專利名稱：N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)合成的小分子化合物N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳?；?-丙 基]-3-苯基丙酰胺(hydrocinnamoyl-L-valyl pyrrolidine , AS-1)的用途，尤其涉 及在制藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。
二背景技術(shù)：
二十世紀(jì)九十年代以來(lái)，心血管疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率明顯增 加，心力衰竭已成為首要致死病因。心力衰竭(heart failure)是指在各種致病因 素的作用下心臟的收縮和/或舒張功能發(fā)生障礙,^使心輸出量絕對(duì)或相對(duì)下降，即 心泵功能減弱，以致不能滿足機(jī)體代謝的病理生理過(guò)程或綜合征。高血壓、心肌 梗死、主動(dòng)脈瓣膜狹窄、心肌炎等是心力衰竭的常見病因。心力衰竭發(fā)生的基礎(chǔ) 是心室重構(gòu)(Ventricular Remodeling, VR),逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)是心力衰竭治療的 關(guān)鍵。
心臟肥厚和重塑既是心臟功能由正常到衰竭的轉(zhuǎn)變過(guò)程，也是心臟組織中大 量蛋白質(zhì)表達(dá)異常、心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過(guò)程。在此過(guò)程中，各種致心臟肥 厚和重塑因素(如心臟負(fù)荷過(guò)重等)通過(guò)心臟細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變相關(guān)核轉(zhuǎn) 錄因子的活性，導(dǎo)致心臟組織中大量基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)出現(xiàn)異常，使得心臟的形 態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。
臨床上常用的抗心力衰竭藥物包括利尿劑、正性肌力藥物如洋地黃類、血 管緊張素酶抑制劑、p-受體阻滯劑、擴(kuò)血管藥物等。這些藥物雖然能夠緩解心力 衰竭的癥狀，但遠(yuǎn)期療效并不理想。
近期的研究發(fā)現(xiàn)核因子kB (NF-kB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào) 通路在心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。在心肌肥大或缺血性心肌 病中該信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，抑制或沉默該信號(hào)通路的激活可以明顯改善心肌肥大 或缺血性心肌病的癥狀，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。
Tamas 831^^等人的研究發(fā)現(xiàn)一種小分子化合物^[2-曱基-1-(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-笨基丙酰胺(AS-1)可抑制核因子kB (NF-kB)、絲裂原活化蛋白 激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活。該化合物在EL4小鼠胸腺瘤細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì) 胞中能抑制IL-1 p誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的激活。此外，Christopher N. Davis等人 的研究發(fā)現(xiàn)在下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞，AS-1具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)的雙重作用。它的化 學(xué)結(jié)構(gòu)如下
具體合成方法見Tamas Bartfai等人2003年發(fā)表在PNAS上7971-7976頁(yè)的文章。目 前，對(duì)其在心室重構(gòu)和心力衰竭中的防治作用尚未見"J艮道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)空白，提供一種N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳 ?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(hydrocinnamoyl-L-valyl pyrrolidine , AS-1 )的用途。
技術(shù)方案N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1) 在防治心室重構(gòu)和心力衰竭藥中的應(yīng)用。
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治壓力 負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大和心室重構(gòu)藥中的應(yīng)用。
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急性 缺血性心臟病和心臟缺血/再灌注損傷藥中的應(yīng)用。
有益效果本發(fā)明對(duì)已知化合物N-[2-曱基-l.(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
本發(fā)明的N-p-曱基-l-(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺安全無(wú)毒， 藥理作用強(qiáng)，有著良好的藥用前景。
N-[2-曱基-l-(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)能夠抑制心 肌細(xì)胞的肥大生長(zhǎng)，改善心肌細(xì)胞的纖維化程度，提高因壓力負(fù)荷過(guò)高而損傷的 心臟的心功能，從而防治心肌細(xì)^^的肥大和心室重構(gòu)，延M^心力衰竭的產(chǎn)生。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)能夠改善遭受急性心 肌缺血和缺血/再灌注損傷心臟的心功能，早期應(yīng)用可減小梗死區(qū)的面積，減少心 肌組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，維持心肌細(xì)胞的功能，延緩心力衰竭的產(chǎn)生。
四

圖1 AS-1對(duì)TAC (主動(dòng)脈弓縮窄)術(shù)后HW/BW (心臟重量/體重)影響。 女與Sham組比，P<0.05， A與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖2 AS-1對(duì)TAC術(shù)后HW/BW影響。女與Sham組比，PO.05, A與TAC組或 DMSO組比，P<0.05。
圖3AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠室間隔舒張厚度的影響。井與Sham組比， PO.05,女與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖4 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠左心室舒張后壁厚度的影響。并與Sham組比， P<0.05，女與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖5 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠射血分?jǐn)?shù)的影響。井與Sham組比，P<0.05，女與 TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖6 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠短軸縮短率的影響。弁與Sham組比，P<0.05, ★ 與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖7 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠心臟外觀的影響
圖8 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌細(xì)胞肥大和纖維化的影響。上排，HE染 色，下排，Masson染色。
圖9 AS-l對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌組織p-P38表達(dá)水平的影響。女與Sham組比， PO.05, A與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖10 AS-l對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌組織p-ERK表達(dá)水平的影響。女與Sham組 比，PO.05, A與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖ll AS-l對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌組織p-JNK表達(dá)水平的影響。女與Sham組 比，PO.05, A與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖12 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌組織NF-KB活性的影響
圖13 AS-1對(duì)TAC術(shù)后小鼠心肌組織NF-KB活性的影響。井與Sham組比， PO.05,女與TAC組或DMSO組比，P<0.05。
圖14 AS-1對(duì)肥大的心肌細(xì)胞面積的影響。
圖15 AS-1對(duì)肥大的心肌細(xì)胞蛋白合成的影響。女與Control組比， PO.05, A與IL-1 組或DMSO組比，P<0.05。
圖16 AS-l對(duì)肥大的心肌細(xì)胞p-P38表達(dá)水平的影響。女與Control組比， PO.05, A與IL-1 組或DMSO組比，P<0.05。圖17 AS-l對(duì)肥大的心肌細(xì)胞p-ERK表達(dá)水平的影響。女與Control組比，PO.05, A與IL-1 組或DMSO組比，P<0.05。
圖18 AS-l對(duì)肥大的心肌細(xì)胞p-JNK表達(dá)水平的影響。女與Control組比，PO.05, A與IL-1 組或DMSO組比，P<0.05。
圖19 AS-1對(duì)肥大的心肌細(xì)胞NF-KB活性的影響。
圖20 AS-1對(duì)肥大的心肌細(xì)胞NF-kB活性的影響?！锱cControl組比，P<0.05， A與IL-1 組或DMSO比，P<0.05。
圖21 AS-1對(duì)小鼠心臟I/R (缺血/再灌注)后射血分?jǐn)?shù)的影響。承與I/R組或DMSO組比，P<0.05。
圖22 AS-1對(duì)小鼠心臟I/R后短軸縮短率的影響。承與I/R組或DMSO組比，
P<0.05。圖23
P<0.05。圖24胞。
圖25
AS-1對(duì)小鼠心臟I/R后心臟梗死面積的影響。*與1/R組或DMSO組比，AS-1對(duì)I/R心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。箭頭所示即為中性粒細(xì)
AS-1對(duì)I/R心肌組織中白介素la的表達(dá)水平的影響。#與Control組比，P<0.05,女與I/R組或DMSO組比，P<0.05。
圖26 AS-1對(duì)I/R心肌組織中白介素lp表達(dá)水平的影響。弁與Control組比，PO.05,女與I/R組或DMSO組比，P<0.05。
圖27 AS-1對(duì)I/R心肌組織中白介素6的表達(dá)水平的影響。并與Control組比，PO.05,女與I/R組或DMSO組比，P<0.05。
圖28 AS-1對(duì)I/R心肌組織NF-kB活性的影響。
圖29 AS-1對(duì)I/R心肌組織NF-kB活性的影響。** PO.01, *P<0.05。
五具體實(shí)施例方式
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成，真空干燥24小時(shí)。以下面的方式配制AS-1 2g , DMSO 100ml。AS-1終濃度20mg/mL。給藥前，用生理鹽水稀釋。
本發(fā)明所述的化合物可以制成注射液，用于靜脈滴注、靜脈注射、腹腔注射、肌肉或皮下注射。也可制成口服的片劑、膠囊等。
實(shí)施例1 (AS-1對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)保護(hù)作用觀察)選用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，7至8周，隨機(jī)分為4組假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(TAC)、手術(shù)+溶劑對(duì)照組(DMSO)、手術(shù)+給藥組(AS-l),每組6-8只。小鼠麻醉后進(jìn)行人工通氣，于胸部左側(cè)第2-3肋間打開胸腔，分離主動(dòng)脈弓，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)縮窄主動(dòng)脈弓(Transverse aortic constriction , TAC),關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組除了不進(jìn)行TAC外，其余手術(shù)程序完全與模型組相同。DMSO和AS-l組術(shù)后即經(jīng)腹腔給藥，每天一次，AS-l給藥濃度為50mg/kg,持續(xù)給藥2周后，取心肌組織進(jìn)行各項(xiàng)分析。
1.1 小鼠心肌月巴厚指數(shù)的測(cè)定
2周后的小鼠稱重，麻醉，進(jìn)行二維超聲心電圖檢測(cè)。隨后處死，快速打開胸腔取出心臟，去除心房組織，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)修剪心臟，用濾紙吸干水分，電子天平準(zhǔn)確稱取全心重量和左心重量。此外取其脛骨，準(zhǔn)確測(cè)量脛骨長(zhǎng)度。計(jì)算其全心重量/體重(HW/BW),左心室/脛骨長(zhǎng)(LVW/TL),統(tǒng)計(jì)比值和心超結(jié)果。
圖l、圖2示TAC2周后，TAC和DMSO組HW/BW和LVW/TL明顯增加，與周齡配對(duì)的Sham相比具有顯著性差異，提示左心室肥厚；AS-1組HW/BW和LVW/TL與TAC或DMSO組相比則明顯降低。
圖3、圖4、圖5、圖6示超聲心動(dòng)圖結(jié)果，TAC2周后小鼠心臟IVS (室間隔厚度)和LVPW (左室后壁厚度)的回聲區(qū)明顯增強(qiáng)，EF (射血分?jǐn)?shù))、FS (短軸縮短率)明顯下降，提示左心室肥厚并伴有心功能的下降；AS-1組小鼠左心室、室間隔舒張期厚度明顯降低，射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率有所升高。
1.2 病理學(xué)4企查
① 肉眼觀察
圖7示TAC和DMSO組小鼠心臟明顯增大，AS-1組小鼠心臟與TAC組或DMSO組相比有明顯減少。
② 光鏡檢查
對(duì)小鼠左心室心肌組織切片，行HE染色和Masson染色，觀察心肌細(xì)胞肥大和纖維化的情況。
圖8示TAC和DMSO組心肌細(xì)胞橫徑增寬，細(xì)胞間隙增大，纖維結(jié)締組織增多。AS-1組心肌細(xì)胞肥大程度及纖維化較肥大組均有所減輕。1.3 AS-1對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)肥厚心肌的NF-KB和MAPK表達(dá)和活性的影響
取左心室組織，提取胞漿和胞核蛋白，以胞漿蛋白分析MAPK (p-P38、JNK、 ERK)表達(dá)水平的改變，取胞核蛋白，檢測(cè)NF-KB結(jié)合活性變化。
圖9、圖10、圖11示TAC術(shù)后2周，p38、 ERKl/2的磷酸化表達(dá)水平增加，而JNK的磷酸化水平與Sham組相比沒有明顯變化；AS-1可抑制TAC引起的p38、ERKl/2表達(dá)水平增加，對(duì)p-JNK表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。DMSO組與TAC組相比 磷酸化蛋白水平?jīng)]有顯著性差異。圖12、圖13示TAC術(shù)后2周心肌組織NF-kb結(jié)合 活性明顯增加，給予AS-1后NF-kB結(jié)合活性明顯降低。
實(shí)施例2 (AS-1對(duì)肥大的原代心肌細(xì)胞作用的觀察)
體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞方法如下清潔級(jí)SD乳鼠斷頸脫臼處死后，取其心 臟，剪下心尖部進(jìn)行消化、離心，在含有15。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37°C 5 。/oC02孵箱中培養(yǎng)36-48hr，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況較好時(shí)，換液、分組。實(shí)驗(yàn)分為四 組空白(control)組；IL-1 刺激組；IL-1 刺激+DMSO組；IL-1 刺激+AS-l 組。IL-1 刺激濃度為10ng/mL, AS-1濃度為100umol/L。 2.1心肌細(xì)胞肥大程度檢測(cè)
原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞刺激后24小時(shí)，用a-actinin免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞 面積，用3H-亮氨酸摻入法(luCi/mL)檢測(cè)其蛋白合成水平。這兩種方法都能有 效的評(píng)估心肌細(xì)胞的肥大程度。
圖14顯示，IL-1 能引起心肌細(xì)胞面積的明顯增加；給予AS-1后，其心肌 細(xì)胞面積減小。圖15顯示，IL-1 能引起心肌細(xì)胞蛋白合成水平明顯增加，給予 AS-1后，蛋白合成水平下降。
2.2 AS-1對(duì)肥大的原代心肌細(xì)胞NF-kb和MAPK表達(dá)和活性的影響
原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞刺激后24小時(shí)，提取胞漿和胞核蛋白，以胞漿蛋白分 析MAPK (p-P38、 JNK、 ERK)表達(dá)水平的改變，取胞核蛋白，檢測(cè)NF-KB結(jié) 合活性變化。
圖16、圖17、圖18示IL-1 刺激使p38、 ERKl/2的磷酸化表達(dá)水平增加，而 JNK的磷酸化水平與Sham組相比沒有明顯變化；AS-1可抑制IL-1 引起的p38、 ERKl/2表達(dá)水平增加，對(duì)p-JNK表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。DMSO組與IL-l 組相 比磷酸化蛋白水平?jīng)]有顯著性差異。圖19、圖20示IL-1 刺激使NF-kB結(jié)合活性 明顯增加，給予AS-1后NF-kb結(jié)合活性明顯降低。
實(shí)施例3 (AS-1對(duì)急性缺血再灌注小鼠心臟的保護(hù)作用觀察)
選用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6至7周，隨機(jī)分為4組假手術(shù)組(Sham)、 手術(shù)組(I/R)、手術(shù)+溶劑對(duì)照組(DMSO)、手術(shù)+給藥組(AS-l),每組6-8只。小 鼠麻醉后進(jìn)行人工通氣，建立缺血再灌注(ischemia/reperfosion, I/R)模型，主 要步驟為于胸部左側(cè)第3-4肋間打開胸腔，剪開心包膜，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)結(jié)扎冠狀動(dòng) 脈左前降支阻斷血流45分鐘后恢復(fù)血液再灌注，關(guān)閉胸腔。于再灌注即刻腹腔給予DMSO或AS-l， AS-l給藥濃度為50mg/kg。再灌注4小時(shí)后取心肌組織檢測(cè)各項(xiàng) 指標(biāo)。
3.1小鼠心肌缺血面積和心功能4全測(cè)
小鼠再灌注4小時(shí)后麻醉，行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)其心功能情況。隨后處死，快 速打開胸腔取出心臟用生理鹽水經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌流沖洗血液，再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左 前降支，用Evans blue灌注以了解缺血區(qū)(危險(xiǎn)區(qū)，RA)的大小，將心臟組織切 成5-6片，用TTC復(fù)染20分鐘，福爾馬林固定后拍照。用軟件分析計(jì)算IA/LV (梗 死區(qū)面積/左室面積)、RA/LV (危險(xiǎn)區(qū)面積/左室面積)、IR/RA(梗死區(qū)面積/危 險(xiǎn)區(qū)面積)，了解心肌損傷程度。
圖21、圖22顯示給予AS-1能明顯改善小鼠心臟的EF (射血分?jǐn)?shù))和FS (短軸 縮短率)。圖23顯示給予AS-1能明顯降低IA/LV、 IR/RA比值，而對(duì)RA/LV比值沒 有影響。
3.2免疫學(xué)#:測(cè)
對(duì)小鼠左心室心肌組織切片，行免疫組化;險(xiǎn)測(cè)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。 圖24顯示，1/R和DMSO組小鼠心臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，AS-1能夠顯著
的減少1/R心臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的程度。
3.3細(xì)胞因子^r測(cè)
取左心室肌組織，提取胞漿蛋白，采用ELISA法檢測(cè)小鼠心臟白介素la、白 介素lp、白介素6的表達(dá)水平。
圖25、圖26、圖27顯示，1/R和DMSO組小鼠心肌組織白介素la、白介素lp、 白介素6的表達(dá)水平明顯增高，而AS-l能夠明顯降低白介素la、白介素lp、白介 素6的表達(dá)水平。
3.2 AS-1對(duì)急性缺血-再灌注心臟NF-KB活性的影響
取左心室肌組織，提取胞核蛋白，檢測(cè)NF-KB結(jié)合活性變化。 圖28、圖29顯示，I/R和DMSO組小鼠心臟NF-KB結(jié)合水平明顯增高，而AS-1能夠明顯降低小鼠心臟組織NF-KB。
權(quán)利要求
1. N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治心室重構(gòu)和心力衰竭藥中的應(yīng)用。
2. N-[2-曱基-l.(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治壓 力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大和心室重構(gòu)藥中的應(yīng)用。
3. N-[2-甲基-卜(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急 性缺血性心臟病和心臟缺血-再灌注損傷藥中的應(yīng)用。
全文摘要
N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治心室重構(gòu)和心力衰竭藥中的應(yīng)用。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大和心室重構(gòu)藥中的應(yīng)用。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳?；?-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急性缺血性心臟病和心臟缺血-再灌注損傷藥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/40GK101474174SQ20091002848
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者劉春樣, 曹志娟, 婷 李, 李躍華, 李金恒, 胡玉龍 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)