專利名稱：抗c35抗體聯(lián)合療法和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殺死癌細(xì)胞，特別是表達(dá)C35的癌細(xì)胞的方法。在一個(gè)方面，該方法包 括施用至少一種C35抗體和至少一種抗HER2抗體。在另一個(gè)方面，該方法包括施用至少一 種C35抗體和至少一種抗EGFR抗體。在一些實(shí)施方案中，治療性試劑也與抗體聯(lián)合施用。 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于C35陽(yáng)性癌癥的治療的方法，其包括測(cè)試受體分子例 如HER2、EGFR和IGFR的表達(dá)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞生長(zhǎng)是響應(yīng)于機(jī)體的特定需要的精確調(diào)節(jié)過(guò)程。有時(shí)候，指示關(guān)于細(xì)胞分裂 規(guī)則的復(fù)雜且受到高度調(diào)節(jié)的調(diào)控會(huì)失效。當(dāng)發(fā)生這種情況時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始不依賴于其穩(wěn)態(tài) 調(diào)節(jié)而生長(zhǎng)并分裂，從而導(dǎo)致通常被稱為癌癥的病狀。事實(shí)上，在25-44歲的美國(guó)人中，癌 癥是導(dǎo)致死亡的第二個(gè)主要原因。目前用于癌癥的療法包括化學(xué)療法和放射療法?；熕幤分饕ㄟ^(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 來(lái)殺死癌細(xì)胞(Fisher，D. E.，Cell 78:539-542(1994) ；Fung,C. Y. ^PD. Ε. Fisher, J. Clin. Oncol. 13 801-807(1995) ；Lowe, S. W.，等人，Cell 74 :957_967 (1993))。放射療法通過(guò)誘 導(dǎo)細(xì)胞凋亡并通過(guò)其他機(jī)制來(lái)殺死癌細(xì)胞。但是，化學(xué)療法和放射療法不能殺死給定腫瘤 中的所有細(xì)胞，并且在經(jīng)過(guò)這種治療后存活下來(lái)的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。因此，這些治療通常不 足以根除整個(gè)腫瘤。因此，需要經(jīng)改善的治療癌癥的治療性方法。已經(jīng)研發(fā)出用于癌癥的免疫治療性策略，這些策略使用抗體靶向在腫瘤細(xì)胞中差 異性表達(dá)的表面膜標(biāo)記物(例如美國(guó)專利號(hào)5，770，195,"Monoclonal Antibodies to the HER2 Rec印tor”，1995年5月23日提交；1998年6月23日授權(quán))。但是，腫瘤中差異性表 達(dá)的許多抗原并非暴露在腫瘤細(xì)胞的表面上。因此，這種細(xì)胞內(nèi)抗原不適合作為用于基于 抗體的治療劑的靶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及殺死表達(dá)C35和HER2的癌細(xì)胞的方法，其包括給所述細(xì)胞施用(a) 一定量的特異性結(jié)合C35的抗C35抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b) —定量的特異性結(jié)合 HER2的抗HER2抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗C35抗體的所述量和所述抗HER2抗體的所 述量對(duì)于殺死所述癌細(xì)胞有效。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括施用一定量的治療 性試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在體內(nèi)執(zhí)行。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法在哺 乳動(dòng)物例如人中執(zhí)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑是化療劑?；焺┻x自順鉬、卡鉬、紫杉 醇、阿霉素、多西他賽、泰素帝、吉西他濱和長(zhǎng)春瑞濱。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是紫杉醇。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是阿霉素。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑是放射。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所述抗HER2抗
6體中的至少一種前施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所述 抗HER2抗體中的至少一種后施用。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，治療性試劑與所述抗C35 抗體或所述抗HER2抗體中的至少一種同時(shí)施用?？笴35抗體和抗HER2抗體同時(shí)或順次施 用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其片段各自以約0. lmg/kg至約100mg/kg患者體重的劑量 施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體或片段選自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，抗C35抗體或片段是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。在一個(gè) 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗C35抗體或片段是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或 衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞選自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前 列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。在一個(gè)進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，乳腺癌細(xì)胞是導(dǎo)管內(nèi)癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用超過(guò)一種抗C35抗體或其片段。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用超過(guò)一種抗HER2抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體是人源化、嵌合或人抗體。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，抗HER2抗體是人源化、嵌合或人抗體。本發(fā)明還涉及殺死患者中的C35陽(yáng)性癌細(xì)胞的方法，其包括測(cè)試在所述患者的癌 細(xì)胞樣品中EGFR和HER2的表達(dá)；和當(dāng)所述癌細(xì)胞對(duì)于EGFR表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，施用有效殺死 所述癌細(xì)胞的一定量的抗EGFR抗體和一定量的抗C35抗體；或當(dāng)所述癌細(xì)胞對(duì)于HER2表 達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，施用有效殺死所述癌細(xì)胞的一定量的抗HER2抗體和一定量的抗C35抗體。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體外測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，體外測(cè)定法選自免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體內(nèi)測(cè)定法 進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)細(xì)胞成像測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。 EGFR和HER2表達(dá)可以通過(guò)不同測(cè)定方法或相同測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，乳腺癌 是導(dǎo)管內(nèi)癌。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，乳腺癌是乳腺癌轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性 的人源化變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié) 合特異性的人源化變體或衍生物。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗C35抗體是全人的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體和所述抗C35抗體在不同時(shí)間施用。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體在所述抗C35抗體前施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗HER2 抗體和所述抗C35抗體在不同時(shí)間施用。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗HER2抗體在所述 抗C35抗體前施用。本發(fā)明還涉及設(shè)計(jì)用于具有C35陽(yáng)性癌癥的患者的治療的方法，其包括測(cè)試在來(lái)自所述癌癥患者的生物樣品中HER2和EGFR的表達(dá)；選擇包括抗C35抗體和針對(duì)HER2或 EGFR的抗體的聯(lián)合抗體療法，其中當(dāng)生物樣品對(duì)于HER2表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，選擇抗HER2抗體， 并且當(dāng)生物樣品對(duì)于EGFR表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，選擇抗EGFR抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品 選自腫瘤組織、血漿和血清。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，C35陽(yáng)性癌癥是乳腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳腺 癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，乳腺癌是乳腺癌轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗C35抗體是1B3或其保留對(duì)于 C35的結(jié)合特異性的人源化變體或衍生物。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體是1F2或其 保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的人源化變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體是 全人的。本發(fā)明還涉及用于鑒定將在治療上響應(yīng)于用抗體聯(lián)合療法來(lái)治療癌癥的方法的 患者的方法，所述方法包括測(cè)試在所述患者的癌細(xì)胞樣品中C35、EGFR和HER2的表達(dá)；測(cè)定 在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR和HER2的組合；和提供針對(duì)在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、 EGFR和HER2的組合的抗體的組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自乳腺癌、肝癌、卵 巢癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是乳腺 癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，C35、EGFR和HER2表達(dá)通過(guò)體外測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，體外測(cè)定法選自免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體內(nèi)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)細(xì)胞成像測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞 表達(dá)C35和EGFR的組合。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體的組合包括抗C35抗 體和抗EGFR抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)C35和HER2的組合。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，抗體的組合包括抗C35抗體和抗HER2抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)C35、EGFR 和HER2的組合。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所提供的抗體的組合是抗C35抗體、抗EGFR 抗體和抗HER2抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)試在所述患者的癌細(xì)胞樣品中 IGFR的表達(dá)；測(cè)定在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR、HER2和IGFR的組合；和提供針對(duì)在所 述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR、HER2和IGFR的組合的抗體的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì) 胞表達(dá)C35和IGFR的組合。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體的組合包括抗C35抗體和抗 IGFR抗體。本發(fā)明還涉及殺死表達(dá)C35和EGFR的癌細(xì)胞的方法，其包括給所述細(xì)胞施用一定 量的特異性結(jié)合C35的抗C35抗體或其抗原結(jié)合片段；和一定量的特異性結(jié)合EGFR的抗 EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗C35抗體的所述量和所述抗EGFR抗體的所述量對(duì)于殺 死所述癌細(xì)胞有效。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括施用一定量的治療性試劑。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在體內(nèi)執(zhí)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在哺乳動(dòng)物中執(zhí)行。 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑是化療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑選自順鉬、卡鉬、紫杉醇、阿霉素、多西他賽、泰素帝、吉西他濱和長(zhǎng)春瑞濱。在一個(gè)實(shí)施方案 中，化療劑是紫杉醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑是阿霉素。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 治療性試劑是放射。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所述抗EGFR抗體中的至 少一種前施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所述抗EGFR抗 體中的至少一種后施用。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，治療性試劑與所述抗C35抗體或所 述抗EGFR抗體中的至少一種同時(shí)施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體和所述抗EGFR抗體同時(shí)施用。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，抗C35抗體和所述抗EGFR抗體順次施用。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體 或其片段各自以約0. lmg/kg至約100mg/kg患者體重的劑量施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體或片段選自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，抗C35抗體或片段是1F2及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，抗C35抗體或片段是1B3及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞選自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前 列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。在一個(gè)進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，乳腺癌細(xì)胞是導(dǎo)管內(nèi)癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用超過(guò)一種抗C35抗體或其片段。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用超過(guò)一種抗EGFR抗體。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 抗C35抗體是人源化、嵌合或人抗體。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是人源化、嵌合 或人抗體。下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的這些以及其他方面。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了用曲妥珠單抗+對(duì)照IgG、曲妥珠單抗+抗C35 1F2抗體、曲妥珠單抗 +抗C35 1B3抗體、或鹽水處理(處理在移植后12天開(kāi)始)的BT474-MD移植小鼠的平均腫 瘤體積。與單獨(dú)的曲妥珠單抗相比較，曲妥珠單抗和1F2或1B3抗C35抗體的組合使腫瘤 體積明顯減少。箭頭指示處理時(shí)間點(diǎn)。圖2顯示了與用曲妥珠單抗+對(duì)照IgG或鹽水處理的小鼠相比較，在BT474-MD異 種移植后的無(wú)腫瘤小鼠數(shù)目在曲妥珠單抗/抗C35組合處理的小鼠(曲妥珠單抗+抗C35 1F2或曲妥珠單抗+抗C35 1B3)中更大。箭頭指示處理時(shí)間點(diǎn)。圖3顯示了晚期細(xì)胞凋亡(A)曲妥珠單抗處理的BT474細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞表面抗C35 抗體染色為染色陽(yáng)性，而(B)活細(xì)胞不顯示細(xì)胞表面抗C35抗體染色。圖4顯示了在用曲妥珠單抗+對(duì)照IgG、曲妥珠單抗+抗C351F2、對(duì)照IgG、抗C35 1F2、或鹽水處理(處理在移植后15天開(kāi)始，當(dāng)平均腫瘤體積為約50mm3時(shí))的BT474-MD移 植小鼠中的平均腫瘤體積。與單獨(dú)的1F2抗C35抗體或單獨(dú)的曲要珠單抗相比較，曲要珠 單抗和抗C35 1F2的組合使腫瘤體積明顯減少。箭頭指示處理時(shí)間點(diǎn)。圖5顯示了與曲妥珠單抗+抗C35 1F2相比較，在用曲妥珠單抗+對(duì)照IgG處理 或無(wú)處理(鹽水)的BT474-MD移植小鼠中的平均腫瘤體積(處理在移植后22天開(kāi)始，當(dāng)平均腫瘤體積為約IOOmm3時(shí))。與單獨(dú)的曲妥珠單抗相比較，曲妥珠單抗和1F2抗C35抗 體的組合使腫瘤體積明顯減少。箭頭指示處理時(shí)間點(diǎn)。發(fā)明詳述概述許多研究已經(jīng)描述了經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的表面膜中的改變。在這些變化中主要 的是磷脂不對(duì)稱性的早期喪失，如由表面膜外頁(yè)上的磷脂酰絲氨酸的暴露反映出來(lái)。已經(jīng) 報(bào)道，表面膜組成中的這種改變有助于通過(guò)巨噬細(xì)胞識(shí)別和去除細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(Fadok， V. Α.，等人，J. Immunol. 148 =2207-2216 (1992)) 0已經(jīng)研發(fā)出一種普通的方法，其通過(guò)使抗 凝血?jiǎng)┠ぢ?lián)蛋白V與暴露的磷脂酰絲氨酸分子結(jié)合來(lái)檢測(cè)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(Koopman， G.，等人，Blood 84 :1415-1420(1994))。已確定存在細(xì)胞內(nèi)腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的亞類，其在化學(xué)療法或放射 性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的條件下變得暴露于腫瘤細(xì)胞膜上，并且可以成為用于使腫瘤內(nèi)抗體綴 合的放射性同位素或毒素濃縮的有效靶。參見(jiàn)2005年7月21日公開(kāi)的美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2005/0158323A1 (通過(guò)引用整體合并入本文)。特別地，通常與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的差異性表達(dá) 的腫瘤特異性C35抗原變得暴露于腫瘤細(xì)胞的表面膜上，所述腫瘤細(xì)胞已通過(guò)放射和/或 化學(xué)療法誘導(dǎo)以經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0158323 Al，圖1_3。使用針對(duì) 這種抗原(例如C35)的抗體的方法是特別有效的，這是因?yàn)樗隹贵w會(huì)增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞凋 亡誘導(dǎo)化學(xué)療法和放射療法在治療癌癥中的治療益處。同樣地，其他細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑例 如針對(duì)表面表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子(例如生長(zhǎng)因子受體例如HER2、EGFR和/或IGFR)的 抗體，可以用于改善針對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體例如針對(duì)C35的抗體的治療益處。在一個(gè)方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)結(jié)合起作用以增 強(qiáng)腫瘤的根除的方法。這基于如下新的觀察結(jié)果腫瘤細(xì)胞內(nèi)差異性表達(dá)的一類細(xì)胞內(nèi)標(biāo) 記物會(huì)變得暴露于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的表面上，在該細(xì)胞的表面上，所述的標(biāo)記物可以被特 異性抗體所靶向。在一個(gè)方面，細(xì)胞凋亡通過(guò)施用針對(duì)細(xì)胞表面受體例如EGFR、HER2或 IGFR的一種或多種抗體來(lái)誘導(dǎo)。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，施用針對(duì)差異性表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)腫 瘤抗原例如C35的一種或多種抗體。這種抗體可以以未與毒性負(fù)載物綴合或者與毒性負(fù) 載物綴合的方式進(jìn)行施用。這種處理方法的益處是數(shù)倍。例如，使用綴合的抗體，該方法 允許將毒性負(fù)載物遞送至腫瘤環(huán)境中，所述毒性負(fù)載物可以破壞在細(xì)胞凋亡靶附近的其他 非細(xì)胞凋亡的腫瘤細(xì)胞。此外，通過(guò)施用2種或更多種抗體的組合，抗體可以協(xié)同作用，實(shí) 現(xiàn)更多的細(xì)胞殺死且允許更低劑量的化學(xué)療法或放射療法或者消除化學(xué)療法或放射療法， 并且從而減少相關(guān)毒性。此外，該方法可以以其他方式防止活細(xì)胞逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡過(guò)程且重 新開(kāi)始生長(zhǎng)，所述活細(xì)胞已經(jīng)通過(guò)(例如)采用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑處理而啟動(dòng)了細(xì)胞凋 亡過(guò)程，如由表面膜組成成分中的改變證實(shí)的(Hammill, A. K.，等人，Exp. Cell Res. 251 16-21(1999))。Evans等人報(bào)道C35在乳腺癌中過(guò)表達(dá)，其中32%的1級(jí)以及66%的2級(jí)和3級(jí) 浸潤(rùn)乳腺導(dǎo)管癌對(duì)于C35表達(dá)測(cè)試陽(yáng)性。Evans等人，Mol. Cancer Ther. 5 =2919-30(2006 年11月)(通過(guò)引用整體合并入本文)。因?yàn)镃35表達(dá)局限于正常人組織，參見(jiàn)Evans等 人，2006，所以它是用于用作特別是乳腺癌中的生物標(biāo)記物以及診斷和治療試劑的極佳候 選物。
盡管正常細(xì)胞通過(guò)生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(RTK)經(jīng)由其分別的配體的高度受 控激活而進(jìn)行增殖，癌細(xì)胞也通過(guò)生長(zhǎng)因子受體的激活而進(jìn)行增殖，但喪失正常增殖的謹(jǐn) 慎控制?？刂频膯适Э梢杂稍S多因素引起，例如生長(zhǎng)因子和/或受體的過(guò)表達(dá)，和由生長(zhǎng)因 子調(diào)節(jié)的生物化學(xué)途徑的自發(fā)激活。涉及腫瘤發(fā)生的RTK的某些例子是關(guān)于表皮生長(zhǎng)因子 (EGFR)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFR)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFR) 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的受體。這些生長(zhǎng)因子與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合誘導(dǎo)受體激 活，這啟動(dòng)且修飾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并且導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體家族的成員是與表皮細(xì)胞的腫瘤發(fā)生相關(guān)的特別重要 的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。發(fā)現(xiàn)的EGF受體家族的第一個(gè)成員是EGFR，其在許多類型的 腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)EGFR涉及腫瘤細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)、修復(fù)和存活、血管發(fā)生、侵 入和腫瘤轉(zhuǎn)移。EGFR是170kD的跨膜糖蛋白，具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)蛋白 質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。特異性配體的結(jié)合導(dǎo)致EGFR自磷酸化、受體的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié) 構(gòu)域的激活、以及調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和存活的多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的啟動(dòng)。EGFR途徑還影響腫瘤 中的多種其他血管發(fā)生因子例如VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的產(chǎn)生。已報(bào)道許多人腫瘤表達(dá)或過(guò)表達(dá)EGFR。EGFR的表達(dá)與預(yù)后不良、存活減少和/或 轉(zhuǎn)移增加相關(guān)。由于在腫瘤發(fā)生中的這種牽涉，EGFR已被特異性靶向用于抗癌療法。這些 療法已主要包括阻斷配體與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體，或直接作用于胞內(nèi)區(qū) 以阻止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的合成酪氨酸激酶抑制劑。抗EGFR抗體還在EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡。胰島素樣生長(zhǎng)因子也稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)和胰島 素樣生長(zhǎng)因子 II(IGF-II) (Klapper，等人，Endocrinol. 112 2215(1983) ；Rinderknecht 等 人，F(xiàn)ebs. Lett. 89 283 (1978))。這些生長(zhǎng)因子通過(guò)與 IGFRl 結(jié)合(Sepp-Lorenzino Breast CancerResearch and Treatment 47 :235 (1998))對(duì)多種細(xì)胞類型包括腫瘤細(xì)胞(Macaulay Br. J. Cancer 65 =311(1992))發(fā)揮促有絲分裂活性。IGF與IGFRl的相互作用通過(guò)觸發(fā)酪 氨酸殘基上的受體的自磷酸化來(lái)激活受體(Butler，等人，Comparative Biochemistry and Physiology 121 :19(1998))。激活后，IGFRl進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)的靶磷酸化，以激活細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)途徑。這種受體激活對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和存活的刺激是關(guān)鍵的。因此，IGFRl活性的抑制代 表治療或預(yù)防人癌癥和其他增殖性疾病生長(zhǎng)的有價(jià)值的潛在方法。幾個(gè)證據(jù)線指出IGF-I、IGF-II及其受體IGFRl是惡性表型的重要介導(dǎo)物。已發(fā)現(xiàn) IGF-I的血漿水平是前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的最強(qiáng)預(yù)測(cè)物(Chan，等人，Science 279 =563(1998)), 并且相似的流行病學(xué)研究將血漿IGF-I水平與乳腺、結(jié)腸和肺癌危險(xiǎn)強(qiáng)烈聯(lián)系。用來(lái)自以化學(xué)方法誘導(dǎo)的大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤的DNA的轉(zhuǎn)染研究的結(jié)果是鑒定了 另一種轉(zhuǎn)化基因。最初稱為neu的這種基因顯示與c-erbB原癌基因相關(guān)，但不同于c_erbB 原癌基因。借助于v-erbB和人EGFR作為探針以篩選人基因組和互補(bǔ)DNA(cDNA)文庫(kù)，2個(gè) 其他團(tuán)體獨(dú)立地分離了人erbB相關(guān)基因，他們分別命名為HER2和c-erbB-2。后續(xù)序列分 析和染色體作圖研究揭示c-erbB-2和HER2是neu的物種變體。HER2也是酪氨酸激酶家族成員；并且與EGFR基因緊密相關(guān)，但不同于EGFR基因， 如由Coussens等人，Science 230 =1132(1985)報(bào)道的。HER2不同于EGFR之處在于它在染色體17的條帶q21上發(fā)現(xiàn)，相比于EGFR基因定位在染色體7的條帶pll-pl3。此外，HER2 基因產(chǎn)生4.8kb的信使RNA (mRNA)，這不同于EGFR基因的5. 8-和10_kb轉(zhuǎn)錄物。最后，由 HER2基因編碼的蛋白質(zhì)是185，000道爾頓，相比于由EGFR基因編碼的170，000道爾頓蛋白 質(zhì)。相反，基于序列數(shù)據(jù)，HER2比酪氨酸激酶家族的其他成員與EGFR基因更緊密相關(guān)。如 同EGFR蛋白質(zhì)，HER2蛋白質(zhì)(pl85)具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、包括2個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)簇 的跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。此外，HER2基因的擴(kuò)增與疾病的負(fù)面預(yù)后和復(fù)發(fā)可能 性顯著相關(guān)?？笻ER2抗體如同抗EGFR抗體在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其他人已觀察到，使用諸如HER2之類的細(xì)胞外表達(dá)抗原，施用針對(duì)蛋白質(zhì)的不 同表位的2種不同抗HER2抗體在體內(nèi)和體外產(chǎn)生抗腫瘤活性。Spiridon等人，Clin. Cancer Res. 8 :1720_30 (2002)(通過(guò)引用整體合并入本文)。事實(shí)上，已證實(shí)了關(guān)于施 用 2 種不同抗 HER2 抗體(Spiridon，2002 ；Friedman 等人 Proc Natl. Acad. Sci USA 102 1915-1920(2005)) ；2 種不同抗 EGFR 抗體(Friedman，2005 ；Perera 等人，Clin. Cancer Res. 11 6390-6399(2005))；以及 1 種抗 HER2 和 1 種抗 EGFR 抗體的組合(Larbouret 等人， Clin. Cancer Res. 13 =3356-3362 (2007))的協(xié)同效應(yīng)。這些協(xié)同效應(yīng)是通過(guò)使針對(duì)相同 分子上的不同表位的高親和力抗體相混合而使細(xì)胞表面分子過(guò)度交聯(lián)的結(jié)果(Spiridon， 2002)。因?yàn)楫惗垠w也在HER2和EGFR的鏈之間形成，所以交聯(lián)用1種抗HER2和1種抗 EGFR抗體也是可能的。超過(guò)一個(gè)表位的同時(shí)銜接引起抗體-受體復(fù)合物的大聚集物形成。 這些大聚集物比更小的抗體復(fù)合物更快速地被胞吞，這導(dǎo)致受體的加速清除(Friedman， 2005)。但是，雖然Spiridon等人觀察到了細(xì)胞外表達(dá)的蛋白質(zhì)HER2，但是如上文所述，C35 為細(xì)胞內(nèi)抗原，其與細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)變得在細(xì)胞表面上表達(dá)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗 HER2和/或抗EGFR抗體誘導(dǎo)C35的細(xì)胞表面表達(dá)的用途，以引起抗C35抗體和抗HER2和 /或抗EGFR抗體的協(xié)同效應(yīng)。C35基因位于染色體17ql2上，并且位于距離ERBB2(Her2/neu)的3'末端505個(gè) 核苷酸。(Evans等人，2006)。在一項(xiàng)研究中，顯示C35和HER2的表達(dá)相關(guān)，而所有HER2 陽(yáng)性乳腺腫瘤也對(duì)于C35測(cè)試陽(yáng)性。(Evans等人，2006)。盡管多達(dá)50 %的C35+乳腺腫 瘤也表達(dá)HER2，并且因此可以用C35和HER2抗體的組合進(jìn)行治療，但許多C35+腫瘤表達(dá) 低HER2或不表達(dá)HER2。如本文在下文實(shí)施例中證實(shí)的，大多數(shù)C35陽(yáng)性腫瘤表達(dá)HER2或 EGFR，其中C35+腫瘤的小亞類表達(dá)HER2和EGFR，并且相似的小亞類既不表達(dá)HER2也不 表達(dá)EGFR。如上文討論的，HER2和EGFR都與腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)，并且當(dāng)通過(guò)抗體靶向時(shí)，各自 被報(bào)道為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如本文在下文證實(shí)的，在30種分析的腫瘤中，7/30腫瘤是C35+/ Her2+/EGFR-, 17/30 是 C35+/Her2_/EGFR+，3/30 是 C35+/Her2+/EGFR+，并且僅 3/30 是 C35+/Her2-/EGFR-。因此，C35和HER2或C35和EGFR抗體的組合可用于治療對(duì)于這些抗 原陽(yáng)性的腫瘤(例如通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以在表面上暴露C35，其中它可以用抗C35抗體靶 向)。與抗C35抗體聯(lián)合使用的HER2和EGFR抗體的協(xié)同作用至少部分是由于其引起C35 的細(xì)胞表面暴露。此外，2種抗體的使用可以增加受體清除活性、細(xì)胞殺死或2種分子的其 他效應(yīng)子功能，與個(gè)別使用任一抗體的治療形成對(duì)比。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于 治療癌癥特別是乳腺癌的方法，其包括施用有效殺死癌細(xì)胞的一定量的抗C35抗體和一定 量的抗HER2抗體和/或一定量的抗EGFR抗體。I.定義
應(yīng)該注意，術(shù)語(yǔ)“一”或“一個(gè)”實(shí)體是指一個(gè)或多個(gè)該實(shí)體；例如“C35抗體”應(yīng)該 理解為代表了一個(gè)或多個(gè)C35抗體。像這樣，術(shù)語(yǔ)“一”(或“一個(gè)”)、“一個(gè)或多個(gè)”和“至 少一個(gè)”在本文中可以交換使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”意指包括了單個(gè)“多肽”以及多個(gè)“多肽”，并指由通過(guò)酰 胺鍵(還稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)或更多 個(gè)氨基酸的任何一條或多條鏈，并且不指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋 白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或者用于指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的任何其他術(shù)語(yǔ)都包 括在“多肽”的定義內(nèi)，并且術(shù)語(yǔ)“多肽”可以代替這些術(shù)語(yǔ)中的任何一個(gè)來(lái)使用，或者可以 與這些術(shù)語(yǔ)中的任何一個(gè)交換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”還意指多肽的表達(dá)后修飾產(chǎn)物，所述修飾 包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白 水解切割、或者使用非天然存在的氨基酸進(jìn)行修飾。多肽可以衍生自天然生物來(lái)源或者通 過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生，但不一定由指定的核酸序列翻譯。多肽可以以任何方式包括通過(guò)化學(xué)合 成而產(chǎn)生。本發(fā)明多肽的大小可以為約3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或 更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、75個(gè)或更多個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)、200個(gè)或更多個(gè)、 500個(gè)或更多個(gè)、1，000個(gè)或更多個(gè)、或2，000個(gè)或更多個(gè)氨基酸。多肽可以具有所定義的 三維結(jié)構(gòu)，但是它們不一定具有這種結(jié)構(gòu)。具有所定義的三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱為折疊的，并 且不具有所定義的三維結(jié)構(gòu)、而是采用大量不同構(gòu)象的多肽被稱為非折疊的。如本文所用， 術(shù)語(yǔ)糖蛋白是指與至少一個(gè)碳水化合物部分偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，所述碳水化合物部分經(jīng)由氨基 酸殘基(例如絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基)的含氧或含氮側(cè)鏈與蛋白質(zhì)附著。“經(jīng)分離的”多肽或其片段、變體或衍生物意指不在其天然環(huán)境的多肽。不需要特 定的純化水平。例如，經(jīng)分離的多肽可以是從其本身的或天然的環(huán)境中取出的。在宿主細(xì) 胞中表達(dá)的、經(jīng)重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的經(jīng)分離的，如同通過(guò) 任何合適的技術(shù)分離、分餾或者部分或基本上純化的天然或重組多肽。作為本發(fā)明的多肽還包括的是上述多肽的片段、衍生物、類似物或變體，及其任何 組合。當(dāng)用于指本發(fā)明的抗體或抗體多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”包 括保留了相應(yīng)天然抗體或多肽的至少一些抗原結(jié)合性質(zhì)的任何多肽。本發(fā)明的多肽的片段 除了包括本文其他地方討論的特定抗體片段以外，還包括蛋白水解片段以及缺失片段。本 發(fā)明的C35和/或HER2抗體和抗體多肽的變體包括如上文所述的片段，還包括具有由于氨 基酸取代、缺失或插入而改變的氨基酸序列的多肽。變體可以是天然的或者是非天然存在 的。非天然存在的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可以包含保守性或 非保守性的氨基酸取代、缺失或插入。抗體的變體包括抗體的人源化形式以及經(jīng)親和力成 熟或優(yōu)化的抗體。親和力優(yōu)化可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法來(lái)實(shí)施。備選地，用于增加 本發(fā)明的抗體的親和力的優(yōu)選方法公開(kāi)于US 2002/0123057 Al中。本發(fā)明的C35抗體和 /或HER2抗體和抗體多肽的衍生物為如下多肽，該多肽經(jīng)過(guò)改變從而表現(xiàn)出在天然多肽中 未發(fā)現(xiàn)的其他特征。實(shí)例包括融合蛋白質(zhì)。如本文所用，C35抗體和/或HER2抗體或抗體 多肽的“衍生物”是指如下對(duì)象多肽，該多肽具有通過(guò)功能性側(cè)基的反應(yīng)以化學(xué)方法衍生出 的一個(gè)或多個(gè)殘基。作為“衍生物”還包括的是這樣的肽，該肽包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一 種或多種天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸
13可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；并且鳥(niǎo)氨酸 可以取代賴氨酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意欲包括單個(gè)核酸以及多個(gè)核酸，并且指經(jīng)分離的核酸分子或構(gòu) 建體，例如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多核苷酸可包含常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī) 鍵(例如酰胺鍵，例如在肽核酸(PNA)中發(fā)現(xiàn)的)。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指在多核苷酸中存在的 任何一個(gè)或多個(gè)核酸節(jié)段，例如DNA或RNA片段?！敖?jīng)分離的”核酸或多核苷酸意指已從其 天然環(huán)境中取出的核酸分子、DNA或RNA。經(jīng)分離的多核苷酸的其他實(shí)例包括保持在異源宿 主細(xì)胞中重組多核苷酸或在溶液中經(jīng)純化(部分或基本上)的多核苷酸。經(jīng)分離的RNA分 子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)或體外的RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多核苷酸或核 酸進(jìn)一步包括合成產(chǎn)生的那些分子。此外，多核苷酸或核酸可以為或者可以包括諸如啟動(dòng) 子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子之類的調(diào)節(jié)元件。如本文所用，“編碼區(qū)域”為由被翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸部分。雖然 “終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)沒(méi)有被翻譯成氨基酸，但是該密碼子可以被認(rèn)為是編碼區(qū) 域的一部分，但是任何側(cè)翼序列，例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等，均 不是編碼區(qū)域的一部分。本發(fā)明的2個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域可以存在于單個(gè)多核苷酸構(gòu)建體中 (例如在單個(gè)載體上)，或者存在于分別的多核苷酸構(gòu)建體中(例如在分別(不同)的載體 上)。此外，任何載體都可以包含單個(gè)編碼區(qū)域，或者可以包含2個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域，例如單 個(gè)載體可以分別編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明的載 體、多核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區(qū)域，該異源編碼區(qū)域融合到或未融合到編碼C35、 HER2或EGFR抗體或其片段、變體或衍生物的核酸中。異源編碼區(qū)域包括，但不限于專用的 元件或基序，例如分泌信號(hào)肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸或核酸為DNA。在DNA的情況下，包含核酸(其 編碼多肽)的多核苷酸通?？梢园c一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域可操作地連接的啟動(dòng)子和/或 其他轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件?？刹僮鞯剡B接是，當(dāng)基因產(chǎn)物(例如多肽)的編碼區(qū)域以某種方 式與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列相連接時(shí)，從而使基因產(chǎn)物的表達(dá)處于調(diào)節(jié)序列的影響或調(diào)控之 下。例如，如果啟動(dòng)子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼所需基因產(chǎn)物的mRNA被轉(zhuǎn)錄，并且如果兩個(gè)DNA 片段之間的連接性質(zhì)不干擾表達(dá)調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力或者干擾待轉(zhuǎn)錄的DNA 模板的能力，則這兩個(gè)DNA片段(例如多肽編碼區(qū)域及與之相連的啟動(dòng)子)是“可操作地連 接的”。因此，如果啟動(dòng)子能夠影響核酸的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子區(qū)域與編碼多肽的核酸可操作地 連接。所述啟動(dòng)子可以為只在預(yù)定細(xì)胞中指導(dǎo)DNA的基本轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。除了 啟動(dòng)子以外，可以使其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(例如增強(qiáng)子、操作子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))與 多核苷酸可操作地連接以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。合適的啟動(dòng)子和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在本文 中公開(kāi)。各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這些區(qū)域包括但不限于，在脊椎 動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，例如但不限于，來(lái)自巨細(xì)胞病毒(即刻早期啟動(dòng)子， 與內(nèi)含子A結(jié)合)、猿猴病毒40(早期啟動(dòng)子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如勞氏肉瘤病毒)的啟 動(dòng)子和增強(qiáng)子節(jié)段。其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域包括由脊椎動(dòng)物基因(例如肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白、 牛生長(zhǎng)激素和兔β球蛋白、以及能夠調(diào)控真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的其他序列)衍生的那 些。其他合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、以及淋巴因子誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如可通過(guò)干擾素或白細(xì)胞介素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)。類似地，各種翻譯調(diào)控元件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這些元件包括但不限于， 核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始密碼子和終止密碼子、以及由小核糖核酸病毒衍生的元件(特 別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或IRES，還稱為CITE序列)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸為RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)域可以與編碼分泌肽或信號(hào)肽的其他編碼區(qū)域 相連，其中所述分泌肽或信號(hào)肽指導(dǎo)了由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號(hào) 假說(shuō)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)鏈穿 過(guò)粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出被啟動(dòng)，所述的信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列便從成熟蛋白質(zhì)中切除。本領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員意識(shí)到由脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的多肽通常具有與多肽N末端融合的信號(hào) 肽，該信號(hào)肽從完整或“全長(zhǎng)”多肽中切除，從而產(chǎn)生被分泌的或“成熟”形式的多肽。在一 些實(shí)施方案中，使用天然的信號(hào)肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽)，或者使用保持指 導(dǎo)與其可操作地連接的多肽分泌的能力的所述序列的功能衍生物。備選地，可以使用異源 哺乳動(dòng)物信號(hào)肽或其功能衍生物。例如，可以使用人組織型纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠 β葡萄糖苷酶的前導(dǎo)序列取代野生型前導(dǎo)序列。本發(fā)明涉及使用某種C35、抗HER2和抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生 物的方法。除非特別指出是全長(zhǎng)抗體(例如天然存在的抗體)，術(shù)語(yǔ)“C35抗體”、“HER2抗 體”或“EGFR抗體”(該術(shù)語(yǔ)在本文中可以分別與術(shù)語(yǔ)“抗C35抗體”、“抗HER2抗體”或“抗 EGFR抗體”交換使用)包括了全長(zhǎng)抗體以及此類抗體的抗原結(jié)合片段、變體、類似物或衍生 物，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或以與抗體分子相同的方式結(jié)合抗原的經(jīng)改造 的抗體分子或片段。同樣地，本發(fā)明涉及使用特定抗IGFRl抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或 衍生物的方法。除非特別指出是全長(zhǎng)抗體(例如天然存在的抗體)，術(shù)語(yǔ)“ IGFR抗體”(IGFR 在本文中可以與術(shù)語(yǔ)IGFRl交換使用，并且IGFR抗體可以與術(shù)語(yǔ)“抗IGFR抗體”交換使用) 包括了全長(zhǎng)抗體以及此類抗體的抗原結(jié)合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然存在的抗 體或免疫球蛋白分子或以與抗體分子相似的方式結(jié)合抗原的經(jīng)改造的抗體分子或片段。術(shù)語(yǔ)“抗體”與“免疫球蛋白”在本文中可以交換使用?？贵w或免疫球蛋白至少包含 重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且通常至少包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中 的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對(duì)公知的。例如參見(jiàn)Harlow等人的Antibodies =A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版 1988)。如本文所用，“本發(fā)明的 抗體”或“本發(fā)明的抗體多肽”包括分別針對(duì)C35、HER2、EGFR和IGFR或C35、HER2、EGFR和 IGFR多肽抗體的抗體。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”包括可以通過(guò)生物化學(xué)方式區(qū)分的種類廣泛的多肽，如將在下 文中進(jìn)行更詳細(xì)的討論。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道重鏈可以分類為gamma、mu、alpha、delta 或印silon，( γ、μ、α、δ、ε )，其中還有一些亞類(例如γ 1_ γ 4)。該鏈的性質(zhì)將抗體 的“類別”分別確定為IgG, IgM, IgA, IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)(例如IgG1, IgG2UgG3UgG4UgA1等)是經(jīng)過(guò)充分表征的，并且已知賦予功能特異性。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容， 這些類別和同種型各自的修飾形式對(duì)于技術(shù)人員是易于辨別的，并且因此它們都在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。所有免疫球蛋白類別清楚地在本發(fā)明的范圍內(nèi)，以下討論總體上針對(duì)免疫球蛋 白分子的IgG類別。關(guān)于IgG，標(biāo)準(zhǔn)的免疫球蛋白分子包含分子量約23，000道爾頓的兩條相同的輕鏈多肽和分子量53，000-70, 000的兩條相同的重鏈多肽。四條鏈通常通過(guò)二硫鍵 以“Y”構(gòu)型連接，其中輕鏈在“Y”的開(kāi)口處開(kāi)始括住重鏈并延續(xù)通過(guò)可變區(qū)。輕鏈可以分類為kappa或lambda ( κ，λ )。每個(gè)重鏈類別都可以與κ或λ輕鏈 結(jié)合?？傮w而言，當(dāng)免疫球蛋白是由雜交瘤細(xì)胞、B細(xì)胞或遺傳改造的宿主細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，輕 鏈和重鏈彼此共價(jià)鍵合，并且兩條重鏈的“尾”部通過(guò)共價(jià)二硫鍵連接或非共價(jià)連接彼此鍵 合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型的叉狀末端處的N末端到各條鏈底端處的C末端。輕鏈和重鏈均被分成結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“恒定的”和“可變的”是就 功能而言來(lái)使用的。在這一點(diǎn)上，應(yīng)該理解輕鏈和重鏈(Vh)部分的可變結(jié)構(gòu)域決定了 抗原識(shí)別和特異性。相反，輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(Q)和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域((^、(^或^^)賦 予了重要生物性質(zhì)，例如分泌、經(jīng)胎盤(pán)移動(dòng)、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合。根據(jù)慣例，隨著恒定區(qū) 結(jié)構(gòu)域與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基末端的距離越遠(yuǎn)，該結(jié)構(gòu)域的數(shù)量增加。N末端部分為 可變區(qū)，并且在C末端部分處為恒定區(qū)；Ch3和Q結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基 末端。如上文所述，可變區(qū)允許抗體選擇性地識(shí)別并特異性地結(jié)合抗原上的表位。換言 之，抗體的\結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域、或者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的亞類相結(jié)合，從而形成定義了 三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)。這種四級(jí)抗體結(jié)構(gòu)形成在Y構(gòu)型的各個(gè)臂的末端處存在的抗 原結(jié)合位點(diǎn)。更具體而言，抗原結(jié)合位點(diǎn)由每個(gè)V1^nt鏈的三個(gè)CDR來(lái)定義。在一些情 況下，例如衍生自駱駝科物種(camelid species)或者基于駱駝科動(dòng)物免疫球蛋白改造的 某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以僅由重鏈組成而不具有輕鏈。例如參見(jiàn) Hamers-Casterman 等人，Nature 363 446-448 (1993)。在天然存在的抗體中，存在于各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的6個(gè)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR” 是短的、非鄰接的氨基酸序列，當(dāng)所述抗體在水環(huán)境中采取其三維構(gòu)型時(shí)，所述氨基酸序列 特異性地定位，從而形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域中的其余氨基酸(稱為“框架” 區(qū)域)顯示較低的分子內(nèi)可變性?？蚣軈^(qū)主要采用β片構(gòu)象，并且CDR形成與β片結(jié)構(gòu)相 連的環(huán)，并且在某些情況下形成β片結(jié)構(gòu)的一部分。因此，框架區(qū)起到了形成支架的作用， 所述支架通過(guò)鏈內(nèi)非共價(jià)作用提供以正確的方向定位的CDR。由定位的CDR形成的抗原結(jié) 合位點(diǎn)定義了與位于免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。這種互補(bǔ)的表面促進(jìn)了抗體與 其同源表位的非共價(jià)結(jié)合。對(duì)于任何給定的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，本領(lǐng)域的任何普通 技術(shù)人員都可以容易地分別鑒定含CDR和框架區(qū)的氨基酸，因?yàn)檫@些氨基酸已經(jīng)被精確地 定義(參見(jiàn)"Sequences of Proteins of Immunological Interest, " Kabat,E·,等人， U. S. Department of Health and Human Services, (1983)；以及 Chothia 禾口 Lesk, J. Mol. Biol.，196 :901-917(1987)，其通過(guò)引用整體合并入本文)。在本發(fā)明的方法中使用的抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物包括但不限于， 多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化、靈長(zhǎng)類源化或嵌合抗體；單鏈抗體；表位結(jié)合片段， 例如 Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fd、Fvs、單鏈 Fvs (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的 Fvs (sdFv)、 包含\或Vh結(jié)構(gòu)域的片段、由Fab表達(dá)庫(kù)產(chǎn)生的片段；以及抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(例如 包括針對(duì)本文公開(kāi)的C35抗體的抗Id抗體；還參見(jiàn)例如Hudson，PJ.和Couriau，C，Nature Med. 9 129-134 (2003)；美國(guó)專利公開(kāi)號(hào) 20030148409 ；美國(guó)專利號(hào) 5，837，242)。例如，scFv 分子是本領(lǐng)域已知的并且在例如美國(guó)專利5，892，019中描述。本發(fā)明的免疫球蛋白或抗體分子可以為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。包括單鏈抗體的抗體片段可以包含單獨(dú)的可變區(qū)或者與以下的全部或部分組合 的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括的是抗原結(jié)合片段， 該片段還包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、ChI結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。用于本文 所公開(kāi)的診斷和治療方法中的抗體或其免疫特異性片段可以來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源包括鳥(niǎo)和 哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，所述抗體為人、鼠類、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、美洲駝羊、馬或雞抗體。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可變區(qū)在來(lái)源中可以是condricthoid (例如得自鯊魚(yú))。如本文所 用，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并且包括由人免疫球蛋白庫(kù)中 或由動(dòng)物中分離得到的抗體，所述動(dòng)物對(duì)于一種或多種人免疫球蛋白是轉(zhuǎn)基因的，并且不 表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白，如下文和例如Kucherlapati等人的美國(guó)專利號(hào)5，939，598中所述。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重鏈部分”包括衍生自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重 鏈部分的多肽包含以下中的至少一種CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(例如上游鉸鏈區(qū)、中游鉸鏈區(qū)和/ 或下游鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、或其變體或片段。例如，用于本發(fā)明的結(jié)合 多肽可以包括包含ChI結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ChI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分和Ch2 結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ChI結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ChI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至 少一部分和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；或者包含ChI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分、CH2結(jié)構(gòu) 域和Ch3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包括包含Ch3結(jié)構(gòu)域的多肽 鏈。此外，用于本發(fā)明的結(jié)合多肽可以缺乏CH2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(例如CH2結(jié)構(gòu)域的全 部或部分)。如上文所述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都應(yīng)該理解這些結(jié)構(gòu)域(例如重鏈部分) 可以被這樣修飾，使得它們?cè)诎被嵝蛄兄胁煌谔烊淮嬖诘拿庖咔虻鞍追肿?。在本文中公開(kāi)的某些C35、HER2和/或EGFR或IGFR抗體或其抗原結(jié)合片段、變體 或衍生物中，多聚體的一條多肽鏈的重鏈部分與該多聚體的第二條多肽鏈上的重鏈部分相 同。備選地，本發(fā)明的包含重鏈部分的單體是不同的。例如，各個(gè)單體可以包含不同的靶結(jié) 合位點(diǎn)，形成例如雙特異性抗體。用于在本文所公開(kāi)的診斷和治療方法中的結(jié)合多肽的重鏈部分可以衍生自不同 的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可以包含衍生自IgGl分子的ChI結(jié)構(gòu)域、以及 衍生自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)例中，重鏈部分可以包含部分衍生自IgGl分子和部 分衍生自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)例中，重鏈部分可以包含部分衍生自IgGl分子和 部分衍生自IgG4分子的嵌合鉸鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“輕鏈部分”包含衍生自免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。優(yōu)選地， 所述輕鏈部分包含至少一個(gè)\或Q結(jié)構(gòu)域?？梢愿鶕?jù)其識(shí)別或特異性結(jié)合的抗原的表位或部分來(lái)描述或詳細(xì)說(shuō)明本文所公 開(kāi)的C35、抗HER2、抗EGFR或抗IGFR抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。與抗體的抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性相互作用的靶多肽部分視“表位”或“抗原決定簇”。靶多肽可以包含 單一表位，但是通常包含至少兩個(gè)表位，并且可以包含任何數(shù)目的表位，這取決于抗原的大 小、構(gòu)象和類型。此外，應(yīng)該注意靶多肽上的“表位”可以為或者可以包含非多肽元件，例如 表位可以包含碳水化合物側(cè)鏈。認(rèn)為關(guān)于抗體的肽或多肽表位的最低限度大小為約4至5個(gè)氨基酸。肽或多肽表位優(yōu)選包含至少7個(gè)、更優(yōu)選至少9個(gè)、最優(yōu)選至少約15個(gè)至約30個(gè)氨基酸。由于⑶R可 以以三級(jí)形式識(shí)別抗原性肽或多肽，所以包括表位的氨基酸無(wú)需是鄰接的，并且在某些情 況下，這些氨基酸甚至可以不在相同的肽鏈上。在本發(fā)明中，被本發(fā)明的抗體識(shí)別的肽或多 肽表位包含C35、HER2、EGFR或IGFR的至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、更優(yōu)選地 至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、或約15個(gè)至約30個(gè)鄰 接或不鄰接的氨基酸?！疤禺愋越Y(jié)合”通常是指抗體經(jīng)由其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與表位結(jié)合，并且這種結(jié)合需 要抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與表位之間一定的互補(bǔ)性。根據(jù)這個(gè)定義，當(dāng)抗體經(jīng)由其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域比該抗體與隨意的、無(wú)關(guān)的表位結(jié)合得更容易與該表位結(jié)合時(shí)，抗體被說(shuō)成與表位“特異 性結(jié)合”。術(shù)語(yǔ)“特異性”在本文中用于定性某種抗體通過(guò)其與某種表位結(jié)合的相對(duì)親和力。 例如，對(duì)于給定的表位，可以認(rèn)為抗體“A”比抗體“B”具有更高的特異性，或抗體“A”可以 被說(shuō)成以比它對(duì)于相關(guān)表位“D”具有的更高特異性與表位“C”結(jié)合?！皟?yōu)先結(jié)合”是指與抗體和相關(guān)的、相似的、同源的或類似的表位結(jié)合相比較，抗體 更容易與表位特異性結(jié)合。因此，與相關(guān)表位相比較，與給定表位“優(yōu)先結(jié)合”的抗體更可 能與所述給定表位結(jié)合，盡管這種抗體可以與所述相關(guān)表位交叉反應(yīng)。通過(guò)非限定性實(shí)例，如果抗體以一定的解離常數(shù)(Kd)與第一表位結(jié)合，該解離常 數(shù)小于該抗體對(duì)于第二表位的KD，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一表位結(jié)合。在另一非限定性 實(shí)例中，如果抗體以一定的親和力與第一表位結(jié)合，該親和力比該抗體對(duì)于第二表位的Kd 小至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一抗原結(jié)合。在另一非限定性實(shí)例中，如果抗 體以一定的親和力與第一表位結(jié)合，該親和力比該抗體對(duì)于第二表位的Kd小至少兩個(gè)數(shù)量 級(jí)，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一表位結(jié)合。在另一非限定性實(shí)例中，如果抗體以一定的離開(kāi)速率(off rate) (k(off))與第一 表位結(jié)合，該離開(kāi)速率小于該抗體對(duì)于第二表位的k(ofT)，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一表 位結(jié)合。在另一非限定性實(shí)例中，如果抗體以一定的親和力與第一表位結(jié)合，該親和力比該 抗體對(duì)于第二表位的k(off)小至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一表位結(jié)合。在 另一非限定性實(shí)例中，如果抗體以一定的親和力與第一表位結(jié)合，該親和力比該抗體對(duì)于 第二表位的k(ofT)小至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)，則可認(rèn)為該抗體優(yōu)先與第一表位結(jié)合。本文所公開(kāi)的抗體或者抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以被說(shuō)成以一定的離開(kāi) 速率(k(ofT))結(jié)合本文所公開(kāi)的靶多肽、或其片段或變體，所述離開(kāi)速率小于或等于 SXlO-2Sec-1UO-2Sec-1 AXlO-3Sec-1或lO^sec"1.更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以被說(shuō)成以一 定的離開(kāi)速率(k(ofT))結(jié)合本文所公開(kāi)的靶多肽、或其片段或變體，所述離開(kāi)速率小于 或等于 SXli^secT1、KT4SecT1 JXKr5SecT1 UCr5SecT1 SXKr6SecT1、KT6SecT1 jXlCTsecT1 或 10 7sec 1O本文所公開(kāi)的抗體或者抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以被說(shuō)成以一定的結(jié) 合速率(k(on))結(jié)合本文所公開(kāi)的靶多肽、或其片段或變體，所述結(jié)合速率大于或等于 IO3IT1 sec secsec 或 5X104IT1 sec—1O更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以被說(shuō)成 以一定的結(jié)合速率(k(on))結(jié)合本文所公幵的靶多肽、或其片段或變體，所述結(jié)合速率大 于或等于 IO5M 1 sec \5X105M 1Sec \IO6M 1Sec
人 5X106IT1
sec 或 IO7IT1 sec ο如果本發(fā)明的抗體與給定表位優(yōu)先結(jié)合，其程度使得該抗體在一定程度上阻斷了爭(zhēng)性抑制參照抗體與給定表位的結(jié)合?？梢?通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法(例如競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定法)來(lái)確定競(jìng)爭(zhēng)性抑制?？贵w可 以被說(shuō)成使參照抗體與給定表位的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制至少90 %、至少80 %、至少70 %、至少 60%或至少50%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和力”是指?jìng)€(gè)別表位與免疫球蛋白分子的CDR的結(jié)合強(qiáng)度 的量度° 例如參見(jiàn) Harlow 等人，Antibodies :ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)，第27_28頁(yè)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親合力”是指免疫球蛋 白與抗原群體之間的復(fù)合物的總體穩(wěn)定性，即，免疫球蛋白混合物與抗原的功能性組合強(qiáng) 度。例如參見(jiàn)Harlow，第29-34頁(yè)。親合力與所述群體中的個(gè)別免疫球蛋白分子與特定表 位的親和力有關(guān)，還與免疫球蛋白和抗原的效價(jià)有關(guān)。例如，二價(jià)單克隆抗體與具有高度重 復(fù)表位結(jié)構(gòu)(例如聚合物)的抗原之間的相互作用是高親合力中的一種。用于在本發(fā)明中使用的抗體可以是“多特異性的”，例如雙特異性的、三特異性的、 或者更多的多特異性，這是指其同時(shí)識(shí)別并結(jié)合存在于一種或多種不同的抗原(例如蛋白 質(zhì))上的兩個(gè)或更多個(gè)不同的表位。因此，不論抗體是“單特異性的”或“多特異性的”(例 如雙特異性的)，均是指結(jié)合多肽與之反應(yīng)的不同表位的數(shù)目。多特異性抗體可以對(duì)本文所 述的靶多肽的不同表位特異，或者可以對(duì)靶多肽以及異源表位(例如異源多肽或固體支持 材料)特異。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“效價(jià)”是指存在于本發(fā)明的抗體、結(jié)合多肽或抗體中的潛在結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的數(shù)目。每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域都特異性結(jié)合一個(gè)表位。當(dāng)結(jié) 合多肽或抗體包含超過(guò)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以特異性結(jié)合相同的表位， 對(duì)于具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，被稱為“二價(jià)單特異性”；或者每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以特異 性結(jié)合不同的表位，對(duì)于具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，被稱為“二價(jià)雙特異性”?？贵w還可以 是雙特異性且就每種特異性而言是二價(jià)的(被稱為“雙特異性四價(jià)抗體”)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，可以制備四價(jià)微型抗體或結(jié)構(gòu)域缺失抗體。雙特異性二價(jià)抗體及其制備方法在例如美國(guó)專利號(hào)5，731，168 ；5，807，706 ； 5，821，333 ；以及美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/020734和2002/0155537中描述，所有這些專利的公 開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體合并入本文。雙特異性四價(jià)抗體及其制備方法在例如WO 02/096948 和TO00/44788中描述，這兩份專利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文。通常參見(jiàn)PCT公 開(kāi) WO 93/17715 ；WO 92/08802 ；WO 91/00360 ；W092/05793 ；Tutt 等人，J.Immunol. 147 60-69 (1991)；美國(guó)專利號(hào) 4，474，893 ；4，714，681 ；4，925，648 ；5，573，920 ；5，601，819 ； Kostelny 等人，J. Immunol. 148 1547-1553 (1992)。如先前所述，各種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“VH結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，并且術(shù)語(yǔ)“CH1 結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(大部分的氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。ChI結(jié)構(gòu)域與Vh 結(jié)構(gòu)域相鄰，并且在免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“CH2結(jié)構(gòu)域”包括例如采用常規(guī)的編號(hào)方案由抗體的約第244個(gè) 殘基延伸至第360個(gè)殘基(第244個(gè)殘基至第360個(gè)殘基，Kabat編號(hào)系統(tǒng)；以及第231-340 個(gè)殘基，EU編號(hào)系統(tǒng)；參見(jiàn)Kabat EA等人在引文中列舉)的重鏈分子部分。CH2結(jié)構(gòu)域是 獨(dú)特的，因?yàn)樗鼪](méi)有與另一結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。相反，兩條N聯(lián)分支糖鏈插入完整的天然IgG分子的兩個(gè)Ch2結(jié)構(gòu)域之間。此外，已經(jīng)清楚證明了 Ch3結(jié)構(gòu)域由IgG分子的Ch2結(jié)構(gòu)域延 伸至C末端，并且包含大約108個(gè)殘基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包括HChI結(jié)構(gòu)域與CH2結(jié)構(gòu)域連接的重鏈分子部分。 該鉸鏈區(qū)包含大約25個(gè)殘基，并且是彈性的，由此允許兩個(gè)N末端抗原結(jié)合區(qū)域獨(dú)立地移 動(dòng)。鉸鏈區(qū)可以被再分為三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域上游、中部和下游鉸鏈結(jié)構(gòu)域(Roux等人， J. Immunol. 161 :4083 (1998))。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“二硫鍵”包括在兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨 酸包括可以與第二個(gè)巰基形成二硫鍵或橋的巰基。在大部分天然存在的IgG分子中，CH1和 Cl區(qū)域通過(guò)二硫鍵連接，并且兩條重鏈在相應(yīng)于采用Kabat編號(hào)系統(tǒng)的239和242的位置 (EU編號(hào)系統(tǒng)的位置226或229)處通過(guò)二硫鍵連接。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”被用于指其中免疫反應(yīng)性區(qū)域或位點(diǎn)得自或衍生自 第一個(gè)物種，并且恒定區(qū)(其可以是完整的、部分的或是根據(jù)本發(fā)明修飾的)得自第二個(gè)物 種的任何抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)域或位點(diǎn)來(lái)自非人來(lái)源(例如小鼠或靈長(zhǎng) 類動(dòng)物)，并且恒定區(qū)是人的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“改造抗體”是指其中重鏈和輕鏈或兩者中的可變結(jié)構(gòu)域通過(guò)以 下方式被改變的抗體通過(guò)來(lái)自特異性已知的抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的至少部分替代，以 及需要時(shí)，通過(guò)部分框架區(qū)替代和序列變化。雖然CDR可以衍生自與框架區(qū)由其衍生的抗 體相同類別或甚至亞類的抗體，但是應(yīng)該想到CDR衍生自不同類別的抗體，并且優(yōu)選地衍 生自來(lái)自不同物種的抗體。其中來(lái)自特異性已知的非人抗體的一個(gè)或多個(gè)“供體”CDR被移 植到人重鏈或輕鏈框架區(qū)內(nèi)的改造抗體在本文中被稱為“人源化抗體”。不一定使用來(lái)自供 體可變區(qū)的完整CDR來(lái)替代所有的CDR，以將一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移給另一 個(gè)。相反，可能僅需要轉(zhuǎn)移維持靶結(jié)合位點(diǎn)的活性所必需的那些殘基?？紤]到在例如美國(guó)專 利號(hào)5，585，089,5, 693，761,5, 693，762和6，180，370中提出的解釋，通過(guò)進(jìn)行常規(guī)的實(shí)驗(yàn) 或者通過(guò)試誤測(cè)試以獲得功能性改造或人源化抗體完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)折疊的多肽”包括如下多肽(例如C35抗體)，其中包含所 述多肽的所有功能性結(jié)構(gòu)域都具有明確的活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非適當(dāng)折疊的多肽”包 括如下多肽，其中所述多肽的至少一個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域不具有活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，適當(dāng) 折疊的多肽包括通過(guò)至少一個(gè)二硫鍵連接的多肽鏈，并且相反地，非適當(dāng)折疊的多肽包括 沒(méi)有通過(guò)至少一個(gè)二硫鍵連接的多肽鏈。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)改造的”包括通過(guò)合成方法(例如通過(guò)重組技術(shù)、體外肽合 成、通過(guò)肽的酶促或化學(xué)偶聯(lián)或者這些技術(shù)的某些組合)對(duì)核酸或多肽分子的操作。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“連接的”、“融合的”或“融合”可交換使用。這些術(shù)語(yǔ)是指通過(guò) 包括化學(xué)綴合或重組方法在內(nèi)的任何方法使兩個(gè)或更多個(gè)元件或組分連接在一起?！翱騼?nèi) 融合(in-frame fusion) ”是指以維持原始ORF的正確翻譯閱讀框的方式，使兩個(gè)或更多個(gè) 多核苷酸開(kāi)放閱讀框(ORF)連接，以形成鄰接的更長(zhǎng)的0RF。因此，重組融合蛋白質(zhì)是單一 蛋白質(zhì)，其包含與由原始ORF所編碼的多肽相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)或更多個(gè)節(jié)段(所述節(jié)段在自然 界中通常不會(huì)如此連接)。雖然由此制備的閱讀框在融合節(jié)段自始至終是連續(xù)的，但是所 述節(jié)段可以通過(guò)例如框內(nèi)連接體序列在物理上或空間上分離。例如，可以使編碼免疫球蛋 白可變區(qū)的⑶R的多核苷酸框內(nèi)融合，但是通過(guò)編碼至少一個(gè)免疫球蛋白框架區(qū)或其他的CDR區(qū)域的多核苷酸分離，只要“融合的” CDR作為連續(xù)多肽的一部分進(jìn)行共翻譯。在多肽的背景中，“線性序列”或“序列”是多肽中以氨基末端至羧基末端方向的氨 基酸的次序，其中在所述序列中彼此相鄰的殘基在所述多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中是鄰接的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因通過(guò)其產(chǎn)生生物化學(xué)物質(zhì)例如多肽的過(guò)程。所 述過(guò)程包括基因在細(xì)胞內(nèi)的功能存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于，基因敲減以及瞬時(shí)表達(dá) 和穩(wěn)定表達(dá)。表達(dá)包括但不限于將基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA (mRNA)，以及將該mRNA翻譯成一種 或多種多肽。如果最終需要的產(chǎn)物為生物化學(xué)物質(zhì)，則表達(dá)包括該生物化學(xué)物質(zhì)和任何前 體的產(chǎn)生?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)生了“基因產(chǎn)物”。如本文所用，基因產(chǎn)物可以為核酸(例如通過(guò) 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA)或多肽(其由轉(zhuǎn)錄物翻譯)。本文所述的基因產(chǎn)物進(jìn)一步包括具 有轉(zhuǎn)錄后修飾(例如多聚腺苷酸化)的核酸或者具有翻譯后修飾(例如甲基化、糖基化、加 入脂質(zhì)、與其他蛋白質(zhì)亞單位結(jié)合、蛋白水解切割等)的多肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”或“處理”是指治療性處理、和預(yù)防性或防護(hù)性措施，其中 目標(biāo)是待預(yù)防或減慢(減輕)不希望有的生理學(xué)變化或病癥，例如多發(fā)性硬化的進(jìn)展。有 益的或所需要的臨床結(jié)果包括但不限于，緩解癥狀、減輕疾病的程度、穩(wěn)定(即，不惡化)疾 病的狀態(tài)、延遲或減慢疾病的進(jìn)程、改善或減輕疾病狀態(tài)、以及緩解(部分或全部)，無(wú)論這 些是可檢測(cè)的還是不可檢測(cè)的。與未接受治療時(shí)所期望的存活相比較，“治療”還可以指延 長(zhǎng)的存活。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)具有病狀或病癥的那些、以及傾向于患有病狀或病癥 的那些或者其中病狀或病癥有待預(yù)防的那些?！笆茉囌摺被颉皞€(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”是指對(duì)于其需要診斷、預(yù)測(cè) 或治療的任何受試者，特別是哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人，家畜，農(nóng)業(yè)動(dòng)物，以 及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)競(jìng)技或?qū)櫸飫?dòng)物，例如犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。如本文所用，短語(yǔ)例如“受益于施用C35、HER2和/或EGFR抗體的受試者”和“需 要治療的動(dòng)物”包括如下受試者，例如哺乳動(dòng)物受試者，該受試者受益于C35、HER2和/或 EGFR抗體的施用。如本文更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的抗體可以以非綴合形式使用或者可以 與例如藥品、藥物前體或同位素綴合。II. C35、HER2、EGFR 和 IGFR 靶多肽C35是在乳腺癌和某些其他腫瘤類型(包括黑素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、膀 胱和胰腺癌)中差異表達(dá)的抗原。已經(jīng)顯示，C35蛋白質(zhì)是異戊二烯化的，并且與細(xì)胞內(nèi)膜 結(jié)合，但是在活腫瘤細(xì)胞的表面膜上不能檢測(cè)出。存在免疫特異性識(shí)別C35表位的許多抗 體，包括小鼠單克隆抗體、人源化抗體和人抗體。參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0158323和美 國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/812，996 (通過(guò)引用合并入本文)。本發(fā)明人還證明，通過(guò)使用化療劑或輻 射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致C35的表面膜暴露，這允許通過(guò)C35特異性抗體識(shí)別完 整的腫瘤細(xì)胞。C35多核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs :1和2)gccgcg atg age ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct cccMet Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro1510gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc ate gtg gtg gag tac tgtGlu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg lie Val Val Glu Tyr Cys0118]152025300119]gaaCCCtgcggcttcgaggcgacctacCtggagCtggccagtgetgtg0120]GluProCysGlyPheGluAlaThrTyrLeuGluLeuAlaSerAlaVal0121]3540450122]aaggagcagtatCCgggcategagategagtcgCgCctcgggggcaca0123]LysGluGlnTyrProGlylieGlulieGluSerArgLeuGlyGlyThr0124]5055600125]ggtgcctttgagatagagataaatggacagCtggtgttctccaagCtg0126]GlyAlaPheGlulieGlulieAsnGlyGlnLeuValPheSerLysLeu0127]6570750128]gagaatgggggctttCCCtatgaggatctcattgaggccatecga0129]GluAsnGlyGlyPheProTyrGluLysAspLeulieGluAlalieArg0130]8085900131]agagccagtaatggagaaaccctagaaaagateaccaacageCgtcct0132]ArgAlaSerAsnGlyGluThrLeuGluLyslieThrAsnSerArgPro0133]951001051100134]CCCtgcgtcateCtgtga0135]ProCysVallieLeu0136]1150137]近期癌癥研究已集中于重組人源化單克隆抗體用于治療癌癥的用途，所述
細(xì)胞過(guò)表達(dá)HER2或EGFR。HER2的序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于，Genbank登記號(hào) ΝΡ_001005862、NP004439、AAA75493或AAA35978。關(guān)于EGFR的序列也是本領(lǐng)域已知的，并且 包括但不限于，Genbank 登記號(hào) AAB19486、AAH94761、AAI28420 和 AAI18666。最后，一般的 人IGFR前體的核苷酸和氨基酸序列包括但不限于，Genbank登記號(hào)X04434或NM_000875， 以及美國(guó)專利號(hào)7，217，796中列出的那些。前體的切割(例如在氨基酸710和711之間) 產(chǎn)生α-亞單位和β-亞單位，其結(jié)合以形成成熟IGFR。HER2基因與編碼EGFR的基因緊密相關(guān)，但不同于編碼EGFR的基因。HER2基因的 擴(kuò)增已與人乳腺癌細(xì)胞中的致瘤性轉(zhuǎn)化相聯(lián)系。HER2的過(guò)表達(dá)已在20-30%的乳腺癌患者 中得到鑒定，其中它與地方性重病、腫瘤復(fù)發(fā)可能性增加和患者存活減少相關(guān)?；加形赴?子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌或結(jié)腸直腸癌的 多達(dá)30-40%的患者也可以顯示出這種蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)。少量HER2蛋白質(zhì)以組織特異性 方式在正常細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)。這種蛋白質(zhì)作為與其他ERBB受體的異二聚體受體復(fù)合物 的一部分存在，所述其他ERBB受體結(jié)合生長(zhǎng)因子配體。這種配體的結(jié)合激活HER2受體，導(dǎo) 致生長(zhǎng)信號(hào)從細(xì)胞外部傳遞給核。這些生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂方面。HER2基 因在正常細(xì)胞中的改變導(dǎo)致HER2蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致增加的細(xì)胞分裂、增加的細(xì)胞生長(zhǎng) 率，并且可能與至癌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化相關(guān)。當(dāng)HER2基因中的此類改變?cè)谀[瘤細(xì)胞中發(fā)生 時(shí)，HER2蛋白質(zhì)直接過(guò)表達(dá)，或基因擴(kuò)增導(dǎo)致該基因的多個(gè)拷貝和HER2蛋白質(zhì)的后續(xù)過(guò)表 達(dá)。觸發(fā)這些改變的一種或多種因素目前是未知的。已經(jīng)證實(shí)EGFR的過(guò)表達(dá)也與結(jié)腸癌(Resnick，Μ. B.，等人，ClinCancer Res. 10 3069-3075(2004))、直腸癌(Kopp, R.，等人，DisColon Rectum 46:1391-1399(2003))、 非小細(xì)胞肺癌(Selvaggi，G.，等人，Ann Oncol. 15 =28-32(2004))和乳腺癌(ffitton, C. J.,等人，J Pathol. 200 :290-297 (2003) ；Tsutsui, S.等人，Clin Cancer Res. 8 3454-3460(2002))中的弱存活和復(fù)發(fā)相關(guān)。還已提出EGFR表達(dá)狀態(tài)可以鑒定在晚期 鼻咽癌內(nèi)的患者亞組，其在誘導(dǎo)化療和放射療法后將具有弱結(jié)果(Chua，D.T.等人，Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 11-20 (2004))。存在EGFR的表達(dá)與前列腺癌中的疾病 復(fù)發(fā)和進(jìn)展至雄激素不依賴性相關(guān)的證據(jù)(Di Lorenzo, G.等人，Clin Cancer Res. 8 3438-3444(2002))。因此，在臨床實(shí)踐中EGFR的檢測(cè)可以影響患者管理，包括EGFR靶向藥 物使用的相關(guān)問(wèn)題。IGFR的過(guò)表達(dá)也已在幾種癌細(xì)胞系和腫瘤組織中得到證實(shí)。IGFR在所有乳腺癌 細(xì)胞系中的40% (Pandini，等人，Cancer Res. 5 1935 (1999))和15%的肺癌細(xì)胞系中過(guò) 表達(dá)。在乳腺癌腫瘤組織中，IGFR過(guò)表達(dá)6-14倍，并且與正常組織相比較，IGFR顯示出 2-4 倍高的激酶活性(Webster，等人，Cancer Res. 56 2781(1996) ；Pekonen，等人，Cancer Res. 48 1343 (1998))。90 %的結(jié)腸直腸癌組織活組織檢查顯示出升高的IGFR水平，其 中IGFR表達(dá)的程度與疾病的嚴(yán)重度相關(guān)。與正常外宮頸細(xì)胞相比較，原發(fā)性宮頸癌細(xì)胞 培養(yǎng)物和宮頸癌細(xì)胞系的分析揭示IGFR分別3和5倍的過(guò)表達(dá)(Steller，等人，Cancer Res. 56 1762 (1996))。在滑膜肉瘤細(xì)胞中IGFR的表達(dá)也與侵略性表型相關(guān)(即轉(zhuǎn)移和高 增殖率；Xie,等人，Cancer Res. 59 3588 (1999))。HER2、EGFR或IGFR受體蛋白質(zhì)的“過(guò)表達(dá)”意指相對(duì)于來(lái)自組織或器官的正常細(xì) 胞中的表達(dá)水平，在患者的特定組織或器官內(nèi)在來(lái)自腫瘤的細(xì)胞中HER2、EGFR或IGFR蛋白 質(zhì)分別地異常表達(dá)水平?；加刑卣髟谟贖ER2、EGFR或IGFR受體過(guò)表達(dá)的癌癥的患者可以 通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法進(jìn)行確定。過(guò)表達(dá)可以使用免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)在冷凍 的固定細(xì)胞或石蠟包埋的組織切片中進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)與組織學(xué)染色偶聯(lián)時(shí)，可以確定被靶向 蛋白質(zhì)的定位，并且可以定性和半定量檢測(cè)它在腫瘤內(nèi)的表達(dá)程度。此類IHC檢測(cè)測(cè)定法 是本領(lǐng)域已知的，并且包括常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定法(CTA)、商購(gòu)可得的LabCorp 4D5測(cè)試、和商購(gòu) 可得的 DAKO HercepTest (DAK0, Carpinteria, Calif.)。后面一種測(cè)定法使用 0 至 3+細(xì)胞 染色的特定范圍(0是正常表達(dá)，3+指示最強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá))，以鑒定具有HER2蛋白質(zhì)的過(guò)表 達(dá)的癌癥(參見(jiàn)；曲妥珠單抗完全處方信息；1998年9月；Genentech，Inc.，SanFrancisco， Calif.)。因此，患有特征在于HER2蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)的癌癥的患者將受益于本發(fā)明的治療 方法，所述HER2蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)或熒光原位雜交(FISH)在1+、2+ 或3+(特別是2+或3+，更特別是3+)范圍內(nèi)。使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)測(cè)定法，幾個(gè)類型的癌癥已表征為具有過(guò)表達(dá)HER2、EGFR或IGFR受 體的細(xì)胞。此類癌癥包括但不限于乳腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、鼻咽癌、非小細(xì)胞 肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。本發(fā) 明的方法在任何此類癌癥的治療/管理中有用，所述癌癥的細(xì)胞過(guò)表達(dá)C35和HER2、EGFR 或IGFR蛋白質(zhì)。特別有利的是乳腺癌。III · C35、HER2 和 EGFR 抗體本發(fā)明涉及針對(duì)C35、HER2和EGFR的抗體(在本文中稱為抗C35、抗HER2或抗 EGFR抗體；或C35、HER2和EGFR抗體)以及使用C35和HER2或C35和EGFR抗體的組合治療癌癥的方法。關(guān)于抗體的上文描述還應(yīng)用于本文描述的C35、HER2和EGFR抗體。本發(fā)明包括與C35、HER2或EGFR多肽或其片段、變體或融合蛋白質(zhì)免疫特異性 結(jié)合的抗體(包括包含抗體片段或其變體的分子，或備選地由抗體片段或其變體組成的分 子)。C35多肽包括但不限于，SEQID NO 2的C35多肽。HER2多肽包括但不限于，Genbank 登記號(hào)AAA75493或AAA35978的HER2多肽。EGFR多肽包括但不限于，Genbank登記號(hào) AAB19486, AAH94761、AAI28420 和 AAI18666 的 EGFR 多肽。C35、HER2 或 EGFR 多肽可以 通過(guò)核酸的重組表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。(關(guān)于C35的含表位片段，參見(jiàn)WO 01/74859和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?2004/0063907 ο )靶向HER2受體功能的最廣泛公認(rèn)的單克隆抗體在商品名Herceptin 下銷 售(通常稱為曲妥珠單抗、huMAb4D5-8或rhuMAbHER2 ；美國(guó)專利號(hào)5，821，337并且可 從Genentech，Inc. , San Francisco, Calif.獲得)。這種重組人源化單克隆抗體對(duì)于 HER2具有高親和力。用患有廣泛轉(zhuǎn)移乳腺癌的患者的早期臨床試驗(yàn)證實(shí)這種單克隆抗體 抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，所述乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)HER2 (Baselga等人(1996) J. Clin. Oncol. 14(3) :737_744)。在一個(gè)此類試驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中用曲妥珠單抗的單一療 法得到14%的總體應(yīng)答率(2%完全應(yīng)答者和12%部分應(yīng)答者)。應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間中值為 9. 1個(gè)月，存活中值為12. 8個(gè)月(范圍為0.5至24+個(gè)月)。24%的患者在5. 8個(gè)月時(shí)無(wú) 進(jìn)展(Genentech，Inc.，文件上的數(shù)據(jù))。HER2的過(guò)表達(dá)程度預(yù)示治療效應(yīng)。盡管最廣泛公認(rèn)的HER2抗體是曲妥珠單抗，但本發(fā)明的方法并不限于這種抗體 的使用。鼠類起源的其他HER2抗體及其人源化和嵌合形式也適合于在本發(fā)明的方法中 使用。其他此類HER2抗體的實(shí)例包括但不限于，4D5抗體(在美國(guó)專利號(hào)5，677，171和 5，772，997中描述)；和520C9抗體及其功能等價(jià)物，命名為452F2、736G9、741F8、758G5和 76讓10(在美國(guó)專利號(hào)6，054，561中描述)；通過(guò)引用合并入本文。此外，新HER2抗體可以 使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，或本文描述的其他。許多研究已集中于針對(duì)EGFR的細(xì)胞外區(qū)域的抗體的產(chǎn)生。所產(chǎn)生的mAb主要通 過(guò)阻斷配體結(jié)合以及信號(hào)的破壞來(lái)介導(dǎo)其抗腫瘤活性。存在最初由Peng等人1996 (Peng D 等人 Cancer Res 1996，56 :3666_3669)和 Mendelson 等人 1997. (Mendelsohn J Clin Cancer Resl997，3 :2703_2707)研發(fā)的特異性識(shí)別 EGFR 的幾種 mAb。Mab 425,528 IgG2a 和225IgGl用于治療具有頭與頸鱗狀細(xì)胞癌的患者(SturgisE M，等人Otolaryngol. Head Neck Surg 1994,111 =633-643) 實(shí)驗(yàn)工作包括放射性標(biāo)記已顯示mAb 425是包括神經(jīng)膠 質(zhì)瘤的腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制劑(Rodeck U等人J Cell Biochem 1987,35:315-320 ；BradyL W 等人 Int J Radiat Oncol Biol Phys 1991,22 225-230 ；Faillot T 等人 Neurosurgery 1996，39 478-483)。IMC-C225 mAb特異性識(shí)別EGFR，并且在癌癥例如頭與頸癌、結(jié)腸直腸 癌、胰腺癌和肺癌的治療中具有許多潛力。mAb255在前列腺細(xì)胞系中上調(diào)p27 K1P1，并且 誘導(dǎo)Gl停滯。IMC-C225也稱為西妥昔單抗(ERBITUX )，是重組的、人/小鼠嵌合 的單克隆抗體，其與人EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。西妥昔單抗是EGFR拮抗劑，其阻 斷與EGFR的配體結(jié)合，阻止受體激活，并且抑制表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。西妥昔單抗 已批準(zhǔn)用于與依立替康組合或不組合用于治療患者，所述患者具有表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá) 的、轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌，所述患者是難治的或不能耐受基于依立替康的化學(xué)療法。mAb R3針對(duì)EGFR產(chǎn)生，并且最初研發(fā)用于在放射免疫療法中使用(WaterfieldM D，等人 J. Cell Biochem. 1982,20 149-161 ；Ramos-Suzarte M，等人 J. Nucl. Med. 1999， 40 768-775)。已產(chǎn)生R3的嵌合和人源化形式且在非洲綠猴中測(cè)試。R3的人源化形式保 留了小鼠抗體的相同結(jié)合親和力，并且發(fā)現(xiàn)具有小于嵌合抗體2倍的免疫原性。使用锝標(biāo) 記的小鼠和人源化mAb在小鼠中的異種移植物的臨床前研究，顯示用人源化形式作為診 斷工具比鼠類形式具有更大的潛力。大鼠抗EGFR mAb, ICR62，有效競(jìng)爭(zhēng)配體結(jié)合，并且消 除小鼠中的人腫瘤異種移植物(鱗狀細(xì)胞癌)。I期臨床試驗(yàn)報(bào)道該抗體安全施用于具 有鱗狀細(xì)胞癌的患者，并且它自那以后已用于研究生長(zhǎng)因子受體及其配體在頭與頸鱗狀 細(xì)胞癌細(xì)胞系中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(0-charoenrat P等人Clin. Exp. Metastasis 2000,18 155-161 ；0-charoenrat P 等人 Int. J. Cancer 2000,86 :307_317 ；0-charoenrat P 等人 Oral Oncol. 2002,38 :627_640)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于抗體的治療方法，其涉及給受試者(優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、且 最優(yōu)選為人)施用至少一種C35抗體和至少一種HER2抗體，用于治療一種或多種癌癥。本 發(fā)明還涉及基于抗體的治療方法，其涉及給受試者(優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、且最優(yōu)選為人)施用 至少一種C35抗體和至少一種EGFR抗體，用于治療一種或多種癌癥。本發(fā)明的治療性化合 物包括但不限于，本發(fā)明的抗體(包括如本文所述的其片段、類似物和衍生物)。本發(fā)明的 抗體可以在如本領(lǐng)域已知的或如本文所述的藥學(xué)上可接受的組合物中提供。本發(fā)明的抗體包括但不限于，多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化或嵌合抗體; 單鏈抗體；scFv ；雙鏈抗體；三鏈抗體；四鏈抗體；微型抗體；結(jié)構(gòu)域缺失抗體；Fab片段； F (ab’)2片段；由Fab表達(dá)庫(kù)產(chǎn)生的片段；以及抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括例如針對(duì)本 發(fā)明抗體的抗Id抗體)；以及上述中任一項(xiàng)的表位結(jié)合片段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”是 指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特異性結(jié)合抗原的抗 原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA和IgY)、類別(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。采用雜交瘤技術(shù)先前制備對(duì)C35多肽特異的雜交瘤細(xì)胞系1F2. 4. 1和1B3. 6. 1。 采用標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過(guò)蛋白質(zhì)G親和純化由雜交瘤上清液中分離抗體。在ELISA和蛋白質(zhì) 印跡測(cè)定法中，來(lái)自兩種雜交瘤細(xì)胞系1F2和1B3的抗體特異性結(jié)合重組C35蛋白質(zhì)。通 過(guò)免疫組織化學(xué)，來(lái)自雜交瘤細(xì)胞系1F2的抗體還特異性地染色福爾馬林固定的、石蠟包 埋的C35陽(yáng)性腫瘤和細(xì)胞系。這些抗體各自是獨(dú)特的，但是兩種抗體都對(duì)C35蛋白質(zhì)特異。 可以用這些抗體中的任一種對(duì)來(lái)自細(xì)胞裂解物的C35蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀，并且用另一種 檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ELISA測(cè)定法表明，由雜交瘤細(xì)胞系1F2和1B3產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合 C35蛋白質(zhì)的不同表位。如通過(guò)引用合并入本文的Evans等人，美國(guó)公開(kāi)號(hào)US20050158323所述，將編碼 1F2和1B3抗體的VL區(qū)域和VH區(qū)域的多核苷酸克隆到TOPO載體內(nèi)，其在表2中所述的日期 保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)，并給予表2中所列出的ATCC保藏編號(hào)。ATCC 位于 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209，USA。ATCC 保藏根據(jù)國(guó)際 承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約來(lái)進(jìn)行。攜帶1F2重鏈序列的克隆1F2G于2003年11月11日保藏于ATCC，并給予ATCC保 藏編號(hào)PTA-5639。攜帶1F2輕鏈序列的克隆1F2K于2003年11月11日保藏于ATCC，并給 予ATCC保藏編號(hào)PTA-5640。攜帶1B3重鏈序列的克隆1B3G于2003年11月11日保藏于ATCC，并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5637。攜帶1B3輕鏈序列的克隆1B3K于2003年11月11 日保藏于ATCC，并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5638。表1.編碼小鼠抗C35可變區(qū)的經(jīng)保藏的多核苷酸克隆 經(jīng)保藏的克隆的小鼠可變區(qū)基因和載體的部分的序列如下所示。斜體字=Topo載體序列(包括在經(jīng)保藏的克隆中)點(diǎn)Hl線.=Topo載體的EcoRl克隆位點(diǎn)小寫(xiě)字母=5’非翻譯區(qū)，包括generacer啟動(dòng)子ATG 二鼠類信號(hào)肽開(kāi)始粗體字=框架區(qū)(FWR)雙下劃線=CDRl、CDR2 或 CDR3下劃線=小鼠IgGl或κ恒定區(qū)的5’部分。1F2鼠類抗C35V γ 1基因多核苷酸序列(來(lái)自克隆1F2G) (SEQID NO 3)GAATTTAGCGGCCGCGAATTCGCCCTT cgactggagcacgggacactgacatggactgaaggagta gaaaacatctctctcattagaggttgatctttgaggaaaacagggtgttgcctaaagg ATGAAAGTGTTGAGTCTGT
tgtacctgttgacagccattcctggtatcctgtctgatgtacagcttcaoga
GTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACC
TTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTTCTGGAACTGGA TCCGG
CDRl
CAGTTTCCAGGGAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAA
CDR2
CTCCAACCCATCTCTCAAftAATCGAATCTCCTTCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGT TTAATTCTGTGACTACTGACGACTCAGCTGCATATTACTGTACAAGAGGAACTACGGGGTTTGCTTACTGG
GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GCCAACDR3 AACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCC AAGGGCG^TTCGJ-XTAJ^CCTGCAGGACTAGTCCCTT信號(hào)肽=18AAFRl = 30AACDRl = 6AAFR2 = 14AACDR2 = 16AA
FR3 = 32AACDR3 = 7AAFR4 =IlAA1F2VH氨基酸序列(由克隆1F2G編碼)(SEQ ID NO 4)DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNSNPSLKNRIS FTRDTSKNQFFLKFNSVTTDDSAAYYCTRGTTGFAYWGQGTLVTVSA1F2鼠類抗C35k V基因多核苷酸序列(來(lái)自克隆1F2K) (SEQID NO 5)CGCGAATTCGCCCTT cgactggagcacgaggacactgacatggactgaaggagtagaaaaattagct
agggaccaaaattcaaagacagaATgGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCAG
AATGTCCAGAGGAcaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtc accatatcctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatg
cdrl
aactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctgga
cdr3aa
CTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAA AGGGCGAATTCGTTT信號(hào)肽=22AAFRl = 23AACDRl = IOAAFR2 = 15AACDR2 = 7AAFR3 = 32AACDR3 = 9AAFR4 = IOAA1F2-VK 核酸序歹Ij (由克隆 1F2K 編碼)(SEQ ID NO 6)QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYHTSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPPTFGGGTKLEIK1B3 鼠類抗 C35V Y V 基因(由克隆 1B3G 編碼)(NC1-A7V139-D-J1 (VH36-60) M13281)(SEQ ID NO 7) ^^MrrCGCCCTT cgactggagcacgaggacactggacatggactgaaggagtagaaaatctctc tcactggaggctgatttttgaagaaaggggttgtagcctaaaagATG-ATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTTGACA GCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGOTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAG
actctgtccctcacctgttctgtcactggcgactccatcaccagtggttactggaactggatccggaaatt cccaggaaata
CDRl
aacttgaatacgtggggtacataagctacagtggtggcacttactacaatccatctctc
CUjl2
aaaagtggaatctccatcactcgasacacatccaagaaccactactacctgcagttgaattctgtgactac tgaggacacagccacatattactgtgcaagaggtgcttactacgggggggccttttttccttacttcgatg ictggggcgctoggaccacggtcaccgtctcctca
cdr3GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCA AGGGCGA ATTCGrTTTAAACCTGC信號(hào)肽=18AAFRl = 30AACDRl = 5AAFR2 = 14AACDR2 = 16AAFR3 = 32AACDR3 = 14AAFR4 =IlAA1B3 VH氨基酸序列(由克隆IBX編碼)(SEQ JD NO 8)EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTCDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYVGYISYSGGTYYNPSLKSRISI TRDTSKNHYYLQLNSVTTEDTATYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGAGTTVTVSS1B3 鼠抗 C35 κ V 基因(來(lái)自克隆 1Β3Κ) (SEQ ID NO 9)GAkTTCGCCCTT cccctggagcacgaggacactgacatggactgaaggagtagaaaatcagttcctg ccaggacacagtttagatATG.AGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATATCAGGTGCCCACTG tgatgtccagataacccagtctcc
&TrTTTTrTTOOTQCAT<;TggTQQAQAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGTACATTAGCA
CDRl
AACATTTAGTCTgQTATCAQQAGAAACCTGGAGAAACTAAAAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTG
CAATCTGGACXTCCATCAAGGTTCAGTGGCAqTGGATCTGGTACAGA
CDR2~
TTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTOAAGATTTTGCAATGTATTACTQT^^g^^^^^^^ ACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA CGGGCT CDR3 GATGCTGCACCAACTGTATC CATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAA AGGGCGAATTCSP = 20AAFRl = 23aaCDRl = IlaaFR2 = 15aaCDR2 = 7AAFR3 = 32aaCDR3 = 9AAFR4 = IOAA1B3 VK 氨基酸序歹Ij (由克隆 1B3K 編碼)(SEQ ID NO 10)DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKYISKHLVWYQEKPGETKKLLIYSGSTLQSGLPSRFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK本發(fā)明的C35抗體包括這樣的抗體，其免疫特異性結(jié)合本發(fā)明的SEQ ID NO 2的 C35多肽、多肽片段、或變體、和/或表位(如通過(guò)用于測(cè)定特異性抗體-抗原結(jié)合的本領(lǐng)域 眾所周知的免疫測(cè)定法測(cè)定的)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”意欲描述如下目的化合物(例如C35抗體)，該化合 物處于與所述化合物天然出現(xiàn)的環(huán)境不同的環(huán)境中?！敖?jīng)分離的”意欲包括在樣品內(nèi)的化合物，該樣品基本上富集了目的化合物和/或在該樣品中目的化合物是部分或基本上純化 的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上富集的”和“基本上純化的”是指這樣的化合物，其從其 天然環(huán)境中取出，并且至少60 %、優(yōu)選為75 %、且最優(yōu)選為90 %不含它與之天然結(jié)合的其 他成分。如本文所用，與參照抗體具有“相同特異性”的抗體是指該抗體結(jié)合與參照抗體相 同的表位?？贵w是否結(jié)合與參照抗體相同的表位的測(cè)定可以采用下文所述的測(cè)定法來(lái)進(jìn) 行。衍生自本文討論的小鼠雜交瘤細(xì)胞系的抗體(1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171)在共同未決的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/812,996中描述。編碼這些抗體的VL和VH區(qū) 域的多核苷酸于2003年11月11日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(“ATCC”)?？寺?F2G于 2003年11月11日保藏于ATCC，并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5639?？寺?F2K于2003年11 月11日保藏于ATCC，并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5640?？寺?B3G于2003年11月11日保 藏于ATCC，并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5637?？寺?B3K于2003年11月11日保藏于ATCC， 并給予ATCC保藏編號(hào)PTA-5638。lF2UB3.MAbc0009.MAb 163, MAb 165或MAb 171抗體的使用用于舉例說(shuō)明性目 的，并且該方法并不應(yīng)解釋為局限于這些抗體。任何C35抗體，包括但不限于共同未決的美 國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/812,996中列出的那些，在本發(fā)明的方法中有用。優(yōu)選地，示例性抗體的類似物通過(guò)保守性的氨基酸取代與示例性抗體不同。為了 將氨基酸的取代分類為保守性的或非保守性的，可以將氨基酸分成以下幾組組I (疏水性 側(cè)鏈)met、ala、val、leu、ile ；組 II (中性親水性側(cè)鏈)cys、ser、thr ；組 III (酸性側(cè) 鏈)asp、glu ；組IV (堿性側(cè)鏈)aSn、gln、hiS、lyS、arg ；組V (影響鏈方向的殘基)gly、 pro;以及組VI (芳香族側(cè)鏈)trp、tyr、phe。保守性的取代包括同一類別中的氨基酸之間 的取代。非保守性的取代構(gòu)成了這些類別之一的成員交換另一類別的成員。最優(yōu)選地，所述抗體為本發(fā)明的人、嵌合(例如人-小鼠嵌合)或人源化抗體，或 者抗原結(jié)合抗體片段，其包括，但不限于Fab、Fab'和F(ab' ) 2、Fd、單鏈Fvs (scFv)、雙 鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、細(xì)胞內(nèi)抗體、以 及含有VL區(qū)域或VH區(qū)域的片段。包括單鏈抗體的抗原結(jié)合抗體片段可以包含單獨(dú)的可變 區(qū)或者與以下的全部或部分組合的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、ChI結(jié)構(gòu)域、Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域。 本發(fā)明還包括的是抗原結(jié)合片段，該片段還包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、ChI結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和 Ch3結(jié)構(gòu)域的任何組合。在本發(fā)明的治療方法中的優(yōu)選抗體為含有CH2結(jié)構(gòu)域缺失的那些 抗體。用于與本發(fā)明的方法一起使用的抗體可以根據(jù)其識(shí)別或特異性結(jié)合的本發(fā)明多 肽的一個(gè)或多個(gè)表位或部分來(lái)進(jìn)行描述或詳細(xì)說(shuō)明。如本文所述，通過(guò)例如N末端和C末 端的位置或者通過(guò)鄰接氨基酸殘基中的大小，可以詳細(xì)說(shuō)明所述一個(gè)或多個(gè)表位或多肽部 分。還排除特異性結(jié)合本發(fā)明的任何表位或多肽的抗體。因此，本發(fā)明包括特異性結(jié)合本 發(fā)明的多肽的抗體，并且允許排除該抗體。用于與本發(fā)明的方法一起使用的抗體還可以根據(jù)其與本發(fā)明的多肽的結(jié)合親和 力來(lái)進(jìn)行描述或詳細(xì)說(shuō)明。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5X10(-7)M、10(-7) M、5X10(-8)M、10(-8)M、5X10(-9)M、10(-9)M、5X10(-10)M、10(-10)M、5X10(-11)M、10(-11)M、5X10(-12)Μ、10(_12)Μ、5Χ10(-13)Μ、10(_13)Μ、5Χ10(_14)Μ、10(_14)Μ、5Χ10(-15) M 或 10(-15)Μ的那些。用于與本發(fā)明的方法一起使用的某些抗體對(duì)于C35的親和力和抗體1F2、1B3、 MAbc0009、MAb 163、MAb 165和MAb 171的親和力相同或相似。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體對(duì)于 C35 的親和力高于抗體 lF2、lB3、MAbc0009、MAb 163,MAb 165 禾Π MAb 171 的親和力。本發(fā)明還包括如下抗體(包括包含抗體片段或其變體的分子，或備選地由抗體片 段或其變體組成的分子)的用途，該抗體具有與本文所述的一種或多種抗體相同的一種或 多種生物學(xué)特征?！吧飳W(xué)特征”是指抗體的體外或體內(nèi)活性或性質(zhì)，例如結(jié)合C35、HER2、 EGFR和/或IGFR多肽的能力；基本上抑制或取消C35、HER2、EGFR和/或IGFR多肽介導(dǎo) 的生物學(xué)活性的能力；殺死C35、HER2、EGFR和/或IGFR相關(guān)癌細(xì)胞的能力；或誘導(dǎo)表達(dá) HER2、EGFR和/或IGFR的癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的能力。任選地，本發(fā)明的抗體與本文特別提 及的抗體中的至少一種相同的表位結(jié)合?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知和下文描述的測(cè)定法常規(guī)測(cè) 定這種表位結(jié)合。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白和人抗體變體具有基本上來(lái)自人免疫球蛋白(稱為 受體免疫球蛋白)的可變框架區(qū)、和基本上來(lái)自小鼠C35、HER2、EGFR和/或EGFR VH和VL 區(qū)域(稱為供體免疫球蛋白)的CDR。此外，恒定區(qū)如果存在的話也基本上來(lái)自人免疫球 蛋白。人源化抗體和人抗體變體表現(xiàn)出對(duì)C35、HER2、EGFR或IGFR的特異性結(jié)合親和力為 至少 10 (2)、10 (3)、10 (4)、10 (5)、10 (6)、10 (7)、10 (8)、10 (9)或 10(10)M(_1)。通常，人源 化抗體和人抗體變體對(duì)于人C35、HER2或EGFR的結(jié)合親和力的上限在小鼠抗體1F2或1B3 的結(jié)合親和力的3、4、5或10倍內(nèi)。通常，對(duì)于人C35的結(jié)合親和力的下限同樣也在小鼠抗 體1F2或1B3的結(jié)合親和力的3、4、5或10倍內(nèi)。優(yōu)選的抗C35人源化免疫球蛋白和人抗 體變體與小鼠抗體1F2或1B3競(jìng)爭(zhēng)與C35結(jié)合，并阻止C35與分別的小鼠或人抗體結(jié)合?？赡艿娜耸荏w抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)由Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health, Bethesda, Md. ,1987 禾口 1991)描述。這樣選擇人受體抗體，使得其可變區(qū)表現(xiàn)出與小鼠C35或HER2抗體的可變區(qū) 的高度序列同一性。重鏈可變框架區(qū)和輕鏈可變框架區(qū)可以衍生自相同或不同的人抗體序 列。人抗體序列可以是天然存在的人抗體的序列或者可以是數(shù)種人抗體的共有序列。可以如下進(jìn)行人源化免疫球蛋白的設(shè)計(jì)。當(dāng)氨基酸歸入以下范疇時(shí)，待使用的人 免疫球蛋白(受體免疫球蛋白)的框架氨基酸被來(lái)自用于提供CDR的非人免疫球蛋白(供 體免疫球蛋白)的框架氨基酸替代(a)受體免疫球蛋白的人框架區(qū)中的氨基酸在該位置處對(duì)于人免疫球蛋白是罕見(jiàn) 的，而供體免疫球蛋白的相應(yīng)氨基酸在該位置處對(duì)于人免疫球蛋白是通常的；(b)氨基酸的位置與⑶R之一緊鄰；或(c)氨基酸能夠與CDR相互作用(分別參見(jiàn)Queen等人，W092/11018.和Co等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88，2869 (1991)，這兩份文獻(xiàn)均通過(guò)引用合并入本文)。關(guān)于人源 化免疫球蛋白的生產(chǎn)的詳細(xì)描述，參見(jiàn)Queen等人和Co等人。通常，人源化抗體和人抗體變體中的⑶R區(qū)域與該⑶R區(qū)域衍生自其的小鼠或 人抗體中的相應(yīng)CDR區(qū)域基本上相同，并且更通常地是相同的?？梢赃M(jìn)行CDR殘基的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，而不明顯影響所得到的人源化免疫球蛋白或人抗體變體的結(jié)合親和力，并且有時(shí)候，CDR區(qū)域或CDR區(qū)域范圍內(nèi)的取代可以增強(qiáng)結(jié)合親和力。例如參見(jiàn) Iwahashi 等人，Mol. Immunol. 36 1079-1091 (1999) ；Glaser 等人，J. Immunol. 149(8) 2607-2614(1992)；和 Tamura 等人，J. Immunol. 164 1432-1441 (2000)。除了上文所述的特定的氨基酸取代以外，人源化免疫球蛋白和人抗體變體的框架 區(qū)與該框架區(qū)衍生自其的人抗體(受體免疫球蛋白)的框架區(qū)通?；旧舷嗤?，并且更通 常地是相同的。當(dāng)然，框架區(qū)中的許多氨基酸幾乎不促成或不直接促成抗體的特異性或親 和力。因此，可以耐受框架殘基的許多個(gè)別的保守性的取代，而沒(méi)有所得到的人源化免疫球 蛋白或人抗體變體的特異性或親和力的明顯改變。噬菌體展示技術(shù)提供了用于選擇類似物的有力技術(shù)，所述類似物與親本序列具有 基本的序列同一性，同時(shí)保留了結(jié)合親和力和特異性(例如參見(jiàn)Dower等人，WO 91/17271 ； McCafferty 等人，W092/01047 ；和 Huse，WO 92/06204 ；US 2002/0123057A1 ；這些文獻(xiàn)各自 通過(guò)引用合并入本文)。如上所述產(chǎn)生的人源化抗體或人抗體變體的可變節(jié)段通常與免疫球蛋白恒定區(qū) (Fe)的至少一部分連接，通常與人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分連接。可以根據(jù)公知的 操作從各種人細(xì)胞(例如永生化的B細(xì)胞)中分離人恒定區(qū)DNA序列(參見(jiàn)上文的Kabat 等人和WO 87/02671)。所述抗體可以包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以包含 CH1、鉸鏈、CH2、CH3，有時(shí)還包含CH4區(qū)域。對(duì)于治療目的而言，CH2區(qū)域可以缺失或省略。人源化抗體或人抗體變體包括具有所有類型恒定區(qū)的抗體，包括IgM、IgG、IgD、 IgA和IgE以及任何同種型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。當(dāng)希望人源化抗體或人抗體 變體表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域通常為補(bǔ)體結(jié)合性恒定結(jié)構(gòu)域，并且其類別通常為 IgGl0當(dāng)不需要這種細(xì)胞毒活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以為IgG2類別。人源化抗體或人抗體變 體可以包含來(lái)自多于一個(gè)類別或同種型的序列。還包括了嵌合抗體用于在本發(fā)明中使用。這種抗體可以包含與另一物種(例如人 或小鼠或馬等)的CH區(qū)域和/或CL區(qū)域融合的VH區(qū)域和/或VL區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，嵌合抗體包含與人C區(qū)域融合的、由鼠抗C35或抗HER2抗體編碼的VH和/或VL區(qū) 域。當(dāng)抗體用于治療目的時(shí)，人CH2結(jié)構(gòu)域可以缺失。嵌合抗體包括了抗體片段，如上文所 述。如上所述產(chǎn)生的嵌合抗體的可變節(jié)段通常與免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一 部分連接，通常與人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分連接?？梢愿鶕?jù)公知的操作從各種 人細(xì)胞(例如永生化的B細(xì)胞)中分離人恒定區(qū)DNA序列(參見(jiàn)上文的Kabat等人和WO 87/02671)。所述抗體可以包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可以包含CH1、鉸鏈、 CH2、CH3，有時(shí)還包含CH4區(qū)域。對(duì)于治療目的而言，CH2區(qū)域可以缺失或省略。嵌合抗體包括具有所有類型恒定區(qū)的抗體，恒定區(qū)包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE 以及任何同種型的抗體(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。當(dāng)希望嵌合抗體表現(xiàn)出細(xì)胞毒 活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域通常為補(bǔ)體結(jié)合性恒定結(jié)構(gòu)域，并且其類別通常為IgGl。當(dāng)不需要這種 細(xì)胞毒活性時(shí)，恒定結(jié)構(gòu)域可以為IgG2類別。嵌合抗體可以包含來(lái)自多于一種類別或同種 型的序列。多種方法可以用于產(chǎn)生此類免疫球蛋白。由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，多種核酸序列編 碼每種免疫球蛋白氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)從頭固相DNA合成或者通過(guò)所需多核苷酸的較早制備的變體的PCR誘變產(chǎn)生所需核酸序列。編碼本申請(qǐng)中描述的抗體的所有核酸都明確地 包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的整體抗體、其二聚體、個(gè)別輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式一經(jīng)表達(dá)， 便可根據(jù)本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)操作(包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱色譜法、凝膠電泳等)進(jìn)行純化 (通常參見(jiàn) Scopes, R.，ProteinPurification, Springer- Verlag, N. Y. (1982)，其通過(guò)引 用合并入本文)。對(duì)于藥學(xué)用途，至少約90%至95%同質(zhì)性的基本純的免疫球蛋白是優(yōu)選 的，并且98%至99%或更高同質(zhì)性是最優(yōu)選的。一旦部分純化或者純化到所希望的同質(zhì) 性，隨后就可以將所述多肽治療性(包括體外)地用于開(kāi)發(fā)或執(zhí)行測(cè)定法操作、免疫熒光 染色等等(一般參見(jiàn)，Immunological Methods，第 I 和 II 卷，Lefkovits 和 Pernis，編輯， Academic Press, New York, N. Y. (1979 和 1981)，或者檢測(cè) C35 或者診斷 C-35 相關(guān)的癌癥。如下文更詳細(xì)地討論的，在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以單獨(dú)使用，彼此組合 使用，或者與其他組合物組合使用。所述抗體可以進(jìn)一步在N末端或C末端處與異源多肽重 組融合，或者與多肽或其他組合物化學(xué)綴合(包括共價(jià)綴合和非共價(jià)綴合)。例如，本發(fā)明 的抗體可以與在檢測(cè)測(cè)定法中用作標(biāo)記物的分子和效應(yīng)分子重組融合或綴合，所述效應(yīng)分 子例如異源多肽、藥品、放射性核素或毒素。例如參見(jiàn)PCT公開(kāi)WO 92/08495 ；WO 91/14438 ； WO 89/12624;美國(guó)專利號(hào)5，314，995和EP 396，387，所述專利通過(guò)引用整體合并入本文。在本發(fā)明的方法中使用的抗體包括經(jīng)修飾的衍生物，所述修飾即通過(guò)使任何類 型的分子與所述抗體共價(jià)附著，從而使得共價(jià)附著不會(huì)妨礙抗體結(jié)合C35、HER2、EGFR或 IGFR0例如但不限于，所述抗體衍生物包括已通過(guò)下述進(jìn)行修飾的抗體例如糖基化、乙酰 化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、由已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白 水解切割、與細(xì)胞配體或其他蛋白質(zhì)相連等等?？梢酝ㄟ^(guò)已知技術(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾中的 任何修飾，其中所述化學(xué)修飾包括但不限于，特異性的化學(xué)切割、乙?；?、甲?；?、衣霉素的 代謝合成等等。此外，所述衍生物可以包含一種或多種非典型氨基酸。在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以由通過(guò)肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵而彼此連接的 氨基酸(即，肽的等排體)組成，并且可以包含除了 20種基因編碼的氨基酸以外的氨基 酸。在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以通過(guò)天然過(guò)程(例如翻譯后加工)或者通過(guò)本領(lǐng) 域公知的化學(xué)修飾技術(shù)來(lái)進(jìn)行修飾。這些修飾在基礎(chǔ)課本和更詳細(xì)的專論中、以及在大 量的研究文獻(xiàn)中充分描述。修飾可以在抗體中的任何位置處發(fā)生，所述位置包括肽主鏈、 氨基酸側(cè)鏈、以及氨基或羧基末端。應(yīng)該理解，相同類型的修飾可以以相同程度或不同程 度存在于給定抗體中的數(shù)個(gè)位點(diǎn)處。此外，給定抗體可以包含許多類型的修飾?？贵w可 以例如由于泛素化而是分支的，并且它們可以是環(huán)狀的，具有或不具有分支。環(huán)狀、分支、 以及分支環(huán)狀的抗體可以起因于翻譯后的天然過(guò)程，或者可以通過(guò)合成方法制備。修飾 包括乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、核黃素的共價(jià)附著、亞鐵血紅素部分的共價(jià)附 著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、磷脂酰肌醇的共價(jià) 附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)體的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸 的形成、甲酰化、Y羧酸化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、 聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的 向蛋白質(zhì)中加入氨基酸(例如精氨?；?以及泛素化(例如參見(jiàn)PROTEINS- STRUCTURE AND M0LECULARPR0PERTIES，第 2 版，Τ· Ε· Creighton，W. H. Freeman andCompany, NewYork(1993) ；POSTTRANSLATIONAL C0VALENTM0DIFICATION OF PROTEINS, B. C.Johnson, 編輯，AcademicPress, New York,第 1-12 頁(yè)(1983) ；Seifter 等人，Meth Enzymol 182 626-646(1990) ；Rattan 等人，Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992))。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含抗體序列的氨基酸序列的多肽，所述抗 體序列具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列包含至少1個(gè)氨基酸取代，但不超過(guò)50個(gè)氨基 酸取代，甚至更優(yōu)選地不超過(guò)40個(gè)氨基酸取代，還更優(yōu)選地不超過(guò)30個(gè)氨基酸取代，并且 甚至還更優(yōu)選地不超過(guò)20個(gè)氨基酸取代。當(dāng)然，按照不斷增加的優(yōu)先次序，高度優(yōu)選多肽 具有包含抗體序列的氨基酸序列，所述抗體序列包含至少1個(gè)氨基酸取代，但不超過(guò)10個(gè)、 9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)氨基酸取代。在具體的實(shí)施方案中，抗體序 列中的加入、取代和/或缺失的數(shù)目為1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150。就取代而 言，保守性的氨基酸取代是優(yōu)選的。所述取代可以在框架區(qū)或CDRs或兩者內(nèi)。該部分的說(shuō)明適用于在本發(fā)明的方法中有用的C35、HER2、EGFR和/或IGFR抗體。 這種抗體可以如本文所述的與毒素綴合或復(fù)合，或者可以是非綴合的或非復(fù)合的。IV . C35、HER2 和 EGFR 抗體多肽本發(fā)明進(jìn)一步涉及構(gòu)成本發(fā)明的抗體的經(jīng)分離的多肽、以及編碼這種多肽的多核 苷酸。本發(fā)明的抗體包括多肽，例如編碼衍生自免疫球蛋白分子的C35、HER2或EGFR特異 性抗原結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列。“衍生自”指定蛋白質(zhì)的多肽或氨基酸序列是指多肽的來(lái) 源。在某些情況下，衍生自特定的初始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有與所述 初始序列或其一部分的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20個(gè) 氨基酸、至少20-30個(gè)氨基酸、至少30-50個(gè)氨基酸組成，或者由于具有其在初始序列中的 來(lái)源，可以以其他方式被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多肽，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū) (VH)，或者基本上由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)組成，或者由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)組成，其中 所述重鏈可變區(qū)的CDR中的至少一個(gè)或者所述重鏈可變區(qū)的CDR中的至少兩個(gè)與來(lái)自上文 提及的C35、HER2或EGFR抗體的參照重鏈CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列至少80%、85%、 90%、95%、99%或100%相同。備選地，所述VH的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)域與來(lái)自上文提 及的抗體的參照重鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3氨基酸序列至少80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或 100%相同。在一些實(shí)施方案中，包含上文所述的一種或多種VH多肽，基本上由上文所述的一 種或多種VH多肽組成，或由上文所述的一種或多種VH多肽組成的抗體或其抗原結(jié)合片段， 與選自lF2、lB3、MAbc0009、MAb 163,MAb 165和MAb 171的單克隆抗體的相同表位特異性 或優(yōu)先地結(jié)合，或者競(jìng)爭(zhēng)性地抑制此類單克隆抗體與C35結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，包含上文所述的一種或多種VH多肽，基本上由上文所述的一 種或多種VH多肽組成，或由上文所述的一種或多種VH多肽組成的抗體或其抗原結(jié)合片 段，與C35、HER2或EGFR多肽或其片段、或者C35、HER2或EGFR變體多肽特異性或優(yōu)先地 結(jié)合，其親和力可表征為解離常數(shù)(Kd)不大于5χ10-2Μ、10-2Μ、5Χ10-3Μ、10-3Μ、5Χ10-4Μ、1(Γ4Μ、 5χ10-5Μ、10-5Μ、5Χ101、1(Γ6Μ、5Χ1(Γ7Μ、1(Γ7Μ、5Χ1(Γ8Μ、1(Γ8Μ、5Χ1(Γ9Μ、1(Γ9Μ、5Χ1(Γ10Μ、1(Γ10Μ、 5χ1(Γ"Μ、Kr11Mjxlir12]^ 1(Γ12Μ、5χ1(Γ13Μ、1(Γ13Μ、5χ1(Γ14Μ、1(Γ14Μ、5χ1(Γ15Μ 或 IO-15M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多肽，其包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，基本上由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)組成，或由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)組成，其中所述 輕鏈可變區(qū)的CDR中的至少一個(gè)或者所述的輕鏈可變區(qū)的CDR中的至少兩個(gè)與來(lái)自上文提 及的C35、HER2或EGFR抗體的參照重鏈CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列至少80%、85%、 90%、95%、99%或100%相同。備選地，所述VL的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)域與來(lái)自上文提 及的抗體的參照輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基酸序列至少80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或 100%相同。在一些實(shí)施方案中，包含上文所述的一種或多種VL多肽，基本上由上文所述的一 種或多種VL多肽組成，或由上文所述的一種或多種VL多肽組成的抗體或其抗原結(jié)合片段， 與選自lF2、lB3、MAbc0009、MAb 163,MAb 165和MAb 171的單克隆抗體的相同表位特異性 或優(yōu)先地結(jié)合，或者競(jìng)爭(zhēng)性地抑制此類單克隆抗體與C35結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，包含上文所述的一種或多種VL多肽，基本上由上文所述的一 種或多種VL多肽組成，或由上文所述的一種或多種VL多肽組成的抗體或其抗原結(jié)合片 段，與C35、HER2或EGFR多肽或其片段、或者C35、HER2或EGFR變體多肽特異性或優(yōu)先地 結(jié)合，其親和力可表征為解離常數(shù)(Kd)不大于5χ10-2Μ、10-2Μ、5Χ10-3Μ、10-3Μ、5Χ10-4Μ、1(Γ4Μ、 5χ10-5Μ、10-5Μ、5Χ101、1(Γ6Μ、5Χ1(Γ7Μ、1(Γ7Μ、5Χ1(Γ8Μ、1(Γ8Μ、5Χ1(Γ9Μ、1(Γ9Μ、5Χ1(Γ10Μ、1(Γ10Μ、 5χ1(Γ"Μ、Kr11Mjxlir12]^ 1(Γ12Μ、5χ1(Γ13Μ、1(Γ13Μ、5χ1(Γ14Μ、1(Γ14Μ、5χ1(Γ15Μ 或 IO-15M0上文所述的任何多肽可以進(jìn)一步包含其他多肽，例如指導(dǎo)所編碼的多肽分泌的信 號(hào)肽、如本文所述的抗體恒定區(qū)、或如本文所述的其他異源多肽。此外，本發(fā)明的多肽包括 在本文其他地方所述的多肽片段。此外，如本文所述，本發(fā)明的多肽包括融合多肽、Fab片 段和其他衍生物。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如本文所公開(kāi)的C35、HER2或EGFR抗體多 肽可以這樣進(jìn)行修飾，使得它們?cè)诎被嵝蛄兄胁煌谒鼈兯苌缘奶烊淮嬖诘慕Y(jié)合多 肽。例如，衍生自指定蛋白質(zhì)的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如與初始序列具有一定 的同一性百分比，例如它可以與初始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99% 相同。此外，可以制備導(dǎo)致在“非必需”氨基酸區(qū)域處的保守性取代或變化的核苷酸或氨 基酸的取代、缺失或插入。例如，衍生自指定蛋白質(zhì)的多肽或氨基酸序列可以與初始序列 相同，除了一個(gè)或多個(gè)個(gè)別氨基酸的取代、插入或缺失，例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、 六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十五個(gè)、二十個(gè)或更多個(gè)個(gè)別氨基酸的取代、插入或缺失。在 一些實(shí)施方案中，相對(duì)于初始序列，衍生自指定蛋白質(zhì)的多肽或氨基酸序列具有1至5、1至 10、1至15、或者1至20個(gè)個(gè)別氨基酸的取代、插入或缺失。本發(fā)明的某些抗體多肽包含衍生自人氨基酸序列的氨基酸序列，基本上由所述氨 基酸序列組成，或由所述氨基酸序列組成。但是，某些抗體多肽包含衍生自其他哺乳動(dòng)物物 種的一個(gè)或多個(gè)鄰接氨基酸。例如，本發(fā)明的抗體可以包含靈長(zhǎng)動(dòng)物的重鏈部分、鉸鏈部分 或抗原結(jié)合區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)例中，一個(gè)或多個(gè)鼠類衍生的氨基酸可以存在于非鼠類的抗 體多肽中，例如C35、HER2或EGFR抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)中。在某些治療性應(yīng)用中，C35、HER2 或EGFR特異性抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或類似物這樣進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便在所述抗體施 用于其的動(dòng)物中是非免疫原性的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體多肽包含通常與抗體無(wú)關(guān)的氨基酸序列或一個(gè)或多個(gè)部分。下文更詳述地描述了示例性的修飾。例如，本發(fā)明的單鏈fv抗體片段可以 包含彈性連接體序列，或者可以進(jìn)行修飾以加入功能性部分(例如PEG、藥品、毒素或標(biāo)記 物)。本發(fā)明的抗體多肽可以包含融合蛋白質(zhì)，基本上由融合蛋白質(zhì)組成，或由融合蛋 白質(zhì)組成。融合蛋白質(zhì)為嵌合分子，其包含例如具有至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、和至少一個(gè)異源部分，即，它在自然界中與之非天然連接的部分。所述氨基 酸序列通?？梢源嬖谟诜珠_(kāi)的蛋白質(zhì)中，并在融合多肽中被集合在一起；或者所述氨基酸 序列通?？梢源嬖谟谕坏鞍踪|(zhì)中，但在融合多肽中以新的排列方式放置。例如可以通過(guò) 化學(xué)合成或通過(guò)產(chǎn)生且翻譯多核苷酸(其中肽區(qū)域以所需關(guān)系編碼)來(lái)產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)?！氨Ｊ匦缘陌被崛〈笔瞧渲邪被釟埢删哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代的 情況。本領(lǐng)域已經(jīng)對(duì)具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族進(jìn)行了定義，所述氨基酸殘基家族包 括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電 荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非 極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β 分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸、組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地由來(lái)自相同側(cè)鏈家族中 的另一種氨基酸殘基替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一串氨基酸可以由側(cè)鏈家族成員的次序 和/或組成中不同的結(jié)構(gòu)上相似的串替代。備選地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)例如飽和誘變，沿著免疫球蛋白編碼序列 的全部或一部分隨機(jī)地引入突變，并且可以將所得的突變體摻入到C35或HER2抗體中，在 本文所公開(kāi)的治療方法中使用。V .融合蛋白質(zhì)和抗體綴合物在本發(fā)明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片段、變 體或衍生物可以進(jìn)一步在N末端或C末端與異源多肽重組融合，或與多肽或其他組合物化 學(xué)綴合(包括共價(jià)綴合和非共價(jià)綴合)。例如，本發(fā)明的抗體與在檢測(cè)測(cè)定法中用作標(biāo)記 物的分子和效應(yīng)分子重組融合或綴合，所述效應(yīng)分子例如異源多肽、藥品、放射性核素或毒 素。例如參見(jiàn) PCT 公開(kāi) W 92/08495 ；WO 91/14438 ；WO 89/12624 ；美國(guó)專利號(hào) 5，314，995 和 EP 396,387。本發(fā)明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物包括 經(jīng)修飾的衍生物，所述修飾即通過(guò)使任何類型的分子與所述抗體共價(jià)附著，從而使得共價(jià) 附著不會(huì)妨礙抗體分別結(jié)合C35、HER2、EGFR或IGFR。例如但不限于，所述抗體衍生物包括 已通過(guò)下述進(jìn)行修飾的抗體例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰 胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割、與細(xì)胞配體或其他蛋白質(zhì)連接 等。可以通過(guò)已知技術(shù)進(jìn)行多種化學(xué)修飾中的任何修飾，所述化學(xué)修飾包括但不限于，特異 性的化學(xué)切害I]、乙?；⒓柞；⒁旅顾氐拇x合成等等。此外，所述衍生物可以包含一種或 多種非典型氨基酸。本發(fā)明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以由 通過(guò)肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵而彼此連接的氨基酸(即，肽的等排體)組成，并且可以包含除了 20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)天然過(guò)程(例如翻譯后加工)或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)來(lái)進(jìn)行修飾。這些修飾在基礎(chǔ)課本和更詳細(xì)的專 論中、以及在大量的研究文獻(xiàn)中充分描述。修飾可以在抗體中的任何位置處發(fā)生，所述位置 包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端、或在諸如糖碳水化合物的部分上。應(yīng)該理解， 相同類型的修飾可以以相同程度或不同程度存在于給定抗體中的數(shù)個(gè)位點(diǎn)處。此外，給定 抗體可以包含許多類型的修飾?？贵w可以例如由于泛素化而是分支的，并且它們可以是環(huán) 狀的，具有或不具有分支。環(huán)狀、分支、以及分支環(huán)狀的抗體可以起因于翻譯后的天然過(guò)程， 或者可以通過(guò)合成方法制備。修飾包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、核黃素的共 價(jià)附著、亞鐵血紅素部分的共價(jià)附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生 物的共價(jià)附著、磷脂酰肌醇的共價(jià)附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)體的 形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、Y羧酸化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、 碘化、甲基化、肉豆蔻?；⒀趸?、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋 化、硒化、硫化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)中加入氨基酸(例如精氨?；?以及泛素化(例 如參見(jiàn) Proteins Structure And Molecular Pproperties, Τ. Ε. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 第 2 版(1993) ；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson,編輯，Academic Press, New York, H 1-12 頁(yè)(1983) ；Seifter 等 人，Meth Enzymol 182:626-646(1990) ；Rattan 等人，Ann NY Acad Sci663 :48_62 (1992))。本發(fā)明還提供了融合蛋白質(zhì)，其包含C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合 片段、變體或衍生物，以及異源多肽?？贵w與之融合的異源多肽可用于發(fā)揮功能或用于靶向 表達(dá)C35、HER2、EGFR或IGFR的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)包含多肽 和異源多肽序列，基本上由多肽和異源多肽序列組成，或由多肽和異源多肽序列組成，所述 多肽具有本發(fā)明抗體的任何一個(gè)或多個(gè)Vh區(qū)域的氨基酸序列、或者本發(fā)明抗體或其片段或 變體的任何一個(gè)或多個(gè)\區(qū)域的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本文公開(kāi)的診斷和 治療方法中使用的融合蛋白質(zhì)包含多肽和異源多肽序列，基本上由多肽和異源多肽序列組 成，或由多肽和異源多肽序列組成，所述多肽具有C35、HER2、EGFR或IGFR特異性抗體或者 其片段、或變體或衍生物的Vh CDR中的任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)的氨基酸序列，或者C35、HER2、 EGFR或IGFR特異性抗體或者其片段、或變體或衍生物的\ CDR中的任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè) 的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白質(zhì)包含多肽和異源多肽序列，所述多肽具 有本發(fā)明C35特異性抗體或其片段、衍生物或變體的Vh CDR3的氨基酸序列，所述融合蛋白 質(zhì)特異性結(jié)合C35的至少一個(gè)表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)包含多肽和異源多 肽序列，所述多肽具有本發(fā)明C35特異性抗體的至少一個(gè)域的氨基酸序列，和本發(fā)明 C35特異性抗體或其片段、衍生物或變體的至少一個(gè)\區(qū)域的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述融 合蛋白質(zhì)的Vh和\區(qū)域相應(yīng)于特異性結(jié)合C35的至少一個(gè)表位的單一來(lái)源的抗體(或者 scFv或Fab片段)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，用于在本文公開(kāi)的診斷和治療方法中使用的 融合蛋白質(zhì)包含多肽和異源多肽序列，所述多肽具有C35特異性抗體的Vh CDR中的任何一 個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)的氨基酸序列，和C35特異性抗體或其片段或變體的\ CDR中的任 何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)的氨基酸序列。優(yōu)選地，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè) Vh CDR(S)或\ CDR(S)相應(yīng)于本發(fā)明的單一來(lái)源的抗體(或者scFv或Fab片段)。本發(fā) 明還包括編碼這些融合蛋白質(zhì)的核酸分子。文獻(xiàn)中報(bào)道的示例性融合蛋白質(zhì)包括以下物質(zhì)的融合物T細(xì)胞受體(Gascoigne等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :2936_2940 (1987)) ；CD4 (Capon 等人，Nature 337 525-531 (1989) ；Traunecker ^ 人，Nature 339:68-70(1989) ；Zettmeissl ^ 人，DNA Cell Biol. USA 9 :347_353 (1990)；和 Byrn 等人，Nature 344 :667_670 (1990)) ；L-選 擇蛋白(歸巢受體)(Watson 等人，J. Cell. Biol. 110 2221-2229 (1990)；和 Watson 等 人，Nature 349 164-167 (1991)) ；CD44 (Aruffo 等人，Cell 61 1303-1313 (1990)) ；CD28 和 B7 (Linsley 等人，J. Exp. Med. 173 :721_730 (1991)) ；CTLA-4 (Lisley 等人，J.Exp· Med. 174 :561-569 (1991)) ；CD22 (Stamenkovic 等人，Cell 66:1133-1144(1991)) ；TNF 受體(Ashkenazi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 10535-10539 (1991) ；Lesslauer 等人，Eur. J. Immunol. 27 :2883-2886 (1991)；禾Π Peppel 等人，J. Exp. Med. 174 1483-1489(1991))；以及 IgE 受體(Ridgway 和 Gorman，J. Cell. Biol.第 115 卷，Abstract No. 1448(1991))。如本文中其他地方所述，可以使在本發(fā)明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR 抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物與異源多肽融合，以增加所述多肽的體內(nèi)半衰期。 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG可以與本發(fā)明的抗體綴合，以增加其體內(nèi)半衰期(Leong， S. R.，等人，Cytokine 16:106(2001) ；Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 531 (2002)；或 Weir 等 人’ Biochem. Soc. Transactions 30 512 (2002))。在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以以非綴合的形式使用，或者可以與多種分子中 的至少一種綴合，從而例如改善所述分子的治療性質(zhì)，以促進(jìn)靶檢測(cè)，或者用于患者的成像 或治療。當(dāng)進(jìn)行純化時(shí)，可以在純化之前或純化之后使在本發(fā)明的方法中使用的抗體或者 其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物標(biāo)記或綴合。特別地，可以使本發(fā)明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體 或衍生物與治療性試劑、前體藥物、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物應(yīng)答修飾劑、藥物試劑 或PEG綴合。本發(fā)明進(jìn)一步包括了與診斷試劑或治療性試劑綴合的在本發(fā)明的方法中使用的 抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。所述抗體可以在診斷中使用，例如，作為臨床檢 驗(yàn)操作的一部分來(lái)監(jiān)控疾病的發(fā)展或進(jìn)程，以例如確定給定治療和/或預(yù)防方案的效果。 可以通過(guò)使抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)來(lái)促進(jìn)檢測(cè)?？蓹z 測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、利用了 各種正電子發(fā)射斷層顯像的正電子發(fā)射金屬、以及非放射性的順磁金屬離子。關(guān)于金屬離 子參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4，741，900，該金屬離子可以與抗體綴合用于作為根據(jù)本發(fā)明的診 斷劑。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯 酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉親核素/生物素、以及抗生物素蛋白/生物素；合 適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、 丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾(luminol)；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括 螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白質(zhì)；合適的放射性材料的實(shí)例包括125I、mI、mIn或"Tc。VI .抗體多肽的表達(dá)如所公知的，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如異硫氰胍提取和沉淀，隨后為離心或色譜 法)從原始的雜交瘤細(xì)胞中或從其他經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離RNA。需要時(shí)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) (例如在寡dT纖維素上的色譜法)從總RNA中分離mRNA。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域熟悉的。
可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從細(xì)胞中分離DNA，通常為質(zhì)粒DNA，根據(jù)詳細(xì)闡明 (例如在關(guān)于重組DNA技術(shù)的現(xiàn)有文獻(xiàn)中)的標(biāo)準(zhǔn)的公知的技術(shù)來(lái)制作限制性圖譜并測(cè)序。 當(dāng)然，可以在分離過(guò)程或隨后的分析過(guò)程中的任何時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明合成DNA。在處理經(jīng)分離的基因材料以提供C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片 段、變體或衍生物后，通常將編碼抗體的多核苷酸插入表達(dá)載體內(nèi)用于引入宿主細(xì)胞內(nèi)，所 述宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生所需量的本發(fā)明的抗體。與本文所述的靶分子結(jié)合的本發(fā)明的抗體或者其片段、衍生物或類似物(例如抗 體的重鏈或輕鏈)的重組表達(dá)需要構(gòu)建包含編碼所述抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。編碼本 發(fā)明的抗體分子或者抗體的重鏈或輕鏈、或者其部分(優(yōu)選包含重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域) 的多核苷酸一經(jīng)獲得，便可以采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)用于產(chǎn)生所述 抗體分子的載體。因此，本文描述了通過(guò)表達(dá)包含編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來(lái)制 備蛋白質(zhì)的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體 包含抗體編碼序列、以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)。這些方法包括例如體外重組DNA技 術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。因此，本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，其包含與啟動(dòng)子可操作 地連接的、編碼本發(fā)明的抗體分子或者其重鏈或輕鏈、或重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸 序列。這種載體可以包含編碼所述抗體分子的恒定區(qū)的核苷酸序列(例如參見(jiàn)PCT公開(kāi)WO 86/05807 ；PCT公開(kāi)WO 89/01036 ；和美國(guó)專利號(hào)5，122，464)，并且所述抗體的可變結(jié)構(gòu)域 可以被克隆到這種載體中，用于表達(dá)完整的重鏈或輕鏈。術(shù)語(yǔ)“載體”或“表達(dá)載體”在本文中用于指根據(jù)本發(fā)明使用的載體，作為用于引入 到宿主細(xì)胞內(nèi)并在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需基因的媒介物。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，這 種載體可以容易地選自質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，與本發(fā)明相容的載體包含 選擇標(biāo)記物、有助于克隆所需基因的合適的限制性位點(diǎn)、以及進(jìn)入真核或原核細(xì)胞和/或 在真核或原核細(xì)胞中復(fù)制的能力。更通常的是，一旦制備出編碼C35、HER2、EGFR或IGFR抗體的單體亞單位的載體或 DNA序列，便可以將表達(dá)載體引入到合適的宿主細(xì)胞內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的 多種技術(shù)來(lái)完成質(zhì)粒向宿主細(xì)胞內(nèi)的引入。這些技術(shù)包括但不限于，轉(zhuǎn)染(包括電泳和電 穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、使用有包膜DNA的細(xì)胞融合、顯微注射以及使用完整病 毒感染。參見(jiàn) Ridgway, A. A. G. “ Mammalian Expression Vectors“ Vectors, Rodriguez 和 Denhardt，編輯，Butterworths，Boston，Mass.，第 24. 2 章，第 470-472 頁(yè)(1988)。通常， 向宿主內(nèi)引入質(zhì)粒經(jīng)由電穿孔。使包含表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞在適合于產(chǎn)生輕鏈和重鏈的 條件下生長(zhǎng)，并就重鏈和/或輕鏈蛋白質(zhì)的合成進(jìn)行測(cè)定。示例性的測(cè)定法技術(shù)包括酶聯(lián) 免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射性免疫測(cè)定法(RIA)、或熒光激活細(xì)胞分揀儀分析(FACS)、 免疫組織化學(xué)等。通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞，以產(chǎn)生在本文所述的方法中使用的抗體。因此，本發(fā)明包括宿主細(xì)胞，其包含編碼與異 源啟動(dòng)子可操作地連接的、本發(fā)明抗體或其片段或者其重鏈或輕鏈的多核苷酸。在用于表 達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)編碼重鏈和輕鏈的載體，用于表 達(dá)完整的免疫球蛋白分子，如下文所述。如本文所用，“宿主細(xì)胞”是指如下細(xì)胞，其包含采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一個(gè)異源基因的載體。在從重組宿主中分離抗體的過(guò)程的描述中，除非另有明確說(shuō)明，否則 術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可交換使用，以表示抗體的來(lái)源。換言之，從“細(xì)胞”中回收多 肽可以指從向下旋轉(zhuǎn)的完整細(xì)胞中，或從包含培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中。可以使用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)在本文所述的方法中使用的抗體分子。 這種宿主表達(dá)系統(tǒng)代表了通過(guò)其可以產(chǎn)生并隨后純化的目的編碼序列的媒介物，還代表 了這樣的細(xì)胞，當(dāng)使用合適的核苷酸編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，其可以原位表達(dá)本發(fā)明 的抗體分子。這些宿主表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于，微生物例如使用包含抗體編碼序列的重 組細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌、枯草桿菌 (B. subtilis))；使用包含抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如酵母菌 屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia))；使用包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載 體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；使用重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒 (cauliflower mosaic virus, CaMV)；煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV))感染 的、或者使用包含抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系 統(tǒng)；或者包含重組表達(dá)構(gòu)建體(其包含衍生自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫 蛋白啟動(dòng)子)或衍生自哺乳動(dòng)物病毒基因組的啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘病毒 7.5K啟動(dòng)子))的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如C0S、CH0、BLK、293、3T3細(xì)胞)。優(yōu)選地，使用專 門(mén)用于表達(dá)完整重組抗體分子的細(xì)菌細(xì)胞例如大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)，更優(yōu)選 地真核細(xì)胞，來(lái)表達(dá)重組抗體分子。例如，與載體例如來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的主要即刻早期基 因啟動(dòng)子結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，是用于抗體的有效的表達(dá)系 統(tǒng)(Foecking 等人，Gene 45:101(1986) ；Cockett 等人，Bio/Technology8 :2 (1990))。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞系通常是哺乳動(dòng)物來(lái)源的；相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員具 有優(yōu)先地確定具體的宿主細(xì)胞系的能力，所述宿主細(xì)胞系最適合于待在其中表達(dá)的所需基 因產(chǎn)物。示例性的宿主細(xì)胞系包括但不限于，CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)、DG44和DUXB11(中 國(guó)倉(cāng)鼠卵巢系，DHFR缺陷)、HELA(人宮頸癌)、CVI (猴腎系)、COS (具有SV40 T抗原的 CVI衍生物)、VERY、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)、MDCK、293、WI38、R1610(中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞)、 BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK (倉(cāng)鼠腎系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63_Ag3. 653 (小 鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI (人淋巴細(xì)胞)和293 (人腎)。宿主細(xì)胞系 通常可從商業(yè)機(jī)構(gòu)、美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心或公開(kāi)的文獻(xiàn)中獲得。此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)、或者以所需的特定方式修飾并加工基因產(chǎn) 物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的此類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對(duì)于所述蛋 白質(zhì)的功能是重要的。對(duì)于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾，不同的宿主細(xì)胞具有 特征性和特異性的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白質(zhì) 的正確修飾和加工。為此，可以使用如下真核宿主細(xì)胞，其具有用于初始轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)加 工，以及基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制。為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，穩(wěn)定地表達(dá)抗 體分子的細(xì)胞系可以是經(jīng)改造的。不使用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以使用由合適 的表達(dá)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等)和可選擇 標(biāo)記物調(diào)控的DNA來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在引入外源DNA之后，可以允許經(jīng)改造的細(xì)胞在富集 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)記物賦予針對(duì)選擇的抗性，并且允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到其染色體內(nèi)，并生長(zhǎng)以形成轉(zhuǎn)化灶(foci)， 該轉(zhuǎn)化灶依次可以被克隆并擴(kuò)展到細(xì)胞系內(nèi)?？梢杂欣厥褂迷摲椒▉?lái)改造穩(wěn)定表達(dá)抗體 分子的細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^(guò)載體的擴(kuò)增來(lái)提高抗體分子的表達(dá)水平(關(guān)于綜述，參見(jiàn)Bebbington 禾口 Hentschel， The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning， Academic Press， New York，第 3 卷.(1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物是可擴(kuò)增的時(shí)，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的 抑制劑的水平提高會(huì)增加標(biāo)記物基因的拷貝數(shù)。由于所擴(kuò)增的區(qū)域與抗體基因結(jié)合，所述 抗體的生產(chǎn)也增高(Grouse 等人，Mol. Cell. Biol. 3 :257(1983))。在體外生產(chǎn)允許按規(guī)模擴(kuò)大，以得到大量所需的多肽。用于在組織培養(yǎng)條件下培 養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括在例如氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器 中的均勻懸浮培養(yǎng)，或者在例如中空纖維、微囊中、瓊脂糖微珠或陶瓷筒上的固定化或截留 的細(xì)胞培養(yǎng)。必需和/或需要時(shí)，在例如合成鉸鏈區(qū)多肽的優(yōu)先生物合成之后、或在本文所 述的HIC色譜法步驟之前或之后，可以通過(guò)常規(guī)的色譜方法(例如凝膠過(guò)濾、離子交換色譜 法、經(jīng)過(guò)DEAE纖維素的色譜法或(免疫)親和色譜法)來(lái)純化多肽溶液。編碼在本發(fā)明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR抗體或者其抗原結(jié)合片段、 變體或衍生物的基因還可以在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞中表達(dá)。容易攝 取核酸的細(xì)菌包括腸桿菌科的成員，例如大腸埃希桿菌或沙門(mén)氏菌屬的菌株；芽孢桿菌科 的成員，例如枯草桿菌；肺炎球菌屬(Pneumococcus)的成員；鏈球菌屬(Str印tococcus) 的成員以及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) 0應(yīng)該進(jìn)一步理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá) 時(shí)，該異源多肽通常成為包涵體的一部分。必須將異源多肽分離、純化，然后組合成功能分 子。當(dāng)需要抗體的四價(jià)形式時(shí)，隨后將亞單位自組合成四價(jià)抗體(W002/096948A2)。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)對(duì)于所表達(dá)的抗體分子預(yù)期的用途來(lái)有利地選擇多種表 達(dá)載體。例如，當(dāng)準(zhǔn)備產(chǎn)生大量此類蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生抗體分子的藥物組合物時(shí)，指導(dǎo)融合蛋 白質(zhì)產(chǎn)物(其易于純化)的高水平表達(dá)的載體是理想的。這種表達(dá)載體包括但不限于，大 腸桿菌表達(dá)載體PUR278 (Ruther等人，EMBO J. 2 :1791 (1983))，其中可以將抗體編碼序列 個(gè)別地連接到所述載體的IacZ編碼區(qū)域的框架中，從而產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)；pIN載體(Inouye & Inouye， Nucleic AcidsRes. 13 3101-3109(1985) ；Van Heeke & Schuster， J. Biol. Chem. 24:5503-5509(1989))等。還可以使用pGEX載體表達(dá)作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)的融合蛋白質(zhì)的外源多肽。通常，這種融合蛋白質(zhì)是可溶的，并且可以通過(guò)吸附并結(jié) 合到基質(zhì)谷胱甘肽瓊脂糖珠子上、然后通過(guò)在游離谷胱甘肽的存在下洗脫，從裂解細(xì)胞中 容易地純化。PGEX載體經(jīng)設(shè)計(jì)以包含凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)，使得可以從GST部 分中釋放經(jīng)克隆的靶基因產(chǎn)物。除了原核生物外，還可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常使用的是釀酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見(jiàn)的面包酵母，但是許多其他菌株(例如巴斯德畢 赤酵母(Pichia pastoris))通常也可以利用。對(duì)于在酵母菌屬中的表達(dá)，通常使用例如質(zhì)粒YRp7 (Stinchcomb等人， Nature 282 39(1979) ；Kingsman 等人，Gene 7 141 (1979) ；Tschemper 等人，Gene 10 157(1980))。這種質(zhì)粒已經(jīng)包含了 TRPl基因，該基因提供了關(guān)于缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的酵母突變株(例如ATCC編號(hào)44076或PEP4-1)的選擇標(biāo)記物(Jones, Genetics 85 12(1977))。那么，作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征的trpl損傷的存在提供了通過(guò)在不存在 色氨酸的情況下生長(zhǎng)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，通常使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病 毒(AcNPV)作為表達(dá)外源基因的載體。該病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì) 胞中生長(zhǎng)?？梢詫⒖贵w編碼序列個(gè)別地克隆到所述病毒的非必需區(qū)域(例如多角體蛋白基 因)內(nèi)，并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的調(diào)控之下。一旦在本發(fā)明的方法中使用的抗體分子已被重組表達(dá)，它便可以通過(guò)本領(lǐng)域已知 用于純化免疫球蛋白分子的任何方法(例如色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法，特 別是在蛋白質(zhì)A后通過(guò)對(duì)于特異性抗原的親和力)以及分子篩柱色譜法)、離心、差異溶解 或通過(guò)用于純化蛋白質(zhì)的任何其他標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù))進(jìn)行純化。備選地，用于增加本發(fā)明抗體 的親和力的優(yōu)選方法在US 2002/0123057 Al中公開(kāi)。W .使用包括抗C35抗體的聯(lián)合療法的治療方法本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的抗體的組合治療過(guò)度增殖性疾病例如治療癌癥的方法。 在一些實(shí)施方案中，施用至少一種抗C35抗體和至少一種抗HER2抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方 案中，施用一種抗C35抗體和一種抗HER2抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，抗C35抗體 是1Β3或1F2或其變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在其 他實(shí)施方案中，可以施用至少一種抗C35抗體和至少一種抗EGFR抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方 案中，施用一種抗C35抗體一種抗EGFR抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，抗C35抗體是 1Β3或1F2或其變體或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在一個(gè) 具體實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在其他實(shí)施方案中，施用2種或更多種抗C35抗體和/或2種或更多種抗HER2和 /或2種或更多種抗EGFR抗體。在其他實(shí)施方案中，一種或多種抗IGFR抗體與一種或多種 抗C35抗體相組合進(jìn)行施用。此外，在另外的實(shí)施方案中，任何前述抗體組合與治療性試劑 一起施用。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，治療性試劑是化療劑。在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中， 化療劑是紫杉醇。在另一個(gè)更特別的實(shí)施方案中，化療劑是阿霉素。在另一特別實(shí)施方案 中，化療劑是順鉬。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，治療性試劑是放射。在一個(gè)具體實(shí)施方案 中，癌癥是乳腺癌。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在其中施用針對(duì)特定多肽的至少2種抗體的實(shí)施方案中(例如2種抗C35、2種抗 HER2、2種抗EGFR和/或2種抗IGFR抗體)，抗體可以各自與多肽內(nèi)的不同表位結(jié)合。例 如，對(duì)于C35，一種抗體可以與位于C35(SEQ ID NO 2)的第105-115殘基內(nèi)的表位結(jié)合，而 另一種可以結(jié)合位于C35 (SEQ ID NO 2)的第48-104殘基內(nèi)的表位。在一個(gè)特別的實(shí)施方 案中，結(jié)合在C35的這些區(qū)域內(nèi)的表位的C35抗體是1B3和1F2、或其變體或衍生物(例如 人源化1B3和/或人源化1F2)。本發(fā)明還包括施用與相同表位結(jié)合的兩種抗體。例如，可以施用與位于C35 (SEQ ID NO 2)的第105-115殘基內(nèi)的表位結(jié)合的兩種不同的C35抗體。類似地，可以施用與位 于C35(SEQ ID NO 2)的第48-104殘基內(nèi)的表位結(jié)合的兩種不同的C35抗體。在一些實(shí)施方案中，基于其與C35、HER2或EGFR多肽或其片段，或C35、HER2或 EGFR變體多肽結(jié)合的能力，可以選擇在本發(fā)明的方法中使用的抗體，其具有特征在于小于參照單克隆抗體的Kd的解離常數(shù)(Kd)的親和力。本發(fā)明包括本文所公開(kāi)的所有C35、HER2 或EGFR抗體作為用于這些實(shí)施方案中的參照單克隆抗體。在具體的實(shí)施方案中，如本文 以及美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0158323A1和20040063907A1 (通過(guò)引用整體合并入本文)中所 公開(kāi)的單克隆抗體1B3和1F2為參照抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述參照單克隆抗體為 MAbl63，如共同未決的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/812，996 (通過(guò)引用整體合并入本文)中公開(kāi)的。因 此，在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種C35抗體與C35多肽或其片段、或者C35變體多肽 結(jié)合，具有特征在于小于MAb lB3、MAb 1F2或MAb 163的Kd的解離常數(shù)(Kd)的親和力。此 外，在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的抗C35抗體結(jié)合與參照抗體相同的表位，特別是 公開(kāi)于美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0158323A1和20040063907A1以及美國(guó)申請(qǐng)?zhí)栔?1/812,996 中的那些抗C35抗體(例如MAb lB3、MAb 1F2或MAb 163)。在另一特別實(shí)施方案中，抗EGFR抗體西妥昔單抗是參照抗體。因此，在一些實(shí)施 方案中，一種或多種抗EGFR抗體與EGFR多肽或其片段、或者EGFR變體多肽結(jié)合，具有特征 在于小于西妥昔單抗的Kd的解離常數(shù)(Kd)的親和力。在另一特別實(shí)施方案中，抗HER2抗 體曲妥珠單抗是參照抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，一種或多種抗HER2抗體與HER2多肽 或其片段、或者HER2變體多肽結(jié)合，具有特征在于小于曲妥珠單抗的Kd的解離常數(shù)(Kd)的 親和力。在其他實(shí)施方案中，基于其與IGFR多肽或其片段，或者IGFR變體多肽結(jié)合的能 力，可以選擇在本發(fā)明的方法中使用的抗體，其具有特征在于小于參照單克隆抗體的Kd的 解離常數(shù)(Kd)的親和力，所述參照單克隆抗體與IGFR特異性結(jié)合。IGFR抗體的實(shí)例包括 如美國(guó)專利號(hào) 7，217，796 中描述的 1H3、15H12、19D12、15H12/19D12 LCA、15H12/19D12 LCB、 15H12/19D12 LCC、15H12/19D12 LCD、15H12/19D12 LCE、15H12/19D12 LCF、15H12/19D12 HCA 或 15H12/19D12 HCB ; α-IR3 (Kull 等人，J. Biol Chem. 258 :6561 (1983)) ； lH7(Li 等 人’ Biochem. Biophys. Res. Comm. 196 :92_98 (1993), SantaCruz biotechnology, Inc. Santa Cruz, Calif.)禾口 MAB391(R&D Systems ；Minneapolis, Minn.)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將一種抗C35抗體和一種抗HER2抗體連同或不 連同另外的治療性試劑一起施用，所述另外的治療性試劑用于治療過(guò)度增殖性疾病例如癌 癥。與C35或HER2特異性結(jié)合的任何抗體包括但不限于本文公開(kāi)的那些，可以在這種方法 中使用。在一些實(shí)施方案中，抗體在治療性試劑的施用之前、之后或同時(shí)施用。在一個(gè)實(shí)施 方案中，MAb 1F2或1B3與曲妥珠單抗和治療性制劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性 試劑是選自紫杉醇、阿霉素和順鉬的化療劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一 個(gè)更具體的實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將一種抗C35抗體和一種抗EGFR抗體連同或不 連同另外的治療性試劑一起施用，所述另外的治療性試劑用于治療過(guò)度增殖性疾病例如癌 癥。與C35或EGFR特異性結(jié)合的任何抗體包括但不限于本文公開(kāi)的那些，可以在這種方法 中使用。在一些實(shí)施方案中，抗體在治療性試劑的施用之前、之后或同時(shí)施用。在一個(gè)實(shí)施 方案中，MAb 1F2或1B3與西妥昔單抗和治療性制劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性 試劑是選自紫杉醇、阿霉素和順鉬的化療劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一 個(gè)更具體的實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將一種抗C35抗體和一種抗IGFR抗體連同或不連同另外的治療性試劑一起施用，所述另外的治療性試劑用于治療過(guò)度增殖性疾病例如癌 癥。與C35或IGFR特異性結(jié)合的任何抗體包括但不限于本文公開(kāi)的那些，可以在這種方法 中使用。在一些實(shí)施方案中，抗體在治療性試劑的施用之前、之后或同時(shí)施用。在一個(gè)實(shí)施 方案中，MAb 1F2或1B3與西妥昔單抗和治療性制劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性 試劑是選自紫杉醇、阿霉素和順鉬的化療劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一 個(gè)更具體的實(shí)施方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在一些實(shí)施方案中，上述C35/HER2或C35/EGFR聯(lián)合療法與IGFR抗體一起施用。 C35/HER2/IGFR或C35/EGFR/IGFR抗體組合物可以連同或不連同治療性試劑的施用一起施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將至少2種C35抗體和1種HER2抗體與治療性試 劑一起施用。在其他實(shí)施方案中，至少2種C35抗體和至少2種HER2抗體與治療性試劑一 起施用。可以施用C35和HER2抗體的任何組合，并且所有組合都包括在本發(fā)明中。在一些 優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括將至少2種C35抗體和1種EGFR抗體與治療性試劑一起施用。 在其他實(shí)施方案中，至少2種C35抗體和至少2種EGFR抗體與治療性試劑一起施用?？梢?施用C35和EGFR抗體的任何組合，并且所有組合都包括在本發(fā)明中。本發(fā)明中還包括的是 與彼此和治療性試劑(例如化療劑)相組合的這些抗體中任何一種的變體(例如人源化形 式、親和力優(yōu)化的形式)或衍生物的施用。本發(fā)明中還包括的是包含連同或不連同治療性 試劑的抗體組合的組合物。在其中患有癌癥的受試者為人的實(shí)施方案中，施用的抗體優(yōu)選為全人的或完全人 源化的。這些人源化抗體可以包括本文所公開(kāi)的任何抗體的人源化形式，例如1F2和/或 1B3的人源化形式。此外，包括但不限于1B3和1F2的抗體的親和力優(yōu)化形式也包括在本發(fā) 明內(nèi)。本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療過(guò)度增殖性疾病、病癥和/或病狀，包括贅 生物?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法治療的過(guò)度增殖性疾病、病癥和/或病狀的實(shí)例包括但不限 于位于以下器官中的贅生物前列腺、結(jié)腸、腹、骨、乳腺、消化系統(tǒng)、肝、胰腺、腹膜、內(nèi)分泌 腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭與頸、神經(jīng)(中樞神經(jīng)和外周 神經(jīng))、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾、胸和泌尿生殖器。此類增殖性病癥的其他實(shí)例包括，但不限于急性兒童成淋巴細(xì)胞性白血病、急性 成淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人(原 發(fā)性)肝細(xì)胞癌、成人(原發(fā)性)肝癌、成人急性淋巴細(xì)胞性白血病、成人急性髓性白血病、 成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴細(xì)胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原 發(fā)性肝癌、成人軟組織肉瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、AIDS相關(guān)惡性腫瘤、肛門(mén)癌、星形細(xì)胞瘤、 膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、乳腺癌、腎盂和輸尿管癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原 發(fā)性)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤、宮頸癌、兒童(原 發(fā)性)肝細(xì)胞癌、兒童(原發(fā)性)肝癌、兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病、兒童急性髓性白血 病、兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童小腦星形細(xì)胞瘤、兒童大腦星形細(xì)胞瘤、兒童顱外生殖細(xì)胞 瘤、兒童霍奇金病、兒童霍奇金淋巴瘤、兒童下丘腦和視覺(jué)通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童成淋巴細(xì) 胞性白血病、兒童成髓細(xì)胞瘤、兒童非霍奇金淋巴瘤、兒童松果體和幕上原始神經(jīng)外胚瘤、 兒童原發(fā)性肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視覺(jué)通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、內(nèi)分泌胰腺胰島細(xì) 胞癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤及相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、顱 外生殖細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇病(Gaucher’ s Disease)、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、多 毛細(xì)胞白血病、頭與頸癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙種球蛋白血癥、下咽癌、 腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞胰腺癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、 肝癌、肺癌、淋巴組織增殖性病癥、巨球蛋白血癥、男性乳腺癌、惡性間皮瘤、惡性胸腺瘤、成 髓細(xì)胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性隱性原發(fā)性鱗狀頸癌、轉(zhuǎn)移性原發(fā)性鱗狀頸癌、轉(zhuǎn)移性鱗 狀頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤、骨髓發(fā)育不良綜合征、髓細(xì)胞性白血病、 髓性白血病、骨髓增生紊亂、鼻腔及鼻旁竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、懷孕期非霍奇金淋巴 瘤、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌、隱性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌、口咽癌、骨/惡性纖維肉 瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖 細(xì)胞腫瘤、卵巢低度潛在惡性腫瘤、胰腺癌、副蛋白血癥、紫癜、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì) 胞瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、前列腺 癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、結(jié)節(jié)病肉 瘤(Sarcoidosis Sarcomas)、塞扎里(Sezary)綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組 織肉瘤、鱗狀頸癌、胃癌、幕上原始神經(jīng)外胚瘤和松果體瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、 甲狀腺癌、腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌、移行腎盂和輸尿管癌、滋養(yǎng)細(xì)胞瘤、輸尿管和腎盂細(xì) 胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、視覺(jué)通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、外陰癌、瓦爾登斯 特倫(Waldenstrom' s)巨球蛋白血癥、韋氏(Wilms)腫瘤、以及位于上述器官系統(tǒng)中除了 瘤形成以外的任何其它過(guò)度增殖性疾病。在一些具體的實(shí)施方案中，所述過(guò)度增殖性病癥為選自乳腺、膀胱、肝、結(jié)腸、卵巢 和皮膚的組織或器官的癌癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一個(gè)更具體的實(shí)施 方案中，乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。在一些實(shí)施方案中，過(guò)度增殖性病癥是上述癌癥之一的轉(zhuǎn)移?？梢允褂帽景l(fā)明的方法和組合物來(lái)治療惡化前的病狀并預(yù)防發(fā)展到腫瘤或惡性 狀態(tài)，包括但不限于上文所述的那些病癥。在已知或者懷疑向贅生物或癌癥發(fā)展之前的情 況下，特別是在其中由增生、化生或最特別地發(fā)育不良組成的非贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)已經(jīng)發(fā)生 的情況下，適用此類用途(關(guān)于這種異常生長(zhǎng)情況的綜述，參見(jiàn)Robbins和Angell，1976， Basic Pathology,% 2 片反，W. B. Saunders Co.，Philadelphia,% 68-79 頁(yè))。增生是受控的細(xì)胞增殖形式，涉及組織或器官中細(xì)胞數(shù)目的增加，而無(wú)結(jié)構(gòu)或功 能中的明顯改變。可以通過(guò)本發(fā)明的方法治療的增生病癥包括但不限于，血管濾泡性縱隔 淋巴結(jié)增生、血管淋巴樣增生伴嗜酸性粒細(xì)胞增多、非典型黑素細(xì)胞增生、基底細(xì)胞增生、 良性巨淋巴結(jié)增生、牙骨質(zhì)增生、先天性腎上腺增生、先天性皮脂增生、囊性增生、乳腺囊性 增生、義齒性增生、導(dǎo)管增生、子宮內(nèi)膜增生、纖維肌性增生、局灶性上皮增生、牙齦增生、炎 性纖維增生、炎性乳頭狀增生、血管內(nèi)乳頭狀內(nèi)皮增生、前列腺結(jié)節(jié)性增生、結(jié)節(jié)性再生性 增生、假性上皮瘤樣增生、老年皮脂腺增生和疣狀增生?；鞘芸氐募?xì)胞生長(zhǎng)形式，其中一種類型的成體或完全分化的細(xì)胞取代了另一 種類型的成體細(xì)胞。可以通過(guò)本發(fā)明的方法治療的化生病癥包括但不限于原因不明性髓 樣化生、頂漿分泌腺化生、非典型化生、自體實(shí)質(zhì)化生(autoparenchymatous metaplasia)、結(jié)締組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、化生性骨化、化生性息肉、髓樣化生、原發(fā)性 髓樣化生、繼發(fā)性髓樣化生、鱗狀化生、羊膜的鱗狀化生以及癥狀性髓樣化生。發(fā)育不良通常為一種癌癥前兆，并且主要在上皮中發(fā)現(xiàn)；其為一種最混亂形式的 非贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)，涉及個(gè)別細(xì)胞均一性和細(xì)胞組構(gòu)方向的喪失。發(fā)育不良的細(xì)胞通常具 有異常大的、染色深的核，并且表現(xiàn)出多形性。發(fā)育不良特征性地出現(xiàn)在其中存在慢性刺 激或炎癥的地方。可以通過(guò)本發(fā)明的方法治療的發(fā)育不良病癥包括但不限于無(wú)汗性外 胚層發(fā)育不良、異側(cè)(anterofacial)發(fā)育不良、窒息性胸廓發(fā)育不良、心房-手指發(fā)育不 良、支氣管肺發(fā)育不良、大腦發(fā)育不良、宮頸發(fā)育不良、軟骨外胚層發(fā)育不良、鎖骨顱骨發(fā)育 不良、先天性外胚層發(fā)育不良、顱骨骨干(craniodiaphysial)發(fā)育不良、顱腕跖骨發(fā)育不 良、顱骨干骺端(craniometaphysial)發(fā)育不良、牙本質(zhì)發(fā)育不良、骨干發(fā)育不良、外胚層 發(fā)育不良、牙釉質(zhì)發(fā)育不良、腦性眼球發(fā)育不良、偏側(cè)骨骺發(fā)育不良、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、 點(diǎn)狀骨骺發(fā)育不良、上皮發(fā)育不良、面-指-生殖器(faciodigitogenital)發(fā)育不良、家 族性頌骨纖維性發(fā)育不良、家族性白色皺褶性發(fā)育不良、纖維肌性發(fā)育不良、骨纖維性發(fā) 育不良、旺盛骨性發(fā)育不良、遺傳性腎-視網(wǎng)膜性發(fā)育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、有汗性外胚層發(fā)育不良、少汗性外胚層發(fā)育不良、淋巴細(xì)胞減少性胸腺發(fā)育 不良、乳房發(fā)育不良、下頌面骨發(fā)育不良、干骺端發(fā)育不良、Mondini發(fā)育不良、單骨性纖維 性發(fā)育不良、粘液上皮發(fā)育不良(muco印ithelial dysplasia)、多發(fā)性骺發(fā)育不良、眼耳 脊椎發(fā)育不良、眼-齒-指發(fā)育不良、眼椎骨發(fā)育不良、牙源性發(fā)育不良、眼下頌支發(fā)育不 良、根尖周牙骨質(zhì)發(fā)育不良、多骨纖維性發(fā)育不良、假性軟骨發(fā)育不全性脊椎骺發(fā)育不良 (pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、視網(wǎng)膜發(fā)育不良、中隔-視神 經(jīng)發(fā)育不良、脊椎Ife (spondyloepiphysial)發(fā)育不良以及ventriculoradial)發(fā)育不良。可以通過(guò)本發(fā)明的方法和組合物治療的其他腫瘤發(fā)生前病癥包括但不限于，良性 增殖障礙(dysproliferative)病癥(例如良性腫瘤、纖維囊性病狀、組織肥大、腸息肉、 結(jié)腸息肉和食道發(fā)育不良)、黏膜白斑病、角化病、鮑恩氏(Bowen’ s)病、慢性光化性皮炎 (Farmer' s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于抑制癌癥(特別是上文所列出 的那些癌癥)的生長(zhǎng)、進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療、抑制癌癥的生長(zhǎng)、進(jìn)展 和/或轉(zhuǎn)移，所述癌癥特別是選自乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑
素瘤的癌癥。治療過(guò)度增殖性疾病而施用的一種或多種抗體可以任選與能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的 試劑一起施用。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法包括化療劑(也稱為抗腫瘤試劑)、放射療法、以及放射 療法與化學(xué)療法的組合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療過(guò)度增殖性疾病(例如癌癥)而施用的本發(fā)明的 抗體與化療劑一起施用。例如，本發(fā)明包括治療癌癥的方法，其包括將至少一種C35抗體和 至少一種HER2抗體與治療性試劑一起施用，以及將至少一種C35抗體和至少一種EGFR抗 體與治療性試劑一起施用。示例性的治療性試劑為長(zhǎng)春花生物堿、表鬼白毒素、蒽環(huán)類抗生素、放線菌素D、普 卡霉素、嘌呤霉素、短桿菌肽D、紫杉醇(Taxol .，Bristol Myers Squibb)、秋水仙堿、細(xì)胞松弛素B、依米丁、美坦辛和安吖啶(或者"mAMSA")。長(zhǎng)春花生物堿類別在Goodman和 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Therapeutics (第 7 版)，(1985),第 1277-1280 頁(yè)中描述。長(zhǎng)春花生物堿的實(shí)例為長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春地辛。表鬼白毒素類別在 Goodman 禾口 Gilman 的 ThePharmacological Basis of Therapeutics (第 7 片反)，(1985)， 第1280-1281頁(yè)中描述。表鬼臼毒素的實(shí)例為依托泊苷、依托泊苷鄰醌和替尼泊苷。蒽環(huán) 類抗生素類另 1J在 Goodman 禾口 Gilman 的 The PharmacologicalBasis of Therapeutics (第 7版)，(1985)，第1283-1285頁(yè)中描述。蒽環(huán)類抗生素的實(shí)例為柔紅霉素、多柔比星、米 托蒽醌和比生群(bisanthrene)。放線菌素D，還稱為更生霉素，在Goodmand和Gilman 白勺 The Pharmacological Basis of Therapeutics(H 7 片反)，(1985),第 1281-1283 M 中描述。普卡霉素，還稱為光神霉素，在Goodmand和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1287-1288頁(yè)中描述。其他化療劑包括順 鉬(Platinol .，Bristol Myers Squibb)、卡鉬(Paraplatin .，BristolMyers Squibb)、 絲裂霉素(Mutamycin . ,Bristol Myers Squibb)、六甲蜜胺(Hexalen , U. S. Bioscience, Inc.)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan ，Bristol Myers Squibb)、洛莫司汀(CCNU) (CeeNU Bristol MyersSquibb)、卡莫司汀(BCNU) (BiCNU , Bristol Myers Squibb)。
示例性的化療劑還包括阿克拉霉素A、阿柔比星、阿克羅寧、山油柑堿、亞德里亞 霉素(adriamycin)、阿地白介素(白細(xì)胞介素_2)、六甲蜜胺(hexamiethylmelamine)、氨 魯米特、氨魯米特(cytadren)、氨基咪唑甲酰胺、安吖啶(m_AMSA ；胺苯吖啶)、阿那曲唑 (anastrazole)(瑞寧得)、環(huán)胞苷、anthracyline、安曲霉素、天冬酰胺酶(優(yōu)適寶)、阿扎 胞苷、阿扎胞苷(拉達(dá)卡霉素)、氮鳥(niǎo)嘌呤、重氮絲氨酸、阿扎尿苷、1，1'，1" _噻替派(P hosphinothioylidynetrisaziridine), azirino (2 ‘，3' 3,4)吡咯并(l，2_a)吲哚 _4， 7-二酮、BCG(theraCys)、BCNU、BCNU氯乙基亞硝基脲、苯甲酰胺、4-(雙(2-氯乙基)氨 基)苯丁酸、比卡魯胺、二氯乙基亞硝基脲、博來(lái)霉素、博來(lái)霉素(blenozane)、博來(lái)霉素類、 溴脫氧尿苷、溴尿苷、白消安(馬利蘭)、氨基甲酸乙酯、卡鉬、卡鉬(伯爾定)、卡莫司汀、卡 莫司汀(BCNU;BiCNU)、苯丁酸氮芥(瘤可寧)、氯乙基亞硝基脲、氯脲菌素(chorozotocin) (DCNU)、色霉素A3、順式視黃酸、順鉬(cis-ddpl ；順氯氨鉬)、克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷； 2cda;克拉立平)、助間型霉素、環(huán)亮氨酸、環(huán)磷酰胺、無(wú)水環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿糖胞 苷、阿糖胞苷、阿糖胞苷HCl(cyt0Sar-U)、2-脫氧-2-(((甲基亞硝胺)羰基)氨基)_D_葡 萄糖、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D(Cosmegen)、柔紅霉素、柔紅霉素HCl (紅比霉素)、氮烯咪胺、 氮烯咪胺(DTIC-dome)、秋水仙胺、地塞米松、二去水衛(wèi)矛醇、重氮亮氨酸、己烯雌酚、多西他 賽(泰索帝)、亞德利亞霉素HCl (阿霉素)、鹽酸多柔比星、依洛尼塞、雌莫司汀、雌莫司汀 磷酸鈉(emcyt)、乙碘油、依托格魯、氨基甲酸乙酯、甲基磺酸乙酯、依托泊苷(VP16-213)、 味甲酰酚胺、氟尿苷、氟尿苷(fudr)、氟他拉濱(福達(dá)華)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟甲睪酮 (halotestin)、氟他胺、氟他米特(氟他胺)、氟尿苷(fluxuridine)、硝酸鎵(花崗巖)、吉 西他濱(健擇)、染料木黃酮、2-脫氧-2-(3-甲基-3-nitr0S0ureid0)-D-吡喃葡萄糖、戈 舍瑞林(諾雷德)、己烷雌酚、羥基脲(hydra)、伊達(dá)比星(idamycin)、ifosfagemcitabine、 異環(huán)磷酰胺(丁福明)、異環(huán)磷酰胺和美司鈉(MAID)、干擾素、干擾素α、干擾素α _2a、干 擾素α _2b、干擾素α-n3、白細(xì)胞介素-2、碘芐胍、碘芐胍碘芐胍、依立替康(camptosar)、 異維甲酸(accutane)、酮康唑、4_( 二(2_氯乙基)氨基)_L_苯丙氨酸、L-絲氨酸重氮基乙酸酯、香菇多糖、甲酰四氫葉酸、乙酸亮丙瑞林(LHRH-類似物)、左旋咪唑(ergamisol)、 洛莫司汀(CCNU;Cee-NU)、甘露莫司汀、美坦辛、氮芥、氮芥HCl (氮芥)、乙酸甲羥孕酮(普 維拉、狄波普維拉)、乙酸甲地孕酮(menace)、乙酸美侖孕酮、美法侖(愛(ài)克蘭)、美諾立爾、 巰嘌呤、巰嘌呤(巰基嘌呤)、無(wú)水巰嘌呤、MESNA、美司鈉(mesne)、甲磺酸乙酯、氨甲喋呤 (mtx;氨甲喋呤)、賽氮芥、含羞草堿、米索硝唑、光輝霉素、米托蒽醌、二溴甘露醇、米托胍 腙、二溴衛(wèi)矛醇、絲裂霉素(突變霉素)、絲裂霉素C、米托坦(0，p' -DDD ；lysodren)、米托 蒽醌、米托蒽醌HCl (諾消靈)、莫哌達(dá)醇、N，N-雙(2-氯乙基)四氫-2H-1，3，2-氧氮雜 膦-2-胺-2-氧化物、N- (1-甲基乙基)-4- ((2-甲基胼基)甲基)苯甲酰胺、N-甲基-雙 (2-氯乙基)胺、尼卡地平、尼魯米特(nilandron)、尼莫司汀、硝氨丙吖啶、氮芥、諾考達(dá)唑、 諾拉霉素、奧曲肽(善得寧)、紫杉醇(泰素)、紫杉醇、密旋霉素、培門(mén)冬酶(PEGx-I)、噴司 他丁(2'-脫氧助間型霉素)、培洛霉素、苯丙氨酸芥肽、光泳(photophoresis)、普卡霉素 (mithracin)、溶鏈菌制劑、哌泊溴烷、普卡霉素、普達(dá)非洛、鬼臼毒素、泊非霉素、潑尼松、丙 卡巴胼、丙卡巴胼HCl (甲苯胼)、螺丙醇、嘌呤霉素、氨基核苷嘌呤霉素、PUVA(補(bǔ)骨脂素+ 紫外線a)、吡喃共聚物、雷帕霉素、S-氮胞苷、2，4，6_三(1-氮丙啶基)-s-三嗪、司莫司汀、 焦土霉素、西羅莫司、鏈脲霉素(鏈佐星)、舒拉明、檸檬酸他莫昔芬(諾瓦得士)、taxon、 喃氟啶、替尼泊苷(VM-26 ；威猛)、替奴佐酸、TEPA、睪內(nèi)酯、噻替哌、硫鳥(niǎo)嘌呤、噻替哌 (thioplex)、替洛隆、拓?fù)涮婵?、維甲酸(vesanoid)、三亞胺醌、木霉素、環(huán)氧甘醚、三乙烯三 聚氰胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺、曲美沙特(三甲曲沙)、三(1-氮丙啶基) 氧化膦、三(1-氮丙啶基)硫化膦、三(氮丙啶基)_對(duì)-苯醌、三(氮丙啶基)硫化膦、尿嘧 啶氮芥、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、長(zhǎng)春堿、硫酸長(zhǎng)春堿(velban)、硫酸長(zhǎng)春新堿(安可平)、 長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、酒石酸長(zhǎng)春瑞濱(諾維本)、(1)_含羞草堿、1-(2_氯乙基)-3-(4_甲 基環(huán)己基)-1-亞硝基脲、(8S-順式)-10- ((3-氨基-2，3，6-三脫氧-α -L-來(lái)蘇-己吡喃 基)氧)-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥基乙酰基)-1_甲氧基_5，12-萘并萘 二酮、131-間碘芐胍(1-131 1086)、5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-1!1-咪唑-4-甲酰胺、 5-( 二 (2-氯乙基)氨基)-2，4(1禮3!1)-嘧啶二酮、2，4，6-三(1_氮丙啶基)_s_噻嗪、2， 3，5-三(1-氮丙啶基)-2，5-環(huán)己二烯-1，4- 二酮、2-氯-N- (2-氯乙基)-N-甲基乙胺、N， N-二(2-氯乙基)四氫-2H-1，3，2-氧氮雜膦-2-胺-2-氧化物、3-去氮雜尿苷、3-碘代 芐基胍、5，12-萘并萘二酮、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、(laS，8S，8aR, 8bS) -6-氨基_8_ (((氨 基羰基)氧)甲基)-1，1 2，8，83，813-六氫-8『甲氧基-5-甲基擬11^110(2' ,3' :3，4) 吡咯并(l，2-a)吲哚_4，7-二酮、6-阿扎尿苷、6-巰嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤及其組合。在具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的化療劑為紫杉醇。在另一具體的 實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的化療劑為阿霉素。優(yōu)選的治療性試劑及其組合可以作為細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)療法進(jìn)行施用，所述細(xì)胞凋 亡的誘導(dǎo)療法包括多柔比星和多西他賽、拓?fù)涮婵?、紫杉?泰素)、卡鉬和泰素、順鉬和放 射、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU和放射、泰素帝(Toxotere)、氟達(dá)拉濱、Ara C、依托泊苷、長(zhǎng)春 新堿和長(zhǎng)春堿。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑是順鉬?？梢栽诒景l(fā)明的方法中施用的化學(xué)劑包括但不限于，抗生素衍生物(例如，多柔 比星、博來(lái)霉素、柔紅霉素和更生霉素)；抗雌激素藥(例如，他莫昔芬)；抗代謝藥(例如， 氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干擾素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巰嘌呤和6-硫鳥(niǎo)嘌呤)；細(xì)胞毒素劑(例如，卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、胞嘧啶阿糖核苷、環(huán)磷酰胺、雌 莫司汀、羥基脲、丙卡巴胼、絲裂霉素、白消安、順鉬和硫酸長(zhǎng)春新堿)；激素(例如，甲羥孕 酮、磷雌氮芥、乙炔基雌二醇、雌二醇、乙酸甲地孕酮、甲睪酮、二乙基己烯雌酚雙磷酸酯、氯 烯雌醚和睪內(nèi)酯)；氮芥衍生物(例如，美法侖、苯丁酸氮芥(氮芥)和噻替哌)；類固醇和 組合(例如，倍他米松磷酸鈉)；和其它(例如，達(dá)卡巴嗪、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸長(zhǎng)春新 堿、硫酸長(zhǎng)春堿和依托泊苷)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑 尼松)或者與CHOP組分的任何組合相組合施用。表2 用于主要癌癥適應(yīng)癥的通常使用的化療藥品 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及施用至少一種C35抗體和至少一種HER2抗 體及治療性放射。在其他實(shí)施方案中，該方法涉及施用至少一種C35抗體和至少一種EGFR 抗體及治療性放射。任選地，這些方法還可以包括施用化療劑。例如，在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明可以包括將至少一種C35抗體和至少一種HER2抗體與化療劑或治療性放射一起施 用。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括將至少一種C35抗體和至少一種EGFR抗體與化療 劑或治療性放射一起施用。治療性放射包括例如分割放射療法、非分割放射療法、超分割放射療法、以及組合 放射和化學(xué)療法。放射的類型還包括電離(Y)放射、粒子放射、低能透射(LET)、高能透射 (HET)、紫外線放射、紅外線放射、可見(jiàn)光放射以及光敏放射。如本文所用，化學(xué)療法包括使 用單一化療劑、或者試劑的組合的治療。在需要治療的受試者中，化學(xué)治療可以與手術(shù)治療 或放射療法，或者與其他抗腫瘤治療形式相組合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或其組合與抗病毒試劑組合施用?？梢?與本發(fā)明的抗體一起施用的抗病毒試劑包括但不限于，阿昔洛韋、病毒唑、金剛烷胺和金剛 焼乙胺(remantidine)。本發(fā)明的抗體或其組合還可以與止吐劑及其組合一起施用，所述止吐劑例如 2-(乙基硫代)-10-(3-(4_甲基-1-哌嗪基)丙基)-10H-吩噻嗪(乙基硫代培拉嗪)、 1_(對(duì)-氯-α-苯基芐基)-4_(間-甲基芐基)_哌嗪(美克洛嗪，氯苯甲嗪)等等。本發(fā)明的多核苷酸和多肽還可以與本文公開(kāi)或者本領(lǐng)域已知的其他治療劑及其組合一起施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體或其組合相組合施用的常規(guī)的非特異性免疫抑制劑包括 但不限于，類固醇、環(huán)孢霉素、環(huán)孢霉素類似物、環(huán)磷酰胺、甲潑尼松、潑尼松、硫唑嘌呤、 FK-506U5-去氧精胍啉(15-deoxyspergualin)和通過(guò)抑制響應(yīng)T細(xì)胞的功能來(lái)起作用的 其他免疫抑制試劑。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其組合與免疫抑制劑相組合施用?？?以與本發(fā)明的抗體一起施用的免疫抑制劑制劑包括但不限于，0RTH0CL0NE (0KT3)、 SANDIMMUNE /NEORAL /SANGDYA (環(huán)胞菌素)、！3R0GRAF (他克莫司)、CELLCEPT (麥考酚 酯)、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素和RAPAMUNE (西羅莫司)。在具體的實(shí)施方案中，免疫抑制劑 可以用于預(yù)防器官或者骨髓移植的排斥。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)施用，或者與一種或多種靜脈內(nèi)免 疫球蛋白制劑相組合施用?？梢耘c本發(fā)明的抗體一起施用的靜脈內(nèi)免疫球蛋白劑包括但不 限于，GAMMAR 、IVEEGAM 、SANDOGLOBULIN 、GAMMAGARD S/D 和 GAMIMUNE 。在具體的實(shí) 施方案中，在移植療法(例如骨髓移植)中，本發(fā)明的抗體與靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑相組合 施用。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體單獨(dú)施用或者與消炎劑相組合施用。可以與 本發(fā)明的抗體一起施用的消炎劑包括但不限于，糖皮質(zhì)激素和非類固醇消炎劑、氨基芳基 羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉 酮、水楊酸衍生物、噻嗪甲酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、 阿米西群、芐達(dá)酸、芐達(dá)明、布可隆、聯(lián)苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈創(chuàng)藍(lán)油烴、萘丁美酮、尼 美舒利、奧古蛋白、奧沙西羅、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普羅喹宗、普羅沙唑和替尼達(dá)
VHA 曰°在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與細(xì)胞因子相組合施用。可以與本發(fā)明的抗 體一起施用的細(xì)胞因子包括但不限于，11^2、11^3、11^4、11^5、11^6、11^7、11^10、11^12、11^13、11^15、 抗⑶40、⑶40L、IFN-Y和TNF-α。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與任何白細(xì) 胞介素一起施用，所述白細(xì)胞介素包括但不限于，IL-I α、IL-I β、IL-2、IL_3、IL_4、IL_5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-19、IL-20 和 IL-21。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與血管生成蛋白質(zhì)相組合施用。可以與 本發(fā)明的抗體一起施用的血管生成蛋白質(zhì)包括但不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的生長(zhǎng)因子 (⑶GF)，如歐洲專利號(hào)EP-399816中所公開(kāi)的；血小板衍生的生長(zhǎng)因子-A(PDGF-A)，如歐 洲專利號(hào)EP-6821 10中所公開(kāi)的；血小板衍生的生長(zhǎng)因子-B(PDGF-B)，如歐洲專利號(hào) EP-282317中所公開(kāi)的；胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)，如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 92/06194中所公開(kāi)的； 胎盤(pán)生長(zhǎng)因子-2(PIGF-2)，如 Hauser 等人 Growth Factors, 4 :259_268 (1993)中所公開(kāi) 的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 90/13649中所公開(kāi)的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子-A (VEGF-A)，如歐洲專利號(hào)EP-506477中所公開(kāi)的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子_2 (VEGF-2)， 如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 96/39515中所公開(kāi)的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-3)；血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子B-186(VEGF-B186)，如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 96/26736中所公開(kāi)的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子-D (VEGF-D)，如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 98/02543中所公開(kāi)的；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D (VEGF-D)，如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 98/07832中所公開(kāi)的；以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子_E (VEGF-E)，如德國(guó)專利號(hào) DE19639601中所公開(kāi)的。上述提及的文獻(xiàn)通過(guò)引用合并入本文。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與造血生長(zhǎng)因子相組合施用?？梢耘c本 發(fā)明的抗體一起施用的造血生長(zhǎng)因子包括但不限于，LEUKINE (SARGRAM0STIM )和 NEUPOGEN (FILGRASTIM )。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子相組合施用。可以與 本發(fā)明的抗體一起施用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括但不限于，F(xiàn)GF-I、FGF-2、FGF-3、FGF-4、 FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10, FGF-11、FGF-12、FGF-13, FGF-14 和 FGF-15。施用時(shí)間本文所述的任何細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法都可以在本發(fā)明的一種或多種抗C35抗體之 前、同時(shí)或之后施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑是選自抗HER2抗體、抗 EGFR抗體和抗IGFR抗體的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗C35抗體和一種或多種細(xì)胞凋亡誘 導(dǎo)抗體同時(shí)施用。例如，抗C35抗體與抗HER2抗體和/或抗EGFR抗體和/或抗IGFR抗體 同時(shí)施用。在其他的實(shí)施方案中，抗體分開(kāi)施用。例如，抗HER2抗體可以在某一時(shí)間施用， 然后抗C35抗體可以在同一天稍后施用或者在第一種抗體施用當(dāng)天之后一天或多天施用。 同樣地，抗EGFR抗體可以在某一時(shí)間施用，然后抗C35抗體可以在同一天稍后施用或者在 第一種抗體施用當(dāng)天之后一天或多天施用。同樣地，抗IGFR抗體可以在某一時(shí)間施用，然 后抗C35抗體可以在同一天稍后施用或者在第一種抗體施用當(dāng)天之后一天或多天施用?？?C35抗體可以在不施用其他抗體(例如，抗HER2、抗EGFR或抗IGFR)的那一天施用，例如在 施用抗HER2抗體、抗EGR抗體或抗IGFR抗體中的至少一種或其組合之前的某一天，或者在 施用抗HER2抗體、抗EGR抗體或抗IGFR抗體中的至少一種或其組合之后的某一天。在其他實(shí)施方案中，多種抗體(例如，抗C35抗體和抗HER2抗體和/或抗EGFR抗 體和/或抗IGFR抗體)的施用可以在化療劑的施用之前、之后或同時(shí)發(fā)生，所述化療劑例 如紫杉醇(Taxol )、阿霉素、順鉬、本文描述的任何其他試劑。例如，一種或兩種或多種抗 體可以與紫杉醇、阿霉素、順鉬或其他試劑在同一時(shí)間施用或在同一天施用。備選地，紫杉 醇、阿霉素、順鉬或其他試劑可以在不施用抗體的那一天施用，例如在施用至少一種抗體之 前的某一天或者在施用至少一種抗體之后的某一天。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑(例如，抗HER2抗體和/或抗EGFR抗體和/ 或抗IGFR抗體)可以在施用至少一種抗C35抗體之前施用。例如，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑(例 如，抗HER2抗體和/或抗EGFR抗體和/或抗IGFR抗體)可以在給需要治療的受試者施用 至少一種抗體之前約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或24小時(shí)施用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑(例如，抗HER2抗體和/或抗EGFR 抗體和/或抗IGFR抗體)可以在施用本發(fā)明的至少一種抗C35抗體之前約1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或 31 天施 用。在特別的實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法是抗體，特別是抗HER2抗體、抗EGFR抗體或 抗IGFR抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在另一具體實(shí)施方案 中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑是化療劑，例如紫杉 醇或阿霉素或順鉬。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑(例如，抗HER2抗體和/或抗EGFR抗體和/或抗IGFR抗體)可以在施用至少一種抗C35抗體之后施用。例如，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑 (例如，抗HER2抗體和/或抗EGFR抗體和/或抗IGFR抗體)可以在給需要治療的受試者 施用至少一種抗 C35 抗體之后約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23或24小時(shí)施用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑(例如，抗HER2抗體 和/或抗EGFR抗體和/或抗IGFR抗體)可以在施用本發(fā)明的至少一種抗C35抗體之后 約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30或31天施用。在特別的實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)療法是抗體，特別是抗HER2抗體、 抗EGFR抗體或抗IGFR抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗HER2抗體是曲妥珠單抗。在另一 具體實(shí)施方案中，抗EGFR抗體是西妥昔單抗。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑是化 療劑，例如紫杉醇或阿霉素或順鉬。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療過(guò)程中，抗體以一周的時(shí)間間隔進(jìn)行施用。在具體的實(shí) 施方案中，在治療過(guò)程中，抗體每周施用一次，共兩周。在更具體的實(shí)施方案中，在治療過(guò)程 的前兩周過(guò)程中，抗體每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，在治療過(guò)程中，抗體每周施用一 次、兩次或三次。在具體的實(shí)施方案中，在治療過(guò)程中，抗體每周施用兩次。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體每周施用兩次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑(例如 化療劑，例如紫杉醇、阿霉素或順鉬)每周施用一次。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性試劑在治 療的第一天時(shí)施用，并且治療性試劑的第二個(gè)劑量在一周后施用，而抗體的組合每周施用 兩次。在具體的實(shí)施方案中，治療過(guò)程可以持續(xù)一周、兩周、三周、四周、五周、六周、七 周、八周、一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè) 月、十一個(gè)月或一年。治療過(guò)程的持續(xù)時(shí)間將取決于癌癥的類型、所使用的抗體、化療劑、患 者的年齡等。這些參數(shù)可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。治療活性的證明在人中使用前，本發(fā)明的方法和抗體可以在體外進(jìn)行測(cè)試，然后在體內(nèi)針對(duì)所需 治療性或預(yù)防性活性進(jìn)行測(cè)試。例如，用于證明化合物或藥物組合物的治療性或預(yù)防性效 用的體外測(cè)定法包括化合物對(duì)細(xì)胞系或患者組織樣品的作用?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已 知的技術(shù)(包括但不限于細(xì)胞增殖測(cè)定法和細(xì)胞裂解測(cè)定法)來(lái)測(cè)定化合物或組合物對(duì)細(xì) 胞系和/或組織樣品的作用。根據(jù)本發(fā)明，可以用于確定施用特定的化合物是否適用的體 外測(cè)定法包括體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法，其中使患者組織樣品在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且暴露于化 合物或以其他方式施用化合物，并觀察這種化合物對(duì)組織樣品的作用。試劑盒本發(fā)明提供了可以在上述方法中使用的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒在一 個(gè)或多個(gè)容器中包含至少一種C35和至少一種HER2抗體或至少一種EGFR抗體或至少一種 IGFR抗體，優(yōu)選地一種或多種經(jīng)純化的抗體。W.藥物組合物和施用方法制備本發(fā)明的一種或多種抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，并且將其施 用于有此需要的受試者的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，或可以容易地確定的?？贵w或 者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的施用途徑可以為例如經(jīng)口、腸胃外、通過(guò)吸入或局部。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)腸胃外包括例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或陰道施用。雖然所有這些施用形式都被清楚地包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是用于施用的形式將是用于注 射，特別是用于靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合適的藥物組合物可 以包含緩沖劑(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑)、表面活性劑(例如聚山梨醇酯)、 任選地穩(wěn)定劑(例如人白蛋白)等。但是，在與本文的教導(dǎo)相容的其他方法中，可以將本發(fā) 明的抗體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物直接遞送至有害細(xì)胞群體的部位，從而增加 患病組織對(duì)治療性試劑的暴露。如上文所討論的，至少一種C35抗體和至少一種抗HER2抗體或至少一種抗EGFR 抗體或至少一種抗IGFR抗體，或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，可以以藥學(xué)有效量施 用，用于過(guò)度增殖性疾病例如癌癥且特別地乳腺癌的體內(nèi)治療。就這一點(diǎn)而言，應(yīng)該理解的是所公開(kāi)的抗體將這樣進(jìn)行配制，從而使得有助于施 用且促進(jìn)活性劑的穩(wěn)定。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的、無(wú)毒、無(wú) 菌載體，例如生理鹽水、無(wú)毒緩沖劑、防腐劑等。就本申請(qǐng)的目的而言，綴合的或非綴合的抗 體或者其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的藥學(xué)有效量是指這樣的量，其足以達(dá)到與靶的有 效結(jié)合且獲得益處(例如緩解疾病或病癥的癥狀)或檢測(cè)物質(zhì)或細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，完整抗體劑量在單次推注中提供。備選地，所述劑量可以通過(guò) 多次施用例如延長(zhǎng)輸注方法來(lái)提供，或者通過(guò)經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)或數(shù)天的跨度(例如約2至約4 天的跨度)施用的反復(fù)注射來(lái)提供。在一些實(shí)施方案中，至少一種抗C35抗體和至少一種抗HER2抗體或抗EGFR抗體 或抗IGFR抗體在同一個(gè)的藥物制劑中一起施用。在其他的實(shí)施方案中，所述抗體作為分開(kāi) 的藥物制劑同時(shí)或順次施用。當(dāng)化合物包括核酸或免疫球蛋白時(shí)，可以采用的制劑和施用方法在上文描述；另 外的合適的制劑和施用途徑可以選自本文在下文描述的那些。多種遞送系統(tǒng)是已知的并且可以用于施用本發(fā)明的化合物，例如，封裝在脂質(zhì)體 中、微粒、微囊、能夠表達(dá)所述化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參見(jiàn)例如，Wu和 Wu, J. Biol. Chem. 262 :4429_4432 (1987))，和作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的部分構(gòu)建核酸 等等。引入方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和經(jīng)口途 徑?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)途徑施用化合物或組合物，例如，通過(guò)輸注或者推注注射，通過(guò)經(jīng)過(guò)上皮 或皮膚粘膜襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等等)吸收，并且可以與其他生物活性劑 一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，可能希望通過(guò)任何合適的途徑將本發(fā)明的藥 物化合物或組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，所述途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；通過(guò)例如與儲(chǔ) 庫(kù)例如Ommaya貯庫(kù)附著的心室內(nèi)導(dǎo)管可以促進(jìn)心室內(nèi)注射。例如，通過(guò)使用吸入器或者噴 霧器和具有霧化劑的制劑，也可以采用經(jīng)肺施用。在特定實(shí)施方案中，希望對(duì)需要治療的部位局部施用本發(fā)明的藥物化合物或組合 物；這可以通過(guò)例如但不限于，在手術(shù)期間的局部輸注、例如與手術(shù)后傷口敷料結(jié)合的局部 應(yīng)用、通過(guò)注射、借助于導(dǎo)管、借助于栓劑或借助于植入物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、無(wú) 孔的或膠狀材料，包括膜，例如sialastic膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括 抗體時(shí)，必須小心使用蛋白質(zhì)與之不吸附的材料。在另一實(shí)施方案中，化合物或組合物可以在囊泡特別是脂質(zhì)體中遞送(參見(jiàn) Langer, Science 249 1527-1533 (1990) ；Treat 等人，in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 禾口 Fidler (編輯)，Liss, New York, 第 353-365 頁(yè)(1989) ；Lopez-Berestein,同前，第 317-327 頁(yè)；一般參見(jiàn)前文)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物或組合物可以在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個(gè) 實(shí)施方案中，可以使用泵(參見(jiàn) Langer，同上；Sefton，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201(1987) ；Buchwald 等人，Surgery88 507(1980) ；Saudek 等人，N. Engl. J. Med. 321 574(1989))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(參見(jiàn)MedicalApplications of Controlled Release, Langer 禾口 Wise(編輯)，CRCPres. , Boca Raton, Florida(1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smo1en 禾口 Ball(編輯)，Wiley, New York(1984) ；Ranger 禾口 P印pas, J.，Macromo1. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983)；還參見(jiàn) Levy 等人，Science 228 190 (1985) ；During 等人， Ann. Neurol. 25 351 (1989) ；Howard 等人，J. Neurosurg. 71 105 (1989))。在另外一個(gè)實(shí)施 方案中，可以將控釋系統(tǒng)放置于治療靶(即，大腦)的附近，因而僅需要系統(tǒng)劑量的一部分 (例如參見(jiàn) Goodson，in Medical Applications of ControlledRelease，同上，第 2 卷，第 115-138 頁(yè)(1984))。其他控釋系統(tǒng)在由 Langer 的綜述(Science 249 1527-1533 (1990)) 中討論。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這種藥物組合物包含治療有效量的化合物和藥學(xué) 上可接受的載體。在具體的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管 理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者是在美國(guó)藥典或其他普遍公認(rèn)的藥典中列出用于在動(dòng)物更特別地人中使 用。術(shù)語(yǔ)“載體”是指治療劑與之一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥物載 體可以為無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油、動(dòng)物、蔬菜或合成來(lái)源的那些油，例如花生油、 大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。特別就可注射 的溶液而言，還可以使用生理鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作為液體載體。合適的藥 物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂 酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。需要時(shí)，所述組合物還 可以包含少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑、或者PH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳 狀液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等形式。所述組合物可以與常規(guī)的粘合劑和載體 例如甘油三酯一起配制成栓劑。經(jīng)口制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)的載體，例如藥物等級(jí)的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的實(shí)例在E.W.Martin 的"Remington' s Pharmaceutical Sciences"中描述。這種組合物包含治療有效量的 所述化合物(優(yōu)選為純化形式)連同合適量的載體，以便提供用于適當(dāng)施用于患者的形式。 所述制劑應(yīng)適合施用方式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)操作將組合物配制成適合于靜脈內(nèi)施用于人類的 藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物為無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。需要時(shí)， 所述組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑(例如利多卡因)，以減輕注射部位處的疼痛。 通常，所述成分分開(kāi)提供或以單位劑型混合在一起，例如作為在指示活性劑的量的緊密密 封容器(例如安瓿或藥囊)中的凍干粉劑或無(wú)水濃縮物。當(dāng)通過(guò)輸注來(lái)施用組合物時(shí)，可 以將該組合物分散于包含無(wú)菌藥物等級(jí)的水或鹽水的輸注瓶中。當(dāng)通過(guò)注射來(lái)施用組合物 時(shí)，可以提供無(wú)菌注射用水或鹽水的安瓿，從而使得所述成分可以在施用前相混合。本發(fā)明的化合物可以被配制成中性或鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括由陰離子形成的那些(例如由鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生而來(lái)的那些)、以及由陽(yáng)離子 形成的那些(例如由氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、 2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生而來(lái)的那些)?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來(lái)確定本發(fā)明化合物的量，其有效治療、抑制和預(yù)防與 本發(fā)明多肽的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或病癥。此外，可以任選采用體外測(cè)定法，以 幫助鑒定最佳的劑量范圍。制劑中待使用的精確劑量還取決于施用途徑以及疾病或病癥的 嚴(yán)重性，并且應(yīng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和各個(gè)患者的情況來(lái)決定?？梢愿鶕?jù)由體外或動(dòng)物模型 測(cè)試系統(tǒng)衍生的劑量_應(yīng)答曲線來(lái)推斷有效劑量。在一個(gè)實(shí)例中，化療劑的最高耐受劑量 和分別的化療方案的確定在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?005/0158323A1 (通過(guò)引用合并入本文)中描 述。就抗體而言，給患者施用的劑量通常為約0. lmg/kg至約100mg/kg患者體重。優(yōu)選 地，給患者施用的劑量為約0. lmg/kg至約20mg/kg患者體重，更優(yōu)選約lmg/kg至約IOmg/ kg患者體重。在一些實(shí)施方案中，以約10mg/kg至約50mg/kg患者體重的總劑量來(lái)施用抗 體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以約20mg/kg至約40mg/kg患者體重的總劑量來(lái)施用抗體。通 常，由于對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答，人抗體在人體內(nèi)具有比來(lái)自其他物種的抗體更長(zhǎng)的半衰 期。因此，較低劑量的人抗體和較不頻繁的施用通常是可能的。此外，通過(guò)修飾(例如脂 化)來(lái)增強(qiáng)抗體的攝取和組織滲透，可以減少本發(fā)明抗體的施用劑量和頻率。如上文所討論的，本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)容器的藥物包裝或試劑盒，所 述容器填充有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成分。例如，所述藥物包裝或試劑盒可以 包含抗體制劑，該抗體制劑包含兩種或更多種抗體(例如，至少一種抗C35抗體和至少一種 抗HER2抗體、或至少一種抗EGFR抗體、或至少一種抗IGFR抗體)、以及化療劑例如紫杉醇 或阿霉素。在一些實(shí)施方案中，抗體在相同的容器中。在其他的實(shí)施方案中，抗體在分開(kāi)的 容器中。在一些實(shí)施方案中，化療劑與抗體制劑在相同的容器中。在其他的實(shí)施方案中，化 療劑在分開(kāi)的容器中。與此類一個(gè)或多個(gè)容器任選結(jié)合的可以是由管理藥物或生物產(chǎn)品的 制造、使用或出售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的注意事項(xiàng)，所述注意事項(xiàng)反映由制造、使用或 出售機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人施用。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的免疫組織學(xué)方法，抗體可以用于測(cè)定生物樣品 中由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的水平(例如參見(jiàn)Jalkanen，等人，J. Cell. Biol. 101 976-985(1985) Jalkanen，等人，J. Cell. Biol. 105 :3087_3096 (1987))。用于檢測(cè)蛋白質(zhì) 基因表達(dá)的其他基于抗體的方法包括免疫測(cè)定法，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和 放射性免疫測(cè)定法(RIA)。合適的抗體測(cè)試法標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，并且包括酶標(biāo)記，例 如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(1311、1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H) JB (115mln、113ln、112ln、mln)、和锝(99Tc、99mTc)、鉈(2tllTi)、鎵(6W7Ga)、鈀(103Pd)、銷(99Mo), 氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177LU、159Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9°Y、47SC、186Re、88Re、142Pr、1(l5Rh、 97Ru ；發(fā)光標(biāo)記，例如魯米諾；以及熒光標(biāo)記，例如熒光素和羅丹明和生物素。除了測(cè)定生物樣品中本發(fā)明多肽的水平以外，蛋白質(zhì)還可以通過(guò)成像在體內(nèi)進(jìn)行 檢測(cè)。用于蛋白質(zhì)體內(nèi)成像的抗體標(biāo)記或標(biāo)記物包括可通過(guò)X-放射顯影法、NMR或ESR檢 測(cè)的那些。對(duì)于X-放射顯影法，合適的標(biāo)記包括放射性同位素例如鋇或銫，所述放射性同 位素發(fā)射可檢測(cè)的放射，但是不會(huì)對(duì)受試者造成明顯的傷害。對(duì)于NMR和ESR合適的標(biāo)記物包括具有可檢測(cè)的特征性自旋的那些(例如氘)，可以通過(guò)標(biāo)記用于相關(guān)雜交瘤的營(yíng)養(yǎng) 物來(lái)將所述合適的標(biāo)記物摻入所述抗體內(nèi)。將已經(jīng)用合適的可檢測(cè)成像部分標(biāo)記的蛋白質(zhì)特異性抗體或抗體片段引入(例 如腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))到待檢查免疫系統(tǒng)病癥的哺乳動(dòng)物內(nèi)，所述合適的可檢測(cè)的成 像部分例如放射性同位素(例如 131I、l12In、99mTc、(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、 氚(3H)、銦(115mln、113mln、112ln、mln)、和锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(6W7Ga)、鈀 (103Pd)、鉬(99Mo)、氣(133Xe)、氟(18F、153Sm、177LU、59Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9°Y、47SC、186Re、 188Re、142Pr、1(l5Rh、97RU))、不透射線的物質(zhì)或可通過(guò)核磁共振檢測(cè)的物質(zhì)。本領(lǐng)域應(yīng)該理解 的是，受試者的身體大小和所采用的成像系統(tǒng)決定了產(chǎn)生診斷圖像所需的成像部分的量。 在放射性同位素部分的情況，對(duì)于人受試者，所注入的放射性的量通常為約5至20毫居 里的"mTc。然后，經(jīng)標(biāo)記的抗體或抗體片段在表達(dá)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的細(xì) 胞位置處優(yōu)先積累。體內(nèi)腫瘤成像在S. W. Burchiel等人的“Immunopharmacokinetics of RadiolabeledAntibodies and Their Fragments " (Tumor Imaging 中的第 13 章 TheRadiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel 禾口 B. A. Rhodes,編輯，Masson Publishing Inc. (1982))中描述。本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以應(yīng)用于標(biāo)記本發(fā)明的多肽(包括抗體)。此類技術(shù)包括但 不限于，雙功能綴合劑的使用(例如參見(jiàn)美國(guó)專利序號(hào)5，756，065 ；5，714，631 ；5，696，239 ； 5，652，361 ；5，505，931 ；5，489，425 ；5，435，990 ；5，428，139 ；5，342，604 ；5，274，119 ； 4，994，560和5，808，003，所述專利各自的內(nèi)容在此通過(guò)引用整體合并入本文)。除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明的實(shí)踐使用了細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn) 基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都在本領(lǐng)域的技術(shù)范 圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中都有充分的說(shuō)明。例如參見(jiàn)Molecular Cloning A Laboratory Manual，第 2 片反，Sambrook 等人，編$|，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)； Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Sambrook 等人，編輯，Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1992), DNA Cloning, D. N. Glover 編輯，第 I 禾Π II 卷(1985)； 01igonucleotideSynthesis，M. J. Gait 編輯，(1984) ；Mullis 等人美國(guó)專利號(hào)4，683，195 ； Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins 編輯(1984) ；Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins 編輯(1984) ；Culture Of Animal Cells, R.I.Freshney,Alan R. Liss,Inc. , (1987) ；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press, (1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc. , N. Y. ；Gene TransferVectors For Mammalian Cells, J. H. Miller禾口M. P. Calos編輯，ColdSpring Harbor Laboratory (1987)； Methods In Enzymology,第 154 禾口 155 卷(Wu 等人編輯)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology, Mayer 禾口 Walker,編輯，Academic Press, London(1987)； Handbook Of Experimental Immunology, 第 I-IV 卷，D. Μ. Weir 禾口 C. C. Blackwel 1, 編 輯，(1986) ；Manipulating the MouseEmbryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1986)；以及 Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley 禾口 Sons, Baltimore, Maryland(1989)?？贵w工程的主要原理在Antibody Engineering,第 2 版，C. Α. K. Borrebaeck,編輯，Oxford Univ. Press (1995)中闡述。蛋白質(zhì)工程的主要原理在Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D.,等人，編輯，IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995)中闡述?？贵w以及抗體-半抗原的結(jié)合的主要原理在Nisonoff， A. , Molecular Immunology,第 2 版，Sinauer Associates, Sunderland, MA(1984)；以及 Steward,Μ. W. ,Antibodies,Their Structure andFunction,Chapman and Hal1,New York, NY(1984)中闡述。此外，本領(lǐng)域已知的并且未特別描述的標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)方法通常可以根據(jù) Current Protocols in Immunology, John Wiley & SonsiNew York ;Stites 等人(編輯)， Basic and Clinical- Immunology (第 8 片反)，Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)以 及 Mishell 禾口 Shiigi (編輯)，Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman andCo.，New York(1980)。闡述免疫學(xué)的主要原理的標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)著作包括Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons，New York ；Klein，J.，Immunology :The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley& Sons，New York (1982) ；Kennett，R.，等人， 編輯，MonocIonalAntibodies, Hybridoma :A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York(1980) ；Campbell，A.，“ Monoclonal AntibodyTechnology“ in Burden， R.，等人，編輯，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology,第 13 卷，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunnology 第 4 片反編輯 Richard A. Goldsby, ThomasJ. Kindt 禾口 Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000) ；Roitt，I.， Brostoff, J.禾口 Male D.，Immunology 第 6 版 London :Mosby(2001) ；Abbas A. ,Abul ,Α.禾口 Lichtman，Α.，Cellular and MolecularImmunology 第 5 片反，Elsevier Health Sciences Division (2005) ；Kontermann 禾口 Dubel，Antibody Engineering，Springer Verlan (2001)； Sambrook 禾口 Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Press (2001) ；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003) ；Harlow 禾口 Lane，Antibodies A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press (1988) ；Dieffenbach 禾口 Dveksler，PCR Primer ColdSpring Harbor Press (2003)。上文所引用的所有文獻(xiàn)、以及現(xiàn)在和下文中所引用的所有文獻(xiàn)均通過(guò)引用整體合 并入本文。
實(shí)施例實(shí)施例1EGFR和HER2在C35陽(yáng)性乳腺腫瘤中的表達(dá)分析了在C35陽(yáng)性乳腺腫瘤中的EGFR和HER2表達(dá)譜。通常，所有HER2陽(yáng)性腫瘤 也是C35陽(yáng)性的。然而，并非所有C35陽(yáng)性腫瘤都是HER2陽(yáng)性的。為了更好地理解C35陽(yáng) 性腫瘤的臨床譜，表3中顯示了通過(guò)免疫組織學(xué)得分的C35hi表達(dá)與HER2過(guò)表達(dá)(HER2hi腫 瘤)和EGFR表達(dá)之間的關(guān)系。C35hi腫瘤定義為得分2+或3+。腫瘤樣品腫瘤樣品衍生自診斷有乳腺癌的患者，所述患者具有腋窩手術(shù)且無(wú)輔助療法，并 且在病理學(xué)上是淋巴結(jié)陰性的。從代表性腫瘤區(qū)域中取出乳腺癌組織的三個(gè)0. 6mm2核心。 這些核心用于構(gòu)建一式三份地組織微陣列。
免疫組織化學(xué)用親和純化的兔多克隆抗體78.2以0.42yg/ml檢測(cè)C35。使用檸檬酸鈉緩 沖液(18 μ M檸檬酸、82 μ M檸檬酸鈉，PH 6.0)執(zhí)行抗原修復(fù)。用兔多克隆抗體(Dako， Carpinteria, CA)以1 50稀釋度檢測(cè)細(xì)胞角蛋白5/6 (CK5/6)。使用Tris/EDTA緩沖液 (ImM EDTAUOmMTris-HCl Base, pH 8. 0)執(zhí)行抗原修復(fù)。使用小鼠抗體(31G7克隆，Invitrogen，Carlsbad，CA)由在37°C下10分鐘的抗原 修復(fù)(0. 胰蛋白酶、0. 氯化鈣)檢測(cè)EGFR。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用REAL EnVision 小鼠/兔試劑盒(Dako)執(zhí)行關(guān)于C35和EGFR的標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)方案。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用Here印Test (Dako)執(zhí)行HER2免疫組織化學(xué)；其中抗原 修復(fù)在96°C下40分鐘。染色在Autostainer(Dako)上執(zhí)行。通過(guò)費(fèi)氏(Fisher)精確雙尾檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析顯示在C35hi組內(nèi)，EGFR表達(dá)在 HER2hi亞組和HER2-a 亞組之間明顯不同p = 0. 0048。三十(30)種C35陽(yáng)性腫瘤就Her2/neu和EGFR的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。30種腫瘤中的 七(7)種是 C35+/Her2+/EGFR-，17/30 是 C35+/Her2_/EGFR+，3/30 是 C35+/Her2+/EGFR+，并 且3/30是C35+/Her2-/EGFR-。90%的C35陽(yáng)性腫瘤對(duì)于HER2或EGFR是陽(yáng)性的。表3.在HER2hi和HER2_/low腫瘤組織樣品中的EGFR表達(dá)EGFR-EGFR+HER2-/low317HER2hi73上表3中顯示的結(jié)果舉例說(shuō)明，當(dāng)與第二種轉(zhuǎn)化基因相結(jié)合時(shí)，C35轉(zhuǎn)化活性是最 大的。實(shí)施例2用于治療癌癥的C35和HER2抗體的組合如圖1和2中舉例說(shuō)明以及這個(gè)實(shí)施例中描述的，測(cè)試了涉及施用抗C35抗體和 抗HER2抗體的治療癌癥的方法。這個(gè)實(shí)施例顯示與曲妥珠單抗相組合的抗C35小鼠單克 隆抗體1F2和1B3在天然地Her2+/C35+人乳腺癌異種移植物模型BT474-MD中的效應(yīng)。1F2和1B3抗體的產(chǎn)生使用72小時(shí)原種培養(yǎng)，以2. OxlO5細(xì)胞/ml接種總共3. 5L⑶雜交瘤。培養(yǎng)物在 3L燒瓶中以700ml/燒瓶分開(kāi)。將燒瓶置于37°C下以90_120rpm振蕩的7% C02溫箱中7 天，而不添加任何補(bǔ)料培養(yǎng)基。在第7天時(shí)，從每個(gè)燒瓶中取出樣品用于在收獲前的細(xì)胞計(jì) 數(shù)。計(jì)數(shù)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除來(lái)進(jìn)行。所有3.5L細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)在3200rpm(2100Xg)下離心 得到澄清。經(jīng)澄清的條件培養(yǎng)基使用0.22 μ m過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾滅菌。在純化期間，將經(jīng) 澄清/經(jīng)過(guò)濾的上清液貯存于4°C過(guò)夜。對(duì)于抗體1B3，每周收獲上清液，約10_12ml/收獲/實(shí)驗(yàn)室?？贵w批次由前6次連 續(xù)收獲組成。抗體純化上清液中的抗體與Gammabind G(GE Healthcare)柱結(jié)合。所結(jié)合的抗體在包含 IM NaCl的PBS，pH 7. 2中洗滌，以減少內(nèi)毒素。經(jīng)洗滌的抗體用0. IM甘氨酸，pH 2. 7洗 脫到包含1 5體積IM Tris, pH8. 0的餾分內(nèi)。包含經(jīng)洗脫的抗體的餾分使用G25 PDlO柱(GEHealthcare)進(jìn)行緩沖液更換。將經(jīng)緩沖液更換的抗體合并，并且使用Centricon Plus-70超濾(Millipore，30kDA麗CO)濃縮至7. 5mg/mL。使經(jīng)濃縮的抗體流過(guò)陰離子交 換Mustang Q(Pall)膜。收集包含抗體的流出物。這種最終配制的抗體使用0. 2um注射器 式濾器(Pall)在生物安全櫥中進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)A280使用Nanodrop分光 光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)天然地C35+/HER2+人乳腺腫瘤BT474-MD細(xì)胞系是經(jīng)來(lái)自JoseBaselga的許可轉(zhuǎn) 讓的，在MD Anderson的Ronald Bast的友情贈(zèng)予。細(xì)胞系的歷史BT474得自ATCC Jose Baselga的實(shí)驗(yàn)室中，在其中它在小鼠中傳代，并且進(jìn)行先體外后體內(nèi)培養(yǎng)，以產(chǎn)生能夠在 體內(nèi)一致地形成腫瘤的系。細(xì)胞系通過(guò)有限稀釋進(jìn)行亞克隆，并且鑒定在體內(nèi)具有有利的 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和成活率的克隆。將細(xì)胞系命名為BT474-MD，并且在達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng) 基(Invitrogen)中進(jìn)行培養(yǎng)，并且進(jìn)行調(diào)整以包含10%胎牛血清。在用于移植的制劑中， 細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA解離，在PBS中洗滌并且重懸浮于108/ml的體積中。動(dòng)物4周大的Swiss裸鼠購(gòu)自Taconic Farms0動(dòng)物在無(wú)特定病原體、隔離設(shè)施條件下 飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)在University Committee on AnimalResources批準(zhǔn)的方案下執(zhí)行。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥品在所提供的媒介物中將抗HER2抗體曲妥珠單抗(Ilerceptin ，Genentech)稀 釋至21mg/ml。曲妥珠單抗的最終劑量是10或100 μ g/劑量( 0. 5或5mg/kg)，經(jīng)由靜 脈內(nèi)注射每周施用兩次，共3周的持續(xù)時(shí)間，在移植后第12天時(shí)開(kāi)始。移植和處理將10，000, 000 C35陽(yáng)性BT474-MD腫瘤細(xì)胞皮下植入4周大的Swiss裸鼠的乳房 脂肪墊中。在移植前24小時(shí)，將90天釋放雌激素丸植入每個(gè)動(dòng)物中。6至9只小鼠的組各 自接受下述處理之一1.無(wú)處理(對(duì)照組)。2. 1(^8/劑量(約0.5!1^/1^)曲妥珠單抗/i. v.注射在第12天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù) 每周兩次，共3周。3. IOyg/劑量(約0.5mg/kg)曲妥珠單抗/i.v.注射連同800 μ g/i. ν.注射 (40mg/kg)的1F2鼠類單克隆抗體在第12天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù)每周兩次，共3周。4. IOyg/劑量(約0. 5mg/kg)曲妥珠單抗/i.v.注射連同800 μ g/i. v.注射 (40mg/kg)的1B3鼠類單克隆抗體在第12天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù)每周兩次，共3周。在移植后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量平均小鼠腫瘤體積(圖1)。在每個(gè)腫瘤上用游標(biāo)卡 尺獲得2個(gè)尺寸；腫瘤體積使用式(長(zhǎng)度χ寬度2)/2進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于每個(gè)腫瘤，腫瘤體積 中的改變百分比計(jì)算為(第X天的腫瘤體積/第11天的腫瘤體積)xl00。如圖1中所示， 不含1F2或1B3抗C35抗體以所示劑量單獨(dú)施用的曲妥珠單抗(IgG)在抑制小鼠中的腫瘤 生長(zhǎng)方面不如與抗C35抗體相組合施用的曲妥珠單抗有效。與曲妥珠單抗相組合的、測(cè)試 的2種鼠類抗C35抗體1F2和1B3各自使C35陽(yáng)性腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)抑制約5倍。此外， 這些經(jīng)組合處理的小鼠也顯示出腫瘤消退中的延遲(圖2)。因此，抗C35抗體與抗HER2抗 體的組合在減少腫瘤生長(zhǎng)中具有顯著效應(yīng)。
實(shí)施例3在抗HER2抗體處理后C35易位的誘導(dǎo)和評(píng)分如圖3中舉例說(shuō)明和這個(gè)實(shí)施例中描述的，顯示抗HER2抗體曲妥珠單抗使C35蛋 白質(zhì)易位至細(xì)胞外膜，在其中它可以通過(guò)抗體染色進(jìn)行檢測(cè)。BT474細(xì)胞以2. 5x10s細(xì)胞/ 燒瓶種植在完全培養(yǎng)基(達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基+10%胎牛血清)中。將曲妥珠單抗 加入完全培養(yǎng)基中至4ug/ml(37.5yM)的終濃度。使細(xì)胞在37°C下溫育5天，隨后用胰蛋 白酶-EDTA收獲，包括漂浮細(xì)胞?？贵w染色使1,000，000細(xì)胞在PAB (磷酸鹽緩沖鹽水、0.01% Azide、l % BSA)中洗滌，并 且與0. 5 μ g兔抗C35多克隆抗體78-2或兔IgG對(duì)照，隨后與和Cy5綴合的驢抗兔抗體 一起溫育30分鐘。細(xì)胞在IX膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中洗滌，并且與4μ 1膜聯(lián)蛋白-PE(BD Pharmingen,結(jié)合在細(xì)胞凋亡的細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸)和0. 1 μ M Sytox Green (DNA染 料，由活細(xì)胞排除)一起在室溫下溫育15分鐘。FACS 分析細(xì)胞群體在FSC/SSC上進(jìn)行門(mén)控(gated)，以排除碎片。樣品隨后在2D中通過(guò)膜 聯(lián)蛋白V/Sytox green染色進(jìn)行顯示，并且門(mén)控成下述群體a.活的膜聯(lián)蛋白 V_/Sytox Green DNA 染料―b.早期細(xì)胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V+/Syt0X Green DNA染料_c.晚期細(xì)胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V+/Syt0X Green DNA染料lQWd.死的膜聯(lián)蛋白 V+/Sytox Green DNA 染料 hi下表4顯示經(jīng)歷細(xì)胞凋亡和/或死亡的經(jīng)曲妥珠單抗處理的BT474細(xì)胞百分比高 于未經(jīng)處理的細(xì)胞的那些。表4.經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的經(jīng)曲妥珠單抗處理的BT474細(xì)胞百分比未經(jīng)處理的曲妥珠單抗活的96.80%91. 45%早期細(xì)胞凋亡的0. 240. 65晚期細(xì)胞凋亡的0.912.91死的1. 734. 28如圖3中所示，活BT474細(xì)胞的群體對(duì)于抗C35抗體染色是陰性的(小圖A)，而晚 期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞對(duì)于抗C35抗體染色是陽(yáng)性的(小圖B)。如本文上文討論的，通常與細(xì) 胞內(nèi)膜結(jié)合的C35抗原變得暴露在腫瘤細(xì)胞的表面膜上，所述腫瘤細(xì)胞通過(guò)放射和/或化 療進(jìn)行誘導(dǎo)以經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0158323A1，圖1-3。如表4中所 示，曲妥珠單抗處理增加晚期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞群體，并且晚期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞對(duì)于C35染 色陽(yáng)性。因此，曲妥珠單抗可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且使C35蛋白質(zhì)易位至細(xì)胞膜的外表面， 使得它成為抗C35抗體易接近的靶。因此，用抗HER2抗體和C35抗體的聯(lián)合治療的一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)是抗HER2抗體也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且使C35易位至腫瘤細(xì)胞外膜。實(shí)施例4與HER2抗體相組合的C35抗體用于處理相對(duì)大的腫瘤如圖4和5中舉例說(shuō)明以及這個(gè)實(shí)施例中描述的，與抗HER2抗體相組合的抗C35抗體施用于移植BT474-MD的小鼠延遲或抑制相對(duì)大的腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)。圖4中顯示了當(dāng) 腫瘤大小約50mm3時(shí)開(kāi)始處理時(shí)，單獨(dú)和與曲妥珠單抗相組合的1F2抗C35抗體的使用延 遲或減少腫瘤生長(zhǎng)。圖5顯示甚至在處理開(kāi)始時(shí)腫瘤體積更大約IOOmm3時(shí)，與曲妥珠單抗 相組合的抗C35小鼠單克隆抗體1F2也抑制腫瘤的生長(zhǎng)。測(cè)試了用單獨(dú)的曲妥珠單抗、單獨(dú)的1F2、或與1F2相組合的曲妥珠單抗處理的 小鼠中的平均腫瘤體積。用于測(cè)定平均腫瘤體積的方法類似于實(shí)施例2中描述的方法，除 了在這個(gè)實(shí)施例中處理在第15或22天時(shí)開(kāi)始以外，這時(shí)平均腫瘤體積分別為約50mm3或 IOOmm30對(duì)于在第15天時(shí)開(kāi)始的處理，9至12只小鼠的每個(gè)組各自接受下述處理之一1.無(wú)處理(鹽水對(duì)照組)。2. 1(^8/劑量(約0.5!1^/1^)曲妥珠單抗/i. v.注射在第15天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù) 每周兩次，共約2周。3. IOyg/劑量(約0.5mg/kg)曲妥珠單抗/i.v.注射連同800 μ g/i. ν.注射 (40mg/kg)的1F2鼠類單克隆抗體在第15天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù)每周兩次，共約2周。4.單獨(dú)的對(duì)照IgG。5. 800 μ g/i. v.注射(40mg/kg)的1F2鼠類單克隆抗體在第15天時(shí)開(kāi)始，并且持 續(xù)每周兩次，共約2周。對(duì)于在第22天時(shí)開(kāi)始的處理，7至12只小鼠的每個(gè)組各自接受下述處理之一1.無(wú)處理(鹽水對(duì)照組)。2. 1(^8/劑量(約0.5!1^/1^)曲妥珠單抗/i.v.注射在第22天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù) 每周兩次，共約2周。3. IOyg/劑量(約0.5mg/kg)曲妥珠單抗/i.v.注射連同800 μ g/i. ν.注射 (40mg/kg)的1F2鼠類單克隆抗體在第22天時(shí)開(kāi)始，并且持續(xù)每周兩次，共約2周。在移植后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量平均小鼠腫瘤體積(圖4)。在第15天時(shí)開(kāi)始處理時(shí)， 腫瘤體積為約50mm3。測(cè)量平均腫瘤體積直至移植后至少45天。如圖4中所示，與曲妥珠 單抗、單獨(dú)的1F2抗C35抗體、單獨(dú)的IgG和未經(jīng)處理的相比較，曲妥珠單抗和1F2抗C35 抗體的組合減少腫瘤體積中的生長(zhǎng)。在處理開(kāi)始時(shí)腫瘤體積約IOOmm3時(shí)，與曲妥珠單抗相組合的1F2抗C35抗體減少 腫瘤生長(zhǎng)的使用對(duì)于延遲或減少腫瘤生長(zhǎng)也是有效的。在移植后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量平均小 鼠腫瘤體積(圖5)。與單獨(dú)的曲妥珠單抗或未經(jīng)處理的相比較，曲妥珠單抗和1F2抗C35 抗體的組合延遲或減少腫瘤生長(zhǎng)。下表5顯示與單獨(dú)的抗HER2抗體相比較，抗C35抗體和抗HER2抗體的組合在預(yù) 防腫瘤生長(zhǎng)方面也是更有效的。如表5中所示，與單獨(dú)的抗C35 1F2或曲妥珠單抗相比較， 具有靜態(tài)(static)腫瘤(即，從處理開(kāi)始直到研究結(jié)束時(shí)，未能生長(zhǎng)或保持相對(duì)恒定的腫 瘤)的小鼠百分比對(duì)于1F2抗C35抗體和曲妥珠單抗處理的組合增加。無(wú)論處理在第15 天時(shí)開(kāi)始(腫瘤體積約50mm3)還是處理在第22天時(shí)開(kāi)始(腫瘤體積約IOOmm3)都顯示了 增加。表5 在處理后腫瘤大小的比較 因此，這個(gè)實(shí)施例顯示與單獨(dú)的抗HER2抗體或單獨(dú)的抗C35抗體相比較，抗C35 抗體和抗HER2抗體的組合在抑制平均腫瘤生長(zhǎng)方面更有效，與處理在第15天時(shí)開(kāi)始(腫 瘤體積約50mm3)還是處理在第22天時(shí)(腫瘤體積約IOOmm3)開(kāi)始無(wú)關(guān)。因此，這個(gè)實(shí)施例 和上文實(shí)施例顯示經(jīng)組合的抗C35和抗HER2處理在抑制或延遲相對(duì)小和大的腫瘤的腫瘤 生長(zhǎng)方面比單獨(dú)的任一處理更有效。本文引用的所有出版物(包括專利、專利申請(qǐng)、期刊論文、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、書(shū)或其他 文件)的完整公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用合并。
權(quán)利要求
殺死表達(dá)C35和HER2的癌細(xì)胞的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用(a)一定量的特異性結(jié)合C35的抗C35抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)一定量的特異性結(jié)合HER2的抗HER2抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗C35抗體的所述量和所述抗HER2抗體的所述量對(duì)于殺死所述癌細(xì)胞有效。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括(c)施用一定量的治療性試劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述方法在體內(nèi)執(zhí)行。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在哺乳動(dòng)物中執(zhí)行。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑是化療劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑選自順鉬、卡鉬、紫杉醇、阿霉素、多西他賽、泰 素帝、吉西他濱和長(zhǎng)春瑞濱。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述化療劑是紫杉醇。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述化療劑是阿霉素。
10.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑是放射。
11.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所 述抗HER2抗體中的至少一種前施用。
12.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所 述抗HER2抗體中的至少一種后施用。
13.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑與施用所述抗C35抗體或所 述抗HER2抗體中的至少一種同時(shí)施用。
14.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體和所述抗HER2抗體同時(shí)施用。
15.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體和所述抗HER2抗體順次施用。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其片段各自以約0.lmg/kg至約 100mg/kg患者體重的劑量施用。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體或片段選自1F2、1B3、 MAbc0009、MAb 163, MAb 165, MAb 171及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗C35抗體或片段是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié)合 特異性的變體或衍生物。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗C35抗體或片段是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合 特異性的變體或衍生物。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞選自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱 癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述乳腺癌細(xì)胞是導(dǎo)管內(nèi)癌細(xì)胞。
24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括施用超過(guò)一種抗C35抗體或其 片段。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括施用超過(guò)一種抗HER2抗體。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體是人源化、嵌合或人抗體。
27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗HER2抗體是人源化、嵌合或人抗體。
28.殺死患者中的C35陽(yáng)性癌細(xì)胞的方法，所述方法包括a)測(cè)試在所述患者的癌細(xì)胞樣品中EGFR和HER2的表達(dá)；和b)當(dāng)所述癌細(xì)胞對(duì)于EGFR表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，施用有效殺死所述癌細(xì)胞的一定量的抗 EGFR抗體和一定量的抗C35抗體；或c)當(dāng)所述癌細(xì)胞對(duì)于HER2表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，施用有效殺死所述癌細(xì)胞的一定量的抗 HER2抗體和一定量的抗C35抗體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體外測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述體外測(cè)定法選自免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交 (FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體內(nèi)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)細(xì)胞成像測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述EGFR和HER2表達(dá)通過(guò)不同測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述EGFR和HER2表達(dá)通過(guò)相同測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述乳腺癌是乳腺癌轉(zhuǎn)移。
38.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗EGFR抗體是西妥昔單抗。
39.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
40.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗C35抗體是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性 的人源化變體或衍生物。
41.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗C35抗體是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性 的人源化變體或衍生物。
42.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗C35抗體是全人的。
43.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗EGFR抗體和所述抗C35抗體在不同時(shí)間施用。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗EGFR抗體在所述抗C35抗體前施用。
45.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗HER2抗體和所述抗C35抗體在不同時(shí)間施用。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述抗HER2抗體在所述抗C35抗體前施用。
47.設(shè)計(jì)用于具有C35陽(yáng)性癌癥的患者的治療的方法，所述方法包括a)測(cè)試在來(lái)自所述癌癥患者的生物樣品中HER2和EGFR的表達(dá)；b)選擇包括抗C35抗體和針對(duì)HER2或EGFR的抗體的聯(lián)合抗體療法，其中當(dāng)所述生物樣品對(duì)于HER2表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，選擇抗HER2抗體，并且當(dāng)所述生物樣品 對(duì)于EGFR表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，選擇抗EGFR抗體。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述生物樣品選自腫瘤組織、血漿和血清。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述C35陽(yáng)性癌癥是乳腺癌。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述乳腺癌是乳腺癌轉(zhuǎn)移。
52.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗EGFR抗體是西妥昔單抗。
53.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗HER2抗體是曲妥珠單抗。
54.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗C35抗體是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性 的人源化變體或衍生物。
55.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗C35抗體是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性 的人源化變體或衍生物。
56.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗C35抗體是全人的。
57.用于鑒定將在治療上響應(yīng)于用抗體聯(lián)合療法來(lái)治療癌癥的方法的患者的方法，所 述方法包括a)測(cè)試在所述患者的癌細(xì)胞樣品中C35、EGFR和HER2的表達(dá)；b)測(cè)定在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR和HER2的組合；和c)提供針對(duì)在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR和HER2的組合的抗體的組合。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、前列 腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述乳腺癌是導(dǎo)管內(nèi)癌。
61.權(quán)利要求57的方法，其中所述C35、EGFR和HER2表達(dá)通過(guò)體外測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述體外測(cè)定法選自免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交 (FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。
63.權(quán)利要求57的方法，其中所述EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)體內(nèi)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述EGFR或HER2表達(dá)通過(guò)細(xì)胞成像測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
65.權(quán)利要求57的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)C35和EGFR的組合。
66.權(quán)利要求65的方法，其中抗體的所述組合包括抗C35抗體和抗EGFR抗體。
67.權(quán)利要求57的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)C35和HER2的組合。
68.權(quán)利要求65的方法，其中抗體的所述組合包括抗C35抗體和抗HER2抗體。
69.權(quán)利要求57的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)C35、EGFR和HER2的組合。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所提供的抗體的所述組合是抗C35抗體、抗EGFR抗體和 抗HER2抗體。
71.權(quán)利要求57的方法，其進(jìn)一步包括d)測(cè)試在所述患者的癌細(xì)胞樣品中IGFR的表達(dá)；e)測(cè)定在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR、HER2和IGFR的組合；禾口f)提供針對(duì)在所述癌細(xì)胞中表達(dá)的C35、EGFR、HER2和IGFR的組合的抗體的組合。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)C35和IGFR的組合。
73.權(quán)利要求72的方法，其中抗體的所述組合包括抗C35抗體和抗IGFR抗體。
74.殺死表達(dá)C35和EGFR的癌細(xì)胞的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用(a)—定量 的特異性結(jié)合C35的抗C35抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b) —定量的特異性結(jié)合EGFR的抗 EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗C35抗體的所述量和所述抗EGFR抗體的所述量對(duì)于殺 死所述癌細(xì)胞有效。
75.權(quán)利要求74的方法，其進(jìn)一步包括(c)施用一定量的治療性試劑。
76.權(quán)利要求74或75的方法，其中所述方法在體內(nèi)執(zhí)行。
77.權(quán)利要求73-75中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在哺乳動(dòng)物中執(zhí)行。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
79.權(quán)利要求75-78中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑是化療劑。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述化療劑選自順鉬、卡鉬、紫杉醇、阿霉素、多西他賽、 泰素帝、吉西他濱和長(zhǎng)春瑞濱。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述化療劑是紫杉醇。
82.權(quán)利要求80的方法，其中所述化療劑是阿霉素。
83.權(quán)利要求75-78中任一項(xiàng)的方法，其中所述化療劑是放射。
84.權(quán)利要求75-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所 述抗EGFR抗體中的至少一種前施用。
85.權(quán)利要求75-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑在施用所述抗C35抗體或所 述抗EGFR抗體中的至少一種后施用。
86.權(quán)利要求75-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療性試劑與施用所述抗C35抗體或所 述抗EGFR抗體中的至少一種同時(shí)施用。
87.權(quán)利要求75-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體和所述抗EGFR抗體同時(shí)施用。
88.權(quán)利要求75-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體和所述抗EGFR抗體順次施用。
89.權(quán)利要求75-88中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體或其片段各自以約0.lmg/kg至約 100mg/kg患者體重的劑量施用。
90.權(quán)利要求75-88中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體或片段選自1F2、1B3、 MAbc0009、MAb 163,MAb 165,MAb 171及其保留對(duì)于C35的結(jié)合特異性的變體或衍生物。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述抗C35抗體或片段是1F2或其保留對(duì)于C35的結(jié)合 特異性的變體或衍生物。
92.權(quán)利要求90的方法，其中所述抗C35抗體或片段是1B3或其保留對(duì)于C35的結(jié)合 特異性的變體或衍生物。
93.權(quán)利要求75-92中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗EGFR抗體是西妥昔單抗。
94.權(quán)利要求75-93中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞選自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱 癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑素瘤。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述乳腺癌細(xì)胞是導(dǎo)管內(nèi)癌細(xì)胞。
97.權(quán)利要求75-96中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括施用超過(guò)一種抗C35抗體或其 片段。
98.權(quán)利要求75-97中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括施用超過(guò)一種抗EGFR抗體。
99.權(quán)利要求75-98中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗C35抗體是人源化、嵌合或人抗體。
100.權(quán)利要求75-99中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗EGFR抗體是人源化、嵌合或人抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及殺死癌細(xì)胞的方法，該方法包括施用至少一種C35抗體和至少一種HER2或至少一種EGFR抗體中任何一種。在一些實(shí)施方案中，將抗體與治療性試劑一起施用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在這些方法中有用的C35、HER2和EGFR抗體。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101932333SQ200880125850
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者E·E·埃文斯, M·佐德?tīng)?申請(qǐng)人:瓦西尼斯公司