專利名稱：：一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于預(yù)防與治療水產(chǎn)動物的水霉病的藥物，特別是涉及一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：水霉病(S即rolegniasis)是一種絲狀真菌寄生在水產(chǎn)動物體內(nèi)而引起的疾病，危害水產(chǎn)動物的種類極其廣泛，在全國各地均有流行，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的危害嚴(yán)重的疾病之一，每年均可對我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大的損失。長期以來在生產(chǎn)中一直以"孔雀石綠"治療該病，并且有較好的療效?？兹甘G(Malachitegreen)又稱堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠，分子式(:231125(:頂2，是一種三苯甲烷類染料。其在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物為無色孔雀石綠(leucomalachitegreen)，分子式C23H26N2。孔雀石綠的氯化電位勢與組成某些微生物、害蟲酶類的氨基酸相似，在細(xì)胞分裂時通過特異性競爭阻礙肽的形成，達(dá)到抗菌殺蟲的目的。因而，孔雀石綠曾經(jīng)作為驅(qū)蟲劑、殺菌劑、防腐劑，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于預(yù)防與治療水產(chǎn)動物疾病，上世紀(jì)九十年代以來，科學(xué)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它有致畸、致癌、致突變、高殘留、高毒性等問題。早在2002年，我國農(nóng)業(yè)部就將"孔雀石綠"列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》。由于"孔雀石綠"的禁用而相應(yīng)的在療效、經(jīng)濟(jì)上能與之相媲美的無公害藥物一直不能問世，致使在養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)了對水霉病治療的藥物真空的現(xiàn)狀。一方面，生產(chǎn)中無療效較好藥物可用，給養(yǎng)殖戶，養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。另一方面，一些養(yǎng)殖戶、不法商販鋌而走險，繼續(xù)違法使用"孔雀石綠"，給食品安全造成了嚴(yán)重隱患，直接危害了公共衛(wèi)生安全；同時也影響到了中國水產(chǎn)品的出口。例如2005年6月始發(fā)于英國并迅速波及我國的"孔雀石綠事件"就是無良好性價比的無公害替代藥品的直接社會反應(yīng)。因此，無論是對于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的病害防治實(shí)際需要，還是對于維護(hù)公共衛(wèi)生安全來說，開發(fā)出安全、高效的能夠在防治水霉病方面替代"孔雀石綠"的藥物都是十分迫切的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要提供一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，使用本發(fā)明的用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑對水產(chǎn)動物在養(yǎng)殖生產(chǎn)中所出現(xiàn)的水霉病具有預(yù)防和治療作用，不但能夠在防治水霉病方面替代"孔雀石綠"的藥物，而且，安全、高效，無副作用，也完全符合維護(hù)公共衛(wèi)生安全的要求。本發(fā)明的另一目的是提供了制備用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的方法。為了達(dá)到上述的目的本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑按重量百分比由以下組分組成生化黃腐酸71_79%、偏重亞硫酸鈉10-15%、溴硝醇10-15%。3本發(fā)明的一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的制備方法包括以下步驟各步驟均在室溫下進(jìn)行，(1)先將10_15%溴硝醇與10_15%偏重亞硫酸鈉投入混合機(jī)中混合5分鐘，得到兩組分混合物；(2)再將71-79%生化黃腐酸加入混合機(jī)內(nèi)的上述混合好的混合物中，繼續(xù)混合10分鐘，后制得防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑。本發(fā)明的一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的藥物優(yōu)點(diǎn)如下1、臨床藥效，實(shí)驗顯示本發(fā)明的干粉制劑藥物對草魚、鯽的水霉病的防治效果接近或達(dá)到"孔雀石綠"水平。廣譜本發(fā)明的干粉制劑主要針對水產(chǎn)病原真菌，此外對主要水產(chǎn)病原細(xì)菌同樣具有良好的抑菌、殺菌作用，特別是革蘭氏陰性菌。標(biāo)本兼治本發(fā)明的干粉制劑既具有外在殺滅真菌、細(xì)菌的作用同時又具有內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)體和增強(qiáng)水產(chǎn)動物免疫力，改善水體環(huán)境作用。2、安全性，與"孔雀石綠"相比本發(fā)明的干粉制劑藥物的最大優(yōu)點(diǎn)在于其安全性。主要成分生化黃腐酸為天然綠色提取物，來源于自然，環(huán)保安全。生化黃腐酸BiotechnologyFulvicAcid簡稱BFA，是近年來開發(fā)的一種以生物技術(shù)制取的類似煤黃腐酸的物質(zhì)，實(shí)質(zhì)上是一種特定生物(如某些植物及農(nóng)副產(chǎn)品)發(fā)酵活性產(chǎn)物的混合物，它可代替從煤中提取的腐植酸或黃腐酸。腐植酸是一類成分復(fù)雜的大分子化合物，按其對不同溶劑的溶解性分成三個組分即黃腐酸、棕腐酸、黑腐酸。腐植酸在自然界中廣泛存在于褐煤，風(fēng)化煤，泥炭之中，含量達(dá)30%_70%，其含有多種活性功能團(tuán)。各組成間通過鍵合、氫鍵、吸附等化學(xué)、物理作用糾結(jié)在一起。由于這些活性基團(tuán)的存在，決定了腐植酸的酸性、親水性、離子交換性，絡(luò)合性和較高的吸附能力、緩沖、催化能力。對于生化黃腐酸，它不但含有腐植酸，還含有一定量的核酸，氨基酸，VB、VC、肌醇、多糖，除具有很強(qiáng)的生物活性外，還是動物重要的營養(yǎng)物質(zhì)?？傊鶕?jù)臨床證明，腐植酸具有止血、消炎、止痛、收斂、吸附、抗過敏、促分泌，調(diào)節(jié)腸胃功能，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)動物的抗病能力。目前腐植酸類物質(zhì)已應(yīng)用于農(nóng)林、醫(yī)療衛(wèi)生、石油、建材、環(huán)保、農(nóng)藥、肥料等行業(yè)。本發(fā)明的一種防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑是經(jīng)過藥物體外篩選、病理模型篩選、復(fù)配藥物篩選、安全性評價模型篩選等得到了防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑，為了驗證其臨床藥效，實(shí)驗選取水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的養(yǎng)殖品種草魚、鯽進(jìn)行藥物防治效果實(shí)驗。下面對其在防治草魚、鯽水霉病的臨床藥效進(jìn)行評價。1材料與方法1.l試驗藥物防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑(實(shí)驗室自配)1.2實(shí)驗用魚實(shí)驗用草魚、鯽購自江蘇南通國營農(nóng)場，鯽規(guī)格為體重24-29g/尾、體長12-13cm;草魚規(guī)格為體重30-37g/尾、體長14-16cm/尾。體表和解剖觀察健康，暫養(yǎng)一周。1.3菌株來源4水霉菌株為本實(shí)驗室分離于自然發(fā)病史氏鱘(編號XJ001)。1.4飼養(yǎng)管理用200L容積暫養(yǎng)缸飼養(yǎng)，增氧器24小時增氧；水源為經(jīng)曝氣、消毒和去氯處理后的自來水，pH為6.56.8，平均水溫為26t:，溶氧為912mg/L，其他指標(biāo)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。飼料配制參照NRC營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。1.5草魚、鯽水霉病人工感染挑取保藏于試管內(nèi)的水霉菌絲轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯塊200300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml)培養(yǎng)皿上，25。C培養(yǎng)72小時，使其鋪滿整個培養(yǎng)皿。取適量培養(yǎng)好的水霉用研缽研碎倒入用于感染的玻璃缸(20L)水中。將若干事先用水煮開裂的玉米粒放入該玻璃缸水體內(nèi)觀察72小時，觀察到90%玉米粒有水霉生長，即判斷玻璃缸水體中有水霉存在，待用于感染實(shí)驗，用手術(shù)刀片將草魚、鯽背鰭下方兩側(cè)鱗片去掉，在肌肉處刮開一厘米左右的小口，將刮傷后的草魚、鯽魚分別放入有水霉存在的用于感染的玻璃缸水中，每個感染缸放入IO尾草魚或鯽。養(yǎng)殖水溫由26t:下降到18t:左右(暫養(yǎng)缸水溫26°C，感染缸水溫18t:左右)，進(jìn)行水霉病人工感染。1.6草魚、鯽水霉病預(yù)防實(shí)驗1.6.1潑灑方式用藥預(yù)防水霉病上述草魚、鯽進(jìn)行人工感染前，對草魚和鯽分別進(jìn)行潑灑方式用藥預(yù)防水霉病實(shí)驗。實(shí)驗設(shè)置3個干粉制劑藥物潑灑濃度0.4、0.8、1.5mg/L。具體的實(shí)驗步驟如下準(zhǔn)備15個用于感染的玻璃缸(20L)，稱之為感染缸，每個玻璃缸加水14L，按照1.5中的水霉病人工感染方法將水霉菌倒入上述感染缸中，待有水霉菌存在以后，將該干粉制劑藥物潑灑進(jìn)上述感染缸，使缸中的干粉制劑藥物濃度分別為0.4、0.8、1.5mg/L，每個干粉制劑藥物濃度設(shè)三個平行對照缸，同時設(shè)置三個空白平行對照缸，即沒有潑灑干粉制劑藥物的對照缸及孔雀石綠0.2mg/L濃度組三個平行對照缸，即潑灑孔雀石綠藥物并使其藥物濃度為0.2mg/L的對照缸，每個對照缸放待用于感染的草魚或鯽10尾，觀察一周。1.6.2浸泡方式用藥預(yù)防水霉病上述草魚、鯽進(jìn)行人工感染前，對草魚和鯽分別進(jìn)行浸泡方式用藥預(yù)防水霉病實(shí)驗。實(shí)驗設(shè)置3個干粉制劑藥物浸泡濃度4、8、16mg/L，具體的實(shí)驗步驟如下準(zhǔn)備15個用于感染的玻璃缸(20L)，稱之為感染缸，每個玻璃缸加水14L，按照1.5中的水霉病人工感染方法將水霉菌倒入上述感染缸中，使感染缸中有水霉菌存在。準(zhǔn)備三個藥物浸泡缸(20L)，每個浸泡缸加水14L，將該干粉制劑藥物倒入上述三個藥物浸泡缸中，分別使其藥物濃度為4、8、16mg/L，將1.5中提到的暫養(yǎng)缸中的魚撈出放入浸泡缸進(jìn)行浸泡，每個浸泡缸每次浸泡30尾魚，每次浸泡1小時，每天浸泡兩次，連續(xù)浸泡5天，每次浸泡完畢后將魚放回暫養(yǎng)缸中。最后將浸泡過的魚按照浸泡藥物的濃度對應(yīng)的放入感染缸中，每個干粉制劑藥物濃度設(shè)三個平行對照缸，同時設(shè)置三個空白平行對照缸，即沒有浸泡過該干粉制劑藥物的對照缸及孔雀石綠2mg/L濃度浸泡10分鐘組三個平行對照缸，即浸泡過濃度為2mg/L的孔雀石綠藥物且每次浸泡時間為IO分鐘的對照缸，每個對照缸放待用于感染的草魚或鯽10尾，觀察一周。1.7草魚、鯽水霉病治療實(shí)驗1.7.1潑灑藥物治療水霉病按照1.5中的感染方法先進(jìn)行水霉菌的感染，然后選取感染成功的草魚、鯽分別進(jìn)行干粉制劑藥物潑灑治療實(shí)驗。感染成功的魚是指感染后魚體出現(xiàn)了水霉病的癥狀。實(shí)驗設(shè)置3個干粉制劑藥物濃度分別為0.4、0.8、1.5mg/L。具體的實(shí)驗步驟如下準(zhǔn)備15個用于感染的玻璃缸(20L)，稱之為感染缸，每個玻璃缸加水14L，按照1.5中的水霉病人工感染方法將水霉菌倒入上述感染缸中，使感染缸中有水霉菌存在。將暫養(yǎng)缸中的魚撈出放入上述感染缸中進(jìn)行感染，使每個缸中感染成功的魚達(dá)到IO尾，然后將該干粉制劑藥物潑灑入上述感染缸中，使缸中的干粉制劑藥物濃度分別為0.4、0.8、1.5mg/L，每個干粉制劑藥物濃度設(shè)置三個平行對照缸，同時設(shè)置三個空白平行對照缸，即沒有潑灑干粉制劑藥物的對照缸及孔雀石綠0.2mg/L濃度組三個平行對照缸，即潑灑孔雀石綠藥物并使其藥物濃度為0.2mg/L的對照缸，觀察l周。1.7.2藥物浸泡治療水霉病按照1.5中的感染方法先進(jìn)行水霉菌的感染，然后選取感染成功的草魚、鯽分別進(jìn)行干粉制劑藥物浸泡治療實(shí)驗。實(shí)驗設(shè)置3個干粉制劑藥物濃度分別為4、8、16mg/L。具體的實(shí)驗步驟如下準(zhǔn)備15個用于感染的玻璃缸(20L)，稱之為感染缸，每個玻璃缸加水14L，按照1.5中的水霉病人工感染方法將水霉菌倒入上述感染缸中，使感染缸中有水霉菌存在。將暫養(yǎng)缸中的魚撈出放入上述感染缸中進(jìn)行感染，使每個缸中感染成功的魚達(dá)到IO尾，準(zhǔn)備三個藥物浸泡缸(20L)，每個浸泡缸加水14L，將該干粉制劑藥物倒入上述三個藥物浸泡缸中，分別使其藥物濃度為4、8、16mg/L，將感染缸中感染成功的魚撈出分別放入以上濃度的浸泡缸中進(jìn)行浸泡，每個浸泡缸每次浸泡30尾魚，每次浸泡1小時，每天浸泡兩次，連續(xù)浸泡5天，每次浸泡完畢后將魚放回感染缸中，每缸10尾魚，這樣每個干粉制劑藥物濃度就有三個平行對照缸，同時設(shè)置三個空白平行對照缸，即沒有浸泡過該干粉制劑藥物的對照缸及孔雀石綠2mg/L濃度浸泡10分鐘組三個平行對照缸，即浸泡過濃度為2mg/L的孔雀石綠藥物且每次浸泡時間為10分鐘的對照缸，觀察1周。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析根據(jù)農(nóng)業(yè)部《漁藥臨床實(shí)驗技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行藥效(保護(hù)率)評價。保護(hù)率公式如下陽性對照組發(fā)病死亡數(shù)一藥物試驗組發(fā)病死亡數(shù)保護(hù)率(％)=-^-X100%陽性對照組發(fā)病死亡數(shù)2實(shí)驗結(jié)果在預(yù)防方面實(shí)驗結(jié)果表明干粉制劑藥物的兩種用藥方式無論是潑灑還是浸泡對水霉病均有較好的預(yù)防作用。潑灑方式用藥濃度在0.8mg/L對草魚、鯽的水霉病平均保護(hù)率分別為96.7%、100%。浸泡方式用藥在8mg/L濃度時對草魚、鯽水霉病的平均保護(hù)率也可以達(dá)到93.3%、100%，如表1、表2。在治療方面實(shí)驗結(jié)果顯示，浸泡用藥方式效果好于潑灑方式，潑灑方式在1.5mg/L濃度時對草魚、鯽的平均保護(hù)率43.3%和40%，而浸泡方式在濃度16mg/L時對草魚和鯽的平均保護(hù)率為50%、53.3%，如表3、4。比較兩種用藥方式效果，浸泡方式在預(yù)防和治療上均優(yōu)于潑灑用藥方式，特別在治療方面，分析原因在于潑灑用藥方式使用的藥物濃度較低，只能達(dá)到抑制水霉孢子的萌發(fā)的濃度，而無法達(dá)到殺滅孢子或菌絲的濃度，而浸泡濃度較高，在足夠浸泡時間條件下能夠在一定程度上達(dá)到上述效果。為更好的評價該干粉制劑的療效，實(shí)驗選擇孔雀石綠作為對照的藥物。在預(yù)防方面潑灑方式干粉制劑在0.4mg/L濃度時對草魚、鯽分別保護(hù)率為73.3%、70%，孔雀石綠在0.2mg/L濃度下保護(hù)率分別為76.7%、73.3%。浸泡方式干粉制劑和孔雀石綠在濃度分別為16mg/L、2mg/L時保護(hù)率均可達(dá)到100%;在治療方面干粉制劑的保護(hù)率略低于孔雀石綠，潑灑方式干粉制劑在0.4mg/L濃度時對草魚、鯽分別保護(hù)率為13.3%、16.7%，孔雀石綠在0.2mg/L濃度下保護(hù)率分別為16.7%、20.0%。浸泡方式干粉制劑在16mg/L濃度時對草魚、鯽的保護(hù)率分別為50%、53.3%，孔雀石綠在2mg/L濃度時保護(hù)率分別為56.7%、53.3%。綜上可見，在預(yù)防和治療的兩種用藥方式上干粉制劑的保護(hù)率均達(dá)到或接近孔雀石綠的水平。但我們同時也看到無論是干粉制劑還是孔雀石綠在對于水霉的治療效果上均不是很理想，分析原因在于當(dāng)病情較重時水霉菌絲已深入至病魚肌肉深處，而藥物治療僅能殺滅體表的菌絲致其脫落，因此水霉病的治療時機(jī)對于治療的效果極為重要，且強(qiáng)調(diào)對水霉病的早期治療的重要性。同時用藥方式浸泡比潑灑效果更好。表1:干粉制劑潑灑方式用藥對草魚、鯽水霉病的預(yù)防效果7藥物草魚解p濃度供試魚感染數(shù)保護(hù)率供試魚感染數(shù)保護(hù)率(mg/L)(尾)(尾)(o/o)(尾)(尾)(%)101010100101001010010101010102100.410273.31070.01041031001000.810096.7100100]0i1001001001.5100100100100100100孔雀石綠101102(對照)10376.710373.30.2103103表2:干粉制劑浸泡方式用藥對草魚、鯽水霉病的預(yù)防效果8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3:干粉制劑潑灑方式用藥對草魚、鯽水霉病的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4:干粉制劑浸泡方式用藥對草魚、鯽水霉病的治療效果藥物草魚雜p濃度供試魚治愈數(shù)保護(hù)率供試魚治愈數(shù)保護(hù)率(mg/L)(尾)(尾)(%)(尾)(尾)(%)1000001000100010010010010041016.710110101102102103810333.31036.71010103104161055010653.3107106孔雀石綠104105(對照)10656.71053.3210710本發(fā)明的一種防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑及其制備方法由以下的實(shí)施例及其附圖給出。圖1是本發(fā)明的一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的制備方法的流程示意圖。具體實(shí)施例方式以下將對本發(fā)明的一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑及其制備方法作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。本發(fā)明的各組分及設(shè)備說明如下生化黃腐酸為上海通微生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，偏重亞硫酸鈉為上海南威化工有限公司產(chǎn)品，溴硝醇為上海友盛化工科技有限公司產(chǎn)品。11所使用的混合設(shè)備為型號WZ-2、功率1.5kw、裝載系數(shù)0.4_0.6的無重力雙軸槳葉混合機(jī)。按下述重量百分比稱取原料生化黃腐酸75%、偏重亞硫酸鈉12.5%、溴硝醇12.5%。制備方法在室溫下進(jìn)行以下各步驟(1)先將12.5%溴硝醇與12.5%偏重亞硫酸鈉投入混合機(jī)中混合5分鐘；(2)后再將75%生化黃腐酸加入混合機(jī)內(nèi)的上述混合好的混合物中，繼續(xù)混合10分鐘，最終制得防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑。權(quán)利要求一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑，其特征在于按重量百分比該干粉制劑由以下組分組成生化黃腐酸71-79％、偏重亞硫酸鈉10-15％、溴硝醇10-15％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)先將10-15%溴硝醇與10-15%偏重亞硫酸鈉投入混合機(jī)中混合5分鐘，得到兩組分混合物；(2)再將71-79%生化黃腐酸加入混合機(jī)內(nèi)的上述混合好的混合物中，繼續(xù)混合10分鐘，后制得防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑；上述各步驟均在室溫下進(jìn)行。全文摘要一種用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑。其特征在于按重量百分比該干粉制劑由以下組分組成71-79％生化黃腐酸、10-15％偏重亞硫酸鈉、10-15％溴硝醇。所述的用于防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑的制備方法其特征在于該方法包括以下步驟(1)先將10-15％溴硝醇與10-15％偏重亞硫酸鈉投入混合機(jī)中混合5分鐘，得到兩組分混合物；(2)再將71-79％生化黃腐酸加入混合機(jī)內(nèi)的上述混合好的混合物中，繼續(xù)混合10分鐘，后制得防治水產(chǎn)動物水霉病的干粉制劑；上述各步驟均在室溫下進(jìn)行。本發(fā)明的干粉制劑主要針對水產(chǎn)病原真菌，對水產(chǎn)病原細(xì)菌也具有良好抑菌、殺菌作用，特別是革蘭氏陰性菌，既具有外在殺滅真菌、細(xì)菌的作用又具有內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)體和增強(qiáng)水產(chǎn)動物免疫力，且使用安全、環(huán)保。文檔編號A61K33/04GK101708187SQ20091004680公開日2010年5月19日申請日期2009年2月27日優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日發(fā)明者張世奇,楊先樂,邱軍強(qiáng),高鵬申請人:上海海洋大學(xué)