專(zhuān)利名稱：抗b7h4單克隆抗體-藥物綴合物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了抗B7-H4抗體、抗體片段、以及與配偶體分子綴合的抗體模擬物，所 述配偶體分子諸如是藥物、放射性同位素和毒素。
背景技術(shù)：
乳腺癌和卵巢癌分別是美國(guó)女性癌癥死亡的第二和第四大主要原因(美國(guó)癌癥 學(xué)會(huì)(2005)Cancer facts and figures)。美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)估計(jì)2005年美國(guó)約40，000位婦女 將死于乳腺癌以及約16，000位將死于卵巢癌。表面上皮腫瘤占所有卵巢腫瘤的80 %以上， 所述卵巢腫瘤包括漿液瘤、粘液性瘤、內(nèi)膜樣瘤和透明細(xì)胞癌(Seidman等“Blaustein’ s Pathology of theFemale Genital Tract，，791-4 (Kurman 編輯，第五版，New York, Springer-Verlag,2002)。卵巢癌通常以晚期存在，其中轉(zhuǎn)移性疾病已擴(kuò)散至局部和遠(yuǎn)處部 位(Pettersson, (1994) Int. Fed. of Gyn. and Obstetrics，第 22 卷；以及 Heintz 等(2001) J. Epidermiol. Biostat. 6 107-38)。因此，盡管一生發(fā)生乳腺癌的概率顯著高于卵巢癌，但 是乳腺癌患者的5年生存率比卵巢癌患者好得多。B7樣分子屬于免疫球蛋白(Ig)超家族。B7樣分子的細(xì)胞外部分含有單IgV和IgC 結(jié)構(gòu)域，并且共享 20% -40%的氨基酸同一性。B7樣分子在控制和精細(xì)調(diào)整抗原特異性 免疫反應(yīng)中起著重要的作用。B7-H4也稱為08E、B7x和B7S1，其為B7家族的成員并且認(rèn)為 其在刺激和抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)中起著作用(Carreno等，(2002) Ann. Rev. Immunol. 20 29-53 和 Khoury 等，(2004) Immunity 20 :529_538)。已將人 B7-H4 定位在 1 號(hào)染色體上， 并且其包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，共66kb，其中外顯子6用于備選地剪接以產(chǎn)生兩種不 同的轉(zhuǎn)錄物(Choi 等(2003) J. Immunol. 171 4650-4654)。B7-H4通過(guò)與T細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮其生理功能，其進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停 滯并抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒性的發(fā)展以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生 (Prasad 等(2003)Immunity 18 :863_873 ；Sica 等(2003)Immunity 18 :849_861 ；Wang 等 (2004)Microbes Infect. 6 :759_66 ；和 Zang 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 10388-10392)。已提示Β7-Η4可能是炎癥反應(yīng)的弱化子以及可能在下調(diào)抗原特異性免疫 和抗腫瘤應(yīng)答中起著作用(zang 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 10388-10392 ； Prasad 等(2003)Immunity 18 :863_873 ;Sica 等(2003)Immunityl8 849-861 ；Choi 等 (2003) J. Immunol. 171 4650-4654 以及 Carreno 等(2003) Trends Immunol. 24 :524_7)。在大范圍正常軀體組織，包括肝、骨骼肌、腎、胰和小腸中檢測(cè)到了 B7_H4mRNA的 表達(dá)，但未檢測(cè)到蛋白質(zhì)表達(dá)(Sica等，(2003)Immunityl8 :849-61和Choi等(2003) J. Immunol. 171 :4650_4)。B7-H4是在刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞后可誘導(dǎo) 的，然而免疫組織化學(xué)分析揭示除了在一些卵巢和肺癌(Id.)中有陽(yáng)性染色之外，其在若 干外周組織中幾乎不表達(dá)。此外，B7-H4在原發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌中一致地過(guò)量表達(dá)，獨(dú)立于 腫瘤分級(jí)或階段，這提示這一蛋白質(zhì)在乳腺癌生物學(xué)中起著重要作用(Tringler等(2005) Clinical Cancer Res. U 1842-48)。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，962，980,6, 699，664,6, 468，546、 6，488，931,6, 670，463和6，528，253，其每一個(gè)均在此引入作為參考。
可利用許多治療模式用于治療晚期乳腺癌和卵巢癌，包括放療、使用細(xì)胞毒抗腫 瘤劑的常規(guī)化療、激素療法(芳香酶抑制劑、黃體化激素釋放激素類(lèi)似物)、二膦酸鹽和信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(Smith (2002) Lancet，360 :790_2)。然而，不幸的是，許多患者對(duì)這些治療模 式的任一個(gè)要么反應(yīng)很差，要么完全沒(méi)反應(yīng)。因此，需要鑒定乳腺癌和卵巢癌的新分子標(biāo)記 和抗乳腺癌和卵巢癌的治療劑。因此，B7-H4代表了治療包括卵巢癌和乳腺癌在內(nèi)的腫瘤 以及各種其它由B7-H4的表達(dá)所表征的疾病的重要靶標(biāo)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了抗體-配偶體分子綴合物，其包含單克隆抗體，尤其是人序列單克 隆抗體，其與B7-H4(a/k/a 08E、B7S1和B7x)結(jié)合并且展示出許多期望的性質(zhì)。這些性質(zhì) 包括與人B7-H4高親和性結(jié)合、被表達(dá)B7-H4的細(xì)胞內(nèi)化、介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性的能 力、和/或當(dāng)綴合至細(xì)胞毒素時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。還提供了應(yīng)用 本發(fā)明的抗體_配偶體分子綴合物治療各種B7-H4介導(dǎo)的疾病的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗體 或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體(a)以Ix 10_8M或更小的親和性結(jié)合人B7-H4 ；(b)被表達(dá)B7-H4的細(xì)胞內(nèi)化；(c)對(duì)表達(dá)B7-H4的細(xì)胞顯示出抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)；和(d)當(dāng)綴合至細(xì)胞毒素時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選地，該抗體顯示性質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)的至少兩種。更優(yōu)選地，該抗體顯示 性質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)的至少三種。更優(yōu)選地，該抗體顯示所有四種性質(zhì)(a)、(b)、(c) 和(d)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體以5xlO_9M或更小的親和性結(jié)合B7-H4。在又 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)該抗體綴合至細(xì)胞毒素時(shí)其在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞 的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，該抗體與乳腺細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系，諸如細(xì)胞系SKBR3(ATCC登 錄號(hào)HTB-30)結(jié)合。一般地，該抗體是人抗體，盡管在備選的實(shí)施方案中，該抗體可以是鼠抗體、嵌合 抗體或人源化抗體。在另一實(shí)施方案中，該抗體在與SKBR3乳腺細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的B7-H4結(jié)合 后被這些細(xì)胞內(nèi)化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單 克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與參照抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7-H4，其中所述參 照抗體(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 6的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人Vh 4-34基因的產(chǎn)物 或衍生自人Vh 4-34基因(其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在本文中描述為SEQ ID NO :51)，其中所述抗體特 異性結(jié)合B7-H4。本發(fā)明還提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗體或 其抗原結(jié)合部分，所述抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人Vh 3-53基因的產(chǎn)物或衍 生自人Vh 3-53基因(其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在本文中描述為SEQ ID NO :52)，其中所述抗體特異性 結(jié)合B7-H4。本發(fā)明還提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗體或其抗 原結(jié)合部分，所述抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人Vh 3-9/D3-10/JH6b基因的產(chǎn) 物或衍生自人VH3-9/D3-10/JH6b基因(其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在本文中描述為SEQ ID N0:53)，其 中所述抗體特異性結(jié)合B7-H4。本發(fā)明還提供了抗體_配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗體或其抗 原結(jié)合部分，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)是人VKA27基因的產(chǎn)物或衍生自
A27基因(其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在本文中描述為SEQ ID NO :54)，其中所述抗體特異性結(jié)合 B7-H4。本發(fā)明還提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)是AVk L6/JK1基因的產(chǎn)物或衍生自人 Vk L6/JK1基因(其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在本文中描述為SEQ ID NO :55)，其中所述抗體特異性結(jié)合 B7-H4。在其它方面，本發(fā)明提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體包含(a)人Vh 4-34、3-53或3_9基因的重鏈可變區(qū)；以及(b)人Vk A27或VK L6的輕鏈可變區(qū)；其中所述的抗體特異性結(jié)合B7-H4。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗體包含人Vh 4-34基因的重鏈可變區(qū)和AVk A27基 因的輕鏈可變區(qū)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗體包含人Vh 3-53基因的重鏈可變區(qū)和
A27基因的輕鏈可變區(qū)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，所述抗體包含AVh 3-9基因的重 鏈可變區(qū)和人Vk L6基因的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其 抗原結(jié)合片段，所述抗體包含包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；以及包含CDR1、 ⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)；其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序列 和其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO 36、37、38、39和40的氨基酸序列 和其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體以ΙχΚΤΜ或更小的KD與人B7-H4結(jié)合；(d)與用B7-H4轉(zhuǎn)染的人CHO細(xì)胞結(jié)合。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸 序列和其保守修飾的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQ ID N0:31、32、 33,34和35的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。
優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO 11、12、13、14和15的氨基酸 序列和其保守修飾的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO =26,27,
28、29 和30的氨基酸序列和其保守修飾的氨基丨酸序列。特別的組合含有
(a)包含 SEQ ID NO11的!■鏈可變區(qū)CDRl
(b)包含 SEQ ID NO16的!■鏈可變區(qū)CDR2
(C)包含 SEQ ID NO21的!■鏈可變區(qū)CDR3
(d)包含 SEQ ID NO26的輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含 SEQ ID NO31的輕鏈可變區(qū)CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO36的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另--特別的組合含有
(a)包含 SEQ ID NO12的!■鏈可變區(qū)CDRl
(b)包含 SEQ ID NO17的!■鏈可變區(qū)CDR2
(C)包含 SEQ ID NO22的!■鏈可變區(qū)CDR3
(d)包含 SEQ ID NO27的輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含 SEQ ID NO32的輕鏈可變區(qū)CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO37的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另--特別的組合含有
(a)包含 SEQ ID NO13的!■鏈可變區(qū)CDRl
(b)包含 SEQ ID NO18的!■鏈可變區(qū)CDR2
(C)包含 SEQ ID NO23的!■鏈可變區(qū)CDR3
(d)包含 SEQ ID NO28的輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含 SEQ ID NO33的輕鏈可變區(qū)CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO38的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另--特別的組合含有
(a)包含 SEQ ID NO14的!■鏈可變區(qū)CDRl
(b)包含 SEQ ID NO19的!■鏈可變區(qū)CDR2
(C)包含 SEQ ID NO24的!■鏈可變區(qū)CDR3
(d)包含 SEQ ID NO29的輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含 SEQ ID NO34的輕鏈可變區(qū)CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO39的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另--特別的組合含有
(a)包含 SEQ ID NO15的!■鏈可變區(qū)CDRl
(b)包含 SEQ ID NO20的!■鏈可變區(qū)CDR2
(C)包含 SEQ ID NO25的!■鏈可變區(qū)CDR3
(d)包含 SEQ ID NO30的輕鏈可變區(qū)CDRl
(e)包含 SEQ ID NO35的輕鏈可變區(qū)CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO40的輕鏈可變區(qū)CDR3。
本發(fā)明的其它特定的抗體或其抗原結(jié)合片段含有
(a)包含 SEQ ID NO1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
(b)包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一特定的組合含有(a)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一特定的組合含有(a)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一特定的組合含有(a)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一特定的組合含有(a)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含抗體或其抗原結(jié)合部分的抗體-配偶體分子綴 合物，所述抗體與任一前述抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7-H4。本公開(kāi)的抗體可以例如是全長(zhǎng)抗體，例如IgGl、IgG2或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體。 備選地，該抗體可以是抗體片段，諸如Fab、Fab’或Fab’ 2片段，或者是單鏈抗體(例如， scFv)ο本發(fā)明還提供了抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含與治療劑連接的本發(fā) 明的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述治療劑諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素。在特別優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了抗體_配偶體分子綴合物，所述綴合物包含與化合物“毒素A”連接 (例如通過(guò)巰基連接)的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供了以下優(yōu)選的抗體_配偶體分子綴合物(i)包含抗體或其抗原結(jié)合部分的抗體_配偶體分子綴合物，所述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 6的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 9的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與諸如毒素A的毒素連接，如在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?60/882,461中詳細(xì)討論的那樣，其在此全文引入作為參考。(ii)抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含以下抗體或其抗原結(jié)合部分，所 述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)CDRl ；
(b)包含SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 26的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 31的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；或所述綴合物包含以下抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 12的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 27的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 32的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)CDR3?；蛩鼍Y合物包含以下抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 13的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 28的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 38的輕鏈可變區(qū)CDR3?；蛩鼍Y合物包含以下抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 14的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 34的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和(f)包含SEQ ID NO 39的輕鏈可變區(qū)CDR3。或所述綴合物包含以下抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體含有(a)包含SEQ ID NO 15的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 30的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與諸如毒素A的毒素連接；以及(iii)包含抗體或其抗原結(jié)合部分的抗體-配偶體分子綴合物，所述抗體與被包 含以下重鏈可變區(qū)的抗體識(shí)別的相同表位結(jié)合(例如，與后者交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7-H4)，其 中所述的重鏈可變區(qū)含有以下氨基酸序列(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 9的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與諸如毒素A的毒素連接。本發(fā)明還提供雙特異性分子，所述雙特異性分子包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合 部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分連接到具有不同于所述抗體或其抗原結(jié)合部分的結(jié)合特 異性的第二功能部分。還提供組合物，所述組合物包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分或抗體_配偶體 分子綴合物或者雙特異性分子以及可藥用載體。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，以及包含此類(lèi)核酸 的表達(dá)載體、包含此類(lèi)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及應(yīng)用此類(lèi)宿主細(xì)胞制備抗B7-H4抗體的方 法。此外，本發(fā)明提供了包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述小鼠 表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及提供了從此類(lèi)小鼠制備的雜交瘤，其中所述的雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明 的抗體。本公開(kāi)也提供了分離的抗B7-H4抗體-配偶體分子綴合物，其以高親和性與B7-H4 特異性結(jié)合，尤其是包含人單克隆抗體的那些。一些此類(lèi)抗體_配偶體分子綴合物能夠被 表達(dá)B7-H4的細(xì)胞內(nèi)化，以及能夠介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。本發(fā)明還提供了應(yīng)用本文公 開(kāi)的抗B7-H4抗體-配偶體分子綴合物治療諸如乳腺癌和卵巢癌的癌癥的方法。還提供了包含本發(fā)明的與配偶體分子綴合的抗體、或其抗原結(jié)合部分的組合物。 可有利地與本文公開(kāi)的抗體配偶體分子綴合物中的抗體綴合的配偶體分子包括但不限于 作為藥物的分子、毒素、標(biāo)記分子(例如放射性同位素)、蛋白質(zhì)和治療劑。本文還公開(kāi)了包 含抗體_配偶體分子綴合物和可藥用載體的組合物。在一個(gè)方面，此類(lèi)抗體-配偶體分子綴合物經(jīng)由化學(xué)接頭綴合。在一些實(shí)施方案 中，接頭是肽基接頭并且在本文中描述為(L4)p-F-(L1)mt5其它接頭包括胼和二硫化物接頭， 并且在在本文中分別描述為(L4)p-H-⑴^或(L4)p-J-(L1)mt5除了連接到所述配偶體的接頭 之外，本發(fā)明還提供了可切割的接頭臂，其適于連接到基本上任何分子種類(lèi)。在另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所表征的疾 病的方法，其包括給受試者施與治療或預(yù)防所述疾病有效量的包含本發(fā)明的抗B7-H4人抗 體的抗體_配偶體分子綴合物。所述疾病可以是癌癥，諸如乳腺細(xì)胞癌或卵巢癌。在另一方面，本發(fā)明提供了治療自身免疫疾病的方法，其包括給受試者施與治療 自身免疫疾病有效量的包含本發(fā)明的抗B7-H4人抗體的抗體_配偶體分子綴合物。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從以下發(fā)明詳述和實(shí)施例中將是顯而易見(jiàn)的，其中所述 實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制性的。本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank登錄號(hào)、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)均在此明確地引入作為參考。附圖簡(jiǎn)述圖IA顯示IGll人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 41)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :1)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 11)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 16)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 21)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖IB顯示IGll人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO 6)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 26)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 31)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 36)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖2A顯示2A7人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 42)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :2)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO :12)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 17)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 22)，并標(biāo)出了 V、D和J種系衍生物。圖2B顯示2A7人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :7)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 27)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 32)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 37)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖3A顯示2F9人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 43)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO 3)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 13)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 18)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 23)，并標(biāo)出了 V、D和J種系衍生物。圖3B顯示2F9人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :8)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 28)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 33)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 38)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖4A顯示12E1人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 44)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO 4)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 14)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 19)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 24)，并標(biāo)出了 V、D和J種系衍生物。圖4B顯示12E1人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :9)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 29)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 34)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 39)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖5A顯示13D12人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 45)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :5)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO 15)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 20)和 CDR3 區(qū)(SEQ ID NO 25)，并標(biāo)出了 V、D和J種系衍生物。圖5B顯示13D12人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)和氨 基酸序列(SEQ ID NO 10)。描述了 CDRl 區(qū)(SEQ ID NO :30)、CDR2 區(qū)(SEQ ID NO 35)和 CDR3區(qū)(SEQ ID NO 40)，并標(biāo)出了 V和J種系衍生物。圖6顯示IGll和13D12的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh 4-34氨基酸序列 (SEQ ID NO 51)的比對(duì)。圖7顯示2A7和2F9的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh 3-53氨基酸序列(SEQ ID NO 52)的比對(duì)。圖8顯示12E1的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與組合的人種系VH3-9/D3_10/JH6b氨基 酸序列(SEQ ID NO 53)的比對(duì)。圖9顯示1G11、2A7、2F9和13D12的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vk A27氨基酸序列(SEQ ID NO 54)的比對(duì)。

圖10顯示12E1的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與組合的人種系Vk L6/JK1氨基酸序列 (SEQ ID NO 55)的比對(duì)。圖IlA和IlB顯示ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其證實(shí)了針對(duì)人08E的人單克隆抗體與08E 特異性結(jié)合。圖IlA顯示了來(lái)自如下的結(jié)果用人抗08E抗體包被ELISA板并隨后添加純 化的08E蛋白質(zhì)并用兔抗08E抗血清檢測(cè)。圖IlB顯示了來(lái)自如下的結(jié)果用抗小鼠Fe、隨 后用單克隆抗C9(0.6yg/ml)包被ELISA板，然后如所標(biāo)出的那樣用五-08E蛋白質(zhì)滴定， 并且隨后用1 μ g/ml的人抗08E抗體滴定。圖12顯示了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證實(shí)抗08E人單克隆抗體2A7與08E轉(zhuǎn)染 的CHO細(xì)胞結(jié)合。圖13顯示了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證實(shí)在SKBR3乳腺癌細(xì)胞中以及在08E轉(zhuǎn) 染的SK0V3和HEK細(xì)胞中表達(dá)08E。圖14顯示了 Hum-Zap內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其證實(shí)針對(duì)人08E的人單克隆抗體可內(nèi)化至 08E+CH0細(xì)胞中。圖15顯示了 Hum-Zap內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其證實(shí)針對(duì)人08E的人單克隆抗體可內(nèi)化至 08E+SKBR3 細(xì)胞中。圖16顯示了用包括1G11、2A7、2F9和13D12在內(nèi)的各種人抗08E單克隆抗體的表
位作圖研究的結(jié)果。圖17顯示了抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定法的結(jié)果，其證實(shí)了人單克隆抗08E 抗體以ADCC依賴性方式殺死人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3。圖18顯示了抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定法的結(jié)果，其證實(shí)了人單克隆抗08E 抗體以ADCC依賴性方式殺死08E轉(zhuǎn)染的SK0V3細(xì)胞。圖19顯示了抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定法的結(jié)果，其證實(shí)了人單克隆抗08E 抗體以濃度和ADCC依賴性方式殺死人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3。圖20顯示了在SCID小鼠上的體內(nèi)研究結(jié)果，其顯示通過(guò)抗08E抗體抑制了 HEK-B7H4腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)。圖21呈現(xiàn)了曲線圖，其顯示了 HEK293-B7H4異種移植的小鼠模型的體內(nèi)結(jié)果，展 現(xiàn)了用各種濃度的單獨(dú)的運(yùn)載體、裸抗體、或抗體-配偶體分子綴合物治療的小鼠中的腫 瘤體積中位數(shù)。圖22呈現(xiàn)了曲線圖，其顯示了 HEK293-B7H4異種移植的小鼠模型的體內(nèi)結(jié)果，展 現(xiàn)了用各種濃度的單獨(dú)的運(yùn)載體、裸抗體、或抗體-配偶體分子綴合物治療的小鼠中的體 重改變中位數(shù)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗體-配偶體分子綴合物，所述綴合物包含以高親和性與B7_H4(a/k/ a 08E、B7S1和B7x)特異性結(jié)合的單克隆抗體，尤其是人序列單克隆抗體。在某些實(shí)施方案 中，本發(fā)明的抗體衍生自特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，諸如含 有特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體、制備此類(lèi)抗體的方法、抗體_配偶體 分子綴合物和包含此類(lèi)抗體的雙特異性分子以及含有所述抗體、抗體_配偶體分子綴合物 或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用所述抗體_配偶體分子綴合物的方法，諸如用于檢測(cè)B7-H4，以及用于治療與B7-H4的表達(dá)相關(guān)的疾病，諸如癌癥。因此，本發(fā)明還 提供使用本發(fā)明的抗B7-H4抗體-配偶體分子綴合物治療各種癌癥的方法，例如，治療乳腺 細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移的乳腺癌、卵巢細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移的卵巢癌和腎細(xì)胞癌。為更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。另外的定義在整個(gè)詳述中闡明。術(shù)語(yǔ)“B7-H4”、“08E”、“B7X”、和“B7SΓ，在本文中可互換使用，并且包括人B7-H4的 變體、同種型、同源物、直向同源物和旁系同源物。例如在某些情況下，對(duì)B7-H4特異性的抗 體可以與來(lái)自非人物種的B7-H4交叉反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，對(duì)B7-H4特異性的抗體可 以是對(duì)人B7-H4完全特異的并且可不顯示物種或其它類(lèi)型的交叉反應(yīng)性。術(shù)語(yǔ)“人B7-H4” 是指人序列B7-H4，諸如具有Genbank登錄號(hào)NP_078902 (SEQ ID NO 56)的人B7-H4的完 全氨基酸序列。B7-H4在本領(lǐng)域還稱為，例如BL-CAM、B3、Leu-14和Lyb-8。人B7-H4可以 由于具有例如保守突變或在非保守區(qū)中的突變而不同于SEQ ID N0:56的人B7-H4，并且該 B7-H4具有與SEQ ID NO :56的人B7-H4基本上相同的生物功能。例如，人B7-H4的生物功能 是在B7-H4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上具有表位，所述表位被本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合，或人B7-H4 的生物功能包括例如，抑制T-細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制細(xì)胞周期產(chǎn)生、或與T細(xì) 胞受體結(jié)合。特定的人B7-H4序列在氨基酸序列上通常至少90%同一于SEQ IDNO 56的人 B7-H4并且含有當(dāng)與其它物種(例如，鼠)的B7-H4氨基酸序列比較時(shí)將氨基酸序列鑒定 為人源的氨基酸殘基。在某些情況下，人B7-H4在氨基酸序列上可以至少95%或甚至至少 96%、97%、98%或99%同一于SEQ ID N0:56的B7-H4。在某些實(shí)施方案中，人B7-H4序列 將顯示不超過(guò)10個(gè)不同于SEQ ID N0:56的B7-H4的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，人B7-H4 可顯示不超過(guò)5個(gè)或甚至不超過(guò)4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)不同于SEQ ID NO 56的B7-H4的氨 基酸。同一性百分?jǐn)?shù)可以如本文所述進(jìn)行測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”是指例如，淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、以及由上 述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子、以及補(bǔ)體)的作用，這些作用導(dǎo) 致對(duì)侵入性病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或者，在自身免疫或病理炎癥情 況下，對(duì)正常的人類(lèi)細(xì)胞或組織的選擇性損害、破壞或?qū)⑺鼈儚娜梭w清除?！靶盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系，這些分子在將信 號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞到細(xì)胞的另一部分中發(fā)揮作用。如本文所使用的短語(yǔ)“細(xì)胞表面受 體”包括例如能夠接受信號(hào)并將這種信號(hào)跨細(xì)胞原生質(zhì)膜傳遞的分子及分子的復(fù)合體。本 發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的實(shí)例是B7-H4受體。本文所稱的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部 分”)或其單鏈?！翱贵w”指包括通過(guò)二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(H鏈)及兩條輕鏈 (L鏈)的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每一條重鏈都包含重鏈可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為Vh)以 及重鏈恒定區(qū)。該重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，ChI、CH2以及Ch3。每一條輕鏈都包含輕鏈 可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為VJ及輕鏈恒定區(qū)。該輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q。V1^nt可以 進(jìn)一步被細(xì)分為多個(gè)高變區(qū)，被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間散布有較保守的被稱為構(gòu)架區(qū) (FR)的區(qū)域。每個(gè)Vh以及\均由3個(gè)CDR及4個(gè)FR組成，從氨基端至羧基端按照以下順 序排布FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主的組織或因子的結(jié)合，這些宿主的組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或“抗體部分”)是指保留特異性結(jié)合 抗原(例如B7-H4)的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以 由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括 (i)Fab片段，其為由\、VH、(^結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，為包括在鉸 鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab’片段，它實(shí)質(zhì)上是帶有鉸鏈區(qū)部 分的 Fab (參見(jiàn)，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul 編著，第 3 版 1993) ； (iv)由 Vh 及 ChI 結(jié)構(gòu) 域組成的Fd片段；(ν)由抗體的單臂的\及Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi) dAb片段(Ward 等，(1989) Nature 341 :544_546)，它由Vh結(jié)構(gòu)域組成；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；以 及(viii)納米抗體(nanobody)，其為含有單可變結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。 此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域即\與Vh是由分開(kāi)的基因編碼的，但是可以使用重組方 法由合成接頭將它們連接起來(lái)，使得它們作為單一蛋白鏈得以制備，其中\(zhòng)及\區(qū)域配對(duì) 形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(jiàn)例如Bird等(1988) Science 242 :423_426 ；及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883)。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分” 也旨在涵蓋此類(lèi)單鏈抗體。這些抗體片段可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并 且對(duì)于這些片段進(jìn)行的有用性的篩選與篩選完整抗體的方式相同。本文所使用的“分離的抗體”指這樣的抗體，即其基本上沒(méi)有具有不同抗原特異性 的其它抗體(例如，特異性結(jié)合B7-H4的分離的抗體基本上沒(méi)有特異性結(jié)合非B7-H4的其 它抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合B7-H4的分離的抗體可對(duì)其它抗原，諸如來(lái)自其它物種 的B7-H4分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上沒(méi)有其它細(xì)胞材料和/或化 學(xué)物質(zhì)。本文所所使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一分子組分的 抗體分子制備物。單克隆抗體組合物顯示了針對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性及親和力。本 文所使用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”或“人序列抗體”意指包括具有這樣的可變區(qū)的抗體，即在這些 可變區(qū)中構(gòu)架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。此外，如果該抗體含有恒定 區(qū)，則該恒定區(qū)也衍生自人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。人抗體可包括后期修飾，所述修飾包括 天然或人為修飾。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人類(lèi)種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基 酸殘基(例如，在體外由隨機(jī)誘變或位點(diǎn)特異性誘變引入的突變或在體內(nèi)由體細(xì)胞突變引 入的突變)。然而，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”并非意指包括以下抗體其中衍生自另一個(gè) 哺乳動(dòng)物物種(諸如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類(lèi)構(gòu)架區(qū)序列上。術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”，其在“人”后面可包括術(shù)語(yǔ)“序列”，是指顯示出單一結(jié)合特 異性的抗體，這些抗體具有這樣的可變區(qū)，即其中構(gòu)架區(qū)和⑶R區(qū)均衍生自人類(lèi)種系免疫 球蛋白序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人 類(lèi)的動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細(xì)胞，所述動(dòng)物具有包含融合至永生化細(xì)胞的人類(lèi) 重鏈轉(zhuǎn)基因及輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有 人抗體，諸如(a)從動(dòng)物(例如小鼠)中分離的抗體，該動(dòng)物對(duì)于人類(lèi)免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn) 基因的或轉(zhuǎn)染色體的，或從由其制備出的雜交瘤分離的抗體(以下將進(jìn)一步說(shuō)明)；(b)從 經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)染瘤)中分離的抗體，(c)從重組的組合人抗體文庫(kù)中分離的抗體，以及(d)通過(guò)任何其它方法來(lái)制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，其中所 述方法包括將人類(lèi)免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列中。此類(lèi)重組人抗體具有這樣 的可變區(qū)，即其中構(gòu)架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自于人類(lèi)種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實(shí)施 方案中，此類(lèi)重組人抗體可經(jīng)受體外誘變(或者，在使用人類(lèi)Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，經(jīng)受 體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的Vh和\區(qū)域的氨基酸序列為這樣的序列其盡管 衍生自人類(lèi)種系Vh和\序列并與之相關(guān)，但是并不天然存在于體內(nèi)人抗體種系所有組成成 分之中。術(shù)語(yǔ)“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(lèi)(例如IgM或IgGl)。短語(yǔ) “識(shí)別抗原的抗體”與“對(duì)抗原特異的抗體”在本文中可與術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合抗原的抗體”互
換使用。術(shù)語(yǔ)“人抗體衍生物”是指人抗體的任何經(jīng)修飾的形式，例如，該抗體與另一種試 劑或抗體的綴合物。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”意指以下抗體，即其中衍生自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種 (諸如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類(lèi)構(gòu)架序列上?？梢栽谌祟?lèi)構(gòu)架序列中進(jìn)行額 外的構(gòu)架區(qū)修飾。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”意指以下抗體，其中可變區(qū)序列衍生自一個(gè)物種而恒定區(qū)序列 衍生自另一個(gè)物種，諸如其中可變區(qū)序列衍生自小鼠抗體而恒定區(qū)序列衍生自人抗體的抗 體。術(shù)語(yǔ)“抗體模擬物”意指能夠模擬抗體結(jié)合抗原之能力的分子，但是它們不局限于 天然抗體結(jié)構(gòu)。此類(lèi)抗體模擬物的實(shí)例包括但不限于親和體(AfTibody)、經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白 重復(fù)蛋白(DARPin)、抗運(yùn)載蛋白(Anticalin)、Avimer、以及萬(wàn)能抗體(Versabody)，所有這 些應(yīng)用這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)，即當(dāng)它們模擬傳統(tǒng)抗體結(jié)合時(shí)，所述結(jié)構(gòu)產(chǎn)自不同的機(jī)制并且通 過(guò)不同的機(jī)制作用。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“配偶體分子”指在抗體_配偶體分子綴合物中與抗體綴合 的實(shí)體。配偶體分子的實(shí)例包括藥物、毒素、標(biāo)記分子(包括但不限于肽和小分子標(biāo)記，諸 如熒光染料標(biāo)記，以及單原子標(biāo)記，諸如放射性同位素)、蛋白質(zhì)以及治療劑。如本文所用，“特異性結(jié)合人B7-H4”的抗體意圖指這樣的抗體，其以Ix 10_7M或更 小，更優(yōu)選5χ10_8Μ或更小，更優(yōu)選3χ 10、或更小，更優(yōu)選Ix 10、或更小，甚至更一般地 5x ICT9M或更小的Kd結(jié)合人Β7-Η4。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞是指不結(jié)合或不以高親和力結(jié)合 蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即，以1Χ10_6Μ或更大，更優(yōu)選為1Χ10_5Μ或更大，更優(yōu)選為1Χ10_4Μ或更 大，更優(yōu)選為1Χ10_3Μ或更大，甚至更優(yōu)選為1Χ10_2Μ或更大的Kd結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)"Kass。?！被颉癒a”旨在表示特定的抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率， 而本文使用的術(shù)語(yǔ)"Kdis”或“K/’旨在表示特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使 用的術(shù)語(yǔ)“KD”旨在表示解離常數(shù)，它是由&與1之比(即Kd/Ka)得到，并被表示為摩爾濃 度(M)?？贵w的Kd值可以使用本領(lǐng)域成熟的方法得以確定。確定抗體的Kd的優(yōu)選方法是 通過(guò)使用表面等離子共振，優(yōu)選使用諸如Biaeore 系統(tǒng)的生物傳感器系統(tǒng)。如本文所使用的那樣，術(shù)語(yǔ)IgG抗體的“高親和性”指抗體對(duì)于靶抗原具有Ix 10_7M或更小、更優(yōu)選5x IO-8M或更小、甚至更優(yōu)選IxlO-8M或更小、甚至更優(yōu)選5x 10_9M或 更小并且甚至更優(yōu)選Ix IO-9M或更小的KD。然而，“高親和性”結(jié)合對(duì)于其它抗體同種型可以不同。例如，IgM同種型的“高親和性”結(jié)合指抗體具有ICT6M或更小、更優(yōu)選ICT7M或更 小、甚至更優(yōu)選10_8M或更小的KD。如本文所使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“受試者，，包括任何人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類(lèi) 動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物，諸如非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、犬、貓、 馬、奶牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等等。符號(hào)“_”不管用作鍵還是與鍵正交顯示，均表明這樣的點(diǎn)，其中所顯示的部分在該 點(diǎn)與分子的剩余部分、固相支持物等連接。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷基”，就其本身或作為另一個(gè)取代基的部分，是指直鏈或支 鏈的或環(huán)狀烴基、或它們的組合，其可以是完全飽和的、單不飽和的、或多不飽和的，并且可 包括二價(jià)以及多價(jià)基團(tuán)，具有所指定的碳原子數(shù)目(即C1-Cltl是指1至10個(gè)碳原子)。飽 和烴基的實(shí)例包括但不限于以下基團(tuán)，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異 丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、 正辛基的同系物或異構(gòu)體，等等。不飽和烷基基團(tuán)是具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的基團(tuán)。 不飽和烷基基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-( 丁二烯 基)、2，4_戊二烯基、3-(1，4_戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3- 丁炔基，以 及更高級(jí)同系物以及異構(gòu)體。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烷基”還意在包括那些以下詳細(xì)說(shuō)明的 烷基衍生物，諸如“雜烷基”。限于烴基基團(tuán)的烷基基團(tuán)被稱為“同烷基(homoalkyl) ”。術(shù)語(yǔ)“亞烷基”其本身或作為另一個(gè)取代基的部分是指衍生自鏈烷的二價(jià)基團(tuán)，例 如但不限于-CH2CH2CH2CH2-,并且進(jìn)一步包括那些如下說(shuō)明為“雜亞烷基”的基團(tuán)。一般地， 烷基(或亞烷基)基團(tuán)將具有1到24個(gè)碳原子，其中具有10個(gè)或更少碳原子的那些基團(tuán) 在本發(fā)明中是優(yōu)選的?！暗图?jí)烷基”或“低級(jí)亞烷基”是較短鏈的烷基或亞烷基基團(tuán)，通常具 有八個(gè)或更少的碳原子。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“雜烷基”就其本身或與另一個(gè)術(shù)語(yǔ)組合，是指穩(wěn)定的直鏈或 支鏈、或環(huán)狀烴基、或它們的組合，其由所說(shuō)明的數(shù)目的碳原子以及至少一個(gè)雜原子組成， 其中所述雜原子選自0、N、Si和S，并且其中氮、碳、以及硫原子可任選地被氧化，并且氮 雜原子可任選地被季銨化。一個(gè)或多個(gè)雜原子0、N、S、及Si可位于雜烷基基團(tuán)的任何內(nèi) 部位置，或可位于該烷基基團(tuán)附著于該分子的其余部分的位置。實(shí)例包括但不限于-CH2 -CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N (CH3) -CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S (0) -CH3、-CH 2-CH2-S (O)2-CH3、-CH = CH-O-CH3、-Si (CH3) 3、-CH2-CH = N-OCH3 和-CH = CH-N(CH3)-CH3。 多達(dá)兩個(gè)雜原子可以是連續(xù)的，例如諸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si (CH3) 3。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ) “雜亞烷基”就其本身或作為另一個(gè)取代基的部分是指衍生自雜烷基的二價(jià)基，例如但不 限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于雜亞烷基基團(tuán)，雜原子也可 占據(jù)鏈末端的任一端或兩端(例如，亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基等 等)。術(shù)語(yǔ)“雜烷基”與“雜亞烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(參見(jiàn)例如，Shearwater Polymers Catalog，2001)。此外，對(duì)于亞烷基以及雜亞烷基連接基團(tuán)，書(shū)寫(xiě)連接基團(tuán)的分子 式的方向并不表示連接基團(tuán)的方向。例如，式-C(O)2R'-代表-C(O)2R'-以及-R’ C(O)2-0與術(shù)語(yǔ)“烷基”或“雜烷基”組合使用的術(shù)語(yǔ)“低級(jí)”是指具有1到6個(gè)碳原子的部 分。術(shù)語(yǔ)“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺?；薄⒁约啊巴榱蚧?或硫代烷氧基)都是以它們的常規(guī)意義使用，并分別指通過(guò)氧原子、氨基基團(tuán)、SO2基團(tuán)、或硫原子附著于該分子的 其余部分的那些烷基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“芳基磺酰基”是指通過(guò)SO2基團(tuán)附著于該分子其余部分的 芳基基團(tuán)，且術(shù)語(yǔ)“巰基”是指SH基團(tuán)。一般而言，“酰基取代基”也選自以上所給出的組。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“酰基取 代基”指附著于羰基碳并滿足其化合價(jià)的基團(tuán)，該羰基碳直接或間接地附著于本發(fā)明的化 合物的多環(huán)核上。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”與“雜環(huán)烷基”，就它們本身或與其它術(shù)語(yǔ)組合，分別 表示環(huán)型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“雜烷基”。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基， 雜原子可占據(jù)這樣的位置，即雜環(huán)在該位置上附著于分子的其余部分。環(huán)烷基的實(shí)例包括 但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括但 不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1_哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、 四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基 等等。環(huán)結(jié)構(gòu)的雜原子以及碳原子可任選地被氧化。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“鹵”或“鹵素”，就它們自身或作為另一個(gè)取代基的部分，是指 氟、氯、溴、或碘原子。此外，諸如“鹵烷基”的術(shù)語(yǔ)是指包括單鹵烷基以及多鹵烷基。例如， 術(shù)語(yǔ)“鹵(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2_三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙
其絕絕寸寸。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“芳基”是指取代或未取代的多不飽和的芳香烴取代基，它可 以是單一的環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選地1至3個(gè)環(huán))，這些環(huán)稠合在一起或以共價(jià)鍵相連接。術(shù)語(yǔ) “雜芳基”指這樣的芳基基團(tuán)(或環(huán))，即所述芳基基團(tuán)(或環(huán))含有一至四個(gè)選自N、0、以 及S的雜原子，其中氮、碳以及硫原子任選地被氧化，并且氮原子任選地被季銨化的。雜芳 基可以通過(guò)雜原子附著于該分子的其余部分。芳基以及雜芳基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括 苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、 4-咪唑基、吡嗪基、2- P惡唑基、4-噴唑基、2-苯基-4- 唑基、5- 唑基、3-異嘴唑基、 4-異唑基、5-異巧悉唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻 吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌 呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹 啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一個(gè)芳基以及雜芳基環(huán)體系的取代基選自以下描述的 可接受的取代基?！胺蓟币约啊半s芳基”還包括這樣的環(huán)體系，即其中一個(gè)或多個(gè)非芳香環(huán) 體系被稠合、或者以其它方式結(jié)合至芳基或雜芳基體系上。簡(jiǎn)言之，術(shù)語(yǔ)“芳基”當(dāng)與其它術(shù)語(yǔ)(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)組合使用時(shí)， 包括以上定義的芳基環(huán)以及雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語(yǔ)“芳烷基”意在包括其中芳基基團(tuán)附著于 烷基基團(tuán)的那些基團(tuán)(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其中所述的烷基基團(tuán)包括 其中碳原子(例如，亞甲基基團(tuán))已被例如氧原子取代的那些烷基基團(tuán)(例如苯氧基甲基、 2_吡啶基氧基甲基、3-(1_萘氧基)丙基等等)。以上術(shù)語(yǔ)(例如“烷基”、“雜烷基”、“芳基”、以及“雜芳基”)各自均包括指定基團(tuán) 的取代以及未取代的形式。以下提供每個(gè)類(lèi)型基團(tuán)的優(yōu)選取代基。烷基以及雜烷基(包括那些經(jīng)常提到的如亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜烯 基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、以及雜環(huán)烯基)的取代基一般分別稱為“烷基取代基”以及“雜烷基取代基”，并且它們可以是一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)，這些基團(tuán)選自但不限 于-OR，、= 0、= NR，、= N-OR，、-NR，R”、-SR，、-鹵素、-SiR' R”R”，、-OC (0)R，、-C(O) R，、-CO2R'、-CONR' R”、-OC (0) NR，R”、-NR” C (0) R，、-NR，-C (0) NR” R”，、-NR” C (0) 2R，、-NR-C(NR，R”R”，) = NR””、-NR-C(NR，R”)= NR””、_S (0) R，、_S (0) 2R，、_S (0) 2NR，R",-NRSO2R' 、-CN和-NO2，數(shù)量在從0到(2m’ +1)的范圍內(nèi)，其中m’是此類(lèi)基團(tuán)的碳原子的總數(shù)。R’、 R”、R”’以及R””各自均優(yōu)選地獨(dú)立地指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基， 例如取代有1至3個(gè)鹵素的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)、或芳烷 基基團(tuán)。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括超過(guò)一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如，當(dāng)存在超過(guò)一個(gè)這些基團(tuán)時(shí)，這 些R基團(tuán)各自均獨(dú)立地選為R’、R”、R”’以及R””基團(tuán)。當(dāng)R’和R”附著于相同的氮原子 時(shí)，它們可與氮原子組合成5、6、或7元環(huán)。例如，-NR’ R”旨在包括，但不局限于，1-吡咯烷 基以及4-嗎啉基。從以上取代基的討論中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白術(shù)語(yǔ)“烷基”旨在包括 這樣的基團(tuán)，即所述基團(tuán)包括結(jié)合到非氫基團(tuán)的基團(tuán)上的碳原子，諸如鹵烷基(例如，-CF3 和-CH2CF3)以及酰基(例如，-C (0) CH3、-C (0) CF3、-C (0) CH2OCH3 等)。類(lèi)似于對(duì)烷基基團(tuán)所說(shuō)明的取代基，芳基取代基以及雜芳基取代基通常 分別被稱為“芳基取代基”以及“雜芳基取代基”，并且是不同的并選自，例如鹵 素、-OR，、 =0、 = NR，、 = N-OR，、-NR，R”、-SR，、-鹵素、-SiR，R” R”，、-OC (0) R，、-C (0) R，、-CO2R，、-CONR，R，，、-OC (0) NR，R，，、-NR，，C (0) R，、-NR，-C (0) NR” R”，、-NR” C (0) 2R，、-NR-C (NR，R” ) = NR”，、-S (0) R，、-S (0) 2R，、-S (0) 2NR，R”、-NRSO2R' 、-CN和-NO2, -R’，-N3, -CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，并且其數(shù)目從0 到芳香環(huán)體系上開(kāi)放化合價(jià)的總數(shù)的范圍內(nèi)；并且其中R’、R”、R”’以及R””優(yōu)選獨(dú)立地選 自氫、(C1-C8)烷基以及雜烷基、未取代的芳基和雜芳基、(未取代的芳基P(C1-C4)烷基、以 及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括超過(guò)一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如， 當(dāng)存在超過(guò)一個(gè)這些基團(tuán)時(shí)所述R基團(tuán)各自均被獨(dú)立地選為R’、R”、R”’以及R””基團(tuán)。任選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)芳基取代基可被 式-T-C(O)-(CRR' )q-u-的取代基取代，其中，T和U獨(dú)立為-NR-、_0_、-CRR，-或單鍵； 且q是從0到3的整數(shù)。備選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選被 式-A- (CH2) r-B-的取代基取代，其中，A 和 B 獨(dú)立地為-CRR，-、-0-、-NR-、-S-、-S (0) -、-S (0) 2 -、-S(0)2NR’_或單鍵；且r是從1到4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可任選被雙鍵代 替。備選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子的取代基上的兩個(gè)取代基可任選地被式-(CRR’) S-X- (CR”R”’) d-的取代基取代，其中s和d獨(dú)立地是從0至3的整數(shù)，并且X是-0-、-NR’ -、-5-、-5(0)-、-5(0)2-或-5(0)2殿，。優(yōu)選地，取代基R、R，、R”以及R”，獨(dú)立地選自氫或取代 或未取代的(C1-C6)烷基。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“二磷酸酯”包括但不限于含有兩個(gè)磷酸酯基團(tuán)的磷酸的酯。術(shù) 語(yǔ)“三磷酸酯”包括但不限于含有三個(gè)磷酸酯基團(tuán)的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷 酸酯的特定藥物包括三磷酸酯本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜原子”包括氧(0)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。除非上下文另有說(shuō)明，符號(hào)“R”是一個(gè)通用縮寫(xiě)，其代表選自以下的取代基取代 或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、 以及取代或未取代的雜環(huán)基基團(tuán)。在以下各分部中進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的不同方面。具有特定功能件質(zhì)的抗B7-H4抗體本發(fā)明的抗體由該抗體的特定功能特征或性質(zhì)所表征。例如，該抗體特異性結(jié)合 人B7-H4，諸如在細(xì)胞表面上表達(dá)的人B7-H4。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和性結(jié)合人 B7-H4，例如以Ix 10_7M或更小的KD，更優(yōu)選以5x 10_8M或更小的Kd,以及甚至更優(yōu)選以Ix IO-8M或更小的Kd結(jié)合。本發(fā)明的抗B7-H4抗體結(jié)合人B7-H4并且優(yōu)選顯示下列性質(zhì)中的 一種或更多種(a)以Ix 10_8M或更小的親和性結(jié)合人B7-H4 ；(b)被表達(dá)B7-H4的細(xì)胞內(nèi)化；(c)對(duì)表達(dá)B7-H4的細(xì)胞顯示出抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)；和(d)當(dāng)綴合至細(xì)胞毒素時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體顯示性質(zhì)(a)、(b)、(C)和(d)的至少兩種。在 一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體顯示性質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)的至少三種。在甚至一個(gè) 更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體顯示所有四種性質(zhì)(a)、(b)、(c)和(d)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，該抗體以5x IO-9M或更小的親和性結(jié)合B7-H4。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng) 該抗體綴合至細(xì)胞毒素時(shí)其在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以5x 10、或更小的Kd結(jié)合B7-H4蛋白，以3x 10、或更 小的Kd結(jié)合B7-H4蛋白，以Ix IO-8M或更小的Kd結(jié)合B7-H4蛋白，以7x ICT9M或更小的Kd 結(jié)合B7-H4蛋白，以6x 10_9M或更小的Kd結(jié)合B7-H4蛋白或以5x 10_9M或更小的Kd結(jié)合 B7-H4蛋白?？贵w對(duì)B7-H4的結(jié)合親和性可以通過(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)的BIAC0RE分析進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)估抗體對(duì)B7-H4的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法是本領(lǐng)域公知的，例如包括ELISA、蛋 白質(zhì)印跡、RIA和流式細(xì)胞分析?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和力)也可通過(guò)本領(lǐng)域 公知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估，諸如通過(guò)elisa、斯卡查德和Biacore 系統(tǒng)分析。作為另一 個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的抗體可與乳腺癌腫瘤細(xì)胞系例如SKBR3細(xì)胞系結(jié)合。單克隆抗體1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12本發(fā)明的示例性抗體包括如在PCT申請(qǐng)PCT/US2006/061816中分離并結(jié)構(gòu)表征的 人單克隆抗體1G11、2A7、2F9、12E1和13D12，所述PCT申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖?。IGlU 2A7、2F9、12E1和13D12的乂11氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO :1、2、3、4和5中。IGlU 2A7、2F9、12E1和13D12的&氨基酸序列分別顯示在SEQ ID N0:6、7、8、9和10中。
考慮到這些抗體中每一種均可以結(jié)合B7-H4，這些V1^nt序列可以“混合并匹配”， 從而產(chǎn)生本發(fā)明的其它的抗B7-H4結(jié)合分子。B7-H4與此類(lèi)“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可 以用上文所述的結(jié)合測(cè)定法(例如FACS或ELISA)來(lái)檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)Vh和\鏈混合并匹 配時(shí)，來(lái)自特定VH/VL配對(duì)的Vh序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的Vh序列。同樣，一般地，來(lái)自特 定VH/\配對(duì)的\序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的\序列。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離 的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其含有(a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4和5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO :6、7、8、9和10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體 與B7-H4、優(yōu)選人B7-H4特異性結(jié)合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(c)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(d)包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(e)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(f)包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(g)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(h)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(i)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(j)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供包含1G11、2A7、2F9、12E1和13D12的重鏈和輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3或其組合的抗體。1G11、2A7、2F9、12E1和13D 12的Vh CDRl的氨基酸序列分別 示于 SEQ ID NO :11、12、13、14 和 15 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vh CDR2 的氨基酸 序列分別示于 SEQ ID NO :16、17、18、19 和 20 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vh CDR3 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vk CDRl 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO :26、27、28、29 和 30 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12&VK CDR2 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO :31、32、33、34和 35 中。1G11、2A7、2F9、 12E1和13D12的Vk CDR3的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO :36、37、38、39和40中。CDR區(qū) 用 Kabat 系統(tǒng)(Kabat, Ε· A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，U. S. D印artment of Health and Human Services，NIH 出版號(hào) 91-3242)描述。考慮到稱為1G11、2A7、2F9、12E1和13D12的人抗體的每一個(gè)均能與B7-H4結(jié)合， 并且抗原結(jié)合特異性主要是由⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)提供的，因此Vh⑶R1、⑶R 2和⑶R 3 序列與Vk⑶RlWDR 2和⑶R 3序列可以“混合并匹配”(即來(lái)自不同抗體的⑶R可以混合 并匹配，盡管每個(gè)抗體必須含有Vh⑶Rl、⑶R 2和⑶R 3 ^P Vk CDR 1、⑶R 2和⑶R 3)，從 而產(chǎn)生本發(fā)明的其它的抗B7-H4結(jié)合分子。B7-H4與此類(lèi)“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可以 用上文所述的結(jié)合測(cè)定法(例如FACS、ELiSA、Biacore 系統(tǒng)分析)測(cè)試。優(yōu)選地，當(dāng)Vh ⑶R序列混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相 似的⑶R序列。同樣，當(dāng)\⑶R序列混合并匹配時(shí)，來(lái)自特定￥￡序列的⑶R1、⑶1 2和/或 CDR3序列一般被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)Vh和/或\⑶R區(qū)序列替換為來(lái)自本文公開(kāi)的單克隆抗體1G11、2A7、 2F9、12E1和13D12的⑶R序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和Vl序列。因此，在 另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其含有(a)包含選自SEQ ID NO 11、12、13、14和15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含選自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含選自SEQ ID NO 26、27、28、29和30的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含選自SEQ ID NO :31、32、33、34和35的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和(f)包含選自SEQ ID NO :36、37、38、39和40的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其 中該抗體與B7-H4、優(yōu)選與人B7-H4特異性結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體含有(a)包含SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 26的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 31的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和(f)包含SEQ ID NO 36的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體含有(a)包含SEQ ID NO 12的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 27的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 32的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 37的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體含有(a)包含SEQ ID NO 13的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 28的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 38的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體含有(a)包含SEQ ID NO 14的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 34的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 39的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括
(a)包含SEQ ID NO 15的重鏈可變區(qū)CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 30的輕鏈可變區(qū)CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 40的輕鏈可變區(qū)CDR3。本領(lǐng)域公知，不依賴于⑶Rl和/或⑶R2結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)的⑶R3結(jié)構(gòu)域就能夠決定抗 體對(duì)于相關(guān)抗原的結(jié)合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預(yù)測(cè)性地產(chǎn)生具有相同結(jié) 合特異性的多種抗體。參見(jiàn)，例如，Klimka等，British J. of Cancer 83(2) =252-260(2000) (描述了僅使用鼠抗⑶30抗體Ki-4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶R3產(chǎn)生人源化抗⑶30抗體)； Beiboer 等，J. Mol Biol. 296 :833_849 (2000)(描述了僅使用親本鼠 M0C-31 抗 EGP-2 抗體 的重鏈CDR3序列產(chǎn)生重組上皮糖蛋白-2 (EGP-2)抗體)；Rader等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α. 95 :8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯(lián)蛋白α ν β 3抗體LM609的重鏈和輕鏈可 變CDR3結(jié)構(gòu)域的一組人源化抗整聯(lián)蛋白α νβ 3抗體，其中每個(gè)成員抗體在CDR3結(jié)構(gòu)域之 外含有不同的序列，并且能夠與親本鼠抗體結(jié)合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣 高或更高)；Barbas 等，J.Am· Chem. Soc. 116 :2161_2162 (1994)(公開(kāi)了 CDR3 結(jié)構(gòu)域?qū)乖?結(jié)合提供了最重要的貢獻(xiàn))；Barbas 等，Proc，Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :2529_2533 (1995) (描述了抗人胎盤(pán)DNA的三種Fab (SI-1，SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列移植入抗破傷 風(fēng)類(lèi)毒素Fab的重鏈上，由此替換了存在的重鏈⑶R3，并且證明單獨(dú)的⑶R3提供結(jié)合特 異性)；和Ditzel等，J. Immunol. 157 :739_749 (1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異 性IgG破傷風(fēng)類(lèi)毒素結(jié)合Fab p313抗體轉(zhuǎn)移親本多特異性Fab LNA3的重鏈⑶R3足以保 留親本 Fab 的結(jié)合特異性)；Berezov 等，BIAjournal 8 =Scientific Review 8(2001)(描 述了基于抗HER2單克隆抗體CDR3的肽模擬物)；Igarashi等，J. Biochem(Tokyo) 117 452-7(1995)(描述了相應(yīng)于抗磷脂酰絲氨酸抗體CDR3結(jié)構(gòu)域的12個(gè)氨基酸的合成多 肽)；Bourgeois等，J.Virol互807_10 (1998)(顯示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV) 抗體重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單肽能夠在體外中和該病毒)；Levi等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.巡4374-8 (1993)(描述了基于鼠抗HIV抗體重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的肽)；Polymenis和 Stoller, J. Immunol. 152 5218~5329 (1994)(描述了通過(guò)嫁接 Z-DNA-結(jié)合抗體的重鏈CDR3 區(qū)域使scFv能夠結(jié)合)；以及Xu和Davis，Immunity 13 :37_45 (2000)(描述了重鏈CDR的 多樣性足以允許除此之外是相同的IgM分子在各種半抗原和蛋白質(zhì)抗原之間進(jìn)行區(qū)分)。 也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，951，646,6, 914，128,6, 090，382,6, 818，216,6, 156，313,6, 827，925、 5，833，943,5, 762，905和5，760，185，其描述了通過(guò)單CDR結(jié)構(gòu)域定義的專(zhuān)利抗體。上述每 一參考文獻(xiàn)都全文弓I入作為參考。因此，在某些方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人抗體諸如小鼠或大鼠抗 體的重鏈和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠與B7-H4特異性 結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，這些本發(fā)明的包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人抗體的重鏈和/或輕鏈 CDR3結(jié)構(gòu)域的抗體與相應(yīng)的親本非人抗體(a)能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合 相同的表位；和/或(d)具有類(lèi)似的結(jié)合親和力。在其它方面，本發(fā)明提供包含一個(gè)或 個(gè)來(lái)自第一人抗體(例如，諸如從非人動(dòng)物獲得的人抗體)的重鏈和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠與 B7-H4特異性結(jié)合，并且其中來(lái)自該第一人抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域代替了缺乏對(duì)B7-H4的結(jié)合 特異性的人抗體中的CDR3結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生能夠與B7-H4特異性結(jié)合的第二人抗體。在 一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域 的抗體與相應(yīng)的親本第一人抗體(a)能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合相同的表 位；和/或(d)具有類(lèi)似的結(jié)合親和力。具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含來(lái)自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈 可變區(qū)和/或來(lái)自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合 部分，其包含產(chǎn)生自或衍生自人VH 4-34基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與B7-H4特異性結(jié) 合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 產(chǎn)生自或衍生自人Vh 3-53基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與B7-H4特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或 片段，其包含產(chǎn)生自或衍生自組合的人Vh 3-9/D3-10/JH6b基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體 與B7-H4特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包含產(chǎn)生自或衍生自人Vk A27基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與B7-H4特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或 片段，其包含產(chǎn)生自或衍生自組合的人Vk L6/JK1基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與B7-H4 特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其中該抗體(a)包含產(chǎn)生自或衍生自AVh 4_34基因、人Vh 3_53基因或組合的人Vh 3-9/ D3-10/JH6b基因(所述基因分別編碼SEQ ID NO :51、52和53所示的氨基酸序列)的重鏈 可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)生自或衍生自AVk A27基因或組合的AVk L6/JK1基因(所述基因分 別編碼SEQ ID NO 54和55所示的氨基酸序列)的輕鏈可變區(qū)；且(c)該抗體與B7-H4、一般為人B7-H4特異性結(jié)合。分別具有Vh 4-34和Vk A27的 Vh和Vk的抗體的實(shí)例是IGll和13D12。分別具有Vh 3-53和Vk A27的Vh和Vk的抗體的 實(shí)例是2A7和2F9。分別具有Vh 3-9/D3_10/JH6b和Vk L6/JK1的Vh和Vk的抗體的實(shí)例是 12E1。如在本文中所使用的那樣，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白 基因的系統(tǒng)中獲得的，則該人抗體包含“產(chǎn)生自”或“衍生自，，特定種系序列的重鏈或輕鏈 可變區(qū)。此類(lèi)系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo) 抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫(kù)?！爱a(chǎn)生自”或“衍生自”人種系免疫球 蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸 序列進(jìn)行比較，并且選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系 免疫球蛋白序列?！爱a(chǎn)生自”或“衍生自”特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然存在的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo) 致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨 基酸序列通常至少90%同一，并且含有當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如 鼠種系序列)相比較時(shí)確認(rèn)該人抗體屬于人類(lèi)抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體 在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少 96 %、97 %、98 %或99 %同一。一般地，衍生自特定人種系序列的人抗體展示出與該人種系 免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過(guò)10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況中，該人抗體 可能展示出與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過(guò)5個(gè)、或者甚至不超過(guò)4、 3、2或1個(gè)氨基酸的差異。同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含這樣的重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中所述的重 鏈和輕鏈可變區(qū)包含與本文所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗 體保留了本發(fā)明抗B7-H4抗體的所期望的功能特性。例如，本發(fā)明提供包含單克隆抗體或其結(jié)合部分的抗體-配偶體分子綴合物，其 中所述的抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)該重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO 1、2、3、4和5的氨基酸序列至少80%同 源的氨基酸序列；(b)該輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80% 同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1 X ICT7M或更低的Kd與人B7-H4結(jié)合；(d)該抗體與用B7-H4轉(zhuǎn)染的人CHO細(xì)胞結(jié)合；和/或(e)當(dāng)綴合至細(xì)胞毒素時(shí)，該抗體在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，該抗體例如可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在另外的實(shí)施方案中，V1^P/或八氨基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和Vl區(qū)高度(即80%或更高)同源的 Vh和&區(qū)的抗體可以如下獲得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID NO 41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的核酸分子，然后用本文描述的功能測(cè)定法測(cè)試所編 碼的經(jīng)改變抗體所保留的功能(即以上(c)、(d)和(e)所述的功能)。如本文所使用的，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分 同一性?？紤]到為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需而引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng) 度后，兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的同一位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)(即％同源 性=相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)X100)。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分同一性的確定 可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2. 0版本)中 的 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 11-17 (1988))的算法來(lái)確定，其使用 PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分以及4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百 分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從http://WWW. gcg. com獲得)的GAP程序中 的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444_453 (1970))的算法來(lái)確定，其使用 Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。
另外地或者備選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步作為“查詢序列”用于進(jìn) 行公共數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，例如鑒定相關(guān)序列。此類(lèi)檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol. Biol. 215 403-10的XBLAST程序(2. 0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程 序進(jìn)行，得分=50，字長(zhǎng)=3，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得 用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例 如 XBLAST 和 NBLAST)的缺省參數(shù)。參見(jiàn) http //www. ncbi. nlm. nih. gov。具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū) 和含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些⑶R序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于 本文所述優(yōu)選抗體(例如1G11、2A7、2F9、12E1或13D12)的特定氨基酸序列或其保守修飾， 并且其中該抗體保留本發(fā)明抗B7-H4抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供一種包含單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的抗體-配偶體分子綴 合物，其中所述的抗體包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含有CDR1、CDR2和 CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)該重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序 列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)該輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO 36、37、38、39和40的氨基酸序 列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以1 X ICT7M或更低的Kd與人B7-H4結(jié)合；(d)該抗體與用B7-H4轉(zhuǎn)染的人CHO細(xì)胞結(jié)合；和/或(e)當(dāng)綴合至細(xì)胞毒素時(shí)，該抗體在體內(nèi)抑制表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO :16、17、18、19和20 的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO 31、32、33、34和35的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重 鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID N0:ll、12、13、14和15的氨基酸序列和其保守修飾的 氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :26、27、28、29和30的氨基酸序 列和其保守修飾的氨基酸序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗體例如可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“保守的序列修飾”是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的 抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸替換、添加和缺失。可以通過(guò)本 領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨 基酸替換是其中將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的替換。具有相似側(cè)鏈的 氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨 酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰 胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明 抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被替換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基，并且可以檢測(cè)改變的抗體所保留的功能。與本發(fā)明的抗B7-H4抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任意B7-H4單克隆抗體結(jié)合人B7-H4 上的相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7-H4的抗體)。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，用于交叉競(jìng)爭(zhēng)研究的參照抗體可以是單克隆抗體IGll (具有分別如SEQ ID NO :1和6所示的V1^Pt序列)，或單克隆抗體2A7(具有分別如SEQ ID NO :2和7所 示的Vh和\序列)，或單克隆抗體2F9 (具有分別如SEQ ID NO 3和8所示的Vh和\序 列)，或單克隆抗體12E1 (具有分別如SEQ ID NO 4和9所示的Vh和\序列)，或單克隆抗 體13D12(具有分別如SEQ ID NO :5和10所示的Vh和\序列)。此類(lèi)交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體可以 根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)B7-H4結(jié)合測(cè)定法中與IG11、2A7、2F9、12E1或13D 12交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力來(lái)鑒 定。例如，可以利用BIAcore 系統(tǒng)分析、ELISA測(cè)定法或流式細(xì)胞分析來(lái)證明與本發(fā)明抗 體的交叉競(jìng)爭(zhēng)。測(cè)試抗體抑制(例如)1G11、2A7、2F9、12E1或13D12與人B7-H4結(jié)合的能 力證明，該測(cè)試抗體可以與1G11、2A7、2F9、12E1或13D12競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人B7-H4并因此與1G11、 2A7、2F9、12E1或13D12相同地結(jié)合人B7-H4上的相同表位。在優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合與由 1G11、2A7、2F9、12E1或13D12所識(shí)別的人B7-H4上的相同表位的抗體是人單克隆抗體。工稈化抗體和修飾的抗體本發(fā)明的抗體進(jìn)一步可以利用具有本文所公開(kāi)的一種或多種Vh和/或\序列的 抗體作為起始材料來(lái)制備，以改造修飾的抗體，該修飾的抗體可具有與起始抗體不同的特 性?？梢酝ㄟ^(guò)修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即％和/或VJ例如一個(gè)或多個(gè)⑶R區(qū)內(nèi)和/或一 個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基來(lái)改造抗體。另外地或備選地，可以通過(guò)修飾恒定區(qū) 內(nèi)的殘基來(lái)改造抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能?？梢赃M(jìn)行的一種類(lèi)型的可變區(qū)改造是 CDR移植。抗體主要是通過(guò)位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)中的氨基酸殘基與靶抗 原相互作用。由于這個(gè)原因，⑶R內(nèi)的氨基酸序列比⑶R外的序列在各個(gè)抗體之間更加多 樣化。由于⑶R序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體_抗原相互作用，因此通過(guò)構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠 表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體，其中所述的表達(dá)載體包括來(lái)自特定天然 存在抗體的CDR序列，該CDR序列被嫁接到來(lái)自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上 (參見(jiàn)，例如，Riechmann, L.等(1998)Nature 332 :323_327 Jones, P.等(1986)Nature 321 -.522-525 ；Queen, C.等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 10029-10033 ；Winter 的美國(guó)專(zhuān)禾U 5，225，539 號(hào)，和 Queen 等的美國(guó)專(zhuān)利 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370 號(hào))。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包 含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)，該⑶R1、⑶R2和⑶R3序列分別包含選自SEQ ID NO :11、12、13、14 和 15，SEQ ID NO 16、17、18、19 和 20，和 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25的氨基酸序列，以及包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，該⑶R1、⑶R2和 CDR3 序列分別包含選自 SEQ ID NO :26、27、28、29 和 30，SEQ ID NO :31、32、33、34 和 35，和 SEQ ID NO :36、37、38、39和40的氨基酸序列。因此，此類(lèi)抗體含有單克隆抗體1G11、2A7、 2F9、12E1或13D12的Vh和\⑶R序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn) “VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)(可從因特網(wǎng)上www, mrc-cpe. cam, ac. uk/vbase獲得),以 及 Kabat, Ε. Α.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號(hào) 94-61242 ;Tomlinson, I. M.等(1992) “The Repertoire of Human Germline VaSequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with DifferentHypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227 776-798 ；禾口Cox, J. P. L.等(1994)“ADirectory of Human Germ—line Vh Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur. J. Immunol. 24 :827_836 ；其內(nèi)容均引入本文作為參 考。作為另一個(gè)例子，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中 發(fā)現(xiàn)。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列可以根據(jù)如下Genbank登錄 號(hào)獲得1-69 (NG_0010109、NT_024637 和 BC070333)、3-33 (NG_0010109 和 NT_024637)和 3-7(NG_0010109*NT_024637)。作為另一個(gè)例子，在HCol2 HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈 種系序列可以根據(jù)如下Genbank登錄號(hào)獲得1_69 (NG_0010109、NT_024637和BC070333)、 5-51(NG_0010109 和 NT_024637)、4-34(NG_0010109 和 NT_024637)、3_30. 3(CAJ556644)和 (AJ406678)。人重鏈和輕鏈種系序列的另一來(lái)源是可從IMGT(http://imgt. cines. fr)獲 得的人免疫球蛋白基因數(shù)據(jù)庫(kù)。使用一種被稱為缺口 BLAST的序列相似性檢索方法將抗體蛋白質(zhì)序列與編譯 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較(Altschul等人.(1997)Nucleic Acids Research 25: 3389-3402)，該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。BLAST是一種啟發(fā)式算法，其中抗體序列和 數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的比對(duì)可能含有所比對(duì)的字的高評(píng)分的區(qū)段對(duì)(HSP)。延伸或 修剪無(wú)法提高其評(píng)分的區(qū)段對(duì)被稱為命中(hit)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，翻譯VBASE來(lái)源的核苷酸序 列(http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase 1/1 ist2. php),保留介于 FRl 禾口 FR3 構(gòu)架區(qū) 之間并且包含F(xiàn)Rl和FR3構(gòu)架區(qū)的區(qū)域。數(shù)據(jù)庫(kù)序列的平均長(zhǎng)度為98個(gè)殘基。除去在蛋 白質(zhì)全長(zhǎng)上完全匹配的重復(fù)序列。使用除了低復(fù)雜性過(guò)濾器(關(guān)閉)以外采用缺省標(biāo)準(zhǔn) 參數(shù)的blastp程序，以及BL0SUM62的取代矩陣，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行BLAST檢索，過(guò)濾前5個(gè)產(chǎn) 生序列匹配的命中。以全部6個(gè)閱讀框翻譯核苷酸序列，在數(shù)據(jù)庫(kù)序列的匹配區(qū)段中不含 終止密碼子的閱讀框被認(rèn)為是潛在的命中。隨后用BLAST程序tblastx進(jìn)行驗(yàn)證，該程序 以全部6個(gè)閱讀框翻譯抗體序列，并且將這些翻譯與以全部6個(gè)框架動(dòng)態(tài)翻譯的VBASE核 苷酸序列進(jìn)行比較?？膳c如上所述的VBASE類(lèi)似地檢索其它人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)，諸如可從 IMGT(http://imgt. cines. fr)獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)。同一性是抗體序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)之間在序列全長(zhǎng)上完全氨基酸匹配。陽(yáng)性(同 一性+替換匹配)不是同一，而是由BL0SUM62取代矩陣引導(dǎo)的氨基酸替換。如果抗體序列 以相同的同一性與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列匹配，則陽(yáng)性最強(qiáng)的命中被確定為匹配序列命中。用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列是在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于由所選擇的本發(fā)明抗體使用 的構(gòu)架序列，例如，類(lèi)似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的Vh 4-34構(gòu)架序列(SEQ ID N0 51)和/ 或 Vh 3-53 構(gòu)架序歹Ij (SEQ ID NO 52)和/ 或 Vh 3-9/D3_10/JH6b 構(gòu)架序列(SEQ ID NO 53)和/或Vk A27構(gòu)架序列(SEQ ID NO 54)和/或組合的Vk L6/JK1構(gòu)架序列(SEQ ID NO 55)。Vh CDRl、CDR 2和CDR 3序列和Vk CDRl、CDR 2和CDR3序列可以被嫁接到與 該構(gòu)架序列的來(lái)源種系免疫球蛋白基因具有同一序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被嫁接到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中， 將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見(jiàn)，例如， Queen 等的美國(guó)專(zhuān)利 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。另一種類(lèi)型的可變區(qū)修飾是突變V1^P /或Vk CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基 酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或 PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合或者其它目標(biāo)功能特性的影響可以用本文所述和 實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)。一般地引入(如上文所述的)保守修飾。這些突 變可以是氨基酸替換、添加或缺失，但是一般是替換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)的不超過(guò)1、 2、3、4或5個(gè)殘基。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗B7-H4單克隆抗體或其抗原結(jié)果 部分的抗體-配偶體分子綴合物，其中所述的抗體包含含有以下的重鏈可變區(qū)(a)Vh CDRl 區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :11、12、13、14和15的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:ll、12、13、 14和15相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列；(b) Vh CDR2區(qū)， 其包含選自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸序列，或與SEQ ID NO 16、17、18、19和 20相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列；(c) Vh⑶R3區(qū)，其包含 選自 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 的氨基酸序列，或與 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 相 比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDRl區(qū)，其包含選自 SEQ ID NO 26、27、28、29 和 30 的氨基酸序列，或與 SEQ ID NO 26、27、28、29 和 30 相比具 有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK⑶R2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :31、32、33、34和35的氨基酸序列，或與SEQ ID NO :31、32、33、34和35相比具有1、 2、3、4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VK⑶R3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :36、37、38、39 和 40 的氨基酸序列，或與 SEQ ID NO :36、37、38、39 和 40 相比具有 1、2、3、 4或5個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對(duì)其Vh和/或Vk內(nèi)的構(gòu)架殘 基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種 方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變 的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過(guò)比較抗體構(gòu)架序列與衍生該 抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，對(duì)于1G11，Vh的氨基酸殘基#71 (FR3內(nèi))是丙氨酸，而在相應(yīng)的Vh 4-34種 系序列中該殘基為纈氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(guò)(例如)定點(diǎn) 誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列(例如，IGll的Vh&FR3 的殘基#71可以從丙氨酸“回復(fù)突變”為纈氨酸)。這樣“回復(fù)突變”的抗體也包括在本發(fā) 明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于1G11，Vh的氨基酸殘基#81 (FR3內(nèi))是精氨酸，而在相應(yīng)的 Vh 4-34種系序列中該殘基為賴氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 IGll的Vh的FR3的殘基#81從精氨酸“回復(fù)突變”為賴氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也 包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于13D12，Vh的氨基酸殘基#83 (FR3內(nèi))是天冬酰胺，而在相應(yīng) WVh 4-34種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將13D12的Vh的FR3的殘基#83從天冬酰胺“回復(fù)突變”為絲氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗 體也包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于2A7，Vh的氨基酸殘基#67 (FR3內(nèi))是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vh 3-53種系序列中該殘基為苯丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 2A7的Vh的FR3的殘基#67從纈氨酸“回復(fù)突變”為苯丙氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也 包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于2F9，Vh的氨基酸殘基#28 (FRl內(nèi))是異亮氨酸，而在相應(yīng)的 Vh 3-53種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將 2F9的Vh的FRl的殘基#28從異亮氨酸“回復(fù)突變”為蘇氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也 包括在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于12E1，Vh的氨基酸殘基#23 (FRl內(nèi))是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vh 3-9種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將12E1 的Vh的FRl的殘基#23從纈氨酸“回復(fù)突變”為丙氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也包括在 本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于lGll，Vk的氨基酸殘基#7(FR1內(nèi))是苯丙氨酸，而在相應(yīng)的Vk A27種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將IGll 的Vk的FRl的殘基#7從苯丙氨酸“回復(fù)突變”為絲氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也包括 在本發(fā)明中。另一個(gè)例子是，對(duì)于IGl 1，Vk的氨基酸殘基#47 (FR2內(nèi))是纈氨酸，而在相應(yīng)的Vk A27種系序列中該殘基為亮氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，例如，可以將IGll 的Vk的FR2的殘基#47從纈氨酸“回復(fù)突變”為亮氨酸。這樣“回復(fù)突變”的抗體也包括在 本發(fā)明中。另一種類(lèi)型的構(gòu)架修飾包括對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或甚至在一個(gè)或多個(gè)⑶R區(qū)內(nèi)的一個(gè)或 多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。這一方法也被 稱為“脫免疫”，并且在Carr等的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20030153043中詳細(xì)記載。除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本 發(fā)明的抗體改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，諸 如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以化學(xué)修飾 本發(fā)明的抗體(例如可將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化， 同樣以改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案中的每一個(gè)均在下文詳細(xì)描述。 Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，使得該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改 變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，677，425號(hào)中詳細(xì)描述。改變 CHl鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了(例如)促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的 穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半壽期。 更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得相對(duì) 于天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱了該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合。該方 法在Ward等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，165，745號(hào)中詳細(xì)記載。
在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半壽期。可以使用多種方法。例如，如 Ward的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，277，375所述，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變T252L、T254S、T256F。 備選地，如Presta等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，869，046和6，121，022所述，為了提高生物半壽期，該 抗體可以在CHl或Q區(qū)內(nèi)進(jìn)行改變，使之含有來(lái)自IgG Fc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救 受體結(jié)合表位。在還其它的實(shí)施方案中，通過(guò)將至少一個(gè)氨基酸殘基替換為不同的氨基酸殘基來(lái) 改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、 318,320和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的 親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。對(duì)其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例 如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的Cl成分。這一方法在Winter等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，624，821和5，648，260 中更詳細(xì)地描述。在另一個(gè)實(shí)例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替 換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體具有經(jīng)改變的Clq結(jié)合和/或降低或消除的補(bǔ)體依賴 性細(xì)胞毒性(⑶C)。該方法在Idusogie等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，194，551中更詳細(xì)地描述。在另一個(gè)實(shí)例中，改變氨基酸位置231和239中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改 變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等的PCT公開(kāi)WO 94/29351中進(jìn)一步描述。在還其它的實(shí)例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或 提高抗體對(duì)Fc γ受體的親和力，通過(guò)修飾一個(gè)或多個(gè)在下列位置處的氨基酸來(lái)修飾Fc區(qū) 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、 398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。該方法在 Presta 的 PCT 公開(kāi) WO 00/42072 中進(jìn)一步描述。此外，已對(duì)人IgGl上對(duì)于Fc y RI、Fc y RII,FcyRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn) 行了作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見(jiàn)，Shields，R.L.等(2001) J.Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位置 256、290、298、333、334 和 339 處的特定突變顯示改善了與 FcyRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變顯示改善了與Fc YRIII結(jié)合T256A/S298A，S298A/ E333A, S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在再一個(gè)實(shí)施方案中，如美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/957，271 (其全文并入本文作為 參考)所描述的那樣，通過(guò)引入半胱氨酸殘基來(lái)修飾本發(fā)明的抗體的C端。此類(lèi)修飾包括 但不限于在全長(zhǎng)重鏈序列的C端處或在其附近替換現(xiàn)有的氨基酸殘基，以及將包含半胱氨 酸的延長(zhǎng)序列引入至全長(zhǎng)重鏈序列的C端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含半胱氨酸的延長(zhǎng)序 列包含序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(從N端至C端)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類(lèi)C端的半胱氨酸修飾的存在為配偶體分子的綴合提供 了位點(diǎn)，該配偶體分子諸如為治療劑或標(biāo)記物分子。特別地，由于C端半胱氨酸修飾，反應(yīng) 性硫羥基的存在可以被用于利用以下詳細(xì)描述的二硫化物接頭來(lái)綴合配偶體分子?？贵w 與配偶體分子以這一方式的綴合使得可以增強(qiáng)對(duì)所附著的特異位點(diǎn)的控制。此外，通過(guò)在 C端或在其附近引入該附著點(diǎn)，可優(yōu)化綴合，使得它減少或者消除對(duì)該抗體的功能特性的干 擾，并且使得綴合制備物的簡(jiǎn)化分析以及質(zhì)量控制成為可能。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無(wú)糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)?？梢愿淖兲腔?例如)以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這樣的碳水 化合物修飾可以例如通過(guò)改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn) 行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換，使一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn)處 的糖基化。這種無(wú)糖基化可以提高抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，714，350和6，350，861中更詳細(xì)地描述。改變糖基化的另外的方法描述在Hanai等的美 國(guó)專(zhuān)禾Ij 7，214，775 ；Presta 的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，737，056 ；Presta 的美國(guó)公開(kāi)號(hào) 20070020260 ； Dickey 等的 PCT
發(fā)明者B·陳, C·拉奧-納伊克, D·J·金, J·A·特雷特, J·M·卡爾達(dá)雷利 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司