專利名稱：：Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的腫瘤治療方法包括放射治療、化學(xué)治療、生物因子治療等。但這些治療方法都不是特異性地針對(duì)腫瘤細(xì)胞，即缺乏耙向性。藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也產(chǎn)生廣泛毒性。致使藥物利用度有限，副作用大，使用劑量受限。因此，需要一種有效的靶向給藥系統(tǒng)使藥物到達(dá)腫瘤區(qū)。這種系統(tǒng)不僅可以提高藥物在腫瘤區(qū)的濃度，更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以減小對(duì)正常細(xì)胞、組織的損害。細(xì)胞表面具有受體，理論上，可以與特異性配體結(jié)合。由于這種結(jié)合特異性很強(qiáng)，我們可以利用配體的向?qū)ё饔?，將藥物定向引?dǎo)至目的組織或細(xì)胞，發(fā)揮藥效，實(shí)現(xiàn)靶向治療。Trastuzumab是一種抗HER2抗原的人源化單克隆抗體，可以特異性地識(shí)別并結(jié)合于細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體-(HER2)(參見專利JP3502885、US5677171、WO2004008099)。已有文獻(xiàn)報(bào)道HER2在許多實(shí)體瘤中高表達(dá)，如結(jié)子宮內(nèi)膜癌、肺癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等(參見文獻(xiàn)HynesNE,StemDRThebiologyoferbB隱2/neu/HER-2anditsroleincancer.BiochemBiophysActa1198,1994，165-184.)。目前，生物蛋白類藥物治療腫瘤的常用方法是免疫毒素治療。免疫毒素是一種由毒素蛋白和靶向性配體(抗體或抗體片斷)經(jīng)基因工程技術(shù)組合形成的融合蛋白。其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是通過靶向性配體特異結(jié)合細(xì)胞上的受體，免疫毒素被細(xì)胞內(nèi)吞后，毒素蛋白促使腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，免疫毒素臨床治療腫瘤的效果并未達(dá)到令人滿意的程度，多數(shù)免疫毒素停止于臨床i、n試驗(yàn)。主要原因如下首先，毒素蛋白的非特異性肝毒性及血管毒性，可以產(chǎn)生血管滲漏綜合征(vls)，由此導(dǎo)致治療劑量受到限制。其次，由于免疫毒素有很強(qiáng)的免疫原性，給藥后人體內(nèi)會(huì)迅速出現(xiàn)抗毒素中和性抗體，從而限制了其臨床的重復(fù)應(yīng)用。因此，在制備免疫毒素時(shí)，如何降低毒素蛋白非特異性毒性、以及降低其免疫原性的敏感性也是亟待解決的問題。另外，蛋白類藥物具有分子量大及空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)，在藥物投遞過程中極易受到復(fù)雜的生理環(huán)境影響(特別是大量酶類物質(zhì)的作用)，而使蛋白的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致其活性喪失。通過制備納米粒，將蛋白包裹起來可以有效解決這些問題。本申請(qǐng)人已于2008年4月8日遞交了專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200810035706.6，發(fā)明名稱為"人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的耙向納米粒及其制備與應(yīng)用"的中國發(fā)明專利申請(qǐng)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，通過選擇具有良好的生物相容性的脂質(zhì)材料，將毒素蛋白包裹起來制備成脂質(zhì)體，可形成主動(dòng)靶向性，并也能有效解決毒素蛋白非特異性毒性、免疫原性的敏感性，以及毒素蛋白的活性喪失等問題。美國FDA已批準(zhǔn)阿霉素脂質(zhì)體制劑用于多發(fā)性骨髓瘤的聯(lián)合治療，并有多種抗腫瘤脂質(zhì)體制劑也已應(yīng)用于臨床。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種特異性靶向HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，使包裹的毒素蛋白的非特異性毒性和免疫原性的敏感性降低、并保持毒素蛋白在應(yīng)用過程中結(jié)構(gòu)不受破壞、活性不會(huì)喪失。本發(fā)明的另一目的是提供上述免疫脂質(zhì)體的制備。本發(fā)明的另一目的是提供上述免疫脂質(zhì)體的應(yīng)用。靶向腫瘤細(xì)胞的載藥脂質(zhì)體，其結(jié)構(gòu)通常應(yīng)包括(1)配體，可以識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面特異性受體，易被細(xì)胞內(nèi)吞；(2)生物相容性的脂質(zhì)材料制備的脂質(zhì)體，包裹并運(yùn)載抗腫瘤藥物；(3)連接基團(tuán)，連接所述配體與脂質(zhì)體。本發(fā)明在納米粒表面聯(lián)接人源化單克隆抗體Trastuzumab，該抗體可以與腫瘤細(xì)胞表面HER2抗原結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞。通過抗體的引導(dǎo)作用，PEG化的免疫脂質(zhì)體原則上可以應(yīng)用于所有HER2過度表達(dá)的腫瘤。本發(fā)明選擇具有良好的生物相容性的脂質(zhì)材料即EPC(eggphosphatidylcholine,蛋黃卵磷脂)、CHOL(cholesterol,膽固醇)、mPEG2000-DSPE(l，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]，甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)，禾口PDP-mPEG2000-DSPE(l，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine[pyridyldithioproprionatemethoxy(polyethyleneglycol)-2000]，卩比啶二硫代丙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)作為制備脂質(zhì)體的生物相容性脂質(zhì)材料。本發(fā)明提供了一種人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，包括以下結(jié)構(gòu)-——配體，為人源化單克隆抗體Trastuzumab，該配體可以選擇性地識(shí)別并結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體-(HER2);——生物相容性脂質(zhì)材料制備的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體中包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白藥物，所述的生物相容性脂質(zhì)材料為EPC、CHOL、mPEG，。-DSPE和PDP-mPEG2000-DSPE以摩爾比為2:1:0.08:0.02混合—；以及-連接基團(tuán)，為巰基禾QSMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate，N-琥珀酰亞胺基-4-對(duì)馬來酰亞胺苯基丁酸鹽)，連接所述配體與表面帶有巰基的脂質(zhì)體。另外，脂質(zhì)體的粒徑大小也會(huì)影響藥物的靶向性，如果粒徑過大，則在血液循環(huán)中很容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，導(dǎo)致藥物迅速清除，無法實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的特異性靶向腫瘤細(xì)胞的載藥脂質(zhì)體的粒徑優(yōu)選范圍為100-200納米，可以有效減少RES的吞噬，提高藥物制劑的靶向性。上述的脂質(zhì)體中包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白藥物是水溶性的抗腫瘤毒素蛋白，具體是指細(xì)菌毒素(如白喉毒素DT及假單孢菌外毒素PE)或植物毒素(如蓖麻毒素Ricin)以及它們的突變體。本發(fā)明還提供了上述人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟(A)采用薄膜分散法，制備包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的含PDP基團(tuán)的PEG化脂質(zhì)體，制備脂質(zhì)體的材料為EPC、CHOL、mPEG，o-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩爾比為2:1:0.08:0.02混合；(B)釆用化學(xué)偶聯(lián)方法，將人源化單克隆抗體Trastuzumab與包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的脂質(zhì)體連接，連接基團(tuán)為巰基和SMPB。具體步驟如圖2所示(A)含PDP基團(tuán)的PEG化脂質(zhì)體的制備將EPC、CHOL、mPEG2000-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩爾比為2丄0.08:0.02，溶于適量的氯仿溶液，制成脂質(zhì)薄膜。將所制得的脂質(zhì)薄膜以抗腫瘤毒素蛋白溶液充分水化，制得脂質(zhì)體混懸液，再以薄膜擠出器過膜，然后過柱將未被包裹的抗腫瘤毒素蛋白除去，將收集到的樣品濃縮后得到脂質(zhì)體混懸液。(B)抗體的修飾及修飾后的抗體與脂質(zhì)體的連接t艮據(jù)文獻(xiàn)Allen,T.M.,Brandeis,E.,Hansen,C.B.，a/.Anewstrategyforattachmentofantibodiestostericallystabilizedliposomesresultinginefficienttargetingtocancercells.Biochim.Biophys.Acta"1995;1237:99-108.所公開的化學(xué)偶聯(lián)方法，將抗體與脂質(zhì)體連接。先將抗體以SMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate,N-琥拍酰亞月安基-4-對(duì)馬來酰亞胺苯基丁酸鹽)修飾制得MPB-Ab，然后在DTT(dl-d池iothreitol,二硫蘇糖醇)的作用下將PDP基團(tuán)還原制備成含SH(巰基)的脂質(zhì)體，載藥脂質(zhì)體表面上的巰基與MPB-Ab反應(yīng)，將配體與載藥脂質(zhì)體連接，制得PEG化免疫脂質(zhì)體。上述偶聯(lián)反應(yīng)，將抗體與脂質(zhì)體連接時(shí)，采用巰基和N-琥珀酰亞胺基-4-對(duì)馬來酰亞胺苯基丁酸鹽(SMPB:)。上述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度以10-30。C為宜。本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體與單純的PEG化脂質(zhì)體相比，以PDP-mPEG2。。。-DSPE為脂質(zhì)原料進(jìn)行修飾后制備成的免疫脂質(zhì)體，可形成主動(dòng)耙向性。本發(fā)明將毒素蛋白包裹于脂質(zhì)體中，毒素蛋白與正常組織接觸的機(jī)會(huì)將大大降低，從而降低毒素蛋白非特異性毒性；同時(shí)包裹又可以減少毒素蛋白與機(jī)體產(chǎn)生的中和性抗體的接觸，可進(jìn)一步降低其免疫原性的敏感性。本發(fā)明還提供了上述人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)休在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。特別是特異性耙向抗原HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，如結(jié)子宮內(nèi)膜癌、肺癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌細(xì)胞等。本發(fā)明的脂質(zhì)體經(jīng)體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明生物革巴向性良好，體外殺傷靶腫瘤細(xì)胞作用顯著；同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒性作用很小。圖1為本發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體的粒徑分布圖。圖2為本發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體的制備示意圖。圖3為本發(fā)明的包裹PE38KDEL的PEG化脂質(zhì)體體外累積釋放時(shí)間曲線圖。圖4為本發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)圖，其中A:各制劑對(duì)HER2抗原高表達(dá)的SK-BR3細(xì)胞的殺傷；B:各制劑對(duì)HER2抗原較低表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷；C:各制劑對(duì)HER2抗原低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞的殺傷。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。實(shí)施例1:抗腫瘤毒素蛋白PE38KDEL分離純化PE38是細(xì)菌毒素中假單孢菌外毒素(pseudomonasextoxin,PE)的一種，分子量為38KD，PE38KDEL是優(yōu)選的PE38突變體，具有非特異性毒性小的優(yōu)點(diǎn)(第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所提供)。參K、文獻(xiàn)SongS,XueJ,FanK,efa/.PreparationandcharacterizationoffUsionproteintruncatedPseudomonasExotoxinA(PE38KDEL)inEscherichiacoli.ProteinExprPurif2005;44:52-57.方法，首先構(gòu)建PE38KDEL的pET(Novagen)表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入工程菌BL21(DE3)(Novagen)中，利用誘導(dǎo)劑IPTG(isopropy-P-D-thiogalactoside，異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)出PE38KDEL毒素蛋白。然后，通過鎳柱親和層析的方法來得到在細(xì)菌中可溶性表達(dá)的PE38KDEL。最后通過兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物體外蛋白翻譯系統(tǒng)，細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)來證實(shí)PE38KDEL的活性(見參考文獻(xiàn)GaoJ，KouG,WangH,aa/.PE38KDEL-loadedanti-HER2nanoparticlesinhibitbreasttumorprogressionwithreducedtoxicityandimmunogenicity.BreastCancerRes.Treat,doi:10.1007/sl0549-008-0043-0.)。實(shí)施例2:包裹抗腫瘤毒素蛋白PE38KDEL的PEG化脂質(zhì)體的制備用MicroBCA法(Pierce公司)精密測(cè)定分離純化后毒素蛋白PE38KDEL的水溶液的濃度，濃度范圍在2-10mg/ml為宜。將EPC、CHOL、mPEG，『DSPE(2:1:0.08，摩爾比)溶于23ml的氯仿溶液，將該溶液加入到梨形燒瓶中，充氮?dú)馊?，然后在真空條件下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀完全揮去有機(jī)溶劑。將所制得的脂質(zhì)薄膜以2mg/ml的PE38KDEL溶液充分水化，制得脂質(zhì)體混懸液，再以薄膜擠出器分別過800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜，然后以PBS(pH7.4)為洗脫液過SepharoseCL-4B柱將未被包裹的PE38KDEL除去，將收集到的樣品以1000，000Da的超濾離心管在2000rpm，6°C條件下濃縮后得到磷脂濃度為20pmol/ml的脂質(zhì)體混懸液。粒徑分布范圍為100-200nm，如圖1所示。實(shí)施例3:抗體的修飾及修飾后的抗體與脂質(zhì)體的連接(1)MPB-Ab(maleimidophenylbutyrate-HER2)的制備將Ab(抗體Trastuzumab，商品名Herceptin，購買于Genentech公司)溶解在HEPES緩沖液中(25mMHEPES，140mMNaCl,pH7.4)，制備成10mg/ml的Ab溶液。將25mM的SMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate,N-琥珀酰亞胺基-4-對(duì)馬來酰亞胺苯基丁酸鹽)溶于DMF(二甲基甲酰胺溶液)，然后緩慢地加入到上述Ab溶液中(SMPB與Ab的摩爾比為20:1)，室溫下反應(yīng)30分鐘。然后以HEPES和MES(25mMHEPES，25mMMES，140mMNaCl，pH6.7)為洗脫液過SephadexG50柱將未結(jié)合的SMPB除去，將收集到的樣品以3,000Da的超濾離心管在2000rpm，6"條件下濃縮后得到10mg/ml的MPB-Ab溶液，同法制備MPB-BSA(牛血清白蛋白)作為對(duì)照。(2)抗體的結(jié)合PEG化的免疫脂質(zhì)體的制備如下。首先以EPC/CHOL/mPEGM00-DSPE/PDP-PEG2000-DSPE(2:1:0.08:0.02，摩爾比)的脂質(zhì)體處方制得脂質(zhì)薄膜(PEG總的摩爾數(shù)為磷脂的5。/c)。然后將所制得的脂質(zhì)薄膜以2mg/ml的PE38KDEL溶液充分水化后，在室溫條件下，以20mM的DTT(二硫蘇糖醇)將脂質(zhì)體外部的吡啶二硫基還原30分鐘。然后以HEPES禾口MES(25mMHEPES,25mMMES,140mMNaCl，pH6.7)為洗脫液過SephadexG50柱除去DTT。巰基化的脂質(zhì)體(20mM磷脂)與MPB-Ab在室溫下孵育過夜，Ab與磷脂的摩爾比為1:1330。以PBS(pH7.4)為洗脫液將制得的脂質(zhì)體過SepharoseCL-4B柱除去未結(jié)合的MPB-Ab。MPB-Ab未結(jié)合的量通過MicroBCA法進(jìn)行測(cè)定。制得的PEG化免疫脂質(zhì)體以1000,000Da的超濾離心管在2000rpm，6"C條件下濃縮至54mM后，充N^密閉保存或冷凍干燥即可。本發(fā)明的制備方法詳見圖2。實(shí)施例4:發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)精密稱取4個(gè)不同批次的包裹PE38KDEL的脂質(zhì)體10.0210.07mg分別置于1000，000Da的20ml超濾離心管中，加入適量pH7.4的PBS緩沖液(含0.02%疊氮鈉作為抑菌劑)為釋放介質(zhì)，置于恒溫水浴搖床中，在100rpm振蕩速度、37。C士0.5。C溫度條件下進(jìn)行包裹PE38KDEL脂質(zhì)體的體外釋放度測(cè)定。分別在1、2、4、6、9、12和24h取出超濾離心管，于在2000rpm，4。C條件下離心20min，吸出下清液，然后以釋放介質(zhì)將超濾離心管中的釋放介質(zhì)補(bǔ)足，再以MicroBCA法測(cè)定下清液中PE38KDEL的含量。在不加mPEG2,-DSPE的情況下，以與實(shí)施例2相同方法制備的普通脂質(zhì)體作為對(duì)照。如表1所示，PE-Liposomes(包裹毒素蛋白的PEG化脂質(zhì)體)和PE-HER-Liposomes(Ab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體)在包封率和載藥量方面無明顯差異(P>0.05)，此外Ab的結(jié)合干擾PE38KDEL體外釋放的定量，因此我們用PE-Liposomes，而不是PE-HER-Liposomes來進(jìn)行PE38KDEL的體外釋放實(shí)驗(yàn)。表l包裹PE38KDEL的PEG化脂質(zhì)體的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果普通脂質(zhì)體在各取樣點(diǎn)的累積釋放百分比依次為25.14±3.41，44.72±4.99，56.28±6.36，69.57±5.80，80.06±5.35，86.97土7.13，99.23土0.52(n=4);PEG化脂質(zhì)體在各取樣點(diǎn)的累積釋放百分比依次為5.18±0.62，10.27±1.84，13.65±3.11，16.41±3.46，19.50±4.29，23.14±4.88，33.07±5.73(n=4)，詳見圖3。由圖可見所制備的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體制劑可滿足作為有效釋放系統(tǒng)的需要。實(shí)施例5:發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂質(zhì)體的體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)通過制造商(Promega，Madison,WI)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以細(xì)胞滴定96孔的非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定(Chen,H.，Gao，丄，Lu,Y.,"a/.PreparationandcharacterizationofPE38KDEL-loadedanti-HER2nanoparticlesfortargetedcancertherapy.J.Control.Release,2008;128:209-216.)。在PEG化脂質(zhì)體(實(shí)施例2制備的)、PEG化的免疫脂質(zhì)體(實(shí)施例1-3制備的)、游離PE38KDEL(實(shí)施例1制備的)或各空白脂質(zhì)體的條件下，將乳腺癌細(xì)胞(lxl04)于37。C，C02孵育器孵育兩天。該法中PE38KDEL的測(cè)定濃度從1到加,000pM(等于0.1mg/ml的總脂濃度)。將沒有PE38KDEL的空白PEG化的脂質(zhì)體和PEG化的免疫脂質(zhì)體在最高總脂濃度(0.1mg/ml)條件下的孵育兩天來測(cè)定細(xì)胞毒性，然后將20(^1MTS/PMS溶液補(bǔ)充到每個(gè)孔里。在3"7。C條件下孵育2小時(shí)，在490nm波長(zhǎng)以全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔中樣品的吸收度。結(jié)果顯示，PEG化的免疫脂質(zhì)體對(duì)SK-BR3的殺傷優(yōu)于PEG化的脂質(zhì)體和游離的PE38KDEL,詳見圖4;沒有PE38KDEL的空白PEG化的脂質(zhì)體和PEG化的免疫脂質(zhì)體在最高總脂濃度(0.1mg/ml)條件下無細(xì)胞毒性。權(quán)利要求1、人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，包括以下結(jié)構(gòu)，且粒徑范圍為100-200納米配體，為人源化單克隆抗體Trastuzumab；包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的脂質(zhì)體，制備脂質(zhì)體的材料為EPC、CHOL、mPEG2000-DSPE和PDP-mPEG2000-DSPE以摩爾比為2∶1∶0.08∶0.02混合；以及連接基團(tuán)，為巰基和SMPB，連接所述配體與表面帶有巰基的脂質(zhì)體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，其特征在于其中的抗腫瘤毒素蛋白是細(xì)菌毒素或植物毒表i)J古們的空亦拔<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化單克隆抗體Tmstuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，其特征在于其中的細(xì)菌毒素是白喉毒素或假單孢菌外毒素。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，其特征在于其中的植物毒素是蓖麻毒素。5、一種如權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟(A)采用薄膜分散法，制備包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的含PDP基團(tuán)的PEG化脂質(zhì)體，制備脂質(zhì)體的材料為EPC、CHOL、mPEG2oQ()-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩爾比為2:1:0.08:0.02混合；(B)采用化學(xué)偶聯(lián)方法，將人源化單克隆抗體Trastuzumab與包裹并運(yùn)載抗腫瘤毒素蛋白的脂質(zhì)體連接，連接基團(tuán)為巰基和SMPB。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于具體步驟如下(A)將EPC、CHOL、mPEG扁『DSPE、PDP-mPEG2,-DSPE以摩爾比為2:1:0.08:0.02溶于氯仿溶液，制成脂質(zhì)薄膜，將所制得的脂質(zhì)薄膜以抗腫瘤毒素蛋白溶液充分水化，制得脂質(zhì)體混懸液，再以薄膜擠出器過膜，然后過柱將未被包裹的抗腫瘤毒素蛋白除去，濃縮；(B)將人源化單克隆抗體Trastuzumab以SMPB修飾制得MPB-Ab，然后在DTT的作用下將PDP基團(tuán)還原制備成含巰基的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體表面上的巰基與MPB-Ab反應(yīng)，將配體與脂質(zhì)體連接；反應(yīng)溫度為1(K3(TC。7、一種如權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中的腫瘤是子宮內(nèi)膜癌、肺癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或膀胱癌。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如放射治療、化學(xué)治療、生物因子治療等缺乏靶向性，免疫毒素治療又存在著毒素蛋白的非特異性毒性和免疫原性的敏感性等問題。本發(fā)明的人源化單克隆抗體Trastuzumab修飾的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂質(zhì)體，在脂質(zhì)體表面連接抗體，可與腫瘤細(xì)胞表面HER2抗原結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞；毒素蛋白包裹于脂質(zhì)體中，可降低毒素蛋白非特異性毒性和免疫原性的敏感性。本發(fā)明還提供了上述脂質(zhì)體的制備與應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)體外殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明生物靶向性良好，體外殺傷靶腫瘤細(xì)胞作用顯著；同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞毒性作用很小。文檔編號(hào)A61K38/16GK101536982SQ20091005003公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月27日優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日發(fā)明者劉青鋒,周閨臣,霽孫,孫治國,宣吉明,翮張,晨方,李博華,王明娟,王江峰,豪鄒,郭亞軍,威鐘,鐘延強(qiáng),婷陳,潔高,瑩魯申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)