專利名稱：：水蛭酶解丙酮粉腸溶劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：中風(fēng)(apoplexy),是以突然暈倒、不省人事，伴口角歪斜、語(yǔ)言不利、半身不遂，或不經(jīng)昏仆僅以口歪、半身不遂為臨床主癥的疾病。因發(fā)病急驟，癥見(jiàn)多端，病情變化迅速，與風(fēng)之善行數(shù)變特點(diǎn)相似，故名中風(fēng)、卒中。本病發(fā)病率和死亡率較高，常留有后遺癥；近年來(lái)發(fā)病率不斷增高，發(fā)病年齡也趨向年輕化，因此，是威脅人類生命和生活質(zhì)量的重大疾患。現(xiàn)代研究表明，我國(guó)中風(fēng)死亡率已躍居世界第2位，并且還有上升趨勢(shì)。中風(fēng)治療費(fèi)用高，治愈率低，對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)危害極大。因此預(yù)防中風(fēng)發(fā)生比治療中風(fēng)意義更大。這正如仲景之所言"上工不治已病治未病。"水蛭(Leech)是一味藥性平和，祛瘀力強(qiáng)而不傷正的活血化瘀藥，具有多種活性成分。水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》"主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無(wú)子，利水道。"《本草綱目》"咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經(jīng)血分藥，故能通肝經(jīng)聚血。"現(xiàn)代臨床上用單味水蛭或配伍復(fù)方，使用煎劑、散劑、膠囊劑等劑型，通過(guò)內(nèi)服給藥治療心腦血管疾病療效顯著。但傳統(tǒng)的炮制提取、制備工藝方法，使得部分成分分解或無(wú)法提取出來(lái)，造成有效成分損失、藥效波動(dòng)，亟待研發(fā)穩(wěn)定且活性高的水蛭制劑以滿足現(xiàn)代醫(yī)療需求。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其穩(wěn)定性好，活性高，水蛭的有效成分損失少，最大程度地保留住了水蛭的藥用價(jià)值。本發(fā)明還提供了其制備方法，并公開(kāi)了其在制備治療/預(yù)防中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，是以水蛭干燥全體或鮮活水蛭為原料，通過(guò)以下制備方法得到的1)取水蛭干燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入l-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調(diào)節(jié)pH至7-9，按每lg水蛭干藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的復(fù)合酶，控制溫度40-6(TC，酶解2-12小時(shí)；3)酶解完后，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入l-5倍體積的丙酮，冷藏沉淀4-12小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，制備成腸溶制劑。所述腸溶制劑為腸溶片劑、腸溶膠囊劑、腸溶滴丸劑中的任一種。所述步驟(3)中丙酮用乙醇、甲醇或乙酸乙酯等有機(jī)溶劑替代。所述步驟(4)具體為將水蛭酶解丙酮粉與藥用輔料制備成顆?；蚱瑒┖?，再使用腸溶材料進(jìn)行包衣，得到腸溶制劑。所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑可以用來(lái)制備治療/預(yù)防中風(fēng)的藥物。本發(fā)明的發(fā)明人在近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)水蛭化學(xué)、藥理和臨床研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)提取、分離和純化得到較高純度抗凝血水蛭肽(AHT)，并對(duì)其體外抗自由基氧化作用，體內(nèi)腦缺血藥理藥效作用進(jìn)行了初步研究，并申請(qǐng)了發(fā)明專利一種水蛭提取物及其制備方法與應(yīng)用(專利申請(qǐng)?zhí)?00810138936.5)。但在后期研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該水蛭提取物活性治療活性隨純度的提高反而降低，且經(jīng)胃蛋白酶處理后活性也顯著降低。因此便用胰蛋白酶處理，制得水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明，水蛭酶解丙酮粉在預(yù)防中風(fēng)作用最高。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1:水蛭酶解丙酮粉的制備取水蛭干燥全體粉碎成80目粉末，加入10倍重量的水，勻漿；取勻漿液，調(diào)節(jié)pH至8.2，按每lg水蛭干藥材加入8000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度5(TC，酶解5小時(shí)，冷卻至室溫；酶解完后，向上述酶解液中加入4倍體積的丙酮冷藏沉淀6小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得水蛭酶解丙酮粉。實(shí)施例2:水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊的制備取水蛭酶解丙酮粉、淀粉、糊精混合均勻后，加入適量濃度乙醇，制作軟材，18目篩制粒，4(TC干燥，16目篩整粒，加入硬脂酸鎂混合均勻后，裝入腸溶膠囊即得水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊。實(shí)施例3:水蛭酶解丙酮粉腸溶片劑的制備取水蛭酶解丙酮粉100g，與10g淀粉混合均勻后，采用5%淀粉漿制作軟材，18目篩制粒，4(TC干燥，16目篩整粒，加入羥甲基淀粉鈉混合均勻后，壓片。將聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉加入到適量丙酮/乙醇混合液中，密閉，攪拌2小時(shí)，然后對(duì)上述片劑進(jìn)行包衣，包衣完成后，于4(TC干燥2小時(shí)，得水蛭酶解丙酮粉腸溶片劑。實(shí)驗(yàn)1:水蛭酶解丙酮粉腸溶膠囊預(yù)防中風(fēng)的實(shí)驗(yàn)1.1藥物與試劑受試藥依據(jù)本發(fā)明提供的方法制備的水蛭酶解丙酮粉陽(yáng)性對(duì)照藥血塞通注射液，規(guī)格100mg:2ml，黑龍江珍寶島制藥有限公司，批號(hào):20080702;試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，水合氯醛，多聚甲醛，肝素，均為sigma進(jìn)口分裝；蛋白定量(考馬斯亮蘭法)試劑盒，MDA試劑盒；SOD試劑盒；GSH試劑；ATPase(Na-K-ATPase;Na+-Mg2+-ATPase)酶試劑盒，NO試劑盒；LDH試劑以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；批號(hào)均為20090502;HE染色試劑盒，碧云天生產(chǎn)。1.2動(dòng)物Wistar大鼠180只，雌雄各半，體重250-280g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)SCXK(魯)-2003004。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1動(dòng)物分組取Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為6組，假手術(shù)組，模型組、血塞通20mgig-1組、水蛭酶解丙酮粉16mg'kg—\8mg'kg—\4mgkg—1組，每組10只，雌雄各半。1.3.2動(dòng)物造模和給藥實(shí)驗(yàn)第l至10d，除假手術(shù)組外其余5組大鼠采用饑餓、疲勞、寒濕、驚慌憂恐、高脂飲食等復(fù)合造模方法制作氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型；實(shí)驗(yàn)第lld，除假手術(shù)組外其余5組大鼠采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作急性不全性腦缺血模型，其中假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并縫合傷口但不進(jìn)行結(jié)扎；除假手術(shù)組外其余5組大鼠分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后用微型無(wú)損動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，3h后松開(kāi)動(dòng)脈夾使其動(dòng)脈恢復(fù)血流，然后縫合傷口消毒。其中預(yù)防治療組于造模每日9:00予血塞通或者水蛭酶解丙酮粉腹腔注射給藥，頸部手術(shù)后不再給藥。1.3.3腦組織勻漿液制備大鼠再灌注24h，斷頭處死，立即于冰浴上取出大腦皮層，稱取0.5g前腦組織，置于4.5ml預(yù)冷為4t:的生理鹽水中充分勻槳，4t:3000rpm離心10min，上清即為10%腦組織勻漿液，上清液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，分裝后按照下表?xiàng)l件貯存待測(cè)。1.3.4超氧化物歧化酶(SOD)活力的測(cè)定通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含有SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。1.3.5丙二醛(MDA)含量的測(cè)定過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰，通過(guò)公式可計(jì)算出MDA含量。1.3.6乳酸脫氫酶(LDH)含量的測(cè)定LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，440nm測(cè)其吸光度即可計(jì)算出LDH含量。I.3.7谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH)活力的測(cè)定GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸陰離子呈現(xiàn)穩(wěn)定的黃色，412nm測(cè)其吸光度即可計(jì)算出GSH含量。1.3.8—氧化氮(NO)含量的測(cè)定5NO在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為N02—和N03—，而N02-進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為N03—，利用硝酸還原酶特異性將NO3—還原為NO2—，通過(guò)顯色在550nm處光吸收值測(cè)定其濃度。1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.4.1水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織SOD的影響如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組的SOD含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，腦缺血再灌注后腦組織SOD含量顯著降低。與模型組比較，水蛭酶解丙酮粉各劑量組腦組織勻漿液SOD含量均有所升高，其中中、高劑量組的含量有顯著性差異(P<0.05和0.01)，呈劑量依賴性拮抗SOD降低。表1水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織SOD活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術(shù)組比較，AAP〈0.011.4.2水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織MDA的影響結(jié)果如表2所示，模型組MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P〈0.01)，表明缺血再灌注后腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，伴有腦組織自由基聚集以及抗氧化酶活性的降低，水蛭酶解丙酮粉中、高劑量組能明顯降低MDA含量，與模型組相比差異有顯著性(P〈0.05禾口0.01)。表2水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織MDA含量影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術(shù)組比較，AAP〈0.011.4.3水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織LDH的影響結(jié)果如表3所示，模型組LDH含量顯著高于假手術(shù)組(P〈0.01)，表明缺血再灌注后腦組織細(xì)胞受損傷程度嚴(yán)重，水蛭酶解丙酮粉低、中、高劑量組能明顯降低LDH含量，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05和0.01)。表3水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織LDH含量影響組別LDH(U/mg,t)假手術(shù)組2509.23±204,22模型組5710,26土521,85厶A血塞通組204941.19±39§.l*水蛭鷗解丙酮粉45291,09±367.73*水蛭酶解丙酮粉84881,08土371,11*水蛭酶解丙觀粉164250.96±361,54**與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術(shù)組比較，AAP〈0.011.4.4水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織GSH的影響結(jié)果如表4所示，模型組的GSH活性顯著下降，與假手術(shù)組有顯著差異(P<0.01)，表明缺血再灌注后腦組織GSH活性受到很大影響，水蛭酶解丙酮粉高劑量組能明顯升高腦組織中GSH含量，與模型組相比差差異有顯著性(P<0.05);表4水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織GSH含量影響組別細(xì)GSH(mg/gprot)假手術(shù)組j^T開(kāi)U'r乂na:血塞通組水蛭n解丙醒粉水蛭,解丙,粉水蛭酶解丙麗粉20481663.37土3.8347.16士5.93厶厶4S.47土4.6657,25土5.9.760.10±4.8^與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術(shù)組比較，AAP〈0.011.4.5水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織NO的影響結(jié)果如表5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織一氧化氮含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比，水蛭酶解丙酮粉三個(gè)劑量組及陽(yáng)性藥血塞通均可顯著降低腦組織一氧化氮。表5水蛭酶解丙酮粉對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型大鼠腦組織NO含量影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。與假手術(shù)組比較，AAP〈0.01以上研究結(jié)果表明，模型組腦組織MDA，LDH含量較假手術(shù)組明顯增高，SOD顯著下降，一氧化氮含量升高，水蛭酶解丙酮粉各劑量組對(duì)氣虛血瘀證大鼠中風(fēng)模型具有較好的預(yù)防作用。權(quán)利要求一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其特征在于，是以水蛭干燥全體或鮮活水蛭為原料，通過(guò)以下制備方法得到的1)取水蛭干燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入1-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調(diào)節(jié)pH至7-9，按每1g水蛭干藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的復(fù)合酶，控制溫度40-60℃，酶解2-12小時(shí)；3)酶解完后，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入1-5倍體積的丙酮，冷藏沉淀4-12小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，制備成腸溶制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，其特征在于所述腸溶制劑為腸溶片劑、腸溶膠囊劑、腸溶滴丸劑中的任一種。3.—種權(quán)利要求1所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)取水蛭干燥全體粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，勻漿；或者取水蛭鮮活全體，加入l-6倍重量的水，勻漿；2)取上述勻漿液，調(diào)節(jié)pH至7-9，按每lg水蛭干藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的復(fù)合酶，控制溫度40-6(TC，酶解2-12小時(shí)；3)酶解完后，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入l-5倍體積的丙酮，冷藏沉淀4-12小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，制備成腸溶制劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中丙酮用乙醇、甲醇或乙酸乙酯替代。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(4)具體為將水蛭酶解丙酮粉與藥用輔料制備成顆?；蚱瑒┖?，再使用腸溶材料進(jìn)行包衣，得到腸溶制劑。6.權(quán)利要求1所述的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑在制備治療/預(yù)防中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種水蛭酶解丙酮粉腸溶劑，是以水蛭干燥全體或鮮活水蛭為原料，通過(guò)以下制備方法得到的1)取水蛭，勻漿；2)取勻漿液，調(diào)節(jié)pH至7-9，按每1g水蛭干藥材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶或以胰蛋白酶為主要成分的復(fù)合酶，控制溫度40-60℃，酶解2-12小時(shí)；3)酶解完后，冷卻酶解液至室溫，向酶解液中加入1-5倍體積的丙酮，冷藏沉淀4-12小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓干燥，得水蛭酶解丙酮粉；4)向上述水蛭酶解丙酮粉中添加藥用輔料，制備成腸溶制劑。本發(fā)明的水蛭酶解丙酮粉腸溶劑可以作為治療/預(yù)防中風(fēng)的藥物應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P9/10GK101690733SQ200910018600公開(kāi)日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年10月10日優(yōu)先權(quán)日2009年10月10日發(fā)明者吉愛(ài)國(guó),宋淑亮,梁浩,王允山申請(qǐng)人:山東大學(xué)威海分校