專利名稱：一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié)軟骨及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié)軟骨及其制備方法，屬于生物醫(yī) 生技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)功能執(zhí)行的必要成分，由軟骨組織及其周圍的軟骨膜構(gòu) 成，軟骨組織則由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一 細(xì)胞，其不斷分泌產(chǎn)生新的軟骨基質(zhì)，最終形成軟骨層。軟骨細(xì)胞位于軟骨基 質(zhì)內(nèi)的軟骨陷窩中，各個細(xì)胞均分別圍以軟骨囊，生活時充滿軟骨陷窩內(nèi)，不 能遷移。透明軟骨基質(zhì)非常復(fù)雜，有多種生物高分子物質(zhì)，而且還含有多種適 當(dāng)?shù)募?xì)胞因子等。這些基質(zhì)通常是可影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增 殖和分化生物活性物質(zhì)，且有嚴(yán)格的環(huán)境條件。透明軟骨基質(zhì)的主要化學(xué)組成 主要為羽狀分支大分子的軟骨粘蛋白，其主要成分是酸性糖胺多糖
(glycosaminoglycan)。這種羽狀分支的大分子結(jié)合著大量的水，大分子之間又 相互結(jié)合構(gòu)成分子篩，并和膠原原纖維結(jié)合在一起形成固態(tài)的結(jié)構(gòu)。軟骨內(nèi)無 血管，但由于軟骨基質(zhì)內(nèi)富含水分(約占軟骨基質(zhì)的75%)，營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透， 故軟骨深層的軟骨細(xì)胞仍能獲得必需的營養(yǎng)。透明軟骨中無膠原纖維，但有許 多細(xì)小的無明顯橫紋的膠原原纖維，纖維排列不整齊。除關(guān)節(jié)面的關(guān)節(jié)軟骨外， 軟骨的表面均覆有軟骨膜。軟骨膜是較致密的結(jié)締組織，即分內(nèi)、外二層，外 層纖維多，細(xì)胞少，主要起保護(hù)作用，內(nèi)層纖維少，細(xì)胞較多，其中有些梭形 小細(xì)胞，稱骨原細(xì)胞，可增殖分化為軟骨細(xì)胞。
關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)支配，也沒有血管及淋巴組織，其營養(yǎng)成分必須從關(guān)節(jié) 液中取得，而其代謝廢物也必須排至關(guān)節(jié)液中，關(guān)節(jié)軟骨的這種營養(yǎng)代謝必須 通過關(guān)節(jié)運(yùn)動，使關(guān)節(jié)軟骨不斷的受到壓力刺激才行，所以關(guān)節(jié)運(yùn)動對于維持 關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)起重要的作用。
由于關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力低下，病損關(guān)節(jié)往往表現(xiàn)為不可扼制的逐步惡 化。關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)能力低下主要源于操作部位缺乏足夠的軟骨細(xì)胞修復(fù)，由于軟骨細(xì)胞幾乎沒有遷移能力，不能迅速聚集到創(chuàng)傷部位。關(guān)節(jié)軟骨沒有血液供 應(yīng)，且軟骨細(xì)胞又包埋于稠厚的細(xì)胞外基質(zhì)中，無法移動到操作部位參與修復(fù)， 滑液細(xì)胞數(shù)量太少，無法進(jìn)行有效修復(fù)。而其它可形成軟骨細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞， 包括軟骨膜骨原細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，肌肉來源的干細(xì)胞等，由于空間時 間及組織阻隔，無法自由移動到關(guān)節(jié)軟骨缺損部位；而且即使在某些情況下這 些干細(xì)胞能自由移動到軟骨層(比如關(guān)節(jié)軟骨伴隨軟骨下骨缺損時，形成骨髓 與軟骨層之間的通道，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以自由移動到軟骨層)，但由 于干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞并行使正常的生理功能修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨有嚴(yán)格的環(huán)境 條件，否則易發(fā)生退行性變化，極易形成力學(xué)強(qiáng)度遜色很多的纖維軟骨，以至 于達(dá)不到修復(fù)的目的。解剖結(jié)構(gòu)上與關(guān)節(jié)軟骨鄰近的是軟骨膜骨原細(xì)胞，但軟 骨膜結(jié)構(gòu)是致密結(jié)締組織，細(xì)胞不可能自由遷移到關(guān)節(jié)軟骨的損傷部位上，修 復(fù)關(guān)節(jié)軟骨層。
對于不嚴(yán)重的關(guān)節(jié)受損可以用關(guān)節(jié)鏡灌洗術(shù)和關(guān)節(jié)清理術(shù)等最基本的傳 統(tǒng)治療手段，但在軟骨受損嚴(yán)重時必須用軟骨修復(fù)。關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)至今沒有比 較理想的技術(shù)，目前軟骨修復(fù)方法主要有剌激關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)的方法、自體 軟骨移植、自體軟骨膜/骨膜移植、自體軟骨細(xì)胞移植、異體軟骨移植、人工 軟骨置換等，但這些技術(shù)都有一定缺陷。
剌激關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)包括軟骨整形、磨削關(guān)節(jié)成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔、 微骨折術(shù)等方法，缺點是這種方法修復(fù)的組織易形成纖維軟骨，脆性大，不耐 用，最終會發(fā)生退變。
自體軟骨移植是目前關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果最佳者，但其手術(shù)總優(yōu)良率僅在
70%左右，適應(yīng)癥范圍也非常狹窄；由于軟骨材料來源有限，自體軟骨移植不 適宜于大面積軟骨缺損患者，而且供體部位常發(fā)生繼發(fā)性病變；此外需要二次 手術(shù)，手術(shù)的過程相對復(fù)雜；易產(chǎn)生恢復(fù)緩慢、疼痛、骨折、流血等并發(fā)癥和 術(shù)后疤痕；在移植軟骨和原始組織之間存在裂縫等種種缺陷。
軟骨膜的來源僅限于肋骨，取材有限，應(yīng)用受到限制，且遠(yuǎn)期效果不佳。 自體骨膜移植技術(shù)取材方便，可早期修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨缺損，改善癥狀，但 存在早期退變，再生軟骨易鈣化，遠(yuǎn)期效果不穩(wěn)定等缺點，而且這些組織移植 后生成的軟骨樣組織的生物學(xué)性能、耐磨性、韌性均欠佳。
自體軟骨細(xì)胞移植是最近才開始采用的一種方法，這種方法需要進(jìn)行手術(shù)
5來獲取骨細(xì)胞并在外面培養(yǎng)以后移植到損傷的關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域，因而病人需要進(jìn) 行二次手術(shù)，并且手術(shù)過程很復(fù)雜和困難，而且軟骨細(xì)胞易纖維化，脆性大， 狀態(tài)不佳、擴(kuò)增能力喪失、壽命不長，即退行性變化。因此據(jù)臨床統(tǒng)計，自體 軟骨細(xì)胞移植的總有效率也僅到百分之七十多。
同種異體骨軟骨和異種骨軟骨移植材料獲得相對較易且可預(yù)制成任意形 狀和大小，因此比自體移植更常用。但是，因新鮮軟骨的供應(yīng)和如何防止細(xì)菌 及病毒性疾病的傳播等問題限制了異體骨軟骨移植的使用；冷凍移植則無法保 證軟骨細(xì)胞的活性。研究證實，冷凍異體軟骨的彈性系數(shù)及黏度系數(shù)有顯著性 改變，軟骨進(jìn)行性退變，軟骨表面裂隙明顯，因凍存致使移植物出現(xiàn)不可逆的 生物力學(xué)改變。異體軟骨曾廣泛應(yīng)用，由于可引起免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死 亡及功能喪失，因而未能廣泛應(yīng)用。
人工軟骨其實分為兩種 一種不含軟骨細(xì)胞，這是目前研究較多的；另一 種則不僅含軟骨細(xì)胞，且包含軟骨細(xì)胞培養(yǎng)支架體系，可稱為組織工程化人工 軟骨。組織化工程人工軟骨至今沒有商業(yè)化產(chǎn)品。
前者是目前研究較多的人工軟骨類型，這類人工軟骨植入材料主要分為兩 類，即人工合成的材料和天然生物材料，具體而言，主要有金屬-超高分子 量聚乙烯對磨關(guān)節(jié)假體、硅橡膠、聚氨酯關(guān)節(jié)軟墊材料、聚乙烯醇水凝膠等。 天然生物材料生物相容性好，通常都有利于細(xì)胞粘附、增殖、分化，但同時也 具有一些無法彌補(bǔ)的缺點，如孔隙率低，孔隙小；降解速度慢，缺乏一定的機(jī)
械強(qiáng)度，難于塑形，因而無法在關(guān)節(jié)軟骨中單獨使用。人工材料的軟骨假體雖 然在一定程度上能起到替代軟骨的作用，但還存在易磨損松動、界面潤滑性差、 缺乏生物活性等等不足，其性能有待進(jìn)一步提高。此外，在對人體軟骨進(jìn)行植 入修復(fù)時，以上材料還存在與軟骨下骨固定的問題?，F(xiàn)在臨床上一般采用嵌入 固定、螺絲固定、不銹鋼網(wǎng)固定、骨水泥粘結(jié)等方法植入缺損部位，但各自均 存在不同問題，.如連接松動、固定效果差、人工軟骨與底骨結(jié)合不牢固、手術(shù) 難度和風(fēng)險大等，影響了人工軟骨的置換和替代效果。
但以上材料最大的缺陷，是它們都沒有利用軟骨細(xì)胞，以至于達(dá)到的修復(fù) 效果有限。正如上所述，軟骨細(xì)胞則是軟骨層修復(fù)的唯一細(xì)胞來源。軟骨細(xì)胞 不斷產(chǎn)生新的軟骨基質(zhì)形成軟骨層。沒有軟骨細(xì)胞參與的修復(fù)，人工軟骨的修 復(fù)只能起到臨時替代及緩解疼痛的作用，無法達(dá)到真正意義上的生理修復(fù)。為了達(dá)到真正意義上的修復(fù)，必須利用軟骨細(xì)胞。然而體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 培養(yǎng)有很多難題沒有解決。因為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖困難，在體外通常需要長時 間的增殖才能達(dá)到所需的數(shù)量，難以滿足臨床要求；而且含活細(xì)胞成分的關(guān)節(jié) 軟骨，生產(chǎn)成本昂貴，制備方法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，加工過程中難以避免 產(chǎn)品受到污染，貯存運(yùn)輸成本高；由于活細(xì)胞多來源于異體細(xì)胞，可引起免疫 排斥反應(yīng)，非目前通用的免疫抑制劑可以控制，無法徹底消除免疫原性，即使 用高效免疫抑制劑，也很難保證不被排斥；異體細(xì)胞的引入導(dǎo)致無法完全避免 攜帶病毒、傳播疾病的風(fēng)險。并且軟骨細(xì)胞行使正常生理功能，修復(fù)軟骨層， 需要嚴(yán)格的環(huán)境條件。這些嚴(yán)格的環(huán)境條件，包括各種適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子及剌 激原的剌激作用，關(guān)節(jié)活動的刺激等，否則易于形成力學(xué)性能遜色很多的纖維 軟骨，而非在關(guān)節(jié)透明軟骨——纖維軟骨和關(guān)節(jié)軟骨兩者力學(xué)性能上有很大的 不同，纖維軟骨難以執(zhí)行關(guān)節(jié)軟骨的功能。這不僅是體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞目前尚 未解決的難題，而且在體內(nèi)進(jìn)行軟骨細(xì)胞移植修復(fù)時，同樣也會遇到的棘手問 題。
因此，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨原位再生是一個理想的做法，目卩使植入人工軟骨 的材料有良好的生物相容性，并植入缺損關(guān)節(jié)軟骨，誘導(dǎo)體內(nèi)干細(xì)胞遷移并分 化為軟骨細(xì)胞，并發(fā)揮正常生理功能，原位修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨；植入的人工軟骨在 關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)后，自動安全降解。這是一個理想的研究方向。
而采用這種方法，需要解決若干問題首先就是體內(nèi)遷移細(xì)胞的來源。細(xì) 胞可以來源于關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞，也可以來源于軟骨下骨細(xì)胞。而且，關(guān)節(jié)滑液中 的軟骨細(xì)胞盡管數(shù)量少，但完全可以自由遷移進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨缺損部位。
鑒于軟骨細(xì)胞幾乎沒有遷移能力，滑液細(xì)胞數(shù)量太少，而其它可分化為正 常軟骨細(xì)胞，如骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨膜細(xì)胞等，由于組織屏障，正常情 況下都不可能自由的移動到關(guān)節(jié)軟骨的損傷部位上并進(jìn)行軟骨修復(fù)。因此，一 般關(guān)節(jié)軟骨缺損是無法自然修復(fù)的。
然而，在針對關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究中發(fā)現(xiàn)，僅軟骨層部分缺損時,關(guān)節(jié)軟骨 基本無再生能力,而當(dāng)伴有軟骨下骨缺損時,骨組織中間充質(zhì)干細(xì)胞可以向缺損
區(qū)遷移并發(fā)生增殖和分化,充填缺損區(qū),但此時缺損區(qū)主要由纖維軟骨而非透明 軟骨充填。也就是說，骨組織和關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)空間位置上相互接近，組織阻 隔在軟骨下層，因此完全可以通過對軟骨下骨打孔形成通道，而介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移至軟骨受損區(qū)。在最近的研究中，有對關(guān)節(jié)表面進(jìn)行打孔、將 含有骨形成蛋白(BMP )的膠原蛋白放呈在所希望的部位，可再生關(guān)節(jié)軟骨 的論文發(fā)表。而且體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)也證實了，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞確 實可以軟化為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。目前研究己經(jīng)證實，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng) 的自我更新能力和多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為軟骨細(xì)胞，有
多篇文獻(xiàn)作了相關(guān)報道。例如，用轉(zhuǎn)化生長因子(31、地塞米松誘導(dǎo)的骨髓間
充質(zhì)干細(xì)胞與聚羥基乙酸/聚乳酸共培養(yǎng)1周后移植入豬的非負(fù)重區(qū)域膝關(guān)節(jié)
骨軟骨缺損處，6個月后膝關(guān)節(jié)缺損處已完全被工程化透明軟骨和松質(zhì)骨所修 復(fù)，蛋白多糖含量與正常關(guān)節(jié)軟骨無差異。Ponticidlo、 Hegewald等都做過先 導(dǎo)性的相關(guān)理論研究。
總之，針對細(xì)胞的來源問題，完全可以通過人為對軟骨下骨打孔形成通道, 而介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移至軟骨受損區(qū)。
因此，采用這處方法，目前真正需要解決的問題是，介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞遷移至軟骨受損區(qū)后，如何有效誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 行使正常的生理功能，最終修復(fù)軟骨層。這就需要嚴(yán)格的擬合關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的 正常環(huán)境條件。
這些嚴(yán)格的擬合的環(huán)境條件，對植入的人工關(guān)節(jié)軟骨而言，包括關(guān)節(jié)活 動的刺激，關(guān)節(jié)軟骨支架材料性能，附著在支架上各種適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子及刺激 原及其可控釋放。由于是關(guān)節(jié)原位再生，關(guān)節(jié)活動對之施加了同等的力學(xué)刺激。 影響因素主要是后兩者。這兩者的嚴(yán)格擬合有著相當(dāng)?shù)碾y度。
首先是支架及其性能。支架性能有兩方面的要求，第一，則是有良好的力 學(xué)性能，彈性極佳，滑潤性好，在關(guān)節(jié)軟骨沒有再生之前，起到臨時替代關(guān)節(jié) 軟骨功能的作用；第二，是支架本身基質(zhì)材料及其結(jié)構(gòu)。因為人工軟骨支架影 響表現(xiàn)型軟骨細(xì)胞的表達(dá)。人工合成聚合物的組織工程支架機(jī)械性能比一般天 然生物材料更好，但天然材料常有利于軟骨修復(fù)。例如II型膠原雖有利于軟骨 細(xì)胞粘附、增殖、分化，可作為良好的材料包埋添加劑，但是缺乏一定的機(jī)械 強(qiáng)度，難于塑形，支架材料在體內(nèi)降解過快，因而無法在關(guān)節(jié)軟骨中單獨使用。 因此，目前研究一定都在尋找合適的材料和方法。目前認(rèn)為單一材料較難適應(yīng) 要求，而通過共混調(diào)整不同材料之間的比例，可以使共混材料具有更適合力學(xué) 性能、降解性和生物學(xué)性質(zhì)等。而在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞完成修復(fù)后，支架可以自動
8降解，避免二次手術(shù)問題。
其實則是細(xì)胞因子和刺激原作用。不僅骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移需要多種 細(xì)胞遷移及歸巢因子的作用。更重要的是，軟骨細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮還需 要多種適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子的刺激，其它一些刺激原也有相應(yīng)作用。因此人工軟骨 支架通常會添加的各種促進(jìn)軟骨生長的成分，這些成分通常是可影響細(xì)胞的形 狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化生物活性物質(zhì)，如某些促軟骨生長的細(xì)胞 因子。細(xì)胞因子輔助治療軟骨損傷法中細(xì)胞因子本身對軟骨生長的促進(jìn)作用很 好，但要將因子固定于組織工程支架材料并能緩釋釋放，目前還沒有相關(guān)專利 和產(chǎn)品。而這對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移至關(guān)節(jié)軟骨受損部位，并定向分化 為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后，行使正常的生理功能原位修復(fù)受損關(guān)節(jié)軟骨一系列關(guān)節(jié)軟 骨原位修復(fù)過程至關(guān)重要。
以上整個人工關(guān)節(jié)軟骨支架體系不僅在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)之前起臨時替代關(guān) 節(jié)軟骨的作用，而且為細(xì)胞的生存及活動提供適宜的場所和支撐，并提供了合 適的生理微環(huán)境。
因此，真正理想的人工軟骨應(yīng)該是可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞原位再生，形成真 正的透明軟骨并與周圍正常軟骨組織結(jié)構(gòu)一致，再生性修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，再生修 復(fù)完成后可人工軟骨可自動降解。
但目前并無具體的制備方法將納米仿生人工軟骨產(chǎn)品制備出來并應(yīng)用于 臨床，這是目前此技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)難題，本發(fā)明正是針對此未攻克的技術(shù)難題 進(jìn)行改進(jìn)和確立具體實現(xiàn)方案。
近年來， 一些納米生物仿生技術(shù)，如靜電紡絲、細(xì)胞打印技術(shù)等的興起為
構(gòu)建新型人工軟骨產(chǎn)品提供了新思路。相比以往的支架制備技術(shù)，由靜電紡絲 納米仿生技術(shù)制備的軟骨生物支架具有以下一些優(yōu)點①由靜電紡絲技術(shù)制備 的納米纖維直徑由幾十納米至幾微米，能在形態(tài)上很好模擬細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)，縱橫交錯的纖維形成很多孔隙，使材料具有高比表面積，有利于細(xì)胞 粘附、增殖和分化；②數(shù)量巨大的納米纖維的排列，使材料具有很好的力學(xué)強(qiáng) 度及柔韌性；③靜電紡生物支架能夠軟骨細(xì)胞及生長因子有效融合； 靜電紡 絲技術(shù)適用于超過100種天然或合成生物材料，還可以通過調(diào)整工藝參數(shù)，獲 得不同材料、不同結(jié)構(gòu)的組合，使生物支架具有靈活的可設(shè)計性，可滿足人體 軟骨中對多細(xì)胞和多材料組成的要求。生物打印技術(shù)是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)。生物打印能按預(yù)定計劃精確定位， 這和打印技術(shù)的特點是一致的。生物打印與一般打印的不同僅在于其墨水和接 受打印的紙張不一樣。生物打印的紙片是在體內(nèi)可降解的生物紙片；生物打印 的"生物墨水"是特制的細(xì)胞溶液或有生物活性的細(xì)胞因子溶液。生物打印技術(shù) 是將這種特制溶液噴射到可生物降解的生物紙片上。打印后再將紙片按一定順 序的堆疊。由于使用了打印技術(shù)，可以將細(xì)胞或/和細(xì)胞因子("生物墨水")精 確的結(jié)合到預(yù)定部位；而按特定的堆疊方式的生物紙片則會形成三維結(jié)構(gòu)。理 論上如果所用的生物墨水是細(xì)胞溶液，則形成三維的組織結(jié)構(gòu)和器官，最后生 物紙片降解，細(xì)胞保留下來，形成立體結(jié)構(gòu)，例如，活的三維組織、血管和器 官。但是生物打印技術(shù)仍處于基礎(chǔ)研究的階段，還沒有出現(xiàn)直接利用細(xì)胞通過 生物打印技術(shù)制備的人工器官，也沒有見到相關(guān)報道。但目前并無具體的制備方法將納米仿生人工軟骨產(chǎn)品制備出來并應(yīng)用于 臨床，這是目前此技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)難題，本發(fā)明正是針對此未攻克的技術(shù)難題 進(jìn)行改進(jìn)和確立具體實現(xiàn)方案。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服己有技術(shù)的缺點，提供一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié) 軟骨，所述人工關(guān)節(jié)軟骨是一種能對關(guān)節(jié)軟骨損傷進(jìn)行原位再生性修復(fù)的生物 型關(guān)節(jié)軟骨植入材料，它不僅涉及人工軟骨材料，并涉及多種細(xì)胞因子、可原 位誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移到人工關(guān)節(jié)軟骨的納米仿生支架內(nèi)，并誘導(dǎo) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，促使誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能、 最后再重生關(guān)節(jié)軟骨，在關(guān)節(jié)軟骨原位再生后，材料可自動安全降解。這種新 型人工軟骨克服了目前關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)中無合適材料可用的被動局面。本發(fā)明的另一個目的是提供上述人工關(guān)節(jié)軟骨的制備方法，所述方法簡單 易行、可適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)、成本低，同時拓寬了生物打印技術(shù)應(yīng)用范圍的。本發(fā)明提供了一種人工關(guān)節(jié)軟骨，在對關(guān)節(jié)面進(jìn)行打孔至軟骨下硬骨骨 髓、將含有細(xì)胞因子的人工關(guān)節(jié)軟骨放呈在所希望的部位，并誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨再 生。它涉及多種細(xì)胞因子、可原位誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及滑液細(xì)胞定向遷移 到人工關(guān)節(jié)軟骨的納米仿生支架內(nèi)，并誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及滑液細(xì)胞分化 為軟骨細(xì)胞，促使誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能、最后再重生關(guān)節(jié)軟骨； 并在關(guān)節(jié)軟骨再生后自動安全降解。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供了一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié)軟骨，包括納米仿生支架和附 著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細(xì)胞因子。所述納米仿生支架是采用支架材料通過靜電紡絲技術(shù)制備得到，所述支架 材料包括聚乳酸、聚已內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸 乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸 酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、 聚對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、 纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、 海藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸。將上述材料溶于一定的 溶劑，形成電紡液，就可以通過靜電紡絲技術(shù)得到納米仿生支架。這些溶劑可 以為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二 甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲垸、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、 二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩Ｉ鲜龅母叻肿硬?料和溶劑用于靜電紡絲的相關(guān)技術(shù)，例如材料與溶劑的重量比例等參照現(xiàn)有技 術(shù)。用上面提到的一種或兩種以上混合材料通過靜電紡絲技術(shù)，可以按照具體 需要做出合適孔徑和直徑的納米材料。此項工藝在本發(fā)明制備方法一節(jié)有詳細(xì) 敘述，操作簡單，所得到的纖維是納米級的，比傳統(tǒng)的方法得到的無紡布直徑 小幾個數(shù)量級，其直徑分布是幾個納米到幾個微米，并可通過工藝參數(shù)調(diào)整得 到不同直徑，做到和人體真皮網(wǎng)狀結(jié)締組織高度相似，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑 大小和其分布也可調(diào)整，孔徑可以調(diào)整到數(shù)十納米到數(shù)個微米之間，以達(dá)到在 允許營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入的同時防止細(xì)胞進(jìn)入；也可以調(diào)整為到數(shù)十到數(shù)百微米，以利于不同類型的細(xì)胞遷入，如50+20微米的孔徑有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞長入，而 神經(jīng)纖維則需要30 100微米的孔徑。靜電紡纖維得到的孔隙大小分布很大程 度上依賴于纖維直徑，已知纖維直徑減小時，孔徑也在同時減小。據(jù)已發(fā)表的 文獻(xiàn)，纖維直徑在4-10pM時，孔徑從20-45pM。采用不同材料不同參數(shù)的靜 電紡絲可生成的不同直徑的纖維。本發(fā)明采用上述材料的電紡絲根據(jù)軟骨修復(fù) 過程自動安全降解，避免了結(jié)締組織的異常增生，軟骨纖維化現(xiàn)象。由于人工 軟骨的特殊要求，靜電紡支架同時有很好的耐磨性和韌性，以達(dá)到對天然軟骨ii的最佳模擬。所述的納米仿生支架在生物打印中同時起到生物"紙片"的作用。所述水溶膠可以是以下聚合物制成的水溶膠多糖類聚合物，如淀粉、纖 維素、海藻酸、透明質(zhì)酸或殼聚糖；多肽類聚合物，如膠原、聚L-賴氨酸或聚 L-谷胺酸；合成的親水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰 胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物制備的水溶膠通過改變溫度、酸堿度、 經(jīng)紫外線照射或者加入交聯(lián)劑(固化液)等方法，可由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)。多種細(xì)胞因子于軟骨細(xì)胞的分化都有很重要的影響。軟骨細(xì)胞的分化和增 殖受到多種因子的調(diào)節(jié)。本發(fā)明所涉及的細(xì)胞因子有以下幾種調(diào)節(jié)軟骨形成 的生長因子，促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及滑液細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞因子， 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其遷移和轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞或其他刺激原。促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及滑液細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞因子包括以下因子轉(zhuǎn)化生長因子f31 (TGF-pi)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (BMP-2)、胰島素樣生 長因子l (IGF-1)等細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)化生長因子(31是促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟 骨分化首選的細(xì)胞因子，其具有多重生物學(xué)效應(yīng)①促進(jìn)軟骨前體細(xì)胞趨化到 骨軟骨損傷部位，并能誘導(dǎo)未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。②促 進(jìn)軟骨基質(zhì)合成。③抑制軟骨分解代謝。④關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)遠(yuǎn)期療效不佳的 一個重要原因是在關(guān)節(jié)軟骨損傷的病理過程中多種炎癥遞質(zhì)(如白細(xì)胞介素、 腫瘤壞死因子、干擾素、基質(zhì)金屬蛋白酶等)參與軟骨基質(zhì)的降解，轉(zhuǎn)化生長 因子pl能抑制這些炎癥遞質(zhì)的活性，并能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2是轉(zhuǎn)化生長因子(3超家族的成員，也能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞增殖并分化為軟骨細(xì)胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和轉(zhuǎn)化生長因子pi還具有協(xié)同 作用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在兩者共同作用下II型膠原合成顯著提高，同時使I 型膠原表達(dá)降至最低。胰島素樣生長因子1是一種強(qiáng)有力的合成代謝刺激因子， 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和成熟，合成軟骨基質(zhì)蛋白多糖。研究表明胰島素樣生 長因子1可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，還可抑制轉(zhuǎn)化生長因子卩l(xiāng) 引起的細(xì)胞外焦磷酸鹽的積聚，防止焦磷酸鈣結(jié)晶的形成和進(jìn)一步成骨，是轉(zhuǎn) 化生長因子(31重要的輔助因子。對干細(xì)胞的歸巢或趨化或細(xì)胞分化起作用的因子，如細(xì)胞定向遷移因子(SDF-1)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素結(jié)合因子(ECM)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF-a)、血小板衍生的生長 因子(PDGF)或細(xì)胞定向遷移因子、胰島素生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子、結(jié)締組織生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長 因子、骨橋蛋白、生長激素類(如促生長素)等細(xì)胞吸引及粘附因子調(diào)節(jié)軟骨形成的生長因子軟骨形成受到的生長因子調(diào)節(jié)作用，許多細(xì)胞因子通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞。目前認(rèn)為促進(jìn)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成代謝的細(xì)胞因子有IGFs， TGF-Ps (如BMPs)， PDGF， FGF， EGF, IGF-I ，而對軟骨細(xì)胞有抑制作用 的有IL-1、 IL-2、 IL-7、 TNF-a、 IFN-y等。TGF-|3可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞車、化為 軟骨細(xì)胞?，F(xiàn)己實驗證明TGF-(3s具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)其分化和胞外 基質(zhì)合成的能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族屬于TGF-(3s超家庭，可加速功 能性關(guān)節(jié)軟骨的再生，被證實為具有骨發(fā)生、軟骨發(fā)生和其它生長和分化類型 的活性。這些BMP包括BMP畫2 、 BMP-3 、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP - 7 ( OP陽1 )、 BMP - 8、 BMP - 9、 BMP - 12、 BMP-13、 BMP-15、 BMP-16、 BMP-17、 BMP-18、 GDF-1、 GDF-3、 GDF-5、 GDF-6、 GDF畫7、 GDF-8、 GDF-9、 GDF-IO、 GDF-ll、 GDF-12、 GDF-14、 Vgr-2和任何生長分化因子(GDF )。 例如，BMP-7(OP-l)是BMP家族中的一員，可增加其堿性磷酸酶活性和提高 mRNA和II型膠原的合成能力，rhBMP(OP-l)能有效促進(jìn)胚胎和成人關(guān)節(jié)軟骨 細(xì)胞合成蛋白多糖和II型膠原。IGF- I能強(qiáng)烈剌激軟骨細(xì)胞合成II型膠原和蛋 白多糖，還能刺激軟骨細(xì)胞集落形成和細(xì)胞增殖，而IGF-II能刺激軟骨細(xì)胞 DNA和RNA的合成且比IGF-I更有效的剌激胚胎細(xì)胞的生長。而IGF結(jié)合 蛋白(IGFlBPs)它通過特異性結(jié)合IGFs而起作用。成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs) 體外實驗發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、成熟和胞外基質(zhì)的合成，而bFGF是 一種強(qiáng)大的軟骨細(xì)胞有絲分裂原，它能刺激生長板中軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合 成。促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成代謝的其它刺激原地塞米松常被認(rèn)為是一 種非特異性的分化刺激原，能提高軟骨細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，使II型膠原和蛋白多糖合成增多。此外，n型膠原是透明軟骨的主要成分之一，對于軟骨細(xì) 胞功能的維持起著重要作用。單獨使用n型膠原也能誘導(dǎo)并維持間充質(zhì)干細(xì)胞 向軟骨細(xì)胞分化，還能與轉(zhuǎn)化生長因子pi相互作用增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力。從以上論述中可以得知，多種因子盡管都對關(guān)節(jié)軟骨的再生有不可或缺的 作用，但其作用方式，其局部濃度及其梯度濃度分配、不同因子的組合和在損 傷部位深淺層次上濃度分配及其不同的比例，都對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)效果有重要 關(guān)系。比如說，促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移的因子在人工軟骨支架材料上的分布應(yīng)該是 內(nèi)層濃度高于外層濃度，以利其遷移。反之，分化因子則應(yīng)該有計劃的成簇分 布為佳。因此，為滿足此點要求，必須將多種細(xì)胞因子精確的與納米仿生支架 結(jié)合。但目前的混紡技術(shù)等都不能做到此點，但生物打印技術(shù)卻可以將不同的 細(xì)胞因子準(zhǔn)確的結(jié)合到計劃部位。本發(fā)明還提供了上述納米仿生人工關(guān)節(jié)軟骨的制備方法，包括以下步驟 (1)制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； (2 )用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架； (3)用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子或軟骨細(xì)胞的水溶膠溶液打印到所述 納米仿生支架上，水溶膠固化后即得。含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液的制備也可以在步驟(3)實施之前再進(jìn)行。在本發(fā)明中，步驟(2)和(3)可重復(fù)一次或者更多次，以得到不同厚度的關(guān)節(jié)軟骨。所述電紡溶液是將所述支架材料溶于一定的溶劑，形成電紡液；支架材料 包括聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸乙二 酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙垸、聚 對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖 維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、海 藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸的一種或兩種以上混合溶液；可用的溶劑為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、 四氫呋喃、二甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、 乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一種或者它們?nèi)我獗壤?的混合物。上述的高分子材料和溶劑用于靜電紡絲的相關(guān)技術(shù)，例如材料與溶 劑的重量比例等參照現(xiàn)有技術(shù)。所述電紡溶液優(yōu)選數(shù)均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯的二氯甲14垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯所占的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質(zhì)量百分比濃度為4 11 % 。步驟(1)所述含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液是含有細(xì)胞因子的水溶膠緩沖 液；所述細(xì)胞因子所占質(zhì)量百分比總數(shù)不高于10%。步驟(1)所述水溶膠緩沖溶液為藻酸鹽或藻酸鹽與其它物質(zhì)的混合溶液， 交聯(lián)劑溶液為氯化鈣溶液；或所述水溶膠緩沖溶液為纖維蛋白原溶液，交聯(lián)劑 溶液為凝血酶溶液；或所述水溶膠緩沖溶液為透明質(zhì)酸碳酸氫鈉溶液，交聯(lián)劑 溶液為酰肼或碳化二亞胺；或所述水溶膠緩沖溶液為膠原-聚陰離子溶液，交 聯(lián)劑為碳化二亞胺。步驟(2)所述靜電紡絲的優(yōu)選參數(shù)為注射泵推進(jìn)速度為0.1 3.0ml/h， 紡絲針頭為IO、 12、 14、 16、 18或20號針頭，施加電壓為10 30KV， 接收 噴絲的細(xì)胞培養(yǎng)皿中裝有交聯(lián)劑溶液，生物打印的紙片為電紡制得的納米仿生 支架。所述噴墨打印機(jī)優(yōu)選改裝的惠普550C噴墨打印機(jī)，改裝方法參考美國專 利US 7051654。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明是對現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，比已有技術(shù)中人工合成聚合物的組織 工程支架機(jī)械性能更好，細(xì)胞因子輔助治療軟骨損傷法中細(xì)胞因子本身對軟骨 生長的促進(jìn)作用很好，但要將因子固定于組織工程支架材料并能緩釋釋放，這 一構(gòu)想目前還沒有得到實際實施，本發(fā)明實現(xiàn)了該構(gòu)想。本發(fā)明采用了原位自體細(xì)胞工程技術(shù)，采用干細(xì)胞趨化因子吸引自體干細(xì) 胞定向遷移進(jìn)入創(chuàng)面并按設(shè)計要求進(jìn)行分化,采用細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞分化因 子，前者吸引關(guān)節(jié)滑液和/或關(guān)節(jié)軟骨下骨中合適的自體細(xì)胞定向遷移進(jìn)入關(guān) 節(jié)軟骨損傷部位，后者促使吸引遷移到損傷部位的自體細(xì)胞按設(shè)計要求分化為 軟骨細(xì)胞并進(jìn)一步行使正常軟骨細(xì)胞功能、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，既避免了使用活細(xì) 胞帶來的不便，又能達(dá)到使用與其同等或者更佳的修復(fù)效果，有廣闊和應(yīng)用前學(xué)本發(fā)明利用生物打印技術(shù)，將生長因子等生物物質(zhì)按設(shè)計要求與納米支架 精確結(jié)合，形成誘導(dǎo)軟骨下骨干細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞遷移、聚集、分化的微環(huán) 境，吸引干細(xì)胞進(jìn)入損傷部位。本發(fā)明采用的三維支架具有理想的降解速度，在關(guān)節(jié)軟骨層再生后降解， 能夠滿足臨床實際應(yīng)用的需要。可完全降解，而且三維支架有一定的耐磨性， 潤滑性，在關(guān)節(jié)軟骨層再生之前可以代替軟骨的功能，可植入固定，與關(guān)節(jié)面 糸5口 口 o本發(fā)明的人工關(guān)節(jié)軟骨生物安全性、相容性好，沒有免疫排斥作用或排斥作用極低；原料無毒性及致瘤性，產(chǎn)品有良好的耐磨性，潤滑性和機(jī)械強(qiáng)度， 有一定的可塑性，有臨時性代替軟骨功能的作用，能與關(guān)節(jié)面緊密結(jié)合。本發(fā)明結(jié)合了靜電紡絲和生物打印技術(shù)，分布了適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子和刺激 原，并可控釋放，提供了合適的微環(huán)境，以利于間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢、粘附、 分化為軟骨細(xì)胞并生長增殖和行使正常生理功能，誘導(dǎo)軟骨組織再生，形成新 的正常透明關(guān)節(jié)軟骨層。本發(fā)明原料來源豐富，易于獲得；材料是目前巳經(jīng)證實對人體無毒無害的 安全生物材料；本發(fā)明制備的人工軟骨本身不含活細(xì)胞成分，不使用外源細(xì)胞 和蛋白，免除了因此而帶來免疫排斥、病毒傳播、疾病傳染的諸多風(fēng)險；本發(fā)明制備的人工軟骨貯存運(yùn)輸簡單；制備方法工藝步驟簡化，生產(chǎn)時間 短，能有效避免加工過程中產(chǎn)品受到污染，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)容易 實現(xiàn)，產(chǎn)品可實現(xiàn)低成本、高效率的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明人工關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為靜電紡絲形成的生物 紙片，2為細(xì)胞分化因子、3為細(xì)胞遷移因子。
具體實施方式
以下通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 實施例l(1)制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液； -電紡溶液優(yōu)選數(shù)均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯的二氯甲垸溶 液；所述聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯所占的重量百分比分別為50 %和50%，溶液 總的質(zhì)量百分比濃度為7%。交聯(lián)劑溶液選用O.IM氯化鈣溶液。含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用藻酸鹽溶液，所述細(xì)胞因子藻酸鹽溶液中 細(xì)胞因子TGF-(31、 IGF-1、 BMP-2的質(zhì)量百分比濃度各為100ppm。將配置好的O.IM氯化鈣溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于靜電 紡絲裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專 利報道進(jìn)行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在電紡 絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細(xì)胞因子定位打印。將配好的細(xì)胞因子藻酸 鹽溶液裝入噴墨打印墨盒中。本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。(2) 用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架； 將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設(shè)定注射泵推進(jìn)速度為0.5ml/h， 選用10號針頭，施加電壓為20KV，用裝有氯化鈣溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿接收噴絲。 噴絲30分鐘后，停止靜電紡絲；(3) 用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的藻酸鹽溶液打印到納米仿生支架上， 水溶膠固化后即得。開啟噴墨打印機(jī)，按照設(shè)定的位置，將細(xì)胞因子藻酸鹽溶液打印在培養(yǎng)皿 的電紡層上，藻酸鹽溶液接觸電紡層上的氯化鈣溶液后迅速固化，形成藻酸鹽 水溶膠，將細(xì)胞因子包裹并固定。重復(fù)打印15遍后，關(guān)閉打印機(jī)。重新靜電紡絲30分鐘，然后再關(guān)閉靜電 紡絲，打??；靜電紡絲和打印循環(huán)重復(fù)。最后形成厚度約1.5mm的人工關(guān)節(jié) 軟骨，制得的人工關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)如圖l所示，圖中l(wèi)為靜電紡絲形成的生物紙 片，2為細(xì)胞分化因子、3為細(xì)胞遷移因子。將制得的納米纖維水溶膠薄膜從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水漂洗5遍，經(jīng)凍 干后真空包裝，經(jīng)25kGy鈷-60滅菌后負(fù)20攝氏度低溫保存。 實施例2實施步驟同實施例1。所述電紡溶液優(yōu)選數(shù)均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯的二氯甲 烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯所占的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質(zhì)量百分比濃度為5 %。交聯(lián)劑溶液選用100IU/ml凝血酶溶液； 含有細(xì)胞因子水溶膠溶液采用細(xì)胞因子纖維蛋白原溶液，BMP-2濃度為 10mg/ml。具體操作是將配置好的凝血酶溶液放入直徑90mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于 靜電紡絲裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按照現(xiàn)有專利報道進(jìn)行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固定在 電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細(xì)胞因子定位打印。將配好的細(xì)胞因子 纖維蛋白原溶液裝入噴墨打印墨盒中，本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設(shè)定注射泵推進(jìn)速度為1.5ml/h，選用 16號針頭，施加電壓為25KV，用裝有凝血酶溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿接收噴絲。噴 絲25分鐘后，停止靜電紡絲，開啟噴墨打印機(jī)，按照設(shè)定的位置，將打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，纖維蛋白原溶液接觸電紡層上的凝血酶溶液后迅速固化， 形成水溶膠，將細(xì)胞因子包裹并固定。重復(fù)打印15遍后，關(guān)閉打印機(jī)，重新 靜電紡絲30分鐘，然后再關(guān)閉靜電紡絲，打印15遍.反復(fù)若干次，形成厚度 約3.0mm的納米仿生人工關(guān)節(jié)。保存方法同實施例1。 實施例3所述電紡溶液優(yōu)選數(shù)均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯所占的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質(zhì)量百分比濃度為10%。交聯(lián)劑溶液選用100mg/ml水溶性碳化二亞胺溶液；含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用細(xì)胞因子的膠原與聚陰離子溶液，其中膠 原濃度為1%，聚陰離子采用聚谷氨酸，濃度50mg/ml，所述細(xì)胞因子包括細(xì) 胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子(3、 BMP-2、地塞米松， 總的質(zhì)量百分比濃度為0.5%。具體操作是將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 至于靜電紡絲裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按 照現(xiàn)有專利報道進(jìn)行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固 定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細(xì)胞因子定位打印。將配好的細(xì)胞 因子溶液裝入噴墨打印墨盒中，本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設(shè)定注射泵推進(jìn)速度為0.2ml/h，選用 12號針頭，施加電壓為20KV，用裝有碳化二亞胺溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿接收噴 絲。噴絲30分鐘后，停止靜電紡絲，開啟噴墨打印機(jī)，按照設(shè)定的位置，將 細(xì)胞因子的透明質(zhì)酸碳酸氫鈉溶液(細(xì)胞因子質(zhì)量百分比濃度0.1%)打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，透明質(zhì)酸溶液接觸電紡層上的碳化二亞胺后迅速固化，形18成透明質(zhì)酸水溶膠，將細(xì)胞因子包裹并固定。重復(fù)打印15遍后，關(guān)閉打印機(jī)，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關(guān)閉靜電紡絲，打印15遍，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關(guān)閉靜電紡絲。反復(fù)若干次， 形成厚度約4.0mm的納米人工關(guān)節(jié)軟骨。保存方法同實施例1。 實施例4所述電紡溶液優(yōu)選數(shù)均分子量為26000的聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己內(nèi)酯所占的重量百分比分別為50 %和50%， 溶液總的質(zhì)量百分比濃度為6%。交聯(lián)劑溶液選用100mg/ml水溶性碳化二亞胺溶液；含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液采用細(xì)胞因子的膠原與聚陰離子溶液，其中膠 原濃度為1%，聚陰離子采用聚谷氨酸，濃度50mg/ml，所述細(xì)胞因子包括細(xì) 胞定向遷移因子SDF-1、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a、 BMP，總的質(zhì)量百 分比濃度為0.5%。具體操作是將配置好的碳化二亞胺溶液放入直徑150mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 至于靜電紡絲裝置及打印機(jī)共用的平板接收器上。將惠普550C噴墨打印機(jī)按 照現(xiàn)有專利報道進(jìn)行改裝，例如可參照美國專利US 7051654公開的方法，固 定在電紡絲裝置箱內(nèi)電紡針頭正下方，用作細(xì)胞因子定位打印。將配好的細(xì)胞 因子溶液裝入噴墨打印墨盒中，本實施例采用的墨盒型號為HP51626A。將電紡溶液裝入注射泵開始紡絲，設(shè)定注射泵推進(jìn)速度為0.4ml/h，選用 12號針頭，施加電壓為25KV，用裝有碳化二亞胺溶液的細(xì)胞培養(yǎng)皿接收噴 絲。噴絲35分鐘后，停止靜電紡絲，開啟噴墨打印機(jī)，按照設(shè)定的位置，將 細(xì)胞因子的透明質(zhì)酸碳酸氫鈉溶液(細(xì)胞因子質(zhì)量百分比濃度0.1%)打印在 培養(yǎng)皿的電紡層上，透明質(zhì)酸溶液接觸電紡層上的碳化二亞胺后迅速固化，形 成透明質(zhì)酸水溶膠，將細(xì)胞因子包裹并固定。重復(fù)打印15遍后，關(guān)閉打印機(jī)，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關(guān)閉靜電 紡絲，打印15遍，重新靜電紡絲35分鐘，然后再關(guān)閉靜電紡絲。反復(fù)若干次， 形成厚度約5.0mm的納米人工關(guān)節(jié)軟骨。保存方法同實施例1。 實施例5用實施例1制得的人工關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行動物實驗選擇新西蘭兔并進(jìn)行肌肉注射麻醉。確定兔子完全麻醉以后，剃光兩條腿 的膝關(guān)節(jié)，用橡皮膏固定，并保持仰臥姿勢。確認(rèn)膝關(guān)節(jié)沒有病變現(xiàn)象以后， 用銳利的手鉆在大股骨關(guān)節(jié)面的位置處打一個中心螺旋狀的凹孔，然后用鉆子在其中心位置打一個直徑4mm的洞，深度達(dá)到3mm，人為建立了一個全厚的 軟骨缺陷。按照上述方法建立軟骨損傷以后，繼續(xù)觀察損傷區(qū)域4個月。確 定關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域沒有自己愈合。再次進(jìn)行肌肉注射麻醉，打開上次手術(shù)部位。用鉆子在上次人為建立的關(guān) 節(jié)軟骨損傷區(qū)之下的硬骨上打洞，移植本發(fā)明制備的人工關(guān)節(jié)軟骨。將本發(fā)明 制備的人工關(guān)節(jié)軟骨的一端植入到硬骨骨洞上。進(jìn)行軟骨修復(fù)12周后進(jìn)行核磁共振檢測。從核磁共振圖上可見，修復(fù)處 表面平滑，表明修復(fù)處未有塌陷。未見明顯免疫炎癥反應(yīng)。進(jìn)行軟骨修復(fù)8個月后，.處死實驗動物，取手術(shù)部位組織觀察。肉眼觀察 可見，在移植物處形成新生的透明軟骨，新生軟骨與關(guān)節(jié)表面融合良好。組織 切片檢測，可見人工關(guān)節(jié)軟骨己被新生的透明軟骨所替代，修復(fù)處未出現(xiàn)塌陷， 與正常軟骨的交界處緊密接合，界線模糊。未見巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，未 見明顯免疫炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果表明，在關(guān)節(jié)軟骨缺損中，本發(fā)明制備的人工關(guān)節(jié)軟骨可促進(jìn)軟 骨的愈合。
權(quán)利要求
1.一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié)軟骨，包括納米仿生支架和附著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細(xì)胞因子。
2. 如權(quán)利要求1所述的人工關(guān)節(jié)軟骨，其特征在于所述細(xì)胞因子包括細(xì)胞的歸巢或趨化起作用的細(xì)胞因子、促使間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞 因子或調(diào)節(jié)軟骨形成的生長因子中的任意一種或幾種。
3. 如權(quán)利要求1所述的人工關(guān)節(jié)軟骨，其特征在于所述納米仿生支架是 采用支架材料溶于溶劑形成電紡液通過靜電紡絲技術(shù)制備得到；所述支架材料 包括聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚對苯二甲酸乙 二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚 對二惡酮、聚氨酯類、聚碳酸酯、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖 維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲蛋白、彈力蛋白擬態(tài)的肽聚合物、海 藻酸、硫酸軟骨素，肝素，瓊脂，葡聚糖、褐藻酸。
4. 如權(quán)利要求3所述人工關(guān)節(jié)軟骨，其特征在于所述溶劑為甲酸、乙酸、 乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氫呋喃、二甲基亞砜、六氟異 丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙 垸、三氟乙酸、水或它們?nèi)我獗壤幕旌衔铩?br> 5. 如權(quán)利要求1所述的人工關(guān)節(jié)軟骨，其特征在于所述水溶膠是以多糖 類聚合物、多肽類聚合物或多肽類聚合物制成的水溶膠；所述多糖類聚合物為 淀粉、纖維素、海藻酸、透明質(zhì)酸或殼聚糖；所述多肽類聚合物為膠原、聚 L-賴氨酸或聚L-谷胺酸；所述合成的親水高分子聚合物為聚丙烯酸、聚甲基丙 烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。
6. —種權(quán)利要求1所述的人工關(guān)節(jié)軟骨的制備方法，其特征在于包括以 下步驟(1) 制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液；(2) 用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；(3) 用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支 架上，水溶膠固化后即得。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液的制備在步驟(2)和步驟(3)之間進(jìn)行。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)和(3) 重復(fù)若干次。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述靜電紡絲的 參數(shù)為注射泵推進(jìn)速度為0.1~3.0ml/h，紡絲針頭為10、 12、 14、 16、 18或 20號針頭，施加電壓為10-30KV,接收噴絲的細(xì)胞培養(yǎng)皿中裝有交聯(lián)劑溶液， 生物打印的紙片為電紡制得的納米仿生支架。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于自體細(xì)胞的人工關(guān)節(jié)軟骨及其制備方法。所述人工關(guān)節(jié)軟骨包括納米仿生支架和附著于其上的水溶膠，所述水溶膠內(nèi)包覆有一種或幾種細(xì)胞因子。本發(fā)明還提供了所述人工關(guān)節(jié)軟骨的制備方法，包括以下步驟制備電紡溶液、含有細(xì)胞因子水溶膠溶液和交聯(lián)劑溶液；用所述交聯(lián)劑溶液接收靜電紡絲制得納米仿生支架；用噴墨打印機(jī)將含有細(xì)胞因子的水溶膠溶液打印到所述納米仿生支架上，水溶膠固化后即得。本發(fā)明采用的三維支架具有理想的降解速度，在關(guān)節(jié)軟骨層再生后降解，能夠滿足臨床實際應(yīng)用的需要，可完全降解，而且三維支架有良好的耐磨性，潤滑性，在關(guān)節(jié)軟骨層再生之前可以代替軟骨的功能。
文檔編號A61L27/54GK101574543SQ20091004011
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者弢 徐, 袁玉宇 申請人:廣州邁普再生醫(yī)學(xué)科技有限公司