專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)機(jī)械破壞表皮進(jìn)行痘病毒載體的疫苗接種的制作方法
通過(guò)機(jī)械破壞表皮進(jìn)行痘病毒載體的疫苗接種聯(lián)邦支持的研究本發(fā)明是依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health, NIH)的國(guó)家過(guò)敏癥禾口傳染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID)授予的授權(quán)號(hào)U19 AI057330和5U54AI057159-05部分在政府的支持下進(jìn)行的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，疫苗是由減毒活病原體、滅活全生物體或滅活毒素組成。在許多情況下， 這些方法已基于抗體介導(dǎo)性應(yīng)答而成功地誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用。然而，某些病原體，例如HIV、 HCV、TB、瘧原蟲(chóng)和癌癥，需要誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)性免疫(cell-mediated immunity, CMI)。經(jīng)證實(shí)，非活的疫苗一般不能有效產(chǎn)生CMI。此外，盡管活疫苗可能誘導(dǎo)CMI，但一些減毒活疫苗會(huì)在免疫抑制個(gè)體中弓I起疾病。因此，需要更有效的疫苗以及可產(chǎn)生增強(qiáng)的治療功效和保護(hù)性免疫應(yīng)答的更有效的疫苗傳遞方式。

發(fā)明內(nèi)容
先前人們?cè)岢?，減毒的復(fù)制缺陷性痘苗病毒，例如修飾型安卡拉痘苗病毒 (modified vaccinia virus Ankara，MVA)株，是頗具前景的活病毒疫苗載體，因?yàn)槠渚哂辛钊擞∠笊羁痰陌踩院兔庖咴蕴卣鳎⑶乙呀?jīng)在臨床前和臨床研究中進(jìn)行測(cè)試。然而， 病毒疫苗(例如MVA)都只是通過(guò)注射途徑投予，到目前為止，還未曾通過(guò)皮膚劃痕法(skin scarification)投予。這可能是因?yàn)橐粋€(gè)假定，即，病毒在表皮中復(fù)制是發(fā)生痘損傷隨后發(fā)生針對(duì)抗原激發(fā)的強(qiáng)烈保護(hù)作用所必需的。盡管如此，本發(fā)明人仍通過(guò)皮膚劃痕法利用 MVA對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫，而出人意料的是，MVA皮膚劃痕法以劑量依賴(lài)性方式誘導(dǎo)特征性痘損傷，并產(chǎn)生針對(duì)痘苗病毒(vaccinia virus, W)抗原的劑量依賴(lài)性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。 不希望受任何特定機(jī)制或理論的束縛，本發(fā)明人相信，借助皮膚劃痕法進(jìn)行免疫來(lái)引起強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，不需要病毒復(fù)制。MVA皮膚劃痕法在用鼻內(nèi)西儲(chǔ)痘苗病毒(Western Reserve vaccinia virus, WR-VV)感染激發(fā)的小鼠體內(nèi)提供了針對(duì)死亡和患病的完全保護(hù)，所用WR-VV劑量是通過(guò)常規(guī)注射途徑進(jìn)行復(fù)制型VV免疫無(wú)法保護(hù)小鼠免受致死性激發(fā)的劑量。在用劑量相當(dāng)?shù)腗VA 進(jìn)行免疫時(shí)，常規(guī)注射途徑只引起較弱的可檢測(cè)T細(xì)胞和抗體應(yīng)答，甚至在二次病毒激發(fā)后也是如此，只提供針對(duì)WR-VV鼻內(nèi)激發(fā)的不良保護(hù)，而用MVA或VV進(jìn)行的皮膚劃痕法則提供強(qiáng)烈的免疫保護(hù)。因此，使用機(jī)械破壞皮膚的方式，用活病毒疫苗，例如復(fù)制缺陷性痘病毒(例如MVA)進(jìn)行表皮免疫，將以比目前臨床上使用的需要高劑量和多次注射方案的注射途徑低得多的劑量，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答和較強(qiáng)的對(duì)免疫宿主的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明部分涉及一種使用含有抗原的修飾型復(fù)制缺陷性痘病毒載體對(duì)個(gè)體進(jìn)行針對(duì)感染(或感染性疾病)或癌癥的免疫的新穎方法，所述痘病毒載體是施用于所述個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮?？梢允褂眯揎椥蛷?fù)制缺陷性或低感染性變異痘苗病毒，這些變異痘苗病毒已經(jīng)過(guò)遺傳修飾而含有編碼抗原的cDNA。在本發(fā)明一方面中，提供一種刺激免疫應(yīng)答的方法。所述方法包含對(duì)個(gè)體投予足以刺激免疫應(yīng)答的量的包含抗原的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒，其中所述痘病毒是投予個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮。所述免疫應(yīng)答是體液應(yīng)答和/或細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞應(yīng)答是由CD4+和/或CD8+T細(xì)胞和/或B細(xì)胞引起。痘病毒可以是正痘、豬痘、禽痘、羊痘、野兔痘、副痘病毒、軟疣痘病毒 (molluscpoxvirus)或亞塔痘病毒(yatapoxvirus)。在一些實(shí)施例中，痘病毒是TRIC0M 。在一些實(shí)施例中，正痘病毒是一種痘苗病毒。這種痘苗病毒可以是修飾型安卡拉痘苗病毒(MVA)、WR 株、NYCBH 株、惠氏株(Wyeth strain)、ACAM2000、李斯特氏株(Lister strain)、LC16m8、Elstree-BNm、哥本哈根株(Copenhagen strain)或天壇株(Tiantan strain)。表皮可借助劃痕針(scarification needle)、皮下注射針或磨蝕裝置機(jī)械破壞。 表皮的機(jī)械破壞可以與痘病毒的投予基本上同時(shí)進(jìn)行，或在投予痘病毒之前進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，個(gè)體患有癌癥或有發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。癌癥可以是皮膚癌、乳癌、 前列腺癌、肺癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌和甲狀腺癌或結(jié)直腸癌。在一些實(shí)施例中，癌癥是前列腺腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、上皮源性卵巢癌、結(jié)直腸腺癌和平滑肌肉瘤、胃腺癌和平滑肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、腎細(xì)胞癌、腎和膀胱的移行細(xì)胞癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、 甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、星狀細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。皮膚癌可以是黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌或基底細(xì)胞癌。在一些實(shí)施例中，個(gè)體患有感染或有發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)。感染可以是病毒、細(xì)菌、 真菌或原蟲(chóng)感染。病毒感染的實(shí)例包括(但不限于)HIV、流感病毒、登革(dengue)病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉(mx)la)病毒、 馬爾堡(Marburg)病毒、狂犬病毒、漢坦(Hanta)病毒感染、西尼羅河病毒(West Nile virus)、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、艾普斯坦_巴爾二氏病毒 (Epstein-Barr virus)、8 型人抱疫病毒、α 病毒禾口圣路易腦炎(St. Louis encephalitis)。細(xì)菌感染可以是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhi)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耳口爾森菌(Yersinia perstis)、土拉熱弗朗西其jf 氏菌(Francisella tularensis)、軍團(tuán)菌(Legionella)、披衣菌 (Chlamydia)、傷寒立克次體(Rickettsia typhi)或梅毒螺旋體(Ti^ponema pallidum)感染。真菌感染包括(但不限于)粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌 (Candida albicans)禾口曲霉屬(Aspergillus species)。原蟲(chóng)感染的實(shí)例包括(但不限于)瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)、間曰癥原蟲(chóng)(Plasmodium vivax)、卵形癥原蟲(chóng)(Plasmodium ovale)、 三日皰原蟲(chóng)(Plasmodium malariae))、禾丨J 什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania species)、錐蟲(chóng)屬(Trypanosome species)(非洲禾口美洲)、隱孢子蟲(chóng)(cryptosporidiums)、等孢球蟲(chóng)屬(isospora species)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲(chóng)屬 (Acanthamoeba species)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、剛地弓形蟲(chóng) (Toxoplasma gondii)禾口卡氏月市抱子蟲(chóng)(Pneumocystis carinii)。在一些實(shí)施例中，抗原是腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)、腫瘤特異性抗原(tumor-specific antigen, TSA)或組織特異性抗原。TAA、TSA或組織特異性抗原可以是粘蛋白 1 (MUCl)、粘蛋白 2 (MUC2)、BAGE-U GAGE-I 8 ；GnTV, HERV-K-MEL, KK-LC-I、KM-HN-I、LAGE-I、MAGE-Al A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-AlO、MAGE-Al2、 MAGE-C3、NA88、NY-ESO-l/LAGE-2、SAGE、Sp 17、SSX-2、SSX-4、TAG-I、TAG-2、TRAG-3、 TRP2-INT2> XAGE-Ib>HC (carcinoembriogenic antigen, CEA)、 CA-125> gplOO/ Rnell7、激肽釋放酶 4(Kallikrein 4)、乳腺珠蛋白-Α、黑色素-A/MART-1、NY-BR-U OA-U 前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)、RAB38/NY-MEL-1、TRP_l/gp75、 TRP-2、酪氨酸酶、親脂素(adipophilin)、AIM_2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING_4、CPSF、細(xì)胞周期素 Dl、DKKl、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER_2/neu、IL13Rα 2、 腸羧酸酯酶、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、M-CSF, MCSP, mdm-2、MMP-2、MUCl、PBF、 PRAME、PSMA、RAGE-I、RGS5、RNF43、RU2AS、分離蛋白 1 (secernin 1)、SOX10, STEAPU生存素 (survivin)、端粒酶、VEGF、WT1、α -肌動(dòng)蛋白-4、ARTC1、BCR-ABL 融合蛋白、B_RAF、CASP_5、 CASP-8、β -連接素、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-U dek-can 融合蛋白、EFTUD2、延伸因子 2、 ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FNU GPNMB, LDLR-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶AS融合蛋白、HLA-A2、 HLA-AlU hsp70-2、KIAA0205、MART2、MEU MUM-U MUM-2、MUM-3、neo-PAP、I 類(lèi)肌球蛋白、 NFYC, 0GT、0S-9、p53、pml-RARa 融合蛋白、PRDX5、PTPRK, K_ras、N_ras、RBAF600、SIRT2、 SNRPD1、SYT-SSXl或-SSX2融合蛋白、TGF-β RII或磷酸丙糖異構(gòu)酶。在一些實(shí)施例中，抗原是病毒、真菌或原蟲(chóng)抗原。抗原可以是HIV (iag、蛋白酶、 逆轉(zhuǎn)錄酶、全長(zhǎng)包膜蛋白、Vpu, Tat和Rev ；流感病毒血凝素、核蛋白、基質(zhì)蛋白1 (matrix protein 1，Ml)、非結(jié)構(gòu)蛋白 1 (non-structural protein 1，NS-1)；病毒所有主要血清型共有的登革病毒交叉保護(hù)抗原(例如非結(jié)構(gòu)蛋白1或NS1、包膜結(jié)構(gòu)域III或EDIII)；甲型肝炎病毒衣殼蛋白l(capsid protein 1，VP-1)；乙型肝炎病毒表面抗原Ofepatitis B virus surface antigen, HBsAg)和核心抗原(HBcAg)；丙型肝炎核心抗原、El、E2、p7、 NS2、NS4和NS4蛋白；HPVE1、E2、Li、L2 ；埃博拉病毒和馬爾堡病毒糖蛋白、核蛋白和基質(zhì)蛋白；狂犬病毒糖蛋白、漢坦病毒核蛋白、包膜糖蛋白和Gl蛋白；西尼羅河病毒前驅(qū)膜蛋白(premembrane，prM)和包膜(envelope，Ε)糖蛋白；SARS樣冠狀病毒0rf3、刺突蛋白、 核衣殼蛋白和膜蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白B和D ；水痘-帶狀皰疹病毒包膜糖蛋白E和 B (gE、gB)、立即早期蛋白 63 (immediate early protein 63，IE63)；艾普斯坦-巴爾二氏病毒(Epstein-Barr virus) gp350, gpllO、核抗原 1 (EBNA-1)、EBNA 2 和 EBNA-3C ；8 型人皰疹病毒補(bǔ)體調(diào)控蛋白(complement control protein，KCP)、糖蛋白 B、0RF6、0RF61 和 0RF65)；結(jié)核桿菌抗原85A、85B、MPT51、PPE44、分枝桿菌65kDa熱休克蛋白(DNA_hsp65)、 6kDa 早期分泌性抗原革巴(6-kDa early secretary antigenic target, ESAT-6)；沙門(mén)氏菌 SpaO、Hla、夕卜膜蛋白(outer membrane protein, 0ΜΡ)；綠月農(nóng)桿菌(P. aeruginosa)OMP> PcrV、OprF, OprI, PilA 和突變 iToxA ；炭疽桿菌保護(hù)性抗原(protective antigen, PA)、鼠疫耶爾森菌低鈣應(yīng)答蛋白V(low calcium response protein, LcrV)、Fl和Fl-V融合蛋白；軍團(tuán)菌(Legionella)月太聚糖相關(guān)月旨蛋白(peptidoglycan—associated lipoprotein, PAL)、mip、鞭毛蛋白(flagella)、0mpS、hsp60、主要分泌蛋白(major secretory protein, MSP)；披衣菌蛋白酶樣活性因子(protease-like activity factor，CPAF)、主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)；梅毒螺旋體(Τ. pallidum)夕卜膜月旨蛋白；球孢子菌屬 Ag2/Pral06、Prp2、磷脂酶(Plb)、α -甘露糖苷酶(alpha-mannosidase，Amnl)、 天冬氨酸蛋白酶、Gell ；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)表面粘附蛋白WI-1 ； 隱球酵母菌GXM、隱球酵母菌GXM的肽模擬表位或甘露糖蛋白；白色念珠菌hsp90-CA、 65kDa甘露糖蛋白(65-kDa mannoprotein，MP65)、分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secretory aspartyl proteinase, Sap)、Alslp-N、Als3p_N ；曲霉 Asp f 16、Asp f2> Der ρ 1 禾口 Fel d U rodlet A、PEP2、曲霉HSP90、90kDa過(guò)氧化氫酶、瘧原蟲(chóng)頂端膜抗原1 (apical membrane antigen 1，AMA1)>25kDa ^ξ f生 P介·( 胃白(25-kDa sexual-stage protein, Pfs25)、紅細(xì)胞膜蛋白 1 (PfEMPl)環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)、裂殖子表面蛋白-l(Merozoite Surface Protein_l，MSPl)；利什曼原蟲(chóng)III型半胱氨酸蛋白酶 (cysteine proteinase, CPC)、核糖體蛋白(LRP)、A2 抗原、核小體組蛋白、HSP20、G46/M_2/ PSA-2前鞭毛體表面蛋白、嬰兒利什曼原蟲(chóng)(L infantum) LACK抗原、GP63、LmSTIl、TSA、P4、 NH36、papLe22 ；錐蟲(chóng)β-微管蛋白(STIB806)、微管相關(guān)蛋白(MAP pl5)、半胱氨酸蛋白酶 (CP)；隱孢子蟲(chóng)表面蛋白gpl5和gp40、Cp23抗原、p23 ；剛地弓形蟲(chóng)表面抗原1 (TgSAGl)、蛋白酶抑制劑-1 (TgPI-I)、表面相關(guān)蛋白MIC2、MIC3、R0P2、GRA1-GRA7 ；卡氏肺孢子蟲(chóng)主要表面糖蛋白(MSG)、p55 抗原、曼森氏血吸蟲(chóng)(Schistosomiasis mansoni) Sml4、21. 7 和 SmFim 抗原、被膜蛋白 Sm29、26kDa GST、日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)、SjCTPI、SjC23、 Sj22.7 或 SjGST-32。在一些實(shí)施例中，本文中所述的刺激免疫應(yīng)答的方法進(jìn)一步包含投予共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子。共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑或細(xì)胞因子的實(shí)例包括 (但不限于)IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-1、B7-2、LFA-3、 B7-H3、CD40、CD40L、ICOS 配體、0X-40L、4_1BBL、GM-CSF, SCF、FGF、Flt3 配體、CCR4、QS-7、 QS-17、QS-21、CpG 寡核苷酸、ST-246、AS-04、LT R192G 突變體、莫坦奈德(Montanide) ISA 720、熱休克蛋白、合成分枝桿菌索狀因子(CAFOl)、脂質(zhì)A模擬物、腸炎沙門(mén)菌血清型 (Salmonella enterica serovar)、鼠傷寒沙門(mén)菌鞭毛蛋白(FliC)、莫坦奈德720、左旋咪唑 (Levamisole, LMS)、咪喹莫特(Lniquimod)、白喉毒素、IMP321、AS02A、AS01B、AS15_SB、鋁膠 (Alhydrogel)、莫坦奈德 ISA、氫氧化鋁、MF59、ISCOMATRIX、MLPA, MPL 和其它 TLR-4 配體、 MDP、其它 TLR-2 配體、AS02A、AS01B、不耐熱毒素 LTK63 和 LT-R192G。在一些實(shí)施例中，共刺激分子是與抗原一起由痘病毒共表達(dá)。共表達(dá)的共刺激分子可以為 IL-U IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、 ICOS 配體、0X-40L、4-1BBL、GM-CSF, SCF、FGF、Flt3 配體或 CCR4。共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子可與抗原基本上同時(shí)投予，或者可以在投予抗原之前或之后投予。在一些實(shí)施例中，共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是在與抗原基本上相同的部位投予，或者在與抗原不同的部位投予。在一些實(shí)施例中，本文中所述的方法進(jìn)一步包含在第一次投予抗原之后某一時(shí)間第二次投予抗原。
在一些實(shí)施例中，非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒包含病毒載體，這一病毒載體包含編碼抗原的核酸。所述編碼抗原的核酸可操作地連接到啟動(dòng)子。這一啟動(dòng)子可以是組成性活性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可進(jìn)一步包含增強(qiáng)子或另一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件 (transcriptional regulatory element，TRE)。在一些實(shí)施例中，在投予包含抗原的痘病毒之前，尚未用抗原激發(fā)個(gè)體，并且個(gè)體有受抗原激發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在這些實(shí)施例中，刺激免疫應(yīng)答將對(duì)個(gè)體提供針對(duì)呈遞抗原的試劑所引起的疾病的保護(hù)。在一些實(shí)施例中，在投予包含抗原的痘病毒之前，已經(jīng)用抗原激發(fā)個(gè)體。在這些實(shí)施例中，刺激免疫應(yīng)答將治療個(gè)體的由呈遞抗原的試劑所引起的疾病。在一些實(shí)施例中，刺激免疫應(yīng)答將防止患病或治療疾病。這一疾病可以是癌癥或感染。癌癥可以是黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳癌、前列腺腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、上皮源性卵巢癌、結(jié)直腸腺癌和平滑肌肉瘤、胃腺癌和平滑肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、腎細(xì)胞癌、腎和膀胱的移行細(xì)胞癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、星狀細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。感染可以是病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)感染。感染可為HIV、流感病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、狂犬病毒、漢坦病毒感染、西尼羅河病毒、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、 艾普斯坦-巴爾二氏病毒、8型人皰疹病毒感染、α病毒、圣路易腦炎、結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、軍團(tuán)菌、披衣菌、傷寒立克次體、梅毒螺旋體、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、隱球酵母菌、白色念珠菌、曲霉屬、瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng))、利什曼原蟲(chóng)屬、錐蟲(chóng)屬(非洲和美洲)、隱孢子蟲(chóng)、等孢球蟲(chóng)屬、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴蟲(chóng)屬、狒狒巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲(chóng)或卡氏肺孢子蟲(chóng)感染。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供試劑盒。在一些實(shí)施例中，試劑盒包含用于破壞個(gè)體表皮的裝置，以及活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒。所述裝置可以是劃痕針、皮下注射針或磨蝕器。痘病毒可附著于所述裝置，或混入溶液中。這一溶液可進(jìn)一步包含增強(qiáng)痘病毒經(jīng)由個(gè)體的表皮傳遞到個(gè)體的試劑。所述溶液還可包含增強(qiáng)個(gè)體的免疫應(yīng)答的試劑。本文中所述的試劑盒可進(jìn)一步包含使用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。 本發(fā)明每一限制都可包含本發(fā)明的各種實(shí)施例。因此，預(yù)期涉及任一要素或要素組合的本發(fā)明的每一限制都可包括在本發(fā)明各個(gè)方面中。本發(fā)明的應(yīng)用不局限于以下描述中陳述或圖式中說(shuō)明的構(gòu)造細(xì)節(jié)和組分布置。本發(fā)明包含其它實(shí)施例，并且能夠以各種方式實(shí)踐或進(jìn)行。另外，本文中使用的措辭和術(shù)語(yǔ)都是出于描述的目的，不應(yīng)視作限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”等旨在涵蓋其后所列各項(xiàng)和其等效物以及其它各項(xiàng)。


圖1.通過(guò)皮膚劃痕法接種痘苗病毒具有優(yōu)于其它免疫途徑的免疫原性。通過(guò)指定途徑，用2 X IO6個(gè)蝕斑形成單位(pfu)劑量的痘苗病毒(VV)使C57BL/6(B6)小鼠免疫， s. s:皮膚劃痕法；i. p.:腹膜內(nèi)注射；s.c 皮下注射；i.d.皮內(nèi)注射；i.m.:肌肉內(nèi)注射。 (a)初次T細(xì)胞應(yīng)答在布雷菲德菌素A(brefelding Α)存在下，用感染VV的靶細(xì)胞(來(lái)自首次接受實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞)再次刺激免疫后(P. i.)第7天收集的脾細(xì)胞6小時(shí)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)量產(chǎn)生IFN-Y的CD8T細(xì)胞的頻率。Ul:未免疫小鼠。(b)免疫后 (p.i.)第5周，評(píng)估記憶性VV特異性T細(xì)胞活性。用感染VV的靶細(xì)胞再次刺激來(lái)自免疫小鼠的脾細(xì)胞48小時(shí)，并收集上清液。借助ELISA測(cè)量上清液中IFN-g的產(chǎn)量。(c_d).在免疫后指定時(shí)間點(diǎn)，借助ELISA測(cè)定血清VV特異性IgG含量。圖2. VV皮膚劃痕法產(chǎn)生優(yōu)于其它免疫途徑的針對(duì)二次皮膚病毒激發(fā)的保護(hù)。通過(guò)所示各種途徑，用VV使B6小鼠免疫。免疫后8周，用二次皮膚VV感染激發(fā)免疫小鼠。激發(fā)后6天，利用實(shí)時(shí)PCR測(cè)量激發(fā)部位的病毒載量。未免疫小鼠作為對(duì)照。圖3.皮膚劃痕法提供針對(duì)二次鼻內(nèi)病毒激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)。(a_b)通過(guò)各種途徑， 用2c IOfiPfu劑量的VV使B6小鼠免疫。免疫后6周，通過(guò)鼻內(nèi)感染西儲(chǔ)痘苗病毒(WR-VV) 致死性激發(fā)免疫小鼠。激發(fā)后每天監(jiān)測(cè)存活率(a)和體重(bodyWeight，BW)變化(b)。(c_d) 通過(guò)皮膚劃痕法，用指定劑量的VV使B6小鼠免疫，并在免疫后6周，通過(guò)鼻內(nèi)WR-VV感染進(jìn)行致死性激發(fā)。激發(fā)后每天監(jiān)測(cè)存活率(c)和體重變化(d)。未免疫小鼠作為對(duì)照。圖4.通過(guò)VV皮膚劃痕法免疫提供針對(duì)皮內(nèi)黑色素瘤激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)。通過(guò)所示途徑，用rVV-ova使B6小鼠免疫。4周后，通過(guò)皮內(nèi)注射B16-0Va黑色素瘤細(xì)胞激發(fā)免疫小鼠。(a-e)植入腫瘤細(xì)胞后第18天，獲取腫瘤激發(fā)的小鼠的照片。(f)監(jiān)測(cè)激發(fā)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，達(dá)40天。圖5.在VV皮膚劃痕法后，針對(duì)二次皮膚激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)需要T細(xì)胞介導(dǎo)性免疫應(yīng)答。通過(guò)皮膚劃痕法或腹膜內(nèi)注射，用VV使野生型(WT)或B細(xì)胞缺陷型mMT小鼠免疫。 接著，在免疫后第6周，通過(guò)二次VV皮膚感染激發(fā)小鼠。(a)激發(fā)后第6天，測(cè)定激發(fā)部位的病毒載量。在一些野生型小鼠組中，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞在激發(fā)前就已經(jīng)耗盡。(b-c)激發(fā)后第6天，在受激發(fā)的wt和mMt免疫小鼠中評(píng)估皮膚引流腹股溝淋巴結(jié)(b)和脾(c)中的二次T細(xì)胞應(yīng)答。(d)激發(fā)后第4天，從激發(fā)部位收集皮膚樣品。利用免疫組織化學(xué)方法鑒別皮膚浸潤(rùn)⑶3+T細(xì)胞。圖6.盡管在致死性鼻內(nèi)WR-VV激發(fā)后既不需要T細(xì)胞也不需要B細(xì)胞，但T細(xì)胞而非抗體對(duì)防止患病極為重要。通過(guò)皮膚劃痕法(a_b)或腹膜內(nèi)注射(c-d)，用VV使野生型(wt)或B細(xì)胞缺陷型μ MT小鼠免疫。接著，在免疫后6周，通過(guò)致死性WR-VV鼻內(nèi)感染激發(fā)小鼠。在一些wt小鼠組中，在激發(fā)前和激發(fā)期間，用大劑量抗⑶4和抗⑶SmAb處理， 耗盡⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞。激發(fā)后每天監(jiān)測(cè)小鼠的存活率(a、c)和BW變化(b、d)。圖7.早在感染后60小時(shí)，淋巴結(jié)(LN)T細(xì)胞活化就在⑶8+T細(xì)胞上印記 (imprint)皮膚或腸道歸巢分子的差別表達(dá)。將標(biāo)記CFSE的Thyl. I+OT-I細(xì)胞繼承性轉(zhuǎn)移到Thyl. 2B6小鼠中。隨后，通過(guò)皮膚劃痕法或腹膜內(nèi)注射，用rVV-ova感染接受小鼠。 (a)感染后60小時(shí)，獲得的Thyl. 1+供體細(xì)胞的直方圖顯示，ILN和MLN中的OT-I細(xì)胞增殖。(b-c)rVV-ova感染后60小時(shí)，分析經(jīng)歷皮膚劃痕的小鼠的ILN(b)和腹膜內(nèi)感染小鼠的MLN(C)的OT-I組織歸巢表型。獲得Thyl. 1+細(xì)胞的散點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字指示Thyl. I+ 細(xì)胞群的百分比。(d)根據(jù)細(xì)胞分裂周期，繪制OT-I細(xì)胞上指定標(biāo)記物的幾何平均熒光強(qiáng)度(GMFl)的圖。圖8. VV皮膚劃痕法后第5天，皮膚引流ILN中活化的T細(xì)胞遷移遍及整個(gè)次級(jí)淋巴組織，但不發(fā)生病毒或病毒抗原散播。(a)在rVV-ova皮膚劃痕法后第5天，由指定組織制備淋巴細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)分析OT-I細(xì)胞的增殖情況。(b) VV劃痕法后第5天，由指定組織制備RNA樣品。利用實(shí)時(shí)RT-PCT測(cè)量VV感染。數(shù)據(jù)表示4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+ 標(biāo)準(zhǔn)差(s. d.)，其中每組3只小鼠。(c)在用rVV-ova進(jìn)行皮膚劃痕法后第4天，用II類(lèi)抗MHC磁珠從B6小鼠的ILN、MLN和脾中純化出抗原呈遞細(xì)胞。將這些細(xì)胞與標(biāo)記CFSE的 Thyl. Γ0Τ-1細(xì)胞共培養(yǎng)60小時(shí)。利用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)OT-I細(xì)胞活化和增殖情況。獲取 Thyl. 1+細(xì)胞群的直方圖。圖9.在用rVV-ova進(jìn)行皮膚劃痕法后第5天，通過(guò)二次歸巢印記法(secondary homing imprinting)上調(diào)散播的0T-1CD8+細(xì)胞上的腸道歸巢分子α4β7。(a)在用 rVV-ova進(jìn)行劃痕法后第5天，收集ILN和MLN。利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Thyl. I+OT-I細(xì)胞上指定歸巢標(biāo)記物的表達(dá)。獲得Thyl. 1+細(xì)胞的散點(diǎn)圖。(b-d)從用rVV-ova進(jìn)行劃痕法之前M小時(shí)開(kāi)始，對(duì)接收了 Thyl. Γ0Τ-1細(xì)胞的B6小鼠每天注射FTY720。感染后第5天，收集指定組織的淋巴細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。(b)總淋巴細(xì)胞中Thyl. 1+細(xì)胞的百分比。ILN中OT-I細(xì)胞上(c) E-Lig和(d)a4i3 7的表達(dá)。獲取Thyl. 1+細(xì)胞群的直方圖。圖10.在急性病毒感染期間，組織特異性歸巢分子的初次和二次印記在記憶階段期間得到保持。在rVV-ova皮膚劃痕法后第30天，從指定組織收集淋巴細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)分析Thyl. Γ0Τ-1中E-Lig+或α4β7+細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表示6只小鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖11.通過(guò)皮膚劃痕法(s. s.)進(jìn)行MVA免疫引起劑量依賴(lài)性免疫應(yīng)答。(a)通過(guò)皮膚劃痕法，用不同劑量的MVA(從左到右:1.8X107U.8X106U.8X105和1.8X104pfu) 使B6小鼠免疫。免疫后第7天，觀察到劑量依賴(lài)性痘損傷。(b-c)通過(guò)皮膚劃痕法，用指定劑量(pfu/小鼠)MVA或VV使B6小鼠免疫，(b)免疫后第7天，測(cè)量脾中的初次痘苗特異性T細(xì)胞應(yīng)答。(c)免疫后第6周，測(cè)量血清痘苗特異性IgG。(d)免疫后第6周，通過(guò)致死性鼻內(nèi)(i. n.) WR-VV感染激發(fā)小鼠。每天監(jiān)測(cè)存活率和BW變化。圖12.用MVA進(jìn)行的皮膚劃痕法提供優(yōu)于注射途徑的免疫應(yīng)答和保護(hù)功效。通過(guò)所示途徑，用ZXlOfiPfu MVA使Β6小鼠免疫。(a)免疫后第7天，測(cè)量初次T細(xì)胞應(yīng)答。(b) 免疫后第6周，測(cè)量VV特異性IgG。(c-f)免疫后第6周，用致死劑量的WR-VV鼻內(nèi)激發(fā)記憶小鼠。激發(fā)后第6天，測(cè)量二次T細(xì)胞應(yīng)答(c)和激發(fā)后VV特異性IgG(d)。激發(fā)后，每天監(jiān)測(cè)存活率(e)和BW變化(f)。經(jīng)歷VV皮膚劃痕QXlOfiPfu)的小鼠作為對(duì)照。圖13. MVA皮膚劃痕法甚至對(duì)于免疫缺陷型宿主也是安全的。利用皮膚劃痕法，用 2X 106pfu MVA或VV使Rag-/-小鼠免疫。(a)免疫后第7天和第28天，獲取痘損傷的照片。每天監(jiān)測(cè)(b)存活率和(C)BW變化。(d)利用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定MVA劃痕法后第3個(gè)月從 Rag 1-/-小鼠收集的病毒載量。天然皮膚和經(jīng)歷VV劃痕第7天的野生型小鼠的皮膚用作對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明各方面部分基于以下發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮投予含有抗原的修飾型、復(fù)制缺陷性或非復(fù)制性痘病毒，可獲得針對(duì)抗原的有效的長(zhǎng)期免疫應(yīng)答。本文中提供刺激個(gè)體對(duì)感染(或感染性疾病)或癌癥的免疫應(yīng)答和/或使其免疫的新穎方法。所述方法包含對(duì)有需要的個(gè)體投予足以刺激針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的量的含有抗原的修飾型、復(fù)制缺陷性或非復(fù)制性痘病毒載體，其中所述痘病毒是投予個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮。個(gè)體應(yīng)指人類(lèi)或脊椎動(dòng)物，包括(但不限于)狗、貓、馬、奶牛、豬、綿羊、山羊、火雞、雞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如猴或黑猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠)和魚(yú)。個(gè)體優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人類(lèi)。本發(fā)明方法可用于刺激需要此類(lèi)治療的個(gè)體的免疫應(yīng)答和/或使其免疫。需要治療的個(gè)體是患有癌癥或有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，或者患有感染或有患感染風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(例如患有病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)感染或有接觸這些感染的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體)?；加邪┌Y的個(gè)體是可檢測(cè)到癌細(xì)胞的個(gè)體。本文中使用的“癌癥”是指干擾體內(nèi)器官和系統(tǒng)的正常功能的細(xì)胞的不受控制生長(zhǎng)。有發(fā)生癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體是發(fā)生癌癥的概率高于正常值的個(gè)體。這些個(gè)體包括例如出現(xiàn)遺傳異常的個(gè)體，經(jīng)證實(shí)，遺傳異常的存在與發(fā)生癌癥的可能性增高相關(guān)。這些個(gè)體還包括暴露于例如煙草、石棉或其它化學(xué)毒素等致癌物質(zhì)(即致癌物)的個(gè)體，或者先前曾治療過(guò)癌癥并得到明顯緩解的個(gè)體?；加懈腥镜膫€(gè)體是曾暴露于感染性微生物并在體內(nèi)具有急性或慢性可檢測(cè)水平的微生物或出現(xiàn)感染性微生物的病征和癥狀的個(gè)體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知評(píng)估和檢測(cè)個(gè)體感染的方法。有感染風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體是預(yù)期可能會(huì)接觸感染性微生物的個(gè)體。此類(lèi)個(gè)體的實(shí)例為醫(yī)療工作者，或旅行到世界上感染發(fā)生率高的地區(qū)的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，由于個(gè)體具有一個(gè)或一個(gè)以上發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)因子，致使個(gè)體發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)升高。發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)因子的實(shí)例包括例如免疫抑制、免疫功能低下、年齡、外傷、燒傷(例如熱燒傷)、手術(shù)、異物、癌癥、新生兒(尤其是早產(chǎn)的新生兒)。感染的風(fēng)險(xiǎn)程度視民眾(multitude)以及個(gè)體所具有的風(fēng)險(xiǎn)因子的嚴(yán)重程度或量值而定。風(fēng)險(xiǎn)圖和預(yù)測(cè)算法可用于根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)因子的存在和嚴(yán)重程度評(píng)估個(gè)體感染的風(fēng)險(xiǎn)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它評(píng)估個(gè)體的感染風(fēng)險(xiǎn)的方法。在一些實(shí)施例中，感染風(fēng)險(xiǎn)較高的個(gè)體可能是表觀健康的個(gè)體。表觀健康的個(gè)體是尚無(wú)疾病病征或癥狀的個(gè)體。本發(fā)明一些方面包含對(duì)個(gè)體投予活的、修飾型、復(fù)制減弱性或非復(fù)制性含抗原痘病毒。痘病毒是適于多種應(yīng)用的有用載體，例如，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的疫苗、用于開(kāi)發(fā)新型疫苗、用于傳遞所需蛋白質(zhì)和用于基因療法。這些痘病毒載體的益處包括(i)易于產(chǎn)生和制造；(ii)基因組尺寸大，允許插入多種基因(即，多價(jià)載體)；(iii)可將基因高效傳遞到多種細(xì)胞類(lèi)型，包括抗原呈遞細(xì)胞；(iv)蛋白質(zhì)表達(dá)水平高；(ν)優(yōu)化抗原向免疫系統(tǒng)的呈遞；以及(vi)能夠引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗體應(yīng)答；(vii)由于痘病毒不具有免疫交叉反應(yīng)性，故能夠使用來(lái)自不同屬的痘病毒的組合；和(viii)在人體中使用這一載體作為天花疫苗獲得了長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)。痘病毒可經(jīng)遺傳工程改造成含有和表達(dá)外來(lái)DNA，同時(shí)削弱或不削弱病毒復(fù)制能力。所述外來(lái)DNA可編碼多種蛋白質(zhì)，例如誘導(dǎo)針對(duì)一種或一種以上感染物質(zhì)的保護(hù)的抗原、免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如共刺激分子)或酶蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，重組痘苗病毒經(jīng)過(guò)工程改造，以表達(dá)皰疹病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)和其它病毒的免疫抗原(凱恩尼(Kieny)等人，自然 (Nature) 312 :163-6(1984)；史密斯(Smith)等人，自然，302 =490-5(1983)；史密斯等人， 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 80 :7155-9 (1983)；扎格雷(Zagury)等人，自然，326 :249-50(1987)；科雷(Cooney)等人，柳葉刀(Lancet) 337 :567-72(1991)；格拉罕(Graham)等人，傳染病雜志(J. Infect. Dis.) 166 :244-52 (1992))，并且經(jīng)顯示，其可引起針對(duì)流感病毒、登革病毒、呼吸道合胞病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應(yīng)答。還曾使用痘病毒產(chǎn)生針對(duì)例如CEA、PSA和MUC等腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)。痘病毒是眾所周知的胞質(zhì)型病毒。由這類(lèi)病毒載體表達(dá)的遺傳物質(zhì)通常保持在細(xì)胞質(zhì)中，并且除非采取特定步驟，否則不具有將遺傳物質(zhì)無(wú)意中整合到宿主細(xì)胞基因中的潛力。歸因于痘病毒的非整合性細(xì)胞質(zhì)性質(zhì)，使得痘病毒載體系統(tǒng)在其它細(xì)胞中不具有長(zhǎng)期持續(xù)性。因此，這一載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞不會(huì)不利地影響宿主動(dòng)物體內(nèi)遠(yuǎn)離靶細(xì)胞位置的細(xì)胞。與例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體等其它系統(tǒng)相比較，痘病毒的大基因組能夠?qū)⒋罅炕虿迦牖诙坏妮d體中。有利地，歸因于痘病毒的細(xì)胞質(zhì)性質(zhì)，使得外來(lái)DNA不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種痘病毒作為活病毒載體來(lái)表達(dá)異源蛋白質(zhì)，例如減毒痘苗病毒株修飾型安卡拉痘苗病毒株(MVA)和惠氏株(薩普克(Gpko)等人，細(xì)胞(Cell) 37 :1053 1062(1984)；莫林(Morin)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84 4626 4630(1987)；洛維(Lowe)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，84 :38963900 (1987)；帕尼卡 (Panicali)和鮑樂(lè)提O^aoletti)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，79 :4927 4931(1982)；馬克特 (Mackett)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，79 :74157419 (1982))。其它減毒痘苗病毒株包括WR 株、NYCBH株、ACAM2000、李斯特氏株、LC16m8、Elstree-BNm、哥本哈根株和天壇株。痘苗病毒是正痘病毒屬的原型。它是一種雙鏈DNA(脫氧核糖核酸)病毒，在實(shí)驗(yàn)條件下具有廣泛的宿主范圍(芬娜(Fermer)等人，正痘病毒(Orthopoxviruses).加利福尼亞州圣地亞哥(San Diego, Calif)學(xué)術(shù)出版公司(Academic Press, Inc.), 1989 ；達(dá)莫索(Damaso)等人，病毒學(xué)(Virology) 277 :439-49 (2000)) 通過(guò)在雞胚成纖維細(xì)胞上進(jìn)行安卡拉痘苗病毒株(CVA)的長(zhǎng)期連續(xù)傳代，已經(jīng)產(chǎn)生了修飾型安卡拉痘苗病毒(MVA)或其衍生物(有關(guān)評(píng)述，參見(jiàn)梅爾A. (Mayr，A.)等人，感染(Infection)，3 :6-14(1975))。MVA病毒本身可從多種公開(kāi)的存放庫(kù)源獲得。舉例來(lái)說(shuō)， MVA是遵照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)的要求于1987年12月15日寄存于CNCM (法國(guó)巴斯的研究中心Gnstitut Pasteur)，微生物菌種保藏中心(Collection Nationale de Cultures Microorganisms), 25, rue du Docteur Roux, 75724Paris Cedex 15),寄存編號(hào) 1-721 (美國(guó)專(zhuān)利第5，185，146號(hào))；MVA病毒是遵照布達(dá)佩斯條約于1994年1月27日寄存于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Culture,ECACC) (CAMR，英國(guó)波登當(dāng)(Porton Down)，索爾茲伯里 Salisbury))，SP40JG，UK)，寄存編號(hào) V94012707 (美國(guó)專(zhuān)利第6，440，422號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第2003/0013190號(hào))。另外，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第2003/0013190號(hào)還揭示了寄存于ECACC的特定MVA株，寄存編號(hào)99101431，且ECACC臨時(shí)登錄號(hào) 01021411。市面上銷(xiāo)售的是 THERION-MVA、THERION PRIFREE 載體和 THERION M 系列載體(塞隆生物公司(Therion Biologies Corporation)，馬薩諸塞州(MA)) MVA是通過(guò)痘苗病毒安卡拉株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳代516代產(chǎn)生 (有關(guān)評(píng)述，參見(jiàn)梅爾A. (Mayr，A.)等人，感染(Infection)，3，6_14 [1975])。由于經(jīng)歷了長(zhǎng)期傳代，這一病毒的基因組序列缺失了約31千堿基(缺失I、II、III、IV、V和VI)，并因此， 描述的所得MVA病毒的宿主細(xì)胞嚴(yán)格局限于禽類(lèi)細(xì)胞(梅耶爾H. (Meyer，H.)等人，普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol.) 72，1031-1038 [1991])。經(jīng)顯示，在多種動(dòng)物模型中，所得MVA明顯無(wú)毒(梅爾A. (Mayr, A.)和丹納K. (Danner, K.) [1978]生物標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展(Dev. Biol. Stand. )41 :225-34)。此外，還在臨床試驗(yàn)中測(cè)試了這一 MVA株作為疫苗以針對(duì)人天花疾病進(jìn)行免疫(梅爾(Mayr)等人，Zbl. Bakt. Hyg. I，Abt. Org. B 167，375-390 [1987]；斯蒂克 (Stickl)等人，Dtsch. med. Wschr. 99，2386-2392 [1974])。這些研究涉及超過(guò) 120，000 人， 包括高風(fēng)險(xiǎn)患者，并且證實(shí)，與基于痘苗的疫苗相比較，MVA的毒力或感染性較弱，同時(shí)其誘導(dǎo)良好的特異性免疫應(yīng)答。一般說(shuō)來(lái)，如果一種病毒株不能在宿主細(xì)胞中再生復(fù)制或只能在宿主細(xì)胞中較弱地再生復(fù)制，那么認(rèn)為這種病毒株為減毒的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制性”或“復(fù)制減弱性”痘病毒是指在大部分正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞或正常原代人體細(xì)胞中不能復(fù)制達(dá)到任何顯著程度的痘病毒。本文中使用的“顯著程度”是指在標(biāo)準(zhǔn)分析法中復(fù)制能力是野生型痘苗病毒的75%或更低。在一些實(shí)施例中， 痘病毒的復(fù)制能力是野生型痘苗病毒的65%、55%、45%、35%、25%或15%。在一些實(shí)施例中，痘病毒的復(fù)制能力是野生型痘苗病毒的5%或更低，或者或更低。非復(fù)制性病毒在正常原代人體細(xì)胞中100%不能復(fù)制。此項(xiàng)技術(shù)中已知病毒復(fù)制分析法，并且可在例如原代角化細(xì)胞上針對(duì)痘苗病毒進(jìn)行分析，且其描述于例如劉(Liu)等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.) 2005，79 12，7363-70中。 非復(fù)制性或復(fù)制減弱性病毒可以是天然(即，其可從自然界以原樣分離)，或者是例如通過(guò)體外育種或通過(guò)遺傳操作(例如對(duì)復(fù)制來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的基因缺失)人工制造的。一般存在一種或少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型可供這些病毒生長(zhǎng)，例如適于MVA生長(zhǎng)的CEF細(xì)胞。本文中使用的“修飾型”痘病毒是指經(jīng)過(guò)某種方式改變，從而與野生型病毒相比較，修飾型病毒的一種或一種以上特征發(fā)生變化的痘病毒。這些變化可以天然發(fā)生或者是通過(guò)工程改造發(fā)生。在一些實(shí)施例中，修飾型痘病毒是改變成包括免疫原性(即，在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答)抗原。抗原包括例如癌癥抗原或微生物抗原。在一些實(shí)施例中，痘病毒的變化包括例如病毒基因表達(dá)譜的改變。在一些實(shí)施例中，修飾型痘病毒可表達(dá)編碼對(duì)于痘病毒來(lái)說(shuō)是外來(lái)(即，在野生型痘病毒中未發(fā)現(xiàn))的肽或多肽的基因或基因部分。這些外來(lái)或異源肽或多肽可包含免疫原性序列，例如腫瘤特異性抗原(TSA)、細(xì)菌、病毒、真菌和原蟲(chóng)抗原序列，或者來(lái)源于除痘病毒外的病毒的抗原序列。在一些實(shí)施例中，本文中描述的修飾型痘病毒能夠表達(dá)包含抗原的非痘病毒多肽，且另外為減毒的，也就是說(shuō)，其因發(fā)生影響病毒復(fù)制速率的修飾而具有較弱的擴(kuò)散能力，以致這些修飾型痘病毒為復(fù)制缺陷性的或非復(fù)制性的。痘病毒作為載體的一個(gè)益處在于，其基因組尺寸較大，由此允許插入多種遺傳物質(zhì)，包括多種基因(即，作為多價(jià)載體)。遺傳物質(zhì)可插入痘病毒基因組內(nèi)的適宜位點(diǎn)以使重組病毒保持活力，即，遺傳物質(zhì)可插入病毒DNA中某一位點(diǎn)(例如，病毒DNA中的非必需位點(diǎn))以確保重組病毒仍能夠感染外來(lái)細(xì)胞并表達(dá)DNA，同時(shí)保持所需的免疫原性和減小的毒力。舉例來(lái)說(shuō)，如上文所述，MVA含有6個(gè)天然缺失位點(diǎn)，經(jīng)證實(shí)，這些位點(diǎn)可用作插入位點(diǎn)。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5，185，146號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6，440，422號(hào)。本文中所述的痘病毒在本文中有時(shí)稱(chēng)為病毒載體或病毒載體系統(tǒng)。在一些實(shí)施例中，將編碼所需抗原的基因以一定方式插入痘病毒基因組中，由此使這些基因能夠與母病毒蛋白正常補(bǔ)體表達(dá)一起由痘病毒表達(dá)。這一過(guò)程可通過(guò)首先構(gòu)筑 DNA供體載體以在體內(nèi)與痘病毒重組來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般說(shuō)來(lái)，DNA供體載體含有以下元件⑴原核復(fù)制起點(diǎn)，由此載體可在原核宿主中擴(kuò)增；(ii)編碼標(biāo)記物的基因，其允許選擇含有所述載體的原核宿主細(xì)胞(例如，編碼抗生素抗性的基因)；(iii)至少一個(gè)編碼所需蛋白質(zhì)的基因，其位于能夠引導(dǎo)所述基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子附近；和(iv)與母病毒基因組中待插入外來(lái)基因的區(qū)域同源的DNA序列， 其側(cè)接元件(iii)的構(gòu)筑體。用于將多種外來(lái)基因引入痘病毒中的供體質(zhì)粒構(gòu)筑方法描述于例如W091/19803 中，其技術(shù)以引用的方式并入本文中。一般說(shuō)來(lái)，用于構(gòu)筑供體載體的所有DNA片段，包括含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的片段以及含有與母病毒基因組中待插入外來(lái)基因的區(qū)域同源的序列的片段，都可從基因組DNA或克隆的DNA片段獲得。供體質(zhì)?？梢允菃蝺r(jià)、二價(jià)或多價(jià)的(即， 可含有一個(gè)或一個(gè)以上插入的外來(lái)基因序列)。供體載體可含有另一編碼標(biāo)記物的基因，所述標(biāo)記物允許鑒別含有插入的外來(lái) DNA的重組病毒。數(shù)類(lèi)標(biāo)記物基因可用來(lái)允許鑒別和分離重組病毒。這些基因包括例如編碼抗生素或化學(xué)劑抗性的基因(例如，參見(jiàn)賽羅普洛斯(Spyropoulos)等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol. ),62 =1046(1988)；法克納(Falkner)和莫斯(Moss.)，病毒學(xué)雜志，62 1849(1988)；弗蘭克(Franke)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol. ),5 :1918(1985)) 以及諸如大腸桿菌(E. coli) IacZ基因等基因，其允許通過(guò)比色分析法鑒別重組病毒蝕斑 (帕尼卡(Panicali)等人，基因(Gene)，47 193 199(1986))。感染細(xì)胞中供體質(zhì)粒DNA與病毒DNA之間的同源重組導(dǎo)致形成并有所需元件的重組病毒。適于體內(nèi)重組的宿主細(xì)胞一般為可感染病毒并經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞。適于與痘病毒合用的此類(lèi)細(xì)胞的實(shí)例為雞胚真皮(chick embryo dermal, CED)細(xì)胞、 HuTK143(人類(lèi))細(xì)胞以及CV-I和BSC-40(都為猴腎)細(xì)胞。用痘病毒感染細(xì)胞和用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞是通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(帕尼卡(Panicali)和鮑樂(lè)提 O^aoletti)，美國(guó)專(zhuān)利第4，603，112號(hào)、TO89/03429)?；蛘撸梢詫⒐wDNA直接連接到母病毒基因組中的獨(dú)特限制性位點(diǎn)(斯奇福格(Scheiflinger)等人，(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)) 89 :9977 9981)。在體內(nèi)重組或連接后，可利用數(shù)種此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的技術(shù)鑒別重組病毒子代。舉例來(lái)說(shuō)，如果DNA供體載體是設(shè)計(jì)成將外來(lái)基因插入母病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因中，那么含有整合的DNA的病毒將為T(mén)K_的，并且可據(jù)此進(jìn)行選擇(莫克特 (Mackett)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 79 :7415 (1982)) 或者，如上文所述，共整合編碼標(biāo)記物的基因或指示基因與相關(guān)外來(lái)基因，可用來(lái)鑒別重組子代。一種優(yōu)選的指示基因是大腸桿菌IacZ基因可使用半乳糖苷酶的顯色底物來(lái)選擇表達(dá)這種酶的重組病毒(帕尼卡(Panicali)等人，基因(Gene)，47 193 (1986))。—旦鑒別出重組病毒，就可以使用此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的多種方法來(lái)分析由插入基因所編碼的多肽的表達(dá)。這些方法包括例如黑斑分析法(針對(duì)病毒蝕斑進(jìn)行的原位酶免疫分析)、免疫印跡分析(Western blot analysis)、放射免疫沉淀法 (radioimmunoprecipitation，RIPA)、酶免疫分析法(enzyme immunoassay, EIA)或功能分析法(例如CTL分析法)。由于痘病毒具有較大基因組，故其可易于用來(lái)傳遞多種遺傳物質(zhì)，包括多種基因 (即充當(dāng)多價(jià)載體)。視病毒株而定，痘病毒基因組的尺寸范圍介于約130到3001Λρ之間， 且最多300個(gè)基因。因此，有可能將較大的外來(lái)DNA片段插入這些病毒中，但仍保持病毒基因組的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，將至少一個(gè)編碼基因的核酸片段插入痘病毒載體中。在另一實(shí)施例中，將至少兩個(gè)且最多約10個(gè)編碼不同基因的不同核酸插入痘病毒載體中。在一些實(shí)施例中，痘病毒中插入編碼所關(guān)注的疾病相關(guān)抗原(例如來(lái)自致病物質(zhì)的抗原或與疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原)的DNA，并表達(dá)所述抗原。在某些實(shí)施例中，痘病毒中插入編碼共刺激分子的DNA，并表達(dá)所述共刺激分子。在某些實(shí)施例中，痘病毒中插入編碼所關(guān)注的疾病相關(guān)抗原和共刺激分子的DNA， 并表達(dá)所述抗原和共刺激分子。任何所關(guān)注DNA都可插入本文中所述的痘病毒載體中?？赏ㄟ^(guò)用于分離所需基因的任何常規(guī)技術(shù)獲得以可表達(dá)形式插入痘病毒基因組中的外來(lái)基因。對(duì)于含有DNA基因組的生物體，編碼所關(guān)注抗原的基因可從基因組DNA中分離；對(duì)于含RNA基因組的生物體，所需基因可從基因組的cDNA拷貝分離。如果可以獲得基因組的限制性圖譜，那么設(shè)計(jì)的策略可通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶消化來(lái)裂解基因組DNA，從而得到含有所關(guān)注基因的DNA片段。在一些情況下，可能先前已經(jīng)克隆了所需基因，因此，可從可用克隆獲得所述基因?；蛘?，如果已知某一基因的DNA序列，那么可借助有關(guān)聚合酶鏈反應(yīng)或脫氧核糖核酸合成(例如磷酸或亞磷酸三酯技術(shù))的任何常規(guī)技術(shù)來(lái)合成所述基因。通過(guò)將編碼所關(guān)注抗原的基因克隆到細(xì)菌宿主中，可擴(kuò)增所述基因。為此，可以使用各種原核克隆載體。實(shí)例有質(zhì)粒PBR322和pEMBL。制備出的編碼所關(guān)注抗原的基因可借助標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)插入痘病毒載體中。一般說(shuō)來(lái)， 可通過(guò)限制性酶消化，從原核克隆載體中切除經(jīng)克隆的基因。必要時(shí)，帶有克隆基因的DNA 片段可經(jīng)修飾，例如以使所述片段各端與痘病毒載體的插入位點(diǎn)相容，隨后純化，接著插入這些載體中的限制性核酸內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)(克隆位點(diǎn))。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知將基因插入病毒中的基本技術(shù)，并且這些技術(shù)涉及例如，側(cè)接供體質(zhì)粒中某一基因的病毒DNA序列與母病毒中存在的同源序列之間的重組(莫克特(Mackett)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 79 :7415-7419(1982))。舉例來(lái)說(shuō)，可以將欲插入病毒中的DNA基因序列放入質(zhì)粒中，例如大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)筑體中，在所述質(zhì)粒中，已經(jīng)插入與一部分DNA(例如痘病毒的DNA)同源的DNA。單獨(dú)將欲插入的DNA基因序列與啟動(dòng)子連接。啟動(dòng)子-基因連接位于質(zhì)粒構(gòu)筑體中，由此啟動(dòng)子-基因連接的兩端側(cè)接的DNA與側(cè)接作為所需插入?yún)^(qū)的痘DNA區(qū)的DNA序列同源。隨后，通過(guò)在大腸桿菌中生長(zhǎng)來(lái)擴(kuò)增所得質(zhì)粒構(gòu)筑體，并分離。這一質(zhì)粒還優(yōu)選含有復(fù)制起點(diǎn)，例如大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，以及用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的標(biāo)記物，例如抗生素抗性基因。將含有欲插入的DNA基因序列的分離質(zhì)粒與痘病毒一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物(例如雞胚成纖維細(xì)胞)中。質(zhì)粒中的同源痘DNA與病毒基因組之間重組相應(yīng)地使痘病毒因?yàn)樵诙徊《净蚪M中在不影響病毒活力的位點(diǎn)存在啟動(dòng)子-基因構(gòu)筑體而得到修飾。在某些實(shí)施例中，插入超過(guò)一個(gè)核酸，例如一個(gè)或一個(gè)以上抗原和共刺激分子。在一些實(shí)施例中，可以將基因插入痘病毒中在很大程度上不會(huì)影響所得重組病毒的病毒活力的位點(diǎn)或區(qū)域(插入?yún)^(qū))中，例如病毒基因，優(yōu)選非必需病毒基因之間的基因內(nèi)區(qū)域。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)例如測(cè)試病毒DNA區(qū)段中允許形成重組體而不會(huì)嚴(yán)重影響重組體病毒活力的區(qū)域，在病毒中容易地鑒別出這些區(qū)域。易于使用并且存在于許多病毒中的一個(gè)區(qū)域例如為胸苷激酶基因，已經(jīng)在所有檢查的痘病毒基因組中發(fā)現(xiàn)了這一基因(野兔痘病毒澳普敦(Upton)等人，病毒學(xué)雜志(J. Virology)，60 :920(1986)(兔纖維瘤病毒)；羊痘病毒吉夏隆(Gershon)等人，普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol.)，70 525(1989)(肯尼亞綿羊-KKenya sheep-Ι))；正痘病毒威爾(Weir)等人，病毒學(xué)雜志 (J. Virol.)，46 530 (1983)(痘苗)；艾斯普托(Esposito)等人，病毒學(xué)(Virology)，135 561(1984)(猴痘和天花病毒)；哈魯比(Hruby)等人，PNAS，80 :3411 (1983)(痘苗)；凱帕曲克(Kilpatrick)等人，病毒學(xué)，143 :399(1985)(雅巴猴腫瘤病毒(Yabamonkey tumor virus))；禽痘病毒比恩斯(Binns)等人，普通病毒學(xué)雜志，69 :1275 (1988)(雞痘)；伯勒 (Boyle)等人，病毒學(xué)，156 :355(1987)(雞痘)；斯奇尼雷恩(Schnitzlein)等人，病毒學(xué)方法(J. Virological Methods)，20 :341(1988)(雞痘、鵪鶉痘)；昆蟲(chóng)痘(萊維恩(Lytvyn) 等人，普通病毒學(xué)雜志，73 :3235-3240(199幻)。在雞痘中，除TK區(qū)外，其它插入?yún)^(qū)域包括例如EPO申請(qǐng)案第O 308 220A1號(hào)中陳述的BamHI J (杰金斯(Jenkins)等人，AIDS研究和人逆轉(zhuǎn)錄病毒(AIDSResearch and Human-Retroviruses) 7 :991-998 (1991)) EcoRI-HindIII 片段、BamHI片段、EcoRV-HindHIII片段、BamHI片段和HindIII片段。(卡爾維特 (Calvert)等人，病毒學(xué)雜志(J. of Virol. )67 :3069-3076(1993)；泰勒(Taylor)等人，疫苗(Vaccine) 6 :497-503(1988)；斯普納(Spehner)等人，(1990)和博斯奈爾(Boursnell) 等人,普通病毒學(xué)雜志(J. of Gen. Virol.) 71 :621-628 (1990))。在一些實(shí)施例中，本文中所述的痘病毒可任選在其基因組中并入一個(gè)或一個(gè)以上編碼一個(gè)或一個(gè)以上免疫刺激分子的基因或其部分，或者基因或其部分。在某些實(shí)施例中，外來(lái)DNA不編碼完整蛋白質(zhì)，而是編碼蛋白質(zhì)的抗原片段，或表位。這些片段可以為足以產(chǎn)生免疫原性或抗原性的任何長(zhǎng)度。片段可為至少4個(gè)氨基酸長(zhǎng)， 優(yōu)選 5 到 9 個(gè)氨基酸長(zhǎng)，但可以更長(zhǎng)，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、500個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)，或者是其間的任何長(zhǎng)度。優(yōu)選可表達(dá)誘導(dǎo)針對(duì)例如細(xì)菌、病毒、真菌和原蟲(chóng)(例如本文中所述者)等多種病原體中任一者的保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位，并且可將其與編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞因子、1型干擾素、Y干擾素、集落刺激因子、白細(xì)胞介素-1、-2、-4、-5、-6、-12)的異源基因序列組合。在一些實(shí)施例中，異源序列可來(lái)源于腫瘤抗原，并且所得重組痘病毒可用來(lái)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而在體內(nèi)使腫瘤消退。重組病毒可經(jīng)工程改造成表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)或組織特異性抗原。在一些實(shí)施例中，插入的編碼抗原的基因可操作地連接到啟動(dòng)子以表達(dá)插入基因。此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知啟動(dòng)子，并且可根據(jù)宿主和希望靶向的細(xì)胞類(lèi)型容易地選擇。舉例來(lái)說(shuō)，在痘病毒中，可以使用痘病毒啟動(dòng)子，例如痘苗7. 5K、40K、雞痘。在某些實(shí)施例中， 也可組合使用增強(qiáng)子元件，以增加表達(dá)水平。在某些實(shí)施例中，可以使用此項(xiàng)技術(shù)中也眾所周知的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，痘病毒啟動(dòng)子包括例如昆蟲(chóng)痘啟動(dòng)子、禽痘啟動(dòng)子或正痘啟動(dòng)子，例如痘苗啟動(dòng)子，例如HH、1 IK或Pi。舉例來(lái)說(shuō)，來(lái)自痘苗Ava I H區(qū)的Pi啟動(dòng)子描述于沃奇曼(Wachsman)等人，傳染病雜志(J. of Inf. Dis.) 155，1188-1197 (1987)中。更具體點(diǎn)說(shuō)，這一啟動(dòng)子來(lái)源于L變體WR痘苗株的Ava I H(Xho I G)片段，其中啟動(dòng)子引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄從右向左進(jìn)行。啟動(dòng)子的圖譜位置距Ava IH的5'端約1.3Kbp (千堿基對(duì))，距痘苗基因組的5'端約12. 5Kbp，并且距Hind IIIC/N接點(diǎn)的5'端約8. 5Kbp。Hind III H啟動(dòng)子(本文中也稱(chēng)為“HH”和“H6”)序列在開(kāi)放閱讀框架H6的上游(羅塞爾(Rosel)等人， 病毒學(xué)雜志(J.Virol. )60,436-449 (1986) ) 0 IlK啟動(dòng)子描述于維克(Wittek)，病毒學(xué)雜志(J.Virol.) 49，371-378 (1984)和波斯雷特C. (Bertholet, C.)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 82, 2096-2100 (1985)中。技術(shù)人員可利用早期啟動(dòng)子或晚期啟動(dòng)子以安排特定基因表達(dá)的時(shí)間。在一些實(shí)施例中，痘病毒載體包含受外部因子或信號(hào)(cue)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，由此通過(guò)活化所述外部因子或信號(hào)來(lái)控制載體產(chǎn)生的多肽水平。舉例來(lái)說(shuō)，熱休克蛋白是啟動(dòng)子受溫度調(diào)節(jié)的基因所編碼的蛋白質(zhì)。編碼含金屬蛋白質(zhì)金屬硫蛋白的基因的啟動(dòng)子對(duì) Cd+離子起反應(yīng)。并入這種啟動(dòng)子或另一受外部信號(hào)影響的啟動(dòng)子還可能調(diào)節(jié)包含抗原的多肽的產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，痘病毒基因組經(jīng)修飾成帶有編碼至少一個(gè)編碼例如抗原的所關(guān)注基因的核酸，其可操作地連接到“誘導(dǎo)性”啟動(dòng)子。此類(lèi)誘導(dǎo)性系統(tǒng)允許小心地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。參見(jiàn)米勒(Miller)和韋蘭(Whelan)，人基因療法(Human Gene Therapy), 8 803-815(1997)。本文中使用的短語(yǔ)“誘導(dǎo)性啟動(dòng)子”或“誘導(dǎo)性系統(tǒng)”包括可以使用外部傳遞的試劑調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性的系統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)包括例如使用來(lái)自大腸桿菌的Iac阻遏蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白以調(diào)節(jié)帶有Iac操縱子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)(布朗 (Brown)等人，細(xì)胞(Cell),49 :603-612,1987)；使用四環(huán)素阻遏蛋白(tetR)的系統(tǒng)(高森 O^ossen)和布嘉德(Bujard)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 89 5547-5551,1992 ；姚(Yao)等人，人基因療法(Human Gene Ther.) 9 :1939-1950,1998 ；肖克特Ghokelt)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，92. 6522-6526,1995)。其它此類(lèi)系統(tǒng)包括使用 castradiol、RU486/米非司酮(mif印ristone)、聯(lián)苯酚米樂(lè)甾酮(diphenol muristerone) 或雷帕霉素(rapamycin)的FK506 二聚體、VP16或p65 (參見(jiàn)米勒(Miller)和韋蘭 (Whelan)，同上文，圖2)。另一實(shí)例為蛻皮激素誘導(dǎo)性系統(tǒng)(例如參見(jiàn)卡恩斯(Karns) 等人，MCB生物技術(shù)(MBC Biotechnology) 1 :11，2001)。誘導(dǎo)性系統(tǒng)可例如從英杰公司 anvitrogen)、克羅泰克公司(Clontech)和阿雷德公司(Ariad)獲得。優(yōu)選使用具有操作子的阻遏蛋白的系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)用痘啟動(dòng)子部分取代哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子來(lái)修改這些啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”或“TRE”經(jīng)誘導(dǎo)以調(diào)節(jié)所關(guān)注基因。本文中使用的TRE是一種調(diào)節(jié)(即控制)可操作連接的聚核苷酸序列在RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄形成 RNA的聚核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列。本文中使用的TRE可增加可操作連接的聚核苷酸序列在允許TRE起作用的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。TRE包含增強(qiáng)子元件和/或痘啟動(dòng)子元件，其可或可不來(lái)源于相同基因。TRE的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組件可呈任何定向和/或與所關(guān)注的編碼序列成任何距離，并且包含前述的多聚體，只要獲得所需的轉(zhuǎn)錄活性即可。在一些實(shí)施例中，提供調(diào)節(jié)所關(guān)注基因的“增強(qiáng)子”。增強(qiáng)子是此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的術(shù)語(yǔ)，并且是來(lái)源于某種基因的聚核苷酸序列，這一基因使可操作連接到啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)錄增加到高于當(dāng)可操作連接到基因時(shí)啟動(dòng)子本身所達(dá)到的轉(zhuǎn)錄活化的程度，即，這一基因使自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增加。如TRE或增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)元件的活性一般視轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的存在和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抑制子的不存在而定。轉(zhuǎn)錄活化可用此項(xiàng)技術(shù)中已知的多種方式測(cè)量，但一般是通過(guò)檢測(cè)和/ 或定量在調(diào)節(jié)元件控制下(即可操作連接到調(diào)節(jié)元件)編碼序列的mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物來(lái)測(cè)量。調(diào)節(jié)元件可以為任何長(zhǎng)度，并且可具有不同序列組成。通過(guò)轉(zhuǎn)錄活化，預(yù)期靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄將增加到基底水平的至少約2倍，優(yōu)選至少約5倍，優(yōu)選至少約10倍，更優(yōu)選至少約 20倍。更優(yōu)選至少約50倍，更優(yōu)選至少約100倍，甚至更優(yōu)選至少約200倍，甚至更優(yōu)選至少約400倍到500倍，甚至更優(yōu)選至少約1000倍?；姿揭话闶欠前屑?xì)胞中的活性水平 (如果存在的話)，或是如在靶細(xì)胞類(lèi)型中測(cè)試的缺乏所關(guān)注TRE或增強(qiáng)子的報(bào)告基因構(gòu)筑體的活性水平(如果存在的話)。經(jīng)顯示，在TRE序列內(nèi)的某些點(diǎn)突變可減少轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和基因活化。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)中和周?chē)鷫A基的某些改變很可能會(huì)不利地影響基因活化和細(xì)胞特異性，而不涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的堿基改變則不太可能具有這些影響。某些突變還能夠增加TRE活性?？衫么隧?xiàng)技術(shù)中已知的任何方法，例如遷移率變動(dòng)分析法， 或在TRE功能性和TRE非功能性細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有這些改變的載體，在體外或體內(nèi)測(cè)試堿基改變的影響。此外，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可在TRE序列中產(chǎn)生點(diǎn)突變和缺失，而不改變這一序列調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力。如本文中所述，本文中提供的痘病毒載體編碼抗原或免疫原或片段(抗原)。所關(guān)注抗原可以是來(lái)自病原微生物的抗原或腫瘤(或癌癥)抗原。編碼此類(lèi)抗原的基因或核酸片段可來(lái)源于任何生物體，包括細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)、正?；蜣D(zhuǎn)化細(xì)胞，或者其它微生物。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注基因是編碼病原生物體的免疫原性蛋白的基因。在某些實(shí)施例中，這些免疫原性蛋白可以是諸如細(xì)菌細(xì)胞壁或病毒包膜等表面結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組分。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注基因是編碼腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原 (TSA)、組織特異性抗原、病毒腫瘤抗原、細(xì)胞癌基因蛋白和/或腫瘤相關(guān)分化抗原的基因。在一些實(shí)施例中，可以使用這些蛋白質(zhì)的免疫原性片段或亞單位。各種蛋白質(zhì)的多個(gè)免疫原性片段或亞單位都可以使用。舉例來(lái)說(shuō)，可表達(dá)來(lái)自單一蛋白質(zhì)不同位點(diǎn)或來(lái)自相同物種不同蛋白質(zhì)，或者來(lái)自不同物種的直系同源蛋白的數(shù)種不同表位。治療癌癥的免疫治療方法是基于以下觀察人腫瘤細(xì)胞表達(dá)多種通常在正常組織中不會(huì)表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)。這些抗原可用作宿主免疫系統(tǒng)的靶，并引起應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤破壞。這一免疫應(yīng)答主要是由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)；一般說(shuō)來(lái)，T細(xì)胞，尤其是I類(lèi)MHC限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，在腫瘤排斥中起到關(guān)鍵作用。海斯托姆K. E. (Hellstrom, K. E.)等人，(1969)癌癥研究進(jìn)展(Adv. Cancer Res.) 12 167 223 ；格林伯格 P.D. (Greenberg，P. D.) (1991)免疫學(xué)進(jìn)展(Advances in Immunology)，第 49 卷(迪隆D. J. (Dixon,D. J.)編)，第觀1355頁(yè)，學(xué)術(shù)出版公司(Academic Press，Inc.)，佛羅里達(dá)州奧蘭多(0rlandO，F(xiàn)L)。用于癌癥免疫療法的TAA的克隆描述于例如布恩Τ. (Βοοη,Τ.)等人’ (1994)免疫學(xué)年評(píng)(Annu. Rev. Immunol.) 12 :337 365 ；布斯卡德 V. (Brithcard, V.)等人，(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 178 :489495 ；寇克斯 A. L. (Cox，A. L.)等人，(1994) 科學(xué)(Science) 264 :716 719 ；豪頓 A. (Houghton, A.N.) (1994)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，180 14 ；中白多爾 D.M. (Pardol 1，D. M.) (1994)自然(Nature) 369 :357358 ；川上 Y. (Kawakami，Y.)等人， (1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 91 :3515 3519;川上 Y.等人， (1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，91 6458 6462中。在抗腫瘤免疫療法中使用痘苗病毒已經(jīng)描述于例如胡S. L. (Hu, S. L.)，海斯托姆 I. (Hellstrom, I.)和海斯托姆K. Ε. (Hellstrom K. Ε.) (1992)疫苗解決免疫問(wèn)題的新方法(Vaccines :New Approaches to Immunological Problems) (R. W.艾利斯(R.W.Ellis) 編)第327343頁(yè)，波士頓巴特沃斯-海納曼出版公司(Butterworth-Heinemann，Boston) 中。人們已經(jīng)使用表達(dá)TAA(例如癌胚抗原(CEA)和前列腺特異性抗原(PSA))的重組痘病毒引起抗腫瘤反應(yīng)。(穆拉羅R. (Muraro,R.)等人，(1985)癌癥研究(Cancer Res.)4S 57695780)；(坎托3. (Kantor，3.)等人(1992)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所雜志(J. Natl. Cancer Inst. )84 :10841091)；(羅賓斯 P. F. (Robbins, P. F.)等人(1991)癌癥研究，51 :3657 3662)(坎托3.等人(1992)癌癥研究，52 :6917 6925。)利用這些載體未觀察到毒性。一般說(shuō)來(lái)，相信病毒疫苗通過(guò)活化I類(lèi)MHC限制性T細(xì)胞，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)來(lái)介導(dǎo)腫瘤排斥。通過(guò)提供適合的免疫調(diào)節(jié)蛋白，例如T細(xì)胞共刺激因子，如 B7基因家族的成員，常常會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞活化。例如參見(jiàn)格林伯格P. D. (Greenberg, P. D.) (1991)免疫學(xué)進(jìn)展(Advances in Immunology)，第 49 卷(迪隆 D. J. (Dixon, D. J.)編)， 第觀1355頁(yè)，學(xué)術(shù)出版公司(Academic Press，Inc.)，佛羅里達(dá)州奧蘭多(Orlando, Fla.)； 福克斯B.A. (Fox B. Α.)等人(1990)生物反應(yīng)修飾劑期刊(J. Biol. Response Mod. ) 9 499511。在一些實(shí)施例中，抗原選自由腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)和/ 或組織特異性抗原組成的群組。這些抗原包括(但不限于)黑色素瘤TAA，其包括(但不限于)MART-I (川上(Kawakami)等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 180 =347-352, 1994)、MAGE-1、MAGE-3、GP-100，(川上等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. U. S. A. )91 :6458-6462,1994)、CEA 和酪氨酸酶(博查德(Brichard)等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178 489,1993)，TAA,例如MUC-U MUC-2、點(diǎn)突變的ras癌基因和點(diǎn)突變的p53癌基因(胰腺癌)、CA-125(卵巢癌)、PSA(前列腺癌)、c-erb/B2(乳癌)、KS 1/4泛癌抗原(佩茲(Perez)和沃克(Walker)，1990，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 142 :3662-3667 ；布莫(Bumal)，1988，雜交瘤(Hybridoma) 7 (4) :407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(余(Yu)等人，1991，癌癥研究(Cancer Res. )51(2) :468-475)、前列腺酸性磷酸鹽(prostatic acid phosphatase)(泰勒(Tailor)等人，1990，核酸研究(Nuc 1. Acids Res.) 18(16) :492 、 前列腺特異性抗原(PSA)(赫托(Henttu)和維克(Vihko)，1989，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Comm.) 160 (2) :903-910 ；伊斯列(Israeli)等人，1993，癌癥研究53 :227-230)、黑色素瘤相關(guān)抗原p97(艾斯汀 stin)等人，1989，國(guó)家癌癥研究所雜志(J. Natl. Cancer Instit.) 81 (6) :445-446)、黑色素瘤抗原gp75 (韋嘉亞薩達(dá)(Vijayasardahl)等人，1990，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，171 1375-1380)、高分子量黑色素瘤 JfiJ^ (high molecular weight melanoma antigen, HMW-MAA) ( MU^M (Natali)等人， 1987，癌癥(Cancer) 59 :55-63 ；米特曼(Mittelman)等人，1990，臨床研究雜志(J.Clin. Invest.) 86 :2136-2144)、前列腺特異性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(佛恩(Foon)等人， 1994，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)會(huì)刊(Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.) 13 294)、多形性上皮粘蛋白抗原、人乳脂球蛋白抗原，結(jié)直腸腫瘤相關(guān)抗原，諸如CEA、TAG-72(橫田(Yokata)等人， 1992，癌癥研究 52 =3402-3408), C017-1A (雷格哈曼(Ragnhammar)等人，1993，國(guó)際癌癥雜志(Int. J. Cancer) 53 :751-758) ；GICA 19-9(赫萊恩(Herlyn)等人，1982，臨床免疫學(xué)雜志(J. Clin. Immunol.) 2 :135)、CTA-I 和 LEA、伯基特氏淋巴瘤抗原-38. 13、CD19(格提(Ghetie)等人，1994，血液學(xué)(Blood) 83 1329-1336)、人 B-淋巴瘤抗原-CD20 (雷夫 (Reff)等人，1994，血液學(xué)，83 :4;35-445)、CD33(薩戈斯(Sgouros)等人，1993，核醫(yī)學(xué)雜志 (J. Nucl. Med.) 34 =422-430)，黑色素瘤特異性抗原，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(薩勒(Saleh)等人，1993，免疫學(xué)雜志，151，3390-3398)、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3 (夏塔拉(Shitara)等人，1993，癌癥免疫學(xué)與免疫療法(Cancer Immunol. Immunother.) 36 :373-380)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2 (李維斯敦(Livingston)等人，1994，臨床腫瘤雜志(J. Clin. Oncol.) 12 :1036-1044)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(霍恩(Hoon)等人，1993，癌癥研究，53 :5M4_5250)，腫瘤特異性移植型細(xì)胞 ^WiiHi W^ (tumor-specific transplantation type ofcell-surface antigen, TSTA), 諸如病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括T-抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的包膜抗原、癌胎抗原-甲胎蛋白，諸如結(jié)腸CEA、膀胱腫瘤癌胎抗原(海斯頓(Hellstrom)等人，1985， 癌癥研究(Cancer. Res. )45 :2210-2188)、分化抗原，諸如人肺癌抗原L6、L20(海斯頓等人，1986，癌癥研究，46 =3917-3923)、纖維肉瘤抗原、人白血病T細(xì)胞抗原_Gp37 (博塔查亞-查特杰(Bhattacharya-Chatterjjee)等人，1988，免疫特異性雜志(J. of Immuno specifically.) 141 :1398-1403)、擬糖蛋白、鞘脂類(lèi)、乳癌抗原，諸如EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)、HER2抗原(pl85HEK2)、多形性上皮粘蛋白(PEM)(海金斯(Hilkens)等人，1992，生物化學(xué)趨勢(shì)(Trends in Bio. Chem. Sci.) 17 :359)、惡性人淋巴細(xì)胞抗原-AP0-1 (伯恩哈德(Bernhard)等人，1989，科學(xué)(Science) 245 :301-304)、分化抗原(菲茲(Feizi)，1985， 自然(Nature)314 :53-57)，諸如見(jiàn)于胎兒紅細(xì)胞、初級(jí)內(nèi)胚層的I抗原，見(jiàn)于成人紅細(xì)胞、 植入前胚胎的I抗原，見(jiàn)于胃腺癌的I (Ma)，見(jiàn)于乳房上皮的M18、M39，見(jiàn)于髓樣細(xì)胞的 SSEA-l，VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、見(jiàn)于結(jié)直腸癌的 D156_22、TRA_1_85 (血型 H)、見(jiàn)于直腸腺癌的C14、見(jiàn)于肺腺癌的F3、見(jiàn)于胃癌的AH6、Y半抗原、見(jiàn)于胚胎癌細(xì)胞的Ley、TL5 (血型A)、 見(jiàn)于A431細(xì)胞的EGF受體、見(jiàn)于胰腺癌的E1系列(血型B)、見(jiàn)于胚胎癌細(xì)胞的FC10. 2、胃腺癌抗原、見(jiàn)于腺癌的C0-514(血型Lea)、見(jiàn)于腺癌的NS-10、C0-43 (血型Leb)、見(jiàn)于A431 細(xì)胞的EGF受體的G49、見(jiàn)于結(jié)腸腺癌的MH2 (血型ALe1VLey)、見(jiàn)于結(jié)腸癌的19. 9、胃癌粘蛋白、見(jiàn)于髓樣細(xì)胞的T5A7、見(jiàn)于黑色素瘤的Ii24，見(jiàn)于胚胎癌細(xì)胞的4. 2,GD3>D1. 1、0FA-1、GM2、 0FA-2、Gd2和Ml =22:25:8,以及見(jiàn)于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的4到8細(xì)胞階段胚胎T細(xì)胞受體源性肽的 SSEA-3 和 SSEA-4(埃德森(Edelson)，1998，癌癥雜志(The Cancer Journal) 4 62)、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-β 17 突變體、IFN-65、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDlla、CDllb、CDllc、CD16、 CD18、CD21、CD28、CD32、CD34、CD35、CD40、CD44、CD45、CD54、CD56、0X40L、4_1BBL、K2、KU P β、0α、Μα、Μβ2、Μβ 1、Hepsin、Pim_l、LMP1、ΤΑΡ2、LMP7、ΤΑΡ1、TRP、0 β、IA β、IAa、 IE β、IE β 2、IEa、CYP21、C4B、CYP21P、C4A、Bf、C2、HSP、G7a/b、TNF-α、TNF-β、D、L、Qa、 Tla、C0L11A2、DP β 2, DPa 2、DP β 1、DPa 1、DNa、DMa、DM β、LMP2、TAPiU LMP7、DO β、 DQ^ 2, DQ a 2,DQ β 3,DQ β UDQa UDR^ ,DRa、G250、HSP-70、HLA-B、HLA-C、HLA-X、HLA_E、 HLA-J, HLA-A, HLA-H、HLA-G, HLA-F、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促生長(zhǎng)素(somatotropin)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素 (somatomedins)、甲狀旁腺素(parathormone)、FSH、LH、EGF、TSH、THS 釋放因子、HGH、GRHR、 PDGF、IGF-I、IGF-II、TGF-β、GM-CSF、M-CSF, G-CS Fl、紅細(xì)胞生成素、β -HCG、4_N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶、GM2、GD2、⑶3、JADE、MART、BAGE、GAGE、MAGE-I、MAGE-2、MAGE-3、XAGE、 MUC-I、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-18、ICAM-U C-CAM、V-CAM、ELAM、匪23、EGFR、E-鈣粘附素、N-CAM、LFA-3 (CD58)、EpCAM、B7. 1、CEA, DCC, PSA、Her2_neu、UTAA、黑色素瘤抗原 p75、 K19、HKer 8、pMel 17、TP10、酪氨酸酶相關(guān)蛋白 1 和 2、p97、p53、RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、 WT-I、MEN-I、MEN-II、BRCAl、VHL、FCC 和 MCC、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、 ret、gsp、hst、bcl 和 abl、Clq、Clr、Cls、C4、C2、因子 D、因子 B、備解素(properdin)、C3、 C5、C6、C7、C8、C9、CUnh、因子H、C4b結(jié)合蛋白、DAF、膜輔因子蛋白、過(guò)敏毒素滅活因子 (anaphylatoxin inactivator) S 蛋白、HRF、MIRL, CRl、CR2、CR3、CR4、C3a/C4a 受體、C5a 受體、艾普斯坦-巴爾二氏病毒抗原(EBNA)、BZLF-I、BXLF-I和核基質(zhì)蛋白、修飾型TAA或 TSA、TAA或TSA的剪接變異體、功能性表位、表位激動(dòng)劑和其簡(jiǎn)并核酸變異體。在一些重要實(shí)施例中，抗原包括粘蛋白1 (MUCl)、粘蛋白2 (MUC2)、BAGE-I、 GAGE-I 8 ；GnTV, HERV-K-MEL, KK-LC-I、KM-HN-I、LAGE-I、MAGE-Al A4、MAGE-A6、 MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C3、NA88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、 TAG-I、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2、XAGE-Ib、癌胚抗原(CEA)、CA-125、gplOO/Pme 117、激肽釋放酶4、乳腺珠蛋白-A、黑色素-A/MART-1、NY-BR-1、0A-1、前列腺特異性抗原(PSA)、RAB38/ NY-MEL-l、TRP-l/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、親脂素、AIM-2、ALDH1A1、BCLX (L)、BING-4、CPSF、 細(xì)胞周期素 Dl、DKKl、ENAH(hMena)、Ep-CAM,EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、 IL13Ra 2、腸羧酸酯酶、甲胎蛋白(AFP)、M-CSF、MCSP、mdm-2、MMP_2、MUC1、PBF、PRAME、PSMA、 RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分離蛋白 1、SOX10、STEAP1、生存素、端粒酶、VEGF、WT1、a -肌動(dòng)蛋白 _4、ARTCl、BCR-ABL 融合蛋白、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β -連接素、Cdc27、CDK4、 CDKN2A、C0A-1、dek-can 融合蛋白、EFTUD2、延伸因子 2、ETV6-AML1 融合蛋白、FLT3-ITD、 FNl、GPNMB, LDLR-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 AS 融合蛋白、HLA-A2、HLA-AlU hsp70_2、KIAA0205、 MART2、MEl、MUM-I、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、I 類(lèi)肌球蛋白、NFYC、0GT、0S-9、p53、pml-RAR α 融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPDl、SYT-SSXl 或-SSX2 融合蛋白、TGF- β RII和磷酸丙糖異構(gòu)酶。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注基因是編碼致病性病原微生物的抗原的基因。這些抗原包括病毒，例如流感病毒血凝素(基因庫(kù)登錄號(hào)J02132 ；艾爾(Air)，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 78 :7639-7643 ；牛頓(Newton)等人，1983，病毒學(xué)(Virology) 128 :495-501)、人呼吸道合胞病毒G糖蛋白(基因庫(kù)登錄號(hào)Z33429 ；蓋西亞(Garcia)等人，1994，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)；柯林斯(Collins)等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，81 :7683)、核心蛋白、基質(zhì)蛋白或登革熱病毒其它蛋白質(zhì)(基因庫(kù)登錄號(hào) M19197 ；哈恩(Hahn)等人，1988，Virology 162 :167-180)、麻疹病毒血凝素(基因庫(kù)登錄號(hào)M81899 ；羅塔(Rota)等人，1992，病毒學(xué)，188 :135-14 、2型單純皰疹病毒糖蛋白gB (基因庫(kù)登錄號(hào)M14923 ；布扎可(Bzik)等人，1986，病毒學(xué)，155 :322-333)、脊髓灰質(zhì)炎病毒I VPl (艾米尼(Emini)等人，1983，自然(Nature) 304 :699)、HIV I的包膜糖蛋白(普特尼 (Putney)等人，1986，科學(xué)(Science) 234 :1392-1395)、乙型肝炎表面抗原(埃托(Itoh) 等人，1986，自然，308 19 ；紐拉斯(Neurath)等人，1986，疫苗(Vaccine) 4 :34)、白喉毒素 (奧迪波特(Audibert)等人，1981，自然，289 :543)、鏈球菌24M表位(比查雷(Beachey), 1985，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展(Adv. Exp. Med. Biol.) 185 :193)、淋球菌菌毛蛋白(gonococcal pilin)(羅斯巴德(Rothbard)和斯查林克(khoolnik)，1985，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展，185 247)、偽狂犬病毒g50 (gpD)、偽狂犬病毒II (gpB)、偽狂犬病毒gill (gpC)、偽狂犬病毒糖蛋白H、偽狂犬病毒糖蛋白E、傳染性胃腸炎糖蛋白195、傳染性胃腸炎基質(zhì)蛋白、豬輪狀病毒糖蛋白38、豬細(xì)小病毒衣殼蛋白、豬痢疾蛇形螺旋體(Serpulina hydodysenteriae)保護(hù)性抗原、牛病毒性腹瀉糖蛋白55、新城病(Newcastle disease)病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶、豬流感血凝素、豬流感神經(jīng)氨酸酶、足口病病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus)、豬月市炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、牛感染性鼻氣管炎病毒(例如牛感染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)或感染性喉氣管炎病毒(例如感染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白1)、拉克羅斯病毒(La Crosse virus) 的糖蛋白(格扎勒-斯卡諾(Gonzales-Scarano)等人，1982，病毒學(xué)，120 :42)、新生小牛腹瀉病毒(馬斯諾(Matsuno)和艾諾耶(Inouye)，1983，感染與免疫學(xué)(Infection and Immunity) 39 :155)、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎(Venezuelan equine encephalomyelitis)病毒(馬薩諾(Mathews)和羅瑞格(Roehrig)，1982，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 129 :2763)、 龐塔托魯病毒(punta toro virus)(戴姆普(Dalrymple)等人，1981，負(fù)鏈病毒的復(fù)制 (Replication of Negative Strand Viruses),畢肖普(Bishop)禾口康中白斯(Compans) (編輯)，紐約愛(ài)思唯爾出版社(Elsevier，N. Y.)，第167頁(yè))、鼠類(lèi)白血病病毒(史蒂文斯(Steeves)等人，1974，病毒學(xué)雜志(J. Virol). 14 :187)、小鼠乳腺腫瘤病毒(馬薩雷 (Massey)和斯奇特曼(Schochetman)，1981，病毒學(xué)，115 :20)、乙型肝炎病毒核心蛋白和/ 或乙型肝炎病毒表面抗原或者其片段或衍生物(例如參見(jiàn)英國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第GB 2034323A 號(hào)，1980年6月4日公開(kāi)；格蒙(Ganem)和凡瑪斯(Varmus)，1987，生物化學(xué)年評(píng)(Ann. Rev. Biochem. )56 :651-693 ；泰爾萊斯(Tiollais)等人，1985，自然，317 :489-495)、馬流感病毒或馬皰疹病毒抗原(例如A型馬流感病毒/安卡拉91神經(jīng)氨酸酶、A型馬流感病毒/邁阿密(Miami) 63神經(jīng)氨酸酶、A型馬流感病毒/肯塔基(Kentucky) 81神經(jīng)氨酸酶1型馬皰疹病毒糖蛋白B和1型馬皰疹病毒糖蛋白D、牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒抗原(例如牛呼吸道合胞病毒吸附蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸道合胞病毒核衣殼蛋白(BRSV N)、3型牛副流感病毒融合蛋白和3型牛副流感病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶)、牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48或糖蛋白53、RSV病毒蛋白(例如RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白)、流感病毒蛋白(例如流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素)、單純皰疹病毒糖蛋白，例如單純皰疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE，HIV(GP-120、pl7、GP-160、gag、 pol、qp41、gpl20、vif、tat、rev、nef、vpr、vpu、vpx 抗原)、流感病毒(NP、血凝素(HA 抗原)、神經(jīng)氨酸酶、PB1、PB2、PA、NP、]^、]\12、NS^NS2))、乳頭瘤病毒(El、E2、E3、E4、E5a、E5b、 E6、E7、E8、L1、L2)、腺病毒(E1A、E1B、E2、E3、E4、E5、Li、L2、L3、L4、L5)、HSV(核糖核酸還原酶、α -TIF、ICP4、ICP8、1CP35、LAT 相關(guān)蛋白、gB、gC、gD、gE、gH、gl、gj 和 dD 抗原)、人乳頭瘤病毒、馬腦炎病毒、肝炎病毒(乙型肝炎表面抗原(gp27S、gp36S、gp42S、p22e、pol、 x)) ο在一些實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性病毒，例如以下病毒的抗原腺病毒科(例如，哺乳動(dòng)物腺病毒和禽腺病毒)、皰疹病毒科(例如，單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、單純皰疹病毒5和單純皰疹病毒6)、光滑病毒科 (例如，光滑病毒、腸桿菌MS2期、allolevirus)、痘病毒科(例如，脊椎動(dòng)物痘病毒科 (chordopoxyirinae)、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、野兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣痘病毒和昆蟲(chóng)痘病毒科(entomopoxyirinae))、乳多空病毒科(papovaviridae)(例如，多瘤病毒和乳頭瘤病毒)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副粘液病毒、副流感病毒1、麻疹病毒屬(例如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒屬(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)、肺炎病毒亞科(pneumonovirinae)(例如，肺炎病毒、人呼吸道合胞病毒)、間質(zhì)肺炎病毒屬(例如，禽肺炎病毒和人間質(zhì)肺炎病毒)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)(例如，腸病毒屬、鼻病毒屬、肝病毒屬(例如，人甲型肝炎病毒)、心病毒屬和口蹄疫病毒屬)、呼腸孤病毒科(reoviridae)(例如，正呼腸孤病毒屬(orthoreovirus)、環(huán)狀病毒(orbivirus)、 輪狀病毒(rotavirus)、質(zhì)型多角體病毒屬(cypovirus)、斐濟(jì)病毒屬(f i jivirus)、植物呼腸孤病毒屬(phytoreovirus)和水稻病毒屬(oryzavirus))、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，哺乳動(dòng)物B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、哺乳動(dòng)物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽類(lèi)C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆轉(zhuǎn)錄病毒群、BLV-HTLV逆轉(zhuǎn)錄病毒)、慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)、 泡沫病毒屬(spumavirus)、黃病毒科(flaviviridae)(例如，丙型肝炎病毒)、嗜肝病毒科(h印adnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)、披蓋病毒科(togaviridae)(例如，甲病毒屬(alphavirus)(例如辛德畢斯病毒(sindbis virus))和風(fēng)疹病毒屬(例如風(fēng)疹病毒)、彈狀病毒科(rhabdoviridae)(例如，水泡病毒屬(vesiculovirus)、狂犬病病毒屬 (Iyssavirus)、暫時(shí)熱病毒屬(ephemerovirus)、質(zhì)型彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)禾口核型彈狀病毒屬(necleorhabdovirus))、沙粒病毒科(arenaviridae)(例如，沙粒病毒 (arenavirus)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、 ■病胃(Ippy virus)禾口 薩病_ (lassa virus))禾口冠(coronaviridae) ( M 如，冠狀病毒(coronavirus)禾口環(huán)曲病毒(torovirus))。在一些重要實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性病毒， 例如HIV、流感病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、狂犬病毒、漢坦病毒感染、西尼羅河病毒、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、艾普斯坦-巴爾二氏病毒、8型人皰疹病毒、α病毒或圣路易腦炎。在一些實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性細(xì)菌，例如炭疽菌(Anthrax)、披衣菌(Chlamydia)、分枝桿菌(Mycobacteria)、軍團(tuán)菌 (Legioniella)0病原性原蟲(chóng)包括(但不限于)瘧原蟲(chóng)、巴貝蟲(chóng)屬(Babesia)、血吸蟲(chóng)病 (Schistosomiasis)。病原性酵母包括例如曲霉和侵襲性念珠菌。
在一些重要實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性細(xì)菌， 例如結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、軍團(tuán)菌、 披衣菌、傷寒立克次體或梅毒螺旋體。在一些實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性真菌，包括 (但不限于)粗球孢子菌、皮炎芽生菌、隱球酵母菌、白色念珠菌和曲霉屬。在一些實(shí)施例中，抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位可來(lái)源于病原性原蟲(chóng)，例如惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)屬、錐蟲(chóng)屬(非洲和美洲)、 隱孢子蟲(chóng)、等孢球蟲(chóng)屬、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴蟲(chóng)屬、狒狒巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲(chóng)或卡氏肺孢子蟲(chóng)。在一些重要實(shí)施例中，感染性物質(zhì)的抗原或免疫原性蛋白質(zhì)片段或表位包括HIV feg、蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、全長(zhǎng)包膜蛋白、VpiuTat和Rev;流感病毒血凝素、核蛋白、基質(zhì)蛋白 1 (Ml)、非結(jié)構(gòu)蛋白I(NS-I)；病毒所有主要血清型共有的登革病毒交叉保護(hù)抗原(例如非結(jié)構(gòu)蛋白1或NS1、包膜結(jié)構(gòu)域III或EDIII)、甲型肝炎病毒衣殼蛋白1 (VP-I)；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)；丙型肝炎核心抗原、El、E2、p7、NS2、NS4和NS4 蛋白；HPVE1、E2、L1、L2;埃博拉病毒和馬爾堡病毒糖蛋白、核蛋白和基質(zhì)蛋白；狂犬病毒糖蛋白、漢坦病毒核蛋白、包膜糖蛋白和Gl蛋白；西尼羅河病毒前驅(qū)膜蛋白(prM)和包膜(E) 糖蛋白；SARS樣冠狀病毒0rf3、刺突蛋白、核衣殼蛋白和膜蛋白；單純皰疹病毒糖蛋白B和 D ；水痘-帶狀皰疹病毒包膜糖蛋白E和B(gE、gB)、立即早期蛋白63(ΙΕ6!3)；艾普斯坦-巴爾二氏病毒gp350、gpllO、核抗原1 (EBNA-I)、EBNA 2和EBNA-3C ；8型人皰疹病毒補(bǔ)體調(diào)控蛋白(KCP)、糖蛋白 B、0RF6、0RF61 和 0RF65)；結(jié)核桿菌抗原 85A、85B、MPT51、PPE44、分枝桿菌65kDa熱休克蛋白(DNA-hsp65)、6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT-6)；沙門(mén)氏菌SpaO 和Hla、外膜蛋白(OMP)；綠膿桿菌OMP、PcrV, OprF, OprI, PilA和突變ToxA ；炭疽桿菌保護(hù)性抗原(PA)、鼠疫耶爾森菌低鈣應(yīng)答蛋白V(LcrV)、Fl和Fl-V融合蛋白；軍團(tuán)菌肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)、mip、鞭毛蛋白、0mpS、hsp60、主要分泌蛋白(MSP)；披衣菌蛋白酶樣活性因子(CPAF)、主要外膜蛋白(MOMP)；梅毒螺旋體外膜脂蛋白；球孢子菌屬Ag2/Pral06、 ft~p2、磷脂酶(Plb)、α-甘露糖苷酶(Amnl)、天冬氨酸蛋白酶、Gell ；皮炎芽生菌表面粘附蛋白WI-I ；隱球酵母菌GXM和其肽模擬表位及甘露糖蛋白；白色念珠菌hsp90-CA、65kDa甘露糖蛋白(MP65)、分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)、Alslp-N、Als3p-N ；曲霉Asp f 16、Asp f 2、Der ρ 1和！^el d 1、rodlet A、PEP2、曲霉HSP90、90kDa過(guò)氧化氫酶；瘧原蟲(chóng)頂端膜抗原I(AMAl)、25kDa有性階段蛋白(Pfs25)、紅細(xì)胞膜蛋白1 (PfEMPl)環(huán)子孢子蛋白(CSP)、 裂殖子表面蛋白-I(MSPl)；利什曼原蟲(chóng)III型半胱氨酸蛋白酶(CPC)、核糖體蛋白(LRP)、 A2抗原、核小體組蛋白、HSP20、G46/M-2/PSA-2前鞭毛體表面蛋白、嬰兒利什曼原蟲(chóng)LACK 抗原、GP63、LmSTIU TSA、P4、NH36、papLe22 ；錐蟲(chóng) β -微管蛋白(STIB 806)、微管相關(guān)蛋白(MAP pl5)、半胱氨酸蛋白酶(CP)；隱孢子蟲(chóng)表面蛋白gpl5和gp40、Cp23抗原、p23 ；剛地弓形蟲(chóng)表面抗原1 (TgSAGl)、蛋白酶抑制劑-1 (TgPI-I)、表面相關(guān)蛋白MIC2、MIC3、R0P2、 GRA1-GRA7 ；卡氏肺孢子蟲(chóng)主要表面糖蛋白(MSG)、p55抗原、曼森氏血吸蟲(chóng)Sml4、21. 7和 SmFim 抗原、被膜蛋白 Sm29、26kDa GST、日本血吸蟲(chóng)、SjCTPI、SjC23、Sj22. 7 或 SjGST-32。在某些實(shí)施例中，如本文中所述投予的重組痘病毒包含抗原以引起個(gè)體的免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施例中，痘病毒可另外包含細(xì)胞因子或共刺激分子。細(xì)胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、IL-15 ；或共刺激分子，例如B7. 1、B7. 2，可用作佐劑。在某些實(shí)施例中，可通過(guò)將編碼細(xì)胞因子或共刺激分子的基因共插入重組痘載體或第二重組痘病毒(其與表達(dá)抗原的重組痘病毒混合)中，共投予這些分子。或者，可將細(xì)胞因子單獨(dú)全身投予宿主。在某些實(shí)施例中，編碼抗原片段的重組痘病毒另外經(jīng)修飾成包括免疫調(diào)節(jié)蛋白， 例如編碼T細(xì)胞共刺激分子和/或細(xì)胞因子的DNA，所述細(xì)胞因子例如為白細(xì)胞介素(IL) (例如IL-2、IL-4、IL-10、IL-12)、干擾素(IFN)(例如IFN- y )、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或輔助分子(例如ICAM-1)。基于本發(fā)明，所述多價(jià)載體(例如痘病毒載體) 的構(gòu)筑在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。在一些情況下，可能需要用多種載體共表達(dá)免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，諸如T細(xì)胞共刺激因子和抗原?？赡苄枰队鑼?shí)質(zhì)上純的(例如)免疫調(diào)節(jié)蛋白制劑以增強(qiáng)疫苗功效。在某些實(shí)施例中，插入痘病毒中的核酸包括共刺激分子、輔助分子，和/或編碼細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因子的基因。共刺激分子的實(shí)例包括(但不限于)B7-l、B7-2、ICAM-1、 CD40、CD40L、LFA-3、CD72、0X40L (含或不含 0X40)。細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括(但不限于)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子 (TNF α和TNF β )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF α和TGF β )、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I和IGF-II)、生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素1到15 (IL-1到IL-15)、干擾素α、β、 Y (IFN-aIFN-β和IFN-γ )、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3和4、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 紅細(xì)胞生成素、EGF樣絲裂原、TGF樣生長(zhǎng)因子、PDGF樣生長(zhǎng)因子、黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)因子、乳腺源性生長(zhǎng)因子1、前列腺生長(zhǎng)因子、軟骨源性生長(zhǎng)因子、軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨源性生長(zhǎng)因子、骨肉瘤源性生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)促生長(zhǎng)因子、初乳堿性生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤血管新生因子、造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞刺激因子2、B細(xì)胞分化因子、白血病源性生長(zhǎng)因子、髓單核細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞活化因子、紅系增能活性 (erythroid-potentiating activity)、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子、雪旺氏細(xì)胞Gchwarm cell)源性生長(zhǎng)因子、痘苗病毒生長(zhǎng)因子、家蠶素(bombyxin)、neu分化因子、v-Sis、神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子/乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、蛙皮素(bombesin)和蛙皮素樣肽、血管緊張素(angiotensin) II、內(nèi)皮素(endothelin)、心房利鈉因子(atrial natriuretic factor, ANF)和ANF樣肽、血管活性腸肽、RANTES、緩激肽 (Bradykinin)和相關(guān)生長(zhǎng)因子。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑或細(xì)胞因子為IL-1、IL-2、 IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-1、B7-2、B7-H3、LFA-3、B7-H3、CD40、CD40L、 ICOS 配體、0X-40L、4-1BBL、GM-CSF, SCF、FGF, Flt3 配體、CCR4、QS-7、QS-17、QS-21、CpG 寡核苷酸、ST-M6、AS-04、LT R192G突變體、莫坦奈德ISA 720、熱休克蛋白、合成分枝桿菌索狀因子(CAF01)、脂質(zhì)A模擬物、腸炎沙門(mén)菌血清型鼠傷寒沙門(mén)菌鞭毛蛋白(FliC)、莫坦奈德720、左旋咪唑(0^)、咪喹莫特、白喉毒素、11^321、六502六、六5018、六515-58、鋁膠、莫坦奈德13々、氫氧化鋁、]\^59、130)獻(xiàn)11 儀、]\1^^、]\0^和其它TLR-4配體、MDP和其它TLR-2配體、 AS02A、AS01B、不耐熱毒素 LTK63 和 LT-R192G。
在一些實(shí)施例中，提供表達(dá)抗原結(jié)構(gòu)域而非完整蛋白質(zhì)的核酸。舉例來(lái)說(shuō)，如果需要免疫反應(yīng)，那么只需編碼刺激免疫反應(yīng)必需的片段。本文中所述的共刺激分子、輔助分子和細(xì)胞因子可用作佐劑，其可通過(guò)將其編碼核酸插入相同或不同重組痘病毒載體中全身投予宿主。在一個(gè)實(shí)施例中，投予含有B7、LFA-3和ICAM-I的痘病毒載體與腫瘤相關(guān)抗原的組合。在另一實(shí)施例中，痘病毒還含有0X40L。可由痘病毒單獨(dú)投予的其它有用佐劑為例如RIBI Detox(Ribi免疫化學(xué)品公司(Ribi Immunochemical))、QS21 (安奎拉公司 (Aquila))、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund' s adjuvant)。在一些實(shí)施例中，提供的表達(dá)B7-1、ICAM-I和LFA-3的痘病毒(也稱(chēng)為T(mén)RIC0M) 可誘導(dǎo)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞活化。(美國(guó)專(zhuān)利第6，045，802號(hào)；霍吉(Hodge)等人，國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)雜志(J. Natl. Cancer Inst.) 92 1228-39 (2000)；霍吉等人，癌癥研究(Cancer Research) 59 :5800-07 (1999))。0X40是遭遇抗原的T細(xì)胞而非天然T細(xì)胞的主要共刺激分子，其在誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性后促進(jìn)T細(xì)胞擴(kuò)增。(巴薩-帕卡(Bansal-Pakal)等人，自然-醫(yī)學(xué)(Nature Med.) 7 :907-12 (2001))。0X40L在T細(xì)胞活化期間通過(guò)以下方式起作用a)持續(xù)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞長(zhǎng)期增殖；b)在不改變IL-4表達(dá)的情況下，使⑶4+和⑶8+T 細(xì)胞產(chǎn)生更多的Thl細(xì)胞因子，例如IL-2、IGN-Y和TNF-α ；c)保護(hù)T細(xì)胞免于凋亡。在某些實(shí)施例中，B7-1、ICAM-I、LFA-3和0X40L的組合可增強(qiáng)初始活化，隨后進(jìn)一步加強(qiáng)天然和效應(yīng)T細(xì)胞的持續(xù)活化。在一些實(shí)施例中，本文中所述的痘病毒在靶細(xì)胞中具有低復(fù)制效率。由于痘病毒具有低復(fù)制效率和非整合性細(xì)胞質(zhì)性質(zhì)，使得這一載體系統(tǒng)不能持續(xù)復(fù)制和感染其它細(xì)胞。因此，感染痘病毒的細(xì)胞不會(huì)不利地影響宿主中遠(yuǎn)離靶細(xì)胞位置的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，修飾型痘病毒還可具有改變的特征性病毒生活周期相關(guān)狀況， 例如靶細(xì)胞特異性、感染途徑、感染速率、復(fù)制速率、病毒粒子組裝速率和/或病毒擴(kuò)散速率。在一些實(shí)施例中，本文中所述的痘病毒能夠感染宿主中的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是受痘病毒感染的任何細(xì)胞，并且這些細(xì)胞能夠表達(dá)痘病毒基因組，包括其中插入的任何外來(lái)基因，例如編碼抗原的基因，達(dá)到足以引起針對(duì)所述抗原的宿主免疫應(yīng)答的程度。本文中所述的痘病毒可用于任何宿主。在一些實(shí)施例中，宿主是非哺乳動(dòng)物宿主， 諸如鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)等。在一些實(shí)施例中，宿主為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，諸如人類(lèi)和黑猩猩；家畜，諸如馬、奶牛、豬等；和寵物，諸如狗和貓，以及嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。可以利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法引入帶有欲傳遞到靶宿主細(xì)胞中的基因的病毒載體。大部分病毒疫苗，諸如減毒或重組病毒，都是由細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制造。用于產(chǎn)生病毒 /疫苗的細(xì)胞可以是細(xì)胞系，即，在體外以單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物形式在生物反應(yīng)器中或以單層形式在組織培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞支持表面上連續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。不僅是細(xì)胞系，原代動(dòng)物細(xì)胞也可用于制造疫苗。舉例來(lái)說(shuō)，脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(chordopoxvirinae)，尤其是MVA， 可在原代或次生雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增。這些細(xì)胞是從培育了 10到 12天的雞蛋胚胎中獲得。隨后分離這些胚胎細(xì)胞并純化。這些原代CEF細(xì)胞可以直接使用或在再經(jīng)歷細(xì)胞傳代后以次生CEF細(xì)胞形式使用。隨后，用MVA感染原代或次生CEF細(xì)胞。對(duì)于MVA的擴(kuò)增，將感染細(xì)胞在37°C培育2到3天。(例如參見(jiàn)梅耶爾H. (Meyer, H.)等人，1991 ；普通病毒學(xué)雜志(J. of General Virology) 72，1031-1038 ；薩特(Sutter)等人， 1994，疫苗(Vaccine), H 12卷，第11期，1032-1040)。由于許多制得的病毒疫苗都是通過(guò)在CEF細(xì)胞中連續(xù)傳代來(lái)降低有毒致病性病毒的毒力，故常常使用CEF細(xì)胞。優(yōu)選諸如MVA 等減毒病毒不是在人類(lèi)細(xì)胞上繁殖，因?yàn)闀?huì)擔(dān)心病毒可能在人類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞中變得具有復(fù)制能力?；謴?fù)了在人類(lèi)細(xì)胞中復(fù)制的能力的病毒如果投予人類(lèi)，尤其是免疫低下的個(gè)體，就會(huì)帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。為此，如果打算用于人類(lèi)，就需嚴(yán)格由CEF細(xì)胞制造一些減毒病毒，例如 MVA。此外，CEF細(xì)胞還用于只能在這些細(xì)胞中生長(zhǎng)的病毒，例如禽類(lèi)病毒，如禽痘病毒、金絲雀痘病毒、ALVAC、雞痘病毒和NYVAC。在某些實(shí)施例中，感染有重組病毒的宿主細(xì)胞，例如表皮的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞，將表達(dá)抗原，并且還可表達(dá)免疫刺激分子。在這些實(shí)施例中，可以在受感染宿主細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)抗原。免疫刺激分子可在細(xì)胞表面表達(dá)，或者可由宿主細(xì)胞主動(dòng)分泌?？乖兔庖叽碳し肿拥谋磉_(dá)可將必要的MHC限制性肽提供到特異性免疫監(jiān)視 (immim0SUrveilling)T細(xì)胞，并將適宜的信號(hào)提供到皮膚中的T細(xì)胞，以幫助抗原識(shí)別以及抗原特異性T細(xì)胞的增殖或克隆擴(kuò)增?？傮w結(jié)果可以是免疫系統(tǒng)的上調(diào)。在某些實(shí)施例中，免疫應(yīng)答上調(diào)是抗原特異性T輔助淋巴細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(包括例如Thl 或Th2CD4+T輔助細(xì)胞介導(dǎo)或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)增加，這些細(xì)胞能夠殺死致病物質(zhì) (諸如癌細(xì)胞)或感染有致病物質(zhì)的細(xì)胞(諸如感染有病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)的細(xì)胞)或抑制其生長(zhǎng)。在某些實(shí)施例中，免疫刺激還涉及抗體應(yīng)答，包含產(chǎn)生一種或一種以上抗體類(lèi)別，例如IgM、IgG和/或IgA。此項(xiàng)技術(shù)中已知測(cè)定免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，可檢查病毒損傷以確定針對(duì)病毒和/或抗原的免疫應(yīng)答的發(fā)生。在一些實(shí)施例中，可以使用體外分析法來(lái)確定免疫應(yīng)答的發(fā)生。所述體外分析法的實(shí)例包括ELISA分析法和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)分析法。在一些實(shí)施例中，通過(guò)檢測(cè)和/或定量抗體的相對(duì)量來(lái)測(cè)量免疫應(yīng)答，所述抗體特異性識(shí)別已經(jīng)通過(guò)投予包含抗原的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒治療的個(gè)體血清中的抗原，所述相對(duì)量是相對(duì)于未治療個(gè)體的抗體量而言。此項(xiàng)技術(shù)中已知用于分析樣品中的抗體和抗體濾紙(antibody filter)的技術(shù)， 并且其包括例如夾心分析法(sandwich assay)、ELISA和ELISpot法?？贵w包括抗體一部分、哺乳動(dòng)物化(例如人源化)抗體、重組或合成抗體和雜合體以及單鏈抗體。通過(guò)用免疫效應(yīng)子或其抗原片段免疫可獲得多克隆抗體和單克隆抗體，并且任一類(lèi)抗體都可用于免疫分析法中。此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知獲得兩類(lèi)血清的方法。通過(guò)對(duì)適合的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射有效量的免疫效應(yīng)子或其抗原部分，從所述動(dòng)物收集血清，并借助任何已知的免疫吸附技術(shù)分離特異性血清，可以相對(duì)容易地制備出多克隆血清。由這種方法制造的抗體可用于實(shí)際上任何類(lèi)型的免疫分析法中。優(yōu)選在免疫分析法中使用單克隆抗體，因?yàn)檫@種抗體能夠大量制造，而且產(chǎn)物具有均質(zhì)性。利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，可以通過(guò)將永生細(xì)胞系與針對(duì)免疫原制劑敏化的淋巴細(xì)胞融合制備出雜交瘤細(xì)胞系，以便制造單克隆抗體。在其它實(shí)施例中，可以使用ELISA分析法，使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的方法測(cè)定同型特異性抗體的含量。CTL分析法可用來(lái)測(cè)定CTL的溶解活性，從而測(cè)量表達(dá)某種抗原的靶細(xì)胞的特異性溶解。免疫分析法可用來(lái)測(cè)量樣品免疫細(xì)胞的活化(例如活化程度)。樣品免疫細(xì)胞是指來(lái)自包括人類(lèi)患者、人類(lèi)供體、動(dòng)物或組織培養(yǎng)的細(xì)胞系在內(nèi)任何來(lái)源的樣品中所含的免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞樣品可來(lái)源于外周血液、淋巴結(jié)、骨髓、胸腺、任何其它組織來(lái)源(包括原位或切除的腫瘤)，或來(lái)源于組織或器官培養(yǎng)物。在分析前，所述樣品可經(jīng)分離或純化以產(chǎn)生或富集特定免疫細(xì)胞亞群。免疫細(xì)胞可借助標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從其來(lái)源分開(kāi)和分離。免疫細(xì)胞包括非休止細(xì)胞和休止細(xì)胞，以及免疫系統(tǒng)中可進(jìn)行分析的細(xì)胞， 包括(但不限于)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、淋巴因子活化的殺傷 (lymphokine-activated killer, LAK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、朗格罕氏細(xì)胞(Langerhans cell)、干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞。可測(cè)量的免疫細(xì)胞活性包括(但不限于)(1)通過(guò)測(cè)量細(xì)胞或DNA復(fù)制測(cè)量的細(xì)胞增殖；(2)細(xì)胞因子產(chǎn)量增加，包括諸如Y IFN、GM-CSF或TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-10、 IL-12等細(xì)胞因子的比測(cè)量值；(3)細(xì)胞介導(dǎo)的靶殺死或溶解；(4)細(xì)胞分化；(5)免疫球蛋白產(chǎn)生；(6)表性變化；(7)產(chǎn)生趨化因子或趨化作用，這意味著能夠?qū)哂汹吇缘内吇刈鞒鰬?yīng)答；(8)免疫抑制，由此抑制某種其它免疫細(xì)胞類(lèi)型的活性；(9)趨化因子分泌，例如IP-10 ； (10)共刺激分子(例如⑶80、⑶86)和成熟分子(例如⑶83)的表達(dá)；(12) II 類(lèi)MHC表達(dá)上調(diào)；和(1 細(xì)胞凋亡，意思指活化的免疫細(xì)胞在某些情況下碎裂，指示異常活化。報(bào)告分子可用于所述許多免疫分析法中。報(bào)告分子是根據(jù)化學(xué)性質(zhì)提供可分析鑒別的信號(hào)從而允許檢測(cè)結(jié)合抗原的抗體的一類(lèi)分子。檢測(cè)可以是定性或定量檢測(cè)。在此類(lèi)分析中，最常用的報(bào)告分子是酶、熒光團(tuán)或含有放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。在酶免疫分析法的情況下，一般借助于戊二醛或高碘酸鹽，將酶與第二抗體結(jié)合。然而，易于認(rèn)識(shí)到，存在多種不同的結(jié)合技術(shù)，這些技術(shù)都易于為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所用。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。所選欲與特異性酶合用的底物一般在相應(yīng)的酶水解時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化。適合酶的實(shí)例包括堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。也可能使用發(fā)熒光的底物，由此得到熒光產(chǎn)物而非上文所述的顯色底物。在所有情況下，將標(biāo)記酶的抗體添加到第一抗體-抗原復(fù)合物中，使其結(jié)合，隨后洗掉過(guò)量的試劑。接著將含有適當(dāng)?shù)孜锏娜芤禾砑拥娇贵w-抗原-抗體復(fù)合物中。底物將與酶連接的第二抗體反應(yīng)，產(chǎn)生可見(jiàn)的定性信號(hào)，可進(jìn)一步定量(常用分光光度法定量)這一信號(hào)，指示樣品中存在的抗原量。或者，可在不改變結(jié)合能力的情況下，借助化學(xué)方式將熒光化合物(例如熒光素和羅丹明(rhodamine))與抗體偶合。當(dāng)用特定波長(zhǎng)的光照射活化時(shí)，標(biāo)記熒光染料的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，隨后放射具有可見(jiàn)的特征顏色的光，其可用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)。使標(biāo)記熒光的抗體結(jié)合于第一抗體-抗原復(fù)合物。洗掉未結(jié)合的試劑后，接著將剩余三元復(fù)合物暴露于適宜波長(zhǎng)的光，觀察到的熒光指示所關(guān)注抗原的存在。一些常見(jiàn)的免疫分析法的實(shí)例為細(xì)胞增殖分析法活化的免疫細(xì)胞增殖欲包括通過(guò)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞重量或通過(guò)并入放射性標(biāo)記的核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)或其它前體分子測(cè)量出的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂或細(xì)胞擴(kuò)增的增加。舉個(gè)例子，DNA復(fù)制是通過(guò)并入放射性同位素標(biāo)記測(cè)量。在一些實(shí)施例中，可通過(guò)用氚化胸苷(3H-Tdr)(—種并入新合成的DNA中的核苷前體)脈沖標(biāo)記培養(yǎng)物進(jìn)行DNA合成，來(lái)測(cè)量刺激的免疫細(xì)胞培養(yǎng)物。胸苷并入將提供對(duì)DNA合成速率的定量測(cè)量，其常常與細(xì)胞分裂速率成正比。通過(guò)在液體閃爍分光光度計(jì)中進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)，可測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)制DNA中并入的標(biāo)記咕的胸苷的量。閃爍計(jì)數(shù)得到的數(shù)據(jù)是每分鐘計(jì)數(shù) (counts per minute，cpm)，其隨后可用作免疫細(xì)胞反應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)量度。用預(yù)致敏免疫細(xì)胞的cpm減去或除以休止免疫細(xì)胞培養(yǎng)物的cpm，將得到刺激指數(shù)比。也可使用流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)用光散射、康特體積(Coulter volume)和熒光技術(shù) (都為此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的技術(shù))測(cè)量DNA，來(lái)測(cè)量增殖。細(xì)胞因子產(chǎn)生增多分析法免疫細(xì)胞刺激是細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、淋巴因子或其它生長(zhǎng)因子的能力的量度?？赏ㄟ^(guò)放射免疫分析法(RIA)、酶連接免疫吸附劑分析法 (ELISA)、生物分析法或測(cè)量信使RNA含量，測(cè)量細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括諸如、IFN、GM-CSF 或TNF-α等細(xì)胞因子的比測(cè)量值。一般說(shuō)來(lái)，對(duì)于這些免疫分析法，使單克隆抗體與欲測(cè)量的細(xì)胞因子特異性結(jié)合，并由此鑒別細(xì)胞因子。免疫分析法是此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的， 并且可包括競(jìng)爭(zhēng)性分析法，以及免疫測(cè)量分析法(immunometric assay)，諸如正向夾心免疫分析法(forward sandwich immunoassay)、反向夾心免疫分析法和同時(shí)免疫分析法 (simultaneous immunoassay)。在上述每一分析法中，將含樣品細(xì)胞因子與細(xì)胞因子特異性單克隆抗體在足以使細(xì)胞因子結(jié)合于單克隆抗體的條件下和時(shí)間內(nèi)培育。一般說(shuō)來(lái)，需要提供足以使細(xì)胞因子與抗體盡可能多地結(jié)合的培育條件，因?yàn)檫@樣將使信號(hào)達(dá)到最大。當(dāng)然，抗體的比濃度、培育溫度和時(shí)間，以及其它此類(lèi)分析條件，都可視各種因素而變化，包括樣品中細(xì)胞因子的濃度、樣品性質(zhì)等。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定每一測(cè)定的操作和最佳分析條件。細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解分析法免疫細(xì)胞活化程度的另一類(lèi)指標(biāo)是免疫細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解，其欲涵蓋任一類(lèi)型的細(xì)胞殺傷，包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡， 以及由被刺激至活躍的的非休止免疫細(xì)胞分泌的分子誘導(dǎo)的靶溶解。細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴溶解技術(shù)通常測(cè)量經(jīng)刺激的免疫細(xì)胞溶解標(biāo)記51Cr的靶細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性是測(cè)量為特異性靶細(xì)胞中釋放的51Cr的百分含量與對(duì)照靶細(xì)胞釋放的51Cr的百分含量的比值。還可通過(guò)計(jì)數(shù)靶細(xì)胞數(shù)量，或通過(guò)定量靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，來(lái)測(cè)量細(xì)胞殺傷。細(xì)胞分化分析法免疫細(xì)胞活性的另一指標(biāo)是免疫細(xì)胞分化和成熟。細(xì)胞分化可用數(shù)種不同的方法評(píng)估。一種此類(lèi)方法是測(cè)量細(xì)胞表型。可在使用將結(jié)合各種免疫細(xì)胞類(lèi)型特有的膜蛋白的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色后，借助流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估免疫細(xì)胞的表型和任何表型變化。另一種評(píng)估細(xì)胞分化的方式是測(cè)量細(xì)胞功能。這可用生物化學(xué)方式，通過(guò)測(cè)量酶、 mRNA、基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞分泌的其它代謝物進(jìn)行。也可使用生物分析法測(cè)量功能細(xì)胞分化。免疫細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞表面分子，其可用單克隆抗體或多克隆抗血清檢測(cè)。也可通過(guò)在經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的固定涂片中用直接免疫熒光法針對(duì)特征性細(xì)胞表面蛋白的存在進(jìn)行染色，來(lái)計(jì)算經(jīng)歷了分化或活化的免疫細(xì)胞數(shù)量。成熟B細(xì)胞可在免疫分析法中例如用細(xì)胞表面抗原(包括CD 19和CD20)測(cè)量，其中可以將經(jīng)熒光染料或者酶標(biāo)記的單克隆抗體用于這些抗原?？赏ㄟ^(guò)在培養(yǎng)細(xì)胞的固定涂片中用直接免疫熒光法針對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫球蛋白染色，來(lái)計(jì)算分化成漿細(xì)胞的B細(xì)胞數(shù)量。免疫球蛋白產(chǎn)生分析法B細(xì)胞活化會(huì)產(chǎn)生少量但可檢測(cè)的多克隆免疫球蛋白。 培養(yǎng)數(shù)天后，可利用放射免疫分析法或酶連接免疫吸附劑分析法(ELISA)測(cè)量這些免疫球蛋白。也可利用反向溶血空斑分析法(reversed hemolytic plaque assay)定量產(chǎn)生免疫球蛋白的B細(xì)胞。在此分析法中，用山羊或兔抗人免疫球蛋白涂覆紅細(xì)胞。將這些免疫球蛋白與活化的產(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞和半固體瓊脂混合，并添加補(bǔ)體。溶血空斑的存在指示存在產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞。趨化因子分析趨化因子是誘導(dǎo)或抑制免疫細(xì)胞遷移到或遷移出血管、組織或器官的分子，包括細(xì)胞遷移因子?？山柚魇郊?xì)胞術(shù)，使用針對(duì)趨化因子或待分析因子的經(jīng)標(biāo)記單克隆抗體分析免疫細(xì)胞的趨化因子。還可借助ELISA或其它免疫分析法、生物分析法、 信使RNA含量以及直接測(cè)量(諸如細(xì)胞計(jì)數(shù))專(zhuān)用遷移室中免疫細(xì)胞的移動(dòng)，來(lái)分析趨化因子。反加分析法(Addback Assay)當(dāng)添加到新鮮外周血單核細(xì)胞中時(shí)，自體離體活化的細(xì)胞展現(xiàn)增強(qiáng)的針對(duì)“回憶(recall) ”抗原的應(yīng)答，這一抗原是外周血單核細(xì)胞先前已經(jīng)暴露過(guò)的抗原。預(yù)致敏或刺激的免疫細(xì)胞當(dāng)與其它免疫細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使其它免疫細(xì)胞對(duì)“回憶”抗原的應(yīng)答增強(qiáng)。這些分析法稱(chēng)為“助手(helper)”或“反加”分析法。在此分析法中，將預(yù)致敏或刺激的免疫細(xì)胞添加到未處理的通常為自體的免疫細(xì)胞中，以測(cè)定未處理細(xì)胞的應(yīng)答。添加的預(yù)致敏細(xì)胞可經(jīng)照射以防止其增殖，從而簡(jiǎn)化未處理細(xì)胞活性的測(cè)量。這些分析特別適用于評(píng)估暴露于病毒的血液的細(xì)胞。如本文中所述，反加分析法可測(cè)量增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和靶細(xì)胞溶解。上述方法和其它測(cè)定免疫應(yīng)答的方法都是此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的。皮膚代表值得關(guān)注的傳遞抗原的靶位點(diǎn)，因?yàn)樵谶@一組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了高濃度抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)、APC前體和免疫細(xì)胞，由此產(chǎn)生增強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本文中所述的方法通過(guò)復(fù)制痘苗病毒自然感染角化細(xì)胞的過(guò)程(這一過(guò)程將提供針對(duì)痘苗基因的極強(qiáng)免疫應(yīng)答)，將類(lèi)似地增強(qiáng)個(gè)體對(duì)本文中提供的痘病毒所表達(dá)的異源抗原(例如其它病毒、細(xì)菌、真菌和癌癥抗原)的免疫性。由此產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可保護(hù)免疫個(gè)體，或者在個(gè)體已經(jīng)染上由抗原呈遞物質(zhì)所引起的疾病時(shí)，可幫助減輕或治療這種疾病。在一些實(shí)施例中，本文中所述的包含抗原的重組痘病毒可以組合物形式投予，所述組合物可進(jìn)一步包含一種或一種以上其它藥學(xué)上可接受的載劑，包括任何適合的稀釋劑或賦形劑。優(yōu)選所述藥學(xué)上可接受的載劑本身不會(huì)誘導(dǎo)生理應(yīng)答，例如免疫應(yīng)答。最優(yōu)選所述藥學(xué)上可接受的載劑不會(huì)產(chǎn)生任何不利或不想要的副作用，和/或不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度毒性。 藥學(xué)上可接受的載劑包括(但不限于)生理鹽水、緩沖的生理鹽水、右旋糖、水、甘油、無(wú)菌等滲水性緩沖液和其組合。藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑和賦形劑的其它實(shí)例提供于雷氏藥學(xué)大全(Itemington' s Pharmaceutical Sciences)(新澤西州默克出版公司(Mack Pub. Co.，N. J.)，最新版；都以全文引用的方式并入本文中)中。
優(yōu)選通過(guò)機(jī)械破壞表皮(例如借助皮膚劃痕法、擦傷、磨蝕或表面?zhèn)?投予修飾型痘病毒。此項(xiàng)技術(shù)中已知用于破壞皮膚和用于將某種物質(zhì)沉積到皮膚表皮中的方法和裝置。用于破壞皮膚的裝置的實(shí)例包括劃痕針、皮下注射針或磨蝕器。本發(fā)明的痘病毒和其組合物可以任何藥學(xué)上可接受的形式傳遞到皮膚表皮區(qū)室中。在一些實(shí)施例中，將痘病毒和其組合物施用于皮膚，隨后在皮膚和痘病毒上移動(dòng)或摩擦機(jī)械破壞表皮的裝置(例如磨蝕器)。在某些實(shí)施例中，可以使用劃痕針或皮下注射針破壞表皮。優(yōu)選使用最少量的磨蝕/機(jī)械破壞來(lái)產(chǎn)生所需結(jié)果。適于所選痘病毒和/或其組合物的磨蝕/機(jī)械破壞量的測(cè)定在此項(xiàng)技術(shù)的一般技能范圍內(nèi)。在另一實(shí)施例中，痘病毒和/ 或其組合物在施用前可以干燥形式施用于磨蝕裝置的磨蝕表面上。在本實(shí)施例中，將復(fù)原液體施用于皮膚的傳遞部位，并將涂有痘病毒(組合物)的磨蝕裝置施用于皮膚含復(fù)原液體的部位。隨后在皮膚上移動(dòng)或摩擦這一裝置，以致痘病毒(組合物)溶解于皮膚表面上的復(fù)原液體中，并與磨蝕同時(shí)傳遞?；蛘?，復(fù)原液體可包含在所述裝置(例如劃痕針、皮下注射針或磨蝕器)中，并且在將裝置施用于皮膚以機(jī)械破壞表皮時(shí)釋放，以溶解痘病毒(組合物)。某些痘病毒(組合物)也可以凝膠形式涂在裝置(例如磨蝕裝置)上。在一些實(shí)施例中，提供準(zhǔn)確靶向表皮間隙的裝置(例如劃痕針、皮下注射針或磨蝕器)。這些裝置可具有實(shí)心或中空的微凸起。這些微凸起的長(zhǎng)度可最多為約1500微米。 在一些實(shí)施例中，這些微凸起的長(zhǎng)度為約200到1500微米。在一些實(shí)施例中，微凸起的長(zhǎng)度為約300到1000微米，或在約400到800微米的范圍內(nèi)。可用于本文中所述的方法中的裝置(例如劃痕針、皮下注射針或磨蝕器)優(yōu)選為能夠破壞皮膚、穿透表皮但不穿透真皮的裝置。在一些實(shí)施例中，這種裝置穿透角質(zhì)層，但不穿透整個(gè)表皮。在某些實(shí)施例中，欲使用本文中所述的方法投予的痘病毒和組合物可在磨蝕之前、與磨蝕同時(shí)或在磨蝕之后施用于皮膚。在某些實(shí)施例中，提供用于將痘病毒和其組合物傳遞到個(gè)體表皮中的方法，其包含以下步驟用痘病毒和其組合物涂覆患者的外層皮膚或裝置(例如磨蝕器，或劃痕針，或皮下注射針)；和跨過(guò)個(gè)體的皮膚移動(dòng)裝置，以提供機(jī)械破壞，留下足以使痘病毒和其組合物進(jìn)入個(gè)體的活表皮(viable epidermis)的溝槽。為了實(shí)現(xiàn)所需的表皮機(jī)械破壞，所述裝置(例如磨蝕器，或劃痕針，或皮下注射針)應(yīng)跨過(guò)個(gè)體的皮膚移動(dòng)至少一次?？稍诮惶娣较蛏掀茐膫€(gè)體的皮膚。所述裝置使痘病毒和/或其組合物能夠更有效地吸收，由此允許將較少的痘病毒和其組合物施用于個(gè)體的皮膚或涂覆裝置。裝置表面可涂有需要傳遞到個(gè)體的痘病毒和/或其組合物。在一些實(shí)施例中，痘病毒和/或其組合物可以是安置在裝置磨蝕表面上的粉末。在某些實(shí)施例中，可以將欲傳遞的痘病毒和/或其組合物直接施用于個(gè)體的皮膚，然后在個(gè)體皮膚上施用和移動(dòng)裝置。在一些實(shí)施例中，裝置(例如劃痕針、皮下注射針或磨蝕器)和微凸起可由不與投予的物質(zhì)反應(yīng)的塑料材料制成。如此項(xiàng)技術(shù)中已知，適合的塑料材料包括例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。或者，微凸起可由如下材料制得金屬，諸如不銹鋼、鎢鋼、鎳合金、鉬、鉻、鈷、鈦及其合金；或其他材料，例如硅、陶瓷和玻璃聚合物。金屬微凸起可以使用類(lèi)似于光刻蝕刻硅晶片或使用金剛石鑲頭的磨機(jī)進(jìn)行顯微機(jī)械加工等此項(xiàng)技術(shù)中已知的各種技術(shù)制成。也可以使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)光刻蝕刻硅晶片來(lái)制造微凸起。還可以經(jīng)由注射模塑法(如例如美國(guó)申請(qǐng)案第10/193，317號(hào)中所述，其以引用的方式并入本文中)以塑料形式制造這些微凸起。微凸起的長(zhǎng)度和厚度是根據(jù)投予的特定物質(zhì)和在欲施用裝置的位置中表皮的厚度選擇。微凸起將穿透表皮，但不刺穿或穿過(guò)整個(gè)真皮。在一些實(shí)施例中，凸起實(shí)質(zhì)上穿透角質(zhì)層，但不刺穿或穿過(guò)整個(gè)表皮。在一些實(shí)施例中，用于在皮膚上準(zhǔn)備傳遞部位的方法包括在所需位置中與患者的皮膚相抵放置裝置(例如微磨蝕器、劃痕針或皮下注射針)。將裝置輕輕地壓在皮膚上，隨后在皮膚上移動(dòng)或跨過(guò)皮膚移動(dòng)。裝置每次移動(dòng)(stroke)的長(zhǎng)度可視由所需傳遞區(qū)域界定的所需傳遞部位尺寸而變化。所選傳遞部位的尺寸應(yīng)能實(shí)現(xiàn)預(yù)定結(jié)果，并且可視傳遞的物質(zhì)和物質(zhì)的形式而變化。在一些實(shí)施例中，裝置移動(dòng)約2到15厘米(cm)。在一些實(shí)施例中，移動(dòng)裝置，以產(chǎn)生機(jī)械破壞的表皮部位，其表面積為約4cm2到約300cm2。在某些實(shí)施例中，隨后將裝置從皮膚上提起，暴露出機(jī)械破壞的表皮區(qū)域，并將重組痘病毒和其組合物施用于機(jī)械破壞的表皮區(qū)域。在某些實(shí)施例中，可在機(jī)械破壞表皮之前或同時(shí)，將欲投予的痘病毒和/或其組合物施用于皮膚表面。機(jī)械破壞表皮的程度視在裝置(例如劃痕針、皮下注射針或磨蝕器)移動(dòng)期間施加的壓力和重復(fù)次數(shù)而定。在一些實(shí)施例中，在裝置第一次越過(guò)后，將其從皮膚上提起，并放回到與初始位置實(shí)質(zhì)上相同的地方和位置上。隨后在相同方向上再次移動(dòng)裝置相同的距離。在某些實(shí)施例中，在第一次越過(guò)后，于交替方向上反復(fù)移動(dòng)裝置跨過(guò)相同部位，同時(shí)不將裝置從皮膚上提起。一般說(shuō)來(lái)，裝置越過(guò)兩次或兩次以上。在一些實(shí)施例中，只在相同方向上，沿柵格狀圖案、環(huán)形圖案或某種其它圖案來(lái)回重?fù)粞b置，持續(xù)一段足以破壞表皮到達(dá)適宜深度的時(shí)間，由此增強(qiáng)痘病毒和/或其組合物的傳遞。此項(xiàng)技術(shù)中已知的借助機(jī)械破壞來(lái)破壞表皮的任何裝置都可用于本文中所述的方法中。這些裝置包括例如帶有短顯微針或微凸起陣列的微電子機(jī)械 (microelectromechanical, MEMS)裝置、砂紙樣裝置、刮刀、劃痕針、皮下注射針等。在一些實(shí)施例中，當(dāng)通過(guò)機(jī)械破壞表皮施用時(shí)，產(chǎn)生針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答而對(duì)個(gè)體投予的如本文中所論述構(gòu)筑的痘病毒的蝕斑形成單位(plaque forming unit，pfu)是常規(guī)注射途徑的約100倍到約100倍以下。在某些實(shí)施例中，當(dāng)通過(guò)機(jī)械破壞表皮施用時(shí)，產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答所投予的痘病毒的Pfu是常規(guī)注射途徑的約90倍、80倍、70 倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、5倍以下。在一些實(shí)施例中，需要單次沉積重組痘病毒以在個(gè)體體內(nèi)引起長(zhǎng)期、有效的抗原特異性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，本文中提供的痘病毒和/或其組合物也可按劑量時(shí)程投予，例如最初投予痘病毒和/或其組合物，隨后進(jìn)行加強(qiáng)投藥。在特定實(shí)施例中，在最初投藥后2 周到1年，優(yōu)選1個(gè)月到6個(gè)月的任何時(shí)間投予第二劑痘病毒和/或其組合物。此外，在第二劑后，在距最初投藥后3個(gè)月到2年或甚至更長(zhǎng)，優(yōu)選4到6個(gè)月或6個(gè)月到1年，可投予第三劑。投予的加強(qiáng)型抗原可使用相同痘病毒，或完整蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的免疫原性肽部分、 另一重組病毒載體或編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA。在一些實(shí)施例中，使用不同的痘病毒。舉例來(lái)說(shuō)，在痘苗后可使用禽痘，例如雞痘，或反之亦然。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，不需要加強(qiáng)免疫。
本發(fā)明還涵蓋使用試劑盒。在本發(fā)明一方面中，提供一種藥包或試劑盒，其包含痘病毒和/或其組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，提供的試劑盒包含一個(gè)或一個(gè)以上容器，其填裝有以下一種或一種以上組分包含抗原并任選包含呈干燥形式(例如凍干的)、鹽或溶液形式的共刺激分子的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒；任選使用的呈干燥形式 (例如凍干的)、鹽或溶液形式的包含共刺激分子的第二病毒；任選使用的溶解或混合病毒的溶液或凝膠；以及任選使用的佐劑。在一些實(shí)施例中，試劑盒另外含有用于破壞表皮的裝置。所述試劑盒可附有管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的有關(guān)如何使用試劑盒的說(shuō)明書(shū)和任選存在的通知，所述通知將反映生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)其用于人類(lèi)投藥。本發(fā)明還涵蓋疾病治療方法。所述方法涉及刺激個(gè)體的針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。所述方法包含對(duì)有需要的個(gè)體投予足以刺激個(gè)體的免疫應(yīng)答的量的包含抗原的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒，其中所述痘病毒是投予個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮，且其中刺激所述免疫應(yīng)答將治療個(gè)體的由抗原引起的疾病。在一些實(shí)施例中，在投予包含抗原的痘病毒之前，已經(jīng)用抗原激發(fā)個(gè)體。在一些實(shí)施例中，提供一種保護(hù)有受抗原激發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)或有染上由抗原引起的疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法。所述方法包含刺激個(gè)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，其包含對(duì)有需要的個(gè)體投予足以刺激免疫應(yīng)答的量的包含抗原的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒， 其中所述痘病毒是投予機(jī)械破壞的皮膚，其中刺激所述免疫應(yīng)答將對(duì)個(gè)體提供針對(duì)由抗原引起的疾病的保護(hù)。在一些實(shí)施例中，在投予包含抗原的痘病毒之前，尚未用抗原激發(fā)個(gè)體。本文中使用的“治療”疾病是指改善患有這種疾病的個(gè)體的狀況。這可包括部分或完全改善。在癌癥的情況下，“治療”癌癥是指完全或部分抑制癌癥或腫瘤細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移，以及抑制癌癥或腫瘤細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移的任何程度的增加。治療可引起腫瘤的停滯、部分或完全減輕，或者可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。在感染性疾病的情況下，“治療”感染性疾病是指完全或部分降低個(gè)體體內(nèi)感染物質(zhì)的載量。所述載量可為病毒載量，并且降低病毒載量是指例如與未治療個(gè)體相比較，感染病毒的細(xì)胞的數(shù)量減少、病毒復(fù)制速率降低、所產(chǎn)生的新病毒粒子的數(shù)量減少、細(xì)胞中總病毒基因組拷貝的數(shù)量減少。所述載量可以是細(xì)菌、酵母、真菌、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)或寄生蟲(chóng)載量，并且降低所述載量是指例如與未治療的個(gè)體相比較，宿主中細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、酵母或寄生蟲(chóng)的數(shù)量減少；群體生長(zhǎng)速率降低；在個(gè)體體內(nèi)的擴(kuò)散減少；由細(xì)菌、酵母、真菌、原蟲(chóng)、 蠕蟲(chóng)或寄生蟲(chóng)產(chǎn)生的有毒產(chǎn)物的量減少。本文中提到的“保護(hù)”個(gè)體免于染上疾病或免于變得易受感染是指部分或完全保護(hù)個(gè)體。本文中使用的“完全保護(hù)”是指，經(jīng)過(guò)治療的個(gè)體可能不會(huì)染上由例如病毒、細(xì)菌、 真菌、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)等物質(zhì)所引起或由癌細(xì)胞所引起的疾病或感染。本文中使用的 “部分保護(hù)”是指，某一小組個(gè)體在治療后可能受到完全保護(hù)，而不會(huì)染上疾病或感染，或者個(gè)體染上疾病或感染的嚴(yán)重程度可能與未治療個(gè)體不同。本文中提供治療和/或預(yù)防個(gè)體(優(yōu)選人類(lèi))感染(或感染性疾病)的方法。這些方法包含對(duì)個(gè)體被機(jī)械破壞的表皮投予包含抗原的重組痘病毒和/或其組合物?？捎眠@些方法治療或預(yù)防的感染或感染性疾病是由感染性物質(zhì)引起，包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)和寄生蟲(chóng)?？梢允褂帽疚闹兴龇椒ㄖ委熁虮疚闹兴龅姆椒▽⑻峁┓雷o(hù)的病毒的實(shí)例包括(但不限于)HIV、流感病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、狂犬病毒、漢坦病毒感染、西尼羅河病毒、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒(HSV1和HSM)、水痘-帶狀皰疹病毒、艾普斯坦-巴爾二氏病毒、8 型人皰疹病毒、α病毒、圣路易腦炎?？捎帽疚闹兴龅姆椒ㄖ委熁虮疚闹兴龅姆椒▽⑻峁┍Ｗo(hù)的其它病毒包括 (但不限于)腸病毒(包括(但不限于)小核糖核酸病毒科病毒，諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、埃可病毒(echo virus))、輪狀病毒、腺病毒，和肝炎病毒，例如甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒。在人體中發(fā)現(xiàn)的病毒的具體實(shí)例包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也稱(chēng)為HTLV-III、LAV或HTLV-III/ LAV或HIV-III ；和其它分離株，例如HIV-LP ；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、 甲型肝炎病毒；腸病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒屬、?？刹《?；杯狀病毒科(例如，引起胃腸炎的病毒株)；披蓋病毒科(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(例如，腦炎病毒、黃熱病病毒)；冠狀病毒科(例如，冠狀病毒)；彈狀病毒科(例如，水皰性口炎病毒、狂犬病毒)；絲狀病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘液病毒科(例如，副流感病毒、 腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)(例如，布尼亞病毒、白齡病毒(phleboviruses)和內(nèi)羅畢病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如，呼腸孤病毒、 環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(Parvoviridae)(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；巨細(xì)胞病毒(CMV)；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、 痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬瘟病毒)；和其它病毒，急性喉氣管支氣管炎病毒、α病毒、卡波西氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)相關(guān)皰疹病毒、新城病病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、諾瓦克病毒(Norwalk virus)、乳頭瘤病毒、副流感病毒和禽流感病可以使用本文中所述的痘病毒和方法治療或預(yù)防的細(xì)菌感染或疾病是由以下細(xì)菌引起，包括(但不限于)結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、軍團(tuán)菌、披衣菌、傷寒立克次體和梅毒螺旋體?？梢允褂帽疚闹兴龇椒ㄖ委熁虮疚闹兴龅姆椒▽⑻峁┓雷o(hù)的其它細(xì)菌包括(但不限于)巴斯德氏菌屬(Pasteurella species)、葡萄球菌屬Staphylococci species)禾口鏈球菌屬(Streptococcus species)。革蘭氏陰性(Gram negative)細(xì)菌包括 (但不限于)大腸桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas species)和沙門(mén)氏菌屬。感染性細(xì)菌的具體實(shí)例包括(但不限于)幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pyloris)、 伯氏疏螺旋菌(Borelia burgdorferi)、分枝桿菌屬(Mycobacteria sp.)(例如鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、戈登分枝桿菌(M. gordonae))、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrheae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、產(chǎn)月農(nóng)鏈球菌(Streptococcus pyogene) (Α 方矣鏈球菌)、無(wú)乳鏈球菌(Sti^ptococcus agalactiae) (B族鏈球菌)、鏈球菌屬(草綠色族 (viridans group))、獎(jiǎng)鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌屬(厭氧種)、肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)、病原性彎曲桿菌屬(pathogenic Campylobacter sp·)、腸球菌屬(Enterococcus sp·)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、白喉?xiàng)U菌(corynebacterium diphtheriae)、棒狀桿菌屬(corynebacterium sp·)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣英膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)、月市炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺性巴氏桿菌 (Pasturella multocida)、擬桿菌屬(Bacteroides sp·)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈木干菌(Streptobaci 1 Ius moniliformis)、細(xì)弱密電累方寵菌(Treponema pertenue)、鉤端螺方寵菌(Leptospira)以及伊氏方文線菌(Actinomyces israelii)。可以使用本文中所述的痘病毒和方法治療或預(yù)防的真菌疾病包括(但不限于)粗球孢子菌、皮炎芽生菌、隱球酵母菌、白色念珠菌、曲霉屬疾病?？梢允褂帽疚闹兴龇椒ㄖ委熁虮疚闹兴龅姆椒▽⑻峁┓雷o(hù)的其它真菌包括(但不限于)莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌和砂眼披衣菌 (Chlamydia trachomatis)0可以使用本文中所述的痘病毒和方法治療或預(yù)防的原蟲(chóng)疾病或感染包括(但不限于)瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng))、利什曼原蟲(chóng)屬、錐蟲(chóng)屬(非洲和美洲)、隱孢子蟲(chóng)、等孢球蟲(chóng)屬、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴蟲(chóng)屬、狒狒巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲(chóng)和卡氏肺孢子蟲(chóng)疾病?？梢允褂帽疚闹兴龅亩徊《竞头椒ㄖ委熁蝾A(yù)防的癌癥或腫瘤包括(但不限于) 黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳癌、前列腺腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、上皮源性卵巢癌、結(jié)直腸腺癌和平滑肌肉瘤、胃腺癌和平滑肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、腎細(xì)胞癌、腎和膀胱的移行細(xì)胞癌、 膀胱鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、腦癌(星狀細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。治療或預(yù)防本文中所述的疾病的方法包含投予其它藥劑。因此，在一些實(shí)施例中， 治療或預(yù)防本文中所述的癌癥的方法可與一種或一種以上抗癌劑組合使用?？捎糜诟鞣N實(shí)施例(包括本文中所述的藥物組合物和劑型，以及試劑盒)中的抗癌藥物的實(shí)例包括(但不限于)阿西維辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；鹽酸阿考達(dá)唑(acodazole hydrochloride)；阿克羅寧(acronine)；阿多來(lái)新(adozelesin)；阿地白介素 (aldesleukin)；六甲密胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；乙酸阿美蒽醌 (ametantrone acetate)；氨魯米特(aminoglutethimide)；安口丫唆(amsacrine)；阿那曲唑 (anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酉先胺酶(asparaginase)；曲林菌素 (asperlin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azet印a)；阿佐霉素(azotomycin)；巴馬司他(batimastat)；苯佐替派(benzodepa)；比卡魯胺(bicalutamide)；鹽酸比生群 (bisantrene hydrochloride) ；二甲石黃酸雙奈法德(bisnafide dimesylate)；比折來(lái)新 (bizelesin) 酸博來(lái)霄素(bleomycin sulfate)；布喧JB內(nèi)(brequinar sodium)；漠匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放線菌素 C (cactinomycin)；卡普睪酮 (calusterone)；卡普他濱(capsitabine)；卡醋胺(caracemide)；卡貝替姆(carbetimer)； 卡怕(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；鹽酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折來(lái)新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥 (chlorambucil)；西羅霉素(cirolemycin)；順鉬(cisplatin)；克拉屈濱(cladribine)； 甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷 (cytarabine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；更生霉素(dactinomycin)；鹽酸道諾霉素 (daunorubicin hydrochloride)；地西他？賓(decitabine)；右?jiàn)W馬 白(dexormaplatin) ；i也扎胍寧(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍寧；地吖醌(diaziquone)；多烯紫杉醇(docetaxel)； 多柔比星(doxorubicin)；鹽酸多柔比星；屈洛昔芬(droloxifene)；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)；達(dá)佐霉素(duazomycin)；依達(dá)曲沙 (edatrexate)；鹽酸依氟鳥(niǎo)氨酸(eflornithine hydrochloride)；依沙聲星 (elsamitrucin)；恩洛鉬(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶 (epipropidine)；鹽酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)； 鹽酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷；埃托寧(etoprine)； 鹽酸法倔唑(fadrozole hydrochloride)；法扎拉濱(fazarabine)；芬維 A 胺 (fenretinide) ；Mi^if (floxuridine) ； 舞酸氣達(dá)拉濱(fludarabine phosphate)；氣尿P密啶(fluorouracil)；氟西他濱(f lurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星鈉 (fostriecin sodium)；吉西他賓(gemcitabine)；鹽酸吉西他賓；輕基脲(hydroxyurea)； 鹽酸伊達(dá)比星(idarubicin hydrochloride)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；伊莫福新 (ilmofosine)；白細(xì)胞介素II (包括重組白細(xì)胞介素II或rIL2)、干擾素α-2a ；干擾素 α -2b ；干擾素α -nl ；干擾素α -η3 ；干擾素β -I a ；干擾γ-I b ；異丙鉬(iproplatin)； 鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；乙酸蘭瑞肽(lanreotide acetate)；雷曲唑 (Ietrozole) ； Δ M ^ V^ ^L ^M (leuprolide acetate) ； ife 禾O(píng) M P坐(liarozole hydrochloride)；洛美曲索鈉(lometrexol sodium)；洛莫司汀(Iomustine)；鹽酸洛索蒽酉昆(losoxantrone hydrochloride)；馬索羅 ) (masoprocol)；美登素(maytansine)；氣芥 (mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、鹽酸硫胺素(rethamine hydrochloride)；乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；乙酸美倉(cāng)孕酮 (melengestrol acetate)；美法倉(cāng)(melphalan)；美諾立爾(menogaril)；巰基口票呤 (mercaptopurine)；甲氨噪呤(methotrexate)；甲氨噪呤鈉；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托卡西(mitocarcin)；米托羅米 (mitocromin)；米托潔林(mitogillin)；米托馬星(mitomalcin)；絲裂霉素(mitomycin)； 米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酷酸(mycophenolic acid)；諾考達(dá)唑(nocodazole)；諾拉霉素 (nogalamycin)；奧馬怕(ormaplatin)；奧昔舒?zhèn)}(oxisuran)；紫杉醇(paclitaxel)；培門(mén)冬酶(pegaspargase)；培利霉素(peliomycin)；奈莫司汀(pentamustine)；硫酸培洛霉素 (P印lomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡 (piposulfan)；鹽酸口比羅惠酉昆(piroxantrone hydrochloride)；普卡霄素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆鈉(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；潑尼莫司 Π" (prednimustine)；鹽酸丙卡巴月井(procarbazine hydrochloride) ；口票吟霄素 (puromycin)；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprine)；羅谷亞胺(rogletimide)；沙芬戈(safingol)；鹽酸沙芬戈；司莫司汀(semustine)；辛曲秦 (simtrazene)；司泊索非鈉(sparfosate sodium)；司帕霉素(sparsomycin)；鹽酸鍺螺胺 (spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺鉬(spiroplatin)；鏈黑霉素(streptonigrin)；鏈佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他禾丨J 霉素 (talisomycin)；替康蘭納(tecogalan sodium)；替力口氣(tegafur)；鹽酸替洛惠酉昆 (teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊昔(teniposide)；替羅昔隆(teroxirone)；睪內(nèi)酯(testolactone)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鳥(niǎo)嘌呤 (thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)； 檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)；乙酸曲托龍(trestolone acetate)；磷酸曲西立濱(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖酸酸三甲曲沙 (trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；鹽酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；烏拉莫司 t丁 (uracil mustard)；烏 卷替派(uredepa)；伐普月太 (vapreotide)；維替泊芬(verteporfin)；硫l酸長(zhǎng)春花喊(vinblastine sulfate) ；it酸長(zhǎng)春新堿(vincristine sulfate)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；硫酸長(zhǎng)春地辛；硫酸長(zhǎng)春匹定 (vinepidine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸長(zhǎng)春羅新 (vinleurosine sulfate)；酒石酸長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine tartrate)；硫酸長(zhǎng)春羅定 (vinrosidine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；折尼怕(zeniplatin)；凈司他丁(zinostatin)；鹽酸左柔比星(zorubicin hydrochloride) > 英丙舒凡(improsulfan)、苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、三乙烯胺三嗪 (triethylenemelamrine)、三亞乙基憐酉先胺(triethylenephosphoramide)、三亞乙基硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)、三輕甲基蜜胺(trimethyIoIomelainine)、氯法嗪(chlomaphazine)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、曲磷胺 (trofosfamide)、雌莫司汀(estermustine)、氯服霉素(chlorozotocin)、健擇(gemzar)、 尼莫司汀(nimustine)、雷諾莫司汀(ranimustine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、甘露莫司汀 (mannomustine)、二溴甘露酉享(mitobronitol)、阿克拉霉素(aclacinomycins)、放線菌素 F(I) (actinomycin F(I))、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素、卡柔比星、嗜癌菌素 (carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、道諾霉素、道諾霉素、6-重氮基_5_氧代-1-正亮氨酸、多柔比星、橄欖霉素(olivomycin)、光神霉素(plicamyciri)、泊非霉素 (porfiromycin)、嘌呤霉素、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、左柔比星、二甲葉酸(denopterin)、 蝶羅呤(pteropterin)、6_巰基嘌呤、安西他濱(ancitabine)、6_氮雜鳥(niǎo)苷、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、依諾他濱(enocitabine)、帕莫澤米(pulmozyme)、醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)、醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、貝曲布昔(bestrabucil)、德福法胺(defofamide)、秋水仙胺(demecolcine)、 依氟鳥(niǎo)氨酸(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、依托格魯(etoglucid)、 氟他胺(f lutamide)、羥基脲、香菇多糖(Ientinan)、蛋氨氮芥(phenamet)、鬼臼酸 (podophyllinic acid)、2_ 乙基酰胼、雷佐生(razoxane)、鍺螺胺、他莫昔芬(tamoxifen)、克癌易(taxotere)、細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三亞氨醌(triaziquone)、2， 2 ‘，2 〃 -三氯三乙胺、烏拉坦(urethan)、長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、長(zhǎng)春新堿 (vincristine)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)和相關(guān)藥劑。20-表-1，25 二羥基維生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍(abiraterone)；阿柔比星；酰基富烯(acylfulvene)；阿的培諾 (adecypenol)；阿多來(lái)新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin) ；ALL-TK 拮抗劑；六甲密胺；胺莫司汀(ambamustine)；阿米度(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基酮戊酸 (aminolevulinic acid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)；血管新生抑制劑；拮抗劑D ；拮抗劑G ；安他利 (antarelix)；抗背部化形態(tài)發(fā)生蛋白-1 (anti-dorsalizing morphogenetic protein-l)； 抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗新普拉通(antineoplaston)；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)；細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)劑；細(xì)胞凋亡調(diào)控劑；無(wú)嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA ；精氨酸脫氨酶；奧沙那寧(asulacrine)；阿他美坦(atamestane)； 阿莫司汀(atrimustine)；阿新司坦汀1 (axinastatin 1)；阿新司坦汀2 ；阿新司坦汀3 ；阿扎司瓊(azasetron)；阿扎托新(azatoxin)；氮雜酪氨酸；漿果赤霉素III (kiccatin III) 衍生物；班蘭諾(balanol)；巴馬司他(l^timastat) ；BCR/ABL拮抗劑；苯并二氫卟吩 (benzochlorins)；苯甲?；切捂呔?benzoylstaurosporine) ； β內(nèi)酯衍生物；β-阿立辛(beta-alethine) ； β 可來(lái)霉素 B (betaclamycin B)；樺木酸(betulinic acid) ；bFGF 抑制劑；比卡魯胺(bicalutamide)；比生群；雙氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)； 雙奈法德；比曲亭A (bistratene A)；比折來(lái)新；比銳來(lái)特(bref late)；溴匹立明 (bropirimine)；布度鈦(budotitane) ；丁硫氨酸亞砜亞胺(buthionine sulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；鈣磷酸蛋白C(calph0Stin C)；喜樹(shù)堿衍生物 (camptothecinderivatives)；金絲雀痘 IL-2 ；卡培他濱(capecitabine)；(羧酰胺-氨基-三唑；羧酰胺基三唑；CaRest M3 ；CARN 700 ；軟骨源性抑制劑；卡折來(lái)新；酪蛋白激酶 Φ IfjiJ 齊[J (casein kinase inhibitors, I COS)；胃精月安(castanospermine)；天 Jl 素 B(cecropin B)；西曲瑞克(cetrorelix) ；二氫卟酚(chlorlns)；氯代喹喔啉磺酰胺 (chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素(cicaprost)；順口卜啉；克拉屈濱；氯米芬 (clomifene)類(lèi)似物；克霉唑(clotrimazole)；柯林斯霉素A(collismycin A)；柯林斯霉素B ；康柏斯達(dá)汀A4(combretastatin A4)；康柏斯達(dá)汀類(lèi)似物；康納京尼(conagenin)；卡貝克汀 816(crambescidin 816)；克立那托(crisnatol)；自念珠藻環(huán)肽 8 (cryptophycin 8)；自念珠藻環(huán)肽A衍生物；卡拉新A(cUracin A)；環(huán)戊基蒽醌 (cyclopentanthraquinones)；環(huán)中白坦(cycloplatam)；塞普霄素(cypemycin)；阿糖胞昔十八烷基磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)；細(xì)胞溶解因子；細(xì)胞抑素(cytostatin)；達(dá)昔單抗(dacliximab)；地西他濱；去氫膜海鞘素B (dehydrodidemnin B)；地洛瑞林 (deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；右異環(huán)磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生 (dexrazoxane)；右維拉中白米(dexverapamil)；地口丫酉昆(diaziquone)；膜海銷(xiāo)素B(didemnin B)；地多斯(didox) ；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine) ；二氫_5_氮雜胞苷；9-二氫紫杉酚；地奧霉素(dioxamycin) ；二苯基螺莫司汀(diphenyl spiromustine)；多烯紫杉醇 (docetaxel)；多可沙諾(docosanol)；多拉司瓊(dolasetron)；去氧氟尿苷 (doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；度卡霉素A(duocarmycin SA)；依布硒(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)、依地福新 (edelfosine)；依決洛單抗(edrecolomab)；依氟鳥(niǎo)氨酸；欖香烯(elemene)；乙嘧替氟 (emitefur)；表柔比星；依立雄胺(印risteride)；雌莫司汀類(lèi)似物；雌激素激動(dòng)劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦(exemestane)；法倔唑(fadrozole)；法扎拉濱(fazarabine)；芬維A胺；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；黃皮利多(flavopiridol)；夫來(lái)折司汀(flezelastine)；夫斯特隆(fluasterone)；氟達(dá)拉濱；鹽酸氟多諾辛(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克(forfenimex)；福美坦 (formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；德口卜啉軋(gadolinium texaphyrin)；硝酸鎵(gallium nitrate)；加洛他濱(galocitabine)；加尼瑞克 (ganirelix)；明膠酶抑制劑(gelatinase inhibitors)；吉西他賓；谷胱甘肽抑制劑；海普舒凡 O^psulfam)；調(diào)蛋白(heregulin)；六亞甲基乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)；金絲桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊達(dá)比星 (idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊決孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)； 伊洛馬司他(ilomastat)；咪唑并吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體抑制劑；干擾素激動(dòng)劑；干擾素；白細(xì)胞介素；碘芐胍 (iobenguane)；碘多柔比星(iododoxorubicin) ；4-甘薯苦醇(ipomeanol，4_)；伊羅普拉 (iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；異苯格唑(isobengazole)；異高軟海綿素 B(isohomohalicondrin B)；伊他司瓊(itasetron)；力口中白金萊德(jasplakinolide)；海括蝓素 F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N(lamellarin-N triacetate)；蘭瑞肽 (Ianreotide)；雷拉霉素(Ieinamycin)；來(lái)格司亭(Ienograstim)；硫酸香菇多糖 (lentinan sulfate)；利普他汀(Ieptolstatin)；雷曲唑；白血病抑制劑因子；白細(xì)胞α 干擾素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑；線性多胺類(lèi)似物；親脂性二糖肽；親脂性鉬化合物；利索林胺7(liSS0Clinamide 7)； 洛鉬(Iobaplatin)；蚯蚓磷脂(Iombricine)；洛美曲索(Iometrexol)；氯尼達(dá)明 (Ionidamine)；洛索蒽醌；洛伐他汀(lovastatin)；洛索立賓(loxoribine)；勒托替康 (Iurtotecan)；德卟啉镥(lutetium texaphyrin)；利索茶堿(Iysofylline)；溶解肽；美坦新(maitansine)；制甘糖酶素A (mannostatin A)；馬立馬斯他(marimastat)；馬索羅酚 (masoprocol)；乳腺絲抑蛋白(maspin)；基質(zhì)溶素抑制劑(matrilysin inhibitors)；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾(menogaril)；麥爾巴隆(merbarone)；美替瑞林 (meterelin)；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺(metoclopraminde) ；MIF 抑制劑; 米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；尼莫斯替(nirimostim)；錯(cuò)配雙鏈 RNA;米托胍腙(mitoguazone) ；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；絲裂霉素類(lèi)似物(mitomycin analogues)；米托萘胺(mitonafide)；魚(yú)尾素纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-肥皂草毒素 (mitotoxin fibroblast growth factor-saporin)；米托惠酉昆；莫法羅汀(mofarotene)； 莫拉司亭(molgramostim)；單克隆抗體，絨毛膜促性腺激素)；單磷酰酯A+分枝桿菌細(xì)胞壁sk ；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；多藥耐藥性基因抑制劑；基于多腫瘤抑制蛋白1的療法；氮芥抗癌劑；印度洋海綿BOiiycaperoxide B)；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；米拉普酮 (myriaporone) ；N-乙?；啬橇?N-acetyldinaline) ；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林 (nafarelin)；那瑞斯普(nagrestip)；納洛麗(naloxone) + 噴他佐辛(pentazocine)；納中白維(napavin)；蔡蔽二酉享(naphterpin)；那托司亭(nartograstim)；奈達(dá)怕(nedaplatin)； 奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；中性內(nèi)肽酶；尼魯胺 (nilutamide)；尼薩霉素(nisamycin)；一氧化氮調(diào)節(jié)劑(nitric oxide modulator)；硝基氧抗氧化劑尼托林(nitrullyn) ；06-苯甲基鳥(niǎo)嘌呤；奧曲肽(octreotide)；奧克昔酮 (okicenone)；寡核苷酸；奧那司酮(onapristone)；昂丹司瓊(ondansetron)； ondansetron ；奧拉素(oracin) ； 口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑；奧馬鉬；奧沙特隆(osaterone)；奧沙利鉬(oxaliplatin)；氧諾霉素(oxaimomycin)；紫杉烷(taxel)；紫杉烷類(lèi)似物；紫杉烷衍生物；帕洛胺(palauamine)；棕櫚?；鼍?palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸 (pamidronic acid)；人參三酉享(panaxytriol)；中白諾米芬(panomifene)；苜I(mǎi)j 球菌素 (parabactin)；帕折普汀(pazelliptine)；培門(mén)冬酶；派德辛(peldesine)；戊聚糖聚硫酸鈉(pentosan polysulfate sodium)；噴司他丁 (pentostatin)；戊四氮(pentrozole)；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺(perfosfamide)；紫蘇醇(perillyl alcohol)；苯連氮霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑；必醫(yī)你舒(picibanil)；鹽酸毛果蕓香堿 (pilocarpine hydrochloride)；比柔比星(pirarubicin) ；口比曲克辛(piritrexim)；中白斯婷A(placetin Α)；帕斯婷B;纖溶酶原活化蛋白抑制劑；鉬絡(luò)合物；鉬化合物；鉬-三胺絡(luò)合物；卟吩姆鈉；泊非霉素(porfiromycin)；潑尼松(prednisone)；丙基雙-吖啶酮；前列腺素J2 (prostaglandin J2)；蛋白酶體抑制劑；基于蛋白質(zhì)A的免疫調(diào)節(jié)劑；蛋白激酶C抑制劑；蛋白激酶C抑制劑微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；吡啉 (purpurins)；吡唑并吖啶(pyrazoloacridine)；吡啶氧基化血紅蛋白聚氧乙烯結(jié)合物 (pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate) ；raf 吉抗齊[J ；雷替曲賽 (raltitrexed)；雷莫司瓊(ramosetron) ；ras法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；ras抑制劑； ras-GAP抑制劑；去甲基化瑞替普汀(retelliptine demethylated)；依替膦酸錸(Re 186)；根瘤菌素(rhizoxin)；核糖酶；RII異維A酰胺(RII retinamide)；羅谷亞胺 (rogletimide)；羅希吐堿(rohitukine)；羅莫肽(romurtide)；羅喹美克(roquinimex)； 盧比吉諾Bl (rubiginone Bi)；盧波斯(ruboxyl)；沙芬戈(safingol)；沙托平 (saintopin) ；SarCNU ；^A (sarcophytol Α) ；^H-(sargramostim) ；Sdi 1 牛莫擬物；司莫司汀(semustine)；衰老細(xì)胞源性抑制劑1 (senescence derived inhibitor 1)；有義寡核苷酸(sense oligonucleotides)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑；單鏈抗原結(jié)合蛋白；(sizofiran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡鈉(sodium borocaptate)；苯基乙酸鈉；索瓦羅(solverol)；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白(somatomedin binding protein)；索納明(sonermin)；斯帕福斯酸(sparfosic acid)；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；脾臟五肽(splenopentin)；海綿抑制素 1 (spongistatin 1)；角鯊胺(squalamine)；干細(xì)胞抑制劑；干細(xì)胞分裂抑制劑(stem-cell division ibitors)；密擠青霉酰胺(stipiamide)； 基質(zhì)裂解素抑制劑(stromelysin inhibitors)；沙芬辛(sulfinosine)；超活性血管活性 1 Ι ο ^Ll (superactive vasoactive intestinal peptide antagonist) ； ff iiiiilip (suradista)；舒拉明(suramin)；苦馬豆素(swainsonine)；合成葡胺聚糖；他莫司汀 (tallimustine)；他莫昔芬甲基碘鹽(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀 (tauromustine)；他扎羅汀(tazarotene)；替康蘭納(tecogalan sodium)；替力口氣 (tegafur)；特拉匹萊(tellurapyrylium)；端粒酶抑制劑(telomerase inhibitors)；替莫泊芬(temoporfin)；替莫 P 坐胺(temozolomide)；替尼泊昔(tenipo side)； tetrachlorodecaoxide ；特拉唑明(tetrazomine)；賽萊其jf汀(thaliblastine)；噻可拉林 (thiocoraline)；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模擬物； (thymalfasin)；胸腺生長(zhǎng)素受體激動(dòng)劑(thymopoietin receptor agonist)；胸腺曲南 (thymotrinan)；促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone)；乙基錫初紫紅素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine) ；二氯二茂鐵(titanocene bichloride)；托普斯汀(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能性干細(xì)胞因子；翻譯抑 制劑(totipotent stem cell factor ；. translation inhibitors)；維甲酸 (tretinoin)；三乙酉先基尿苷(triacetyluridine)；曲西立濱(triciribine)；三甲曲沙 (trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托燒司瓊(tropisetron)；妥羅雄脲 (turosteride)；酪氨酸激酶抑制劑；酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostins) ；UBC抑制劑； (ubenimex)；泌尿生殖竇源性生長(zhǎng)抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽(vapreotide)；法洛林 B (variolin B)； 用于紅細(xì)胞基因療法的載體系統(tǒng)(vector system, erythrocyte gene therapy)；維拉雷瑣 (velaresol)；薬聲胺(veramine)；瓦丁其jf (verdins)；維替泊芬(verteporfin)；長(zhǎng)春 賓；維沙拉汀(vinxaltine)；維他辛(vitaxin)；伏氯唑(vorozole)；扎諾特隆 (zanoterone)；折尼怕(zeniplatin)；亞節(jié)維(zilascorb)；禾口凈司他丁斯酉旨(zinostatin stimalamer)。 在一些實(shí)施例中，治療或預(yù)防本文中所述的細(xì)菌感染(或疾病)的方法可與一種或一種以上抗細(xì)菌劑組合使用。抗細(xì)菌劑包括(但不限于)氨基糖苷類(lèi) (aminoglycosides)、β -內(nèi)酉先胺齊[J類(lèi)(p-lactam agents)、頭抱菌素類(lèi)(cephalosporins)、 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(macrolides)、青霉素類(lèi)(penicillins)、喹諾酮類(lèi)(quinolones)、磺酰胺類(lèi) (sulfonamides)和四環(huán)素類(lèi)(tetracyclines)?？辜?xì)菌劑的實(shí)例包括(但不限于)醋氨苯砜(Acedapsone)、醋氨苯砜鈉、阿來(lái)霉素(Alamecin)、阿來(lái)西定(Alexidine)、阿姆地諾西林克拉維酸鉀(Amdinocillin Clavulanate Potassium)、阿姆地諾西林(Amdinocillin)、 阿姆地諾西林雙酯(Amdinocillin Pivoxi 1)、阿米環(huán)素(Amicycline)、氨氟沙星 (Amifloxacin)、甲磺酸氨氟沙星(Amifloxacin Mesylate)、阿米卡星(Amikacin)、硫酸阿米卡星、氨基水楊酸、氨基水楊酸鈉、阿莫西林(Amoxicillin)、安福霉素(Amphomycin)、氨芐西林(Ampicillin)、氨芐西林鈉、阿帕西林鈉(Apalcillin Sodium)、安普霉素 (Apramycin)、門(mén)冬托星(Aspartocin)、硫酸阿司米星(Astromicin Sulfate)、阿維霉素 (Avilamycin)、阿伏帕星(Avoparcin)、阿奇霉素(Azithromycin)、阿洛西林 (Azlocillin)、阿洛西林鈉、鹽酸巴氨西林(Bacampicillin Hydrochloride)、桿菌肽 (Bacitracin)、亞甲基雙水楊酸桿菌肽(Bacitracin Methylene Disalicylate)、桿菌肽 Itt JH # S (Bambermycins) > ^ ^ B. 丐(Benzoylpas Calcium) > % % B(Berythromycin)、硫酸倍他米星(Betamicin Sulfate)、比阿培南(Biapenem)、比尼霉素 (Biniramycin)、鹽酸珍尼柳酯(Biphenamine Hydrochloride)、硫酸鎂雙巰氧吡啶 (Bispyrithione Magsulfex)、布替卡星(Butikacin)、硫酸布替羅星(Butirosin Sulfate)、硫酸卷曲霉素(Capreomycin Sulfate)、卡巴多司(Carbadox)、羧節(jié)西林二鈉 (Carbenicillin Disodium)、羧節(jié)西林弗滿鈉(Carbenicillin Indanyl Sodium)、羧節(jié)西
42林苯基鈉(Carbenicillin Phenyl Sodium)、羧芐西林鉀、卡蘆莫南鈉(Carumonam Sodium)、頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢羥氨芐(Cefadroxil)、頭孢孟多(Cefamandole)、頭孢孟多酯鈉(Cefamandole Nafate)、頭孢孟多鈉、頭孢帕羅(Cefaparole)、頭孢曲嗪 (Cefatrizine)、頭孢氮氟鈉(Cefazaflur Sodium)、頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢唑林鈉、 頭孢拉宗(Cefbuperazone)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢妥侖匹酯(Cefditoren Pivoxil)、 頭孢吡肟(Cef印ime)、鹽酸頭孢吡肟、頭孢替考(Cefetecol)、頭孢克肟(Cefixime)、鹽酸頭孢甲肟(Cefmenoxime Hydrochloride)、頭孢美唑(Cefmetazole)、頭孢美唑鈉、頭孢尼西單鈉(Cefonicid Monosodium)、頭孢尼西鈉(Cefonicid Sodium)、頭孢哌酮鈉 (Cefoperazone Sodium)、頭孢雷特(Ceforanide)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢噻肟鈉、頭孢替坦(Cefotetan)、頭孢替坦二鈉、鹽酸頭孢替安(Cefotiam Hydrochloride)、頭孢西丁 (Cefoxitin)、頭孢西丁鈉、(Cefpimizole)、頭孢咪唑鈉(Cefpimizole Sodium)、頭孢匹胺 (Cefpiramide)、頭孢匹胺鈉、硫酸頭孢匹羅(Cefpirome Sulfate)、頭孢泊肟酯 (Cefpodoxime Proxetil)、頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢沙定(Cefroxadine)、頭孢磺啶鈉 (Cefsulodin Sodium)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢他啶鈉、頭孢布烯(Ceftibuten)、頭孢唑肟鈉(Ceftizoxime Sodium)、頭孢曲松鈉(Ceftriaxone Sodium)、頭孢呋辛 (Cefuroxime)、頭孢呋辛酯(Cefuroxime Axetil)、頭孢呋辛匹伏酯(Cefuroxime Pivoxetil)、頭孢呋辛鈉、頭孢乙腈鈉(Cephacetrile Sodium)、頭孢氨芐(Cephalexin), 鹽酸頭孢氨芐、頭孢來(lái)星(C印haloglycin)、頭孢噻啶(C印haloridine)、頭孢噻吩鈉 (Cephalothin Sodium)、頭孢匹林鈉(C^phapirin Sodium)、頭孢拉定(C 印 hradine)、鹽酸西托環(huán)素(Cetocycline Hydrochloride)> 乙酉先氯霉素(Cetophenicol)、氯霉素 (Chloramphenicol)、氯霉素棕櫚酸酯(Chloramphenicol Palmitate)、氯霉素泛酸酯絡(luò)合物(Chloramphenicol Pantothenate Complex)、5 白酸 內(nèi)氣霄素(Chloramphenicol Sodium Succinate)、氨基苯磷酸氯已定(Chlorhexidine Phosphani late)、氯二甲酚 (Chloroxylenol)、雙硫酸氯四環(huán)素(Chlortetracycline Bisulfate)、鹽酸氯四環(huán)素、西司他丁(Cilastatin)、西諾沙星(Cinoxacin)、環(huán)丙沙星O^iprofloxacin)、鹽酸環(huán)丙沙星、西羅霉素(Cirolemycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、克拉維酸鉀(Clavulanate Potassium)、鹽酸克林沙星(Clinafloxacin Hydrochloride)、克林霉素(Clindamycin) > 克林霉素右旋糖(Clindamycin Dextrose)、鹽酸克林霉素、鹽酸克林霉素棕櫚酸酯 (Clindamycin Palmitate Hydrochloride)、磷酸鹽酸克林霉素棕櫚酸酯、氯法齊明 (Clofazimine)、芐星鄰氯青霉素(Cloxacillin Benzathine)、氯唑西林鈉(Cloxacillin Sodium)、氯羥喹(Cloxyquin)、多粘菌素E(Colistimethate)、多粘菌素E甲磺酸鈉 (Colistimethate Sodium)、硫酸粘桿菌素(Colistin Sulfate)、庫(kù)馬霉素(Coumermycin)、 庫(kù)馬霉素鈉、環(huán)己西林(Cyclacillin)、環(huán)絲氨酸(Cycloserine)、達(dá)福普汀 (Dalfopristin)、氨苯砜(Dapsone)、達(dá)托霉素(Daptomycin)、地美環(huán)素 (Demeclocycline)、鹽酸地美環(huán)素、去甲環(huán)素(Demecycline)、地奴真菌素(Denofungin)、 二氨藜蘆啶(Diaveridine)、雙氯西林(Dicloxacillin)、雙氯西林鈉、硫酸雙氫鏈霉素 (Dihydrostreptomycin Sulfate)、雙口比硫翁(Dipyrithione)、地紅霉素(Dirithromycin)、 多西環(huán)素(Doxycycline)、多西環(huán)素鈣、多西環(huán)素磷酸復(fù)合物(Doxycycline R)sfatex)、鹽酸多西環(huán)素(Doxycycline Hyclate)、單水合多西環(huán)素、屈克沙星鈉(Droxacin Sodium)、依諾沙星(Enoxacin)、依匹西林(Epicillin)、鹽酸差向四環(huán)素(Epitetracycline Hydrochloride)、厄他培南(Ertapenem)、紅霉素(Erythromycin)、醋硬脂紅霉素 (Erythromycin Acistrate)、依托紅霉素(Erythromycin Estolate)、玻乙紅霉素 (Erythromycin Ethylsuccinate) ,MiMWMHMM (Erythromycin Gluceptate) > LH@I 紅霉素(Erythromycin Lactobionate)、丙酸紅霉素、硬脂酸紅霉素(Erythromycin Stearate) ZiMTII (Ethambutol Hydrochloride) > ^ ^ ! (Ethionamide) > Μ 羅沙星(Fleroxacin)、氟氯西林(Floxacillin)、氟氘丙氨酸(Fludalanine)、氟甲喹 (Flumequine)、憐霉素(Fosfomycin)、憐霉素氨基丁三酉享(Fosfomycin Tromethamine)、呋莫西林(Fumoxicillin)、呋唑氯銨(Furazolium Chloride)、酒石酸呋噻咪唑(Furazolium Tartrate)、夫西地酸鈉(Fusidate Sodium)、夫西地酸(Fusidic Acid)、加替沙星 (Gatifloxacin)、吉米沙星(Genifloxacin)、硫酸慶大霉素(Gentamicin Sulfate)、格洛莫南(Gloximonam)、短桿菌肽(Gramicidin)、鹵普羅近(Haloprogin)、海他西林 (Hetacillin)、海他西林鉀、?？宋鞫?Hexedine)、依巴沙星(Ibafloxacin)、亞氨培南 (Lnipenem)、異康唑(Isoconazole)、異帕米星(Is印amicin)、異煙胼(Isoniazid)、交沙霉素(Josamycin)、硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)、吉他霉素(Kitasamycin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、左呋喃他酮(Levofuraltadone)、左普匹西林鉀(Levopropylcillin Potassium)、來(lái)紅霉素(Lexithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、鹽酸林可霉素、利奈唑胺(Linezolid)、洛美沙星(Lomef loxacin)、鹽酸洛美沙星、甲磺酸洛美沙星、勞拉頭孢 (Loracarbef)、磺胺米隆(Mafenide)、甲氯環(huán)素(Meclocycline)、磺基水楊酸甲氯環(huán)素 (Meclocycline Subsalicylate)、巨霉素憐酸鉀(Megalomicin Potassium Phosphate)、美喹多司(Mequidox)、美羅培南(Meropenem)、美他環(huán)素(Methacycline)、鹽酸美他環(huán)素、烏洛托品(Methenamine)、馬尿酸烏洛托品(Methenamine Hippurate)、扁桃酸烏洛托品 (Methenamine Mandelate)、(Methicillin Sodium)(Metioprim)、ife 酸甲硝唑(Metronidazole Hydrochloride),；磷酸甲硝唑、美洛西林(Mezlocillin)、美洛西林鈉(Mezlocillin Sodium)、米諾環(huán)素(Minocycline)、鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸米林霉素 (Mirincamycin Hydrochloride)、莫能星(Monensin)、莫能星鈉、鹽酸莫西沙星 (Moxifloxacin Hydrochloride)、萘夫西林鈉(Nafcillin Sodium)、萘啶酸鈉(Nalidixate Sodium)、萘啶酸(Nalidixic Acid)、那他霉素(Natamycin)、尼拉霉素(Nebramycin)、棕櫚
酸新霉素(Neomycin Palmitate)、硫酸新霉素、i--烯酸新霉素(Neomycin
Undecylenate)、硫酸奈替米星(Netilmicin Sulfate)、中性霉素(Neutramycin)、硝呋拉定(Nifuradene)、硝呋地腙(Nifuraldezone)、硝呋太爾(Nifuratel)、硝呋隆 (Nifuratrone)、硝呋達(dá)齊(Nifurdazil)、硝呋米特(Nifurimide)、硝呋吡醇 (Nifurpirinol)、硝呋奎唑(Nifurquinazol)、硝呋噻唑(Nifurthiazole)、硝環(huán)素 (Nitrocycline)、硝化呋喃妥因(Nitrofurantoin)、硝米特(Nitromide)、諾氟沙星 (Norfloxacin)、新生霉素鈉(Novobiocin Sodium)、氧氟沙星(Ofloxacin)、奧美普林 (Ormetoprim)、苯唑西林鈉(Oxacillin Sodium) J虧莫南(Oximonam) J虧莫南鈉、奧索利酸 (Oxolinic Acid)、氧四環(huán)素(Oxytetracycline)、氧四環(huán)素鈣、鹽酸氧四環(huán)素、帕地霉素 (Paldimycin)、對(duì)氯酚(Parachlorophenol)、保洛霉素(Paulomycin)、培氟沙星 (Pefloxacin)、甲磺酸培氟沙星、培那西林培那西林(Penameci 11 in)、芐星青霉素
44G (Penicillin G Benzathine)、青霉素 G 鉀鹽、普魯卡因青霉素 G(Penicillin G Procaine)、青霉素 G 鈉鹽、青霉素 V (Penicillin V)、芐星青霉素 V (Penicillin V Benzathine)、海巴明青霉素V (Penicillin V Hydrabamine)、青霉素V鉀鹽、戊齊酮鈉 (Pentizidone Sodium)、氨基水楊酸苯酯、哌拉西林(Piperacillin)、哌拉西林鈉 (Piperacillin Sodium)、吡節(jié)西林鈉(Pirbenicillin Sodium)、吡地西林鈉 (Piridicillin Sodium)、鹽酸吡利霉素(Pirlimycin Hydrochloride)、鹽酸匹氨西林 (Pivampicillin Hydrochloride)、雙輕萘酸匹氨青霉素(Pivampicillin Pamoate)、丙苯酸匹氨青霉素(Pivampicillin Probenate)、硫酸多粘菌素 B (Polymyxin B Sulfate)、泊非霉素(Porfiromycin)、普匹卡星(Propikacin)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、吡啶硫酮鋅 (Pyrithione Zinc)、乙酸喹地卡明(Quindecamine Acetate)、奎奴普丁(Quinupristin)、 消旋甲砜霉素(Rac印henicol)、雷莫拉寧(Ramoplanin)、雷尼霉素(Ranimycin)、瑞洛霉素 (Relomycin)、瑞普米星(R印romicin)、利福布汀(Rifabutin)、利福美坦(Rifametane)、利?？宋?Rifamexil)、利福米特(Rifamide)、利福平(Rifampin)、利福噴丁(Rifapentine)、 利福昔明(Rifaximin)、氫吡四環(huán)素(Rolitetracycline)、硝酸氫吡四環(huán)素、羅沙米星 (Rosaramicin)、丁酸羅沙米星、丙酸羅沙米星、羅沙米星磷酸鈉(Rosaramicin Sodium Phosphate)、硬脂酸羅沙米星、羅索沙星(Rosoxacin)、羅沙胂(Roxarsone)、羅紅霉素 (Roxithromycin)、山環(huán)素(Sancycline)、山費(fèi)培南鈉(Sanfetrinem Sodium)、沙莫西林 (Sarmoxicillin)、沙匹西林(Sarpicillin)、司可芬凈(Scopafungin)、西索米星 (Sisomicin)、硫酸西索米星、司帕沙星(Sparfloxacin)、鹽酸大觀霉素(Spectinomycin Hydrochloride)、螺方寵霉素(Spiramycin)、鹽酸司他霉素(Stallimycin Hydrochloride) > 司替霉素(Steffimycin)、無(wú)菌替卡西林二鈉(Sterile Ticarcillin Disodium)、硫酸鏈霉素(Sti^ptomycin Sulfate)、煙胼鏈霉素(Sti^ptonicozid)、舒巴坦鈉(Sulbactam Sodium)、磺胺苯(Sulfabenz)、磺胺苯酰(Sulfabenzamide)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、 磺胺醋酰鈉、磺胺西汀(Sulfacytine)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺嘧啶鈉、磺胺多辛 (Sulfadoxine)、磺胺林(Sulfalene)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶 (Sulfameter)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)、磺胺噁唑 (Sulfamoxole)、氨苯磺酸鋅(Sulfanilate Zinc)、磺胺硝苯(Sulfanitran)、柳氮磺吡啶 (Sulfasalazine)、磺胺異噻唑(Sulfasomizole)、磺胺噻唑(Sulfathiazole)、磺胺吡唑 (Sulfazamet)、磺胺異噁唑(Sulfisoxazole)、乙酰磺胺異噁唑(Sulfisoxazole Acetyl)、 磺胺異噁唑二乙醇胺(Sulfisoxazole Diolamine)、磺粘菌素(Sulfomyxin)、硫培南 (Sulopenem)、舒他西林(Sultamicillin)、森西林鈉(Suncillin Sodium)、鹽酸酞氨西林 (Talampicillin Hydrochloride)、三唑巴坦(Tazobactam)、替考拉寧(Teicoplanin)、鹽酸替馬沙星 CTemafloxacin Hydrochloride)、替莫西林(Temocillin),四環(huán)素 (Tetracycline)、鹽酸四環(huán)素、四環(huán)素磷酸復(fù)鹽(Tetracycline Phosphate Complex)、四氧普林 CTetroxoprim)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、苯硫青霉素鉀(Thiphencillin Potassium)、替卡西林甲苯酯鈉(Ticarcillin Cresyl Sodium)、替卡西林二鈉、替卡西林單鈉(Ticarcillin Monosodium)、替克拉酮(Ticlatone)、氯化喬多(Tiodonium Chloride)、妥布霉素(Tobramycin)、硫酸妥布霉素、托氟沙星(Tosufloxacin)、三甲氧芐啶(Trimethoprim)、硫酸三甲氧芐啶、三重磺胺嘧啶(Trisulfapyrimidines)、醋竹桃霉素 (Troleandomycin) > Wi1 B. X M 9 M (Trospectomycin Sulfate) > 曲 ^ ^ M (Trovafloxacin)、短桿菌素(Tyrothricin)、萬(wàn)古霉素(Vancomycin)、鹽酸萬(wàn)古霉素、維吉霉素(Virginiamycin)、佐爾博霉素(Zorbamycin)0在一些實(shí)施例中，治療或預(yù)防本文中所述的病毒感染(或疾病)的方法可與一種或一種以上抗病毒劑組合使用。抗病毒劑可從天然來(lái)源分離或合成，并且可用于殺死病毒或抑制病毒生長(zhǎng)或功能?？共《緞┑膶?shí)例包括(但不限于)免疫球蛋白類(lèi)、金剛胺類(lèi)、干擾素類(lèi)、核苷酸類(lèi)似物類(lèi)和蛋白酶抑制劑類(lèi)。抗病毒劑的具體實(shí)例包括(但不限于)醋孟南(Acemarman)；阿昔洛韋(Acyclovir)；阿昔洛韋鈉；阿德福韋(Adefovir)；阿洛夫定(Alovudine)；阿韋舒托(Alvircept Sudotox)；鹽酸金剛烷胺(Amantadine Hydrochloride)；阿拉諾丁(Aranotin)；阿立酮(Arildone)；甲磺酸阿替韋啶(Atevirdine Mesylate)；阿夫立定(Avridine)；西多福韋(Cidofovir)；西潘茶堿(Cipamfylline)；鹽酸阿糖胞苷(Cytarabine Hydrochloride)；甲磺酸地拉韋啶(Delavirdine Mesylate)；地昔洛韋(Desciclovir)；去羥肌苷(Didanosine)； 二噁沙利(Disoxaril)；依度尿苷(Edoxudine)；恩韋拉登(Enviradene)；恩韋月虧 (Enviroxime) ；(Famciclovir) 5 ^^ (Famotine Hydrochloride)
濱(Fiacitabine)；非阿尿苷(Fialuridine)；磷利酯(Fosarilate)；膦甲酸鈉(Foscarnet Sodium)；膦乙醇鈉(Fosfonet Sodium)；更昔洛韋(Ganciclovir)；更昔洛韋鈉；碘苷 (Idoxuridine)；凱托沙(Kethoxal)；拉米夫定(Lamivudine)；洛布卡韋(Lobucavir)；鹽酸美莫汀(Memotine Hydrochloride)；美替沙腙(Methisazone)；奈韋拉平(Nevirapine)； 噴昔洛韋(Penciclovir)；吡羅達(dá)韋(Pirodavir)；利巴韋林(Ribavirin)；鹽酸金剛乙胺 (Rimantadine Hydrochloride)；甲磺酸沙奎那韋(Saquinavir Mesylate)；鹽酸索金剛胺 (Somantadine Hydrochloride)；索立夫定(Sorivudine)；維司托隆(Statolon)；司他夫定 (Stavudine)；鹽酸替洛隆(Tilorone Hydrochloride)；曲氟尿苷(Trifluridine)；鹽酸伐昔洛韋(Valacyclovir Hydrochloride)；阿糖腺苷(Vidarabine)；磷酸阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸鈉；韋羅肟(Viroxime)；扎西他濱(hlcitabine)；齊多夫定(Zidovudine)；和凈韋月虧(Zinviroxime)?？共《緞┻€包括核苷酸類(lèi)似物類(lèi)。核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例包括(但不限于)阿昔洛韋(用于治療單純皰疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒)、更昔洛韋(用于治療細(xì)胞肥大病毒)、 碘苷、利巴韋林(用于治療呼吸道合胞病毒)、二脫氧肌苷、二脫氧胞苷、齊多夫定(疊氮胸苷)、咪喹莫特和雷西莫特(resimiquimod)。干擾素是由感染病毒的細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。干擾素通過(guò)結(jié)合感染細(xì)胞附近的細(xì)胞上的特異性受體，引起細(xì)胞變化，從而保護(hù)其免受病毒感染來(lái)起作用。α和 β -干擾素還誘導(dǎo)感染細(xì)胞表面上I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子表達(dá)，使供宿主免疫細(xì)胞識(shí)別的抗原呈遞增加。α和β-干擾素可以重組形式使用，并且已經(jīng)用于治療慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染。有效進(jìn)行抗病毒療法的劑量的干擾素具有嚴(yán)重副作用，例如發(fā)燒、不適和體重減輕。在一些實(shí)施例中，治療或預(yù)防本文中所述的真菌感染(或疾病)的方法可與一種或一種以上抗真菌劑組合使用?？拐婢鷦┑膶?shí)例包括(但不限于)咪唑類(lèi)，例如克霉唑(clotrimazole)、舍他康唑(sertaconzole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)和活力康唑 (voriconacole)，以及FK 463、兩性霉素B (amphotericin B) ,BAY 38-9502,MK 991、泊拉弟霉素(pradimicin)、UK 292、布替萘芬(butenafine)和特比萘芬(terbinafine)。其它抗真菌劑通過(guò)分解殼多糖(例如殼多糖酶)或免疫抑制(501乳膏)起作用。在一些實(shí)施例中，治療或預(yù)防本文中所述的原蟲(chóng)感染(或疾病)的方法可與一種或一種以上抗原蟲(chóng)劑組合使用?？乖x(chóng)劑的實(shí)例包括(但不限于)阿苯達(dá)唑(albendazole)、兩性霉素 B (amphotericin B)、節(jié)硝唑(benznidazole)、硫氯酚 (bithionol)、鹽酸氯喹(chloroquine HCl)、磷酸氯喹、克林霉素(clindamycin)、去氫依米丁(dehydroemetine)、乙胺嗪(diethylcarbamazine)、糠酸二氯尼特(diloxanide furoate)、依氟鳥(niǎo)氨酸(ef lornithine)、呋喃唑酮(furazolidaone)、糖皮質(zhì)激素類(lèi)、 鹵泛群(halofantrine)、雙碘喹啉(iodoquinol)、伊維菌素(ivermectin)、甲苯達(dá)唑(mebendazole)、甲氟喹(mefloquine)、葡甲胺鋪酸鹽(meglumine antimoniate)、 美拉月申醇(melarsoprol)、美曲憐酉旨(metrifonate)、甲銷(xiāo)唾(metronidazole)、氣硝柳胺(niclosamide)、硝呋替莫(nifurtimox)、奧沙尼喹(oxamniquine)、巴龍霉素(paromomycin)、噴他脒羥乙磺酸鹽(pentamidine isethionate)、哌嗪、吡喹酮 (praziquantel)、磷酸伯胺喹(primaquine phosphate)、氯胍(proguanil)、雙羥萘酸噻嘧唆(pyrantel pamoate)、乙胺啼唆力口磺酉先胺(pyrimethanmine-sulfonamides)、乙胺啼唆加磺胺多辛(pyrimethanmine-sulfadoxine)、鹽酸米帕林(quinacrine HCl)、硫酸奎寧 (quinine sulfate)、葡糖酸查尼丁 (quinidine gluconate)(spiramycin)、葡糖酸鋪鈉(stibogluconate sodium/ sodium antimony gluconate)、舒拉明(suramin)、四環(huán)素、多西環(huán)素(doxycycline)、噻苯達(dá)唑(thiabendazole)、替硝唑(tinidazole)、三甲氧芐啶加磺胺甲 1I惡唑(trimethroprim-sulfamethoxazole)和錐蟲(chóng)月申胺(tryparsamide)，其中一些可單獨(dú)使用或者彼此組合使用。以下實(shí)例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為以任何方式進(jìn)一步限制本發(fā)明。本申請(qǐng)案中所引用的所有參考文獻(xiàn)(包括文獻(xiàn)參考、發(fā)表的專(zhuān)利、公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)案和共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)案)的全部?jī)?nèi)容都以引用的方式清楚地并入本文中。鍾實(shí)例1 經(jīng)由皮膚劃痕法進(jìn)行表皮VV免疫將產(chǎn)生明顯強(qiáng)于常規(guī)注射途徑的細(xì)胞和體液免疫。產(chǎn)生VV皮膚劃痕法小鼠模型。在劃痕的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的急性表皮痘反應(yīng)與人天花疫苗極為類(lèi)似。使用這一模型，嚴(yán)格比較在通過(guò)皮膚劃痕法(S. S.)、皮下(S. C)注射、皮內(nèi)(i.d.)注射和肌肉內(nèi)(i.m.)注射進(jìn)行痘苗病毒(VV)免疫后初次和記憶適應(yīng)性免疫應(yīng)答。高免疫原性腹膜內(nèi)(i. P.)注射途徑盡管未用于臨床免疫，但仍包括在內(nèi)作為VV特異性免疫應(yīng)答的陽(yáng)性對(duì)照。與常規(guī)注射途徑(s. c、i.d.和i.m.)相比較，VV皮膚劃痕法誘導(dǎo)明顯較強(qiáng)的初次和記憶性T細(xì)胞應(yīng)答，以及較高的血清VV特異性IgG含量(圖1)。在VV劃痕小鼠和i.P.免疫的小鼠中，長(zhǎng)期T細(xì)胞記憶性和血清IgG含量相當(dāng)。因此，根據(jù)IFN-Y 應(yīng)答和血清IgG含量，經(jīng)由皮膚劃痕法進(jìn)行局部表皮VV免疫達(dá)到的免疫原性與建立全身病毒感染的i.P.感染相當(dāng)。
實(shí)例2 =VV皮膚劃痕法提供針對(duì)二次抗原激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)。本實(shí)例使用三種不同的模型來(lái)確定VV皮膚劃痕法是否能提供針對(duì)二次激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)。第一激發(fā)模型是皮膚痘病毒感染(經(jīng)由皮膚感染)。選擇這一模型是出于兩個(gè)原因。第一，在臨床上，通過(guò)用Dryvax皮膚劃痕法激發(fā)接種疫苗的個(gè)體，來(lái)評(píng)估天花疫苗候選物的保護(hù)功效。第二，天然的痘病毒感染可經(jīng)由皮膚，尤其是損傷的皮膚區(qū)域暴露于病毒而獲得。在皮膚激發(fā)后，利用VV特異性實(shí)時(shí)PCR來(lái)測(cè)定皮膚病毒載量(圖幻。與未免疫的對(duì)照小鼠相比較，經(jīng)s. c、i. d.和i.m.注射免疫的小鼠都顯示出部分保護(hù)，分別出現(xiàn)15、9. 5 和3倍的病毒載量降低。在i. p.免疫的小鼠中，病毒載量達(dá)到3-log降低。值得關(guān)注的是， 到這一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，預(yù)先經(jīng)由皮膚劃痕法免疫的所有小鼠的病毒完全清除。因此，與注射途徑 (包括高免疫原性i. P.途徑)相比較，皮膚劃痕法提供針對(duì)二次皮膚痘病毒激發(fā)的優(yōu)良保護(hù)。天然的痘病毒感染主要是通過(guò)呼吸性氣溶膠傳播。因此，評(píng)估各種免疫途徑針對(duì)病原性西儲(chǔ)痘苗病毒(WR-VV)引起的致死性鼻內(nèi)感染的保護(hù)功效。如圖3a、!3b中所示，經(jīng)由s. c、i. d.和i. m.注射途徑使小鼠免疫QX IO6Pfu劑量)出現(xiàn)明顯的臨床疾病(表現(xiàn)為體重(BW)的明顯減輕)，并且只得到部分保護(hù)免于死亡。相比之下，經(jīng)由s. s.和i.p.途徑免疫的小鼠得到完全保護(hù)，即100%存活和最小的體重變化。事實(shí)上，即使劑量降低到 1/1000，皮膚劃痕途徑得到的保護(hù)功效仍優(yōu)于s. c、i.d.和i.m.途徑(圖3c、3d)。因此， 經(jīng)由皮膚劃痕法進(jìn)行VV免疫在保護(hù)呼吸道粘膜方面比常規(guī)免疫途徑有效。接著，研究與VV皮膚劃痕法相關(guān)的優(yōu)良保護(hù)是否能延續(xù)到非病毒激發(fā)模型。利用表達(dá)卵清蛋白(OVA)Kb表位0財(cái)257_264的重組痘苗病毒(rVV)，經(jīng)由不同途徑使C57B1/6小鼠免疫，并在免疫后5周，用表達(dá)OVA的B16黑色素瘤細(xì)胞以皮內(nèi)方式激發(fā)。腫瘤植入后第 18天，經(jīng)由注射途徑(s.c、i.d.、i.m.和i.p.)免疫的所有小鼠都出現(xiàn)較大的皮膚黑色素瘤腫塊(圖如-4d)。引人注目的是，在任一皮膚劃痕小鼠上都未檢測(cè)到可見(jiàn)或可觸知的腫瘤(圖4e)。盡管最終在所有B16-0VA激發(fā)的小鼠中都出現(xiàn)腫瘤，但與其它各組相比較，劃痕法組中的腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩(圖4f)且存活率得到較大改善(數(shù)據(jù)未圖示)。已知疫苗和腫瘤細(xì)胞只共有單一 CD 8T細(xì)胞表位，并且只給予小鼠單次劑量的VV皮膚劃痕，故這些結(jié)果是非常值得期待的，并且具有廣泛的臨床意義。隨時(shí)間推移，B16腫瘤細(xì)胞很有可能在免疫選擇下喪失OVA表達(dá)，使得0va257_264特異性⑶8+T細(xì)胞記憶應(yīng)答無(wú)效，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)例3 針對(duì)二次激發(fā)的VV皮膚劃痕相關(guān)性保護(hù)需要記憶性T細(xì)胞而非Ab。為了研究在痘病毒皮膚劃痕法后的優(yōu)良保護(hù)功效的潛在機(jī)制，將研究在皮膚劃痕法相關(guān)免疫保護(hù)中體液和細(xì)胞應(yīng)答的相對(duì)貢獻(xiàn)。利用VV，經(jīng)由皮膚劃痕法或i.p.注射(這是本研究中兩種免疫原性最強(qiáng)的途徑)使野生型(wt)和B細(xì)胞缺陷型μ MT小鼠免疫。隨后，通過(guò)二次皮膚或鼻內(nèi)痘病毒感染激發(fā)記憶小鼠。如圖fe中所示，當(dāng)在皮膚上用VV激發(fā)時(shí)，i.P.免疫的μ MT小鼠的病毒載量比i.p.免疫的野生型小鼠高4-log。有趣的是，經(jīng)由s. s.途徑免疫的μ MT小鼠仍顯示出針對(duì)皮膚激發(fā)的強(qiáng)烈保護(hù)，其病毒載量與經(jīng)由皮膚劃痕法免疫的野生型小鼠相當(dāng)。然而，當(dāng)在激發(fā)之前和期間，耗盡野生型記憶小鼠體內(nèi)的T 細(xì)胞(通過(guò)用大劑量抗⑶4和抗⑶8mAB處理)時(shí)，s. s.和i. p.兩個(gè)免疫組中的免疫保護(hù)完全消除。這一數(shù)據(jù)表明，盡管在i.P.免疫后針對(duì)皮膚激發(fā)的保護(hù)需要T細(xì)胞和抗體，但在W皮膚劃痕法后僅僅T細(xì)胞記憶性應(yīng)答就足夠強(qiáng)大以有效控制皮膚激發(fā)。實(shí)際上，與 i.p.免疫的小鼠相比較，在劃痕法免疫的小鼠中，引流激發(fā)的皮膚的脾和淋巴結(jié)(LN)中的二次T細(xì)胞應(yīng)答明顯較強(qiáng)(圖^、5c)。在μ MT小鼠中，各免疫組之間的差異甚至更顯著。 進(jìn)一步在顯微鏡下檢查不同組小鼠的受激發(fā)皮膚組織中T細(xì)胞的存在。引人注目的是，在經(jīng)由s. s.途徑免疫的小鼠的基層表皮和真皮中觀察到大量的CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)，而在從所有其它免疫組收集的皮膚中只散布極少T細(xì)胞(圖5d)?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明，VV皮膚劃痕法對(duì)于產(chǎn)生大量皮膚歸巢Trai特別有效，而這些皮膚歸巢Tm對(duì)于二次皮膚抗原性激發(fā)具有較高保護(hù)性。類(lèi)似地，T細(xì)胞記憶對(duì)于針對(duì)鼻內(nèi)激發(fā)的完全保護(hù)似乎比抗體應(yīng)答更重要。用W， 經(jīng)由皮膚劃痕法使野生型和μΜΤ小鼠免疫，并用WR-VV，經(jīng)由鼻內(nèi)感染致死性激發(fā)。兩種品種的小鼠完全得到保護(hù)以免死亡，同時(shí)體重變化極小。然而，耗盡野生型記憶小鼠體內(nèi)的T 細(xì)胞導(dǎo)致較明顯的體重減輕，盡管所有T細(xì)胞耗盡的免疫小鼠在激發(fā)后存活(圖6)。這一數(shù)據(jù)表明，處于呼吸道上皮襯層中或能夠迅速遷移到呼吸道上皮襯層中的保護(hù)性Tem以及皮膚歸巢Tm是由皮膚劃痕法表皮VV免疫產(chǎn)生。這些細(xì)胞在針對(duì)氣溶膠傳播的病原體的免疫監(jiān)視中起到重要作用。實(shí)例4 在區(qū)域性LN中，VV皮膚劃痕法通過(guò)初次和二次組織歸巢印記程序產(chǎn)生大量皮膚歸巢Trff/TM以及具有高度通用的歸巢能力的T細(xì)胞。在局限于皮膚的局部VV感染后，抗原特異性T細(xì)胞怎樣產(chǎn)生高度通用的歸巢能力以提供全身免疫保護(hù)？這一問(wèn)題將通過(guò)以下方式進(jìn)行研究在用rVV-0va257_264進(jìn)行皮膚劃痕法或i. p.感染后，將天然的標(biāo)記CFSE的Thyl. l+0va257_264特異性0T_I T細(xì)胞適應(yīng)性轉(zhuǎn)移到Thyl. 2+野生型小鼠中，隨后跟蹤其體內(nèi)活化、增殖和遷移。早在皮膚劃痕法后60小時(shí)，OT-I細(xì)胞就在皮膚引流的腹股溝淋巴結(jié)(ILN)內(nèi)大量增殖，而在i.p.感染后，在腸道引流的腸系膜淋巴結(jié)(MLN)中觀察到類(lèi)似的增殖(圖7a)。與預(yù)期的一樣，這些OT-I細(xì)胞明顯下調(diào)淋巴結(jié)歸巢分子⑶62L，這一分子在循環(huán)于次級(jí)淋巴組織中間的天然和T。m T細(xì)胞中高度表達(dá)(圖 7b)。同時(shí)，在ILN內(nèi)活化的OT-I細(xì)胞上的皮膚歸巢分子E-Lig和P-Lig (P-選擇素配體) 以及在MLN內(nèi)活化的OT-I細(xì)胞上的腸道歸巢分子α 4β 7穩(wěn)定上調(diào)。組織歸巢分子的表達(dá)在3次細(xì)胞分裂后上調(diào)，并隨著細(xì)胞分裂持續(xù)增加(圖7c)。因此，早在活化時(shí)，抗原特異性 T細(xì)胞就在發(fā)生預(yù)致敏的區(qū)域性LN內(nèi)印記有組織特異性歸巢表型(初次歸巢印記)。這使得活化的T細(xì)胞早在VV皮膚劃痕法后3天就能夠特異性遷移到感染組織(數(shù)據(jù)未圖示)。 先前未曾理解在初次VV皮膚劃痕法后這一 T細(xì)胞驚人迅速地募集到皮膚中的現(xiàn)象。還得到幾個(gè)其它不曾預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)。與在感染后第60小時(shí)高度特異性組織移行 (trafficking)相比，活化的OT-I細(xì)胞在rVV-ova皮膚劃痕法后第5天已經(jīng)散播到非引流淋巴結(jié)中(圖8a)。通過(guò)帶有VV或VV抗原的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的全身散播未得到這一結(jié)果，因?yàn)榻柚呙舾行詫?shí)時(shí)RT-PCR無(wú)法檢測(cè)到在皮膚或皮膚引流淋巴結(jié)外部的痘苗基因的表達(dá)(圖8b)，并且從MLN和脾分離的APC無(wú)法在體外活化OT-I細(xì)胞(圖Sc)。因此， 一小組ILN活化的OT-I細(xì)胞在整個(gè)淋巴組織中散播，并在不存在持續(xù)抗原刺激的情況下持續(xù)分裂。出乎意料的是，這些細(xì)胞也表達(dá)其它組織特異性歸巢分子。如圖9a中所示，在增殖的OT-I細(xì)胞上，腸道歸巢α4β7上調(diào)。當(dāng)使用FTY720(—種調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞從淋巴組織遷出的鞘氨醇1-磷酸的功能性拮抗劑)阻止OT-I細(xì)胞活化后從ILN中遷出OT-I細(xì)胞(圖 9b)時(shí)，OT-I細(xì)胞上E-Lig的表達(dá)不受影響(圖9c)，但OT-I細(xì)胞上α 4β消除(圖9d)。 這一數(shù)據(jù)明顯表明，腸道歸巢分子上調(diào)是在OT-I遷移到MLN中后發(fā)生(第二次組織歸巢印記)。據(jù)悉，在表達(dá)推定的肺和粘膜移行分子的其它非引流LN中可能會(huì)發(fā)生類(lèi)似過(guò)程。當(dāng)在感染后30天檢查T(mén)細(xì)胞時(shí)，初級(jí)(皮膚特異性E-Lig)和次級(jí)(腸道特異性α 4 β 7)歸巢分子仍存在于記憶性O(shè)T-I細(xì)胞上(圖10)。總的說(shuō)來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)由皮膚劃痕法進(jìn)行局部VV免疫產(chǎn)生保護(hù)性T細(xì)胞應(yīng)答，以實(shí)現(xiàn)病毒進(jìn)入位點(diǎn)的即時(shí)皮膚特異性免疫控制， 以及針對(duì)不同解剖學(xué)位置(例如呼吸道表皮)潛在病毒散播或二次激發(fā)的更為靈活的全身保護(hù)的機(jī)制。實(shí)例5 =MVA皮膚劃痕法代表一種優(yōu)良、安全且有效的新穎免疫策略。由于高度減毒的復(fù)制缺陷型VV病毒株MVA在臨床前和臨床研究中表現(xiàn)出令人印象深刻的安全性和免疫原性特征，故人們已經(jīng)積極研究將其作為一種頗具前景的活病毒疫苗載體。MVA疫苗專(zhuān)門(mén)經(jīng)由注射途徑投予，從未經(jīng)由皮膚劃痕法投予。這可能歸因于直覺(jué)推測(cè)，即，痘損傷的發(fā)生以及隨后針對(duì)激發(fā)的強(qiáng)烈保護(hù)作用都需要病毒在表皮中復(fù)制。盡管如此，仍經(jīng)由皮膚劃痕法用MVA使小鼠免疫。意外的是，MVA皮膚劃痕法以劑量依賴(lài)性方式誘導(dǎo)特征性痘損傷(圖Ila)，并產(chǎn)生針對(duì)VV抗原的劑量依賴(lài)性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答(圖lib、lie)。重要的是，當(dāng)用鼻內(nèi)WR-VV感染進(jìn)行致死性激發(fā)時(shí)，MVA皮膚劃痕法在l.SXKfpfiK圖lid)劑量下提供針對(duì)死亡和疾病的完全保護(hù)，而利用這一劑量，通過(guò)常規(guī)注射途徑進(jìn)行復(fù)制性VV免疫無(wú)法保護(hù)小鼠免受致死性激發(fā)(圖3a、3b)。不出所料，利用相當(dāng)劑量OXlO6Pfu)的MVA進(jìn)行免疫，常規(guī)注射途徑只引起較弱的可檢測(cè)T細(xì)胞和抗體應(yīng)答(圖1加、12b)，甚至在二次病毒激發(fā)后也是如此(圖12c、12d)，并提供針對(duì)WR-VV鼻內(nèi) (i. n.)激發(fā)的較弱保護(hù)作用(圖12e、12f)，而經(jīng)由皮膚劃痕法，利用MVA或VV都會(huì)提供強(qiáng)烈的免疫保護(hù)作用。因此，與皮膚劃痕法相關(guān)的優(yōu)良免疫原性和保護(hù)功效延續(xù)到高度減毒的MVA疫
田ο在缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的Rag-/-小鼠中，確定MVA皮膚劃痕法對(duì)于免疫低下宿主的安全性。MVA劃痕的Rag-/-小鼠產(chǎn)生較小的痘損傷，這一損傷只限于接種部位(圖13a)， 并且長(zhǎng)期存活，同時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)任何體重減輕(圖13b、13c)或可檢測(cè)的病毒血(圖13d)。而大相徑庭的是，在感染后約4周，VV劃痕的Rag-/-小鼠出現(xiàn)逐漸惡化的皮膚侵蝕和壞死， 并因傷致死(圖13a-c)。MVA皮膚劃痕法在產(chǎn)生保護(hù)性免疫方面特別有效的觀察結(jié)果說(shuō)明，不需要在表皮中產(chǎn)生病毒感染來(lái)獲得強(qiáng)烈的保護(hù)功效。然而，用代謝活性活病毒感染表皮似乎是產(chǎn)生嚴(yán)格的免疫應(yīng)答所必需的。這一點(diǎn)可由以下幾方面說(shuō)明第一，熱滅活的W當(dāng)經(jīng)由皮膚劃痕法投予時(shí)，即使劑量很高，也無(wú)法誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答；第二，用鹽水同時(shí)進(jìn)行皮膚“劃痕” 法無(wú)法增強(qiáng)通過(guò)注射VV感染的小鼠的免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未圖示)。表皮中針對(duì)VV感染的固有皮膚應(yīng)答的獨(dú)特特征可用作天然佐劑以優(yōu)化隨后的適應(yīng)性應(yīng)答。人們發(fā)現(xiàn)，原代人體角化細(xì)胞，而非真皮纖維母細(xì)胞或真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞，能夠在不存在宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答的情況下限制體外VV復(fù)制，支持了上述觀點(diǎn)。此外，在VV皮膚劃痕法后，角化細(xì)胞中固有細(xì)胞因子IL-I α的轉(zhuǎn)基因過(guò)度表達(dá)使體內(nèi)適應(yīng)性免疫應(yīng)答進(jìn)一步增強(qiáng)。
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總的說(shuō)來(lái)，這些觀察結(jié)果證實(shí)，免疫途徑是設(shè)計(jì)疫苗接種策略的重要考慮因素。與臨床上(尤其是關(guān)于MVA)常用的注射途徑相比較，用活病毒疫苗(包括非復(fù)制性病毒)進(jìn)行表皮免疫會(huì)產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答和更強(qiáng)的保護(hù)作用。由此，已經(jīng)描述了本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施例的幾個(gè)方面，但應(yīng)理解，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將易于進(jìn)行各種改變、修改和改進(jìn)。這些變化、修改和改進(jìn)將打算作為本發(fā)明的一部分， 并且打算包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，前述描述和圖式都只是舉例。
權(quán)利要求
1.一種用于刺激免疫應(yīng)答的方法，其包含對(duì)個(gè)體投予足以刺激所述免疫應(yīng)答的量的包含抗原的活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒，其中所述痘病毒是投予機(jī)械破壞的表皮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是體液應(yīng)答和/或細(xì)胞應(yīng)答。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞應(yīng)答是由CD4+和/或CD8+T細(xì)胞和/或 B細(xì)胞引起。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述痘病毒選自由以下各物組成的群組正痘、豬痘、禽痘、羊痘、野兔痘、副痘病毒、軟疣痘病毒和亞塔痘病毒(yatapoxvirus)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述痘苗病毒選自由以下各物組成的群組修飾型安卡拉痘苗病毒(MVA)、WR株、NYCBH株、惠氏株(Wyeth strain)、ACAM2000、李斯特氏株(Lister strain)、LC16m8、Elstree-BNm、哥本哈根株(Copenhagen strain)或天壇株 (Tiantan strain)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表皮是借助劃痕針、皮下注射針或磨蝕器機(jī)械破壞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表皮的機(jī)械破壞是與所述痘病毒的投予基本上同時(shí)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表皮的機(jī)械破壞是在所述痘病毒投予之前進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體患有癌癥或有發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌癥是皮膚癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌和甲狀腺癌或結(jié)直腸癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述癌癥是選自由以下癌癥組成的群組前列腺腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、上皮源性卵巢癌、結(jié)直腸腺癌和平滑肌肉瘤、胃腺癌和平滑肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、腎細(xì)胞癌、腎和膀胱的移行細(xì)胞癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、星狀細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述皮膚癌選自由以下癌癥組成的群組黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體患有感染或有發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述感染是病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述病毒感染選自由以下感染組成的群組 HIV、流感病毒、登革(dengue)病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉(mx)la)病毒、馬爾堡(Marburg)病毒、狂犬病毒、漢坦(Hanta)病毒感染、 西尼羅河病毒(West Nile virus)、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、 艾普斯坦-巴爾二氏病毒(Epstein-Barr virus)、8型人皰疹病毒、α病毒和圣路易腦炎 (St. Louis encephalitis)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)菌感染選自由以下感染組成的群組結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhi)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia perstis)、土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、軍團(tuán)菌(Legionella)、披衣菌(Chlamydia)、傷寒立克次體 (Rickettsia typhi)禾口梅毒螺旋體(Treponema pallidum)感染。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述真菌感染選自由以下感染組成的群組粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)禾口曲霉屬(Aspergillus species)感染。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述原蟲(chóng)感染選自由以下感染組成的群組瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(chóng)(Plasmodium ovale)、三曰皰原蟲(chóng)(Plasmodium malariae))、禾丨」什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania species)、維蟲(chóng)屬(Trypanosome spec ies)(非洲和美洲)、隱孢子蟲(chóng)(cryptosporidiums)、 等孢球蟲(chóng)屬(isospora species)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲(chóng)屬 (Acanthamoeba species)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、剛地弓形蟲(chóng) (Toxoplasma gondii)禾口卡氏月市抱子蟲(chóng)(Pneumocystis carinii)感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原是腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、腫瘤特異性抗原(TSA)或組織特異性抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原是病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含投予共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述共刺激分子是與所述抗原一起由所述痘病毒共表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述共表達(dá)的共刺激分子選自由以下各物組成的群組IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-27、B7-2、B7-H3、CD40、CD40L、 ICOS 配體、0X-40L、4-1BBL、GM-CSF, SCF、FGF、Flt3 配體、CCR4。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述痘病毒為T(mén)RIC0M 。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是與所述抗原基本上同時(shí)投予。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是在所述抗原之前投予。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是在所述抗原之后投予。
29.根據(jù)權(quán)利要求沈至觀中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是在與所述抗原基本上相同的位點(diǎn)投予。
30.根據(jù)權(quán)利要求沈至觀中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述共刺激分子、生長(zhǎng)因子、佐劑和/或細(xì)胞因子是在與所述抗原不同的位點(diǎn)投予。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含在所述第一次投予所述抗原后某一時(shí)間第二次投予所述抗原。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒包含病毒載體，所述病毒載體包含編碼所述抗原的核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述編碼所述抗原的核酸可操作地連接到啟動(dòng)子。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是組成性活性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其進(jìn)一步包含增強(qiáng)子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在投予包含所述抗原的所述痘病毒之前，未用所述抗原激發(fā)所述個(gè)體，且其中所述個(gè)體有受所述抗原激發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中刺激所述免疫應(yīng)答將對(duì)所述個(gè)體提供針對(duì)呈遞所述抗原的試劑所引起的疾病的保護(hù)作用。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在投予包含所述抗原的所述痘病毒之前，所述個(gè)體已經(jīng)用所述抗原激發(fā)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中刺激所述免疫應(yīng)答將治療所述個(gè)體的由呈遞所述抗原的試劑引起的疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求37或39所述的方法，其中所述疾病是感染或癌癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述癌癥選自由以下癌癥組成的群組黑色素瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、乳癌、前列腺腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、上皮源性卵巢癌、結(jié)直腸腺癌和平滑肌肉瘤、胃腺癌和平滑肌肉瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、腎細(xì)胞癌、腎和膀胱的移行細(xì)胞癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、星狀細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述感染是病毒、細(xì)菌、真菌或原蟲(chóng)感染。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述感染選自由以下感染組成的群組HIV、流感病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、狂犬病毒、漢坦病毒感染、西尼羅河病毒、SARS樣冠狀病毒、單純皰疹病毒、 水痘-帶狀皰疹病毒、艾普斯坦-巴爾二氏病毒、8型人皰疹病毒、α病毒、圣路易腦炎、結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌、炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、軍團(tuán)菌、披衣菌、 傷寒立克次體、梅毒螺旋體、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、隱球酵母菌、白色念珠菌、曲霉屬、瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng))、利什曼原蟲(chóng)屬、錐蟲(chóng)屬(非洲和美洲)、隱孢子蟲(chóng)、等孢球蟲(chóng)屬、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴蟲(chóng)屬、狒狒巴拉姆希阿米巴、剛地弓形蟲(chóng)和卡氏肺孢子蟲(chóng)感染。
44.一種試劑盒，其包含用于破壞個(gè)體表皮的裝置，以及活的、修飾型、非復(fù)制性或復(fù)制減弱性痘病毒。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述裝置是劃痕針、皮下注射針或磨蝕裝置。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述痘病毒附著于所述裝置。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述痘病毒是混合于溶液中。<
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的試劑盒，其中所述溶液進(jìn)一步包含增強(qiáng)所述痘病毒向個(gè)體的傳遞的試劑，其中所述痘病毒是通過(guò)所述個(gè)體的表皮傳遞。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的試劑盒，其中所述溶液進(jìn)一步包含增強(qiáng)個(gè)體的免疫應(yīng)答的試劑，其中所述免疫應(yīng)答是由所述痘病毒所刺激。
50.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含使用所述試劑盒的說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明提供刺激個(gè)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包含對(duì)有需要的個(gè)體投予活的、修飾型和/或重組復(fù)制減弱性或非復(fù)制性痘病毒，所述痘病毒包含足以刺激所述免疫應(yīng)答的量的抗原，其中所述病毒是通過(guò)機(jī)械破壞表皮來(lái)投予。本發(fā)明還提供包含所述病毒和表皮破壞裝置的試劑盒。
文檔編號(hào)A61P37/00GK102281897SQ200880132576
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者T·S·顧巴, 劉露錚麗莎 申請(qǐng)人:T·S·顧巴, 劉露錚麗莎