專利名稱：一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口服緩控釋制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含中藥多組分銀杏酮酯前體脂質(zhì)體組合 物及制備方法，該凍干粉末可以灌裝硬膠囊或制成顆粒劑供口服給藥。本發(fā)明的前體脂質(zhì)體 可促進(jìn)難溶性黃酮類藥物口服吸收，體內(nèi)生物利用度是普通片劑的3倍以上。
背景技術(shù)：
銀杏酮酯(GBE50)為新一代銀杏葉提取物，含多種有效成分，銀杏總黃酮>44%，銀 杏黃酮醇苷》24%，銀杏總內(nèi)酯》6%，其中銀杏黃酮醇苷含槲皮素、山奈酚和異鼠李素，具 有改善人體血液循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈作用；有效防止心肌和腦局部缺血，改善老年 性癡呆和血管性癡呆高危人群的認(rèn)知功能，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞、 腦血栓和缺血性腦中風(fēng)等疾病。
銀杏酮酯中多組分黃酮醇苷難溶于水，結(jié)構(gòu)中均含有多酚羥基，較易氧化、在強(qiáng)堿性條 件下不穩(wěn)定。銀杏酮酯普通片劑(或膠囊劑)口服后銀杏黃酮與萜內(nèi)酯多種組分在胃腸吸收 機(jī)制復(fù)雜，由于銀杏黃酮醇苷的生物活性較弱，導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度低[張曉丹，馬靈芝， 銀杏葉總黃酮的研究進(jìn)展.中國(guó)心血管雜志，2006， 11(5):385-387]。 Bombarddli研究發(fā)現(xiàn)，黃 酮類化合物與天然磷脂載體有較好的親和力，兩者可結(jié)合形成復(fù)合物，磷脂黃酮復(fù)合物發(fā)揮 協(xié)同治療作用，能有效預(yù)防心腦血管類疾病的發(fā)生，增強(qiáng)銀杏黃酮治療心腦血管疾病的療效。 [White TC , Marr KA ， Bowden RA. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. C/z'"/c"/M.cro6油gy ，1998 ， 11 (2): 382 -402.]。劉衍興等研
究證明磷脂脂質(zhì)體對(duì)銀杏葉乙醇提取物具有明顯藥理增效作用[劉衍興,郭輝.磷脂脂質(zhì)體對(duì) 銀杏葉乙醇提取物藥理增效作用實(shí)驗(yàn)觀察.基層中藥雜志,1998，12(4):35]。
銀杏酮酯普通片劑或杏靈顆粒劑口服體內(nèi)普遍存在黃酮類成分吸收無(wú)規(guī)律，導(dǎo)致制劑口 服生物利用度偏低，為解決上述問(wèn)題。CN 101019837A公開(kāi)了銀杏酮酯分散片的制備方法， 測(cè)定總銀杏黃酮醇苷的溶出量，由于銀杏酮酯中含多種糖類，黏性大且易吸潮，中藥分散片 制備工藝復(fù)雜易產(chǎn)生黏沖、溶出遲緩等問(wèn)題。CN 1651007A公開(kāi)了一種杏靈滴丸的制備方法， 滴丸劑雖然能適當(dāng)增加藥物釋放，但體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線面積(AUC)與普通片無(wú)明顯 差異，由于峰濃度過(guò)高常存在潛在臨床用藥的安全隱患，專利中未標(biāo)明測(cè)定總黃酮混合物的 溶出度還是幾種黃酮單一成分。CN 1679519A公開(kāi)了一種穩(wěn)定長(zhǎng)效的銀杏酮酯軟膠囊及其制 備方法，擬解決藥物體內(nèi)吸收，維持長(zhǎng)效作用，發(fā)明未公開(kāi)幾種黃酮醇苷體內(nèi)血藥濃度測(cè)定方法和藥動(dòng)學(xué)。以上劑型僅改變了銀杏酮酯的分散狀態(tài)，并未解決中藥黃酮類成分口服跨膜 吸收困難的問(wèn)題。
大部分藥物口服給藥直接進(jìn)入血液循環(huán)通過(guò)肝門(mén)系統(tǒng)吸收，脂溶性藥物在外源性化合物 刺激下與腸粘膜脂蛋白甘油三酯乳糜微粒相互作用，可經(jīng)過(guò)腸淋巴系統(tǒng)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。磷脂、 磷脂衍生物、膽固醇等類脂質(zhì)載體能促進(jìn)類脂蛋白的形成，使親脂性藥物與類脂蛋白的脂質(zhì) 核心結(jié)合，通過(guò)淋巴旁路系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收進(jìn)入體循環(huán)，可避免首過(guò)效應(yīng)、增加藥物的口服吸收， 延長(zhǎng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體循環(huán)的時(shí)間，達(dá)到緩釋作用[Caitriona.M.O,Driscoll,Lipid-based formulations for intestinal lymphatic delivery-European Journal of Pharmaceutical Sciences 2002 (15) 405-415]
脂質(zhì)體作為銀杏酮酯口服的類脂質(zhì)載體，可有效包裹黃酮類成分在脂質(zhì)雙分子層，防止 酶水解或肝臟首過(guò)作用，增強(qiáng)其在胃腸道中的穩(wěn)定性，易于被腸粘膜吸收。另外脂質(zhì)體可以 使藥物被動(dòng)靶向心肌缺血組織，尤其是梗塞的心肌，為攜載銀杏黃酮類藥物治療心血管疾病 的理想載體。脂質(zhì)體中親水性藥物組分在制備和儲(chǔ)存過(guò)程易存在滲漏問(wèn)題，藥物分配在外水 相增多，使包封率降低；將藥物制成固體前體脂質(zhì)體，可以提高制劑長(zhǎng)期Ii存過(guò)程藥物的穩(wěn) 定性，有效解決普通脂質(zhì)體的聚集、沉降、融合滲漏和滅菌磷脂的氧化等問(wèn)題。為延緩藥物 釋放，增強(qiáng)藥物療效，降低副作用，開(kāi)發(fā)銀杏酮酯口服固體前體脂質(zhì)體十分必要，具有重要 的理論價(jià)值和臨床研究意義，其市場(chǎng)前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種增加銀杏酮酯口服吸收的前體脂質(zhì)體及制備方法，涉及一種能夠有效抑 制腸道酶對(duì)有效活性成分銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的降解。脂質(zhì)體中的類脂成分磷脂和膽固醇能 夠促進(jìn)類脂蛋白的形成，使藥物通過(guò)淋巴系統(tǒng)旁路轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體循環(huán)吸收，口服后顯著增加藥 物跨胃腸膜吸收的速度，防止胃腸酶降解，避免首過(guò)效應(yīng)，提高中藥制劑口服相對(duì)生物利用 度；另通過(guò)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)可提高藥物與組織的親和性，被動(dòng)靶向于病灶部位，提高心血管藥物的 藥效。更進(jìn)一步，本發(fā)明能延緩脂質(zhì)體中藥物持續(xù)緩慢釋放，與普通片劑比較其平均駐留時(shí) 間(MRT)延長(zhǎng)，患者每天給藥次數(shù)由2 3次減為1次，給藥劑量降低，大大提高了病人順應(yīng) 性，從而最大限度減少中藥制劑臨床用藥的不安全因素。
本發(fā)明的銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體及其制備方法，需解決的關(guān)鍵技術(shù)在于如何解決液
體脂質(zhì)體中磷脂和藥物的氧化和降解問(wèn)題？尤其如何解決脂質(zhì)體在je存過(guò)程有效活性成分泄
漏和磷脂氧化的穩(wěn)定性難題。本發(fā)明采用逆向蒸發(fā)-多次凍融法制備固體凍干粉末，提供一種 脂溶性藥物被穩(wěn)定包裹在磷脂雙分子層的單室脂質(zhì)體，保持了單室脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的完整性克服脂質(zhì)體聚集、融合及藥物滲漏等不穩(wěn)定因素。本發(fā)明的銀杏酮酯含銀杏總黃酮》44%， 銀杏黃酮醇苷》24%，銀杏總內(nèi)酯》6%，既可使前體脂質(zhì)體達(dá)到高包峰率，又具有較高載藥 量，平均粒徑為100 350nm，具有較窄粒徑分布和低滲漏率。 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體，其特征在于主要由銀杏酮酯、磷脂、膽固醇、表面活 件劑按重量份數(shù)計(jì)為1:2 35:0.5 15: 0.08 3.0份；
其較好的銀杏酮酯、磷脂、膽固醇、表面活性劑配比按重量份計(jì)為1:4 25:2 10:0.2 2,0份。
一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體，其特征在于銀杏酮酯源于天然銀杏葉提取物，主要有 效活性成分由銀杏總黃酮、銀杏萜內(nèi)酯等組成，選自含銀杏總黃酮》44%，銀杏黃酮醇苷》 24%,銀杏總內(nèi)酯》6%。
本發(fā)明所述的口服前體脂質(zhì)體，其中磷脂選自大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、天然或合成心磷 脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油或磷脂 酰膽堿中的一種或幾種。
所述表面活性劑選自聚山梨酯80、聚山梨酯85、泊洛沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油 (CremolphorEL)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(CremolphorRH40/RH60)、或辛酸癸酸聚乙二醇甘 油酯(Labrasol)的一種或幾種。
一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，按如下方法制備稱取磷脂、 膽固醇溶于有機(jī)溶劑(有機(jī)相)，另稱取銀杏酮酯與含表面活性劑的緩沖液分散溶解(水相)。 將水相緩慢注入上述有機(jī)相，超聲乳化形成0/W乳劑，于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑得乳膠 液，將分散相置高壓乳勻機(jī)(5000psi) 5(TC下勻化3 5次，即得脂質(zhì)體混懸液。
上述有機(jī)溶劑選自氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或者它們中任選 的混合液。
上述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、醋酸-醋酸鉀緩沖液、醋酸-醋酸鈉 緩沖液或硼砂-氯化鈣緩沖液，pH5.0 7.0。
一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體凍干粉的制備方法，其特征在于，按如下步驟制備
(1) 稱取磷脂、膽固醇溶于有機(jī)溶劑(有機(jī)相)，另稱取銀杏酮酯與含表面活性劑的緩 沖液分散溶解(水相)。將水相緩慢注入上述有機(jī)相，超聲乳化形成0/W乳劑，于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去有機(jī)溶劑得乳膠液，將分散相置高壓乳勻機(jī)(5000psi) 50'C下勻化3 5次，即得脂質(zhì) 體混懸液。
(2) 將凍干保護(hù)劑溶于純凈水與上述脂質(zhì)體混懸液混合均勻，分裝于容器一70。C低溫預(yù)凍2h，反復(fù)-解凍冷凍二次，再經(jīng)冷凍干燥24h，即得前體脂質(zhì)體凍干粉。
本發(fā)明所述凍干保護(hù)劑選自甘露醇、乳糖、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、氯化鈉、環(huán)糊精、 麥芽糖、蔗糖、右旋糖苷或果糖的一種或幾種。較好比例為1份藥物加入2 25份凍干保護(hù)劑， 優(yōu)選1份藥物加入4 15份凍干保護(hù)劑。
本發(fā)明的銀杏酮酯前體脂質(zhì)體的固體制劑，按照常規(guī)方法灌裝硬膠囊劑或制成顆粒劑。 其固體制劑輔料選自噴霧干燥乳糖(Flowlac100)、結(jié)塊乳糖(Tablettose70,80,100)、復(fù)合物 噴霧干燥乳糖(Microcelac80，100: 75% Lactose Monohydrate， 25% Microcrys Cellulose)篩分 乳糖(Prismalac40，60,80,100)、微晶纖維素(Avicel PH101,PH102,PH301,PH302)、可壓性淀 粉、糊精、淀粉、羥丙甲纖維素、羥丙基纖維素、聚維酮、滑石粉、硬脂酸鎂、微粉硅膠或 微粉硅膠/微晶纖維素復(fù)合材料。
本發(fā)明采用逆相蒸發(fā)-多次凍融法制備銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體，銀杏酮酯中有效活性成 分黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯被有效穩(wěn)定保護(hù)在雙分子層，提高了多組分銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯貯存 過(guò)程的穩(wěn)定性。前體脂質(zhì)體的平均粒徑為100 350nm，三種黃酮醇苷的包封率為50 90%， 滲漏率明顯降低。本發(fā)明提供的銀杏酮酯前體脂質(zhì)體經(jīng)口服給藥，由于加入了表面活性劑， 可有效抑制P-糖蛋白對(duì)活件成分的外排代謝作用，黃酮成分跨胃腸膜吸收量顯著增加；另外 磷脂類載體促進(jìn)了類脂蛋白形成，使黃酮類親脂性成分通過(guò)腸淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，故本發(fā)明前體 脂質(zhì)體制劑可提高口服生物利用度，減少臨床用藥劑量(由含銀杏酮酯40mg/次減為15mg/次)， 每天給藥為一次，達(dá)到提高藥物臨床療效和降低毒副作用的目的。
本發(fā)明采用快速、準(zhǔn)確、靈敏的梯度洗脫HPLC法檢測(cè)銀杏酮酯中有效活性成分含量和釋 放度，采用滲透法研究前體脂質(zhì)體包峰率、載藥量和滲漏率，解決了定量測(cè)定多組分中藥脂 質(zhì)體指標(biāo)性成分質(zhì)量問(wèn)題。
銀杏黃酮醇苷含槲皮素、山奈酚和異鼠李素等成分，以葡萄糖、鼠李糖等形式結(jié)合而成 糖苷，通常黃酮醇苷采用強(qiáng)酸水解為黃酮苷元再進(jìn)行HPLC分析，按轉(zhuǎn)化因子計(jì)算總黃酮醇 苷的含量。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是采用梯度洗脫RP-HPLC法研究三種黃酮成分的包峰率和載藥量， 提供具體如下的質(zhì)量研究?jī)?nèi)容
1.銀杏酮酯中黃酮成分的包峰率和載藥量測(cè)定 (1)梯度洗脫RP-HPLC法色譜條件色譜柱Kromasil-ds柱(150 mmX4.6 mm, 5 pm);流動(dòng)相0.2%磷酸水溶液:甲醇(A:B)系統(tǒng)，梯度洗脫程序0 min， B保持4P/。； 0 —17min， B為41%—85%; 17—17.1 min， B為85%—41% ; 17.1—20min， B保持41%。 檢測(cè)波長(zhǎng)371 nm;柱溫30°C;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20nL。
標(biāo)曲曲線方程槲皮素C=1.26X 10^ + 7.79X10-2， r = 0.9998 (0.5 12.0嗎'mU1);山奈酚 C-lJSXKT^ + l^SXlO-1, r = 0.9998 (0,5 12,0 lig'mL-1) 異鼠李素C= 1.78X 10-4j+ 3.60X10-2; r = 0.9998 (0.1 4.0嗎'mL—"
(2)包峰率和載藥量測(cè)定稱取銀杏酮酯脂質(zhì)體凍干粉適量，pH6.8的磷酸緩沖液水合 分散為脂質(zhì)體混懸液。吸l mL于透析袋中兩端扎緊，置pH6.8的磷酸鹽緩沖液20mL， 37。C水 浴透析，磁力攪拌速度為200r/min，于5h吸取透析液5 mL置量瓶甲醇破膜稀釋，梯度洗脫 RP-HPLC法測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算透析外液中游離藥物總量。另吸上述脂質(zhì)體混懸 液lmL，加甲醇5mL和25。/。鹽酸lmL, 8CTC水浴中水解60min。同法測(cè)定峰面積計(jì)算脂質(zhì)體中 藥物總量，計(jì)算包峰率和載藥量。
包封率(％) = (l —透析外液藥物總量/脂質(zhì)體藥物總量)X100%
載藥量(％)氣附-附)/『cX 1000/0
『,為脂質(zhì)體膠體溶液中藥物總含量，『,為游離藥物量，『c為磷脂用量。W=(『r蹄彼素 + ^山奈酷+『(異鼠李素)X2.519;『,=(^嫩索+ ^山奈酚+ W異鼠李索)X2.52。
2.脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化采用薄膜蒸發(fā)法、逆向蒸發(fā)法和逆向蒸發(fā)-反復(fù)凍融法制備脂 質(zhì)體。以脂質(zhì)體粒徑、各黃酮醇苷的包封率和滲漏率為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表l。
表l工藝條件對(duì)黃酮醇苷指標(biāo)成分的影響
槲皮素 山奈酚 異鼠李素
工藝 粒徑 _
包封率滲漏率包封率滲漏率包封率滲漏率
條件 (nm)
(%)(%)(%)(%)(%)(%
薄膜蒸發(fā)法325.536.25.427.64.925.34.7
逆向蒸發(fā)法(凍融前)297.271.35.265.64.663.46.3
一次凍融208.675.33.269.12.868.92.2
逆向蒸發(fā)-二次凍融180.381.81.379.31.776.61.5
凍融法三次凍融271.065.41.458.42.157.71.9
試驗(yàn)表明，薄膜蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體粒徑較大、包封率較低；逆向蒸發(fā)-反復(fù)凍融法具有操 作簡(jiǎn)單，能有效保護(hù)藥物在外水相的穩(wěn)定性，減少藥物的滲漏性，提高包封率，逆向蒸發(fā)-二次凍融法參數(shù)較易控制，適于脂質(zhì)體中試生產(chǎn)。 (2)逆向蒸發(fā)溫度的選擇
表2逆向蒸發(fā)溫度對(duì)三種銀杏黃酮物理特性的影響(n=3)溫度平均粒徑包封率(％)
(nm)槲皮素山奈酚異鼠李素
30343.6±3.270.1±1.965.3±2.661.0±3.0
40175.5土1.981.2土1.178.2±2.678.4±2.1
50422.3±5.864.2±1.361,2±1.850.1±1.3
逆向蒸發(fā)溫度選擇4(TC，制備的脂質(zhì)體粒徑較小、包封率高。
(3)超聲乳化時(shí)間的選擇
表3超聲乳化時(shí)間對(duì)三:種銀杏黃酮物理特性的影響(n==3)
超聲時(shí)間平均粒徑包封率(％)
(min)(nm)槲皮素山奈酚異鼠李素
10387.2±3.969.8±2.661.3士2.257.5±2.3
20178.6±1,782.1±3.479.2±2.777.6±3.0
30180.3±1.673.9±3.170.2±3.765.3±2.2
超聲乳化10min，乳劑形成不夠均勻，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)20min后，脂質(zhì)體的粒徑和包封率基本不變，故優(yōu)選乳劑超聲時(shí)間為20min。
(4)水合介質(zhì)種類的影響采用三種水合介質(zhì)溶解藥物及輔料制備脂質(zhì)體混懸液，測(cè)定粒徑、包封率等指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4水合介質(zhì)對(duì)脂質(zhì)體中銀杏黃酮特性的影響(n=3)
水合介質(zhì)種類包封率(％)平均粒徑Zeta電位
槲皮素山奈酚異鼠李素(nm)(mV)
pHl.2鹽酸溶液55.1±0,251.8±1.349.3±1,5260.9±2.118.8±0.2
純凈水78.7±0.675.5±0.972.6±1.2193.2±1.517.4±0.8
pH6.8緩沖液81.4±0.477.3±1.475.U0.9189.2±1.719.0±0.7
pH7.4緩沖液75.9±1.373,3±2.571.3±1.3202.8±1.619.4±0.3
由于藥物為弱酸性在pH1.2的鹽酸溶液中難分散溶解，包峰率降低，pH7.4緩沖液能增加藥物的分散溶解，也會(huì)影響有效活性成分萜內(nèi)酯如銀杏內(nèi)酯A、 B、 C和白果內(nèi)酯的穩(wěn)定性，故脂質(zhì)體水合介質(zhì)優(yōu)選pH5.0 7.0。
(5)表面活性劑對(duì)銀杏黃酮的增溶作用配制含1.0%聚山梨酯-80、十二烷基硫酸鈉、泊洛沙姆188、 CremopherRH40水溶液和純凈水各100mL，取銀杏酮酯適量加入上述溶液，25'C振蕩24h達(dá)藥物平衡溶解，吸取5mL過(guò)濾，照"l.質(zhì)量測(cè)定方法項(xiàng)下測(cè)定"，黃酮醇醇苷的平衡溶解度(S)見(jiàn)表5。
表5在幾種表面活性劑溶液中的溶解度(n=3)
溶媒純凈水 聚山梨酯-80十二烷基硫酸鈉泊洛沙姆188Cremopher
RH40
S (mg/mL)0.28±0.01 2.15±0.161.53±0.081.78±0.051,21±0.04
結(jié)果表明，黃酮醇甙在水中溶解度較小，聚山梨酯-80、卜二垸基硫酸鈉、泊洛沙姆188和CremopherRH40均對(duì)其有明顯的增溶作用，其中聚山梨酯-80的增溶作用最強(qiáng)，聚山梨酯-80對(duì)銀杏黃酮物理特性的影響見(jiàn)表6。
表6聚山梨酯-80對(duì)銀杏黃酮物理特性的影響(n=3)
藥物:聚山梨酯-80平均粒徑包封率(％)
(w/w)槲皮素山奈酚異鼠李素
0397.262.4±2.557.3±2.452.4±2.8
1: 0.1237.777.2±2.674.8±2.370.1±2.0
1: 0,5157.583,3土2,880.6±4.277,3±3.3
1: 2.0163.863.2±1.159.8±3.455.2±2.7
I: 3.5161,443.2±3.238.2±2.735.6±3.5
表面活性劑比例增加，脂質(zhì)體的粒徑逐漸減小，包封率先增大后減小，表面活性劑易使脂質(zhì)體雙分子膜的流動(dòng)性、滲透性增大，用量增大貯存過(guò)程隨脂質(zhì)體破裂導(dǎo)致藥物滲漏。故
藥物與表面活性劑較好重量比例為1:0.08 3.0份，優(yōu)選比例為1:0.1 2.0份。
3.凍干保護(hù)劑的選擇在脂質(zhì)體凍干過(guò)程中，由于冰晶的形成、滲透壓的改變、相分離及相轉(zhuǎn)變等因素均可導(dǎo)致脂質(zhì)體膜折疊、融合、破裂和藥物滲漏。選用甘露醇、山梨醇、噴霧干燥乳糖和葡萄糖等為凍干保護(hù)劑，測(cè)定脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶后的包封率，研究表明凍干保護(hù)劑優(yōu)選甘露醇，較好為噴霧干燥乳糖和山梨醇，結(jié)果見(jiàn)表6。
表7甘露醇比例對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響(n=3)
藥物:甘露醇
包封率(％)
槲皮素
山奈酚
異鼠李素
1: 51: 101:201: 30
67.8±1.883.1±5.263.6±3.248.4±2.1
65.2±2.469.3±2.757.6±4.345.3±1.8
56.7±3.367.5±3.154.5±3.742.7±1.5
結(jié)果表明，藥物與甘露醇重量比為1:6，脂質(zhì)體凍干粉末呈蓬松良好性狀，隨甘露醇用量增加，脂質(zhì)體中各黃酮醇苷指標(biāo)成分的包封率逐漸降低，故藥物與凍干保護(hù)劑較好重量比為l:2 25'優(yōu)選1:4 15。


圖l是本發(fā)明銀杏酮酯前體脂質(zhì)體體外滲透釋放曲線(n=6)
1-1 0.1mol/L鹽酸溶液(pHl-2)， l-2pH6.8磷酸鹽緩沖液，1-3 pH7.4磷酸鹽緩沖液圖2是本發(fā)明銀杏酮酯前體脂質(zhì)體的透射電鏡照片
圖3是本發(fā)明大鼠口服給予銀杏酮酯脂質(zhì)體制劑體內(nèi)黃酮醇苷血藥濃度曲線(n=6)前體脂質(zhì)體(—■-)，普通片劑(— —)
具體實(shí)施例方式
原料來(lái)源銀杏酮酯購(gòu)于上海杏靈科技股份有限公司，批號(hào)060405，含總黃酮大于
44%,銀杏黃酮醇苷》24%,銀杏萜內(nèi)酯》6%;槲皮素(HS)、山奈酚(SN)和異鼠李素(YS)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品檢驗(yàn)所。
實(shí)施例1
稱取11.2g大豆磷脂(含磷脂酰膽堿92%)和膽固醇5.6g溶于120mL甲醇和乙醚(1:1)混合溶劑，超聲20min;稱取銀杏酮酯1.6g禾ni.2g聚山梨酯85溶于100mLpH6.5磷酸鹽緩沖液，再緩緩加入上述磷脂混合液中，超聲20分鐘形成O/W初乳，于40'C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將分散相依次過(guò)0.8、 0.45和0.22pm濾膜，即得脂質(zhì)體混懸液。取10.8g乳糖溶于40mL純凈水與脂質(zhì)體混合均勻，分裝于容器一70 。C低溫預(yù)凍2h，解凍再預(yù)凍2h，經(jīng)冷凍干燥24h，即得前體脂質(zhì)體凍干粉。
取脂質(zhì)體凍干粉適量用純凈水復(fù)溶稀釋，測(cè)定脂質(zhì)體平均粒徑為202.6nm，梯度洗脫RP-HPLC法測(cè)定脂質(zhì)體的載藥量為5.4。/。，各黃酮醇苷槲皮素、山奈酚和異鼠李素的包封率分別為82.5%、 77.5°/。和74.2%。
實(shí)施例2
稱取10.8g大豆磷脂(含磷脂酰膽堿82%)和3.6g膽固醇溶于130mL乙醚與氯仿(3:1)混合溶劑，超聲20tnin;將1.8g銀杏酮酯、0.6g聚山梨酯-80溶于100mLpH6.8磷酸鹽緩沖液，再將其緩慢注入磷脂混合液中，超聲20分鐘形成O/W初乳，于40'C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將分散相置高壓乳勻機(jī)(5000psi) 5(TC下勻化3次，即得脂質(zhì)體混懸液。取12.5g甘露醇溶于50mL純凈水與脂質(zhì)體混懸液混合均勻，分裝容器一70 'C低溫預(yù)凍2h，解凍二次再預(yù)凍2h，經(jīng)冷凍干燥24h，即得前體脂質(zhì)體凍干粉。
取脂質(zhì)體凍干粉適量用純凈水復(fù)溶稀釋，測(cè)定脂質(zhì)體平均粒徑為168.8nm，梯度洗脫RP-HPLC法測(cè)定載藥量為5.6。/。，各黃酮醇苷槲皮素、山奈酚和異鼠李素的包封率分別為84.8%、 75.4%和73.3%。
實(shí)施例3
稱取15g蛋黃卵磷脂和4.8g膽固醇溶于110mL乙醚與氯仿(2:1)混合溶劑，超聲20min;稱取2.1g銀杏酮酯和1.2g聚氧乙烯氫化蓖麻油(CremolphorRH40)超聲溶于100mLpH7.0磷酸鹽，將其緩慢注入磷脂混合液中，超聲20分鐘形成O/W乳劑，于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去有機(jī)溶劑，即得脂質(zhì)體混懸液。取10.6g山梨醇溶于50 mL純凈水與上述脂質(zhì)體混懸液混勻，將分散相置高壓乳勻機(jī)(5000psi) 5(TC下勻化5次，在一70 。C低溫預(yù)凍2 h反復(fù)解凍兩次，再冷凍干燥得前體脂質(zhì)體凍干粉。稱取上述凍干粉10g，微晶纖維素PHIOI 3.0g，加入微粉硅膠0.2g，混合均勻，直接填充l號(hào)硬膠囊。
測(cè)定脂質(zhì)體的平均粒徑為224.7 nm，梯度洗脫RP-HPLC法測(cè)定載藥量為4.8n/。，各黃酮醇苷槲皮素、山奈酚和異鼠李素的包封率分別為73.1%、 69.0%和65.5%。
實(shí)施例4
稱取16.8g大豆磷脂和3.2g膽固醇置梨形瓶，力口lOOmL甲醇與氯仿(4:1)混合溶劑溶解，稱取1.5g銀杏酮酯和1 .Og聚山梨酯-85加1 OOmL pH7.2的磷酸鹽緩沖液超聲溶解，將其緩慢注入類脂質(zhì)混合液，超聲30分鐘形成O/W乳劑，除去有機(jī)溶劑，即得脂質(zhì)體混懸液。稱取12.0g甘露醇用40mLpH6.5磷酸鹽溶解，與上述脂質(zhì)體混懸液混勻，將分散相置高壓乳勻機(jī)(5000psi)50'C下勻化4次。一70 。C低溫預(yù)凍2h反復(fù)解凍兩次，經(jīng)冷凍干燥即得前體脂質(zhì)體凍干粉。稱取10g脂質(zhì)體凍干粉、2.0g噴霧干燥乳糖，過(guò)篩混勻，干法制顆粒，包裝，每袋含銀杏酮酯15mg。
測(cè)定脂質(zhì)體用純凈水復(fù)溶后的平均粒徑為190.9nm，梯度洗脫RP-HPLC法測(cè)定載藥量為4.5%，各黃酮成分槲皮素、山奈酚和異鼠李素的包封率分別為78.5%、 75.3%和70.2%。
實(shí)施例5
取凍干粉水合后脂質(zhì)體混懸液lmL置透析袋，兩端扎緊分別置錐形瓶中，釋放介質(zhì)為0.1mol/L鹽酸溶液(pHl-2)、 pH6.8和pH7.4的磷酸鹽緩沖液，于0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24h取樣5mL，置帶塞試管中，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)介質(zhì)5mL。另取水合后脂質(zhì)體混懸液lmL置帶塞試管，加入25%鹽酸lmL和甲醇適量，80'C水浴水解60min，冷卻，用甲醇稀釋，吸20pL
12注入HPLC分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)體的釋放度。計(jì)算滲透釋放的游離藥物總量,釋放度(％)=(透析外液藥物總量/脂質(zhì)體藥物總量)xlOO%;三種黃酮醇苷槲皮素
(HS)、山奈酚(SN)和異鼠李素(YS)體外釋放曲線見(jiàn)圖l (1-1、 l-2和l-3)。
實(shí)施例6
穩(wěn)定性試驗(yàn)將銀杏酮酯前體脂質(zhì)體膠囊，按雙鋁塑密閉避光包裝，25'C室溫(RH，60%)長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別于0、 1、 2、 3和6個(gè)月取樣研究，測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑和包封率結(jié)果見(jiàn)表8，
表8前體脂質(zhì)體膠囊長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=6)
時(shí)間包封率(％)諒Zeta電位
(h)槲皮素山奈酚異鼠李素(nm)(mv)
082.1±0,279.6±0,274.3±1.4196.9±1.819.3±0.5
181.8±0.179.5±0.575.1±2.5201.8±1.618.5±0.7
280.5±1.176.8±0.773.2±2,0195.4±1.319.2±0.2
77.5±1,478.3±0.276.4±3.8200.3±1,818.9±0.5
680.2±0.579.3±4.674.6±2.7203,5±1.418.8±0.4
經(jīng)6個(gè)月初步穩(wěn)定性研究表明，前體脂質(zhì)體制劑的外觀不變，膠囊內(nèi)粉末疏松、均勻，粒徑和包封率均無(wú)變化，故脂質(zhì)體膠囊具有良好的穩(wěn)定性。
實(shí)施例7
動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)(1)體內(nèi)給藥方案大鼠12只，體重220 260g，隨機(jī)分成兩組，每組6只，禁食24小時(shí)。大鼠分別口服給予銀杏酮酯普通片(上海杏靈制藥股份有限公司)，劑量600mg/kg(含黃酮醇苷19.9mg/kg)和銀杏酮酯前體脂質(zhì)體(按照實(shí)施例2制備)，劑量1200mg/kg(含黃酮醇苷19.2mg/kg)，溫開(kāi)水送服。于0.083、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12和24h于眼眶靜脈叢取血0.5mL，肝素化處理，3500rmin"離心20min，取血漿于一29。C凍箱保存。
(2)色譜條件儀器LC-10AD型高效液相色譜儀、SPD-10A檢測(cè)器(日本島津公司)；色譜柱KromasilC18柱(150 mmX4.6mm， 5pm);流動(dòng)相0.5%磷酸水溶液:甲醇(A:B)系統(tǒng)，按梯度洗脫程序設(shè)置條件；柱溫3(TC，檢測(cè)波長(zhǎng)371 nm，流速lmL/min，進(jìn)樣
量20[iL。(3) 血漿樣品的提取:吸血漿25(^L置離心管，加內(nèi)標(biāo)液25pL和3mol/L的鹽酸溶液0.3mL，渦旋lmin，在80。C水浴中加熱水解30min，冷去P，加乙醚5mL，渦旋lmin， 3500r/min離心20min，取上層液于40'CN2流揮干。殘?jiān)眉状?00nL渦旋溶解，吸20nL注入HPLC梯度洗脫法分析。
(4) 藥動(dòng)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Kinetica4.4.1藥動(dòng)學(xué)軟件，按非房室模型處理血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，兩制劑中總黃酮醇苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表9，血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。
表9兩種制劑體內(nèi)總黃酮醇苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)
藥動(dòng)學(xué)參數(shù)前體脂質(zhì)體普通片
Lz(l/h)0.08±0.020.08±0.01
Tmax,l (h)0.50.5
C腿i (ng/mL)402.55±18.32*103,32±9.07*
Tmax,2 (h)8.0/
Cmax2 (ng/mL)173.12±47.73/
AUCo—。(ng'h/mL)2095.431±256.52*786.86±22,37*
MRT (h)10.82±5.587.24±1,54
T1/2(h)9.15士4.605155.92±1.10*
F(%)327.2%
結(jié)果表明，大鼠口服體內(nèi)給予銀杏酮酯脂質(zhì)體吸收較快，血藥濃度出現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，
Tmax,!、 Tmax,2為0.5h和8h，銀杏酮酯前體脂質(zhì)體與普通片比較，MRT有所延長(zhǎng)，脂質(zhì)體的丁1/2
延長(zhǎng)，表明制劑具有緩釋作用。而C^^和AUCo一有顯著性差異(尸O.Ol)，前體脂質(zhì)體峰濃度和AUCo—明顯大于普通片劑，前體脂質(zhì)體的AUC是普通片劑的3.3倍，說(shuō)明脂質(zhì)體顯著增加了銀杏黃酮口服跨膜吸收，提高了口服多組分銀杏黃酮的生物利用度。
1權(quán)利要求
1、一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體，其特征在于主要由銀杏酮酯、磷脂、膽固醇、表面活性劑按重量份數(shù)計(jì)為1∶2～35∶0.5～15∶0.08～3.0份組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體，其特征在于銀杏酮酯、磷脂、膽固 醇、表面活性劑按重量份計(jì)為1:4 25:2 10:0.2 2.0份；銀杏杏酮酯主要由有效活性成分 銀杏總黃酮、銀杏萜內(nèi)酯等組成，含銀杏總黃酮》44%，銀杏黃酮醇苷>24%，銀杏總內(nèi)酯
3、 權(quán)利要求1或2的口服前體脂質(zhì)體，其特征在于磷脂選自大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、天然或合成心磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰絲 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油或磷脂酰膽堿中的一種或幾種。表面活性劑選自聚山梨酯80、聚山梨酯85、泊洛沙姆188、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫 化蓖麻油、或辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的一種或幾種。
4、 權(quán)利要求1至3之一項(xiàng)的銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體制備方法，其特征在于按以下方法制備稱取磷脂、膽固醇溶于有機(jī)溶劑(有機(jī)相)，另稱取銀杏酮酯與含表面活性劑的緩沖液分散溶解(水相)。將水相緩慢注入上述有機(jī)相，超聲乳化形成0/W乳劑，于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去有機(jī)溶劑，將分散相置高壓乳勻機(jī)5(TC下勻化3 5次，即得脂質(zhì)體混懸液。
5、 權(quán)利要求4的銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自氯 仿、乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或者它們中任選的混合液。所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、醋酸-醋酸鉀緩沖液、醋酸-醋酸鈉 緩沖液或硼砂-氯化鈣緩沖液，pH5.0 7.0。
6、 權(quán)利要求1至3之一項(xiàng)的銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體凍干粉，其特征在于按重量份計(jì)， l份藥物加入2 25份的凍干保護(hù)劑，優(yōu)選1份藥物加入4 15份的凍干保護(hù)劑。凍干保護(hù)劑選 自甘露醇、乳糖、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、氯化鈉、環(huán)糊精、麥芽糖、蔗糖、右旋糖苷或 果糖的一種或它們的混合物。
7、 權(quán)利要求6銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體凍干粉的制備方法，包括如下步驟(1) 稱取磷脂、膽固醇溶于有機(jī)溶劑(有機(jī)相)，另稱取銀杏酮酯與含表面活性劑的緩 沖液分散溶解(水相)。將水相緩慢注入上述有機(jī)相，超聲乳化形成0/W乳劑，于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去有機(jī)溶劑，將分散相置高壓乳勻機(jī)50'C下勻化3 5次，即得脂質(zhì)體混懸液。(2) 將凍干保護(hù)劑溶于純凈水與上述脂質(zhì)體混懸液混合均勻，分裝于容器—70。C低溫預(yù) 凍2h，反復(fù)-解凍冷凍二次，再經(jīng)冷凍干燥24h，即得前體脂質(zhì)體凍干粉。
8、 權(quán)利要求7的銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體凍干粉的制備方法，脂質(zhì)體凍干粉經(jīng)水合介質(zhì)復(fù)溶可形成脂質(zhì)體混懸液，脂質(zhì)體平均粒徑為100 350nm，三種黃酮醇苷的包封率為50% 90%，其固體前體脂質(zhì)體制劑口服能顯著增加藥物吸收。
全文摘要
一種銀杏酮酯口服前體脂質(zhì)體及其制備方法，主要由銀杏酮酯、磷脂、膽固醇、表面活性劑和凍干保護(hù)劑組成。本發(fā)明涉及一種多組分脂溶性中藥被穩(wěn)定包裹在磷脂雙分子層的單室脂質(zhì)體，采用逆向蒸發(fā)-二次凍融法制備的銀杏酮酯前體脂質(zhì)體，包峰率高，粒徑小于350nm，該工藝能顯著提高前體脂質(zhì)體產(chǎn)品長(zhǎng)期貯存的穩(wěn)定性。制劑具有緩慢釋放藥物作用，口服能顯著增加藥物跨胃腸膜吸收的速度，使黃酮類有效活性成分通過(guò)淋巴旁路系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)，體內(nèi)生物利用度是普通片劑的3.3倍。
文檔編號(hào)A61K47/28GK101548994SQ20091002661
公開(kāi)日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者婕 何, 周育丹, 娟 李, 王廣基 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)