專利名稱：一種日本血吸蟲病樹枝狀載體-dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種日本血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗及其制備方法，涉及人畜共患 病核酸疫苗，特別是針對血吸蟲病的核酸疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康、影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。 目前，血吸蟲病流行于全球76個國家和地區(qū)，威脅著約7億多人口的健康，估計(jì)感染人 口約2億。我國是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國家，經(jīng)過多年積極防治，我國血吸蟲病 防治工作雖取得了舉世矚目的成就，但由于日本血吸蟲有40多種保蟲宿主，中間宿主釘 螺分布廣且難以消滅，而且再感染頻繁發(fā)生，故以吡喹酮化療為主的血防策略難以阻斷 傳播，血吸蟲病的流行狀況依然嚴(yán)峻。研制安全、有效的血吸蟲病疫苗，控制家畜感 染，減少傳播來源和對人體的威脅是WHO提出的綜合防治血吸蟲病中的一個主要措施， 且放在優(yōu)先發(fā)展的位置上，目前已有6種曼氏血吸蟲候選疫苗分子得到WH0/TDR認(rèn)可。
DNA疫苗作為第三代疫苗，由于其穩(wěn)定、多效、操作簡便及易于制備等優(yōu)點(diǎn)受 到廣泛的關(guān)注并成為研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外研究者至今已在抗血吸蟲病領(lǐng)域進(jìn)行了大量的 研究，顯示了良好的應(yīng)用前景。日本血吸蟲中國大陸株23kDa膜蛋白(SjC23)DNA疫苗， 在不同基因型小鼠C57BL/6和BALB/c和主要的保蟲宿主之一大動物"豬"中進(jìn)行保護(hù) 性實(shí)驗(yàn)都顯示了較好的免疫保護(hù)作用。因此，SjC23DNA疫苗是一個很有希望的日本血 吸蟲病DNA疫苗。但是，由于其保護(hù)率還未能穩(wěn)定達(dá)到WHO規(guī)定的高于40X的保護(hù)力 水平，因此如何提高日本血吸蟲疫苗的保護(hù)力成為當(dāng)前血吸蟲病疫苗亟待解決的問題， 也是當(dāng)今血吸蟲病DNA疫苗的研究熱點(diǎn)。 DNA向細(xì)胞內(nèi)的傳遞過程是影響DNA轉(zhuǎn)染水平的一個關(guān)鍵因素，裸露的DNA 在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染水平對真核細(xì)胞的效率都很低，并且進(jìn)入細(xì)胞的DNA容易受到細(xì)胞內(nèi) 核酸酶的酶切作用影響，從而使存留和表達(dá)的時間很短，難以滿足治療和預(yù)防的需要。 同時，只有載體系統(tǒng)有效地通過生物體內(nèi)的一系列生物屏障(靶向目的細(xì)胞、組織和器 官)，DNA才能進(jìn)入細(xì)胞。因此，建立安全有效的DNA載體系統(tǒng)對提高疫苗的保護(hù)作用 尤為重要。樹枝狀高分子(dendrimers)是一類三維的、高度有序的人工合成的新型納米載 體。其中，聚酰胺-胺型樹枝狀高聚物(PAMAM dendrimers)是研究較為廣泛和成熟的類 型，分子表面帶正電荷的大量氨基能夠與抗體、核酸或熒光團(tuán)發(fā)生靜電作用而形成復(fù)合 物，鑒于樹枝狀高分子的納米結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此是一類非常理想的生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體。近 年來，提高樹枝狀高分子的細(xì)胞黏附能力并降低其細(xì)胞毒性成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。哺乳 動物細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，因此帶正電荷的材料表面與細(xì)胞膜表面由于靜電吸附，有利 于細(xì)胞黏附，而帶負(fù)電荷的材料表面由于靜電排斥，不利于細(xì)胞黏附。研究發(fā)現(xiàn)，將含 有豐富正電荷基團(tuán)的氨基酸接枝在樹枝狀高分子表面，可以增加黏附細(xì)胞的數(shù)量、增強(qiáng) 細(xì)胞的黏附力。本發(fā)明將經(jīng)改性的樹枝狀載體與血吸蟲病DNA疫苗結(jié)合構(gòu)建成樹枝狀載 體-DNA疫苗。2/8頁

發(fā)明內(nèi)容
針對單純的DNA疫苗轉(zhuǎn)染水平不高的缺點(diǎn)，本發(fā)明擬用生物相容性良好的 L-賴氨酸(L-lysine)對PAMAM進(jìn)行表面修飾，合成生理?xiàng)l件下具有良好生物相容性 的PAMAM-賴氨酸接枝共聚物(PAMAM-Lys)，增加PAMAM表面氨基基團(tuán)數(shù)目，增強(qiáng) PAMAM的正電性，從而便于和更多的DNA負(fù)電荷相互作用，攜帶更多的DNA。將新 型載體PAMAM-Lys與日本血吸蟲pJW4303-SjC 23DNA疫苗結(jié)合，構(gòu)建成一種新型的樹 枝狀載體-DNA疫苗，以增強(qiáng)血吸蟲病DNA疫苗的免疫保護(hù)作用。 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗，由血吸蟲病DNA
疫苗pJW4303-SjC23和改性的樹枝狀載體PAMAM-Lys結(jié)合，即為血吸蟲病樹枝狀載
體-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23復(fù)合物。 該血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟 (l)DNA疫苗pJW4303-SjC23的構(gòu)建和制備 1)根據(jù)SJC23基因序列設(shè)計(jì)一對引物P1 : 5 ， GCGCTAGCATG GCGACT TTG GGTACT-3 ，p2 : 5' GCGGATCCAAC ATT CTG ATAATCG-3' pl、 p2分別引入限制性酶切位點(diǎn)Nhel和BamHI，由上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)有限公司合成； 2)日本血吸蟲總RNA的提取取lOOmg日本血吸蟲中國大陸株成蟲，加入 lmLTRIzol(Invitrogen公司)，用一次性研磨杵充分勻漿，在Ependorf管中，室溫放置 5min， 4°C、 12,000rpm離心10min，取上清；加入200iiL氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放 置3-5min使其自然分相，4°C、 12,000rpm離心10-15min后分成三層黃色的有機(jī)相，中 間層和無色的水相，RNA主要在水相中，把水相(約550 ii L)小心轉(zhuǎn)移到新Ependorf管 中，加入550iiL冰冷的異丙醇，室溫放置10-20min， 4°C、 12,000rpm離心10min， RNA 沉淀于管底，棄上清；在RNA沉淀中加入lmL用RNase-free水配制的75X乙醇，輕輕顛 倒混勻，以清洗RNA沉淀，室溫放置1-2分鐘晾干沉淀后加入100 ii L去RNA酶雙蒸水 (RNase-free水)溶解，其濃度及純度經(jīng)BECKMAN DU-600核酸蛋白測定儀測定，-70°C 保存?zhèn)溆茫?3)cDNA第一鏈的合成 在Ependorf管中加RNA 1 y g， 75 °C變性5min，迅速置于冰浴中；加入 2iiL10X反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4iiL25m mol/LMgC12溶液、2 ii L10m mol/L dNTP液、1 ii L RNA酶抑制劑、0.5 ii g反轉(zhuǎn)錄引物Oligo dT(12 18個核苷酸組成)和20單位的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)，用RNase-free水補(bǔ)充到20 y L，充分混勻，42t:反應(yīng)1 3h 后加pH 8.0的0.5mol/L EDTA 2 y L終止反應(yīng)；95。C加熱5min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，置冰 浴5min，合成的cDNA第一鏈保存于-20^備用；
4)RT-PCR RT-PCR反應(yīng)體系如下cDNA第一鏈10iiL、 10X Buffer 10 ii L、 25m mol/L MgCl2溶液6iiL、 10m mol/L dNTP液2 ii L、弓l物pl2yL、弓l物p22yL、 Taq DNA聚合 酶2.5單位、加ddH20至總體積100 ii L ;
反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min; 95。C變性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin， 進(jìn)行30個循環(huán)；末次循環(huán)后72t:延伸10min ;取5 y L反應(yīng)產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像系統(tǒng)鑒定RT-PCR產(chǎn)物片段大小與目的片段SJC23大小相同即657bp ;其核苷酸 序列為SEQIDNO : 1
5)DNA疫苗的構(gòu)建 本發(fā)明采用pJW4303真核表達(dá)質(zhì)粒(DNA immunisation with Onchocerca volvulus chitinase induces partial protection against challenge infection with L31arvae in mice.Harrison RA， WuY， EgertonG， Bianco AE.Vaccine. 1999Novl2 ; 18(7-8) : 647-655.)作為血吸蟲 抗原基因SjC 23的表達(dá)載體。取含真核表達(dá)質(zhì)粒pJW4303的大腸桿菌XLl-blue單菌落 于含氨芐青霉素(Amp，終濃度100 g/mL)的3mL培養(yǎng)基中，37°C、 250rpm振蕩培養(yǎng) 16h，按照Promega公司質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)抽提質(zhì)粒； 限制性內(nèi)切酶Nhel和BamHI雙酶切質(zhì)粒pJW4303 : pJW430316iiL、 Nhe I
1 ii L、 BamH I 1 ii L、 Buffer B 2 ii L，總體積20 ii L， 37。C水浴4h ;將所得的SJC23在相同條件下用限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI酶切； 將酶切純化后的SJC23與pJW4303用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)如下
pJW43036iiL、 SjC232iiL、 T4DNA連接酶1 y L、 10X緩沖液liiL，總體積10iiL，
16。C水浴過夜12 16h ; 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue后，鑒定陽性重組子，通過雙酶切及DNA測序 鑒定，得到的陽性重組子即為重組質(zhì)粒pJW4303-SjC23 ;
6pNA疫苗的大量制備pJW4303-SjC23質(zhì)粒DNA的大量制備按Qiagen公司Qiagen-2500操作說明進(jìn) 行，制備的質(zhì)粒DNA溶解于無菌生理鹽水，其濃度及純度經(jīng)BECKMAN DU-600核酸蛋 白測定儀測定，所制備DNA的A260/A280為1.85 1.95，濃度均調(diào)整為lmg/mL ;
p)聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM，乙二胺為內(nèi)核)的端基改性
1)縮合反應(yīng) 由于PAMAM的代數(shù)越高，末端端基數(shù)越多，細(xì)胞毒性也越大，故本發(fā)明對目 前常用的4.0代PAMAM進(jìn)行改性(購自SIGMA公司)。以無水N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)為溶劑，將4.0代PAMAM lg和氨基保護(hù)的L-賴氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)4g加入 50mL三頸瓶中，加入1-羥基苯并三唑(HOBt)、苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基 脲六氟磷酸酯(HBTU)和N， N-二異丙基乙胺(DIPEA)(HOBt : HBTU : DIPEA質(zhì)量比
為i : i : 2)組成的縮合劑(o.ig)，通氮?dú)猓覝財(cái)嚢璺磻?yīng)4h;加入大量乙醚使產(chǎn)物沉
淀析出，離心去除上層清液，然后用過量乙醚洗滌沉淀，離心收集得到氨基保護(hù)的L-賴 氨酸改性聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc)淡黃色沉淀。
2)芴甲氧羰基(Fmoc-)保護(hù)基的脫除 Fmoc-保護(hù)基在酸性條件下穩(wěn)定，但在10%哌啶下很容易脫除，缺點(diǎn)是進(jìn)行其 它反應(yīng)時要盡量避免使用強(qiáng)堿性條件。實(shí)驗(yàn)中，加入哌啶和無水DMF(體積比為30 : 70) 脫除Fmoc-官能團(tuán)。先用14mL DMF溶解上述步驟1)所得產(chǎn)物氨基保護(hù)的L-賴氨酸改 性聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc)，再加入6mL哌啶，然后在室溫下冷凝回流lh。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物在大量乙醚中沉淀，離心去除上層清液；并用過量乙醚 多次洗滌沉淀，離心收集沉淀物，得到白色粉末狀沉淀。
3)叔丁氧羰基(Boc-)保護(hù)基的脫除 Boc-保護(hù)基在堿性條件下穩(wěn)定，但可以在酸性條下脫除。實(shí)驗(yàn)中，以三氟乙酸 和無水DMF(體積比為1 : 9)脫除Boc-官能團(tuán)。先用9mL無水DMF溶解步驟2)所得脫 除芴甲氧羰基(Fmoc-)保護(hù)基的氨基保護(hù)的L-賴氨酸改性聚酰胺-胺樹枝狀高分子產(chǎn)物， 再加入lmL三氟乙酸，室溫冷凝回流lh。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物在大量乙醚中沉淀，離心去 除上層清液。并用過量乙醚多次洗滌沉淀，離心收集沉淀物，得到白色粗產(chǎn)品沉淀，即 為L-賴氨酸改性聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM-Lys)。
4)產(chǎn)物純化 將步驟3)所得產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸改性聚酰胺-胺樹枝狀高分子(PAMAM-Lys)溶于 雙蒸水并在4t:條件下用截留分子量為14000的透析膜透析12h，冷凍干燥條件下收集產(chǎn) 物，得到白色粉末PAMAM-Lys。 PAMAM改性前后的結(jié)構(gòu)變化如圖1所示。從圖1中 可以看出，改性后PAMAM-Lys內(nèi)層結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，表面基團(tuán)增多，末端氨基數(shù)目比 4.0代PAMAM增加一倍，分子半徑明顯增大。
5)PAMAM-Lys的表征將PAMAM-Lys(2 3mg)粉末樣品與無水溴化鉀(約300mg)研細(xì)后放入模
具中，在真空下用壓片機(jī)加壓制成含有分散樣品的鹵鹽薄片，固定在樣品架上，采用
Magna 750型傅立葉變換紅外光譜儀對PAMAM-Lys進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；同時用德國Bruker公
司Avance300核磁共振儀對PAMAM-Lys進(jìn)行"H-NMR結(jié)構(gòu)表征。觀測頻率為399Hz，重
水(D20)做溶劑。紅外光譜和核磁共振光譜表征的結(jié)果說明賴氨酸改性4.0代PAMAM
樹枝狀高分子的合成是成功的。(3)樹枝狀載體-DNA疫苗的制備 將PAMAM-Lys樹枝狀載體聚合物溶于生理鹽水中，配成lmg/mL備用，由于整 代PAMAM及其衍生物的外層-NH2在水溶液中容易電離，從而帶一個單位的正電荷，但 質(zhì)粒單核苷酸在水溶液中通常帶單個負(fù)電荷，因此選用電荷比(U，即聚合物外層正電 荷的摩爾數(shù)與DNA中磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的摩爾數(shù)之比作為確定整代PAMAM樹枝狀高分子 與質(zhì)粒DNA配比的標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算公式為
Cplai;mid X Kplasmid—Cp0jvmcr X i\'p0jvmcr
^-■，十A —- 上式中，Cplasmid為質(zhì)粒濃度(mg/mL)， Vplasmid為質(zhì)粒體積(P L)， 330為質(zhì)粒單核 苷酸分子量，Mp。lymCT為聚合物相對分子質(zhì)量，Cp。lymCT為聚合物濃度(mg/mL)， Np。lymCT為聚 合物表面基團(tuán)數(shù)，V為需要加入的聚合物體積(PL)。 由公式計(jì)算出電荷比R^ = 0.5、 1、 2、 4、 8、 10時所需要的聚合物用量。具 體制備過程如下用移液槍分別量取10y L質(zhì)粒DNA溶液和所需體積的樹枝狀高分子溶 液，然后在Eppendorf管中混合均勻，振蕩10s， 37。C靜置10min，即為血吸蟲病樹枝狀載 體-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23復(fù)合物。本發(fā)明的有益效果日本血吸蟲病pJW4303-SjC23疫苗與PAMAM-Lys結(jié)合構(gòu)
建成的樹枝狀載體-DNA疫苗具有明顯提高宿主的免疫反應(yīng)性和免疫保護(hù)作用，而且與
8宿主組織細(xì)胞具有良好的生物相容性。該疫苗具有十分廣闊的應(yīng)用前景。


圖1PAMAM改性前后的結(jié)構(gòu)變化。(a)4.0G PAMAM， (b)PAMAM-Lys。 圖2樣品的透射電鏡圖。A、純質(zhì)粒(X5萬倍)，B、 PAMAM-Lys/DNA(R^—=
4， X8萬倍)。 圖3各組免疫小鼠IgG抗體水平。1、對照組1(pJW4303)， 2、對照組2(PAMAM-Lys)3、 pJW4303-SjC23組，4、 PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23組。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :樹枝狀載體-DNA疫苗的特性分析 1 、電泳阻滯實(shí)驗(yàn)通過瓊脂糖凝膠電泳確定質(zhì)粒DNA與PAMAM-Lys樹枝狀高分子完全復(fù)合的最佳電荷比R^-。結(jié)果表明PAMAM-Lys在電荷比為4時結(jié)合DNA能力達(dá)到最強(qiáng)。 2、樹枝狀載體-DNA疫苗的形態(tài)考察用透射電子顯微鏡(TEM)觀察疫苗形態(tài)。分別將質(zhì)粒DNA和樹枝狀載體-DNA疫苗溶液10 ii L滴在銅網(wǎng)上，吸附2min后，用濾紙將溶劑吸干；再用10iiL2X醋酸雙氧鈾滴在銅網(wǎng)上進(jìn)行負(fù)染色，吸附2min后，再用濾紙吸干。待晾干后放置于電鏡下觀測。結(jié)果質(zhì)粒DNA與樹枝狀載體結(jié)合后，較純質(zhì)粒直徑變小，樹枝狀載體-DNA疫苗的粒徑趨向于平均化；PAMAM-Lys/DNA復(fù)合物(R^ = 4)形成的復(fù)合物圖像上呈現(xiàn)出規(guī)則排列的粒子形態(tài)，粒徑在50 100nm之間(圖2)。 3、樹枝狀載體-DNA疫苗的穩(wěn)定性考察將該樹枝狀載體-DNA疫苗溶液放置Oh、 6h、 12h、 24h、 36h后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，考察疫苗的穩(wěn)定性。結(jié)果樹枝狀高分子與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物在36h時間內(nèi)沒有發(fā)生解離，有較好的穩(wěn)定性。
實(shí)施例2樹枝狀載體的體外細(xì)胞毒性評價(jià) 取生長狀態(tài)良好的293人胚腎細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至lX105/mL，均勻鋪于96孔板(100iiL/孔)，于37。C， 5XCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后將5.0代PAMAM、PAMAM-Lys聚合物溶液及PAMAM/DNA復(fù)合物溶液按照2 y L、 10 y L、 50 y L三組用量加入到96孔板中，每組作3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h后加入100 ii L 5%小牛血清(FCS)DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)，于37°C、 5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)12h、 24h和48h。 顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞相對增殖率，考察不同加藥量和
用藥時間對細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活性的影響。細(xì)胞相對增殖率
<formula>formula see original document page 9</formula> 5XFCSDMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對照，其細(xì)胞相對增殖率設(shè)為
100%，陽離子聚合物多聚賴氨酸(PLL)作為陽性對照，本底設(shè)為5XFCSDMEM培養(yǎng)
基、MTT、 二甲基亞砜(DMSO)，不含細(xì)胞。各復(fù)孔的OD值取平均數(shù)。樹枝狀高分子5.0代PAMAM和PAMAM-Lys在10 y L(濃度約為100 y g/mL)用量下沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性；PAMAM-Lys細(xì)胞相對增殖率為91.7%， 5.0GPAMAM 細(xì)胞相對增殖率為80.2% ，而陽離子聚合物PLL相對增殖率僅為27.6%; PAMAM-Lys細(xì) 胞毒性明顯低于5.0GPAMAM ;與4.0GPAMAM相比，PAMAM-Lys增加了末端氨基基 團(tuán)數(shù)目，即表面正電荷數(shù)目，從而提高了與DNA的結(jié)合效率；與具有相同末端基團(tuán)數(shù)目 的5.0GPAMAM相比，PAMAM-Lys可降低因多步合成所造成的細(xì)胞毒性，證實(shí)了所合成 樹枝狀載體PAMAM-Lys具有良好的生物相容性，可以用于生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3樹枝狀載體-DNA疫苗的免疫反應(yīng)性測定 將50只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組，即pJW4303(對照組1)、 PAMAM-Lys(對照組 2)、 pJW4303-SjC23和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23，每組12 14只。各組小鼠分別注射 純化的pJW4303、 PAMAM-Lys、 pJW4303-SjC23和復(fù)合物PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23 于小鼠股四頭肌，每鼠100iig，左右腿各50iig。每隔2周加強(qiáng)免疫1次，劑量和方法 相同，共免疫3次。首次免疫前及末次免疫后4周分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清置-2(TC 保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA法檢測免疫后小鼠的抗體，評價(jià)經(jīng)疫苗免疫后小鼠產(chǎn)生特異 性抗體的水平?？贵w檢測結(jié)果表明，pJW4303-SjC23疫苗和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23疫 苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體，A站。值分別為0.546±0.152、 0.725±0.165，與 pJW4303-SjC23相比，PAMAM-lys/pJW4303-SjC23的抗體水平顯著升高(P < 0.05)，對照 組1(pJW4303)和對照組2(PAMAM-Lys)均未檢測到特異性抗體(圖3)。
實(shí)施例4脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測 末次免疫后3周，每組各取2只小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，常規(guī)法制備單個脾 細(xì)胞懸液，用SjC23-大親水片段蛋白(SjC23-HD)[日本血吸蟲(大陸株)23kD分子(SJC23) 大親水肽段(HD)在PGEX-5X-1中表達(dá)。余傳信.朱蔭昌.殷旭仁.何偉.華萬全.實(shí)用 寄生蟲病雜志2000(4)]作為剌激原誘生細(xì)胞因子。具體步驟 l)拉頸處死小鼠，75X酒精浸泡3 5min，取出后置于平皿中，無菌取脾臟。
2)脾臟用鑷子研磨，通過200目不銹鋼篩網(wǎng)濾下，用不完全RPMI-1640(GIBCO) 培養(yǎng)液懸浮至5mL。 3)1000rpm離心5min ;棄去上清，在沉淀中加2mL紅細(xì)胞裂解液，混勻。
4)1000rpm離心5min ;棄去上清，用5mL不完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸脾細(xì) 胞。 5)1000rpm離心5min ;小心吸掉上清，用10% FCS RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整 細(xì)胞濃度為6Xl(f個/mL。 6)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加脾細(xì)胞懸液100iiL，加剌激原100iiL。每組小 鼠的脾細(xì)胞懸液分為二份， 一份以SjC23(5 ii g/mL)作為剌激原，余下的一份加10% FCS 完全RPMI-1640培養(yǎng)液作為對照。每份樣品均行雙復(fù)孔檢測。 7)培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中，5%C02， 37t:培養(yǎng)72h，離心收集上清進(jìn)行細(xì)胞因子檢 測。流式細(xì)胞儀檢測鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、 Y干擾素(IFN-Y)、腫瘤壞死因子(TNF)水平，操作按照BD公司試劑盒說明書，采用流 式細(xì)胞微球法(CBA法)進(jìn)行檢測。脾細(xì)胞經(jīng)SJC23剌激，IL-2、 IFN- Y和TNF的細(xì)胞 因子水平，相對于空質(zhì)粒對照組1(pJW4303)和改性樹枝狀載體對照組2(PAMAM-Lys)，
10疫苗組pJW4303-SjC23組和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23組均有所升高，且PAMAM-Lys/ pJW4303-SjC23組明顯高于pJW4303-SjC23組(表1)。 各組的IL-4和IL-5的水平均低于 檢測限。 表1細(xì)胞因子IL-2、 IFN- Y和TNF檢測結(jié)果
IL-2 (pg/mL) !FN-y (pg/mL) TNF (pg/mL)
組別 -■- ——
傘A甜蹈SjC23空白對照S i C.2 j空白對照
l)AMA M習(xí)Lys/p J W43 03鄰23,,02<20329.71<202聽J4<20
pJW'130-VSj(，2352,86<2092扁<20107,86<20
對麗龜1 (ijJW4303》<20<20<2041,24<20
對照纟H 2 (iWMAM-Lys》<20<2030.12<2039,73<20 實(shí)施例5免疫保護(hù)性試驗(yàn) 將50只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組，即pJW4303(對照組1)、 PAMAM-Lys(對照組 2)、 pJW4303-SjC23和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23，每組12 14只。各組小鼠分別注 射pJW4303、 PAMAM-Lys、 pJW4303-SjC23及PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23于小鼠股四 頭肌，每鼠100iig，左右各50yg。每隔2周加強(qiáng)免疫1次，劑量和方法相同，共免疫3 次。第3次免疫后4周每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染(40士1)條尾蚴。攻擊感染后42d剖殺 小鼠，用枸櫞酸生理鹽水灌沖，在門靜脈收集成蟲并計(jì)數(shù)，取出肝臟稱重后剪碎置5mL 5XK0H溶液中，37t:消化過夜，計(jì)數(shù)蟲卵。按下列公式計(jì)算減蟲率及減卵率 減蟲率=[(對照組平均每鼠成蟲數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均每鼠成蟲數(shù)y對照組平均每鼠成
蟲數(shù)]X100X 減卵率=[(對照組平均每鼠肝臟蟲卵數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均每鼠肝臟蟲卵數(shù))/對照組平 均每鼠肝臟蟲卵數(shù)]X100X 各實(shí)驗(yàn)組小鼠所檢成蟲數(shù)低于對照組，P<0.01。 相對于對照組l， pJW4303-SjC23組和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23組減蟲率分別為34.00%和45.33%，且 PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23組減蟲率顯著高于pJW4303-SjC23組，P < 0.05 ;對照組1
與對照組2差異無顯著性(P > 0.05)各組小鼠檢獲的成蟲數(shù)見表2。
表2各組小鼠檢獲的成蟲數(shù)的比較
組別*小鼠數(shù)成蟲數(shù)P值
(x±s)(%)
pJW4303-SjC231219息4.1134.00<0.()1
PAM扁層Lys/pJ，4303-SjC231216,德2.4145.33<0.01
對麗組1 (pJW4303)1330扉5,06—<0.01
對照組2 (PAMAM-Lys)1329息3J91.9>0.05 各組小鼠肝臟組織中檢獲的蟲卵數(shù)見表3。各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織檢獲的蟲 卵數(shù)均低于對照組，P < 0.01。
相對于對照組1， pJW4303-SjC23組和PAMAM-Lys/ pJW4303-SjC23組減卵率分別為40.14X禾P 59.61%， PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23組減卵 率顯著高于pJW4303-SjC23組，P < 0.05 ;對照組1與對照組2差異無顯著性(P > 0.05)。
表3各組小鼠肝臟組織檢獲的蟲卵數(shù)的比較
組別*小鼠數(shù)蟲卵數(shù) (X ±s)減卵率 (%)P值
pJW4303-SjC23124300tttlOU540.14<0.01
PAMAM-Lys/pJW棚3畫SjC231263727±1138759.61<0.01
對廳蘊(yùn)l (pJW4303)106454±26742—<0,01
對照組2 (PAMA.M-Lys)131〗27i5土20148>0.05 序列表 SEQIDNO : 1 atggcgactt tgggtactgg gatgaggtgt ctgaagagtt gtgtgttcat attgaacatt 60 atctgtctgt tatgttccct tgtattaata ggcgctggtg catatgtaga agttaaattc 120 agccagtatg aggctaattt acataaagtc tggcaggcgg ctcccatcgc aattattgtg 180 gttggagtgg taattctcat agtaagcttc ttgggctgtt gtggagctat aaaggaaaac 240 gtctgcatgc tttacatgta tgcatttttc cttattgtcc ttctgattgc tgagttggtc 300 gccgccattg ttgcggtggt gtacaaggat aaaatcgatg acgaaattaa tacactaatg 360 actggtgctc tggaaaatcc aaacgaggaa她acggcaa ccatggataa gatacaaaca 420 tcattccatt gttgtggagt caaaggtcca gacgattata aagggaatgt gccagcatca 480 tgtaaagaag ggcaagaagt ttatgttcag ggttgtctat ctgtctttag tgcattctta 540 aaacgcaact taataattgt tgcctgtgtg gcattcggtg tatgcttctt ccaactgcta 600 agcatcgtta tagcttgttg tttgggtcaa cgaatacacg attatcagaa tgtttaa 657 pi : 5， -GCGCTAGCATGGCGACTTTGGGTACT-3， p2:5， -GCGGATCC AAC ATT CTG ATAATCG-3，
1權(quán)利要求
一種日本血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗，其特征在于由血吸蟲病DNA疫苗pJW4303-Sj23和改性的樹枝狀載體PAMAM-Lys結(jié)合，即為血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23復(fù)合物。
2. 權(quán)利要求1所述的血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗的制備方法，其特征在于它包括 以下步驟(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的構(gòu)建和制備1) 根據(jù)SJC23基因序列設(shè)計(jì)一對引物p 1 : 5' -GC GCTAGC ATG GCG ACT TTG GGTACT-3' p2 : 5' -GC GGATCC AAC ATT CTG ATAATCG-3' pl、 p2分別引入限制性酶切位點(diǎn)Nhe I和BamH I;2) 日本血吸蟲總RNA的提取取100mg日本血吸蟲中國大陸株成蟲，加入lmL TRIzol，用一次性研磨杵充分勻漿，在Ependorf管中，室溫放置5min， 4°C、 12,000rpm 離心10min，取上清；加入200 y L氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5min使其自然分 相，4°C、 12,000rpm離心10-15min后分成三層黃色的有機(jī)相，中間層和無色的水相， RNA主要在水相中，把水相小心轉(zhuǎn)移到新Ependorf管中，加入550 y L冰冷的異丙醇，室 溫放置10-20min， 4°C、 12,000rpm離心10min， RNA沉淀于管底，棄上清；在RNA沉淀 中加入lmL用RNase-free水配制的75%乙醇，輕輕顛倒混勻，以清洗RNA沉淀，室溫 放置l-2min晾干沉淀后加入100 y L RNase-free水充分溶解，其濃度及純度經(jīng)BECKMAN DU-600核酸蛋白測定儀測定，-70°〇保存?zhèn)溆茫?) cDNA第一鏈的合成在Ependorf管中加RNA lyg， 75。C變性5min，迅速置于冰浴中；加入2iiL10X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4iiL 25m mol/LMgCl2溶液、2 y L 10m mol/L dNTP液、1 y L RNA酶抑 制劑、0.5iig反轉(zhuǎn)錄引物OligodT和20單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，用RNase-free水補(bǔ)充到 20iiL，充分混勻，42。C反應(yīng)1 3h后加pH8.0的0.5mol/LEDTA2iiL終止反應(yīng)；95°C 加熱5min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，置冰浴5min，合成的cDNA第一鏈保存于-20匸備用；4) RT-PCRRT-PCR反應(yīng)體系如下cDNA第一鏈10 ii L、 10XBuffer 10 ii L、 25mmol/L MgC12 溶液6iiL、 10mmol/LdNTP液2iiL、弓l物pl2yL、弓l物p22yL、 TaqDNA聚合酶2.5 單位、加ddH20至總體積100 ii L ;反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min; 95。C變性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin，進(jìn)行 30個循環(huán)；末次循環(huán)后72t:延伸10min ;取5 y L反應(yīng)產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠 成像系統(tǒng)鑒定RT-PCR產(chǎn)物片段大小與目的片段SJC23大小相同，即657bp ;5pNA疫苗的構(gòu)建采用pJW4303真核表達(dá)質(zhì)粒作為血吸蟲抗原基因SjC 23的表達(dá)載體，取含真核表達(dá) 質(zhì)粒pJW4303的大腸桿菌XLl-blue單菌落于含終濃度100 y g/mL氨芐青霉素的3mL培養(yǎng) 基中，37°C、 250rpm振蕩培養(yǎng)16h，按照Promega公司質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒抽提質(zhì) 粒；限制性內(nèi)切酶Nhel和BamHI雙酶切質(zhì)粒pJW4303 : pJW4303 16yL、 Nhel lyL、 BamH I 1 ii L、 Buffer B 2 ii L，總體積20 ii L， 37。C水浴4h ;將所得的SJC23在相同條件下用限制性內(nèi)切酶Nhe I和BamH I酶切；將酶切純化后的SJC23與pJW4303用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)如下 pJW4303 6 ii L、 SjC23 2 y L、 T4 DNA連接酶1 P L、 10 X緩沖液1 y L，總體積10 y L， 16。C水浴過夜12 16h ;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue后，鑒定陽性重組子，通過雙酶切及DNA測序鑒 定，得到的陽性重組子即為重組質(zhì)粒pJW4303-SjC23 ;6)DNA疫苗的大量制備pJW4303-SjC23質(zhì)粒DNA的大量制備按Qiagen公司Qiagen-2500操作說明進(jìn)行，制 備的質(zhì)粒DNA溶解于無菌生理鹽水，其濃度及純度經(jīng)BECKMAN DU-600核酸蛋白測定 儀測定，所制備DNA的A260/A280為1.85 1.95，濃度均調(diào)整為lmg/mL ;(2) 聚酰胺-胺樹枝狀高分子乙二胺為內(nèi)核的PAMAM的端基改性1) 縮合反應(yīng)對4.0代PAMAM進(jìn)行改性以無水N， N-二甲基甲酰胺為溶劑，將4.0代PAMAM lg，和氨基保護(hù)的L-賴氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OH4g，加入50mL三頸瓶中，加入1-羥基 苯并三唑HOBt、苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU和N， N-二異丙基乙胺DIPEA， HOBt : HBTU : DIPEA質(zhì)量比為1 : 1 : 2組成的縮合 劑0.1g，通氮?dú)?，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h;加入乙醚使產(chǎn)物沉淀析出，離心去除上層清液， 用過量乙醚洗滌沉淀，離心收集得到氨基保護(hù)的L-賴氨酸改性聚酰胺-胺樹枝狀高分子 PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc淡黃色沉淀；2) 芴甲氧羰基Fmoc-保護(hù)基的脫除用14mL無水DMF溶解PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc，再加入6mL哌啶，哌啶無水 DMF體積比為30 : 70，然后在室溫下冷凝回流lh，反應(yīng)完成后，產(chǎn)物在大量乙醚中沉 淀，離心去除上層清液；并用過量乙醚多次洗滌沉淀，離心收集沉淀物，得到白色粉末 狀沉淀；3) 叔丁氧羰基Boc-保護(hù)基的脫除以三氟乙酸和無水DMF脫除Boc-官能團(tuán)，三氟乙酸無水DMF體積比為1 : 9， 先用9mL無水DMF溶解步驟2)所得脫除Fmoc-保護(hù)基后的產(chǎn)物，再加入lmL三氟乙 酸，室溫冷凝回流lh，反應(yīng)完成后，產(chǎn)物在大量乙醚中沉淀，離心去除上層清液，并用 過量乙醚多次洗滌沉淀，離心收集沉淀物，得到白色粗產(chǎn)品沉淀，即為L-賴氨酸改性聚 酰胺-胺樹枝狀高分子PAMAM-Lys ;4) 產(chǎn)物純化將步驟3)所得產(chǎn)物PAMAM-Lys溶于水并在4"C條件下用截留分子量為14000的透析 膜透析12h，冷凍干燥條件下收集產(chǎn)物，得白色粉末PAMAM-Lys;(3) 樹枝狀載體-DNA疫苗的制備將PAMAM-Lys樹枝狀載體聚合物溶于生理鹽水中，配成lmg/mL備用；用移液槍 分別量取10 y L質(zhì)粒DNA溶液和所需體積的樹枝狀高分子PAMAM-Lys溶液，高分子外 層正電荷的摩爾數(shù)與DNA中磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的摩爾數(shù)之比，即電荷比R^-為0.5、 1、 2、 4、 8或10.時所需要的聚合物體積用量計(jì)算公式為3<formula>formula see original document page 4</formula>上式中，Cplasmid為質(zhì)粒濃度mg/mL， Vplasmid為質(zhì)粒體積P L， 330為質(zhì)粒單核苷酸分 子量，Mp。lymCT為聚合物相對分子質(zhì)量，Cp。lymCT為聚合物濃度mg/mL， Np。lymCT為聚合物表 面基團(tuán)數(shù)，V為需要加入的聚合物體積P L ;然后在Eppendorf管中混合均勻，振蕩10s， 37。C靜置10min，即為血吸蟲病樹枝狀載 體-DNA疫苗；即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23復(fù)合物。
全文摘要
一種日本血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗及其制備方法，涉及人畜共患病核酸疫苗，特別針對血吸蟲病的核酸疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由血吸蟲病DNA疫苗pJW4303-SjC23和改性的樹枝狀載體PAMAM-Lys結(jié)合，即為血吸蟲病樹枝狀載體-DNA疫苗PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23復(fù)合物。其制備方法，包括以下步驟(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的構(gòu)建和制備，(2)聚酰胺-胺樹枝狀高分子乙二胺為內(nèi)核的PAMAM的端基改性，(3)樹枝狀載體-DNA疫苗的制備。日本血吸蟲病DNA疫苗pJW4303-SjC23與PAMAM-Lys結(jié)合構(gòu)建成的樹枝狀載體-DNA疫苗，具有明顯提高宿主的免疫反應(yīng)性和免疫保護(hù)作用，而且與宿主組織細(xì)胞具有良好的生物相容性。該疫苗具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K48/00GK101690806SQ20091003624
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者朱蔭昌, 李新松, 王曉婷, 趙松, 郭玲香, 高秋端 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所;東南大學(xué)