物中可摻入賦形劑并采用可攝入片劑、口含片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸液、糖漿、 薄片等形式。為了通過腸胃外施用之外的方式施用本發(fā)明化合物，可能有必要使用防止其 失活的材料對所述化合物進行包衣或者與所述化合物共施用。還可將補充性活性化合物摻入所述組合物中。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗 14-3-3 η抗體與一種或多種另外的治療劑共配制和/或共施用。例如，DMARD或DMOAD或 另一種抗體。這樣的聯(lián)合治療可有利地利用較低劑量的所施用治療劑，從而避免了與各種 單一治療相關的可能毒性或并發(fā)癥。本發(fā)明的藥物組合物可包含“治療有效量”或“預防有效量”的本發(fā)明抗體?！爸委?有效量”是指在必要的劑量和時間下有效實現(xiàn)期望治療結果的量。所述抗14-3-3 η抗體的 治療有效量可根據(jù)例如個體的疾病狀況、年齡、性別和體重以及所述抗14-3-3 η抗體在該 個體中引發(fā)期望應答的能力等因素而有所不同。治療有效量也是治療有益作用勝過抗體任 何毒性或有害作用的量?！邦A防有效量”是指在必要的劑量和時間下有效實現(xiàn)期望預防結果 的量。通常，由于預防性劑量在疾病之前或早期階段用于對象，因此預防有效量會少于治療 有效量。可以調(diào)整給藥方案以提供最佳的期望應答(例如治療性或預防性應答)。例如，可 施用單次劑量，可隨時間施用若干分開的劑量，或者可根據(jù)治療情況的迫切性來按比例減 少或增加劑量。配制成劑量單位形式的胃腸外組合物是尤其有利的，因為這便于施用且劑 量均一。本文使用的“劑量單位形式”是指適合作為待治療哺乳動物對象之單次劑量的物 理上離散的單位；每單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生期望治療效果的預定量的活性化合物以及所需的 藥物載體。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由(a)所述活性化合物的獨特特性和待實現(xiàn)之特定治療或預防效果，以及(b)在制備這樣的活性化合物以用于個體敏感治療的領域中固有的 限制所決定并直接取決于它們。本發(fā)明抗體的治療或預防有效量的示例性非限制性范圍是0. 1 20mg/kg，更優(yōu) 選1 10mg/kg。應當注意，劑量值可隨著待緩解病癥的類型和嚴重程度而變化。還應理解， 對于任何特定對象來說，具體給藥方案應根據(jù)個體需要以及施加或指導施用所述組合物的 人的專業(yè)判斷隨時間進行調(diào)整，本文所設定的劑量范圍僅為示例性的且不意在限制所要求 保護之組合物的范圍或?qū)嵤?。本文所述的藥物組合物可置于單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿或小瓶/ 管)中。此類容器通常以保持所述制劑的無菌和穩(wěn)定性直至使用的方式進行密封。一般地， 制劑可作為油或水性介質(zhì)中的混懸液、溶液或乳劑來保存，如上文所示。或者，藥物組合物 可以凍干狀態(tài)保存，其僅需要在臨使用前加入無菌液體載體即可?？?4-3-3 η抗體的治療性用途本文中“治療”意指針對疾病、病癥或不希望的狀況的治療性或預防性治療或者抑 制性手段?！爸委煛焙w在疾病癥狀出現(xiàn)之前和/或疾病的臨床表現(xiàn)或其它表現(xiàn)之后向?qū)ο?施加適當形式的抗14-3-3 η抗體，從而降低疾病的嚴重程度、停止疾病發(fā)展或消除疾病。 疾病的預防包括拖延或延遲疾病或病癥之癥狀的出現(xiàn)，優(yōu)選在疾病易感性提高的對象中。在一個方面中，本發(fā)明提供了治療涉及14-3-3 η之疾病的方法。所述方法包括向 患者施用治療有效量的本發(fā)明抗14-3-3 η抗體。在一些實施方案中，所述方法包括聯(lián)合治 療。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療關節(jié)炎的方法，包括治療下列疾病的方法 強直性脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合 征、纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié) 炎、佩吉特病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性 關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個實施方案中，所述方法涉及聯(lián)合治療，其中除了施用一種或多種本發(fā)明的 抗14-3-3 η抗體之外還施用至少一種另外的治療劑。在一個優(yōu)選實施方案中，所述治 療劑選自改變病因的抗風濕藥物(DMARD)、改變病因的骨關節(jié)炎藥物(DM0AD;例如參見 Loeser, Reumatologia, 21 104-106，2005)、抗 TNF α 抗體、抗 IL-1 抗體、抗 CD4 抗體、抗 CTLA4抗體、抗CD20抗體、抗IL-6抗體、來氟米特、柳氮磺吡啶和甲氨蝶呤。診斷、預后和治療性診斷(theragnostic)方法以及治療監(jiān)測在一個方面中，本發(fā)明提供了用于診斷涉及14-3-3 11之疾病和病癥的方法。所 述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體來檢測14-3-3 η蛋白的變化，例如表達、定位、 功能等的變化。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 II抗體進行免疫沉 淀。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體進行ELISA。在一個實施 方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體進行Western印跡。在一個實施方案中， 檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于免疫組織化學中。在一個實施方案中，檢測包括 將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于免疫熒光中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗 14-3-3 η抗體用于FACS分析中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗 體用于放射性免疫測定中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于試條測試中。在一個實施方案中，檢測包括將本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體用于床邊檢驗中。 在一個實施方案中，將檢測14-3-3 11與檢測另一種疾病標志物(例如，針對關節(jié)炎的MMP、 抗CCP抗體、抗RF抗體和/或CRP)聯(lián)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷炎性病癥的方法。在一個優(yōu)選實施方 案中，提供了診斷關節(jié)炎的方法。包括診斷選自以下之疾病的方法強直性脊柱炎、白塞病、 彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌痛、痛風、感染 性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性多 肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié) 炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。一般地，可基于患者的滑膜液、血漿或血清中14-3-3 η的存在來檢測患者的關節(jié) 炎。換句話說，細胞外的14-3-3 11蛋白可用作指示關節(jié)炎的標志物。此外，14-3-3 η的存在或者包括14-3-3 η在內(nèi)的14_3_3蛋白同工型的相對水平 (如通過使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體以及其它抗14-3-3抗體所測定地)可作為早期關 節(jié)炎在發(fā)展成衰弱形式之前的預后指示物。早期預后或診斷的優(yōu)點是較早實施治療方案。14-3-3 η的存在或相對水平可與患者樣品中另一些蛋白質(zhì)(例如基質(zhì)金屬蛋白 酶(MMP)，如MMP-I或ΜΜΡ-3)的存在或相對水平相關聯(lián)。已鑒定出至少25種不同的ΜΜΡ。 檢測患者樣品中的14-3-3 η以及至少一種MMP可用于診斷關節(jié)炎。另外，患者樣品中的 14-3-3 η以及至少一種MMP的存在或相對水平可用作早期關節(jié)炎在發(fā)展成衰弱形式之前 的預后指示物。在一個實施方案中，所述方法包括檢測患者的滑膜液、血漿或血清中的14-3-3 η 蛋白。在一個實施方案中，通過使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體對來自滑膜液、血漿或血清 的14-3-3 η蛋白進行免疫沉淀來進行檢測。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗 14-3-3 η抗體進行ELISA。在一個實施方案中，檢測包括使用本發(fā)明的抗14_3_3 η抗體對 包含患者的滑膜液、血漿或血清的樣品進行Western印跡。在一個實施方案中，檢測包括使 用放射性免疫測定。在一個實施方案中，檢測包括使用試條測試。在一個實施方案中，檢測 包括使用床邊檢驗。在一個實施方案中，將檢測14-3-3 11與檢測另一種關節(jié)炎標志物(例 如，MMP、抗CCP抗體、抗RF抗體和/或CRP)聯(lián)用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷神經(jīng)性病癥的方法。在一個優(yōu)選實施 方案中，提供了用于診斷選自細菌性腦膜炎和克_雅病之疾病的方法。在一個實施方案中， 檢測腦脊液中14-3-3 11的存在。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于確定患者對炎性疾病之治療的響應潛力的方 法。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了確定患者對關節(jié)炎治療之響應潛力的方法。包括確定 針對選自以下疾病之治療的響應潛力的方法強直性脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚 癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié) 炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉特病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、 假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合 征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個實施方案中，所述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體確定患者樣品 中的14-3-3 11水平。在一個優(yōu)選實施方案中，將患者樣品中的14-3-3 11水平與來自治療響應能力已知的對象中的樣品進行比較。與來自非炎癥對象的樣品和/或來自另一炎 癥患者的樣品相比，第一患者樣品中相對較高的14-3-3 η水平可指示該第一患者是用抗 14-3-3 η抗體或替代性的DMARD療法(例如抗TNF抗體)進行治療的優(yōu)選候選者。相反， 與來自另一炎癥患者的樣品相比，第一患者樣品中相對較低的14-3-3 11水平可指示該第 一患者不是用抗14-3-3 η抗體或替代性的DMARD療法(例如抗TNF抗體)進行治療的優(yōu) 選候選者，尤其是當所述水平接近于非炎癥對象中樣品的水平時。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于區(qū)分炎性疾病亞型的方法。在一個優(yōu)選實施 方案中，提供了區(qū)分關節(jié)炎亞型的方法。在一個實施方案中，所述方法包括使用本發(fā)明的 抗14-3-3 η抗體確定患者樣品中的14-3-3 η水平。在一個優(yōu)選實施方案中，將患者中的 14-3-3 η水平與炎性疾病亞型或預后已知的對象之樣品中的14-3-3 η水平進行比較。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于預防涉及14-3-3 η之疾病發(fā)生的預防性方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在具有發(fā)生炎性疾病之風險的對象中預防 炎性疾病發(fā)生的預防性方法。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了用于在具有發(fā)生關節(jié)炎之風 險的對象中預防關節(jié)炎的預防性方法。包括用于預防選自以下疾病的預防性方法強直性 脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、纖維 肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、佩吉 特病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關節(jié)炎、 類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。所述方法包括向?qū)?象施用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。在一個實施方案中，將所述抗14-3-3 η抗體作為本文 所述聯(lián)合治療的組分來施用。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測炎性病癥之治療的方法。在一個優(yōu)選實施 方案中，提供了用于監(jiān)測關節(jié)炎治療的方法。包括用于監(jiān)測選自以下疾病之治療的方法強 直性脊柱炎、白塞病、彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)、埃-當綜合征(EDS)、費爾蒂綜合征、 纖維肌痛、痛風、感染性關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、狼瘡、混合性結締組織病(MCTD)、骨關節(jié)炎、 佩吉特病、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、假性痛風、銀屑病關節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、反應性關 節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征、斯蒂爾病和韋格納肉芽腫病。在一個實施方案中，所述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體測定患者樣品 中的14-3-3 η水平，以及監(jiān)測進行治療的患者中14-3-3 η的水平。在一個方面中，本發(fā)明提供了用于檢測患者樣品中14-3-3 11以及任選地其它 標志物(例如MMP)之存在的試劑盒，所述試劑盒可用于提供適于診斷或區(qū)分多種涉及 14-3-3 11之疾病類型的診斷或預后結果。試劑盒包含本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。此試劑 盒還可包含特異性針對特定MMP (其為關節(jié)炎標志物)的檢測試劑。所述試劑盒還可包含 免疫檢測14-3-3 11所需的其它試劑，例如帶標記的第二抗體、生色或發(fā)熒光的試劑、聚合 劑和/或出于診斷或預后目的使用所述試劑盒的說明。有關診斷方法，還參見2007年5月9日提交的WO 2007/128132。對于使用抗體來檢測樣品中的蛋白質(zhì)標志物來說，存在多種本領域技術人員已知 的測定形式。參見例如，Harlow 禾P Lane, Antibodies :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，關節(jié)炎或其它涉及14_3_3 η之病癥的存在與否或者患 者預后可如下確定(a)將從患者獲得的生物樣品與本發(fā)明的抗14-3-3 11抗體接觸；(b)檢測樣品中與所述抗體結合的14-3-3 η水平；以及(C)將多肽水平與預定截斷值(即對 照)進行比較。在一個優(yōu)選實施方案中，所述測定包括使用固定于固體支持物上的本發(fā)明抗 14-3-3 η抗體來結合14-3-3 η蛋白并將其從樣品剩余物中除去。然后，可使用含有報告基 團并且特異性結合抗體/蛋白質(zhì)復合物的檢測試劑來檢測所結合的14-3-3 η蛋白。這樣的 檢測試劑可包含例如特異性結合14-3-3蛋白的結合劑?；蛘?，可利用競爭性測定，其中用 報告基團標記14-3-3 11蛋白，并在將所述抗體與所述樣品孵育后使之結合經(jīng)固定的抗體。 樣品中的組分抑制經(jīng)標記14-3-3 11蛋白與抗體結合的程度指示樣品與經(jīng)固定抗體的反應 性。在這些測定中使用的合適蛋白質(zhì)包括全長14-3-3 η蛋白以及與抗體結合的其多肽部 分。所述固體支持物可以是本領域技術人員已知的任何材料。例如，所述固體支持物 可以是微量滴定板中的測試孔或者硝酸纖維素膜或其它合適的膜?；蛘?，所述支持物可以 是珠或盤，例如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物還 可以是磁性顆粒或光纖傳感器，例如美國專利No. 5，359,681中公開的那些。所述抗體可以 使用本領域技術人員所知的多種方法固定在固體支持物上，其充分地描述于專利和科學文 獻中。在本發(fā)明中，術語“固定”是指非共價結合(例如吸附)和共價連接(可以是抗體與 支持物上官能團的直接連接，或者可以是通過交聯(lián)劑的連接)。優(yōu)選通過吸附固定于微量滴 定板的孔中或膜上。在此情形中，可以通過在合適緩沖液中將抗體與固體支持物接觸一段 合適的時間來實現(xiàn)吸附。接觸時間隨溫度而變化，但通常為約1小時至約1天。在一個實 施方案中，使用經(jīng)鏈霉親和素包被的微量滴定板與生物素化抗體相組合?？贵w與固體支持物的共價連接一般可通過下述方式實現(xiàn)首先將支持物與雙功能 試劑反應，所述雙功能試劑與支持物和抗體均能發(fā)生反應。在某些實施方案中，所述測定是雙抗體夾心測定。該測定可通過下述方式進行首 先將已固定于固體支持物(通常為微量滴定板的孔)的抗體與樣品接觸，從而使樣品中的 14-3-3 η蛋白與經(jīng)固定的抗體結合。然后，從經(jīng)固定的蛋白質(zhì)-抗體復合物中除去未結合 之樣品，加入含有報告基團的檢測試劑(優(yōu)選能夠結合所述多肽上不同位點的第二抗體)。 然后，使用適合于特定報告基團的方法測定仍與固體支持物結合的檢測試劑的量。經(jīng)固定的抗體和檢測抗體優(yōu)選是不同的。在一個優(yōu)選實施方案中，經(jīng)固定抗體是 本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體，而檢測抗體是本發(fā)明的另一種抗14-3-3 η抗體或者能夠結合 14-3-3 η的另一種抗14-3-3抗體。在一個實施方案中，所述檢測抗體是泛14_3_3抗體。在另一實施方案中，所述檢測抗體是本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體，而經(jīng)固定抗體是 本發(fā)明的另一種抗14-3-3 η抗體或者能夠結合14-3-3 η的另一種抗14-3-3抗體。在一 個實施方案中，所述經(jīng)固定抗體是泛14-3-3抗體。所述方法包括使用本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。作為所述第二抗體的替代方案，可 使用與14-3-3 η結合的另一種配體來與本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體相組合。這種配體的實 例有R18 (Wang等人1999-參考文獻35)?？贵w一經(jīng)如上所述固定于支持物上，通常就將支持物上剩余的蛋白質(zhì)結合位點封 閉。本領域技術人員已知的任何合適封閉劑，例如牛血清白蛋白或脫脂奶粉。然后，將經(jīng)固 定抗體與樣品一起孵育，使14-3-3 η蛋白與抗體結合?？稍诜跤坝煤线m的稀釋劑(例如磷酸鹽緩沖液(PBS))稀釋樣品。一般地，合適的接觸時間(即孵育時間)是足以檢測獲得 自患關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 η之病癥的個體樣品中14-3-3 η蛋白存在的時間。優(yōu)選 地，接觸時間足以實現(xiàn)這樣的結合水平，即在結合和未結合之14-3-3 n蛋白平衡狀態(tài)下所 實現(xiàn)水平的至少約95%。本領域技術人員會了解，可通過測定在一段時間內(nèi)發(fā)生結合的水 平來容易地確定實現(xiàn)平衡所需的時間。在室溫下，約30分鐘的孵育時間通常是足夠的。然后，可通過用合適的緩沖液(例如含有0. 吐溫20 的PBS)清洗固體支持物 以除去未結合的樣品。然后，可將含有報告基團的第二抗體加至固體支持物。適于本發(fā)明 方法的報告基團是本領域公知的。然后，將檢測試劑與經(jīng)固定的抗體-蛋白質(zhì)復合物一起孵育足以檢測所結合 14-3-3 n蛋白的時間。合適的時間一般可通過測定一段時間內(nèi)發(fā)生的結合水平來測定。然 后除去未結合的檢測試劑，使用報告基團檢測結合的檢測試劑。用于檢測報告基團的方法 取決于報告基團的性質(zhì)。對于放射性基團來說，閃爍計數(shù)或放射自顯影方法一般是合適的。 光譜分析法可用于檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團?？墒褂门c不同的報告基團(通常為放 射性或熒光基團或酶)偶聯(lián)的親和素來檢測生物素。酶報告基團一般可通過加入底物(一 般保持特定的時間段)然后對反應產(chǎn)物進行光譜分析或其它分析來檢測。為了確定是否存在關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 η病癥，一般將仍結合于固體支持 物之報告基團檢測到的信號與對應于預定截斷值(對照)的信號進行比較。在一個優(yōu)選 實施方案中，所述截斷值是當經(jīng)固定抗體與來自未患關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 11之病癥 的患者樣品一起孵育時獲得的信號的平均值。一般地，認為產(chǎn)生高于預定截斷值三倍標準 差之信號的樣品是關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 η之病癥陽性的。在一個替代性優(yōu)選實施方 案中，可使用接收者操作特征曲線(Receiver Operator Curve)來確定截斷值，例如參見 Sackett等人，Clinical Epidemiology :A Basic Science for ClinicalMedicine,Little Brown and Co.，1985，106-7頁的方法。簡言之，在該實施方案中，截斷值可根據(jù)對應于診斷 測試結果之每個可能截斷值的真陽性率(即靈敏度)和假陽性率(100% -特異性)的配 對曲線來確定。曲線上最接近于左上角的截斷值(即囊括了最大面積的值)是最精確的截 斷值，產(chǎn)生高于根據(jù)該方法確定之截斷值的信號的樣品可認為是陽性的?；蛘?，所述截斷值 可以沿曲線向左移，從而使假陽性率最小，或者向右移，從而使假陰性率最小。一般地，產(chǎn)生 高于該方法確定之截斷值的信號的樣品被認為是關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 n之病癥陽性 的。在一個實施方案中，所述測定作為床邊檢驗來提供。例如，在一個相關實施方案 中，所述測定采用流通(flow-through)形式或試條測試形式進行，其中所述抗體固定于膜 (例如硝酸纖維素膜)上。在流通測試中，隨著樣品與膜接觸，樣品中的14-3-3蛋白結合 至經(jīng)固定的抗體。然后，隨著含有第二結合劑的溶液接觸所述膜，第二經(jīng)標記結合劑結合 至結合劑-多肽復合物。然后，可如上所述對所結合的第二結合劑進行檢測。在試條測試 形式中，將結合有抗體之膜的一端浸于含有樣品的溶液中。樣品沿膜遷移，通過含有第二 14-3-3 n結合劑的區(qū)域，到達經(jīng)固定抗體的區(qū)域。在經(jīng)固定抗體區(qū)域處的第二結合劑的濃 度指示關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 n之病癥或者患者預后等的存在情況。通常，該位點處第 二結合劑的濃度產(chǎn)生可目測的圖案，例如線。沒有該圖案指示陰性結果。一般地，選擇固定 于所述膜上的結合劑的量以使得當生物樣品含有足以在雙抗體夾心測定中產(chǎn)生陽性信號的多肽水平時產(chǎn)生肉眼可辨別的圖案(以上述形式)。用于這些測定的優(yōu)選結合劑是抗體 及其抗原結合片段。這些測試通?？墒褂煤苌倭康纳飿悠凡⑶铱呻S時進行。在一個優(yōu)選實施方案中，所述經(jīng)固定抗體是本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體。所述第二 結合劑是另一種14-3-3 η配體，其是否選擇性地結合14-3-3 η蛋白均可。在另一實施方案中，所述第二結合劑是本發(fā)明的抗14-3-3 η抗體，最優(yōu)選其抗原 結合片段，所述經(jīng)固定抗體是能夠結合14-3-3 η蛋白的抗14-3-3抗體。所述抗體是否選 擇性地結合14-3-3 η蛋白均可。當然，還存在許多其它適用于本發(fā)明抗14-3-3抗體的測定方案。以上描述僅旨在 舉例。為了改善靈敏度，可在給定樣品中測定多種標志物。特別地，可與14-3-3蛋白相 結合地測定關節(jié)炎或其它涉及14-3-3 n之病癥的一種或多種其它標志物或者預后指示物 等。這些另外的標志物可以是蛋白質(zhì)或核酸。在一個優(yōu)選實施方案中，其中所述疾病是關 節(jié)炎，一種或多種其它標志物是MMP蛋白或核酸或者其它常用作關節(jié)炎指示物的因子，例 如抗CCP抗體、抗RF抗體、CRP等?；趨⒖夹蛄蟹蛛x和測定核酸的方法是本領域中公知 的?？赏瑫r或依次進行組合測定?？苫诔Ｒ?guī)實驗選擇標志物，以確定得到最佳靈敏 度的組合。本發(fā)明還提供了用于上述任何診斷方法中的試劑盒。這些試劑盒通常包含進行診 斷測定所需的兩種或更多種組分。組分可以是化合物、試劑、容器和/或設備。例如，試劑盒 中的一個容器可含有本發(fā)明的抗14-3-3 η單克隆抗體。如上所述，可提供連接至支持物材 料的這些抗體。一個或多個另外的容器可容納測定中所用的要件，例如試劑或緩沖液。這 樣的試劑盒還可包含如上所述的檢測試劑，其含有適于直接或間接檢測抗體結合的報告基 團。試劑盒還可包含檢測其它關節(jié)炎標志物的試劑，包括編碼特定MMP的特定mRNA。實驗表1:14-3-3 η 表位
SEQ ID NO 193-107螺旋LETVCNDVLSLLDKFSEQ ID NO 2191-199螺旋EQACLLAKQSEQ ID NO 3144-155螺旋NSVVEASEAAYKSEQ ID NO 4144-152螺旋NSVVEASEASEQ ID NO 5147-155螺旋VEASEAAYKSEQ ID NO 6163-170螺旋EQMQPTHP
權利要求
抗14 3 3η抗體，其中所述抗體能夠特異性結合天然構型的人14 3 3η蛋白，并且其中所述抗體表現(xiàn)出相對于其它的人14 3 3蛋白同工型來說對所述人14 3 3η蛋白的選擇性。
2.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3η抗體，其中所述抗體不與位于所述人14-3-3 η蛋白 N端的表位結合。
3.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3η抗體，其中所述抗體能夠結合包含選自以下η肽的 表位14-3-3 n環(huán)肽、14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽。
4.根據(jù)權利要求3的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠結合包含14-3-3 n環(huán)肽的 表位，其中所述14-3-3 n環(huán)肽包含選自SEQ ID NO 11-16的氨基酸序列。
5.根據(jù)權利要求3的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠結合包含14-3-3 n螺旋肽 的表位，其中所述14-3-3 n螺旋肽包含選自SEQ IDNO :1_10的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求3的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠結合包含14-3-3 n非螺旋 肽的表位，其中所述14-3-3 n非螺旋肽包含選自SEQID NO 17-32的氨基酸序列。
7.根據(jù)權利要求4的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠結合包含LDKFLIKNSNDF(SEQ ID NO 30)的表位。
8.根據(jù)權利要求4的抗體，其中所述抗體能夠結合包含KKLEKVKAYR(SEQID NO 31)的表位。
9.根據(jù)權利要求4的抗14-3-3η抗體，其中所述抗體能夠結合包含 KNSVVEASEAAYKEA (SEQ ID NO 32)的表位。
10.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體表現(xiàn)出相對于人14-3-3 α、β、 δ、ε、Υ、τ和ξ蛋白來說對所述人14-3-3 η蛋白的選擇性。
11.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠從包含所述14-3-3 n蛋白 之生物溶液中免疫沉淀所述14-3-3 η蛋白。
12.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體當用于ELISA中時，能夠在對包 含所述人14-3-3 n蛋白的生物溶液進行所述ELISA時特異性結合所述生物溶液中的所述 人14-3-3 η蛋白。
13.根據(jù)權利要求11或12的抗14-3-3n抗體，其中所述生物溶液包含來自關節(jié)炎患 者之滑膜液、血漿或血清的樣品。
14.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體能夠抑制14-3-3 n對MMP的誘 導，其中所述MMP選自MMP_1、3、8、9、10、11和13。
15.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.根據(jù)權利要求1的抗14-3-3n抗體，其中所述抗體是人源化單克隆抗體。
17.抗14-3-3η抗體，其與權利要求2或3的抗體競爭結合天然構型的人14-3-3 η蛋 白，其中所述抗體表現(xiàn)出相對于其它的人14-3-3蛋白同工型來說對所述人14-3-3 n蛋白 的選擇性。
18.制備權利要求1的抗14-3-3η抗體的方法，其包括用選自14_3_3 η環(huán)肽、 14-3-3 n螺旋肽和14-3-3 n非螺旋肽的肽免疫哺乳動物。
19.診斷關節(jié)炎的方法，其包括使用權利要求1的抗14-3-3n抗體來檢測包含來自患 者之滑膜液、血漿或血清的樣品中的14-3-3 n蛋白。
20.權利要求1-16中任一項的抗14-3-3η抗體用于檢測包含來自患者之滑膜液、血漿 或血清的樣品中的14-3-3 η蛋白以診斷關節(jié)炎的用途。
21.用于診斷關節(jié)炎的試劑盒，其包含權利要求1的抗14-3-3η抗體和實施權利要求 19之方法的說明。
22.用于治療關節(jié)炎的方法，其包括向有此治療需要的患者施用治療有效量的權利要 求1-16中任一項之抗14-3-3 η抗體。
23.權利要求1-16中任一項的抗14-3-3η抗體用于治療患者中關節(jié)炎的用途。
24.權利要求1-16中任一項的抗14-3-3η抗體用于制備治療患者中關節(jié)炎之藥物的 用途。
25.權利要求1-16中任一項的抗14-3-3η抗體，其用于治療患者中的關節(jié)炎。
26.藥物組合物，其包含權利要求1-16中任一項的抗14-3-3η抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗14-3-3η抗體，其特異性結合天然構型的人14-3-3η蛋白同工型，同時表現(xiàn)出相對于人14-3-3α、β、δ、ε、γ、τ和ξ蛋白同工型的選擇性。還提供了包含所述特異性抗14-3-3η抗體的方法、試劑盒和藥物組合物，用于診斷和治療關節(jié)炎。
文檔編號A61K39/395GK101952313SQ200880125676
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權日2007年11月27日
發(fā)明者安東尼·馬羅塔 申請人:不列顛哥倫比亞大學