專利名稱：臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，涉及臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的 應用。
背景技術：
間質(zhì)干細胞(MSCs)最初是特指骨髓基質(zhì)細胞，后來研究發(fā)現(xiàn)在胎兒肝臟、肺臟、 心臟等實質(zhì)臟器、臍帶及臍帶血中均提取到了與骨髓基質(zhì)細胞生物學特性相似、免疫表 型相同的干細胞，因此將間質(zhì)組織來源的與骨髓MSCs生物學性狀相似，具有多向分化 潛能的細胞統(tǒng)稱為間質(zhì)干細胞。MSCs是多潛能的成體基質(zhì)細胞，能分化為多種間質(zhì)起 源的組織，如成骨、軟骨和脂肪細胞，在特殊環(huán)境下，還能橫向分化為肌細胞、神經(jīng)細 胞、血管內(nèi)皮細胞、肝胰細胞等多種其他組織細胞。MSCs分裂40代后仍能維持轉(zhuǎn)染 基因的表達，是基因治療的優(yōu)良載體。目前已經(jīng)有充分的證據(jù)表明，MSCs通過阻止細 胞分裂抑制T細胞、B細胞和樹突狀細胞的增殖；MSCs同樣能夠抑制NK細胞的增殖， 干擾樹突狀細胞的成熟和抗原遞呈；MSCs對多種損傷組織具有替代修復作用。MSCs 植入體內(nèi)后，可在多種造血以外的組織如肺、骨、軟骨和皮膚等處定位和分布；且移植 后無免疫排斥反應，并能分泌多種細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)。體內(nèi)外研究均表明MSCs 具有誘導免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)的作用。MSCs通過分泌多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子 卩(TGF-P)、肝細胞生長因子(HGF)、白細胞介素-6 (IL-6)、 IL-7、 IL-IO、干擾素Y(IFN-力、 前列腺素E2(PGE2)等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
臍帶MSCs具有骨髓間質(zhì)干細胞的類似的生物學特性。如貼壁生長，臍帶MSCs 表達CD105 (SH2)、 CD73 (SH3， SH4)、 CD29、 CD44、 CD71、 CD90、 CD106分子， 不表達CD14， CD34， CD45等造血細胞標記，表達HLA-1，不表達HLA-DR，不表達 共刺激分子CD80， CD86和CD40。與骨髓MSCs相比，臍帶MSCs SH2、 CD106和 HLA-1表達低，OCT mRNA表達陽性，這說明臍帶MSCs是一種更原始的MSCs群。 大量的體外實驗證明，在不同誘導條件下，臍帶MSCs不僅可以向多種中胚層來源的組 織細胞分化，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等，還可以向外胚層和內(nèi)胚 層來源的神經(jīng)元樣細胞和肝細胞樣細胞分化。最近研究表明臍帶MSCs能在精原細胞誘 導條件下，可以分化為精原細胞。臍帶MSCs在適當條件下，可以誘導分化為胰島樣細胞。
Weiss等研究發(fā)現(xiàn)臍帶MSCs能分泌細胞因子，支持造血，抑制刀豆素A所致的脾 細胞增殖。不表達或表達極低水平的MHC-II分子，F(xiàn)as配體和T細胞共剌激分子 CD80, CD86， CD40， CD40L，因此不易被宿主T細胞識別，并能逃脫宿主免疫系統(tǒng) 的排斥。豬臍帶MSCs移植到鼠大腦，在沒有用免疫抑制劑的情況下，豬臍帶細胞在鼠 腦內(nèi)存活移行，并表達豬神經(jīng)細胞的標記，表明臍帶MSCs可逃脫宿主免疫系統(tǒng)的排斥。 Ma等在人臍帶華爾通(Wharton's Jelly)來源的MSCs的特性及向神經(jīng)細胞分化的研究 中證實臍帶MSCs不表達或低表達移植免疫排斥相關的表面標記CD80， CD86， CD40， CD40L。表明人臍帶MSCs可能不表達MHC I和MHCII ，同種異基因MSCs移植至 中樞祌經(jīng)系統(tǒng)后未見短期排斥反應，推測臍帶MSCs免疫調(diào)節(jié)的主要機制是通過抑制樹 突狀細胞發(fā)育和分泌IL-IO、 TGF-P等細胞因子，從而抑制異體T細胞的活化，MSCs 表達的MHC-I類分子可激活T淋巴細胞提供第一信號，但由于缺乏協(xié)同刺激分子，不 能產(chǎn)生第二信號，導致T淋巴細胞無能，從而誘導免疫耐受。臺灣學者將由臍帶MSCs 誘導分化的胰島樣細胞移植給STZ誘導的T1DM大鼠，能顯著降低糖尿病大鼠血糖， 大鼠體內(nèi)人胰島素水平顯著提高，糖耐量恢復且無移植排斥反應。移植12周后，大鼠 肝臟內(nèi)可檢測到表達人胰島素和抗人細胞核單克隆抗體雙陽性細胞。未分化的臍帶 MSCs則不具備類似作用。
已有大量動物試驗表明臍帶MSCs移植治療肝臟損傷、移植物抗宿主病、神經(jīng)系統(tǒng) 疾病、糖尿病、骨質(zhì)缺損有效。Nakamura等發(fā)現(xiàn)，在鼠膠原瘤模型實驗中運用基因工 程的MSCs具有抗腫瘤作用；Sato等將表皮細胞生子因子受體(EGFR)轉(zhuǎn)染的MSCs 移植于鼠腦膠質(zhì)瘤內(nèi)，實驗組生存時間明顯延長。體外實驗顯示基因轉(zhuǎn)染的MSCs能較 長時間的表達外源性基因，這使得基因修飾的MSCs治療疾病成為可能。在治療急性心 肌梗死的研究中，Matsumotov等用腺病毒作為載體把血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因 165修飾的MSCs直接注入左冠狀動脈阻塞造成的鼠心臟梗死區(qū)域，1周后該區(qū)域可檢 測到VEGF表達明顯增高，28天后梗死區(qū)域的左室大小、左室射血分數(shù)、E/A波比率、 毛細血管密度均明顯改善，表明基因修飾的MSCs移植在治療急性心肌梗死中效果顯 著。此外，用轉(zhuǎn)染顯性負數(shù)突變體I型膠原基因的MSCs治療易碎性骨疾病和成骨不全 也獲得成功。
自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫應答反應導致組織器官損傷 和相應功能障礙為主要發(fā)病機制的一類疾病。是臨床上常見的一大類疾病，目前已被公認的自身免疫性疾病至少有30多種。根據(jù)自身免疫反應對組織器官造成損傷的范圍， 通常將自身免疫性疾病分器官特異與非器官特性兩大類。
臨床上常見的自身免疫性疾病包括結(jié)締組織疾病類風濕關節(jié)炎(RA)、幼年特發(fā)
性關節(jié)炎(JIA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬 皮病(SSc)、系統(tǒng)性血管炎；神經(jīng)肌肉疾病多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無力(MG)、脫 髓鞘疾病；內(nèi)分泌性疾病原發(fā)性賢上腺皮質(zhì)萎縮、慢性甲狀腺炎、糖尿??；消化系統(tǒng) 疾病炎性腸病(克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、慢性活動性肝炎、惡性貧血與萎縮性胃炎； 泌尿系統(tǒng)疾病自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出血性綜合征；血液系統(tǒng)疾病自身免疫 性溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、特發(fā)性白細胞減少癥。 自身免疫性疾病的常規(guī)治療方法有
(1) 腎上腺皮質(zhì)激素是多數(shù)自身免疫性疾病最常用的治療藥物，具有較快抑制 免疫反應和較強的抗炎作用。近年采用的激素沖擊療法提高了危重癥的緩解率，但是激 素也有不少副作用，長期應用可以抑制下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)，垂體前葉分泌促腎上 腺皮質(zhì)激素的量明顯減少，使腎上腺皮質(zhì)素分泌減少，皮質(zhì)腺出現(xiàn)萎縮，從而患者需要 長期服用激素維持治療，并且他們的應激能力減弱，容易出現(xiàn)感冒及各種感染，在受到 外傷、冷風刺激、精神刺激、手術治療其它疾病等應激狀態(tài)時，由于體內(nèi)激素的分泌不 足， 一方面可能誘發(fā)自身免疫性疾病發(fā)生或加重，另一方面會出現(xiàn)疲乏無力，食欲減退， 低血糖反應，肌肉關節(jié)疼痛等腎上腺皮質(zhì)分泌激素不足的癥狀。此外，激素還可導致肥 胖、多毛、高血壓、青光眼、糖尿病、消化道潰瘍、出血、精神癥狀、骨質(zhì)疏松、股骨 頭壞死等。
(2) 免疫抑制劑自身免疫反應對多數(shù)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系， 除激素外，臨床工作中往往還需應用l一數(shù)種免疫抑制劑以控制患者病情發(fā)展。常用的 免疫抑制劑有環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯等，這些藥物的主要副作用有 胃腸道反應、血液系統(tǒng)損害、泌尿系統(tǒng)反應、影響生育、脫發(fā)、增加腫瘤發(fā)生率等。大 劑量人體免疫球蛋白靜脈注射通過抗體封閉作用治療激素和免疫抑制劑不能控制的難 治性患者，國內(nèi)外均有成功經(jīng)驗，但此法對不同的病人療效差異很大，價格昂貴，應用 受限。
(3)造血干細胞移植盡管給予了激素和免疫抑制劑治療，仍有不少病人病情得不到 控制或不能耐受常規(guī)治療帶來的嚴重不良反應，這促使臨床工作者不斷探索新的治療方
法。造血干細胞移植(HSCT)是近十余年來發(fā)展起來的一項治療手段，在治療自身免疫性疾病時主要采用了自體HSCT方式，其治療原理有兩方面， 一是在預處理時，通過 大劑量化療或全身照射摧毀患者的異常免疫系統(tǒng)，對自身免疫性疾病起緩解作用；二是 移植的自體外周血干細胞以重建正常的免疫系統(tǒng)，在免疫重建中阻斷自身抗體的產(chǎn)生或 誘導對自身抗原的免疫耐受。根據(jù)最新統(tǒng)計，目前全世界有近1000例難治性自身免疫 性疾病患者接受了 HSCT，其中包括SSc 190例，SLE 86例，PM/DM 14例，RA86例， MS 368例，Crohn病21例。由于自體免疫疾病自體HSCT后仍有部分患者病情不能控 制，并有一些病例在術后復發(fā)，加之移植治療風險較高，相關死亡率約為7%，高于非 自身免疫性疾病(3%)，制約了該技術的廣泛應用。移植相關死亡率與具體病種相關， 從高到低依次為SSc、 SLE、 MS和RA;病例選擇、支持治療、預處理方案、是否去移 植物中的淋巴細胞等也影響患者的存活率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用。 臍帶間質(zhì)干細胞可以應用于制備治療自身免疫性疾病的藥物中。 所述的自身免疫性疾病是指包括系統(tǒng)性硬化癥、炎性腸病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、
自身免疫性溶血性貧血、混合性結(jié)締組織病、類風濕關節(jié)炎、白塞病、原發(fā)性膽汁性肝
硬化等在內(nèi)的一大類疾病。
所述自身免疫性疾病尤其指系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎和皮肌炎
或多發(fā)性硬化。
所述臍帶間質(zhì)干細胞可以采用以下方法制備
(1) 臍帶間質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)取新生兒臍帶立即放入80%DMEM和20%抗生
素溶液中，4h內(nèi)去掉臍帶靜脈，然后將所述臍帶重新縫合形成環(huán)狀，灌入含n型膠原
酶的PBS緩沖液，6-8 h后，從所述的環(huán)狀臍帶中移出懸液，用PBS稀釋離心后，將沉 淀的細胞接種于含有10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液中，置于5%C02、 37。C飽和 濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
(2) 臍帶間質(zhì)干細胞的傳代步驟(1)中所述臍帶間質(zhì)干細胞培養(yǎng)至貼壁細胞90% 融合時，用PBS洗滌，然后用胰酶消化，完全培養(yǎng)液終止消化，離心去上清，將沉淀的 細胞接種于L-DMEM完全培養(yǎng)液，置37'C、 5 %C02、飽和濕度002培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
(3) 取各代骨髓間質(zhì)干細胞測定細胞表面標記并測定其核型，得具有間質(zhì)干細胞特征 且染色體核型正常的骨髓間質(zhì)干細胞。
發(fā)明人通過調(diào)研大量的案例，發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在異常，在
6疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓MSCs體外生長較正常 人緩慢，易衰老，傳代過程(10代)中活力會逐漸喪失，IL-6、 IL-7mRNA表達降低，并 且MSCs存在細胞骨架異常。發(fā)明人最近的研究又發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡骨髓MSCs體外 向脂肪及軟骨細胞的分化能力較正常明顯降低，移植到裸鼠體內(nèi)成骨也明顯下降。另外， 還發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓MSCs和正常人外周血單個核細胞在體外共培養(yǎng)時， 刺激調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)上調(diào)的能力也明顯低于正常MSCs。由于自身免疫性疾病患 者存在MSCs異常，臍帶MSCs具有誘導免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)的作用，所以能應用于制 備治療自身免疫性疾病的藥物中。
本發(fā)明提出臍帶MSCs在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用。采用臍帶MSCs 制備得到的治療自身免疫性疾病的藥物與自身免疫性疾病常規(guī)治療藥物相比較，具有以 下優(yōu)點臍帶間質(zhì)干細胞作為治療自身免疫性疾病藥物的活性成分，用于治療自身免疫 性疾病具有"治療方便、療效持久"的特點，能幫助患者減少藥物治療的種類和數(shù)量以及 藥物帶來的各種副作用，甚至可能停用免疫抑制劑等藥物治療，降低死亡率和致殘率， 改善患者生活質(zhì)量；目前臍帶來源的間質(zhì)干細胞的基礎研究扎實，技術可推廣程度高， 技術可控，并安全性好，治療費用的接受程度好，受益面廣泛。因此臍帶MSCs在制備 治療自身免疫性疾病藥物中的應用具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。


圖1表示SLE患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后24小時尿蛋白定量的變化；
圖2表示SLE患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后外周血CD4+Foxp3+Treg的變化；
圖3表示SLE患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后疾病活動評分(SLEDAI)評分變化；
圖4表示SLE患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后血清ANA變化；
圖5表示SLE患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后血清抗ds-DNA滴度變化；
圖6表示系統(tǒng)性硬化患者移植臍帶間質(zhì)干細胞后56天脊髓MRI的變化；
其中圖1、圖2、圖5的各" "表示在同一條件下所取不同樣品的測量值，"一"
表示同一條件下各測量值的平均值；
圖l一圖5中，MSCT—臍帶間質(zhì)干細胞移植，MSCT (—) —臍帶間質(zhì)干細胞移
植前，M—月，W—周，P(..是具有統(tǒng)計學意義。
具體實施例方式
實施例1臍帶間質(zhì)干細胞(MSCs)體外分離、培養(yǎng) (一)細胞的來源1新生兒臍帶來源細胞經(jīng)體外擴增培養(yǎng)而成
2商品化臍帶間質(zhì)干細胞(來源江蘇省北科生物技術有限公司和細胞產(chǎn)品國家工程研究 中心)
(二)新生兒臍帶來源的臍帶MSCs分離與培養(yǎng)
1所用設備，材料，試劑
超凈工作臺C02培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機恒溫水浴箱高壓蒸氣滅菌鍋
25 cm2、 75cn^細胞培養(yǎng)瓶離心管(50ml， 15ml)吸管L-DMEM培養(yǎng)液胎牛血清
青霉素/慶大霉素PBS液胰酶II型膠原酶
2臍帶MSCs原代分離、培養(yǎng)
(1) 取新生兒臍帶立即放入80%DMEM和20%抗生素(青霉素G: 167 U/m L，慶大 霉素50mg/mL)溶液中，每段臍帶長4-5cm。
(2) 4h內(nèi)沿著靜脈血管長軸切開，去掉靜脈。
(3) 將臍帶重新縫合形成環(huán)狀，灌入12-15mL含lmg/mLlI型膠原酶的PBS緩沖液。
(4) 6-8h后，從臍帶環(huán)管中移出懸液，用PBS稀釋以減輕粘度，離心(400g，20min)。
(5) 去掉懸液，用PBS重懸，離心(250g， 5min)后，將沉淀的細胞接種于含有10% 胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液中，置于5MC02、 37。C飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(6) 培養(yǎng)每三天半量換液一次。換液后48-72h后可出現(xiàn)貼壁生長的間充質(zhì)樣細胞， 呈短棒狀或梭形樣細胞，有較長的突起，有折光性，貼壁。
3臍帶MSCs傳代
(1) 培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代；
(2) 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；
(3) 加入PBSlml，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，吸除PBS;
(4) 培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰酶lml，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面；
(5) 在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應立即加入完全培養(yǎng) 液hnl終止消化；
(6) 反復吹打瓶壁細胞，細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液；
(7) 將細胞懸液吸入離心管，離心(常溫170g， 5min)，棄上清；
(8) 用L-DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5xl()S個細胞/ml，接種于25 112培養(yǎng)瓶 中，每瓶5ml;
(9) 置37。C、 5%C02、飽和濕度C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8培養(yǎng)代數(shù)2~3代。 4臍帶MSCs細胞凍存
(1) 消化貼壁細胞，步驟同3中的步驟(1) (7);
(2) 加入0.1ml二甲基亞砜(DMSO)， 0.9ml胎牛血清，移入細胞凍存管；
(3) 凍存細胞(4'C， l小時；-20°C， 4小時；-70°C， 12小時；液氮罐保存)。 5臍帶MSCs細胞復蘇
(1) 取出凍存管，立即放入37。C水浴中，搖動，迅速解凍；
(2) 吸管吸出細胞懸液，放入離心管，加入10mlPBS，吹打；
(3) 離心(常溫170g， 5min)，棄上清，重復一次；
(4) 加入L-DMEM完全培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中， (三)臍帶MSCs的鑒定
1細胞總數(shù)
測量細胞懸液的總體積。吸取0.1ml混勻的細胞懸液，滴于細胞計數(shù)板上，計數(shù)。 計算出細胞總數(shù)。 2活細胞比例
進行臺盼藍染色，計數(shù)采集細胞中活細胞所占比例。 3流式細胞儀檢測細胞表面標志
取各代MSCs與FITC或PE標記的CD14、 CD29、 CD14、 CD44、 CD45、 CD 105 作用，流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示CD14、CD14和CD45為陰性，CD29、CD44和CD105 為陽性，呈現(xiàn)為間質(zhì)干細胞的特征。 4臍帶MSCs染色體核型測定
取各代臍帶MSCs，培養(yǎng)上清中加入秋水仙素使其最終濃度為lpg/ ml，繼續(xù)培養(yǎng) 30min，棄上清，1%枸櫞酸鈉低滲液處理50min，用固定液(甲醇:冰乙酸3:1)固定， 原位收獲細胞，45'C烤片過夜，胰酶法G顯帶。每例標本計數(shù)15個中期分裂相，分析 5個核型。該染色體核型檢測結(jié)果顯示正常染色體核型。
實施例2臍帶MSCs給藥方法 (一)新生兒臍帶來源的臍帶MSCs使用前最終鑒定
1無菌試驗
如培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)任何異常，常規(guī)在臍帶MSCs輸注患者前3天，最后一次換液 后，對每一培養(yǎng)瓶中的上清液作無菌試驗，培養(yǎng)細菌和霉菌。無菌試驗按《中國生物制
9品規(guī)程(1995)》的規(guī)定進行。細胞上清液不得有細菌、霉菌生長。 2外觀及鏡下觀察
在輸注的當天，如無菌試驗報告無細菌、霉菌生長，對培養(yǎng)瓶中的上清液進行顏色 觀察，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞密度、有無細菌或霉菌生長。如有可疑，須 再次抽樣作無菌試驗培養(yǎng)細菌、霉菌。
3活細胞比例
輸注當天對收集的細胞懸液抽樣檢查活細胞比例占95%以上。 4染色體核型
臍帶MSCs輸注前3天抽樣行染色體核型檢查應為正常染色體核型。 5表面標志
臍帶MSCs輸注前3天抽樣行表面標志測定CD14、 CD34、 CD45表達陰性；CD29、 CD44、 CD45表達陽性。
(二) 商品化臍帶間質(zhì)干細胞買來后直接使用。
(三) 臍帶MSCs的給藥方法
1. 所用設備，材料，試劑
超凈工作臺離心機 一次性注射器注射用生理鹽水人血白蛋白
2. 輸注前操作
當細胞總數(shù)量達到(l 2)xl()S/kg患者體重，可作輸注準備
(1) 輸注前2日留取細胞培養(yǎng)上清液做細菌、真菌培養(yǎng)、支原體檢測及內(nèi)毒素測定(送 本院檢驗科細菌室)；
(2) 在超凈工作臺內(nèi)取細胞，計數(shù)細胞濃度、活細胞比例、細胞表面標志、細胞染色 體核型測定，具體見MSCs的鑒定；
3. 輸注操作
(1) 消化所有細胞(操作同前)，離心(常溫170g， 5min)，棄上清；
(2) 將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入生理鹽水，混勻后離心，棄上清。重復一次。
(3) 經(jīng)過以上洗滌步驟后，加入含5%人血白蛋白的生理鹽水lOOml，輸注的細胞懸 液中僅殘留不足0.5%的細胞培養(yǎng)液。抽取0.1ml細胞懸液計細胞數(shù)。標明患者姓名，準 備輸注。
(4) 細胞輸注前半小時給患者靜脈甲強龍40mg。
(5) 開放手背靜脈，連接裝有細胞的分離袋，調(diào)整輸注速度。(6)輸注過程中觀察患者反應，及時對癥處理。整個過程耗時約15分鐘。
實施例3臍帶MSCs在制備治療不同自身免疫性疾病的藥物中的應用 (一)臍帶MSCs在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的藥物中的應用
(1) 臍帶MSCs在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型的藥物中的應用 MRL/lpr狼瘡鼠為SLE的動物模型。我們應用臍帶MSCs移植治療MRL/lpr鼠，
研究發(fā)現(xiàn)移植后，抗ds-DNA抗體滴度、24h尿蛋白定量、血肌酐及尿素氮水平較對照 組明顯減輕。對照組小鼠腎臟病理改變表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小球系膜細胞增殖、基質(zhì) 增寬，并可見新月體形成，腎間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞浸潤；臍帶MSCs移植治療后腎小球 硬化及間質(zhì)纖維化程度均較對照組為輕，表現(xiàn)為系膜細胞、系膜基質(zhì)輕至中度增生，局 灶性硬化，偶爾可見的腎間質(zhì)的炎癥細胞的浸潤。對照組IgG、 IgM系膜下、上皮上、 內(nèi)皮下廣泛沉積，治療組腎小球IgG、 IgM沉積明顯減少，治療組新月體形成率與對照 組比有統(tǒng)計學差異。這種治療作用可能與抑制單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、高遷移 率族蛋白-1 (HMGB-1);上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞等有關。對照組MRL/lpr鼠出現(xiàn)典型間質(zhì) 性肺炎的改變，表現(xiàn)為肺間質(zhì)內(nèi)血管充血水腫以及淋巴細胞和單個核細胞浸潤，細支氣 管和小血管周圍出現(xiàn)灶性淋巴細胞和單個核細胞聚集，部分肺組織實變。臍帶MSCs 移植治療組炎癥程度明顯減輕。CFSE標記的臍帶MSCs在MRL/lpr鼠體內(nèi)能歸巢于腎 臟、肺臟、肝臟等組織器官。
(2) 臍帶MSCs在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的藥物中的應用 18例SLE患者均符合美國風濕病學院(ARA) 1997年修訂的SLE分類診斷標準，疾
病活動指數(shù)評分參照SLEDAI法，SLEDA&8分為活動期，SLEDAK8分為非活動期。 入選標準i)確診為SLE的患者，SLEDA&8，年齡15 70歲，男女兼有；ii)重癥
狼瘡難治性狼瘡性腎炎，24小時尿蛋白定量^lg;難治性全血細胞減少；重度肺動脈 高壓；難治性神經(jīng)精神狼瘡；重癥狼瘡性肺炎；iii)強的松維持量大于20mg/日；iv)環(huán) 磷酰胺0.4 0.6/m2，半月1次，治療半年無效；或其它免疫抑制劑，如驍悉2g/日，治療 3月無效；V)試驗前簽署知情同意書。
移植方案預處理給予CTX0.8-1.8g,分2-3天靜脈輸入，隔日予MSCs移植，移植細 胞數(shù)為lxl(^/kg體重。
療效評價觀察移植前及移植后l周、l月、3月、6月、12月、18月、24月患者SLEDAI 評分、24小時尿蛋白、血清肌酐、尿素氮、ANA、抗ds-DNA抗體滴度、外周血調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)數(shù)量及Thl、 Th2型細胞因子變化，評價移植療效。
結(jié)果移植后患者尿蛋白下降，腎炎得到改善(見圖1)，患者調(diào)節(jié)性T細胞上升 (見圖2)，疾病活動改善(見圖3)，血清ANA抗體滴度下降(見圖4)，血清ds-DNA 抗體滴度下降(見圖5)。
(二) 臍帶MSCs在制備治療系統(tǒng)性硬化癥的藥物中的應用
1. 病例入選標準l)確診為系統(tǒng)性硬化癥，2)已用激素和l種以上免疫抑制劑治 療半年以上，無明顯療效者，3)簽署知情同意書同意MSCs治療。
2. 排除標準1)患者存在嚴重的感染，2)疾病終末期，己出現(xiàn)重要臟器功能嚴 重受損。
3. 移植方案MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為lxl(^/kg體重。
4. 治療評價共治療6例患者，其中男性4例。移植前、移植后1月、3月、12月對 患者內(nèi)臟損傷及皮膚硬化記分進行評估，結(jié)果顯示患者心、肺、腎功能保持穩(wěn)定，皮膚 積分逐步改善，皮膚潰瘍愈合加速。
典型病例
俞x，男，40歲，因"四肢皮膚多發(fā)性改變4年"入院?；颊?年前無明顯誘因下出現(xiàn) 雙下肢外側(cè)皮膚局限性腫脹、增厚、變硬，繼之向周圍蔓延融合，4個月后雙下肢足部 以外的皮膚全部變硬，踝關節(jié)和膝關節(jié)屈曲困難，踝關節(jié)側(cè)面和胭窩皮膚皸裂、破潰、
疼痛。繼而出現(xiàn)雙手臂、雙足皮膚變硬。査體頭、面、頸、雙手部皮膚地圖樣色素缺
失，張口困難，四肢、臀部、下腹皮膚增厚變硬，有蠟樣光澤，胸腹部皮膚局限性色素 沉著，四肢大關節(jié)處皮膚變薄，有鱗屑樣脫屑，胭窩、雙踝關節(jié)屈側(cè)皮膚散在潰瘍，少
量滲液，紗布包扎，四肢肌力正常，雙踝關節(jié)和膝關節(jié)屈曲困難。皮膚活檢示(右前 臂)復磷上皮輕度萎縮，真皮層膠原纖維增生，皮膚附屬器上移，皮下脂肪組織內(nèi)血管 增生擴張，血管周圍炎細胞浸潤，診斷為"系統(tǒng)性硬化癥"，強的松、青霉胺、秋水仙堿
等治療效果不明顯。入院后完善相關檢查，預處理給予CTX0.6x3d后，行臍帶間質(zhì)干細 胞移植術，共輸細胞數(shù)7.2><107個。術后三天患者破潰處皮膚廣泛發(fā)紅，雙胭窩破裂皮膚 有愈合趨勢，滲出減少，皮膚疼痛有明顯改善，術后一周患者全身皮膚緊繃感、張口困 難較前略有好轉(zhuǎn)，疼痛明顯減輕。臍帶間質(zhì)干細胞療效顯著，出院后強的松減量為10mg qd，繼續(xù)服用丹參滴丸，門診隨診調(diào)整環(huán)磷酰胺用量。
(三) 臍帶MSCs在制備治療多發(fā)性肌炎/皮肌炎的藥物中的應用
1.病例入選標準1)確診為多發(fā)性肌炎/皮肌炎，2)已用激素和l種以上免疫抑制劑治療半年以上，無明顯療效者，3)簽署知情同意書同意MSCs治療。
2. 排除標準1)患者存在嚴重的感染，2)疾病終末期，已出現(xiàn)重要臟器功能嚴
重受損。
3. 移植方案MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為lxl(^/kg體重。
4. 治療評價共治療3例患者，其中男性2例。移植前、移植后1月、移植后3月、 移植后12月對患者肌力、皮損情況進行評估，并行肌酶、肌肉MRI檢査判斷肌肉炎癥有 無變化。結(jié)果顯示患者治療后肌無力癥狀改善，肌酶迅速下降并保持穩(wěn)定，MRI檢査顯 示肌肉炎癥好轉(zhuǎn)。
典型病例
徐xx，女性，40歲，因"反復四肢無力5個月"入院(2008-09-21)?；颊?個月前無明 顯誘因下出現(xiàn)雙下肢近端肌肉乏力，步行、抬腿均費力，并進行性加重，伴雙下肢近端 肌肉酸痛，雙手背部腫脹，隨后出現(xiàn)雙上肢近端肌肉無力，上抬雙臂、持物困難，查CK 6002U/L,肌電圖示神經(jīng)性損害，肺功能示重度限制性通氣功能減退、彌散量明顯降低； 胸部CT示肺間質(zhì)病變。診斷為"多發(fā)性肌炎、肺間質(zhì)病變"，予"激素、CTX"等治療后好 轉(zhuǎn)。3個月前又出現(xiàn)雙下肢乏力，下蹲站起、抬腿、步行均困難，梳頭困難，生活需家 屬協(xié)助；2月余前出現(xiàn)雙下肢浮腫，間斷發(fā)熱，最高體溫39.5'C，活動后胸悶氣喘，査 CK 1879U/L;血漿白蛋白29.7g/L;胸部CT示雙肺間質(zhì)性改變伴炎癥；甲狀腺功能示FT3 2.18pmol/L， T3 1.05nom/L。入院后體檢雙手背輕度腫脹，雙下肢輕度凹陷性浮腫， 雙上肢肌力5級，雙下肢肌力4級，肌肉無壓痛，肌張力正常。輔檢AST90U/L， CK4200U/L， LDH808U/L。 2008-09-24行異基因臍帶間質(zhì)干細胞移植，共輸細胞數(shù) 6.2"07個，術后患者無不適主訴。移植后一周患者感雙下肢無力明顯好轉(zhuǎn)，查體雙上 肢肌力5級，雙下肢肌力4級，復查CK400U/L， MRI檢査顯示肌肉炎癥好轉(zhuǎn)，予以出院。 (四)臍帶MSCs在制備治療多發(fā)性硬化的藥物中的應用
1. 病例入選標準l)確診為多發(fā)性硬化，2)已用激素和l種以上免疫抑制劑治療 半年以上，無明顯療效者，3)簽署知情同意書同意MSCs治療。
2. 排除標準1)患者存在嚴重的感染，2)疾病終末期，已出現(xiàn)重要臟器功能嚴 重受損。
3. 移植方案MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為lxl(^/kg體重。
4. 治療評價共治療5例患者，其中男性2例。移植前、移植后1月、移植后3月、 移植后12月對患者肌力情況進行評估，并行頭顱及脊髓MRI檢查判斷移植前后有無變化。結(jié)果顯示患者治療后肌無力癥狀改善，頭顱及脊髓MRI好轉(zhuǎn)。 典型病例
患者女性，55歲，因"全身麻木乏力5月"于2008年8月14日入院?；颊哂?008年3 月出現(xiàn)雙膝以下麻木并逐漸向上發(fā)展；5月麻木感發(fā)展到頸部，且出現(xiàn)雙下肢乏力；7月 雙下肢乏力急劇加重，不能行走及活動，同時出現(xiàn)雙上肢乏力，尤其左上肢抬舉不能。 入院時體格檢查體溫37 'C，脈搏78次/分，呼吸21次/分，血壓104/70 mmHg。 心肺聽診正常，肝脾肋下未及，雙下肢無水腫；語言尚流利，雙側(cè)瞳孔等大等圓，直徑 3mm，對光反射及集合反射均靈敏；頸部以下深、淺感覺均減退，腰部以下及左側(cè)肢體 明顯；四肢肌肉萎縮，下肢明顯；四肢肌張力正常；雙下肢肌力0級，左上肢肌力2級， 右上肢肌力3級；雙側(cè)巴氏征陽性。輔助檢查血、尿、大便常規(guī)及生化全套基本正常。 查腦脊液細胞數(shù)6個/ul，單核細胞增多；頭顱及脊髓MRI示胼胝體、雙側(cè)額、頂、枕葉 異常信號，延髓至C6水平頸髓異常信號，脊髓圓錐內(nèi)異常信號。診斷為多發(fā)性硬化，給 予甲基潑尼松龍500mg/dX5d后逐漸減至維持量以及營養(yǎng)神經(jīng)等治療無明顯療效。根據(jù) 擴展的功能障礙狀況量表(expanded disbility status scale , EDSS)，該患者EDSS評分為8.5 分。因傳統(tǒng)方法治療欠佳，在獲得患者知情同意后，決定行MSCs移植。
在連用CTX 0.6 g/dX3d后，我們于2008年8月19日對該患者行臍帶MSCs移植， 鞘內(nèi)注射臍帶MSCslOml (細胞數(shù)為1X107)，并靜脈輸注臍帶MSCs 20ml (細胞數(shù)為 2X107)。移植后第三天，下肢肌力開始恢復，左下肢肌力2—級，右下肢肌力l級；移 植后第六天，軀體麻木感開始減輕；移植后第九天，左下肢肌力2級，右下肢肌力2一 級，左上肢肌力3級，右上肢肌力4級，患者可在幫助下坐起，但需要旁人支撐，雙下 肢懸垂并可作主動活動，EDSS評分為8分；移植后第十六天，雙下肢肌力2級，患者 可在幫助下坐起，無需旁人支撐；移植后第六十天，雙下肢肌力3級，可下地行走。復 查脊髓MRI示Cl~5頸段脊髓內(nèi)及腰段脊髓內(nèi)片狀長Tl長T2異常信號，頸段脊髓內(nèi) 病灶范圍較移植前明顯縮小(圖6)，患者神經(jīng)組織恢復，移植過程及移植后均未出現(xiàn)毒 副反應。
發(fā)明人通過調(diào)研大量的案例，發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在異常，在 疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因為臍帶MSCs有獨特的免疫調(diào)節(jié)和修復作用，所以能 應用于制備治療自身免疫性疾病藥物中，不僅包括上述在制備治療實施例中提到的系統(tǒng) 性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎/皮肌炎和多發(fā)性硬化的藥物中的應用，還包括 在制備治療其它的自身免疫性疾病中的藥物中的應用。
1權(quán)利要求
1. 臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中 的應用，其特征在于所述自身免疫性疾病是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、 多發(fā)性肌炎和皮肌炎或多發(fā)性硬化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用，所述臍帶間質(zhì)干細胞采用以下方法制備(1) 臍帶間質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)取新生兒臍帶立即放入80%DMEM和20% 抗生素的溶液中，4h內(nèi)去掉臍帶靜脈，然后將所述臍帶重新縫合形成環(huán)狀，灌 入含II型膠原酶的PBS緩沖液，6-8 h后，從所述的環(huán)狀臍帶中移出懸液，用 PBS稀釋離心后，將沉淀的細胞接種于含有10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng) 液中，置于5%<:02、 37t:飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；(2) 臍帶間質(zhì)干細胞的傳代步驟(1)中所述臍帶間質(zhì)干細胞培養(yǎng)至貼壁細 胞卯％融合時，用PBS洗滌，然后用胰酶消化，完全培養(yǎng)液終止消化，離心去 上清，將沉淀的細胞接種于L-DMEM完全培養(yǎng)液，置37。C、 5 %C02、飽和濕度C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(3) 取各代骨髓間質(zhì)干細胞測定細胞表面標記并測定其核型，得具有間質(zhì)干細 胞特征且染色體核型正常的骨髓間質(zhì)干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了臍帶間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用。自身免疫性疾病患者的骨髓間質(zhì)干細胞存在異常，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。臍帶間質(zhì)干細胞具有誘導免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)的作用，能應用于制備治療自身免疫性疾病的藥物中。
文檔編號A61K35/44GK101480410SQ20091002508
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者馮學兵, 孫凌云, 張華勇 申請人:南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院