專利名稱:水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的分離培養(yǎng)方法及用途的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種菌株的分離培養(yǎng)方法,特別是一種農(nóng)桿菌屬水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6(Agrobacterium isolate N6)的分離培養(yǎng)方法;本發(fā)明還涉及該菌株的用途。
背景技術:
近年來,由于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境自我污染的加劇和自然環(huán)境污染的目趨嚴重,造成養(yǎng)殖動物生存環(huán)境不斷惡化,病原微生物增多,傳播速度加快,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的損失。同時為了防治疾病所使用的某些違禁化學藥品在動物體內的殘留,極大地影響到了產(chǎn)品的品質。但是因為在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中為了防治病害而使用的綠霉素、孔雀石綠等違禁藥物在動物體內的殘留,導致了養(yǎng)殖海水甲殼類的品質下降,價格下滑,出口量銳減,甚至被在大部分的傳統(tǒng)出口國和地區(qū)列入“黑名單”禁止進口;從而對整個海水甲殼類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的沖擊,嚴重損害了海水甲殼類養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。因此從長遠來看,必須改變傳統(tǒng)的養(yǎng)殖和病害防治模式,從自然水體中篩選有益微生物來取代抗生素等抗菌類化學藥品,從根本上解決抗生素所引發(fā)的細菌抗藥性增加而引發(fā)的二重感染和內源性感染以及破壞微生態(tài)平衡等問題,避免抗生素所帶來的藥物殘留、二次污染等負面影響,實現(xiàn)清潔和環(huán)境友好的海水甲殼類生態(tài)養(yǎng)殖模式。
近年來,幾種可選擇的生物控制疾病的方法已成功地用于海水甲殼類的苗種生產(chǎn)中。Noganmi K等所篩選的海洋細菌PM-4可以在海水細菌群落中占據(jù)優(yōu)勢,而使弧菌(Vibrio spp)的數(shù)量迅速下降,甚至達到不能檢測的低水平,將該菌株添加于三疣梭子蟹(Portuns trituberculatus)育苗水體中可大幅度提高幼體的成活率。Maeda M等發(fā)現(xiàn)PM-4同樣對斑節(jié)對蝦幼體有益生作用。Garriques等用溶藻膠弧菌競爭性排斥育苗水體中潛在的病原菌,提高了萬氏對蝦幼苗的產(chǎn)量。Rengpipat等用加有芽抱桿菌Bacillus S11的餌料投喂斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)促進了對蝦生長,并提高了對蝦存活率。國內的相關研究自90年代起步,已經(jīng)取得了諸多的科研成果,其中李濟秋等從中國對蝦中篩選獲得的益生菌Arthrobacter XE-7可以達到與氯霉素相似的抑制致病弧菌的效果,同時還可以充當硝化細菌的作用,將有害的NH3-N轉化為無害的NO3-N,從而達到了細菌性疾病防治和水質改善的雙重效果,在未添加任何抗生素的條件下提高了稚蝦(post-larvae)的成活率近50%。這些有益菌均來自養(yǎng)殖水體或養(yǎng)殖動物體表或體內的正常細菌區(qū)系,不會對養(yǎng)殖動物造成危害并且日趨成為生物控制的一種模式。
但是目前國內還未見有關的海水甲殼類幼體益生菌的產(chǎn)品面世。光合細菌、芽孢桿菌等微生物產(chǎn)品以對養(yǎng)殖水體進行水質調節(jié)的作用為主,難以對海水甲殼類病原細菌具有特異性的抑制效果。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足,提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的分離培養(yǎng)方法,通過該方法分離得到的海洋益生菌可以對水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病進行生物防治。
本發(fā)明所涉及的菌株農(nóng)桿菌屬水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6(AgrobacteriumisolateN6),該菌株已于2009年1月29日在Gennbank注冊,登錄號FJ804473。公眾如果需要該菌株,淮海工學院海洋學院可對外提供,地址連云港市蒼梧路59號。
以下對本發(fā)明技術方案進行進一步的闡述。
一、本發(fā)明菌株的分離、篩選。
(一)菌株篩選和培養(yǎng)。
采集中華絨螯蟹育苗用水,將該水梯度稀釋后,涂布到2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基上,20℃恒溫培養(yǎng)72~96h;挑選不同菌落形態(tài)的菌株接種到2216E海洋細菌斜面培養(yǎng)基保藏待用;然后將斜面菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基,20℃,160r/min,培養(yǎng)48h后,離心后獲得細菌菌體;取各離心后獲得細菌菌體,通過單株細菌菌體感染剛出膜的中華絨螯蟹蚤狀一期幼體的方法,比較蚤狀二期幼體變態(tài)率,導致蚤狀二期幼體變態(tài)率最高的細菌即為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6菌株。
(二)菌株的形態(tài)特征和生長特性。
1、形態(tài)特征。
對菌株進行光學顯微鏡觀察。結果顯示該菌株為革蘭氏陽性短桿菌,大小為0.2~0.6μm×0.8~2.0μm,無芽孢,無莢膜;在2216E平板上形態(tài)為乳白色、邊緣光滑、中間突起。
2、生長特性。
該菌為好氧菌,生長溫度范圍為0℃~28℃,最適生長溫度為22℃,生長pH范圍為5.5~11.0,最適pH為7.6;耐NaCl的濃度為12%,最適合的鹽濃度為2%,無NaCl不生長;該菌能利用葡萄糖,不能利用淀粉;能液化明膠;硫化氫試驗、V-P試驗及過氧化氫接觸酶試驗呈陽性;甲基紅試驗呈陰性。
(1)NaCl濃度對菌株生長的影響。
其他條件不變,改變基礎培養(yǎng)基中NaCl濃度,對菌株的耐鹽性進行考察。圖1顯示了NaCl濃度分別為0.5g/L,1g/L,1.5g/L,2g/L和2.5g/L條件下,N6菌株搖床培養(yǎng)24h后,在650nm下測得的OD值。從圖1中可以看出,NaCl濃度為2g/L時,菌種生長情況最好,是典型的海洋細菌。
(2)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。
①不同碳源對菌株N6生長的影響。
本實驗選取的5種碳源分別是葡萄糖,淀粉,蔗糖,乳糖和D-果糖。培養(yǎng)基其他成分蛋白胨5g,酵母膏1g,NaCl 2g,蒸餾水1000ml,pH 7.6。
配制300ml培養(yǎng)液,分裝5個250ml三角瓶。按6g/L量分別加入5種碳源成分。高壓滅菌后接入菌株N6斜面菌種。28℃,180r/min搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定OD值。結果見圖2。由圖2可直觀地看出,葡萄糖是菌株N6生長的最佳碳源。
②葡萄糖濃度對N6菌株生長的影響。
其他條件不變,葡萄糖濃度分別為2g/L,4g/L,6g/L,8g/L和10g/L。搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液4倍稀釋,650nm測定OD值。結果見圖3。由圖3的曲線圖可以得到,培養(yǎng)基中葡萄糖的最佳濃度為6g/L。
③不同氮源對N6菌株生長的影響。
其他條件不變,將氮源改為蛋白胨,尿素,硝酸銨和硫酸銨,濃度6g/l。培養(yǎng)基其他成分葡萄糖6g,牛肉膏1g(作為生長因子),NaCl 2g,蒸餾水1000ml,pH7.6-7.8。28℃,180r/min搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋8倍,650nm測定OD值結果見圖4。由圖4可以看出,硫酸銨對應的菌種與其他氮源成分相比,在24h生長明顯。且蛋白胨,尿素和硝酸銨3種氮源的對應吸光度明顯低于硫酸銨,故可以排除這3種氮源。選擇硫酸銨作為最佳氮源。
④硫酸銨濃度對N6菌株生長的影響。
實驗中硫酸銨濃度分別為2g/L,4g/L,6g/L,8g/L,10g/L。結查見圖5,由圖5可知,硫酸銨最適濃度為4g/L。
⑤生長因子對N6菌株生長的影響。
分別以玉米漿粉,牛肉膏和酵母膏作為生長因子,28℃,180r/min搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定OD值。結果見圖6。圖6顯示酵母膏與其他2種生長因子相比,吸光度最高。因此選取酵母膏作為最佳生長因子。
⑥正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成。
選擇葡萄糖、酵母浸膏和硫酸銨作為3個因素設計3水平的正交試驗,配制的發(fā)酵液,利用L15(33)正交表設計實驗進行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定。因素水平見表1,結果見表2。
表1因素水平
表2培養(yǎng)基正交試驗設計及結果分析
由表2可以看出A1B2C3為最佳搭配,即葡萄糖7g/L,硫酸銨4g/L,酵母膏1.5g/L。
通過R值可看出RC>RB>RA,即生長因子種類和比例對菌種生長產(chǎn)生影響最大,其次是氮源,碳源的影響最小。
⑦初始pH對N6菌株生長的影響。
實驗中初始pH值分別為6.8,7.2,7.6,7.8,8.0,8.4。搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定,結果見圖7。由圖7可以看出當初始pH為7.6時吸光度最大,選取7.6為最佳pH。
⑧接種量對N6菌株生長的影響。
實驗中的接種量設為1%,2%,3%,4%,5%,6%,搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋8倍,650nm測定,結果見圖8。圖8顯示當接種量為5%時培養(yǎng)液吸光度達到最高。
⑨搖床轉速對N6菌株生長的影響。
實驗中設定的搖床轉速分別為125r/min150r/min,175r/min,200r/min,搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定,結果見圖9。由圖9得到最佳搖床轉速為175r/min。
⑩溫度對N6菌株生長的影響。
本實驗過程中的溫度分別設定為20℃,23℃,26℃,29℃,搖瓶培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋4倍,650nm測定,結果見圖10。由圖10得到最佳的溫度條件是26℃。
綜合以上結果,得到的菌株N6的最佳培養(yǎng)基組分及最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖7g/L,硫酸銨4g/L,酵母膏1.5g/L,NaCl 2g/L,初始pH7.6,搖床轉速175r/min,接種量5%,溫度26℃,培養(yǎng)時間24h。
(三)本發(fā)明菌株的用途及使用方法。
本發(fā)明所述的分離培養(yǎng)方法所得到的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6可以提高海水甲殼類幼體的變態(tài)率與存活率。所述的海水甲殼類幼體包括中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、中國明對蝦或南美白對蝦等海水甲殼類幼體。用于該用途的菌株的使用方法為將該菌株擴大培養(yǎng)(擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基和條件為上述實驗得到的菌株N6的最佳培養(yǎng)基組分及最佳培養(yǎng)條件)后,離心得菌體,加滅菌過的自然海水配成濃菌液,在海水甲殼類幼體的蚤狀一期階段按照1~10×105cfu/ml的濃度投放至養(yǎng)殖水體中,每1-2天投放1-2次,并采用滅菌餌料進行投喂,每日換水量控制在10%-30%;變態(tài)為蚤狀二期幼體后,按正常方法管理。
與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明技術方案具有以下優(yōu)點 1、本發(fā)明所涉及的篩選益生菌的方法簡潔高效; 2、該益生菌對多種甲殼類動物幼體具有益生作用; 3、該益生菌生產(chǎn)及使用方法簡便; 4、該益生菌只在甲殼類動物蚤狀一期投放,即可提高和穩(wěn)定幼體后期的變態(tài)率,從而大幅度提高苗種產(chǎn)量。
圖1為NaCl濃度對菌體生長的影響圖。
圖2為不同碳源對菌體生長的影響圖。
圖3為葡萄糖濃度對菌體生長的影響圖。
圖4為不同氮源對菌體生長的影響圖。
圖5為硫酸銨濃度對菌體生長的影響圖。
圖6為生長因子對菌體生長的影響圖。
圖7為初始pH對菌體生長的影響圖。
圖8為接種量對菌體生長的影響圖。
圖9為搖床轉速對菌體生長的影響圖。
圖10為溫度對菌體生長的影響圖。
具體實施例方式 以下進一步描述本發(fā)明的具體技術方案,以便于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明,而不構成對其權利的限制。
實施例1。一種農(nóng)桿菌屬水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6(Agrobacterium isolate N6)的分離培養(yǎng)方法,其步驟是采集中華絨螯蟹育苗用水,將該水梯度稀釋后,涂布到2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基上,20℃恒溫培養(yǎng)72~96h;挑選不同菌落形態(tài)的菌株接種到2216E海洋細菌斜面培養(yǎng)基保藏待用;然后將斜面菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基,20℃,160r/min,培養(yǎng)48h后,離心后獲得細菌菌體;取各離心后獲得細菌菌體,通過單株細菌菌體感染剛出膜的中華絨螯蟹蚤狀一期幼體的方法,比較蚤狀二期幼體變態(tài)率,導致蚤狀二期幼體變態(tài)率最高的細菌即為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6菌株。
實施例2。實施例1所述的分離培養(yǎng)方法中,離心所得到的菌株具有以下菌株特征該菌株為革蘭氏陽性短桿菌,大小為0.2~0.6μm×0.8~2.0μm,無芽孢,無莢膜;在2216E海洋細菌平板培養(yǎng)基上形態(tài)為乳白色、邊緣光滑、中間突起;該菌為好氧菌,生長溫度范圍為0℃~28℃,最適生長溫度為22℃,生長pH范圍為5.5~11.0,最適pH為7.6;耐NaCl的濃度為12%,最適合的鹽濃度為2%,無NaCl不生長;該菌能利用葡萄糖,不能利用淀粉;能液化明膠;硫化氫試驗、V-P試驗及過氧化氫接觸酶試驗呈陽性;甲基紅試驗呈陰性。
實施例3。參照圖1-10。實施例1或2所述的分離培養(yǎng)方法中,離心所得到的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖7g/L,硫酸銨4g/L,酵母膏1g/L,NaCl 2g/L,pH7.6;發(fā)酵條件為接種量5%,20℃,180r/min,培養(yǎng)24h。
實施例4。應用實施例1所述的分離培養(yǎng)方法所得到的菌株進行的海水甲殼類一期幼體的細菌感染及益生菌的篩選實驗。
實驗中所用的菌株是將菌株擴大培養(yǎng)后,離心得菌體,加滅菌過的自然海水配成菌液。
將孵化出膜的中華絨螯蟹、梭子蟹、中國明對蝦、南美白對蝦無節(jié)幼體變態(tài)的蚤狀一期幼體迅速用150目網(wǎng)抄撈取,經(jīng)無菌海水清洗后分置于1000ml無菌海水的燒杯中,每個燒杯30只,每組3個平行;一組為對照,其余各組組分別添加菌株N6菌液(106CFU/ml),連續(xù)充氣,水溫20℃,每天換水(無菌海水)一次并重新添加同種菌液(106CFU/ml);適量投喂已滅菌的餌料,培養(yǎng)3-5天,每日記錄幼體的存活數(shù),統(tǒng)計蚤狀2期幼體個數(shù)并計算變態(tài)率,實驗重復兩次,取各組數(shù)據(jù)的平均值。
菌株N6對海水甲殼類幼苗存活率的影響如下 1、菌株N6對中華絨螯蟹蚤狀I期幼體的變態(tài)率的影響見表3。
表3.中華絨螯蟹蚤狀I期幼體的變態(tài)情況對照表
與空白對照相比,添加菌株的河蟹蚤狀一期的變態(tài)率(54.4%)比對照(41.1%)高32.4%。
2、菌株N6對三疣梭子蟹蚤狀I期幼體的變態(tài)率的影響見表4。
表4.三疣梭子蟹蚤狀I期幼體的變態(tài)情況對照表
與空白對照相比,添加本發(fā)明菌株的三疣梭子蟹蚤狀一期的變態(tài)率(50%)比對照(33%)高51.5%。
3、菌株N6對中國對蝦蚤狀I期幼體的變態(tài)率的影響見表5。
表5.中國對蝦蚤狀I期幼體的變態(tài)率生長情況對照表
與空白對照相比,添加本發(fā)明菌株的中國對蝦蚤狀一期的變態(tài)率(70%)比對照(50.3%)高40%。
4、菌株N6對南美白對蝦蚤狀I期幼體的變態(tài)率的影響見表6。
表6.南美白對蝦蚤狀I期幼體的變態(tài)率生長情況對照表
與空白對照相比,添加本發(fā)明菌株的南美白對蝦蚤狀一期的變態(tài)率(70%)比對照(43.3%)高40.8%。
實施例5。應用實施例1所述的分離培養(yǎng)方法所得到的菌株進行的養(yǎng)殖實驗。
實驗一。
選取待產(chǎn)的健壯中華絨螯蟹親蟹,分別置于3個容積為30立方米的水泥池中集中孵化,使得水體中蚤狀I期幼體密度15萬尾/立方米左右,連續(xù)充氣,水溫20-21℃,適量投喂200網(wǎng)目過濾的蛋黃,一次添加菌株(細菌密度105-106CFU/ml),每天換水(處理后的滅菌海水)30%,并再添加菌株(投放細菌密度105-106CFU/ml),直至90%個體變?yōu)樵闋領I期幼體后,按照常規(guī)管理進行操作。試驗結果為,3個育苗池分別獲得中華絨螯蟹大眼幼體9公斤、10公斤和12公斤,平均10.3公斤;而同期未投放本發(fā)明菌株的該場其它育苗池獲得中華絨螯蟹大眼幼體的平均產(chǎn)量為7.5公斤,平均增產(chǎn)37.3%。
實驗二。
選取待產(chǎn)的健壯三疣梭子蟹親蟹,分別置于3個容積為30立方米(底面積為20平方米)的水泥池中集中孵化,使得水體中蚤狀I期幼體密度12萬尾/立方米左右,連續(xù)充氣,水溫24-25℃,適量投喂200網(wǎng)目過濾的蛋黃,一次添加菌株(細菌密度105-106CFU/ml),每天換水(處理后的滅菌海水)30%,并再添加菌株(投放細菌密度105-106CFU/ml),直至90%個體變?yōu)樵闋領I期幼體后,按照常規(guī)管理進行操作。試驗結果為,3個育苗池分別獲得三疣梭子蟹1-2期幼蟹9公斤、7.5公斤和8.0公斤,平均8.2公斤;而同期未投放本發(fā)明菌株的該場其它育苗池獲得中華絨螯蟹大眼幼體的平均產(chǎn)量為6.3公斤,平均增產(chǎn)30%。
實驗三。
選取活力良好的中國對蝦無節(jié)幼體,分別置于3個容積為30立方米(底面積為20平方米)的水泥池中集中孵化,使得水體中無節(jié)幼體的密度為15萬尾/立方米左右,連續(xù)充氣,水溫21-22℃,待無節(jié)幼體變態(tài)為蚤狀I期幼體后適量投喂250網(wǎng)目過濾的蛋黃、酵母,一次添加菌株(細菌密度105-106CFU/ml),每天換水(處理后的滅菌海水)30%,補充菌株(投放細菌密度105-106CFU/ml),直至90%個體變?yōu)樵闋領I期幼體后,按照常規(guī)管理進行操作。試驗結果為,3個育苗池分別獲得中國對蝦仔蝦240萬尾、250萬尾和300萬尾,平均263萬尾;而同期未投放本發(fā)明菌株的該場其它育苗池獲得中華絨螯蟹大眼幼體的平均產(chǎn)量為206萬尾,平均增產(chǎn)27.7%。
實驗四。
選取活力良好的南美白對蝦無節(jié)幼體,分別置于3個容積為30立方米(底面積為20平方米)的水泥池中集中孵化,使得水體中無節(jié)幼體的密度為12萬尾/立方米左右,連續(xù)充氣,水溫22-23℃,待無節(jié)幼體變態(tài)為蚤狀I期幼體后 適量投喂250網(wǎng)目過濾的蛋黃和酵母,一次添加菌株(細菌密度105-106CFU/ml),每天換水(處理后的滅菌海水)30%,補充菌株(投放細菌密度105-106CFU/ml),直至90%個體變?yōu)樵闋領I期幼體后,按照常規(guī)管理進行操作。試驗結果為,3個育苗池分別獲得南美白對蝦仔蝦248萬尾、280萬尾和310萬尾,平均279萬尾;而同期未投放本發(fā)明菌株的該場其它育苗池 獲得南美白對蝦仔蝦的平均產(chǎn)量為234萬尾,平均增產(chǎn)19.2%。
權利要求
1.一種農(nóng)桿菌屬水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6(Agrobacterium isolate N6)的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,其步驟是采集中華絨螯蟹育苗用水,將該水梯度稀釋后,涂布到2216E海洋細菌固體培養(yǎng)基上,20℃恒溫培養(yǎng)72~96h;挑選不同菌落形態(tài)的菌株接種到2216E海洋細菌斜面培養(yǎng)基保藏待用;然后將斜面菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基,20℃,160r/min,培養(yǎng)48h后,離心后獲得細菌菌體;取各離心后獲得細菌菌體,通過單株細菌菌體感染剛出膜的中華絨螯蟹蚤狀一期幼體的方法,比較蚤狀二期幼體變態(tài)率,導致蚤狀二期幼體變態(tài)率最高的細菌即為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,離心所得到的菌株具有以下菌株特征該菌株為革蘭氏陽性短桿菌,大小為0.2~0.6μm×0.8~2.0μm,無芽孢,無莢膜;在2216E海洋細菌平板培養(yǎng)基上形態(tài)為乳白色、邊緣光滑、中間突起;該菌為好氧菌,生長溫度范圍為0℃~28℃,最適生長溫度為22℃,生長pH范圍為5.5~11.0,最適pH為7.6;耐NaCl的濃度為12%,最適合的鹽濃度為2%,無NaCl不生長;該菌能利用葡萄糖,不能利用淀粉;能液化明膠;硫化氫試驗、V-P試驗及過氧化氫接觸酶試驗呈陽性;甲基紅試驗呈陰性。
3.根據(jù)權利要求1所述的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,離心所得到的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖7g/L,硫酸銨4g/L,酵母膏1g/L,NaCl2g/L,pH7.6;發(fā)酵條件為接種量5%,20℃,180r/min,培養(yǎng)24h。
4.一種如權利要求1或2或3所述的分離培養(yǎng)方法所得到的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6提高海水甲殼類幼體的變態(tài)率與存活率的用途。
5.根據(jù)權利要求4所述的用途,所述的海水甲殼類幼體是中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、中國明對蝦或南美白對蝦。
6.根據(jù)權利要求4所述的用途,其特征在于,用于該用途的菌株的使用方法為將該菌株擴大培養(yǎng)后,離心得菌體,加滅菌過的自然海水配成濃菌液,在海水甲殼類幼體的蚤狀一期階段按照1~10×105cfu/ml的濃度投放至養(yǎng)殖水體中,每1-2天投放1-2次。
全文摘要
農(nóng)桿菌屬水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6(Agrobacterium isolate N6)的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,采集中華絨螯蟹育苗用水,將該水梯度稀釋后,涂布到2216E固體培養(yǎng)基上,20℃恒溫培養(yǎng)72~96h;挑選不同菌落形態(tài)的菌株接種到2216E斜面培養(yǎng)基保藏待用;然后將斜面菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基,20℃,160r/min,培養(yǎng)48h后,離心后獲得細菌菌體;取各離心后獲得細菌菌體,通過單株細菌菌體感染剛出膜的中華絨螯蟹蚤狀一期幼體的方法,比較蚤狀二期幼體變態(tài)率,導致蚤狀二期幼體變態(tài)率最高的細菌即為水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌N6菌株。該篩選益生菌的方法簡潔高效;該益生菌對多種甲殼類動物幼體具有益生作用,從而大幅度提高苗種產(chǎn)量。
文檔編號A61P43/00GK101691548SQ20091003517
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月14日 優(yōu)先權日2009年9月14日
發(fā)明者朱明 , 閻斌倫, 陳靜, 夏振強 申請人:淮海工學院