專利名稱：Hirsutanols A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物Hirsutanols A的新用途。
背景技術(shù)：
海洋微生物，資源極其豐富。由于海洋環(huán)境十分獨特，如高鹽、高壓、低 營養(yǎng)、無光照、海洋微生物適應(yīng)了海洋獨特的生活環(huán)境，必然造就了其獨特的代 謝途徑和遺傳背景。研究發(fā)現(xiàn)海洋微生物能產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特的、具各種生理活 性的代謝產(chǎn)物，其中很多是陸源微生物所不能產(chǎn)生的、是海洋微生物所獨有的。 海洋微生物可實現(xiàn)大規(guī)?；陌l(fā)酵培養(yǎng)，活性代謝產(chǎn)物的制備、藥物研發(fā)不存在 資源問題，海洋微生物已被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)海洋新藥的最重要資源。目前已有多個海 洋微生物代謝產(chǎn)物作為藥物已進(jìn)入了臨床前或臨床試驗。
海洋微生物的研究，主要集中于海洋細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌、真菌。由于各 種原因，國際上對海洋真菌的化學(xué)研究起步比較晚，其真正興起開始于上世紀(jì)90 年代中期。被研究的海洋真菌主要分離于海綿、海藻、被囊動物、軟體動物的體 表或體內(nèi)，以及海洋漂浮木、海洋底泥。已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個結(jié)構(gòu)新穎的海洋真菌代 謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)類型多種多樣，但主要為生物堿類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯類化合物。 據(jù)初步統(tǒng)計，近80%的化合物被報道具有生物活性，如抗腫瘤、抗心血管病、 抗菌、酶抑制劑等。(李厚金，海洋真菌的代謝產(chǎn)物，見林永成主編《海洋微生
物及其代謝產(chǎn)物》第七章，p224—293， 2003年化學(xué)工業(yè)出版社；Natural Products Reports, 2004, 21， 143-163.)。
海洋真菌的藥用研究最成功的例子是頭孢菌素的研制。在1945年7月， Brotzu G.在地中海撒丁島海域分到的一株真菌即頂頭孢霉(C印to/cw;w/w" acre,m',)，并且發(fā)現(xiàn)該菌的培養(yǎng)液能抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的生長。后 來對培養(yǎng)液活性成分進(jìn)行提取、分離，得到多種抗菌素，如頭孢菌素 Cephalosporin C， Cephalosporin PI ， P2， P3， P4， P5以及青霉素Penicillin N。 六十多年過去了，頭孢菌素仍在臨床上廣泛使用。從真菌篩選，到半合成結(jié)構(gòu)改造，目前產(chǎn)品品種已達(dá)200多種，產(chǎn)量占世界抗生素產(chǎn)量的60%以上，頭孢菌素
與青霉素相比具有抗菌譜較廣，耐青霉素酶，療效高、毒性低，過敏反應(yīng)少等優(yōu)點。
盡管珊瑚的化學(xué)成分及藥用研究近半個世紀(jì)來一直都是國際研究的熱點，但 來源于珊瑚的海洋真菌的研究仍是非常稀少，僅有的幾例報道也可見該研究方向
的潛力。例如在1999年，McDonald L.A.報道了從一個未鑒定的軟珊瑚中分離 到一株未經(jīng)鑒定的真菌，從該真菌的代謝產(chǎn)物中分離得到spiroxinsA-E，其中 spiroxinA對25種不同腫瘤細(xì)胞系的平均IC5o為0.09 pg/mL，并且具有獨特的DNA 斷裂作用機(jī)制(Tetrahedron Lett.， 1999， 40， 2489.)。
南海扭曲肉芝軟珊瑚Sa/ro;7/7;;tow tom w，能產(chǎn)生多個具有獨特的雙十四 元大環(huán)的四萜化合物，如methyl sartortuoate， methyl isosartortuoate禾Q methyl tortuoateA-C，在多種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒篩選實驗中，這些四砲化合物也顯示 了中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性(Journal of Asian Natural Products Research, 2007, 9(3), 267-271; Journal of Natural Products, 2004, 67(11), 1915-1918; Journal of the American Chemical Society, 1986, 108(1)， 177-178.)。我們對采自海南三亞西島海 域的軟珊瑚Sara Myto" to池M,的內(nèi)生微生物進(jìn)行了分離培養(yǎng)，已純化得到數(shù) 十株內(nèi)生真菌，這些微生物均可穩(wěn)定培養(yǎng)、保藏，其中一株新的內(nèi)生真菌 Ozo"draWereww sp. nov.，在培養(yǎng)液中分離發(fā)現(xiàn)系列Hirsutane類倍半砲化合物。
Hirsutane類倍半萜，結(jié)構(gòu)獨特，由三個五元環(huán)駢合合成，主要發(fā)現(xiàn)于真菌的 代謝產(chǎn)物。1998年，&6^等報道從海綿/^//^朋3 .中分離的一株種屬未鑒定的 真菌在玉米粉(Difco，s com meal)海水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生hirsutane類倍半萜化合物 hirsutanols A-C禾Qe"f-gloeosteretriol。陸源真菌Cw/o/ws coraons ATCC 66132在葡 萄糖(coriolus glucose broth, CGB)海水培養(yǎng)基能產(chǎn)生具有同樣骨架的hirsutanol D 。化合物Hirsutanol A和e對-gloeosteretriol有弱的抗枯草桿菌Sac/〃tw wto7&活性 (Tetrahedron, 1998， 54, 7335-7342.) 。 (3a^,3W ，65> 3，3a,3b，4,5, 6隱六氫腳3b,6-二羥 基-3a,5,5-三甲基-3-亞甲基-2iZ-環(huán)戊二烯并[a]戊搭稀-2-酮(化合物英文名 (3a^,3bi ,65)陽3，3a,3b， 4,5,6- hexahydro -3b,6- dihydroxy隱3a,5,5 -trimethyl-3-methylene-2//" cyclopenta[a]pentalen-2-one, 又名Hirsutanols A， 以下簡稱為化合 物A〉是新的內(nèi)生真菌C/wm/myferei/m sp. nov.的一個主要代謝產(chǎn)物。Hirsutanols A的抗腫瘤活性未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海洋真菌代謝產(chǎn)物Hirsutanols A在制備抗腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的化合物Hirsutanol A的中文名為(3aS,3bi ,65> 3,3a,3b,4,5, 6-六氫-3b,6-二羥基-3a,5,5-三甲基-3-亞甲基-2/Z-環(huán)戊二烯并[a]戊搭稀-2-酮；英文名 為(3a5,3W ,6S)- 3,3a,3b， 4,5,6- hex勿dro -3b，6- dihydroxy陽3a，5,5 -trimethyl-3-methylene-2//-cyclopenta[a]pentalen-2-one， 又名Hirsutanols A， 以下簡稱為化合 物A，是新的內(nèi)生真菌C/wm/raWeret/m sp. nov.的一個主要代謝產(chǎn)物。 化合物A的結(jié)構(gòu)式為
A
本發(fā)明的化合物A可以從真菌，例如南海海洋軟珊瑚5^co/^W卵tor^Mwm 的內(nèi)生真菌C/wm/raWweMW sp. nov.的培養(yǎng)液中提取分離而得到。
本發(fā)明化合物A由真菌C/w"c/ra^e^"w sp. nov.發(fā)酵制備方法包括以下步驟
a. 海洋真菌C^om/msferewm sp. nov.的禾中子培養(yǎng)
選用PDA (potato dextrose agar)培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g， 葡萄糖20g，瓊脂20g，海水1L;制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，25-28 。C培養(yǎng)5-7天;
b. 海洋真菌C720"t/m^erew附sp. nov.的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比按重量比為葡萄糖5-35，酵母提取物0.5-1.5，蛋白 胨I-IO，粗海鹽30-50，水1000;將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室 溫25-30。C靜置20-40天；
C.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，濾除菌體，收集發(fā)酵液；
d. 發(fā)酵液用乙酸乙酯提取，合并提取液，濃縮得到總提取物；
e. 用乙酸乙酯溶解提取物，溶解物在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙
5酸乙酯-甲醇梯度淋洗；
f.收集石油醚-乙酸乙酯(1: 3)得到的洗脫組分，用乙酸乙酯重結(jié)晶3次， 純化得到白色無晶形固體，即為所需的化合物A。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)化合物A對
多種腫瘤細(xì)胞系顯示出強(qiáng)效的細(xì)胞毒性，如對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和SUNE1 ， 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、 MDA-MB-435和MDA-MB-453，人肝癌細(xì)胞HEP3B的 ICso值分別為4.06、 3.44、 10.14、 9.86、 4.30和2.61pg/mL。表明化合物A可 用于制備抗腫瘤藥物，可與其他藥物制成抗腫瘤藥物組合物，可與藥學(xué)可以接受 的輔料制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑和乳劑等劑型；其給藥 途徑可為經(jīng)口服、靜脈、肌肉或皮膚給藥。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例l:化合物A的制備
a. 海洋真菌C7w"t/msfe"i/m sp. nov.的禾中子培養(yǎng)
菌種以PDA為培養(yǎng)基，組成為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水 1L。制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，25-28'C培養(yǎng)7天后于4X:保存。
b. 海洋真菌C7w"c^asterew附sp. nov.的發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g，酵母提取物lg，蛋白胨2g，粗海鹽30g， 水1L;將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-28'C靜置培養(yǎng)30天；
c. 將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，濾除菌體，收集培養(yǎng)液；
d. 培養(yǎng)液用體積比為l: l的乙酸乙酯萃取3次，合并提取液，40。C水浴旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到總提取物；
e. 用乙酸乙酯溶解提取物，溶解物在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙 酸乙酯-甲醇梯度淋洗；
f. 收集由石油醚-乙酸乙酯(1: 3)洗脫得到的組分，蒸除溶劑后，再加乙
酸乙酯進(jìn)行重結(jié)晶，純化得到白色無晶形固體化合物A。
化合物A的試驗數(shù)據(jù)
元素分析 ％，(:15111803): C73.18， H7.39， 0 19.43， N0.000;計算值C73.15， H 7.37， O 19.49。 IR Wcra^ (KBr): 3401， 2966, 1678， 1642， 1590， 1455， 1366, 1284, 1155， 1131， 1031, 879。 HREI-MS:附/z 246.1336 [M]+。晶體數(shù)據(jù)從乙酸 乙酯中結(jié)晶。正交晶系，空間群P2(l)2(l)2(l)， a=8.2584(2)， 6=8.9021(2), c= 19.3724(4) A, V 1424.20(6) A3, Z 6。晶體大小0.40x0.20x0.20 mm?；衔顰的 NMR實驗數(shù)據(jù)如表1所示。
化合物A的結(jié)構(gòu)與碳的位置編號
表1 化合物A的NMR數(shù)據(jù)(500MHz, 13C, 125MHz; DMSO-d6, TMS )
位13CDEPT!H(ppm)畫BC
號(PPm)
182.5C6.38,5.74, 4.73,2.17， 1.63,1.12
261.1C6.38， 1.125.95，5.74, 5.14, 4.73,2.17， 1.63,
3148.9C5.95,5.74,5.14, 1.12
4195.3C5.95,5.74,5.14
5119.3CH5.95,s5.14
6188.6C6.38，5.95,4.54, 1.12
7115.9CH6.38， d, 2.0Hz5.95，4.54
8174.0C6.38,5.95，5.31, 4.73， 4.54，2.17, 1.12
975.7CH4.54, dd, 6.0, 2.0 Hz6.38,5.31,2.17,1.63, 1.21,0.84
1042.1C5.31,4.54,2.17， 1.63,0.84,1.21
1144.5CH21.63， d, 15.0Hz; 2.17, d, 15.0Hz4.73
1227.1CH31.12, s5.74,5.14
13112.6CH25.14， d, 1.0Hz; 5.74, d, 1.0Hz1.21，1.12,0.84
1429.5CH31.21， s4.54,2.17，1.63,0.84
1523.9CH30.84,s4.54,2.17,1.63, 1.21
161-OH4.73,s
179-OH5.31, d, 6.0Hz
7實施例2:化合物A的抗腫瘤活性試驗
a. 細(xì)胞株鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、 SUNE1;乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、 MDA-MB-453、 MDA-MB-435;肝癌細(xì)胞株HEP3B。
b. 取對數(shù)生長的上述腫瘤細(xì)胞株加入96孔板中，每孔200 含有3000-8000個細(xì)胞。
c. 再加入藥物，設(shè)7個藥物濃度梯度，分別為0、 0.39、 0.78、 1.56、 3.12、 6.25、 12.5、 25pg/mL，另設(shè)DMSO溶劑對照組。
d. 每組設(shè)4個平行孔，置37t:培養(yǎng)72小時。實驗終止前4小時加入10pL 5mg/mLMTT液，再培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)液，力口入O.lmLDMSO。
e. 待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測儀上雙波長(570nm， 655nm)檢測每孔的OD 值。按下列公式求出生長抑制率，再按BLISS法計算機(jī)程序求出半數(shù)抑制率(IC50 值〕，實驗結(jié)果見表2。
細(xì)胞生長抑制率^ (1 一用藥組平均OD值/對照組孔OD值)X 100%
_表2化合物A的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果_
藥物濃度 人腫瘤細(xì)胞系與抑制率 (嗎/mL) CNE2 SUNE1 MCF-7 MDA-MB-435 MDA-MB-453 HEP3B
0.397.83.1613.72.67.1017.1
0.7810.6616.2812.18.911.0133.3
1.5622.3222.3114.610.332.9529.4
3.1242.8038.9421.213.942.3446.2
6.2561.3567.9524.250.846.9963.6
12.574.6080.3056.959.065.8787.1
2592.0094.5080.569.893.3391.2
半數(shù)抑制率4.063.4410.149.864.302.61
IC50 Og/mL)
權(quán)利要求
1、Hirsutanols A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物的劑型為注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑或乳劑。
3、 含有權(quán)利要求1所述Hirsutanols A的抗腫瘤藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了Hirsutanols A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)化合物Hirsutanols A對多種腫瘤細(xì)胞系顯示出強(qiáng)效的細(xì)胞毒性，如對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和SUNE1，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-453，人肝癌細(xì)胞HEP3B的IC₅₀值分別為4.06、3.44、10.14、9.86、4.30和2.61μg/mL。表明Hirsutanols A可用于制備抗腫瘤藥物，可與其他藥物制成抗腫瘤藥物組合物，可與藥學(xué)可以接受的輔料制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑和乳劑等劑型；其給藥途徑可為經(jīng)口服、靜脈、肌肉或皮膚給藥。
文檔編號A61K31/122GK101491511SQ20091003754
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日
發(fā)明者朱孝峰, 李厚金, 芬 楊, 藍(lán)文健, 蓉 鄧 申請人:中山大學(xué)