專利名稱：一種可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜及其制備方 法，屬于生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
硬腦膜缺損在神經外科臨床工作中常見，開放性顱腦損傷(工業(yè)、交通、 戰(zhàn)爭等)、腫瘤的侵蝕、先天性腦膜缺損及其它顱腦疾患原因均可引發(fā)硬腦膜 缺損。硬腦膜缺損需及時修補以防腦脊液外溢，防止腦的膨出和大氣壓的壓迫， 否則將危及人體生命。硬腦膜缺損還能引發(fā)顱內感染、腦粘連、皮下積液等并 發(fā)癥，經常會引起如癲痛、頭痛、腦功能障礙等疾病。
目前硬腦膜的代用品雖有很多，修復硬腦膜的材料可分為自體筋膜、同 種異體材料、天然及人工合成材料、異種材料4類。目前市場上產品各有其優(yōu) 缺點。
但這些材料在應用于臨床時，都不可避免有臨床感染率較高等缺陷。此外， 在因腦腫瘤侵蝕破壞腦膜而引起的腦膜修復手術中，盡管腦膜得到了修復，但 腦腫瘤復發(fā)率仍是居高不下。
感染可以用抗感染藥物的預防應用控制，腫瘤的復發(fā)則可以用化療藥物治 療，但這兩者在應用于腦部時都面臨一個問題，這就是血脈屏障的存在。
所謂血腦屏障，是由毛細血管形成的血漿與腦細胞外液間的屏障以及由脈 絡膜形成的血漿與腦脊液間的屏障。此屏障對許多大分子或極性較高的藥物是 不可通透的，難進入中樞神經系統(tǒng)。這種腦毛細血管阻止某些物質(多半是有 害的)進入腦循環(huán)血的結構，對血液中溶質進行選擇性的通透，稱為血腦屏障， 它可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質的損害，從而保持腦組織內環(huán) 境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學意義。但 在臨床上進行腦部疾病治療時，也妨礙了許多藥物到達腦部，或不能達到有效 的藥物濃度，影響病程。
因此，針對腦部用藥發(fā)展出多種給藥方式。常見的注射給藥方式有鞘內給藥、靜脈給藥等。靜脈給藥由于血腦屏障的存在而難以達到預期效果；鞘內 給藥是將藥物溶液直接注入蛛網(wǎng)膜下腔，從而使藥物在腦脊液中很快達到有效 和血藥濃度，避免了血腦屏障對藥物擴散至腦脊液中的影響。但很可能引起出 血、脊神經根損傷、感染等不良反應；進行相關研究較多的是鞘內用藥和腦室 內給藥，而腦室內給藥由于其對腦組織的侵襲性操作，存在潛在的神經功能損 害的可能性，故在臨床上很少應用?？诜幬锿ǔ２荒芡高^血腦屏障，難以達 到有效的濃度。
腦膜移植的感染率倍受關注，這是因為在顱腦敏感區(qū)，若有感染等并發(fā)癥 出現(xiàn)，這些并發(fā)癥可對中樞神經系統(tǒng)造成嚴重損害，因此通常都會采用預防用 藥。由于腦膜移植手術復雜，目前腦膜移植手術，通常需要進行開顱手術，盡 管由于技術進步和積極預防，并采取了術前、術中、術后靜脈預防性應用抗生 素及不斷提高手術過程中的無菌條件等措施，但顱術后顱內感染目前在臨床上 仍不少見，據(jù)我國一般統(tǒng)計，開顱手術的感染率為4%。且顱內感染一旦發(fā)生 較難控制，若處理不當可直接導致患者死亡，且病死率較高，占顱內感染的
20% 40%。因此，這一直是困擾神經外科醫(yī)生的一個難題。已有的人工硬腦
膜在臨床感染率等方面的表現(xiàn)不盡如人意。據(jù)文獻報道以豬小腸黏膜為原料
制備的硬腦膜，其感染率在3.4%，而用膠原制備的腦膜，感染率在3.8%，也 另有文獻報道在1.8%。因此，抗生素的預防性應用不可避免。而上述抗感染 藥物，如抗生素等，正是對腦部組織用藥，因血腦屏障的存在，靜脈給藥藥物 難以在腦脊液中達到有效濃度，而鞘內給藥則有引起出血、脊神經根損傷、感 染等不良反應的危險，這對于剛進行過腦膜移植手術的患者而言，無異于雪上 加霜。
此外，因腦腫瘤侵蝕破壞而進行腦膜移植修復手術是常見的腦膜修復原因 之一。腦腫瘤表現(xiàn)各異，但總體而言，其復發(fā)率較高，尤其是惡性腦腫瘤。手 術切除是腦腫瘤治療的主要方式，而手術切除不全、腫瘤本身的侵襲性及腫瘤 內多生發(fā)中心等因素則是復發(fā)的主要原因。手術能否徹底切除病變是復發(fā)的關 鍵因素。腦腫瘤有一半以上不能徹底切除，因而手術之后通常還需要進行化療 及放射治療。但不同腦瘤對放射能的敏感度不同，有一定的適用范圍。化學藥 物治療則因為許多化學藥物毒性較大，尤其是由于血腦屏障的存在，化療藥物 不能通透血腦屏障，不能達到有效的濃度，因而影響治療效果。而鞘內給藥則有引起出血、脊神經根損傷、感染等不良反應的危險，這對于剛進行過腦膜移 植手術的患者而言，無異于雪上加霜。
己有的人工硬腦膜在臨床感染率等方面的表現(xiàn)不盡如人意， 一般也不具有 抑制腦腫瘤復發(fā)的功能。據(jù)臨床報道，人工腦膜的臨床感染率在3%以上。針 對以上問題， 一個易于想到的解決方法就是在靜電紡絲的過程中放藥物。
目前的人工腦膜一般不含有治療性藥物。這主要是由于以下兩個因素首 先根據(jù)人工腦膜來源的影響，自體筋膜根本不可能添加藥物，同種或異體材料 亦不大可能，只有天然或人工合成材料才會進行此種加工。第二，受到藥物添 加方式方法的限制。并非所有加工方式都可以順利的固定于人工腦膜其材料 上，進而在腦膜移植后于體內釋放，達到治療的目的。目前這此天然或人工材 料制備人工腦膜的方法及加工步驟有噴涂，溶紡、高熱處理、化學交聯(lián)，等。 但這些方法都不可能將藥物固定于其上。其抗感染藥物的添加方法一般是用抗 感染藥物浸泡，即在制備過程中將產品在抗生素溶液中浸泡，也是一種抗感染 藥物的添加方法。但這種方法添加的藥物絕大部分停留在人工腦膜基礎材料的 表面，易于流失，也不能達到有效可控釋放的目的。至于化療藥物，由于其毒 副作用比較大，藥物劑量和時相控制嚴格，更不可能用上述方法添加。
但靜電紡絲卻可以有效的混合治療藥物，并可控釋放。靜電紡絲的最大優(yōu) 勢之一就是混紡，即將不同的材料混在一起制備成靜電紡絲原液。靜電紡絲原 液中不僅可以混合各種靜電紡納米纖維的支架材料——各種高分子聚合物，同 時還可以混有上述各種藥物。這樣通過混紡就可以將上述各種藥物添加到人工 腦膜內，改善了人工腦膜的性能，取得更好的臨床效果；而可降解的高分子聚 合物通過靜電紡絲得到超細纖維同時也可作為藥物緩釋載體，調節(jié)其降解速 度，可對上述藥物的釋放速度進行調整。由于藥物作用，可降低人工腦膜移植 的臨床感染率，也對降低腦腫瘤的再發(fā)生率有重要意義。
應用靜電混紡技術，不僅可以添加治療性藥物，也可以添加細胞因子，諸 如堿性成纖維細胞因子等，可加速硬膜化過程，促進腦膜完全修復。
總之，目前沒有一種人工腦膜，可以在有效的混合藥物的同時達到一般人 工腦膜要求的綜合品質要求。這些綜合品質要求包括可完全吸收、力學機械 性能好、生物組織相容性佳、防止腦粘連等。
發(fā)明內容
本發(fā)明的所要解決的技術問題是克服已有技術的不足，目的在于提供一種 不僅具有人工腦膜要求的一般綜合品質要求，同時還能有效混合藥物，可作為 藥物釋控體系、由于藥物作用在臨床上有降低腦膜移植手術感染發(fā)生率、腦腫 瘤復發(fā)率的納米仿生人工硬腦膜。
本發(fā)明的另一目的是提供上述納米仿生人工硬腦膜的制備方法。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的-
一種可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜，包含至少兩層結構，面 向大腦的一層為疏水性的防粘連電紡層，背向大腦的一層為親水性的納米細胞 支架層；兩層之間還可以有過渡層；所述人工硬腦膜的任何一層中還混紡有細 胞因子或藥物；任意兩個相鄰層之間的連接方式優(yōu)選通過電紡連接。
所述親水性的納米細胞支架層由靜電紡制成，即背向大腦面的電紡層為細 胞支架層，是為了有效誘導干細胞及成纖維細胞的遷入，該層則采用采用生物 相容性好的親水性材料，再者，通過靜電紡絲參數(shù)調整，設計上將平均孔徑達 到20 100)aM。這樣有利于成纖維細胞的遷入、粘附、增殖和生長分化。
所述防粘連層是采用疏水性材料，不利于細胞的遷入，從而達到防粘連的 目的；制備該層材料的靜電紡絲參數(shù)進行調整，其孔隙孔徑在納米以下，比細 胞小一到二個數(shù)量級，從而阻止細胞進入，防止腦粘連產生。因為人體細胞直 徑平均在10 20一， 一般成纖維細胞直徑在20 30pM之間。腦膜主要分布成 纖維細胞及其分泌的膠原纖維。平均孔徑在3pM以下，已經可以有效的防止 腦粘連的產生。靜電紡纖維得到的孔隙大小分布很大程度上依賴于纖維直徑， 已知纖維直徑減小時，孔徑也在同時減小。據(jù)已發(fā)表的文獻，纖維直徑在 4 10pM時，孔徑從20~45一。文獻報道，靜電紡再生絲素纖維非織造織物的 平均孔徑可達到2piM。
所述細胞因子是對成纖維細胞的粘附、遷移、增殖、分化起作用的因子， 如堿性成纖維細胞生長因子。由于人工腦膜的主要作用是在硬膜再生之前起到 密封腦、防止腦脊液漏、保護腦的作用，納米仿生支架已經為成纖維細胞的粘 附、遷移、增殖、分化提供了良好的支架，同時由于細胞因子的作用，加以加 速硬膜化的過程。本發(fā)明選用對硬膜化過程有促進作用的因子，如堿性成纖維 細胞因子。
所述藥物可以依據(jù)具體情況選擇抗生素或止血或防粘連藥物，在因腦腫瘤侵蝕而引起腦膜移植中，可采用針對腦腫瘤的化療藥物。
所述的抗生素選自頭孢類、芐氨西林，螺旋霉素，磺胺，喹諾酮類抗生素 等。首選為頭孢曲松鈉。因腦膜手術通常需要開顱，目前絕大多數(shù)的開顱術后 顱內感染是細菌性的，主要致病菌包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、 大腸桿菌、沙門菌屬及綠膿桿菌等。其中金黃色葡萄球菌最常見，有報道為 70.6%。根據(jù)臨床報道，多認為頭孢曲松鈉的臨床治療效果比較好。
所述抗腫瘤藥物，可以選自多種抗腫瘤藥物，如尼莫司汀、司莫司丁、脂 質體阿霉素、放線菌素D、長春新堿等。首選為長春新堿。
所述止血或防粘連藥物，可加速創(chuàng)傷愈合，防止粘連產生。如止血因子 (可使材料同時具備止血功能)、膠原合成酶的抑制劑(如曲尼斯特和毗嗜司 特，可以抑制膠原合成酶組胺和前列腺素的釋放，抑制膠原再生)、抗凝血藥 (如雙香豆素、肝素鈉、水蛭素等)、消炎藥(如異丙嗪、地塞米松、氫化可 的松、潑尼松龍、布洛芬、羥基保泰松等)、鈣通道阻滯劑(如鹽酸地爾硫卓、 硝苯地平、鹽酸維拉帕米等)、細胞生長抑制劑(如氟尿嘧啶)、水解酶(如玻 璃酸酶、鏈激酶、尿激酶、胃蛋白酶、tPA)、氧化還原劑(如亞甲藍)等等。
上述納米仿生人工硬腦膜的制備方法包括以下步驟
(1) 制備含有細胞因子或藥物的疏水性聚合物的電紡溶液；制備含有細 胞因子或藥物的親水性聚合物的電紡溶液；
(2) 用制得的疏水性聚合物的電紡溶液通過靜電紡制成疏水性的防粘連 電紡層；
(3) 用制得的親水性聚合物的電紡溶液在所述防粘連電紡層上通過靜電 紡制備疏水性的細胞支架層，接收為膜狀結構得到納米仿生人工硬腦膜。
上述步驟(1)中所述制備含有細胞因子或藥物的親水性聚合物的電紡溶 液也可以在步驟(2)和步驟(3)之間進行；
所述(2)、 (3)可重復若干次以得到合適的厚度。
所述防粘連層的靜電紡的工藝參數(shù)為微量注射泵的速率為0.1~5.0毫升 /小時，高壓發(fā)生器的電壓為5 40KV,接收距離為5.0 30.0厘米。細胞支架 層的靜電紡的工藝參數(shù)為0.5-20.0毫升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為 10 45KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為5.0 30.0厘米。 ■制得的人工硬腦膜經清洗、滅菌、包裝后貯存。所述疏水性的電紡溶液可選擇疏水性的L-聚乳酸和S-己內酯，兩者重量比
為50: 50或30:70或70:30，作為共聚高分子材料，數(shù)均分子量是 150000-500000，溶于六氟異丙醇或二氯甲烷；可甩8 14%的聚己內酯的氯仿/ 甲醇混合溶液；或者其他合適的聚合物及溶劑。
上述電紡溶液中可以加入0.01~3%抗生素溶液，或/和0.001 3%止血和防 粘連藥物，與L-聚乳酸和s-己內酯溶液混合，得到均一溶液。
將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.1-10 毫升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為10 45 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離 為10 40厘米，并將纖維接收為膜狀結構。
此處通過靜電紡制備得到纖維直徑平均孔徑在3pM或以下，纖維直徑在 50-1000nM之間。
所述親水性的電紡溶液選擇的親水性材料作制備細胞支架層，可以選用親 水性聚氨酯或者天然明膠、纖維素、殼聚糖、硫酸軟骨素等親水性材料；優(yōu)選 的方案親水性聚氨酯，與/或天然明膠，硫酸軟骨素、聚乙二醇，重量比20~80: 80~20，紡絲液為溶液總重量的3~15%;或者用親水性聚氨酯與天然明膠，或 硫酸軟骨素，重量比20 80: 80~20，紡絲液為溶液總重量的3~15%;也可選 用其他合適聚合物及溶劑。
上述親水性聚合物電紡溶液中還可加入堿性成纖維細胞因子溶液，與上述 電紡液混合均勻，使細胞因子終濃度達為0.001 0.5%，接收距離從15 25cm， 電壓15 45KV，親水性的納米細胞支架層孔徑為20 200^iM。納米細胞支架層 纖維直徑介于5-200pM，在已紡好的防粘連層上繼續(xù)紡細胞支架層。
所述電紡溶液是一種或兩種以上聚合物混合的電紡溶液，親水性聚合物材 料選自硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸、改性纖維素、海藻酸、淀 粉、纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、膠原蛋白、 殼聚糖、改性殼聚糖、親水性聚氨酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲 基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚乙烯醇或聚丙交酯； 疏水性聚合物材料選自疏水性聚氨酯、聚碳酸酯、聚乳酸、聚已內酯、聚乙交 酯或聚對苯二甲酸乙二酯。由于目前高分子材料改性研究在不斷發(fā)展，原本親 水性材料改性為疏水或疏水材料改性為親水都越來越常見，范圍也越來越廣。
將上述材料溶于一定的溶劑，形成電紡液，就可以通過靜電紡絲技術制得納米仿生支架。
所述電紡溶液的溶劑可以為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二 甲基乙酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲垸、三 氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙垸、三氟乙酸、水或它們的任意 混合物。上文所述的高分子材料和溶劑用于靜電紡絲，這類報道在已有的文獻 中有相當多的數(shù)量。
所述電紡溶液加入了細胞因子、抗生素或止血/防粘連藥物。
所述細胞因子是對成纖維細胞的粘附、遷移、增殖、分化起作用的因子， 如堿性成纖維細胞生長因子。由于人工腦膜的主要作用是在硬膜再生之前起到 密封腦、防止腦脊液漏、保護腦的作用，納米仿生支架己經為成纖維細胞的粘 附、遷移、增殖、分化提供了良好的支架，同時由于細胞因子的作用，加以加 速硬膜化的過程。堿性成纖維細胞因子是目前公認的可以誘導成纖維細胞生長 增殖并加速硬膜化過程的細胞因子，其它如白細胞介素，集落剌激因子，TNF、 血小板源生長因子等細胞因子也有文獻報導，有加速腦硬膜化過程的作用。所 述止血或防粘連藥物、抗感染藥物或抗腫瘤藥物，選自止血因子、曲尼斯特、 放線菌素D、尼莫司汀、長春新堿、氨芐西林等。止血藥物可以起到迅速止血， 加快愈合，而防粘連藥物則可進一步減少腦粘連的產生。因為硬腦膜的修復在 很多情況下是因為腦腫瘤而導致的，而腦腫瘤的復發(fā)將導致硬腦膜的再次損 傷。在靜電紡電紡溶液中加入抗腫瘤藥物如放線菌素D、尼莫司汀等都可以降 低腦腫瘤的復發(fā)率。在因腦腫瘤而導致的硬腦膜修復手術中，加入這類藥物可 大大降低腦腫瘤的復發(fā)率。抗感染藥物可選自抗生素，如氨芐西林，螺旋霉素， 磺胺，喹諾酮類抗生素等可防止細菌感染，在臨床上可降低腦膜移植的感染率。
所述電紡溶液中添加藥物或因子的優(yōu)選方案是含有電紡溶液重量的
0.001~0.05%的堿性成纖維細胞成長因子，電紡溶液重量的3%的節(jié)氨西林，電 紡溶液重量的0.001~0.05%的止血因子，在用于因腦腫瘤而導致的腦膜修復手 術中，可以包含有0.01-5%的尼莫司汀。
制得的產品經清洗、滅菌，包裝后貯存。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)本發(fā)明不但具有用靜電紡絲技術制備的人工硬腦膜的一般優(yōu)點，，還 有單純用靜電紡絲所不具有的其它有益效果。用靜電紡絲技術制備的人工硬腦膜的具有多種一般優(yōu)點，這些優(yōu)點包括a機械特性能滿足適應癥對抗拉伸強 度及柔韌性的要求。b雙層設計，內側面(即面向大腦的一面)光滑，能防粘 連，能起著很好地隔離頭皮軟組織與腦組織的作用，外側面(即背向大腦的一 面)和側邊則為多孔結構，允許細胞長入；可促使腦膜早日修復。利于日后進 行顱骨修復手術;c能夠在新生組織生成后被完全吸收的，避免了膜片致癌；d 不含活細胞成分，不使用外源細胞和蛋白，免除了因此而帶來免疫排斥、病毒 傳播、疾病傳染的諸多風險；能杜絕疾病傳播；e材料來源充分，成本較低， 貯存運輸簡單；f制備方法工藝步驟簡化，生產時間短，能有效避免加工過程 中產品受到污染，產品質量易于控制，產品標準容易實現(xiàn)，產品可實現(xiàn)低成本、 高效率的產業(yè)化生產；臨床應用簡單。
(2) 本發(fā)明還利用將堿性成纖維細胞生長因子、血小板源生長因子等細 胞因子按設計要求混紡于電紡液中，細胞因子與納米支架結合，納米支架同時 作為細胞因子緩釋控制體系，細胞因子可控釋放，形成有利于成纖維細胞遷移、 聚集、分化的微環(huán)境，吸引成纖維細胞進入硬腦膜缺損部位，并聚集、分化， 加速了硬膜化過程；與沒有加入細胞因子的人工腦膜相比，其過程大為縮短。
(3) 本發(fā)明也可以用混紡技術添加治療藥物。用混紡技術加入了藥物的 人工腦膜，比單純利用靜電紡絲技術的人工腦膜，可有效防止感染、防粘連、 防腦腫瘤復發(fā)。此種效應與沒有加入藥物的人工腦膜相比，其感染率大為降低， 腦粘連發(fā)生率和腦腫瘤復發(fā)率大為降低。這種明顯的區(qū)別是應用混紡技術比單 純應用靜電紡技術的優(yōu)勢所在。


圖1為電紡混紡藥物及生長因子的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞支 架層，2為堿性成纖維細胞因子，3為止血和防粘連藥物，4為抗生素，5為防 粘連層。
圖2為電紡混紡藥物的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞支架層，3 為止血和防粘連藥物，4為抗生素，5為防粘連層。
圖3為電紡混紡生長因子的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞支架層， 2為堿性成纖維細胞因子，5為防粘連層。
圖4為電紡混紡化療藥物的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞支架層， 5為防粘連層，6為化療藥物。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。所涉及到的濃度如 未特別注明均為重量百分比濃度。 實施例l
(1) 制備防粘連層選擇疏水性的聚已內酯，氯仿/甲醇混合溶劑比例為 1: l，混合頭孢曲松鈉，濃度為1%?；旌现寡幬锂惐?，至終濃度為10mg/ml。
得到均一溶液。
將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.8毫 升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為12 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為15 厘米，并將纖維接收為膜狀結構。得到纖維直徑為600納米。
關閉靜電裝置。
(2) 制備細胞支架層用親水性絲素與天然明膠，比例20 80: 80~20， 紡絲液質量分數(shù)為9%。
配制堿性成纖維細胞因子溶液，與上述電紡液混合均勻，使細胞因子終濃 度達為0.001%，接收距離10cm，電壓20KV，開啟靜電紡絲，在已紡好的防 粘連層上繼續(xù)紡細胞支架層，纖維平均直徑在微米級。制得的人工硬腦膜的結 構如圖1所示，圖1為電紡混紡藥物及生長因子的人工腦膜結構示意圖，其中 l為細胞支架層，2為堿性成纖維細胞因子，3為止血和防粘連藥物，4為抗生 素，5為防粘連層。
將制得的人工腦膜從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經凍干后真空包 裝，經25kGy鈷-60滅菌后負20攝氏度低溫保存。 實施例2
(1) 制備防粘連層選擇疏水性的聚已內酯，氯仿/甲醇混合溶劑比例為
1: l，混合頭孢曲松鈉，濃度為1%。混合止血藥物異丙嗉，至終濃度為10mg/ml。 將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.8毫 升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為12 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為15 厘米，并將纖維接收為膜狀結構。得到纖維直徑為600納米。 關閉靜電裝置。
(2) 制備過渡層本實施例選用以下方案聚氨酯與透明質酸的質量比
為70:30,紡絲液質量分數(shù)為10%。混合氨芐西林，濃度為3°/。。得到均一溶液。開啟靜電紡絲，在已紡好的防粘連層上繼續(xù)紡過渡層。
接收距離從llcm，電壓20KV，纖維平均直徑在5jim。 關閉靜電紡。
(3)制備細胞支架層用親水性絲素與天然明膠，比例20 80: 80 20， 紡絲液質量分數(shù)為9%。
配制長春新堿溶液，與上述電紡液混合均勻，使其終濃度為100ng/ml。得 到均一溶液。接收距離10cm，電壓20KV,開啟靜電紡絲，在已紡好的過渡 層上繼續(xù)紡細胞支架層，纖維平均直徑在微米級。制得的人工硬腦膜結構如圖 2所示，圖2為電紡混紡藥物的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞支架層，3 為止血和防粘連藥物，4為抗生素，5為防粘連層。
清洗、保存方式同實施例l。此人工腦膜應用于因腦腫瘤侵蝕而進行的腦 膜修復手術中。 實施例3
(1) 制備防粘連層選擇疏水性的聚已內酯，氯仿/甲醇混合溶劑比例為 1: 1，混合頭孢曲松鈉和，濃度為1%?；旌现寡幬锂惐?，至終濃度為 10mg/ml。 得到均一溶液。
將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.8毫 升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為12 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為15 厘米，并將纖維接收為膜狀結構。得到纖維直徑為600納米。
關閉靜電裝置。
(2) 制備細胞支架層用親水性絲素與天然明膠，比例20 80: 80~20， 紡絲液質量分數(shù)為9%。
將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，接收距離10cm，電壓20KV, 開啟靜電紡絲，在已紡好的防粘連層上繼續(xù)紡細胞支架層，纖維平均直徑在微 米級。制得的人工硬腦膜結構如圖2所示。
將制得的人工腦膜從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經凍干后真空包 裝，經25kGy鈷-60滅菌后負20攝氏度低溫保存。 實施例4
(1)制備防粘連層選擇疏水性的聚已內酯，氯仿/甲醇混合溶劑比例為
h 1。將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.8毫
升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為12 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為15 厘米，并將纖維接收為膜狀結構。得到纖維直徑為600納米。 關閉靜電裝置。
(2)制備細胞支架層用親水性絲素與天然明膠，比例20 80: 80 20， 紡絲液質量分數(shù)為9%。
配制堿性成纖維細胞因子溶液，與上述電紡液混合均勻，使細胞因子終濃 度達為0.001%，接收距離10cm，電壓20KV，開啟靜電紡絲，在已紡好的防 粘連層上繼續(xù)紡細胞支架層，纖維平均直徑在微米級。制得的人工硬腦膜結構 如圖3所示，圖3為電紡混紡生長因子的人工腦膜結構示意圖，其中1為細胞 支架層，2為堿性成纖維細胞因子，5為防粘連層。
將制得的人工腦膜從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經凍干后真空包 裝，經25kGy鈷-60滅菌后負20攝氏度低溫保存。 實施例5
(1) 制備防粘連層選擇疏水性的聚已內酯，氯仿/甲醇混合溶劑比例為
h 1。
將上述溶液加入靜電紡裝置的注射器中，調節(jié)微量注射泵的速率為0.8毫 升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為12 KV，調節(jié)接收裝置的接收距離為15 厘米，并將纖維接收為膜狀結構。得到纖維直徑為600納米。
關閉靜電裝置。 '
(2) 制備細胞支架層用親水性絲素與天然明膠，比例20 80: 80 20， 紡絲液質量分數(shù)為9%。
配制長春新堿溶液，與上述電紡液混合均勻，使其終濃度為100ng/ml。得 到均一溶液。接收距離10cm，電壓20KV，開啟靜電紡絲，在已紡好的過渡 層上繼續(xù)紡細胞支架層，纖維平均直徑在微米級。制得的人工硬腦膜結構如圖 4所示，圖4為電紡混紡化療藥物的人工腦膜結構示意圖，其中l(wèi)為細胞支架 層，5為防粘連層,6為化療藥物。
將制得的人工腦膜從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經凍干后真空包 裝，經25kGy鈷-60滅菌后負20攝氏度低溫保存。 實施例6用實施例1制備的硬腦膜進行犬動物實驗
實驗犬體重15 20KG,年齡1.5 2歲，雌雄不拘，共5只。以氯胺酮肌 肉注射全麻，麻醉剃毛后，將動物置于專用手術臺上，腹臥位。用2%碘酒和 75%酒精消毒。動物頭頂正中，縱向切開。用剝離器分離骨膜，暴露雙頂部顱 骨板，用高速磨鉆磨開顱骨，雙頂部形成骨窗。用小剪刀剪掉雙側頂部3 cmx3cm大小的矩形硬腦膜，制造出頂部的硬腦膜缺損。在暴露的腦表面電灼， 造成6個1 mmxl mm大小的損傷點。將用本發(fā)明實施例1所制備的人工腦膜 修剪成相應形狀及尺寸的修補材料，防粘連層向腦表面，用4/0無損傷絲線 間斷縫合，針距4mm，修補于犬頂部的缺損。用圓針4號絲線縫合肌肉。術 后對動物進行常規(guī)的喂養(yǎng)及觀察。術后動物恢復良好，切口愈合良好，無腦脊 液漏，無癲癇發(fā)生。術后進食進水正常，動物的戶外活動正常，沒有發(fā)現(xiàn)運動 障礙，存活至預定期限。
術后15個月，動物以手術部位為中心，在大于手術部位lcm范圍切取標 本，使其包括人工腦膜及周邊硬腦膜及內面的腦組織。切取出標本后，可見人 工腦膜與硬腦膜的連接處對合平整，無分界，已完全愈合，僅見縫合的絲線。 原生硬腦膜之間未見明顯充血，出血等排異反應。 實施例7
用實施例2制得的硬腦膜進行新西蘭兔動物實驗
實驗的動物施行頂部開顱，人為制造部分硬腦膜缺損及腦組織損傷，然后 以人工腦膜分別實施硬腦膜修補術。術后對動物進行常規(guī)的喂養(yǎng)及觀察。術后
動物恢復良好。術后15個月，動物以手術部位為中心，在大于手術部位lcm 范圍切取標本，使其包括人工腦膜及周邊硬腦膜及內面的腦組織。切取出標本 后，可見內側表面可見上皮細胞覆蓋，上皮下可見纖維組織增生，纖維母細胞 增生，膠原纖維增多，致使材料內帶血運的新生組織增生，宿主新生組織侵入， 材料降解，總量明顯減少，內部可見毛細血管。新老組織界面無中性粒細胞， 淋巴細胞等炎癥細胞反應，界面處無囊壁形成。蛛網(wǎng)膜及腦組織正常。 實施例8
用實施例2制得的硬腦膜進行新西蘭兔分組動物實驗。取200只新西蘭兔 分為兩組，每組各100只。如實施例4進行人工腦膜移植實驗。第一組修補所 用的人工腦膜為僅用高分子材料靜電紡絲所得，沒有混入藥物或細胞因子。第二組用本發(fā)明所制備的、混紡了抗生素藥物和細胞因子的人工腦膜。
術后觀察。第一組術后四周內，有2只動物出現(xiàn)感染，有局部紅腫和積液 現(xiàn)象。經抗菌素治療后痊愈。第二組實驗動物術后四周內無感染現(xiàn)象出現(xiàn)。 術后15個月解剖結果如下第一組實驗動物的人工硬腦膜開始膠原化，不與 腦組織粘連。內部尚無毛細血管生成。第二組實驗動物人工硬膜與腦組織接觸 面膠原化，不與腦組織粘連。內表面被上皮覆蓋。內部可見毛細血管。無炎癥 類細胞反應。厚度減小。
權利要求
1.一種可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜，其特征在于包含至少兩層結構，面向大腦的一層為疏水性的防粘連電紡層，背向大腦的一層為親水性的納米細胞支架層；所述人工硬腦膜的任一層中還混紡有細胞因子和/或藥物。
2. 如權利要求1所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述防粘連電 紡層和親水性的納米細胞支架層還有過渡層。
3. 如權利要求1或2所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述親水 性的納米細胞支架層由靜電紡制備得到，孔徑為20 200^M，纖維直徑在 5 200jiM之間，防粘連層纖維直接介于50~1000nM之間。
4. 如權利要求1或2所述的納米仿生人工碗腦膜，其特征在于所述防粘 連電紡層孔徑在3pM以下，纖維直徑在50~1000nM之間。
5. 如權利要求1或2所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述細胞 因子選自對硬膜化過程有促進作用的細胞因子。
6. 如權利要求5所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述對硬膜化 過程有促進作用的細胞因子選自白細胞介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、 血小板源生長因子或堿性成纖維細胞因子中任一種或幾種。
7. 如權利要求1或2所述的納米仿生人工硬腦膜，其特征在于所述藥物 是抗生素、止血藥物、防粘連藥物或抗腫瘤藥物的一種或藥學常規(guī)可混合使用 的幾種藥物的混合物。
8. —種權利要求1所述可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜的制 備方法，包括以下步驟(1) 制備含有細胞因子或藥物的疏水性聚合物的電紡溶液；制備含有細 胞因子或藥物的親水性聚合物的電紡溶液；(2) 用制得的疏水性聚合物的電紡溶液通過靜電紡制成疏水性的防粘連 電紡層；(3) 用制得的親水性聚合物的電紡溶液在所述防粘連電紡層上通過靜電 紡制備疏水性的細胞支架層，接收為膜狀結構得到納米仿生人工硬腦膜。
9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述含有細胞 因子或藥物的親水性聚合物的電紡溶液的制備在步驟(2)和步驟(3)之間進行。
10.如權利要求8或9所述的制備方法，其特征在于所述防粘連層的靜電 紡的工藝參數(shù)為微量注射泵的速率為0.1~5.0毫升/小時，高壓發(fā)生器的電壓為5~40 KV，接收距離為5.0 30.0厘米；細胞支架層的靜電紡的工藝參數(shù)為-0.5~20.0毫升/小時，調節(jié)高壓發(fā)生器的電壓為10~45 KV，調節(jié)接收裝置的 接收距離為5.0-30.0厘米。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可同時作為藥物緩釋體系的納米人工硬腦膜，包含至少兩層結構，面向大腦的一層為疏水性的防粘連電紡層，背向大腦的一層為親水性的納米細胞支架層；所述人工硬腦膜的任一層中還混紡有細胞因子和/或藥物。本發(fā)明還提供了所述納米仿生人工硬腦膜的制備方法。本發(fā)明用混紡技術加入了藥物和細胞因子的人工腦膜，比單純利用靜電紡絲技術的人工腦膜，可有效防止感染，更快的促進人工腦膜的再生過程。同時，本發(fā)明也為治療腦部疾病提供了一種新型藥物加載及釋放方式，載入的藥物可隨著硬腦膜的植入而直接和高效輸送進入腦顱腔并按要求進行釋放，達到良好的治療效果，應用前景十分廣闊。
文檔編號A61L27/56GK101559242SQ20091003968
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權日2009年5月22日
發(fā)明者弢 徐, 袁玉宇 申請人:廣州邁普再生醫(yī)學科技有限公司