專利名稱：：一種嗜水氣單胞菌滅活疫苗及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及魚用疫苗，具體說(shuō)是一種嗜水氣單胞菌滅活疫苗及其制備。
背景技術(shù)：
：嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和糞便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株感染譜十分廣泛，是淡水魚類的主要病原菌。由該菌引起的細(xì)菌性敗血癥是我國(guó)養(yǎng)魚史上危害魚的種類最多、危害魚的年齡范圍最大、流行地區(qū)最廣、流行季節(jié)最長(zhǎng)、危害養(yǎng)魚水域類別最多、造成的損失最嚴(yán)重的一種急性傳染病。本病目前主要以抗生素和化學(xué)藥物控制為主，但長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素易產(chǎn)生耐藥性，化學(xué)藥物會(huì)造成殘留，污染水質(zhì)，破壞生態(tài)平衡，而采用免疫防治疾病則可以避免這種弊端。目前嗜水氣單胞菌疫苗主要有全苗滅活疫苗、減毒活疫苗、化學(xué)疫苗、DNA疫苗等。研究表明這些疫苗的防病效果大大超過(guò)了抗生素、化學(xué)藥品等其它防治措施，但這些疫苗也存在一些問(wèn)題，如:免疫效果不穩(wěn)定、安全性較差、制備技術(shù)較差、成本較高等，因此這些疫苗在實(shí)際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用還存在一定的困難。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，研究一種嗜水氣單胞菌滅活疫苗，該種滅活疫苗，免疫效果穩(wěn)定，安全性好，且制作成本低，操作簡(jiǎn)便，適于批量生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方法實(shí)現(xiàn)的。(1)從患細(xì)菌性敗血病的病魚中分離出致病菌嗜水氣單胞菌a、無(wú)菌采取發(fā)病或?yàn)l死鯉魚的肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，觀察溶血情況并挑取單菌落接種于含1.5%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h進(jìn)行毒力因子的測(cè)定。c、選取分離菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)lS24h，用法國(guó)梅里埃產(chǎn)API細(xì)菌鑒定條進(jìn)行生化鑒定。d、先進(jìn)行16SrRNA基因序列測(cè)定，然后進(jìn)行序列同源性分析。e、根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測(cè)定的結(jié)果，并結(jié)合16SrRNA基因序列測(cè)定的結(jié)果，對(duì)供試菌進(jìn)行菌種歸類判定。(2)常規(guī)配制疫苗的方法將菌種接種于普通肉湯，180r/min、28°C搖床培養(yǎng)18h后，用0.2%福爾馬林滅活。采用常規(guī)方法進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，和疫苗的安全性檢測(cè)。(3)疫苗培養(yǎng)液條件的優(yōu)化a、培養(yǎng)溫度的選擇設(shè)3個(gè)組，于3瓶普通肉湯中分別接種嗜水氣單胞菌，然后分別于3個(gè)不同溫度，180r/min，搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)。b、培養(yǎng)方法的選擇設(shè)定2個(gè)組，于2瓶普通肉湯中分別接種嗜水氣單胞菌，然后分別于180r/min、28。C搖瓶培養(yǎng)18h和28。C恒溫箱靜置培養(yǎng)18h,然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)。c、培養(yǎng)基適宜pH的選擇設(shè)定7個(gè)組，將每組普通肉湯的pH值分別調(diào)整為7個(gè)不同的數(shù)值，然后接種嗜水氣單胞菌，180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)。d、培養(yǎng)源的優(yōu)化選擇設(shè)定5個(gè)組，每組普通肉湯分別加入不同的營(yíng)養(yǎng)源，然后接種嗜水氣單胞菌，180r/min、28。C搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)。(4)疫苗滅活a、疫苗滅活條件的選擇將菌種接種于普通肉湯中，180r/min、28°C搖床培養(yǎng)18h后，分成15組，設(shè)定不同的滅活溫度、不同滅活濃度滅活，于不同滅活時(shí)間檢測(cè)其滅菌效果和溶血價(jià)。b、滅活后菌液抗原損失程度的比較以滅活的菌液作抗原，以自制的嗜水氣單胞菌兔抗血清(1:2稀釋)作抗體，37°C濕盒中進(jìn)行瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)，以沉淀線的有、無(wú)、強(qiáng)、弱作為判斷抗原損失程度的依據(jù)。(5)最佳培養(yǎng)條件下的滅活疫苗的制備將菌種接種到加有1%胰蛋白胨、pH為7.5的普通肉湯中，180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h后，加0.2%甲醛，28°C培養(yǎng)12h，制得嗜水氣單胞菌全菌苗的滅活疫苗，采用常規(guī)方法進(jìn)行無(wú)菌檢査和安全性檢驗(yàn)。使用本疫苗，可有效預(yù)防和控制淡水魚細(xì)菌性敗血病的爆發(fā)和流行，降低魚的死亡率，從而給淡水魚養(yǎng)殖業(yè)減少經(jīng)濟(jì)損失。具體實(shí)施例方式下面根據(jù)實(shí)施例和應(yīng)用例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1(1)從患細(xì)菌性敗血病的病魚中分離出致病菌嗜水氣單胞菌a、無(wú)菌采取發(fā)病或?yàn)l死鯉魚的肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h,挑取單個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上典型菌落為圓形，無(wú)色或淺黃色，半透明，表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，無(wú)水溶性色素。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)。普通光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短小桿菌，菌體兩端鈍圓或平直，多數(shù)單個(gè)排列，少數(shù)2個(gè)排列，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，可見(jiàn)血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，典型菌落中1.52.0mm，菌落圓形、濕潤(rùn)、光滑、無(wú)色、透明，呈露水珠樣，邊緣整齊，菌落周圍有透明溶血環(huán)，呈明顯的e溶血。并挑取單菌落接種于1.5%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h菌落周圍均出現(xiàn)清晰溶蛋白圈。c、選取分離菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)lS24h，用法國(guó)梅里埃產(chǎn)API細(xì)菌鑒定條進(jìn)行生化鑒定(見(jiàn)表l)。表1分離菌株生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>d、先進(jìn)行16SrRNA基因序列測(cè)定，然后通過(guò)經(jīng)比對(duì)，同源性為99%。e、根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測(cè)定的結(jié)果，并結(jié)合16SrRNA基因序列測(cè)定的結(jié)果，判定供試菌種為嗜水氣單胞菌。(2)常規(guī)配制疫苗的方法將菌種接種于普通肉湯，180r/min、28°C搖床培養(yǎng)18h后，用0.2%福爾馬林滅活。采用常規(guī)方法進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和疫苗的安全性檢測(cè)。經(jīng)培養(yǎng)獲得的細(xì)菌培養(yǎng)液，滅活后無(wú)菌檢查無(wú)菌、無(wú)溶血。安全檢査合格。(3)疫苗培養(yǎng)液條件的優(yōu)化a、培養(yǎng)溫度的選擇設(shè)定3個(gè)組，于3瓶普通肉湯中分別接種嗜水氣單胞菌，然后分別于3個(gè)不同溫度，180r/min，搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)(見(jiàn)表2)。表2不同溫度時(shí)的OD值和溶血效價(jià)培養(yǎng)溫度/'c202837OD值1.1121.2860.192溶血價(jià)262722b、培養(yǎng)方法的選擇設(shè)定2個(gè)組，于2瓶普通肉湯中分別接種嗜水氣單胞菌，然后分別于180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h和28°C恒溫箱靜置培養(yǎng)18h,然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)(見(jiàn)表3)。表3不同培養(yǎng)方法時(shí)的OD值和溶血效價(jià)培養(yǎng)方法靜置培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)OD值1.2861.804溶血價(jià)272,2c、培養(yǎng)基適宜pH的選擇設(shè)定7個(gè)組，將每組普通肉湯的pH值分別調(diào)整為7個(gè)不同的數(shù)值，然后接種嗜水氣單胞菌，180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)(見(jiàn)表4)。表4不同pH值時(shí)的OD值和溶血效價(jià)pH值5.06.06.57.07.58.09,0OD值2.0102.1102.0712.0382.2321.9591.590溶血價(jià)2122132I221221421229d、培養(yǎng)源的優(yōu)化選擇設(shè)定5個(gè)組，每組普通肉湯，分別加入不同的營(yíng)養(yǎng)源，然后接種嗜水氣單胞菌，180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h，然后測(cè)其OD值和溶血價(jià)(見(jiàn)表5)。表5不同營(yíng)養(yǎng)源時(shí)的OD值和溶血效價(jià)^1%葡萄1%胰蛋~~i%酵母營(yíng)養(yǎng)源i%乳糖l%蔗糖糖白胨浸膏OD值溶血價(jià).176.149.1892.3812.2562"(4)疫苗滅活a、疫苗滅活條件的選擇將菌種接種于普通肉湯中，180r/min、28°C搖床培養(yǎng)18h后，分成15組，設(shè)定不同的滅活溫度、不同滅活濃度滅活，于不同滅活時(shí)間檢測(cè)其滅菌效果和溶血價(jià)(見(jiàn)表6)。表6不同滅活條件下的滅菌效果滅活溫度('c)2837甲醛濃度(%)滅活時(shí)間Oi)o.i0.20.30.40.50.10.20.30.40.50.10.20.30.4612243648有菌、有溶有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)有菌、有溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)溶無(wú)菌、無(wú)無(wú)菌、無(wú)0.5血環(huán)血環(huán)血環(huán)溶血環(huán)溶血環(huán)b、滅活后菌液抗原損失程度的比較以滅活的菌液作抗原，以自制的嗜水氣單胞菌兔抗血清(1:2稀釋)作抗體，37°C濕盒中進(jìn)行瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn),以沉淀線的有、無(wú)、強(qiáng)、弱作為判斷抗原損失程度的依據(jù)。經(jīng)過(guò)比較，滅活溫度28°C，滅活12h，滅活濃度為0.2%甲醛所得疫苗的沉淀線最強(qiáng)。(5)最佳培養(yǎng)條件下的滅活疫苗的制備將菌種接種到加有1%胰蛋白胨、pH為7.5的普通肉湯中，180r/min、28°C搖瓶培養(yǎng)18h后，加0.2%甲醛，28°C培養(yǎng)12h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，采用常規(guī)方法進(jìn)行無(wú)菌檢查，再用嗜水氣單胞菌全菌苗雙倍濃度腹腔注射6尾鯉魚進(jìn)行安全檢驗(yàn)。用722分光光度計(jì)測(cè)得此種培養(yǎng)方法所得菌液的濃度為8.3xlO"cfli/mL。滅活后無(wú)菌檢查無(wú)任何菌落，也無(wú)溶血環(huán)，安全檢查結(jié)果6尾鯉魚均無(wú)任何異樣。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，所不同的僅僅是用冷凍干燥機(jī)將液體疫苗制成固體粉末狀疫苗。應(yīng)用例隨機(jī)抽取2025g的健康魚100條，暫養(yǎng)2周后分成3組，以腹腔注射方式免疫。兩免疫組為腹腔注射O.lmL濃度為3.0xl08的滅活疫苗，對(duì)照組腹腔注射O.lmL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)過(guò)程養(yǎng)殖條件相同。兩周后，進(jìn)行第二次免疫。在加強(qiáng)免疫4周后，分別以LD50、10LD5()嗜水氣單胞菌攻擊兩免疫組魚，對(duì)照組以LD5Q嗜水氣單胞菌攻擊，同樣環(huán)境養(yǎng)殖7天，觀察死亡魚數(shù)，計(jì)算各組魚的相對(duì)存活率。l一免疫組死亡率相對(duì)存活率(RPS)=------------------------------x100%對(duì)照組死亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果是對(duì)照組魚全部死亡，以LD5Q嗜水氣單胞菌攻擊的免疫組相對(duì)存活率為91%,以10LD5o嗜水氣單胞菌攻擊的免疫組相對(duì)存活率為82%。說(shuō)明本發(fā)明嗜水氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果較好，能有效預(yù)防和控制魚的細(xì)菌性敗血病的爆發(fā)和流行。權(quán)利要求1、一種嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，其特征為從患病魚中以無(wú)菌手續(xù)提取其病原菌嗜水氣單胞菌菌種，復(fù)壯后制備菌懸液。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述之嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，先從患病魚中分離出其致病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、毒力因子、生化反應(yīng)和基因測(cè)序確定其為嗜水氣單胞菌，將此菌種經(jīng)魚體進(jìn)行復(fù)壯后，選擇最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)，再選擇最佳滅活條件進(jìn)行滅活，其特征在于以pH為7.5、1%胰蛋白胨肉湯在28'C、180r/min振蕩培養(yǎng)的菌液最佳；以0.2%甲醛在28'C恒溫培養(yǎng)箱滅活12h的疫苗抗原性最強(qiáng)，無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)合格。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述之嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，其特征在于所用培養(yǎng)液為pH為7.5、1%胰蛋白胨肉湯。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述之嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，其特征在于菌液最佳培養(yǎng)條件為28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述之嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，其特征在于用0.2%甲醛進(jìn)行滅活。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述之嗜水氣單胞菌的滅活疫苗，其特征在于菌液最佳滅活條件為在28°C恒溫培養(yǎng)箱滅活12h，其間要振搖3次。全文摘要本發(fā)明涉及魚用疫苗及其制備方法，具體說(shuō)是一種嗜水氣單胞菌滅活疫苗及其制備，具體為先從患病魚中分離出其致病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、毒力因子、生化反應(yīng)和基因測(cè)序確定其為嗜水氣單胞菌，再將此菌種經(jīng)復(fù)壯，選擇最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)，再選擇最佳條件滅活，制成嗜水氣單胞菌疫苗，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)合格。本發(fā)明采用從患病魚體中分離的病原菌株制備滅活疫苗，操作方法簡(jiǎn)便，且針對(duì)性保護(hù)作用非常強(qiáng)，免疫效果好。制備本發(fā)明的滅活疫苗，所用的材料成本低，適于批量生產(chǎn)。本發(fā)明為鯉魚細(xì)菌性敗血病的防治提供了切實(shí)可行的方法。文檔編號(hào)A61K39/02GK101642567SQ20091000366公開(kāi)日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年1月14日優(yōu)先權(quán)日2009年1月14日發(fā)明者史相國(guó),張玉芬,張秀軍申請(qǐng)人:張秀軍;張玉芬;史相國(guó)