專利名稱：表達(dá)FoxMlsiRNA的重組腺病毒及其在腫瘤治療和預(yù)防中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，針對(duì)FoxMl核酸和蛋白或其功能片段設(shè)計(jì)制備的各類藥物，通過(guò)抑制或降低 FoxMl的表達(dá)、活性和功能，用于預(yù)防、治療或延緩人類腫瘤。具體地說(shuō)是涉及腫瘤基因治療領(lǐng)域，涉及 一種表達(dá)針對(duì)FoxMl的shRNA的重組腺病毒及其在腫瘤治療和預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子Forkhead Box Ml(FoxMl)是完成細(xì)胞周期所必需的調(diào)控蛋白，抑制其表達(dá)能有效終止細(xì)胞周 期、阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)[1-5]。目前已研究的各種人實(shí)體瘤樣本的腫瘤細(xì)胞中，都存在FoxMl過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象[6-9], 對(duì)其表達(dá)水平的檢測(cè)，已被用于多種腫瘤的診斷和預(yù)后(美國(guó)專利7056674 "Prediction of likelihood of cancer recurrence"、 美國(guó)專利7081340 "Gene expression profiling in biopsied tumor tissues"、 美國(guó)專禾Ll 7308364 "Diagnosis of multiple myeloma on gene expression profiling"、美國(guó)專利7526387 "Expression profile algorithm and test for cancer prognosis "、美國(guó)專利753300 "Method of diagnosing breast cancer ")。在小鼠活體腫瘤模型中特異性抑制FoxMl表達(dá)后，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都受到阻斷[10-12]。這 些證據(jù)表明，F(xiàn)oxMl可作為抑制腫瘤生長(zhǎng)的靶基因[13, 14]。因此，本發(fā)明提出針對(duì)FoxMl核酸和蛋A或 其功能片段設(shè)計(jì)制備的各類藥物，包括化學(xué)合成藥物、RNA干擾分子、小分子多肽片段、抗體等及其藥物 組合，通過(guò)抑制或降低FoxMl的表達(dá)、活性和功能，用于預(yù)防、治療或延緩人類腫瘤。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中 導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象[15]。外源雙 鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的反義鏈和多種核酸酶形成 了沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC), RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干 擾的過(guò)程。RNAi具有抑制基因表達(dá)的特異性和高效性，該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具，并在病 毒感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤的治療等方面發(fā)揮重要作用[16-19]。本發(fā)明運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)的RNA干 擾技術(shù)，通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中高量表達(dá)FoxMl特異性的shRNA，抑制腫瘤細(xì)胞中FoxMl的表達(dá)，從而達(dá)到抑 制腫瘤生長(zhǎng)的目的。外源基因不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞。通常把基因治療中將治療基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的運(yùn)載工具稱作基因轉(zhuǎn)移載 體，它分為病毒載體和非病毒載體兩大類[20， 21]。以人工改造的病毒作為基丙進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸工具稱為 病毒載體，它能與細(xì)胞的表面受體相互識(shí)別繼而把外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)。病毒具有一些獨(dú)特的性質(zhì)，如 多數(shù)病毒可感染特異的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不易降解等，因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目前已被用作 載體的病毒有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒等[20],尤其常用的是腺病毒。腺病毒是長(zhǎng)度約36Kb的線性雙鏈DNA無(wú)包膜病毒，可感染包括非分裂細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞，能制備獲得很高的病 毒滴度[22]?；蛑委煵捎玫南俨《据d體經(jīng)改造去除了部分病毒復(fù)制必須的基因(E1和E3區(qū)缺失)，使之 在野生環(huán)境下無(wú)法自我復(fù)制，確保了病毒載體的安全性并降低其免疫原性，獲得了插入外源基因的空間[23， 24]。腺病毒DNA不整合到宿主細(xì)胞基因組中，對(duì)人體無(wú)遺傳毒性，作為基因載體，重組腺病毒具有感染 效率高、外源基因高表達(dá)和安全的特點(diǎn)[25]并有效用于基礎(chǔ)科研[26-29]。目前，全世界基因治療臨床方 案所使用的載體系統(tǒng)中，重組腺病毒載體占26%,數(shù)目居各方案之首。其他可用于基因治療的病毒和非病 毒載體均存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)。腫瘤主要表現(xiàn)為細(xì)胞失去控制的異常增生，導(dǎo)致機(jī)體局部形成腫塊。惡性腫瘤除了表現(xiàn)腫瘤本身的持 續(xù)增殖之外，還會(huì)對(duì)鄰近正常組織的侵犯及經(jīng)血管、淋巴管和體腔轉(zhuǎn)移到身體其它部位，而這往往是腫瘤 致死的原因。世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2005年全球因惡性腫瘤死亡760萬(wàn)人，患惡性腫瘤病例2460萬(wàn)，估計(jì) 到2020年將達(dá)到3000萬(wàn)，每年將造成1000多萬(wàn)人死亡。過(guò)去的10年間，全球惡性腫瘤發(fā)病率增長(zhǎng)了 22 %，如果這一趨勢(shì)繼續(xù)，每年新病例預(yù)期將從2002年1090萬(wàn)增加至2020年1600萬(wàn)。它已經(jīng)成為常見且嚴(yán)重威脅人們生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤發(fā)病分子機(jī)制及細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理研究的深入，腫瘤的基因治療研究取得了巨大的進(jìn)展，根據(jù)腫瘤的類型和分布，采用了多種技術(shù)來(lái)抑制和消除腫瘤細(xì)胞，許多己經(jīng)應(yīng)用到了臨床試驗(yàn) [30-32]。目前基因臨床試驗(yàn)中，67%病例是對(duì)于腫瘤的基因治療，占所有基因臨床治療的絕大部分。主要參考文獻(xiàn)見《實(shí)質(zhì)審査參考資料》發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在尋找一種預(yù)防、治療或延緩人類腫瘤的方法。運(yùn)用RNAi技術(shù)，針對(duì)癌細(xì)胞增殖過(guò)程中一 個(gè)重要基因FoxMl,設(shè)計(jì)出針對(duì)該基因核酸序列的sh咖A片段，并將其與一種安全高效的病毒載體相結(jié)合， 使之可以直接在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄該片段，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)FoxMl的表達(dá)，而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的， 在此基礎(chǔ)上開發(fā)出一種新型的抗腫瘤藥物。本發(fā)明主要涉及到病毒基因治療重組載體的制備方法及其用于制備預(yù)防或/和治療腫瘤藥物的應(yīng)用。 本發(fā)明運(yùn)用DNA克隆技術(shù)，先構(gòu)建完整的針對(duì)FoxMl的shRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒，然后將其與病毒載體相結(jié) 合，構(gòu)建成一個(gè)能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)FoxMl的shRNA的基因治療重組體。該重組體選用的載體可以為 DNA病毒或RNA病毒的任一種，其優(yōu)選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體，最優(yōu)選載體 為腺病毒載體。該重組體由腺病毒載體與針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒構(gòu)建而成，定義為重組腺病毒體AdFoxMlshRNA， 其融合序列為腺病毒5基因組序列左側(cè)""GGA CCA CTT TCC CTA CTT TCG AAA AAG TAG GGA AAG TGG TCC—腺病毒5 基因組序列右側(cè) 其中1) 腺病毒5基因組序列左側(cè)和腺病毒5基因組序列右側(cè)見Genebank No: HC_001406的腺病毒5基因 組全序列2) 1-458:腺病毒左側(cè)臂堿基1-458，包括5' L-ITR和病毒包裝信號(hào)3) 459-572:病毒構(gòu)建所需序列，包括attBl位點(diǎn)，堿基512-5364) 573-836: U6啟動(dòng)子5) 837-879: FoxMl shRNA6) 880-885: Pol III終止子7) 886-931:病毒構(gòu)建所需序列，包括attB2位點(diǎn)，堿基890-9148) 932-30931:腺病毒右側(cè)臂，其932位堿基位于腺病毒5基因組序列正向3513位堿基，E3區(qū)缺失， 包括3' R-ITR。該重組體的針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒是由U6啟動(dòng)子+表達(dá)FoxMl特異性shRNA的雙鏈oligo+Pol III終止子構(gòu)成的特征序列。本發(fā)明的重組體是通過(guò)位點(diǎn)特異性同源重組獲得的，首先構(gòu)建含attBl重組位點(diǎn)/針對(duì)FoxMl的shRNA 表達(dá)盒/ a B2重組位點(diǎn)的質(zhì)粒pFoxMlshRNA,再與含有腺病毒左側(cè)堿基1-458/attRl重組位點(diǎn)/氯霉素抗 性基因(CmR)和大腸桿菌ccdB基因/ attR2重組位點(diǎn)/腺病毒右側(cè)堿基3513-35935 (E3缺失)的pAd質(zhì) 粒在體外進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組體pAdFoxMlshRNA，隨后經(jīng)內(nèi)切酶PacI線性化 去除原核質(zhì)粒序列，再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得重組腺病毒體AdFoxMlshKNA。根據(jù)上述方案，首先通過(guò)人工合成的方法合成DNA序列CAC CGG GAC CAC TTT CCC TAC TTT CGA AAA AGT AGG GAA AGT GGT CC和互補(bǔ)鏈MA AGG ACC ACT TTC CTA CTT TTT CGA AAG TAG GGA AAG TGG TCC C，經(jīng) 變性與復(fù)性后形成雙鏈DNA，克隆成質(zhì)粒pFoxMlshRNA,該質(zhì)粒含U6啟動(dòng)子和attBl、 attB2重組位點(diǎn)。 合成得到的雙鏈DNA位于U6啟動(dòng)子下游，構(gòu)成針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒。測(cè)序驗(yàn)證后，運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染 技術(shù)證實(shí)該質(zhì)粒在腫瘤細(xì)胞中能通過(guò)表達(dá)針對(duì)FoxMl的shRNA而抑制FoxMl的表達(dá)。運(yùn)用質(zhì)粒pFoxMlshRNA和含有腺病毒左側(cè)堿基1-458/attRl重組位點(diǎn)/氯霉素抗性基因(CmR)和大腸 桿菌ccdB基因/ attR2重組位點(diǎn)/腺病毒右側(cè)堿基3513-35935 (E3缺失)的pAd質(zhì)粒，通過(guò)重組酶反應(yīng)， 在體外進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組(attBl與attRl之間、attB2與attR2之間)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組體 質(zhì)粒pAdFoxMlshRNA。測(cè)序驗(yàn)證后，運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)證實(shí)該質(zhì)粒能抑制FoxMl的表達(dá)。進(jìn)一步大量擴(kuò)增pAdFoxMlshRNA質(zhì)粒，經(jīng)內(nèi)切酶Pacl線性化，再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)包裝成腺 病毒，獲得重組腺病毒體AdFoxMlshRNA。該重組FoxMlshRNA腺病毒載體具有下列特點(diǎn) 它是由腺病毒載體和FoxMlshRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒兩部分構(gòu)成，1. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)其本質(zhì)是一個(gè)活的重組腺病毒體，不同于現(xiàn)有的化學(xué)合成藥物、中藥、基因工程藥物 等。它是直接實(shí)現(xiàn)目的DNA片段在體內(nèi)表達(dá)，生物學(xué)活性高，可有效達(dá)到治療作用；腺病毒載體轉(zhuǎn)染率高、 可制備高效價(jià)的病毒顆粒，宿主范圍廣，安全性好，致病性低，尤其是經(jīng)改建后的腺病毒載體免疫原性大 大下降，使目的基因易于在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定、持久地轉(zhuǎn)錄表達(dá)；FoxMlshRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒是用U6啟動(dòng)子直接啟 動(dòng)FoxMlshRNA的轉(zhuǎn)錄，末端是Poly III RNA終止子信號(hào)，從而構(gòu)成一個(gè)完整的U6啟動(dòng)子-FoxMlshRNA RNAi 轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒(U6-FoxMlshRNA RNAi expression cassette),可導(dǎo)致FoxMlshRNA在靶細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄。2. 應(yīng)用特點(diǎn)該重組AdFoxMlshRNA腺病毒載體為廣譜抗瘤藥，其作用機(jī)理為(一)通過(guò)直接抑制 腫瘤細(xì)胞內(nèi)FoxMl的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)程停止，達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的；(二)已發(fā)表實(shí)驗(yàn)證據(jù)表 明降低腫瘤組織FoxMl的表達(dá)可以抑制腫瘤內(nèi)新生血管的形成，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的；(三)降低腫 瘤細(xì)胞內(nèi)FoxMl的表達(dá)可以促使細(xì)胞對(duì)DNA損傷更為敏感，增進(jìn)DNA損傷劑和放射性療法的治療效果。利 用該重組AdFoxMlshRNA腺病毒載體進(jìn)行的針對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞系增殖和成瘤抑制實(shí)驗(yàn)表明，該重組體可 以對(duì)肝癌、肺癌、子宮頸癌、骨肉瘤、鼻咽癌等的增殖有明顯的抑制作用。同時(shí)，抑制FoxMl表達(dá)增高腫 瘤細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的水平并增進(jìn)DNA損傷劑造成的DNA損傷效果。本發(fā)明所制備的重組AdFoxMlshRNA腺病毒體，通過(guò)轉(zhuǎn)染到基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中培養(yǎng)、繁殖， 濃縮純化即可成為用于臨床的重組腺病毒AdFoxMlshRNA抗癌注射液。其中本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用的293細(xì)胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，2007年3月28日從ATCC訂購(gòu))來(lái) 源于經(jīng)5型腺病毒(Ad5) DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎上皮細(xì)胞獲得，含有Ad5 5'端的11%的基因組(包括E1A、 E1B基因)。該細(xì)胞對(duì)腺病毒的感染和生長(zhǎng)是高度許可的。應(yīng)用該重組FoxMlshRNA腺病毒體在多種人源腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行的研究表明，AdFoxMlshRNA感染鼻咽癌 細(xì)胞CNE、肝癌細(xì)胞H印G2、子宮頸癌細(xì)胞Hela、肺癌細(xì)胞A549、骨肉瘤細(xì)胞U20S等細(xì)胞株，與對(duì)照組 相比，腫瘤細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果差異明顯，實(shí)例見附圖7和圖9一12，同時(shí)，AdFoxMlshRNA 能明顯降低CNE鼻咽癌細(xì)胞的成瘤能力，見附圖8。另外，AdFoxMlshRNA感染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致FoxMl表達(dá)降 低后，胞內(nèi)DNA損傷程度增高，同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥劑造成DM損傷的敏感性增加，圖13中顯示 AdFoxMlshRNA感染后，腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大量DNA斷裂；經(jīng)DNA損傷藥劑Etoposide (20 mM)造成的DNA損 傷后24小時(shí)，被AdFoxMlshRNA感染的細(xì)胞與未感染細(xì)胞或?qū)φ詹《靖腥镜募?xì)胞相比，胞內(nèi)未被修復(fù)的DNA 斷裂明顯增多，暗示本藥物可以增加臨床腫瘤治療中化療與放療的效果。本發(fā)明的貢獻(xiàn)在于，利用"RNA千擾"原理，構(gòu)建U6啟動(dòng)子-FoxMlshRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒并克隆到腺病毒 El缺失株中，通過(guò)該病毒感染腫瘤細(xì)胞或組織，使其在腫瘤內(nèi)表達(dá)出FoxMl的干擾序列，抑制FoxMl的表 達(dá)，進(jìn)而阻滯細(xì)胞增殖過(guò)程，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。"RNA干擾"藥物被認(rèn)為是未來(lái)腫瘤治療的一種非7常有潛力的藥物。直接利用體外合成的RNA干擾藥物進(jìn)行的抗腫瘤研究，存在成本高、KNA不穩(wěn)定和易降 解、藥效作用時(shí)間短等問(wèn)題，使其實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用存在較大的難度。本發(fā)明利用重組腺病毒載體攜帶做A干 擾序列，直接在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，解決了直接合成RNA干擾藥物存在的一系列應(yīng)用難題。運(yùn)用重組MFoxMlshRNA腺病毒載體進(jìn)行的抗腫瘤研究表明，該腺病毒可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、高效 地表達(dá)FoxMlshRNA,明顯降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)FoxMl的表達(dá)水平，使腫瘤細(xì)胞的增殖停滯。同時(shí)，由丁-降低 FoxMl的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，使其對(duì)放射性照射或DNA損傷藥劑造成的DNA損傷更 為敏感，因而在臨床腫瘤治療中可結(jié)合放射性療法或化療，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)己有傳統(tǒng)治療手段的敏感度， 提高治療效果。另外，已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明FoxMl參與新t血管生成，抑制FoxMl的表達(dá)可以降低腫瘤內(nèi)新 生血管的生成，因此，直接將該重組體注射到腫瘤組織內(nèi)，抑制FoxMl表達(dá)有助T"降低腫瘤內(nèi)新生血管生 成，從而抑制腫瘤整體生長(zhǎng)的目的，提高腫瘤患者的生存率。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了將外源性RNA干擾序列在細(xì)胞 內(nèi)高效表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖特異性基因FoxMl的功能，阻斷腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，使得腫瘤基因 治療的S的得以實(shí)現(xiàn)。


圖1是本發(fā)明的重組AdFoxMlshRNA腺病毒體的構(gòu)建與制備技術(shù)路線框圖。 圖2是本發(fā)明的重組AdFoxMlshRNA腺病毒體的構(gòu)建過(guò)程示意圖。圖3是所獲pAdFoxMlsh柳A質(zhì)粒，經(jīng)純化后Pacl酶切的瓊脂糖凝膠分析結(jié)果。泳道1為分子量標(biāo)A;, 泳道2為pAdFoxMlshRNA/PacI限制性內(nèi)切酶酶切樣品。圖4是CsCl2密度梯度離心純化的重組AdFoxMlshRNA腺病毒體及病毒滴度測(cè)定和所制備病^中g(shù)制W 腺病毒的檢測(cè)。圖5是已純化重組AdFoxMlsh,A腺病毒體感染U20S細(xì)胞后,提取細(xì)胞裂解物,后經(jīng)ffestern Wotting 測(cè)定FoxMl蛋白水平的分析結(jié)果。圖中1，人U20S骨肉瘤細(xì)胞，2, AdFoxMlshRNA(小鼠)，感染U20S細(xì) 胞3天后，3, AdFoxMlshRNA(人〉,感染U20S細(xì)胞3天后。圖6是重組AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞中FoxMl的表達(dá)的分析結(jié)果。圖7是重組AdFoxMlshRNA腺病毐體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞增殖的分析結(jié)果。圖8是重組AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞成瘤能力的軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果。 圖9是重組AdFoxMlshRNA腺病毒體對(duì)H印G2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的曲線示意圖。 圖10是重組AdFoxMlshRNA腺病毒體對(duì)Hela子3頸癌細(xì)胞增殖抑制作用的曲線示意圖。 圖11是i組AdFoxMlshRNA腺病S體對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖抑制作W的曲線示意圖。 圖12是重組AdFoxMlshRNA腺病毒體對(duì)U20S骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用的曲線示意圖。 圖13是重組AdFoxMlshKNA腺病毒體增高腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥劑造成DNA損傷的敏感性的yH2AX foci 免疫染色結(jié)果。具體實(shí)施方法下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋和說(shuō)明，對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1，構(gòu)建重組腺病毒體AdFoxMlshRNA及其鑒定本發(fā)明的重組AdFoxMlshRNA腺病毒體的構(gòu)建與制備技術(shù)路線見圖1。1、 根據(jù)FoxMl的siRNA序列，人工合成FoxMlshRNA的DNA正鏈CAC CGG GAC CAC TTT CCC TAC TTT CGA AM AGT AGG GAA AGT GGT CC和互補(bǔ)鏈AAA AGG ACC ACT TTC CTA CTT TTT CGA AAG TAG GGA AAG TGG TCC C。經(jīng)變性與復(fù)性后形成雙鏈DNA,聯(lián)接形成質(zhì)粒pFoxMlshRNA: FoxMlshRNA雙鏈DNA位于U6啟動(dòng)子 下游，構(gòu)成針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒。2、 將pFoxMlshRNA質(zhì)粒與的pAd質(zhì)粒進(jìn)行體外同源重組反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)4'C孵育30分鐘、 42'C熱休克45秒鐘后，加1ml LB培養(yǎng)液37'C振搖1小時(shí)；將菌鋪到LB瓊脂培養(yǎng)板，待其上長(zhǎng)出克隆子， 用滅菌牙簽挑取單個(gè)細(xì)菌克隆，然后放入干凈的含有LB的培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒， 獲得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pAdFoxMlshRNA (圖2)。3、 經(jīng)CsCl2密度梯度離心純化大量制備pAdFoxMlshRNA質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶PacI將該質(zhì)粒酶切 過(guò)夜，瓊脂糖膠電泳分析，可見AdFoxMlshR跳基因組片段(圖3)。4、 從pAdFoxMlshRNA/PacI酶切電泳后的瓊脂糖膠中分離獲得AdFoxMlshRNA基因組片段，用脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染方法將該片段轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞。7天后細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染病^E效應(yīng)，收集細(xì)胞和上清。經(jīng)37'C、 -8(TC 反復(fù)凍融裂解細(xì)胞三次，2000rpm離心10分鐘，取上清，該上清中含第一代AdFoxMlshRNA腺病毒體。運(yùn) 用該上清感染更多量的293細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增病毒，3天后收集出現(xiàn)病變效應(yīng)的細(xì)胞。凍融裂解細(xì)胞三次后，病 毒樣本進(jìn)行CsCl2密度梯度離心二次，條件為第一次，下層CsCh密度為L(zhǎng)4g/L，上層CsCl2密度為1.2 g/L ， 23，000rpm 4'C離心1.5小時(shí)，收集腺病毒體分離帶；第二次，同樣條件離心16小時(shí)后收集腺病毒 體分離帶(圖4, A箭頭所示)。病毒樣品經(jīng)4'C透析4小時(shí)，用0. 25mn的濾膜過(guò)濾除菌分裝，一8(TC保存。5、 運(yùn)用組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量法測(cè)定AdFoxMlshRNA病毒滴度(1)用完全培養(yǎng)基稀釋病毒；(2)制 備1X105 cells/ml的293細(xì)胞懸液，以100nl/孔接種于96孔板；(3)每排前10孔用不同稀釋倍數(shù)(10— 5至10—12)的病毒100 jal進(jìn)行感染，后2孔加入lOOpl完全培養(yǎng)基做陰性對(duì)照；(4)被感染細(xì)胞置于5%C02 孵箱內(nèi)37。C培養(yǎng)10d，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察，判斷并記錄每排細(xì)胞病變效應(yīng)情況，只要有少量細(xì) 胞發(fā)生病變效應(yīng)即為陽(yáng)性。按照下述公式計(jì)算病毒滴度T=101+d<s—a5)IU/ml，其中d-Log,。稀釋倍數(shù)，S二從 第一次稀釋起的陽(yáng)性比率之和。所得AdFoxMlshRNA病毒滴度結(jié)果見圖4， B, T=10"=2.0 X 10s IU/ml。6、 所制備AdFoxMlshRNA病毒中復(fù)制型腺病毒的檢測(cè)接種A549細(xì)胞于12孔板(4 X 105 cells/孔)， 5%0)2孵箱37'C培養(yǎng)過(guò)夜，將3 X 10'°病毒顆粒稀釋到120 ml完全培養(yǎng)基中后，感染A549細(xì)胞(1 ml/孔， 共10個(gè)12孔板)，另設(shè)野生型腺病毒Ad5感染板(陽(yáng)性對(duì)照)和非處理板(陰性對(duì)照)。培養(yǎng)2周后顯微鏡下觀測(cè)是否出現(xiàn)病變效應(yīng)。結(jié)果如圖4， C所示，10個(gè)板都無(wú)病變效應(yīng)形成，表明所制備AdFoxMlshRNA 病毒中復(fù)制型腺病毒水平低于1復(fù)制型腺病毒/3 X 10"病毒顆粒，符合SFDA標(biāo)準(zhǔn)。圖4， D為陽(yáng)性對(duì)照。 7、 AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制腫瘤細(xì)胞中FoxMl的表達(dá)。運(yùn)用AdFoxMlshRNA腺病毒體感染U20S細(xì) .胞(10 IU/cel1) ，3天后收集細(xì)胞制備蛋白，取100pg蛋白樣品上樣，運(yùn)用Western Blotting方法分析 FoxMl的蛋白水平。同時(shí)以未處理細(xì)胞和小鼠FoxMl特異性的AdFoxMlshRNA (Mouse)感染細(xì)胞為對(duì)照。 p actin蛋白水平作為上樣對(duì)照。結(jié)果見圖5，證實(shí)AdFoxMlshRNA腺病毒體能抑制U20S腫瘤細(xì)胞中FoxMl 的表達(dá)。實(shí)施例2， AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞的增殖及成瘤鼻咽癌在我國(guó)是常見的惡性腫瘤之一，為耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤的78. 08%， 占上呼吸道癌的92. 99%。鼻咽癌原發(fā)于鼻咽粘膜上皮，具有原發(fā)部位隱蔽、不易被早期發(fā)現(xiàn)、病理分化差、 惡性程度高、易呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。95%以上的鼻咽癌惡性程度高，生長(zhǎng)快，容易出現(xiàn)淋巴 結(jié)或血道轉(zhuǎn)移，對(duì)這種晚期腫瘤，傳統(tǒng)的放射治療效果較差。1、 AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞中FoxMl的表達(dá)。運(yùn)用AdFoxMlshRNA腺病毒體感染鼻 咽癌細(xì)胞株CNE (2000病毒顆粒/細(xì)胞)，3天后收集樣品制備總RNA和蛋白裂解液，采用半定量RT—PCR 方法和Western Blotting方法檢測(cè)FoxMl表達(dá)水平。與CNE細(xì)胞及對(duì)照病毒AdGFP感染細(xì)胞相比， AdFoxMlshRNA感染樣品中FoxMl mRNA水平明顯降低(圖6， A);同時(shí)，F(xiàn)oxMl的蛋白水平液明顯下降(圖 6， B)，說(shuō)明AdFoxMlshRNA腺病毒體能有效抑制CNE細(xì)胞中FoxMl的表達(dá)。2、 AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞的增殖。AdFoxMlshRNA感染CNE細(xì)胞(2000病毒顆粒 /細(xì)胞)后，顯微觀測(cè)可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)細(xì)胞增殖減緩的外形特征，胞體增大(圖7， A)。 用AdFoxMlshRNA (2000病毒顆粒/細(xì)胞)感染CNE細(xì)胞，起始細(xì)胞數(shù)為1 X 105個(gè)，隨后每天計(jì)數(shù)，確 定細(xì)胞增殖速度，同時(shí)用AdGFP對(duì)照病毒感染細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，AdFoxMlshRNA能明顯抑制 CNE細(xì)胞的增殖(圖7， B，林代表T-test統(tǒng)計(jì)分析p值〈0. 01, *林代表T-test統(tǒng)計(jì)分析p值〈0. 001)。3、 AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制CNE鼻咽癌細(xì)胞的成瘤。釆用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定AdFoxMlshRNA 對(duì)CNE細(xì)胞成瘤能力的影響AdFoxMlshRNA感染1000個(gè)CNE細(xì)胞(2000病毒顆粒/細(xì)胞)，與0. 35%瓊脂 培養(yǎng)基混合后，加入60mm細(xì)胞培養(yǎng)板(鋪好0.7%瓊脂培養(yǎng)基做底層)。待上層瓊脂凝固后，置入5% C02 培養(yǎng)箱，37'C培養(yǎng)10 — 14天，在體式顯微鏡下觀察集落形成情況，同時(shí)用CNE細(xì)胞和AdGFP對(duì)照病毒感 染細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果表明，AdFoxMlshRNA能明顯抑制CNE胞的成瘤能力(圖8， A)，通過(guò)集落計(jì)數(shù)， AdFoxMlshRNA感染組集落數(shù)目明顯低于CNE細(xì)胞組和AdGFP病毒感染對(duì)照組(圖8， B， ***代表T-test 統(tǒng)計(jì)分析p值〈0. 001)。實(shí)施例3， AdFoxMlshRNA腺病毒體抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖運(yùn)用肝癌細(xì)胞H印G2、子宮頸癌細(xì)胞Hela、肺癌細(xì)胞A549、骨肉瘤細(xì)胞U20S等細(xì)胞株，測(cè)定 AdFoxMlshRNA對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。用AdFoxMlshRNA (2000病毒顆粒/細(xì)胞)分別感染上述 腫瘤細(xì)胞，每天計(jì)數(shù)確定細(xì)胞生長(zhǎng)速度。與AdLacZ對(duì)照病毒感染組相比，腫瘤細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制， 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果差異明顯，結(jié)果見圖9_12 (*代表T-test統(tǒng)計(jì)分析p值<0. 05， **代表T-test統(tǒng)計(jì)分析p 值<0. 01，術(shù)代表T-test統(tǒng)計(jì)分析p值<0. 001)。實(shí)施例4, AdFoxMlshRNA腺病毒體增高腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥劑造成DNA損傷的敏感性AdFoxMlshRNA感染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致FoxMl表達(dá)降低后，胞內(nèi)DNA損傷程度增高，同時(shí)腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損 傷藥劑及放射性照射造成DNA損傷的敏感性增加，圖13中顯示AdFoxMlshRNA感染后，腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大 量DNA斷裂(由yH2AX foci免疫染色確定)；經(jīng)DNA損傷藥劑Etoposide(20 mM)造成的DNA損傷后24小 時(shí)，被AdFoxMlshRNA感染的細(xì)胞與未感染細(xì)胞或?qū)φ詹《靖腥镜募?xì)胞相比，胞內(nèi)未被修復(fù)的DNA斷裂明 顯增多，暗示本藥物可以增加臨床腫瘤治療中化療和放療的效果。核苷酸序列表具有抑制人FoxMl表達(dá)的功能的小分子干擾RNA (siRNA)序列: 5' - GGA CCA CUU UCC CUA CUU U -3'
權(quán)利要求
1、一種預(yù)防、治療或延緩人類腫瘤的方法，其特征在于，針對(duì)人腫瘤生長(zhǎng)基因FoxM1核酸和蛋白或其功能片段設(shè)計(jì)制備的各類藥物，包括化學(xué)合成藥物、RNA干擾分子、小分子多肽片段、抗體等及其藥物組合，抑制或降低FoxM1的表達(dá)、活性和功能。
2、 如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于， 一種病毒載體與能表達(dá)抑制FoxMl的特定短發(fā)夾RNA(shRNA)而抑制腫瘤生長(zhǎng)的重組體，該重組體是由DNA克隆技術(shù)構(gòu)建的病毒載體與針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu)建成一個(gè)能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)FoxMl的shRNA的基因治療載體。
3、 如權(quán)利要求2所述的重組體，其特征在于，該重組體的載體是腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體。
4、 如權(quán)利要求3所述的重組體，其特征在于，它是由腺病毒載體與針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒構(gòu)建而成，其融合序列為腺病毒5基因組序列左側(cè)""GGA CCA CTT TCC CTA CTT TCG AAA AAG TAG GGA AAG TGG TCC一腺病毒5基因組序列右側(cè)其中-1) 腺病毒5基因組序列左側(cè)和腺病毒5基因組序列右側(cè)見Cenebank No: HC—001406的腺病毒5基因組全序列2) 1-458:腺病毒左側(cè)臂堿基1-458，包括5' L-ITR和病毒包裝信號(hào)3) 459-572:病毒構(gòu)建所需序列，包括attBl位點(diǎn)，堿基512-5364) 573-836: U6啟動(dòng)子5) 837-879: FoxMl shRNA6) 880-885: Pol III終止子7) 886-931:病毒構(gòu)建所需序列，包括attB2位點(diǎn)，堿基890-9148) 932-30931:腺病毒右側(cè)臂，其932位堿基位丁腺病毒5基因組序列正向3513位堿基，E3區(qū)缺失，包括3' R-ITR。
5、 如權(quán)利要求2所述的重組體，其特征在于，該重組體的針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒是由U6啟動(dòng)子十表達(dá)FoxMl特異性shRNA的雙鏈oligo+Po1 III終止子構(gòu)成的特征序列。
6、 如權(quán)利要求2所述的重組體,其特征在于，該重組體的針對(duì)FoxMl的shRM序列來(lái)源于能抑制FoxMl表達(dá)的小分子干擾RNA (siRNA)序列GGA CCA CUU UCC CUA CUU U。 FoxMl特異性的shRNA表達(dá)盒中雙鏈oligo序列是由FoxMlsiRNA序列+CGAA+FoxMlsiRNA反義序列組成的DNA序列。
7、 如權(quán)利要求2所述的重組體，其特征在于.該重組體的針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒中雙鏈oligo序列還可由FoxMlsiRNA序列+任意4至15核苷酸+FoxMlsiRNA反義序列組成。
8、 如權(quán)利要求3所述的重組體，其特征在于，該重組體是通過(guò)位點(diǎn)特異性同源重組獲得的，首先構(gòu)建含attBl重組位點(diǎn)/針對(duì)FoxMl的shRNA表達(dá)盒/ attB2重組位點(diǎn)的質(zhì)粒pFoxMlshRNA,再與含有腺病毒左側(cè)堿基1-458/attRl重組位點(diǎn)/氯霉素抗性基因(CmR)和大腸桿菌ccdB基因/ attR2重組位點(diǎn)/腺病毒右側(cè)堿基3513-35935 (E3缺失)的pAd質(zhì)粒在體外進(jìn)行位點(diǎn)特異性同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組體pAdFoxMlshRNA,隨后經(jīng)內(nèi)切酶Pacl線性化去除原核質(zhì)粒序列，再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得重組腺病毒體AdFoxMlsh腿。
9、 如權(quán)利要求1所述的方法用于制備治療各種惡性腫瘤的藥物及預(yù)防腫瘤的發(fā)生和手術(shù)切除后的腫瘤再生的藥物。
10、 如權(quán)利要求2所述的重組體用于制備進(jìn)行靜脈注射、動(dòng)脈注射，瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水內(nèi)注射的藥物。
全文摘要
針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Forkhead Box M1(FoxM1)核酸和蛋白或其功能片段制備的各類藥物，包括化學(xué)合成藥物、RNA干擾分子、小分子多肽片段、抗體等及其藥物組合，通過(guò)抑制FoxM1的表達(dá)、活性和功能，阻斷腫瘤生長(zhǎng)，用于預(yù)防、治療人類腫瘤。運(yùn)用病毒載體，構(gòu)建能在腫瘤中表達(dá)抑制FoxM1的短發(fā)夾RNA(shRNA)的基因治療載體。本發(fā)明依據(jù)抑制FoxM1表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了能表達(dá)針對(duì)FoxM1的shRNA的腺病毒載體；該載體感染腫瘤細(xì)胞后高量表達(dá)特定的shRNA，并隨后被加工成針對(duì)FoxM1 mRNA分子的siRNA，抑制FoxM1表達(dá)而阻斷腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明的腺病毒載體，可制備成臨床級(jí)基因治療制品，用于治療和預(yù)防人類惡性腫瘤。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101596316SQ20091004367
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
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