專利名稱：一種cik細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種CIK細(xì)胞及其制備方法和 細(xì)胞制劑。
背景技術(shù)：
腫瘤生物治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種治療模式，CIK細(xì)胞 (Cytokine induced killer cell, CIK)治療是目前國際上公認(rèn)的最有效的腫瘤生 物治療手段。
CIK細(xì)胞是在體外條件下，將人外周血單個核細(xì)胞用多種細(xì)胞因子(如 抗CD3McAb、 IL-2、 IFN-Y 、 IL-1等)共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異 質(zhì)細(xì)胞。由于其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞的表面標(biāo)志(TCR- a / 3 ， CD3)， 也有NK細(xì)胞的表面標(biāo)志(CD56)，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK 細(xì)胞的非MHC (主要組織相容性復(fù)合體)限制性殺瘤優(yōu)點。CIK細(xì)胞中的 主要效應(yīng)細(xì)胞CD3CD56細(xì)胞在正常人外周血中極為罕見，僅1% 5%，在 體外經(jīng)多因子培養(yǎng)28 30天，CD3CD56細(xì)胞迅速增多，較培養(yǎng)前升幅達(dá) 1 000倍以上。將CIK細(xì)胞注入患者體內(nèi)來治療腫瘤，可以在沒有損傷機(jī)體 免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并且調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的 免疫功能，最大可能地恢復(fù)細(xì)胞正常的生長調(diào)節(jié)，為徹底地進(jìn)行腫瘤治療提 供了新的途徑。CIK細(xì)胞治療法是由美國斯坦福大學(xué)骨髓移植于1991年建 立(Schmidt-WolfIGH， etal. J. Exp. Med. 1991; 174:139-149)。目前該方法在 國內(nèi)外腫瘤治療中已得到廣泛應(yīng)用。與過去過繼免疫治療所使用過的淋巴因 子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine-activated killer, LAK)和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)相比，CIK具有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力和更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞作用，且毒副作用很小。
CIK細(xì)胞治療腫瘤的療效主要取決于輸注細(xì)胞的數(shù)量和殺傷活性。因為 CIK細(xì)胞為一種以T淋巴細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，其中對腫瘤有殺傷作用的
主要是靠CD3+CD56+和CD8+這兩種細(xì)胞，因此，提高CD3+CD56+和CD8+ 的比例以及提高體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞的數(shù)量對提高腫瘤治療效果非常重要。目 前傳統(tǒng)的方法是將分離得到的患者外周血單個核細(xì)胞，用干擾素-Y刺激 24h，隨后再用CD3單抗、IL-1 a 、 IL-2等剌激因子進(jìn)行誘導(dǎo)。這些方法的 CIK細(xì)胞的增殖力較低，CIK細(xì)胞中的CD3+CD56+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞的比例 不高，對腫瘤的治療效果有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的方法所得CIK細(xì)胞存在增殖 力較低，CD3+CD56+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞的比例不高的不足，提供一種新的 制備方法以及所制得CIK細(xì)胞，該CIK細(xì)胞的增殖力較強(qiáng)，CD3+CD56+和 CD8+細(xì)胞的比例較高，具有更佳的治療腫瘤的效果。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)1) CIK細(xì)胞制備中，干擾 素-Y刺激外周血單個核細(xì)胞(PBMC)后很多細(xì)胞會發(fā)生凋亡，也就是說干 擾素-Y刺激是造成這些細(xì)胞調(diào)亡的重要原因，這直接影響了細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò) 增，而植物血凝素(PHA)對PBMC的誘導(dǎo)效果和干擾素-Y相同，干擾素-Y可以完全由PHA代替用于制備CIK細(xì)胞；2)抗CD3單抗與抗CD28單 抗聯(lián)合共同誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，比抗CD3單抗一種單抗誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞具有更 高的增殖力；3)將抗CD3單抗與抗CD28單抗包被在培養(yǎng)瓶壁上，比游離 狀態(tài)的效果更好，所需的單抗總量降低，而又增加了CIK細(xì)胞的增殖力。因 此，本發(fā)明人從以上三方面對現(xiàn)有的CIK細(xì)胞制備方法進(jìn)行改進(jìn)，終于令人 驚喜的獲得了增殖力強(qiáng)、CD3+CD56+和CD8+細(xì)胞的比例高、腫瘤的治療效 果更好的CIK細(xì)胞，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是 一種制備 CIK細(xì)胞的方法，包括以下步驟將分離好的單個核細(xì)胞置于含有植物血凝
素的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 72小時后，移植到包被有抗CD3單抗和抗CD28 單抗的培養(yǎng)瓶中，同時加入含IL-lci和IL-2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5 15天， 其中每隔2~3天分瓶培養(yǎng)一次。
根據(jù)本發(fā)明，所述的植物血凝素的終濃度較佳的為1U/ml。植物血凝素 可以刺激培養(yǎng)24 72小時，較佳的刺激48小時。因為一般情況，T淋巴細(xì) 胞的增殖周期是48 60小時，因此刺激48小時，就能夠保證細(xì)胞開始增殖。 所述的培養(yǎng)液較佳的是GT-T503或1640培養(yǎng)基。所述的抗CD3單抗和抗 CD28單抗較佳的包被密度是采用兩種單抗的濃度各為1~2 pg/ml的包被液 包被。當(dāng)包被濃度小于1 )Lig/ml，對細(xì)胞增殖有影響，增殖倍數(shù)降低；大于 2pg/ml后對提高增殖倍數(shù)沒有明顯影響，由于抗CD3、 CD28單抗價格昂貴， 增大濃度就將增加成本，最佳的濃度為1嗎/ml。所述的IL-1 ct的終濃度較 佳的為20U/ml， IL-2的終濃度較佳的為300U/ml。繼續(xù)培養(yǎng)5~15天，最佳 的繼續(xù)培養(yǎng)10天。一般繼續(xù)培養(yǎng)20天以后CIK細(xì)胞的增殖力、CD3+CD56+、 CD8+兩種細(xì)胞的比例不會再增加，15天后CIK細(xì)胞的殺傷能力將逐漸下降， 因此選擇15天收獲細(xì)胞，進(jìn)行臨床應(yīng)用。繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)到3 5 X 108 細(xì)胞/ml時，較佳的應(yīng)該分瓶培養(yǎng)， 一般每隔2~3天分瓶培養(yǎng)一次，較佳的 每2天就分瓶培養(yǎng)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所釆用的技術(shù)方案之二是 一種如上所述的方 法所制備的CIK細(xì)胞。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是 一種CIK細(xì)胞制 劑，包括CIK細(xì)胞和IL-2，其中，所述的CIK細(xì)胞為如上所述的CIK細(xì)胞。
本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。 本發(fā)明制備出的CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性 (1)細(xì)胞組成T淋巴細(xì)胞(CD3+)大于90%。 T淋巴細(xì)胞中各亞群圍， 一般為CD3+CD56+細(xì)胞為40~60%， CD8+細(xì)胞為65 85%， CD3-CD56+細(xì)胞為25~45%。
(2) 增殖數(shù)量高新型人體CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法擴(kuò)增的數(shù)量比傳統(tǒng)CIK 細(xì)胞明顯強(qiáng)大，體外培養(yǎng)10天后前者細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)是后者的3~5倍，是LAK 細(xì)胞的100倍左右。
(3) 殺瘤活性高用MTT法檢測二者的殺傷活性，結(jié)果新型人體 CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法誘導(dǎo)出的CIK細(xì)胞比傳統(tǒng)CIK細(xì)胞明顯強(qiáng)大，前者是后 者的3 5倍。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下該方法制備出的CIK細(xì)胞具 有細(xì)胞增殖明顯提高，CD8細(xì)胞比例較大增加，抗瘤譜廣，殺瘤活性增強(qiáng)等 特點。對手術(shù)后的腫瘤患者可有效預(yù)防轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；與放化療聯(lián)合應(yīng)用可降低 前者的毒副作用，增強(qiáng)患者耐受性，提高療效；對晚期患者可明顯延長生命 周期，提高生活質(zhì)量。
具體實施例方式
下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施 例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
實施例1本發(fā)明的CIK細(xì)胞的制備
(1) 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)采集制備 用血細(xì)胞分離機(jī)在無菌條件下采集腫瘤患者抗凝血，生理鹽水對倍稀
釋，比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液(中科院天津血研所生物科技公司產(chǎn)品) 與稀釋血按l: 2加入離心管中，離心2500 rpm/30min，分離得PBMC，用 Hanks液洗滌2次，用無血清培養(yǎng)液GT-T503調(diào)整細(xì)胞濃度，使得細(xì)胞濃度 為2Xl()S細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
(2) 本發(fā)明的新型人體CIK細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增
6將分離獲得的細(xì)胞懸液置于含有PHA(植物血凝素)IO U/ml的GT-T503 培養(yǎng)液中，放入225cn^的培養(yǎng)瓶(美國CORNING公司)中，150 ml/瓶， 置入37。C， 5% (v/v) C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，移植到包被有抗CD3單抗 和抗CD28單抗的225cm2的培養(yǎng)瓶中，同時加入CIK細(xì)胞誘導(dǎo)液(含終濃 度100 U/ml的IL-1 a禾n 100 U/ml的IL-2的GT-T503培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)48 h， 每24 h觀察細(xì)胞生長情況，并做細(xì)胞計數(shù)。離心去上清，在如上包被的225cm2 的培養(yǎng)瓶中用上述CIK細(xì)胞誘導(dǎo)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2Xl(^細(xì)胞/ml繼續(xù)培 養(yǎng)。每隔48小時，按上述細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)增培養(yǎng)一次，培養(yǎng)十天后收獲細(xì) 胞(共分瓶擴(kuò)增培養(yǎng)5次)。
其中的抗CD3、 CD28單抗包被方法為在GT-T503培養(yǎng)液中加入抗 CD3、 CD28單抗(美國Sigma公司)，制備成抗CD3、 CD28單抗?jié)舛确謩e 為l pg/ml的包被液，將50 ml該包被液置入225cmn咅養(yǎng)瓶中，4。C過夜或 37°C4h，棄去包被液，將培養(yǎng)瓶口旋緊備用。
對比例1傳統(tǒng)的CIK細(xì)胞的制備
按照參考文獻(xiàn)(任歡，邢淑賢等CIK細(xì)胞體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性 的實驗研究，中國腫瘤生物治療雜志。1999， 6(1): 17-21)中的方法進(jìn)行傳 統(tǒng)CIK細(xì)胞培養(yǎng)分離外周血PBMC細(xì)胞，將分離的細(xì)胞置入含有干擾素-Y (濃度為1000U/ml)，濃度5% (v/v) C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，加入抗 CD3單抗(10jig/ml)， IL-la (100U/ml)， IL-2 (100U/ml)據(jù)細(xì)胞生長情 況進(jìn)行擴(kuò)增，IO天后收獲即為CIK細(xì)胞。
實施例2 CIK細(xì)胞各指標(biāo)的檢測
1) 無菌試驗和熱源檢測
實施例1和對比例1收獲的CIK細(xì)胞，無菌試驗和熱源檢測均為陰性。
2) 表型檢測
用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。
表型檢測結(jié)果，實施例1收獲的CIK細(xì)胞中，T淋巴細(xì)胞(CD3+細(xì)胞)占細(xì)胞總數(shù)的90%以上。其中，T淋巴細(xì)胞中各亞群的比例因個體差異有一
定變化范圍CD3+CD56+細(xì)胞的比例為40~60%， CD8+細(xì)胞的比例為 65~85%， CD3-CD56+細(xì)胞的比例為25~45%。對比例1收獲的CIK細(xì)胞中， CD3+CD56+細(xì)胞的比例是25 35%; CD8+細(xì)胞的比例是45~60%。
3) 活細(xì)胞計數(shù)檢測
檢測方法為常規(guī)從培養(yǎng)瓶中吸取0.1ml培養(yǎng)液，對其所含的CIK細(xì)胞 用臺盼蘭進(jìn)行染色，活細(xì)胞被染成蘭色，死細(xì)胞不能被染色，在顯微鏡下計 數(shù)200個細(xì)胞，看被染色細(xì)胞的比例。
活細(xì)胞計數(shù)檢測結(jié)果50ml外周血分離出PBMC，按實施例1收獲的 CIK細(xì)胞數(shù)為8乂109細(xì)胞；按對比例1收獲的CIK細(xì)胞數(shù)為2乂109細(xì)胞。 可見，本發(fā)明的人體CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法誘導(dǎo)出的CIK細(xì)胞比傳統(tǒng)CIK細(xì)胞 明顯強(qiáng)大，前者是后者的3 5倍。
4) MTT法檢測CIK細(xì)胞的殺傷活性
將CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)(實驗用腫瘤細(xì)胞株有兩種1、對NK 敏感的K562腫瘤株；2、對NK不敏感的HL-60腫瘤株)，培養(yǎng)6小時后， 用MTT法檢測腫瘤細(xì)胞死亡比例來比較殺瘤活性。結(jié)果換算為殺瘤單位 (LU)。
實施例1的CIK細(xì)胞為31LU/l(f細(xì)胞，對比例1的傳統(tǒng)CIK細(xì)胞殺瘤 單位為23 LU/1()6細(xì)胞。
實施例3本發(fā)明的新型CIK細(xì)胞制劑
將實施例1中體外培養(yǎng)10天后收獲的CIK細(xì)胞置入50 ml離心管中， 離心1000 rpm/10min，收集1乂101()細(xì)胞，生理鹽水洗滌--次，棄上清液， 用生理鹽水將沉淀細(xì)胞打均，轉(zhuǎn)移到100ml輸液瓶中，加IL-2 50萬單位， 注射用生理鹽水100ml，制備成細(xì)胞懸液，留樣，進(jìn)行指標(biāo)檢測。CIK細(xì)胞 活率記數(shù)大于95%，細(xì)菌檢測、熱源檢測均為陰性的為合格。合格者加蓋封 口，低溫保存待用。實施例4腫瘤患者治療
1、 治療對象肝癌中、晚期無法手術(shù)患者ll例，年齡47~73歲，男性 10例，女性1例。所有患者均進(jìn)行過化療，病情未得到有效控制。血清腫瘤
標(biāo)志物甲胎蛋白在400U/L以上?；颊哳A(yù)期生存大于3個月；重要生命器官 正常；無嚴(yán)重細(xì)菌感染；無生物制品過敏史。上述是經(jīng)無錫東方腫瘤醫(yī)院診 斷確診的患者。
2、 治療過程所有患者均在化療終止后15天采用實施例3所得的CIK 細(xì)胞靜脈輸注進(jìn)行治療。每天一次，5天為一個療程，每次輸注CIK細(xì)胞為 1乂109細(xì)胞。第一療程完成后的第三個月進(jìn)行第二療程治療，每患者接受兩 個療程治療。
3、 療效評估
1) 影象學(xué)指標(biāo)(CT指標(biāo))
CIK細(xì)胞治療療效評定采用WHO通用實體瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)。完全緩解
(CR):可測量的病灶完全消失，維持4周以上；部分緩解(PR):可測量
的病灶最大直徑及最大垂直橫徑的乘積縮小一半及以上，無新病灶出現(xiàn)；好 轉(zhuǎn)(MR):可測量的病灶兩徑乘積縮小25 50%，無新病灶出現(xiàn)；穩(wěn)定(SD)-可測量的病灶兩徑乘積縮小<25%或增大<25%，無新病灶出現(xiàn)；進(jìn)展(PD): 可測量的病灶兩徑乘積增大>25%，或出現(xiàn)新的病灶。有效率={ (CR+PR) /治療病人總數(shù)}乂100%。
2) 血清動態(tài)腫瘤標(biāo)志物(甲胎蛋白)檢測
治療前、治療后每月進(jìn)行一次檢測，甲胎蛋白不再升高、穩(wěn)定或持續(xù)下 降為有效。
3) 生命質(zhì)量評分
按照國際通行標(biāo)準(zhǔn)KPS評分方法，對患者治療前、后動態(tài)生命質(zhì)量進(jìn)
行評分，分?jǐn)?shù)增加為有效。
4) 免疫功能檢測對患者治療前、后動態(tài)T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，觀察T淋巴細(xì)胞亞群變化情況，反映患者免疫功能恢復(fù)情況。 5、結(jié)果治療后影象學(xué)指標(biāo)CR0例、PR3例，MR4例，SD2例，PD2例。 有效率=3/11X100% = 27.2%。甲胎蛋白檢測結(jié)果下降6例，穩(wěn)定3例，升高2例。甲胎蛋白呈動態(tài) 下降，其中3例患者在第二療程治療后，甲胎蛋白降到正常植。結(jié)果表明80% 患者對治療有反應(yīng)，病情不再進(jìn)展或好轉(zhuǎn)。生命質(zhì)量評分7例升高，2例穩(wěn)定，2例降低。T細(xì)胞亞群檢測治療前，11例患者中有8例T細(xì)胞亞群異常，治療后 有5例患者恢復(fù)正常，占72%。
權(quán)利要求
1、一種制備CIK細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟將分離好的單個核細(xì)胞置于含有植物血凝素的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24～72小時后，移植到包被有抗CD3單抗和抗CD28單抗的培養(yǎng)瓶中，同時加入含IL-1α和IL-2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5～15天，其中每隔2～3天分瓶培養(yǎng)一次。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物血凝素的終濃度為1 U/ml。
3、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液是GT-T503或1640培養(yǎng)基。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD3單抗和抗CD28單抗的包被密度是采用兩種單抗的濃度各為1~2 pg/ml的包被液包被。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IL-la的終濃度為20 U/ml，所述的IL-2的終濃度為300 U/ml。
6、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞密度達(dá)到3~5Xl()S細(xì)胞/ml時，就分瓶培養(yǎng)。
7、 一種如權(quán)利要求1~6任一項所述的方法所制備的CIK細(xì)胞。
8、 一種CIK細(xì)胞制劑，包括CIK細(xì)胞和IL-2，其特征在于，所述的CIK細(xì)胞為如權(quán)利要求7所述的CIK細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開一種CIK細(xì)胞及其制備方法和細(xì)胞制劑。該制備CIK細(xì)胞的方法，包括以下步驟將分離好的單個核細(xì)胞置于含有植物血凝素的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24～72小時后，移植到包被有抗CD3單抗和抗CD28單抗的培養(yǎng)瓶中，同時加入含IL-1α和IL-2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5～15天，其中每隔2～3天分瓶培養(yǎng)一次。該方法制備出的CIK細(xì)胞具有細(xì)胞增殖明顯提高，CD8細(xì)胞比例較大增加，抗瘤譜廣，殺瘤活性增強(qiáng)等特點。對手術(shù)后的腫瘤患者可有效預(yù)防轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；與放化療聯(lián)合應(yīng)用可降低前者的毒副作用，增強(qiáng)患者耐受性，提高療效；對晚期患者可明顯延長生命周期，提高生活質(zhì)量。
文檔編號A61K35/14GK101519646SQ200910045790
公開日2009年9月2日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者鳴 徐 申請人:上海德嘉生物科技有限公司;徐 鳴