專利名稱：一種制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備可生物降解組織工程用血管中間層支架材料的方 法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管中間層支架材料的制作是血管組織工程領(lǐng)域非常關(guān)鍵的 一個環(huán)節(jié)。 而作為血管平滑肌細(xì)胞種植的支架，不僅應(yīng)具有良好的生物相容性和生物可 降解性，適宜的孔隙結(jié)構(gòu)，還應(yīng)當(dāng)具有一定的強(qiáng)度和可塑性，能夠抗血流壓 力和剪切力，使接種細(xì)胞黏附、增殖、分化后，在支架空間內(nèi)有序分布、排
列，合成適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)(ECM),分化成具有血管中間層特定功能的血管 樣三維結(jié)構(gòu)組織。
膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，是機(jī)體的主要結(jié)構(gòu) 蛋白，是支持組織和結(jié)締組織的主要組分，它具有良好的生物相容性、促新 細(xì)胞形成功能和細(xì)胞粘附性。類人膠原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一 段mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，經(jīng)過特定序列重復(fù)和修飾，轉(zhuǎn)化于大腸桿 菌中，并經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得，由西安巨子生物基因技術(shù) 股份有限公司發(fā)明并獨家生產(chǎn)。它從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不 溶性和病毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問題，并且具有良好的生物 學(xué)特性和功能，促新細(xì)胞形成和促上皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞，生長功能相比動物 體提取膠原蛋白優(yōu)良，免疫排異反應(yīng)低。
絲素蛋白(silk fibroin, SF)是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含 量約占蠶絲的70%-80%,富含18種氨基酸，尤其以甘氨酸、丙氨酸、絲氨
4酸含量最高，超過90%。實驗表明蠶絲絲素蛋白覆層能顯著促使成纖維細(xì)胞 在培養(yǎng)的初始階段具有較高的葡萄糖攝入和較低的谷氨酸鹽消耗，增加細(xì)胞 外I型膠原蛋白的聚集，并且具有優(yōu)良的機(jī)械性能和生物相容性，適合作為 血管組織工程中血管中間層支架材料的原料。
雖然膠原蛋白和絲素蛋白都具有良好的生物相容性，但是單純用膠原蛋 白構(gòu)建的支架材料機(jī)械性能較差，降解速率快；單純用絲素蛋白構(gòu)建的支架 材料不太利于細(xì)胞的吸附生長，均不能滿足組織工程的要求。體內(nèi)血管的中 間層富有大量彈性纖維、膠原蛋白極富彈性，因此可以對膠原蛋白與絲素蛋 白進(jìn)行交聯(lián)和改性，使其具有較高的機(jī)械性能以及具有與組織再生相匹配的 降解速率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可生物降解組織工程用血管中間層支架材料的制備 方法，該方法工藝簡單，所制備的支架材料機(jī)械性、生物相容性、血液相容 性以及免疫相容性優(yōu)異，徹底杜絕了動物膠原蛋白支架材料所不可避免的病 毒隱患，使用安全性大幅度提高。
本發(fā)明內(nèi)容如下
一種制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架材料的方法，包括以 下步驟
1) 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成質(zhì)量百分比濃度為1%~3%的溶液；
2) 將脫膠絲素溶解于30%~50%的CaCl2溶液中，透析后得濃度為 2 4%的絲素蛋白溶液；
3) 將上述兩種溶液混合均句，加入質(zhì)量百分比濃度為20%~50%的戊二 醛水溶液，混合攪拌、過濾后真空脫泡；
4) 將上述混合液注入管狀模具中，4。C交聯(lián)2天后置入-80。C冰箱，冷凍 干燥制成血管內(nèi)層支架；
5) 蒸餾水洗滌，再次冷凍干燥成型，鈷6()消毒即可。上述步驟中，所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵 生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白，該蛋白與人體免疫排異反應(yīng)更低，促進(jìn)受損組 織修復(fù)能力更強(qiáng)，而且不存在病毒隱患。
上述步驟3)中，類人膠原蛋白和絲素蛋白混合的質(zhì)量比為(1 9):1，該
質(zhì)量比以純類人膠原蛋白和絲素蛋白計算。
上述步驟3)中，在類人膠原蛋白和絲素蛋白混合溶液中還加入了質(zhì)量 百分比為0.1%~0.5%的增塑劑，增塑劑的重量百分比為增塑劑占類人膠原蛋 白和絲素蛋白混合溶液的比例，所用的增塑劑為丙三醇或者1.3-丁二醇中的 一種或兩種。
上述步驟4)中，所用的管狀模具內(nèi)徑為5mm，外徑為7mm。 本發(fā)明提供的可生物降解組織工程用支架材料具有適宜的微觀結(jié)構(gòu)和 空隙率，具有優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和可控的降解速率，適于平滑肌細(xì)胞增殖分化 形成血管中間層組織，可應(yīng)用于血管組織的修復(fù)與重建。與現(xiàn)有技術(shù)相比， 所制備的支架材料機(jī)械性、生物相容性、血液相容性以及免疫相容性優(yōu)異， 該支架材料又具有顯著的優(yōu)點它的免疫排異反應(yīng)更低，而且徹底杜絕了動 物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，使用安全性大幅度提高。
具體實施例方式
下面通過具體實施實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
根據(jù)文獻(xiàn)報道方法制備B.mori絲素蛋白。將蠶繭剪碎，用0.02 M的 Na2C03溶液溶解約lh,脫去絲膠。然后將所得到的脫膠絲素蛋白用蒸餾水 反復(fù)沖洗，再溶于40%的CaCl2溶液中，水浴約40min,所得絲素溶液用透 析袋(截留分子量3500)透析，當(dāng)所測溶液的電導(dǎo)率小于4.0 ^時中止透 析。將所得絲素溶液干燥，稱重，計算出絲素溶液的濃度為3-4.%。
實施例1:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.5%的溶液，將脫膠絲素在水洛條件 下溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為3°/。的絲素溶液，然后將兩者按質(zhì)量比2:1混合，攪拌均勻后，再加入40pL 25%戊二醛水溶液，輕輕攪 拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀模具中，4"C交聯(lián)2天后置入-8(TC冰 箱冷凍5h成型，并于-l(TC真空干燥制成血管內(nèi)層支架，蒸餾水洗滌5次后， 重新冷凍干燥成型，鈷6()消毒后備用。 實施例2:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件下 溶解于45% CaCl2溶液中，透析后得濃度為3%的絲素溶液，然后將兩者按 質(zhì)量比5:1混合，加入溶液總量的0.4%的丙三醇，撹拌均勻后，再加入40jiL 25%戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min，過濾后真空脫泡，注入管狀模具中，4"C 交聯(lián)2天后置入-80。C冰箱冷凍5h成型，并于-IO'C真空干燥制成血管內(nèi)層 支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷6°消毒后備用。
實施例3:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.5%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件 下溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為3%的絲素溶液，然后將兩者 按質(zhì)量比6:1混合，加入溶液總量的0.4%的1.3-丁二醇，攪拌均勻后，再加 入40pL 25%戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀 模具中，4。C交聯(lián)2天后置入-8(TC冰箱冷凍5h成型，并于-10。C真空干燥制 成血管內(nèi)層支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷M消毒后備用。
實施例4:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件下 溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為2%的絲素溶液，然后將兩者按 質(zhì)量比3:1混合，加入溶液總量的0.4%的丙三醇，攪拌均勻后，再加入20)iL 50%戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀模具中，4。C 交聯(lián)2天后置入-8(TC冰箱冷凍5h成型，并于-l(TC真空干燥制成血管內(nèi)層 支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷6()消毒后備用。
實施例5:將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成3%的溶液，將脫膠絲素在水洛條件下
溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為4%的絲素溶液，然后將兩者按 質(zhì)量比4:1混合，加入溶液總量的0.4%的丙三醇，撹拌均勾后，再加入40pL 25%戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀模具中，4°C 交聯(lián)2天后置入-8(TC冰箱冷凍5h成型，并于-l(TC真空干燥制成血管內(nèi)層 支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷6°消毒后備用。 實施例6:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.5%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件 下溶解于30% CaCl2溶液中，透析后得濃度為4%的絲素溶液，然后將兩者 按質(zhì)量比5:1混合，加入溶液總量的0.2%的丙三醇，攪拌均勻后，再加入 4(^L25M戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀模具 中，4。C交聯(lián)2天后置入-8(TC冰箱冷凍5h成型，并于-l(TC真空干燥制成血 管內(nèi)層支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷6°消毒后備用。
實施例7:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件下 溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為4%的絲素溶液，然后將兩者按 質(zhì)量比6:1混合，加入溶液總量的0.2。/。的丙三醇和0.2%的1.3-丁二醇，攪 拌均勻后，再加入40(iL 25°/。戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空 脫泡，注入管狀模具中，4C交聯(lián)2天后置入-8(TC冰箱冷凍5h成型，并于 -l(TC真空干燥制成血管內(nèi)層支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型， 鈷6()消毒后備用。
實施例8:
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2%的溶液，將脫膠絲素在水浴條件下 溶解于40% CaCl2溶液中，透析后得濃度為4%的絲素溶液，然后將兩者按 質(zhì)量比7:1混合，加入溶液總量的0.3%的1.3-丁二醇，攪拌均勻后，再加入 4(^]:25%戊二醛水溶液，輕輕攪拌30min,過濾后真空脫泡，注入管狀模具中，4。C交聯(lián)2天后置入-80。C冰箱冷凍5h成型，并于-10'C真空干燥制成血 管內(nèi)層支架，蒸餾水洗滌5次后，重新冷凍干燥成型，鈷6()消毒后備用。 制備得到的支架材料的性能測試實驗
1、 機(jī)械性能測試
支架的拉伸性能由Instron 5565型電子萬能實驗機(jī)檢測(純類人膠原蛋 白HLC為對照)。將干樣品制成直式片15 mm x 6 mm (厚200iim),采 用IOON載荷傳感器，橫梁的位移速度為lmm/min,得到樣品斷裂時的應(yīng)力 與應(yīng)變并計算出材料的楊氏模量。每種材料平行檢測6個樣品。測試結(jié)果表 明當(dāng)類人膠原蛋白(HLC)與絲素蛋白(SF)以質(zhì)量比7:3， 5:5復(fù)合時， 力學(xué)性能測試表明本發(fā)明5:5,7:3復(fù)合支架呈現(xiàn)出接近于SF的應(yīng)力與應(yīng)變。
5:5 H-S和7:3 H-S血管支架的應(yīng)力分別達(dá)到378 ± 23 KPa和332 ± 16 KPa,通過LSD顯著性分析，這兩種支架的應(yīng)力和絲素蛋白(356士9KPa)沒 有顯著性差異，而和純類人膠原蛋白相比(214土 11 KPa), P<0.05，差異顯 著。
5:5 H-S和7:3 H-S血管支架的應(yīng)變均高于類人膠原蛋白，和絲素蛋白相 當(dāng)，達(dá)到50 ±5%。
2、 降解實驗
取一定質(zhì)量的HLC-SF血管支架分別置于5u/mL胰蛋白酶XIV(5u/mg, Sigma)溶液和PBS溶液(對照組)中，37。C震蕩孵育20天。分別于5， 10, 15, 20天取樣，蒸餾水沖洗，冷凍干燥，稱重。計算支架降解后的剩余質(zhì)量百 分率。剩余的質(zhì)量百分率二W/W()XlOOn/。。 Wt為消化一定時間后，各時間點 的剩余質(zhì)量，W。為膠原酶消化前的支架質(zhì)量。體外酶降解實驗證明5:5， 7:3 H-S支架較慢的降解速率。
3、 生物相容性實驗 7:3H-S支架具有良好的促細(xì)胞黏附、增殖的作用；體內(nèi)的動物學(xué)實驗更
進(jìn)一步驗證了 7:3H-S支架良好的生物相容性。
9
權(quán)利要求
1.一種制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架材料的方法，其特征在于包括以下步驟1)將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成質(zhì)量百分比濃度為1％～3％的溶液；2)將脫膠絲素溶解于30％～50％的CaCl2溶液中，透析后得濃度為2～4％的絲素蛋白溶液；3)將上述兩種溶液混合均勻，加入戊二醛水溶液，混合攪拌、過濾后真空脫泡；4)將上述混合液注入管狀模具中，4℃交聯(lián)1-3天后置入-80℃冰箱，冷凍干燥制成血管內(nèi)層支架材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架 材料的方法，其特征在于所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌 高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架 材料的方法，其特征在于類人膠原蛋白和絲素蛋白混合過程中質(zhì)量比為 (1 9):1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架 材料的方法，其特征在于戊二醛水溶液中戊二醛的質(zhì)量百分比濃度為 20% ~ 50%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架 材料的方法，其特征在于步驟3)中，在類人膠原蛋白和絲素蛋白混合溶 液中還加入了重量百分比為0.1% 0.5%的增塑劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備可生物降解的組織工程用血管中間層支架 材料的方法，其特征在于所用的增塑劑為丙三醇或1.3-丁二醇中的一種或兩種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任意之一所述制備可生物降解的組織工程用支架材料的方法，其特征在于步驟4)中，所用的管狀模具內(nèi)徑為5mm, 外徑為7mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備可生物降解組織工程用血管中間層支架材料的方法，包括以下步驟將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成質(zhì)量百分比濃度為1％～3％的溶液；將脫膠絲素溶解于30％～50％的CaCl₂溶液中，透析后得濃度為2～4％的絲素蛋白溶液；將上述兩種溶液混合均勻，加入質(zhì)量百分比濃度為20％～50％的戊二醛水溶液，混合攪拌、過濾后真空脫泡；將上述混合液注入管狀模具中，4℃交聯(lián)2天后置入-80℃冰箱，冷凍干燥制成血管內(nèi)層支架。與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制備的支架材料機(jī)械性、生物相容性、血液相容性以及免疫相容性優(yōu)異，該支架材料免疫排異反應(yīng)更低，而且徹底杜絕了動物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，使用安金性大幅度提高。
文檔編號A61L27/26GK101554490SQ20091002261
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者惠俊峰, 朱曉麗, 朱晨輝, 李萬華, 梁麗華, 鈺 米, 范代娣, 嵐 陳, 沛 馬, 馬曉軒, 駱艷娥 申請人:西北大學(xué)