專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種牛舌草總黃酮提取純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種維吾爾藥的提取方法，具體涉及牛舌草總黃酮的提取、純化和干燥方法。
背景技術(shù)：
：牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草AnchusaitaliceRetz.或琉璃苣Bomgeo伍cinalesL.的地上部分。夏季花盛期，一般割取地上部分曬干。氣微芳香，味淡，具粘性，是維吾爾醫(yī)治心腦血管疾病的常用藥材之一，具有生濕生熱、調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)、生濕補(bǔ)腦、祛寒補(bǔ)心、雙薪悅智、潤(rùn)燥消炎、止咳平喘等功效。牛舌草的這些作用與其黃酮類(lèi)成分有密切關(guān)系。研究表明黃酮類(lèi)化合物具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗病毒、消炎、降壓和清熱解毒等作用。由于黃酮類(lèi)化合物的這些生物活性使得對(duì)它的研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段，因此，牛舌草總黃酮的研究開(kāi)發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。另外，牛舌草總提取物成分復(fù)雜，因含有較多的糖類(lèi)而具有吸濕性，容易凝結(jié)，顆粒粗、黑，難以選擇劑型。因此對(duì)牛舌草總黃酮進(jìn)行純化，使純化后的產(chǎn)品符合中藥新劑型的需要具有重要的意義。傳統(tǒng)的總黃酮提取方法有熱水提取法、醇提法、其它有機(jī)溶劑萃取法。其中熱水提取法收率很低，并且由于其極性大，易把蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽等易溶于水的成分提取出來(lái)，因此易霉變，一般提取液存放10天左右就會(huì)有發(fā)霉、變質(zhì)現(xiàn)象，提取液過(guò)濾、濃縮等操作困難且又費(fèi)時(shí)，黃酮含量低。醇提是提取總黃酮最常用的方法。包括冷浸法、滲流法和回流法。冷浸法雖不需加熱，但提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低。滲流法提取效率高、浸液雜質(zhì)少，但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，溶劑用量大，操作麻煩?；亓鞣ㄐ首罡?，但受熱易破壞藥材的成分，不宜用此法。其它有機(jī)溶劑萃取法，這種方法設(shè)備簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率高，但產(chǎn)品中雜質(zhì)含量較高，有機(jī)溶劑成本也較高。本研究采用30%50%乙醇為提取劑，電磁波加熱，減壓回流提取，提取物冷凍干燥，可減少提取物活性成分的損失，提高提取效率和收率，節(jié)約溶劑。利用大孔樹(shù)脂純化提取物，可以提高黃酮活性成分純度和保存期限，使純化后的產(chǎn)品符合中藥新劑型的需要，并在臨床和醫(yī)藥行業(yè)中得到應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種牛舌草總黃酮的提取、純化和黃酮類(lèi)提取物的干燥方法。本發(fā)明提供了一種牛舌草總黃酮的提取方法，由以下具體步驟組成-1)取粉碎的牛舌草，以60%乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量1020倍量的30%50%乙醇為提取劑，加熱至回流提取，收集提取液，減壓回收乙醇，得濃縮液；2)將步驟1得到的提取液濃縮到每毫升含提取物22.5mg,過(guò)濾，濾液用HPD-100或HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，工藝條件為上樣吸附時(shí)間為02.0h小時(shí)，水洗體積為1BV3BV，水洗流速為lBV/h4BV/h，洗脫劑為乙醇，洗脫用乙醇濃度為50%90%，乙醇洗脫量為1.5BV4BV，乙醇洗脫速度為lBV/h4BV/h。3)收集步驟2的乙醇洗脫液，真空冷凍干燥，收集干燥提取產(chǎn)物，封口，稱(chēng)重，置于干燥處。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法步驟1中的加熱方式選取電磁爐加熱，功率為500W1200W，優(yōu)選800W。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法步驟l中的回流方式為減壓回流，壓力條件〈20Pa,提取時(shí)間為13小時(shí)，優(yōu)選提取時(shí)間為2小時(shí)。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法步驟1中優(yōu)選條件以60%乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量15倍量的40%乙醇為提取劑，用功率為800W的電磁爐加熱，減壓至20Pa回流提取2小時(shí)。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法步驟2中優(yōu)選DIOI大孔樹(shù)脂對(duì)濾液進(jìn)行純化，優(yōu)選工藝條件為上樣吸附時(shí)間為1.0小時(shí)，水洗體積為2BV，水洗流速為2BV/h，洗脫劑為乙醇，洗脫用乙醇濃度為70%，乙醇洗脫量為3BV，乙醇洗脫速度為2BV/h。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法步驟3中冷凍干燥機(jī)的真空度小于20Pa，冷凝溫度為-40-60'C，優(yōu)選-50'C。本發(fā)明提供的牛舌草總黃酮提取方法，獲得牛舌草提取物的總黃酮質(zhì)量含量>55%,總黃酮轉(zhuǎn)移率>90%。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.減少提取物活性成分的損失。牛舌草有效活性成分對(duì)熱不穩(wěn)定，本發(fā)明以合適濃度乙醇為溶劑，采用電磁波加熱，且減壓回流，提取溫度低，從而減少了因過(guò)熱而引起的提取物活性損失。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)提取物采用冷凍干燥，能夠很好的保持提取物的有效活性。2.本發(fā)明所采用的提取方法可以提高提取效率和收率，節(jié)約溶劑。3.本發(fā)明以乙醇為溶劑和洗脫劑，價(jià)廉、無(wú)毒。4.本發(fā)明采用D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化。該樹(shù)脂價(jià)格較低，而且安全性較高，是目前國(guó)內(nèi)藥品行業(yè)中使用最多的一種大孔樹(shù)脂。5.本發(fā)明獲得牛舌草提取物中的總黃酮質(zhì)量含量>55%，總黃酮轉(zhuǎn)移率>90%。圖1為吸附時(shí)間對(duì)總黃酮回收率和純度的影響。圖2為洗脫劑濃度對(duì)總黃酮回收率的影響。圖3為70%乙醇對(duì)牛舌草總黃酮的洗脫曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施方式-.本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1本發(fā)明的一種牛舌草總黃酮的提取方法1)取粉碎的牛舌草100g，以60%乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量15倍量的40%乙醇為提取劑，用功率為800W的電磁爐加熱，減壓至20Pa回流提取2小時(shí)，收集提取液，過(guò)濾，減壓回收乙醇，濃縮至每毫升含提取物22.5mg。2)將牛舌草濃縮提取液上柱，控制流出液流速為lBV/h，至提取液全部進(jìn)入樹(shù)脂床，靜置1小時(shí)，讓其充分吸附。以2BV體積的去離子水沖洗樹(shù)脂床，控制流出液流速為2BV/h，以除去未被樹(shù)脂吸附部分，用3BV的70%乙醇洗脫，流速為2BV/h,收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，真空度小于20Pa，冷凝溫度為-5(TC，即得干燥的純化產(chǎn)物2.64g，總黃酮質(zhì)量含量為57.8%，總黃酮轉(zhuǎn)移率為92.8%。實(shí)施例2電磁爐工作功率對(duì)總黃酮提取的影響取粉碎的牛舌草三份，每份100g，以60%乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量15倍量的40%乙醇為提取劑，分別用功率為500W、800W、1200W的電磁爐加熱，減壓至20Pa回流提取2小時(shí)，收集提取液，過(guò)濾，減壓回收乙醇，濃縮至每毫升含提取物22.5mg，利用分光光度法，測(cè)吸光度計(jì)算總黃酮含量，由此得出總黃酮收量分別為2.28g、2.54g、2.56g。電磁爐工作功率為800W和1200W時(shí)總黃酮收量分別為2.54g、2.56g,為節(jié)約用電，優(yōu)選800W。實(shí)施例3減壓回流提取的時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響取粉碎的牛舌草三份，每份100g，以60%乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量15倍量的40%乙醇為提取劑，用功率為800W的電磁爐加熱，分別減壓至20Pa回流提取1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)，收集提取液，過(guò)濾，減壓回收乙醇，濃縮至每毫升含提取物22.5mg，利用分光光度法，測(cè)吸光度計(jì)算總黃酮含量，由此得出總黃酮收量分別為2.34g、2.54g、2.60g。當(dāng)提取時(shí)間為3小時(shí)時(shí)總黃酮收率最高，考慮到收率和節(jié)約問(wèn)題，優(yōu)選提取時(shí)間為2小時(shí)。實(shí)施例4總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)分別稱(chēng)取9份粉碎牛舌草，每份100g，用60%乙醇浸泡12小時(shí)后，按表l的因素水平分別進(jìn)行正交試驗(yàn)，均提取1次，收集提取液，過(guò)濾，減壓濃縮，真空冷凍干燥至恒重，并采5用分光光度法測(cè)量提取物中總黃酮的含量，通過(guò)該指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表2。表1牛舌草總黃酮提取工藝因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上述正交表中各數(shù)據(jù)，可以看出，正交實(shí)驗(yàn)中四因素對(duì)結(jié)果的影響大小依次為提取時(shí)間>乙醇濃度>乙醇用量>電磁爐功率，由數(shù)據(jù)可以得出提取時(shí)間為顯著影響因素，其最佳提取條件為A2B2C1D2。即減壓回流提取2小時(shí)、40%乙醇、15倍乙醇用量、電磁爐功率800W。實(shí)施例5五種樹(shù)脂對(duì)牛舌草總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)稱(chēng)取lg干樹(shù)脂，分別裝入100ml錐形瓶中，各加入濃度為13.45mg/ml的樣品溶液20ml。每隔10min振蕩10s，持續(xù)2h，靜置24h，使其達(dá)到飽和吸附，抽濾，取濾液l.Oml，利用分光光度法求得樣品的黃酮含量。按下式計(jì)算樹(shù)脂吸附量-吸附量=[初始質(zhì)量濃度-剩余質(zhì)量濃度]x溶液體積/樹(shù)脂量將濾出的樹(shù)脂另置100ml錐形瓶中，加入70o/。乙醇20ml，每隔10min振蕩10s，持續(xù)2h，抽濾，取濾液l.Oml，利用分光光度法求得樣品的黃酮含量。按下式計(jì)算解吸率(％):解吸率=[解吸液濃度x解吸液體積]/吸附量><100%表3五種樹(shù)脂靜態(tài)飽和吸附量及靜態(tài)洗脫率測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過(guò)表3可知，HPD-400的吸附量最大，D101其次，兩者的差距很小，解吸率也相近，但DIOI—般用作黃酮類(lèi)化合物的吸附，故選擇DIOI型吸附樹(shù)脂。實(shí)施例6沖洗雜質(zhì)用水體積稱(chēng)取已處理的D101型樹(shù)脂3份(每份相當(dāng)于干樹(shù)脂8g)，濕法裝柱，上柱黃酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速為lBV/h，至提取液全部進(jìn)入樹(shù)脂床，靜置1小時(shí)，讓其充分吸附，分別用1BV、2BV、3BV蒸餾水以2BV/h的速度沖洗，繼續(xù)用3BV的70%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集洗脫液，測(cè)其吸光度，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果表明總黃酮回收率分別為89.3%、88.7%、89.4%,總黃酮的純度分別為45.3%、45.7%、44.3%'數(shù)據(jù)結(jié)果表明洗脫水用量對(duì)總黃酮回收率和純度無(wú)明顯影響。為減少洗脫用水，縮短洗脫時(shí)間且充分沖洗雜質(zhì)，選擇2BV為洗脫雜質(zhì)用水量。實(shí)施例7洗脫劑流速對(duì)純化的影響稱(chēng)取已處理的D101型樹(shù)脂3份(每份相當(dāng)于干樹(shù)脂8g)，濕法裝柱，上柱黃酮提取液50ml(22.5mg/ml),控制流出液流速為lBV/h，至提取液全部進(jìn)入樹(shù)脂床，靜置1小時(shí)，讓其充分吸附，以2BV蒸餾水，2BV/h速度沖洗后，以3BV的70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速分別為lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h，純化后總黃酮回收率分別為95,23%，94.47%，92.19%，89.67%。洗脫劑流速lBV/h比2BV/h的回收率高，但相差不大，為了提高效率，洗脫劑流速選擇2BV/h。實(shí)施例8D101大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫實(shí)驗(yàn)洗脫用醇的體積稱(chēng)取已處理的D101型樹(shù)脂3份(每份相當(dāng)于干樹(shù)脂8g)，濕法裝柱，上柱黃酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速為lBV/h，至提取液全部進(jìn)入樹(shù)脂床，靜置1小時(shí)，讓其充分吸附，以2BV蒸餾水，2BV/h速度沖洗后，分別用2BV、3BV、4BV的70%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集洗脫液，測(cè)吸光度計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果表明總黃酮的回收率分別為87.6%、93.4%、95.2%。洗脫用量過(guò)多會(huì)增加洗脫時(shí)間，同時(shí)造成一定的浪費(fèi)，故選擇3BV的70%乙醇進(jìn)行洗脫。實(shí)施例9吸附時(shí)間對(duì)總黃酮回收率的影響取五根相同規(guī)格的玻璃色譜柱，稱(chēng)取已處理的D101型樹(shù)脂3份(每份相當(dāng)于干樹(shù)脂8g)，濕法裝柱，上柱黃酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速為lBV/h，吸附時(shí)間分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0h，以2BV蒸餾水，2BV/h速度沖洗后，用3BV的70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為2BV/h。收集洗脫液，測(cè)其總黃酮含量，計(jì)算總黃酮回收率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，吸附時(shí)間超過(guò)1.0小時(shí)時(shí)，回收率明顯下降，被樹(shù)脂吸附的部分黃酮化合物難以被洗脫。吸附時(shí)間為零時(shí)總黃酮的回收率最高，但純化效果不好，除黃酮以外的其它成分也未充分吸附，導(dǎo)致黃酮的純度不高，僅有37.5%。當(dāng)吸附時(shí)間為l.O小時(shí)時(shí)總黃酮的純度最高，為55.3%，故吸附時(shí)間宜為l.O小時(shí)。實(shí)施例10洗脫劑濃度對(duì)總黃酮回收率的影響稱(chēng)取已處理的D101型樹(shù)脂3份(每份相當(dāng)于干樹(shù)脂8g)，濕法裝柱，上柱黃酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速為lBV/h，吸附lh，以2BV蒸餾水，2BV/h速度沖洗后，分別用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的3BV乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，流速為2BV/h。收集洗脫液，測(cè)定黃酮的吸光度并計(jì)算總黃酮的回收率。隨著乙醇濃度的增加，總黃酮的回收率逐步增加，當(dāng)高于50%時(shí)趨于緩和。90%時(shí)最高，但耗費(fèi)太大，且當(dāng)乙醇濃度為50%、70%、90%時(shí)，總黃酮的純度分別為48.6%,58.3%,54.1%,宜選乙醇溶液濃度為70%。實(shí)施例11乙醇對(duì)牛舌草總黃酮的洗脫實(shí)驗(yàn)。權(quán)利要求1.一種牛舌草總黃酮提取物的提取方法，其特征是提取步驟為1)取粉碎的牛舌草，以60％乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量10～20倍量的30％～50％乙醇為提取劑，加熱至回流提取，收集提取液，減壓回收乙醇，得濃縮液；2)將步驟1得到的提取液濃縮到每毫升含提取物22.5mg，過(guò)濾，濾液用HPD-100或HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，工藝條件為上樣吸附時(shí)間為0～2.0小時(shí)，水洗體積為1BV～3BV，水洗流速為1BV/h～4BV/h，洗脫劑為乙醇，洗脫用乙醇濃度為50％～90％，乙醇洗脫量為1.5BV～4BV，乙醇洗脫速度為1BV/h～4BV/h；3)收集步驟2的乙醇洗脫液，真空冷凍干燥，得干燥的純化產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求1所述的牛舌草總黃酮提取物的提取方法，其特征是所述步驟1中的加熱方式為電磁爐加熱，功率為500W1200W。3.如權(quán)利要求1所述的牛舌草總黃酮提取物的提取方法，其特征是所述步驟1中的回流方式為減壓回流，壓力條件小于20Pa，提取時(shí)間為13小時(shí)。4.如權(quán)利要求1所述的牛舌草總黃酮提取物的提取方法，其特征是所述歩驟3中冷凍干燥機(jī)的真空度小于20Pa，冷凝溫度為-40-6(TC。5.如權(quán)利要求1所述的牛舌草總黃酮提取物的提取方法，其特征是獲得牛舌草提取物中的總黃酮質(zhì)量含量>55%,總黃酮轉(zhuǎn)移率>90%。全文摘要本發(fā)明涉及一種牛舌草總黃酮成分的提取純化工藝，提取步驟為1)取粉碎的牛舌草，以60％乙醇為溶劑，浸泡12小時(shí)，以藥材質(zhì)量10～20倍量的30％～50％乙醇為提取劑，用功率為500～1200W的電磁爐加熱，減壓至小于20Pa回流提取1～3小時(shí)，收集提取液，減壓回收乙醇，得濃縮液；2)將步驟1得到的提取濃縮液用大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，乙醇溶液洗脫；3)收集步驟2的乙醇洗脫液，濃縮，真空冷凍干燥，得產(chǎn)品。本發(fā)明用電磁波加熱，減壓回流提取，冷凍干燥，對(duì)活性成分損害少，節(jié)約提取劑。同時(shí)，用本發(fā)明方法提取的牛舌草提取物產(chǎn)品中總黃酮質(zhì)量含量可達(dá)55％以上，其總黃酮轉(zhuǎn)移率可達(dá)90％以上，且重現(xiàn)性好，樹(shù)脂可重復(fù)使用。文檔編號(hào)A61K36/185GK101584752SQ200910016999公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年7月9日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者霞孟,段洪東,王世瀟,秦大偉申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院