專利名稱：一種組織工程化異種皮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化異 種皮的制備方法。
背景技術(shù)：
嚴重的深度燒傷、皮膚缺損需要解決快速有效封閉創(chuàng)面的問題。目前臨 床上治療深度燒傷主要使用自體皮移植，這樣就會增加新的創(chuàng)面。針對大面 積燒傷患者而言存在有自體皮源不足的問題，異體皮加自體微粒皮移植技術(shù) 是目前覆蓋大面積深度燒傷創(chuàng)面最常用的有效手段，但是異體皮來源越來越 有限，那么研制一種皮膚替代物在大面積深度燒傷病人的救治中至關(guān)重要。 而嚴重創(chuàng)傷導(dǎo)致的大面積皮膚缺損也需面對上述問題。為了克服這些難題， 開展了多種在體外構(gòu)建人工皮膚的研究。國外已經(jīng)有成熟的人工皮膚產(chǎn)品上
巿,如Integra、 Alloderm、 Epicel、 Dermagraft、 Apligraft等的產(chǎn)品， 但由于價格昂貴、來源受限、制作時間長、保存時間短等多種原因影響，在 國內(nèi)沒有形成規(guī)模性應(yīng)用。Integra作為一種人工合成真皮材料，已被較廣 泛的應(yīng)用于大面積燒傷的創(chuàng)面覆蓋；其在一層硅膜的保護下，通過促進創(chuàng)基 毛細血管內(nèi)皮細胞和纖維母細胞長入而"成活"，去掉硅膜，移植自體薄皮 片后可獲得較好的功能和外觀；缺點是需要二次自體皮移植治療。Alloderm 是通過去除異體皮真皮層中的細胞成分而獲得，也是促進創(chuàng)基毛細血管內(nèi)皮 細胞和纖維母細胞長入而"成活"，其效果較好、免疫原性低，缺點是來源 受限、存在傳播疾病的潛在可能。目前國內(nèi)巿場上應(yīng)用于臨床的豬皮敷料主要有豬去細胞真皮基質(zhì)、新鮮 豬皮、戊二醛豬皮、輻照豬皮、凍干豬皮。經(jīng)動物實驗和臨床實踐證明，豬 皮敷料存在有以下缺陷豬去細胞真皮基質(zhì)缺乏表皮結(jié)構(gòu)，應(yīng)用時仍需自體
刃厚皮償還覆蓋，需要二次自體皮移植治療，對患者形成新的損傷；新鮮豬
皮的抗原性較強，細菌污染率較高，用于切(削)痂創(chuàng)面后排斥較早，容易誘
發(fā)感染，創(chuàng)面裸露需二次手術(shù)；戊二醛豬皮的彈性較差，透水性高，應(yīng)用于創(chuàng) 面后易干燥，不能與創(chuàng)面緊密粘附，皮膚新生血管生長緩慢；輻照豬皮和凍 干豬皮一樣，粘附性差，無促進機體表皮細胞和真皮細胞的生長作用。這些 敷料雖能起到保護創(chuàng)面的作用，但均存在不同程度的缺點，尚不能取代異體 皮用于覆蓋大面積深度燒傷切(削)痂創(chuàng)面，只能作為臨時性覆蓋物使用。 因此臨床上迫切需要一種可供移植的皮膚替代物。其應(yīng)具備'以下要求 1)良好的生物相容性和組織相容性；2)與正常皮膚兩層結(jié)構(gòu)相似，彈性好； 3)促進機體表皮細胞和真皮細胞生長，加快皮膚新生血管生長；4)有毛孔 便于引流，為促進自體表皮"穿過"真皮支架提供通道，實現(xiàn)自體表皮化； 5)安全可靠、無毒性，避免疾病傳播；6)性狀柔軟濕潤、粘附性好，便于 與創(chuàng)面緊密結(jié)合；7)真皮層支架永久性保留生長，防止因真皮層缺失而導(dǎo) 致瘢痕形成過重；8)價格低廉，適合于臨床廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺點，本發(fā)明的目的就是提出 一種組織工程化異 種皮的制備方法，使制備的異種皮能滿足上述要求，適于臨床治療燒傷和創(chuàng) 傷引起的皮膚缺損。
本發(fā)明提出的組織工程化異種皮的制備方法，釆用來源豐富的仔豬為皮 源，經(jīng)過取皮、表皮固定、切削、去除真皮層細胞、修飾三維膠原結(jié)構(gòu)、改變物理性狀、滅菌包裝的步驟獲得成品；具體操作包括以下步驟
步驟一，取檢疫合格豬皮洗凈，用0. 1%新潔爾滅浸泡15 30min,用水 充分清洗；再對豬皮表皮面單面釆用體積濃度為1~2%的戊二醛溶液固定 30 60min,用生理鹽水充分沖洗，去除戊二醛殘留；再去除真皮面多余脂 肪和結(jié)締組織，用片皮機從真皮面切削，切削時切除毛囊留毛孔，保留0. 2 ~ 0. 4mm厚度帶表皮層和真皮層及毛孔的豬皮；最后用0. 1%新潔爾滅浸泡15 ~ 30min，滅菌水充分清洗；
步驟二，將經(jīng)步驟一處理的豬皮的真皮面單面釆用生理鹽水配制的 0.25 — 0. 5% (W/V)胰酶溶液浸泡，在37。C恒溫搖床80 - 100轉(zhuǎn)/分鐘，消 化45 60min,超聲波震蕩30~60 min后，用滅菌水反復(fù)清洗；再置入含 有(V/V) 0. 5°/。硫酸慶大霉素的0. 5~1% TritonX-100(曲拉通)溶液中，于 37'C恒溫搖床80 100轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h,超聲波震蕩30 - 60 min去除殘留 成分，用水充分清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸慶大霉素的0. 5~1%SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液中，于37匸恒溫搖床80 100轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h, 超聲波震蕩30~60 min去除殘留成分，用滅菌水清洗；再將其浸入0. 5 ~ 1 mol/LNaOH溶液中,于恒溫搖床80 ~ 100轉(zhuǎn)/分鐘堿化處理15 min，去除殘 留的成分，用滅菌水清洗；
步驟三，將經(jīng)步驟二處理的豬皮雙面浸泡于新鮮的體積濃度為0.2%的 戊二醛溶液中交聯(lián)15 30min,生理鹽水充分沖洗；通過該處理降低了免疫 原性，并使膠原原纖維再次交聯(lián)融合恢復(fù)原有的三維膠原支架結(jié)構(gòu)，修飾了 膠原的空間結(jié)構(gòu)；再將豬皮放入柔化劑溶液中浸泡30 - 60 min進行柔化， 清洗后再放入保濕劑溶液中，37。C保濕處理30 60 min,生理鹽水充分沖 洗去除殘留；步驟四，將經(jīng)步驟三處理得到的產(chǎn)品，根據(jù)臨床需要裁剪為不同規(guī)格，
真空包裝，鈷60照射，在2-1(TC環(huán)境下可保存2年以上。
本發(fā)明所述對豬皮單面(表皮面/真皮面)的處理方法，可以釆用將豬
皮一面粘貼在平板上，放入處理液中，即可進行裸露面的處理，稱為貼板法； 也可以釆用將豬皮對折，用夾子/卡子夾緊對折的敞口邊，放入處理液中， 即可進行裸露面的處理，稱為夾邊法。
所述的柔化劑(用量為10~15%，同行熟知)可以選擇十六烷基三甲基 氯化銨、或十六烷基三甲基溴化銨、或十七烷基-N氨乙基咪唑啉環(huán)氧丙烷 (柔軟劑ES)、或十八烷基二甲基芐基氯化銨的任一種；所述的保濕劑(用 量為5~10%,同行熟知)可以選擇丙三醇、或透明質(zhì)酸(HA)吡咯烷酮羧 酸鈉(簡稱PCA-NA)混合溶液、或天然二甲基氨酸脯氨酸、或十八烷基二 甲基氧化胺的任一種。
釆用本發(fā)明方法制備的組織工程化異種皮，通過動物實驗和臨床實踐與 現(xiàn)有產(chǎn)品和技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1)使用戊二醛完整固定表皮層使其 成為保護膜，能防止機體液體丟失；徹底脫除真皮層細胞使真皮層成為自體 皮生長的支架。2)在用片皮機切削豬皮的同時，可達到一并去除豬毛及毛 囊效果，利用豬皮天然的毛孔作為微孔可以促進自體表皮"穿過"真皮支架， 實現(xiàn)自體表皮化，加快皮膚新生血管的生長速度。在現(xiàn)有技術(shù)中人為地給異 體皮、人工復(fù)合皮、豬皮敷料打孔多釆用激光打孔，而激光對膠原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 灼燒，形成微小的燋痂，使膠原原有的結(jié)構(gòu)不完整，不利于細胞的生長；本 發(fā)明解決了激光打孔存在的弊端。3)豬皮的單面處理，在固定表皮層時可 避免戊二醛固定真皮層，在脫除真皮層細胞時可避免損傷表皮層，實現(xiàn)在完 整保留表皮層的同時去除真皮層細胞。4)通過脫除真皮層細胞、Triton和SDS清洗、以及兩次戊二醛交聯(lián)共同降低了免疫原性。5)使用柔化劑和保 濕劑增加本發(fā)明異種皮的柔軟性和濕潤性，與已有干、硬的豬皮敷料和現(xiàn)有 的人工皮膚相比，更便與創(chuàng)面粘附緊密，加快皮膚新生血管的生長速度，縮 短創(chuàng)面愈合時間。6)適用于燒傷、皮膚缺損，具有與自體皮結(jié)構(gòu)相似的兩 層結(jié)構(gòu)，使用安全可靠、無毒，避免疾病傳播；真皮支架永久性保留，可避 免因真皮層缺失而導(dǎo)致瘢痕形成過重，同時加快皮膚新生血管生長速度，縮
短創(chuàng)面愈合時間。7)本發(fā)明制備的產(chǎn)品生產(chǎn)周期短、保存時間長、而且價
格低廉，適合于臨床廣泛應(yīng)用。
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步說明。
步驟一，選純品系生物級別飼養(yǎng)3個月大小、體重30 50Kg的仔豬作 為皮源。取檢疫合格(不含有豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、流 行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、口蹄疫病毒)的豬皮剃毛洗凈， 用0. 1%新潔爾滅(北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠生產(chǎn))浸泡25min，用水充分清洗； 對豬皮表皮面(釆用貼板法)進行單面處理，將豬皮的表皮面浸泡入新鮮配制 的2%戊二醛溶液中交聯(lián)固定40min (最好在攪拌條件下進行)，用生理鹽水 沖洗(從貼板取下)，洗去戊二醛殘留。之后去除真皮面多余脂肪和結(jié)締組織， 用片皮機均一地從真皮面切削，切削時一并切除毛囊留毛孔，保留0. 3mm厚 度帶表皮層和真皮層及毛孔的豬皮。最后用0. 1%新潔爾滅浸泡25min后， 用滅菌注射用水清洗。
步驟二，經(jīng)步驟一處理的豬皮(釆用夾邊法)，將真皮面單面釆用生理 鹽水配制的0. 3% (V/W)胰酶溶液浸泡，在37r水浴恒溫搖床中100轉(zhuǎn)/分 鐘，消化50min，超聲波震蕩40 min后，用滅菌注射用水反復(fù)清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸慶大霉素的1% TritonX-lOO溶液中，于37匸水浴 恒溫搖床中80轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h,超聲波震蕩50 min去除殘留成分，用水 充分清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸慶大霉素的0.8MSDS溶液中，防止 處理過程中細菌污染，于37。C水洛恒溫搖床80轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h，超聲波震 蕩40min去除殘留成分，用滅菌水清洗；再將其浸入1 mol/L NaOH溶液中， 于恒溫搖床80轉(zhuǎn)/分鐘堿化處理15 min，去除殘留的成分，用滅菌注射用 水清洗(打開夾邊)。
步驟三，將經(jīng)步驟二處理的豬皮雙面浸泡于新鮮配制的體積濃度為Q. 2% 的戊二醛溶液中交聯(lián)20min,用生理鹽水充分沖洗，洗去戊二醛殘留液；通 過該處理降低了免疫原性，并使膠原原纖維再次交聯(lián)融合恢復(fù)原有的三維膠 原支架結(jié)構(gòu)，修飾了膠原的空間結(jié)構(gòu)；再將豬皮放入10% (十六烷基三甲基 氯化銨)的柔化劑溶液中浸泡40 min進行柔化，清洗后再放入8%的(透明 質(zhì)酸吡咯烷酮羧酸鈉混合溶液)保濕劑溶液中，37'C保濕處理30min,最后 用生理鹽水充分沖洗去除殘留。
步驟四，將經(jīng)步驟三處理得到的產(chǎn)品，根據(jù)臨床需要裁剪為不同規(guī)格， 抽真空包裝，U5 25KGy)鈷60照射，在2 ~ l(TC環(huán)境下可保存2年以上。
經(jīng)動物實驗和臨床實踐證明，所制備的異種皮解決了已有人工皮膚產(chǎn)品 的價格昂貴、來源受限、制作時間長、保存時間短、二次植皮為機體帶來損 傷的缺點；也解決了豬皮敷料缺乏表皮結(jié)構(gòu)、抗原性較強、應(yīng)用時仍需二次 自體皮移植又形成新的損傷、細菌污染率較高、用于創(chuàng)面后排斥較早形成創(chuàng)
面裸露、易干燥、容易誘發(fā)感染、彈性較差、透水性高，不能與創(chuàng)面緊密粘 附，無促進機體表皮細胞和真皮細胞生長、和皮膚新生血管生長緩慢的缺點。
權(quán)利要求
1、一種組織工程化異種皮的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，取檢疫合格豬皮洗凈，用0.1％新潔爾滅浸泡15～30min，用水充分清洗；再對豬皮表皮面單面采用體積濃度為1～2％的戊二醛溶液固定30～60min，用生理鹽水充分沖洗；再去除真皮面多余脂肪和結(jié)締組織，用片皮機從真皮面切削，切除毛囊留毛孔，保留0.2～0.4mm厚度帶表皮層和真皮層及毛孔的豬皮；最后用0.1％新潔爾滅浸泡15～30min，滅菌水清洗；步驟二，將經(jīng)步驟一處理的豬皮的真皮面單面，采用生理鹽水按重量體積比配制的0.25～0.5％胰酶溶液浸泡，在37℃恒溫搖床80～100轉(zhuǎn)/分鐘，消化45～60min，超聲波震蕩30～60min后，用滅菌水反復(fù)清洗；再置入含有體積比0.5％硫酸慶大霉素的0.5～1％ TritonX-100溶液中，于37℃恒溫搖床80～100轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h，超聲波震蕩30～60min，用水充分清洗；再置入含有體積比0.5％硫酸慶大霉素的0.5～1％SDS溶液中，于37℃恒溫搖床80～100轉(zhuǎn)/分鐘清洗24h，超聲波震蕩30～60min，用滅菌水清洗；再將其浸入0.5～1mol/L NaOH溶液中，于恒溫搖床80～100轉(zhuǎn)/分鐘堿化處理15min，用滅菌水清洗；步驟三，將經(jīng)步驟二處理的豬皮雙面浸泡于新鮮的體積濃度為0.2％的戊二醛溶液中交聯(lián)15～30min，生理鹽水充分沖洗；再將豬皮放入柔化劑溶液中浸泡30～60min進行柔化，清洗后再放入保濕劑溶液中，37℃保濕處理30～60min，生理鹽水充分沖洗；步驟四，將經(jīng)步驟三處理得到的產(chǎn)品，根據(jù)臨床需要裁剪，真空包裝，鈷60照射，在2～10℃環(huán)境下保存。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，所述對豬皮單面的處理釆用貼板法、或夾邊法。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中的柔化劑為十六烷基三甲基氯化銨、或十六烷基三甲基溴化銨、或十七烷基-N 氨乙基咪唑啉環(huán)氧丙烷、或十八烷基二甲基節(jié)基氯化銨的任一種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中的保濕 劑為丙三醇、或透明質(zhì)酸吡咯烷酮羧酸鈉混合溶液、或天然二甲基氨酸脯氨 酸、或十八烷基二甲基氧化胺的任一種。
全文摘要
一種組織工程化異種皮的制備方法，本發(fā)明采用來源豐富的仔豬為皮源，經(jīng)過取皮、表皮固定、切削、去除真皮層細胞、修飾三維膠原結(jié)構(gòu)、改變物理性狀、滅菌包裝的獲得成品，在2～10℃環(huán)境下可保存2年以上。本發(fā)明制備的組織工程化異種皮，應(yīng)用于深度燒傷、皮膚缺損，具有免疫原性低、與創(chuàng)面粘附緊密、保濕的功能特點，既可以作為人體暫時性的創(chuàng)面覆蓋物保護創(chuàng)面，又可以永久性的保留真皮支架生長修復(fù)創(chuàng)面；解決了已有人工皮膚產(chǎn)品的價格昂貴、來源受限、制作時間長、保存時間短、二次植皮為機體帶來損傷的缺點。本發(fā)明制備的產(chǎn)品材料來源廣、生產(chǎn)周期短、保存時間長、價格低廉，適合于臨床廣泛應(yīng)用。
文檔編號A61L27/36GK101537207SQ20091002225
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者孫天駿, 張勇杰, 楊紅明, 柴家科, 鵬 蘇 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院;陜西艾博生生物工程有限公司