專利名稱：：刺參腐皮綜合征的抗菌免疫雙效復方中草藥的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于防治養(yǎng)殖刺參重大疾病的專用藥物，是一種對刺參腐皮綜合征的抗菌免疫雙效復方中草藥。
背景技術：
：21世紀初，刺參養(yǎng)殖在我國北方沿海蓬勃發(fā)展，年產值超過200億元，成為我國第五次海水養(yǎng)殖浪潮的主體。由于刺參養(yǎng)殖規(guī)4莫迅速擴展，病害防治等配套技術相對滯后，加上生產過程中的不規(guī)范操作，導致病害問題日趨嚴重，每年因病害暴發(fā)造成的年經濟損失超過30億元，其中以刺參"腐皮綜合征"造成的危害最為嚴重，是導致我國刺參大面積死亡的最重要疾病。為治療和預防水產動物疾病，傳統(tǒng)防治方法是使用化學消毒劑、抗生素，且已有30多年的歷史；因長期使用，不僅病原的抗藥性越來越明顯，而且其藥物殘留也日趨嚴重，造成疾病難以治愈，水產品質量安全受到影響；疫苗也是預防動物傳染性疾病一個有效的辦法，^f旦有針對性強、作用范圍小等缺陷，對于主務農靠非特異性免疫系統(tǒng)的低等無脊推動物(如對蝦、刺參、貝類等)作用有限，而且使用操作也很不方便，難以推廣應用。在本發(fā)明形成之前，關于養(yǎng)殖刺參"腐皮綜合征"的報道主要集中在流行病學、病原學和組織病理學等方面的研究上。本發(fā)明人率先開展了我國海參疾病的研究，并且于2004年命名了養(yǎng)殖海參重大疾病"腐皮綜合征"。腐皮綜合征俗稱"化皮病"，其主要癥狀包括厭食、搖頭、肺嘴、排臟、口腫潰爛、身體萎縮、體表大面積潰瘍，1—2周內死亡率達到80%,其病傳染性強，波及面廣。該病致病原具有多樣性，已報道的有4種，分別為杣爛弧菌(r/6r/o^7/e/力'^^)、<叚交替單胞菌(/^ei/fl^a/fei7/Z7aoa//^r/尸ac/e/7i1)、哈纟,氏f瓜菌(P76r/o力ari/e//)、惡臭,i單J包菌G^e〃^/z70/as;w〃^s),其發(fā)病癥狀和主要病原詳見表1。表l:養(yǎng)殖刺參"腐皮綜合征"的發(fā)病癥狀和主要病原:采樣時間采樣地點發(fā)病癥狀病原菌報道者2003.04青島地區(qū)兩個發(fā)病養(yǎng)殖場感染刺參厭食、搖頭、腫嘴、排臟、口腫潰爛、身體萎縮、體表大面積潰瘍，l-2周內個別參池的死亡率達到80%杣爛弧菌張春云、王印庚、榮小軍2004.11-2005.01山東省牟平、即墨、膠南地區(qū)3家發(fā)病刺參養(yǎng)殖場初期感染刺參搖頭，口部腫脹，繼而大部分刺參會出現(xiàn)排臟現(xiàn)象；中期感染刺參身體萎縮、僵直，口腹部先出現(xiàn)小面積潰瘍，形成藍白色斑點；末期感染刺參的體壁潰瘍處增多，表皮大面積腐爛，最后溶為鼻弟狀"交體假交替單胞菌(尸.刀/gi"/尸ac7'e"i1)王印庚、方波、張春云、榮小軍2005年春山東省萊州市金城鎮(zhèn)發(fā)病初期患病刺參的口部或膽門部位的皮膚上有小白點，部分刺參有吐腸的現(xiàn)象，刺參活動性降低；而后這個白點的范圍迅速擴大，3天內刺參就會出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；5天內刺參全部腐爛變成一堆白色鼻沐樣黏液假交替單胞菌孟慶國、吳劉記、吳信忠、楊建波2006.01-2006.05青島即墨市和;成陽區(qū)胂嘴、搖頭、排臟、體表藍白色潰爛，身體萎縮，最終解體死亡惡臭假單胞菌(戶.pu〃cfe)王印庚、黃華偉2006.07-2006.10青島即墨市和i成陽區(qū)腫嘴、排臟、身體微縮，體表出現(xiàn)藍白色潰爛繼而解體死亡。解剖發(fā)現(xiàn)未排臟的病參其腸道呈橘紅色，體內壁呈乳白色近乎潰爛狀哈維氏弧菌(K-Aarreja')王印庚、黃華偉迄今為止，國內針對刺參"腐皮綜合征"防治藥物的研究報道主要是抗生素。用中草藥進行口服治療的有關報道，僅見有李華等"治療刺參細菌性化皮病的中草藥復方制劑"(專利申請?zhí)?00810012641.3)，未見該配方具有提高海參免疫力和預防化皮病的效果及相關報道。
發(fā)明內容:本發(fā)明目的是提供一種復方中草藥，解決其復方中草藥的技術問題，使該復方的使用能有效提高刺參免疫力、并同時具備抑制刺參"腐皮綜合征"多種病原菌的功能，提高刺參養(yǎng)殖存活率。本發(fā)明所采用的技術方案是藥物成分及配比為藥物成分為穿心蓮、大青葉、金銀花和川芎，藥物呈粉末狀，粒度200目；藥物按重量配比為2:1:3:2。月良用方式口月l。藥物用量是口服預防或治療輕癥用量，每公斤飼料添加20g藥粉，口服治療重癥用量為每公斤飼料添加30g藥粉。使用方法是在口服預防和治療使用時，均按照上述用量稱取藥物，與海參飼料攪拌均勻后投喂，每日損:喂1次，連續(xù)20天為一個療程。本發(fā)明復方具有以下特點1、本發(fā)明是在對腐皮綜合征多種致病原進行單方、復方藥效學分析和海參免疫作用的勤出上研制而成，具有提高刺參免疫、高效抗菌雙效特點。2、本發(fā)明所配制的刺參"腐皮綜合征"專用藥物，在幼參期和成參期均可以使用，對已患病刺參的治愈率可達到80°/。以上，存活率達到85%以上。3、使用操作方法筒便，只需按比例將藥物添加到飼料中進行投喂即可，適用于幼參培育和養(yǎng)殖生產疾病控制。4、復方成分采用綠色、無毒副作用的中草藥，價格低廉。使用本發(fā)明可減少或替代抗生素的使用，對養(yǎng)殖刺參的商品質量和食品安全具有保障作用。圖1:體腔液中石威性磷酸酶(AKP)的變化；[]空一表示為空白對照，只投喂基礎飼料；圈葡一表示為1°/。p-l、3-葡聚糖為陽性對照；図高一表示為3%復方中草藥；図中一表示為1%復方中草藥；圈低一表示為0.5%復方中草藥。圖2:體腔液中酸性磷酸酶(ACP)的變化。具體實施例方式本發(fā)明是在對腐皮綜合征多種致病原進行單方、復方藥效學分析和海參免疫作用的基礎上研制而成，具有抗菌免疫雙效特點。下面以實施實例結合附圖詳細敘述本發(fā)明的技術內容一、本發(fā)明藥物成分的篩選及配比的確定1、藥物的篩選和處理才艮據(jù)中藥藥性，選用蒼術、大黃、馬齒莧、甘草、穿心蓮、大青葉、魚腥草、當歸、金銀花、五加皮、杜仲、淫羊藿、秦皮、川穹、柴胡、茯茶、黃柏、地榆、黨參、五倍子、板藍根和黃茶24種中草藥干粉，依次編號為H-l、H—2、H-3……H-24。中草藥干粉通過200目過篩后，各稱取5g,分別加入約50。C蒸餾水，即350mL,浸泡2小時后，用大火加熱至沸騰，再小火熬制90min;濃縮至50mL時，用8層消毒紗布濾出藥液，最后用雙層濾紙加壓過濾，即制成0.lg/mL濃度的中草藥原液，12rC滅菌20min備用。用無菌的96孔酶標板(有96個孔的透明塑料板，每孔最大工作容積約為250juL)其中的7個加樣孔加測定中草藥原液(0.lg/mL),用液體TSB(TSB為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術有限公司)進行2倍遞進稀釋，然后每孔中加5mL0.5%紅四氮唑指示劑，用于指示細菌生長與否。27。C濕盒中搖床培養(yǎng)6-8h，有菌生長者其對應酶標板孔中液體呈現(xiàn)紅色，無顏色變化者的最低抑菌濃度即為MIC值。對于因中草藥本身帶顏色而影響判斷者，用無菌棉簽蘸取酶標板孔中的混合液涂布于TSB平板上(TSB為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，既可以配置成固體平板培養(yǎng)基，也可以配置成液體培養(yǎng)基)，直接采取培養(yǎng)法觀察細菌生長與否來判斷藥物的藥效和最低抑菌濃度，見表2。結果顯示，單方中草藥H-5(穿心蓮)、H-6(大青葉)、H-9(金銀花)和H-14(川芎)對4抹海參腐皮綜合征病原菌有良好抑菌效果，其MIC值分別為6.25、7.81、5.86和3.52mg/L。表2:24種單方中草藥水煎劑對4種細菌的最低抑菌濃度(mg/mL):<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>H-53.133.136.2512.50H-612.506.256.256.25H-712.5012.5050.0050.00H-825-0025.0050.0025.00H-91.563.136.2512.50H墨IO1.563.133.13>100.00H-ll25.0050—0050.0050.00H-1212.5012.5012.5050.00H-13>跳003.13〉100.0050.00H-141.563.133.136.25H-1525.0050.0025.0050.00H-1650,0012.5050.0050.00H-1712.5050.0050.00>100.00H-1850.0050.00〉100.0050.00H-1925.0025.0050.00〉100.00H-20>跳0050.00>100.00>100.00H-2112.5025.0050.0012.50H-2225.0025.0050.00>跳00H-2350.0012.5025.00>100.00H-2425.00〉100.0050.0050.002、抑菌圈測定取直徑約90mm的平底雙碟，注入經加熱融化的TSB7-9mL，均勻布于碟底，放置超凈工作臺，待其凝固后，在每一平底雙碟中等分置入內徑6.0士0.1mm,外徑7.8士0.1mm牛津杯，再倒入經加熱融化的TSB15-17mL,凝固后再用滅菌鑷子將牛津杯取出，便形成帶孔的培養(yǎng)基平板。待平板冷卻至室溫后，將菌懸液(lxlO、fU/mL)用滅菌棉簽在帶孔平板上均勻涂布，然后在孔中加入100|iL中草藥原液，每種中草藥同時做2個平行組，測定記錄抑菌圏大小(抑菌圈大小反映出藥物抑菌效果的大小)，取其平均值(取平均值可以消除實驗誤差。是選出4種單方中草藥的實驗勤出)。通過體外抑制"腐皮綜合征"病原菌試驗，從24種中草藥中篩選出有最好抑菌效果的4種單方中草藥，即穿心蓮、大青葉、金銀花、川芎，見表3。表3:24種單方中草藥水煎劑的抑菌圈測定單位(mm)叫爛弧菌假交替單胞菌哈維氏弧菌惡臭假單胞菌尸.//gW/"ac/e;s尸./w〃VsH-l0000H-20000H-30000H-40000H-516221616H-615181113H-701600H-811000H-91722170H-1014000H-110000H-1201500H-130000H-141718110H-150000H-1600016H-170000H-180000H-190000H-2001100H-2100011H-2201300H-2301400H-240000注因為牛津杯形成的孔大約為10mm，故抑菌圏直徑《10mm時值為0。然后再設計正交試驗，見表4，復方中草藥H-5(穿心蓮)、H-6(大青葉)、H-9(金銀花)、H-14(川芎)比例分別為20g、10g、30g和20g時，其抑菌圈平均直徑分別達最大值，即為15.25咖、12.67mm、13.50mm和13.25mm。復方最佳配比即為H-5:H-6:H-9:H-14=2:1:3:2。表4:復方配伍與抑菌效果分析表質量濃度-H-5H-6H-9H--14而(g/L)(mg/mL)(mm)(mg/mL)(mm)(mg/mL)(mm)(mg組)(mm)103.288.921.7912.672.718.422.458.67201.6415.252.499.752.6210.251.7813.25301.728.002.369.751.1913.501.8210.25注蔵表示MIC平均值，M表示抑菌圈直徑平均值。再進4亍體外抑菌試-驗，結果i正明，該復方(H-5:H-6:H-9:H-14=2:1:3:2)對4種致病菌的抑菌效果明顯，見表5。表5:復方中草藥對4種細菌的體外抑菌試驗:濃度1/161/321/641/1281/2561/512杣爛弧菌+++++-假交替單胞菌+++++-p合維氏弧菌++++--惡臭假單胞菌+++---"+，，表示該濃度下未生長細菌"-"表示該濃度下生長了細菌。二、藥物的實施實驗及效果1、免疫增強效果^r測試驗組2007年10月在山東煙臺天源水產有限公司海參養(yǎng)殖場，選擇健康海參個體，30-90g/頭，飼養(yǎng)于約35L大小的白色塑料箱中，加水20L。每箱祠養(yǎng)6頭，每組飼養(yǎng)3箱，試驗共分6組，試驗組用基礎祠料為大連豐源達鉺料有限公司生產的益參寶牌幼參專用配合伺料。每kg祠料中入穿心蓮、大青葉、金4艮花、川芎(質量比為2:1:3:2)復方中草藥，設定0.5%、1%、3%3個藥物濃度梯度，每個實驗組分別以0.5%、1°/和3%的0-1、3-葡聚糖為其陽性對照組，只投喂基礎祠料的為空白對照組，投喂飼料量按刺參體重的1%才更喂。水源為深井海水，平均水溫為16。C。早上虹吸法吸底，換水一次，傍晚投喂一次。試驗前暫養(yǎng)1周，前2天不投食，后5天4更喂^^祠料。試驗開始后，每5天采樣一次，每次撈取4頭刺參，各抽取0.3mL體腔液于離心管中，3小時內測定完畢離心管中體腔液石咸性磷酸酶(AKP)和酸性-疇酸酶(ACP)這2項與刺參免疫力高低相關的指標。由圖l可知，各組增強劑對刺參免疫增強效果有顯著差異。復方的高劑量添加組(3D從第5天開始，AKP小幅度升高，第10天，極顯著高于空白組(P〈0.01),第20天達峰值，是空白組的5.5倍，是初始值(第0天)的4倍，25天后開始下降，但仍高于空白組。中劑量組1%和低劑量組0.5%則表現(xiàn)平穩(wěn)。由圖2可知，高劑量添加組3%對刺參體腔液ACP影響最明顯，第IO天時，高劑量添加組使il顯著高于空白組(P〈0.01),隨后降低到低于空白組，但第25天時達峰值，顯著高于空白組(P〈0.05),同時顯著高于其他試驗組同期ACP值，極顯著高于初始值(P<0.01)。中劑量組與低劑量組在試一驗期間ACP活力與空白對照組相比差異不顯著。通過免疫實驗表明，復方中草藥在添加3%劑量下能夠顯著提高刺參的免疫力，即每公斤飼料中加入30g復方中草藥可獲得最佳免疫效果。2、藥物安全性測試分2個實驗組進行。實驗組1伺料中加入20%的復方中草藥(20g中草藥/80g祠料)，實驗組2飼料中加入25%中草藥(25g中草藥/75g飼料)，對照組只投喂基本飼料。每個實驗組設3個重復組，每個重復組有6頭刺參(30-90g/頭)。實驗前暫養(yǎng)2天不投飼料。實驗時將上述比例的中草藥加入流體飼料中(投喂流體飼料海參方可直接攝食)，攪拌均勻并浸泡2小時后投喂刺參，刺參養(yǎng)殖于白色塑料箱中。通過第2天刺參辨料剩余量及糞便情況確定刺參的進食狀況。試驗持續(xù)時間15天。結果表明各實驗組刺參無任何異常狀況，各比例添加藥物均沒有對刺參造成毒性影響，刺參攝食正常，生長良好。結論口服用藥進行疾病防治時，添加復方中草藥30g/kg飼料，即可提高海參免疫力，并對海參無毒副作用。三、應用本復方中草藥對山東地區(qū)6個不同養(yǎng)殖場患"腐皮綜合征，，刺參進行治療。效果如下表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>腫嘴，體表潰爛=2:1:3:2的配比3%伴詞投喂治療85%2007.12青島稚參，搖頭，腫嘴，有自溶穿心蓮大青葉金銀花川芎=2:1:3:2的配比3%伴祠投喂治療14天治愈率80%2008.1威海50-120g參，部分參體表爛透，部分排臟穿心蓮大青葉金銀花川芍=2:1:3:2的配比2%伴飼才殳喂治療20天治愈率90%2008.3日照稚參肉刺禿鈍，部分排臟穿心蓮大青葉金銀花川芎=2:1:3:2的配比2%伴祠投喂治療17天治愈率90%2008.2膠南腐皮綜合征高發(fā)期穿心蓮大青葉金銀花川芎=2:1:3:2的配比2%伴飼投喂預防20天未見發(fā)病，預防效果顯著2008.2蓬萊腐皮綜合征高發(fā)期穿心蓮大青葉金銀花川芎=2:1:3:2的配比2%伴飼投喂預防20天未見發(fā)病，預防效果顯著通過大量臨床防治試驗證明在腐皮綜合征高發(fā)期，以2%伴飼投喂預防，未見發(fā)病，其預防效果良好；癥狀較輕者以2%伴祠投喂，癥狀較重者以3%伴飼投喂，投喂治療20天內其治愈率為80-90%以上。臨床實踐過程中已在諸多養(yǎng)殖場進行了治療中試試一驗，防治效果顯著，為養(yǎng)殖單位挽回了大量的經濟損失。本發(fā)明開創(chuàng)了利用中草藥提高海參免疫力并同時有效抑制腐皮綜合征病原菌的先例，具有免疫、抗病雙效作用，可減少和取代抗生素的使用，對解決重大疾病"腐皮綜合征"，提高養(yǎng)殖成活率和產品質量，保障養(yǎng)殖生產穩(wěn)產、高產具有十分重要的意義。權利要求1、一種刺參腐皮綜合征的抗菌免疫雙效復方中草藥，其特征在于它的藥物成分為穿心蓮、大青葉、金銀花和川芎；藥物按重量配比為2∶1∶3∶2；藥物呈粉末狀，粒度200目。全文摘要一種刺參腐皮綜合征的抗菌免疫雙效復方中草藥，藥物成分為穿心蓮、大青葉、金銀花和川芎；藥物按重量配比為2∶1∶3∶2；藥物呈粉末狀，粒度200目。以口服方式防治刺參腐皮綜合征，預防或治療輕癥用量為每kg飼料添加20g藥粉，治療重癥用量為每kg飼料添加30g藥粉。使用時按所需用量稱取藥物，與刺參飼料攪拌均勻后投喂，每日1次，連續(xù)20天為一個療程；本發(fā)明是刺參腐皮綜合征的專用藥物，幼參期和成參期均可使用，在腐皮綜合征高發(fā)期其預防效果良好；對患病刺參2-3周內的治愈率達到80-90％，存活率達85％以上。該復方中草藥具有免疫、抗病雙效作用，無毒副作用，使用方法簡便，可減少或替代抗生素使用，適用于幼參培育和養(yǎng)殖生產疾病控制。文檔編號A61K36/355GK101623315SQ20091001717公開日2010年1月13日申請日期2009年7月28日優(yōu)先權日2009年7月28日發(fā)明者敏冷,廖梅杰,曲江波,王印庚,榮小軍,霞陳申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所